CN111041037B - 一种调控多粘菌素b同系物组分的方法 - Google Patents

一种调控多粘菌素b同系物组分的方法 Download PDF

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    • C07K7/60—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation occurring through the 4-amino group of 2,4-diamino-butanoic acid
    • C07K7/62—Polymyxins; Related peptides
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

本发明公开了一种调控多粘菌素B同系物组分的方法，包括如下步骤：(1)构建pMAD‑△A和pMAD‑△C，(2)将pMAD‑△A转化菌株CJX518，筛选，得到转化成功的菌株，再培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR测序验证为结构域替换菌株518‑A；再将pMAD‑△C转化菌株518‑A，筛选，培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR测序验证为结构域替换菌株518‑AC；(3)种子培养，得到二级种子；(4)多粘菌素B生产：将二级种子接入发酵培养基中，发酵72小时。本发明的方法调控多粘菌素B的同系物组分，增加了B1与B2的比例，降低了B3与B1‑1的比例。

Description

一种调控多粘菌素B同系物组分的方法
技术领域
本发明属于生物与新医药技术领域，涉及一种调控多粘菌素B的同系物组分的方法。
背景技术
多粘菌素B对超级细菌具有强烈的抑制活性，是目前人类使用抗生素的最后一道防线，在使用过程中具有肾毒性和神经毒性。多粘菌素B是由多黏类芽孢杆菌通过非核糖体肽合成酶催化生产的含有多种同系物的复杂混合物，临床以及商业多粘菌素B制剂中通常包括B1、B2、B3、B1-1四种同系物，其中主要成分是B1与B2。不同的单一组分活性不同，且联合使用效果不同，引起的临床效应也不同。许多文献报道了非核糖体肽合成酶的机理，通过培养基优化调控其他脂肽物质的组分，同时也有研究多粘菌素的基因簇以及合成机制，但是多粘菌素B的组分调控的机制仍不是很清楚，并且不同的菌株生产多粘菌素的组分比例也不尽相同，因此缺少调控多粘菌素B同系物组分的有效方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种调控多粘菌素B同系物组分的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种调控多粘菌素B同系物组分的方法，包括如下步骤：
(1)质粒构建：将对亮氨酸特异性的腺苷酸活化结构域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的上游500bp同源臂基因与CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的下游500bp同源臂基因，通过重叠延伸PCR的方法相连得到的片段连接到载体pGEMT-Easy，获得载体pT-A，通过BamH I与Sal I双酶切pT-A与pMAD质粒，将酶切片段相连，得到pMAD-△A；
将对6-甲基辛酸、6-甲基庚酸强特异性识别的缩合结构域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的上游500bp同源臂基因与CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的下游500bp同源臂基因通过重叠延伸PCR的方法相连得到的片段连接到载体pGEMT-Easy获得载体pT-C，通过BamH I与Sal I双酶切pT-C与pMAD质粒，将酶切片段相连，得到pMAD-△C；
所述对亮氨酸特异性的腺苷酸活化结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的上游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的下游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述对6-甲基辛酸、6-甲基庚酸强特异性识别的缩合结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的上游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的下游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(2)菌种构建：将pMAD-△A转化CJX518，通过抗生素和蓝白斑筛选得到转化成功的菌株，再42-45℃培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR测序验证为结构域替换菌株518-A；
再将pMAD-△C转化所述结构域替换菌株518-A，通过抗生素和蓝白斑筛选得到转化成功的菌株，再42-45℃培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR测序验证为结构域替换菌株518-AC；
(3)种子培养：将结构域替换菌株518-AC在种子培养基中培养，得到一级种子；将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子；
(4)多粘菌素B生产：将步骤(3)获得的二级种子按初始OD600为0.2的接种量接入发酵培养基中，在转速为180-250rpm，温度为28-37℃条件下摇瓶发酵72小时。
本发明优点：
本发明是在多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa CJX518的多粘菌素B合成基因簇中，用对亮氨酸特异性的腺苷酸活化结构域以及对6-甲基辛酸、6-甲基庚酸强特异性识别的缩合结构域替换原先的结构域，从而调控多粘菌素B同系物的组分比例。增加了B1与B2的比例，降低了B3与B1-1的比例。
附图说明
图1pMAD-△A质粒构建图谱。其中：
up：上游同源臂；
down：下游同源臂；
BamH I：限制性内切酶；
Sal I：限制性内切酶；
Overlap PCR：重叠延伸PCR；
pMAD：大肠-芽孢杆菌穿梭质粒；
pGEMT-Easy：线性T载体。
图2pMAD-△C质粒构建图谱。
up：上游同源臂；
down：下游同源臂；
BamH I：限制性内切酶；
Sal I：限制性内切酶；
Overlap PCR：重叠延伸PCR；
pMAD：大肠-芽孢杆菌穿梭质粒；
pGEMT-Easy：线性T载体。
图3为多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa CJX518生物量情况。
图4为多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa CJX518的多粘菌素组分情况。
图5为多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa CJX518-AC生长量情况。
图6为多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa CJX518-AC的多粘菌素组分情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明：
本发明涉及的菌株的CJX-518为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，实验室分离菌株，于2013年01月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.7096
pGEMT-Easy(商品)，pMAD质粒(商品)。
多黏类芽孢杆菌CJX518简称CJX518。
实施例1
1L种子培养基含下述成分：葡糖糖3-7g，淀粉25-35g，酵母粉0.5-3g，蛋白胨2-6g，NaCl 0.3-1g，KH2PO40.8-2g，MgSO4·7H2O 0.1-1.2g，蒸馏水定容到1L，自然pH。
实施例2
1L发酵培养基含下述成分：葡萄糖50-80g，酵母粉0.1-2.0g，牛肉膏1-3g，蛋白胨6-12g，NaCl 3-8g，KH2PO40.4-1.4g，KCl 0.2-0.6g，MgSO4·7H2O 0.4-1.2g，FeSO4·7H2O0.01-0.05mg，MnSO4·7H2O 3-9mg，蒸馏水定容到1L，自然pH。
实施例3(对照)
(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC 7096的多黏类芽孢杆菌CJX518(Paenibacillus polymyxa)在实施例1的种子培养基中培养，得到一级种子；将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子；
(2)多粘菌素B生产：将步骤(1)获得的二级种子按初始OD600为0.2的接种量接入200mL实施例2的发酵培养基中，在转速为200rpm，温度为30℃条件下摇瓶发酵72小时。
测多粘菌素B1的含量为41％，B2的含量为23％，B3的含量为17％，B1-1的含量为19％。
实施例4
一种调控多粘菌素B同系物组分的方法，包括如下步骤：
(1)质粒构建：将对亮氨酸特异性的腺苷酸活化结构域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的上游500bp同源臂基因与CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的下游500bp同源臂基因，通过重叠延伸PCR的方法相连得到的片段连接到载体pGEMT-Easy，获得载体pT-A，通过BamH I与Sal I双酶切pT-A与pMAD质粒，将酶切片段相连，得到pMAD-△A；
将对6-甲基辛酸、6-甲基庚酸强特异性识别的缩合结构域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的上游500bp同源臂基因与CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的下游500bp同源臂基因通过重叠延伸PCR的方法相连得到的片段连接到载体pGEMT-Easy获得载体pT-C，通过BamH I与Sal I双酶切pT-C与pMAD质粒，将酶切片段相连，得到pMAD-△C；
(2)菌种构建：将pMAD-△A转化CJX518(保藏菌)，通过红霉素和蓝白斑筛所述对亮氨酸特异性的腺苷酸活化结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(多黏类芽孢杆菌，Paenibacillus polymyxa E681)；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的上游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(多黏类芽孢杆菌，Paenibacillus polymyxa CJX518)；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的下游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(多黏类芽孢杆菌，Paenibacillus polymyxa CJX518)；
所述对6-甲基辛酸、6-甲基庚酸强特异性识别的缩合结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(多黏类芽孢杆菌，Paenibacillus polymyxa E681)；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的上游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示(多黏类芽孢杆菌，Paenibacillus polymyxa CJX518)；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的下游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(多黏类芽孢杆菌，Paenibacillus polymyxa CJX518)；
选得到转化成功的菌株，再42℃(也可以选42℃-45℃之间的任意值)培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR测序验证为结构域替换菌株518-A；
再将pMAD-△C转化所述结构域替换菌株518-A，通过红霉素和蓝白斑筛选得到转化成功的菌株，再42℃(也可以选42℃-45℃之间的任意值)培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR测序验证为结构域替换菌株518-AC；
(3)种子培养：将结构域替换菌株518-AC在实施例1的种子培养基中培养，得到一级种子；将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子；
(4)多粘菌素B生产：将步骤(3)获得的二级种子按初始OD600为0.2的接种量接入1200mL发酵培养基中，在转速为200rpm(也可以选180或250rpm)，温度为30℃(也可以选28或37℃)条件下摇瓶发酵72小时。
测多粘菌素B1的含量为60％，B2的含量为20％，B3的含量为12％，B1-1的含量为8％。
实验一、保藏编号为CGMCC 7096的多黏类芽孢杆菌CJX518(简称CJX518)产多粘菌素B同系物
将经过种子培养的CJX518按初始OD600为0.2的接种量，转入200mL发酵培养基中。在温度30℃，转速200rpm条件下发酵72h。
在48h,72h取样检测生物量、72h多粘菌素B同系物组分比例以及抑菌活性。各时间段检测到的生物量如图3，多粘菌素组分比例如图4。
实验二、结构域替换菌株518-AC(简称518-AC)产多粘菌素B同系物
将经过种子培养的518-AC按初始OD600为0.2的接种量，转入200mL发酵培养基中。在温度30℃，转速200rpm条件下发酵72h。
在48h,72h取样检测生物量、72h多粘菌素B同系物组分比例以及抑菌活性。各时间段检测到的生物量如图5，多粘菌素组分比例如图6。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种调控多粘菌素B同系物组分的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 615
<212> DNA
<213> 多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 1
ctggcttatg tcatctatac gtcaggtacg acgggcaatc ccaaaggggt catgctggag 60
catcacggtt tggtcagctt gaagctgatg ttcgcggaca ggctgggcat cacggagcat 120
gaccggatcg ttcaattcgc cagcctgtcg ttcgacgcgt cctgctggga agtgttcaaa 180
gcgctctatt ttggcgcggc tttgtacatc ccgacggccg agacgattct cgacaaccgc 240
ctgttcgaga gttatatgaa cgagcatgcg attacggcgg cgattttgcc tccgacgtac 300
agtgcttatt tgaacccgga ccgccttccc agcttaacga agctcgtaac gggaggctcg 360
gcggtatcgg ccgaattcgt gcagcagtgg aaacgcaagg tccactattt caatgcttac 420
ggccctaccg aagcttcgat tgttacgacg ctttgggatg cggatgagga gcagccggag 480
ggcagagtca ttccgatcgg gcgcccgctg gccaatcacc ggatttttat tttggatgcc 540
cacctgcagc ttgtgcctcc gggagtggac ggcgagctgt gcgtggcagg cgtggggctt 600
gcgagaggtt acctg 615
<210> 2
<211> 498
<212> DNA
<213> 多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 2
cttgtgacgg aggcggaaaa aaccgacctt ctcggacgtt ttaacgacac catcacggaa 60
tttccgcgcg ggaagacgct cattcaattg ttcgaagagc aggcggagcg catcccggat 120
gcagccgcca tctccttgaa tgagcaagag ctgacctacc gcgagctgaa cgaacgcgtc 180
aaccgccttg cccgtacctt gcgtagccac gggatatcca aaggccgtct ggtcgccatt 240
atggctgagc gttccattga aatggtggtg ggcatgctgg cggcacacaa agccggagcg 300
gcttacgtac cgattgaccc ggaatatccc gaggagcgta tccgtttctt gatcgaggat 360
tcgggagcgc aggtcatgct gacgcaaagc cgcttgcgcg agcgcctggc gggttcagac 420
tccgtgatct tattggatga cgaggccttc tatcacgagg acggcacaaa tctaaatccg 480
ggcaccgaag cgacagat 498
<210> 3
<211> 471
<212> DNA
<213> 多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 3
aaccggccgg agctgacggc ggagaaattt gtggacaatc cgtttgtgcc gggagagcgc 60
atgtaccgga cgggggattt ggcgaaatgg ctgccggacg gcacgatcga atacgtagga 120
cggacggacg accaagtgaa aatccgcggc ttccgcattg agctgggcga gatcgaagct 180
cagcttcaga aagtggaggg aattcggaaa acgacggtat tcgcgaggga aaacgcctcc 240
ggcgagaagc agctttgcgc ctattatgaa gcggaccgcg agcttccggc ggccgagctg 300
aagagcgcgc tttcccagga actgccggcc tacatgatcc cggcgtacct gatccagttg 360
gagcggctcc cgctgacggc aaacggcaag gtcgaccgcc ggtcccttcc ggcgccggag 420
gagagcttgc agccgggcga aggacgtact ccgcctcgga ctccgctgga a 471
<210> 4
<211> 1287
<212> DNA
<213> 多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 4
aaagagcaat atggattaac gcaagcccag cgccgaatat ggttcatgga aattatgaat 60
ccgggaacgt ccatcacgat gctttccgcg acctaccaga ttacgggcga gatcaacaca 120
cagcttctgg agcaagcggc agcagagatc gtcaaaacct atgacgtttt ccgaatccgc 180
attagcgggg atttgcaaaa tccaacgcag tggttcgaag agccggagaa tgtccaggct 240
aggataagcc gcctcgaaat aggcacaacc gaacaattct atgcttgggt gaaagaagta 300
agcgaaaaac cggccagcgt gttcgacgaa cacctccacc aatttacgat tatccatttt 360
gtgaacggcc aagtatggct caatttgacg gtaaatcata ttatcgccga cggcttgtcc 420
gtcaatgctt tgctgcatgc ggtgatggaa aaatacctgg aactgcgcaa aggcatctcc 480
agcagttacc aggccccttc ctatctggat tatatttccg cggagcgtga atatgagcaa 540
tcgcagcgtt atcaaaaagg caaggaatac tggctgacga agtacaacac tttgcctgaa 600
acgaccggca ttaaatcgta tccgccattc tcgatcggca gcgaatccaa taaactgtcc 660
atcactttgg acggttcccg gtatgaacgc attctgacct tcagcgaaca atatcaggtc 720
agcttatata cgttatttct gtccgccatg tacgccttat tgtacaagct gaccgacagc 780
atcgatgttc cggtcggcac ggttttcgcc aatcgcacca gcaagaagga aaaagaaacg 840
attggcatgt tcgtcagcac cgtggctacg cggattcgtc tgaatccaga caggaacgtg 900
ctttccttga tccaaacggt ttccaaggaa aatacggcgg atctgcggta tcagaaatac 960
ccttataacc aattgatcca ggatttacgt gaacaacacg gccgcaacga tctttcgggg 1020
ctgttccgca cgtctctgga atatctgcct ttgaaaatcg tggagtacga agaaatcaag 1080
gtacgcctgg aggctcactt tgctaggcac gagatggacg atttgctgct gcgcttcgac 1140
catatgctga atgaaggcca tgtcattctc catgcttcct atcgtaccgg cttgttcgag 1200
acggccgaga ttgatcggat tatggaacag tatgtaaccg ttctggacca gtttcttcag 1260
actcccgaac tgccgatacg cgagatt 1287
<210> 5
<211> 500
<212> DNA
<213> 多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 5
tccgcgctgg ataacgaatc ccagcattgg gtacagcagg ccctgaacgt attgatgaag 60
gggcgtacca ccattctgat cgcccaccgt ctcagcaccg tggaacatgc ggatttaatt 120
accgtcatga accaagggac ggtcgtcgag cggggccgcc atcaggacct gctggcgctc 180
gggggttatt acgcccggct gtacggctag acccgcttta cggcgggcgg cttcctgctt 240
gcgaatgcga cagagtcttt tagtaatcca aggtatgact ttataaccgg tagttaccag 300
aaaacgtaga cacgaaaaag gaggaagagt ccgaaggagc cgttccggga gtggcctgcg 360
cggttcttct aagagtgact aagtgacatc taggtacaaa gcctatctat aaagaatctc 420
taaaccggga gtgtgtcgat gtgagagaga ataccaacga gaaatatgga ttaacgcaag 480
cccagcgccg aatatggttc 500
<210> 6
<211> 510
<212> DNA
<213> 多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 6
tctctgctga gcgatgagga gagacaccgc attctcaacg tttttaaccc gccggttgca 60
gggcttagcg agggagaagc gtttcatcgg tatgttgaaa agtttgcccg ggaaattcca 120
gatcatccgg cagtcgtcta catggacaaa cagctgacct acggcgaatt gaacgaacgc 180
gccgagcggc tggcttctct ccttcgcgaa cagggcgtgg gaagggagac gattacgggg 240
atctgggcgg agcgttcggt ggaactgctg gtcggagtgc tcgccgtttg gaaagccggc 300
ggagcctatg taccgctgga ccccgattat ccggcggagc ggattgagta catgctcagc 360
gatagcgatg catcggtgct gcttacgcag cgtcatctgt tggagcgggc cagaggttgg 420
ttggccgatg accggctgaa gcttcaagct gtctatgcca tggacgatga acagatttat 480
aacggggatg ccttagccgt ggaatttgaa 510

Claims (1)

1.一种调控多粘菌素B同系物组分的方法，其特征包括如下步骤：
（1）质粒构建：将对亮氨酸特异性的腺苷酸活化结构域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的上游500 bp同源臂基因与CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的下游500 bp同源臂基因，通过重叠延伸PCR的方法相连得到的片段，通过BamH I与Sal I双酶切连接到载体pGEMT-Easy，获得载体pT-A，通过BamH I与Sal I双酶切pT-A与pMAD质粒，将酶切片段相连，得到pMAD-△A；
将对6-甲基辛酸、6-甲基庚酸强特异性识别的缩合结构域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的上游500 bp同源臂基因与CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的下游500 bp同源臂基因通过重叠延伸PCR的方法相连得到的片段，通过BamH I与Sal I双酶切连接到载体pGEMT-Easy获得载体pT-C，通过BamH I与Sal I双酶切pT-C与pMAD质粒，将酶切片段相连， 得到pMAD-△C；
所述对亮氨酸特异性的腺苷酸活化结构域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的上游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7结构域的下游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；
所述对6-甲基辛酸、6-甲基庚酸强特异性识别的缩合结构域基因的核苷酸序列如SEQID NO.4 所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的上游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1结构域的下游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示；
（2）菌种构建：将pMAD-△A转化CJX518，通过抗生素和蓝白斑筛选得到转化成功的菌株，再42-45℃ 培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR 测序验证为结构域替换菌株518-A；
再将pMAD-△C转化所述结构域替换菌株518-A，通过抗生素和蓝白斑筛选得到转化成功的菌株，再42-45℃ 培养传代得到质粒丢失菌株，通过PCR 测序验证为结构域替换菌株518-AC；
（3）种子培养：将结构域替换菌株518-AC在种子培养基中培养，得到一级种子；将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子；
（4）多粘菌素B生产：将步骤（3）获得的二级种子按初始OD600为0.2的接种量接入发酵培养基中，在转速为180-250 rpm，温度为28-37℃条件下摇瓶发酵72小时。
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