CN101235407A - 发酵法合成多粘菌素b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵法合成多粘菌素B的方法，包括将多粘芽孢杆菌bacillus polymyxa ATCC10401接种于培养基中进行培养的步骤，其特征在于，所述培养基使用的有机氮源的浓度为4％～10％。由本发明培养基发酵合成多粘菌素B的最高发酵单位可达6534.5U/ml。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵法生物合成多粘菌素B的方法。
背景技术
多粘菌素是由多粘芽孢杆菌(bacillus polymyxa)产生的，由多种氨基酸和脂肪酸组成的一族碱性环多肽类抗生素的总称。研究到目前为止已发现多粘菌素A、B、C、D、E、M等多个组分中，其中只有多粘菌素B(polymyxinB简称polymyxin)、多粘菌素E(polymyxinE简称Colistin)具有较低的毒性及良好的抗菌活力。因此对多粘菌素B和多粘菌素E研究相对较多，且目前已有相应的产品在临床上使用。临床上常用它们的硫酸盐或甲磺酸盐，其中后者多用于非肠道给药途径，在组织中水解出多粘菌素起作用。可用于治疗一些由革兰氏阴性菌引起的脑膜炎、痢疾等，特别是它能抑制其他抗生素几乎没有作用的绿脓杆菌，且不产生耐药性，因此它对防止烫伤和外科手术后感染绿脓杆菌及有耐药性的痢疾菌和由其他革兰氏阴性菌引起的疾病等都有一定的临床意义。
目前，多粘菌素B的生产主要采用微生物发酵法进行生物合成，但发酵单位较低，尚未实现规模化生产。其中，对比文献The Biosynthesis ofPolymyxin B by Growing Cultures of Bacillus polyrnyxa一文也披露了一种生物合成多粘菌素B的培养基，由于该培养基不含有机氮源，氮源单一且含量少，因此产量较低，为1043U/ml。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提高多粘芽孢杆菌发酵生物合成多粘菌素B的产量。
为此，本发明提供一种发酵法合成多粘菌素B的方法，包括将多粘芽孢杆菌bacillus polymyxa ATCC10401接种于培养基中进行培养的步骤，其特征在于，所述培养基使用的有机氮源的浓度为4％～10％。
所述有机氮源的浓度优选为5～8％，更优选为5.8％～6.2％，最优选为6.0％。
本发明方法中的培养基包括碳源、有机氮源、无机氮源、CaCO3以及微量元素等。
优选地，该培养基的有机氮源采用大豆分离蛋白、豆粕、玉米浆、花生粉、棉仔饼粉或黄豆饼粉等。
更优选地，有机氮源采用大豆分离蛋白。
该培养基所使用的碳源包括但不限于玉米粉、淀粉、葡萄糖和蔗糖，优选淀粉；培养基中碳源的浓度为1％～6％，优选2％～4％。
所述CaCO3在培养基中的浓度为0.5％～2.0％，优选0.8％～1.0％。
所述微量元素包括但不限于Mg2+和Mn2+的可溶性盐类，其浓度通常为0.001％～0.005％，优选0.002％。
本发明方法中，最优选的培养基组分和重量百分比含量为：淀粉3％，大豆分离蛋白6％，硫酸铵0.1％，CaCO30.8％，MgSO40.002％，MnSO40.002％，余量为水。
本发明方法中的培养基由于高含量有机氮源的独特配方，因此所合成的多粘菌素B的发酵单位得以大大提高。本发明方法发酵合成多粘菌素B的最高发酵单位可达6534.5U/ml。
具体实施方式
实施例1
按照以下配方配制培养基，其中培养基a为本发明的配方，培养基b为对比文献的配方：
培养基a：大豆分离蛋白60g，淀粉30g，硫酸铵1g，CaCO38g，MgSO4·7H2O 0.02g，MnSO4·H2O 0.01g，蒸馏水定容至1L。
培养基b：葡萄糖5g(以50％的浓度单消)，(NH4)2SO41.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，ZnSO40.01g，MnSO4·H2O0.0075g，40ml 0.5M K3PO4，生物素0.5μg。
其中培养基a和b均接入bacillus polymyxa ATCC 10401的种子培养物，接种量7％，消前pH值调至7.2；温度30℃；装量30ml/250ml；培养40小时后放瓶，结果前者得到6534.5U/ml多粘菌素B，后者得到1043U/ml多粘菌素B。
实施例2
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成大豆分离蛋白40g，结果得到5652.1U/ml多粘菌素B。
实施例3
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成大豆分离蛋白100g，结果得到6072.3U/ml多粘菌素B。
实施例4
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成大豆分离蛋白50g，结果得到6195.2U/ml多粘菌素B。
实施例5
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成大豆分离蛋白80g，结果得到6146.3U/ml多粘菌素B。
实施例6
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成大豆分离蛋白58g，结果得到6478.6U/ml多粘菌素B。
实施例7
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成大豆分离蛋白62g，结果得到6486.4U/ml多粘菌素B。
实施例8
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成花生粉60g，结果得到1854.5U/ml多粘菌素B。
实施例9
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成黄豆饼粉60g，结果得到5456.2U/ml多粘菌素B。
实施例10
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成豆粕60g，结果得到4332.3U/ml多粘菌素B。
实施例11
将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成棉子饼粉60g，结果得到1003.8U/ml多粘菌素B。
Claims (8)
1. 一种发酵法合成多粘菌素B的方法，包括将多粘芽孢杆菌bacilluspolymyxa ATCC10401接种于培养基中进行培养的步骤，其特征在于，所述培养基使用的有机氮源的浓度为4％～10％。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机氮源的浓度为5％～8％。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机氮源的浓度为5.8％～6.2％。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述有机氮源的浓度为6.0％。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机氮源为豆粕、大豆分离蛋白、玉米浆、花生粉、棉仔饼粉和黄豆饼粉中的一种。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基使用的无机氮源为硫酸铵，其浓度为0.02％～0.2％。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基使用的碳源为玉米粉、淀粉、葡萄糖或蔗糖，该碳源的浓度为1％～6％。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基使用的微量元素为Mg2+或Mn2+的可溶性盐类，该微量元素的浓度为0.001％～0.005％。
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