CN103923190B - 从多黏菌素b的混合组分中分离纯化多黏菌素b1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从多黏菌素B的混合组分中分离纯化多黏菌素B1的方法，包括如下步骤：(a)将大孔型吸附树脂的层析介质装成层析柱；(b)将多黏菌素B溶液上样，用含有机溶剂的酸性溶液作为洗脱液，把多黏菌素B的各组分依次洗脱下来，获得多黏菌素B1洗脱液。本发明方法操作简单，所用分离介质化学性质稳定，重复使用率高，易于工业放大，得到的多黏菌素B1的峰纯度可达98％以上。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及从多黏菌素B的混合组分中分离纯化单组份多黏菌素B1的方法。
背景技术
多黏菌素B(polymyxin B，其结构通式见下式I)是由多黏芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)产生的一种由多种氨基酸和脂肪酸组成的碱性环多肽类抗生素。多黏菌素B的药用形式为多黏菌素B的硫酸盐及其与其他药物的复方制剂，临床上主要作为抗感染类药物使用，治疗由绿脓杆菌等革兰氏阴性菌引起的皮肤创面、泌尿系统以及眼、耳、气管等部位感染，也可用于败血症、腹膜炎等。多黏菌素B是结构相似的多组分混合物，现已发现的组分共有七种，分别是B1、B1-I、B2、B3、B4、B5和B6(结构通式见式1)，各组分的X(第3位)，Y(第6位)的氨基酸残基相同，分别是DAB和D-苯丙氨酸；R(脂肪酸链)和Z(第7位)的差异见表1。
式1：多黏菌素B结构通式
表1：多黏菌素B各组分差异
早期关于多黏菌素的毒副作用的报道相对较多从而限制了其使用。近年来，多重耐药革兰氏阴性菌所致的重症感染日渐增多，但却缺乏能对抗这种感染的新型抗生素，这促使人们对临床上曾经应用过的多黏菌素类抗生素进行了重新的评价。市售的硫酸多黏菌素B药物一般是多黏菌素B1、B2、B1-I和B3这四种组分的混合物，因各组分结构相近，单一组分获得很困难。
目前，对多黏菌素B的各单组分进行分离与制备，并进行结构改造，研究各组分及其衍生物的抗菌活性、毒性及代谢动力学，对于降低多黏菌素B的毒性，提高用药安全性，扩大其临床应用，具有重要的意义。因此，建立一种工艺简单的分离纯化多黏菌素B单一组分的方法非常有必要。
多黏菌素B1是多黏菌素B的最主要组分，关于多黏菌素B1分离纯化方法研究的文献报道如下：W.Hausmann等最早尝试用逆流分布法来分离多黏菌素B各组分，但分离效果较差(参见W.Hausmann等，Polymyxin B1.1Fractionation，Molecular WeightDetermination，AminoAcid and Fatty Acid Composition.Journal of the AmericanChemicalsociety，1954，76(19)：4892-4896)；H.Kalasz等采用置换色谱法，以分析型色谱柱LiChrosorb RP-18(5μm，250×4.6mm I.D.)为固定相，使B1和B2得到了分离，但仅能制备微量的多黏菌素B1(参见H.Kalasz等，Preparative-scale separation of polymyxinswith an analytical high-performance liquid chromatography system by usingdisplacementchromatography.Journal of Chromatography A，1981，251：295-302)；Y.Kimura等则用Hitachi凝胶3010(粒径25μm)和Amberlite XAD-2(100-200目)为填料，采用线性梯度洗脱，使B 1和B2得到有效分离(参见Y.Kimura等，Analytical andpreparative methods for polymyxinantibiotics using high-performance liquidchromatography with a porousstyrene-divinyllbenzene copolymer packing.JournalofChromatographyA，1981，206：563-572)；I.Elverdam等采用反向硅胶柱LiChrosorbSi100ODS(10μm，250×40mm I.D.)，以等度洗脱法，对多黏菌素B单组分进行了分离(参见I.Elverdam等，Isolation and characterization of three newpolymyxins inpolymyxins B and E by high-performance liquidchromatography.Journal ofChromatography A，1981，218：653-661)；国内的何凤云等也采用了反相硅胶YMC C18-ODS-A(C18键合硅胶，5μm，150mm×30mm)的制备柱，以含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(21/79，V/V)为流动相，制备多黏菌素B1，但其单批制备量也较低，平均每毫升填料的载样量为1.1mg(参见何凤云等.多黏菌素B中多黏菌素B1的制备方法研究.化工时刊，2011，25(8)：20-22)。
通过上述方法分离纯化多黏菌素B1存在如下缺点：采用逆流分布法，分离效果较差；采用C18反相色谱法、C18反相置换色谱法以及凝胶色谱联合大孔吸附树脂法分离，对设备要求较高，分离介质的稳定性较差，重复使用次数少，且成本较高。总之，上述方法均不易于规模化的制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、易于工业放大的分离纯化多黏菌素B1的方法，该方法利用常规的大孔吸附树脂柱层析法将多黏菌素B1从多黏菌素B混合组分中分离出来，所用分离介质化学性质稳定、重复使用率高，得到的多黏菌素B1的峰纯度可达98％以上。
本发明提供的多黏菌素B1分离纯化方法中，所述的多黏菌素B可为市售品(如：盐城市优化医药化工科技有限公司，20101118)，也可从多黏菌素B的发酵液中提取的多黏菌素B产品(如通过专利201110385129.5实施例1所述的方法制备得到)。
本发明提供一种从多黏菌素B的混合组分中分离纯化多黏菌素B1的方法，包括如下步骤：
(a)将大孔型吸附树脂的层析介质装成层析柱；
(b)将多黏菌素B溶液上样，用含有机溶剂的酸性水溶液作为洗脱液，把多黏菌素B的各组分依次洗脱下来，获得多黏菌素B1的洗脱液。
根据本发明一个优选的实施方式，步骤(a)中所述的大孔型吸附树脂的层析介质为以聚苯乙烯/二乙烯苯或聚丙烯酸酯为骨架的小颗粒反相层析介质。
根据本发明一个优选的实施方式，所述小颗粒反相层析介质的粒径小于或等于120μm。
根据本发明另一个优选的实施方式，步骤(a)还包括在上样前先用洗脱液将层析柱平衡。
根据本发明一个优选的实施方式，步骤(b)中使用的有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮，优选乙腈。
根据本发明另一个优选的实施方式，步骤(b)中使用的有机溶剂的浓度为1-50％(V/V)，优选5-15％(V/V)。
根据本发明一个优选的实施方式，步骤(b)中使用的酸性水溶液的pH为1.0-5.0，优选pH2.0-3.0。
根据本发明另一个优选的实施方式，调节步骤(b)中使用的含有有机溶剂的酸性水溶液的pH所用的酸为H2SO4、HCl、H3PO4、三氟乙酸、醋酸或甲酸，优选醋酸或甲酸，更优的为甲酸。
根据本发明一个优选的实施方式，该分离纯化方法过程中所采用的色谱分析法为欧洲药典7.0所规定的液相分析法，峰纯度是按照面积归一法去除溶剂峰后计算得来。
根据本发明另一个优选的实施方式，步骤(b)中获得的多黏菌素B1洗脱液用色谱分析法进行测定，收集多黏菌素B1峰纯度大于98％的部分。
附图说明
图1为实施例1获得的多黏菌素B1的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这些实施例的范围。
实施例1-8中的硫酸多黏菌素B样品购自盐城市优化医药化工科技有限公司。
实施例1：
取硫酸多黏菌素B样品，加水溶解配置成50mg/ml的水溶液。
装PS30-300(苏州纳微生物科技有限公司，粒径为30μm)层析柱床30ml，用含8％乙腈(V/V)的酸性水溶液(甲酸调pH2.3)平衡3倍柱体积后，取10ml样品上柱，再用含8％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH2.3)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，收集多黏菌素B1峰纯度大于98％的部分，得到的多黏菌素B1纯度为99.2％，收率为63％。
实施例2：
取硫酸多黏菌素B样品，加水溶解配置成10mg/ml的水溶液。
装PS25-300(苏州纳微生物科技有限公司，粒径为25μm)层析柱床30ml，用含9％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH2.0)平衡3倍柱体积后，取30ml样品上柱，再用含9％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH2.0)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，收集多黏菌素B1峰纯度大于98％的部分，得到的多黏菌素B1纯度为99.5％，收率为60％。
实施例3：
取硫酸多黏菌素B样品，加水溶解配置成100mg/ml的水溶液。
装PS30-300层析柱床30ml，用含15％乙醇的酸性水溶液(甲酸调pH2.3)平衡3倍柱体积后，取3ml样品上柱，再用含15％乙醇(V/V)酸性水溶液(甲酸调pH2.3)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，收集多黏菌素B 1峰纯度大于98％的部分，得到的多黏菌素B1纯度为98.6％，收率为45％。
实施例4：
取硫酸多黏菌素B样品，加水溶解配置成100mg/ml的水溶液。
装PMM40-500(苏州纳微生物科技有限公司，粒径为40μm)层析柱床30ml，用含5％的乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH2.3)平衡3倍柱体积后，取3ml样品上柱，再用含5％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH2.3)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，收集多黏菌素B1峰纯度大于98％的部分，得到的多黏菌素B1纯度为98.3％，收率为30％。
实施例5：
取硫酸多黏菌素B样品，加水溶解配置成60mg/ml的水溶液。
装XT20(陶氏化学，粒径为20μm)层析柱床30ml，用含45％异丙醇的酸性水溶液(硫酸调pH2.3)平衡3倍柱体积后，取5ml样品上柱，再用含45％异丙醇的酸性水溶液(硫酸调pH2.3)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，收集多黏菌素B1峰纯度大于98％的部分，得到的多黏菌素B1纯度为98.5％，收率为40％。
实施例6：
取硫酸多黏菌素B样品，加水溶解配置成100mg/ml的水溶液。
装PS30-300层析柱床30ml，用含10％乙腈的酸性水溶液(醋酸调pH2.3)平衡3倍柱体积后，取3ml样品上柱，再用含10％乙腈的酸性水溶液(醋酸调pH2.3)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，收集多黏菌素B1峰纯度大于98％的部分，得到的多黏菌素B1纯度为99.2％，收率为56％。
实施例7：
取硫酸多黏菌素B样品，加水溶解配置成100mg/ml的水溶液。
装PS30-300层析柱床30ml，用含8％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH3.0)平衡3倍柱体积后，取4.5ml样品上柱，再用含8％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH3.0)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，得到的多黏菌素B1纯度为98.1％，收率为43％。
实施例8：
取硫酸多黏菌素B样品，加水溶解配置成100mg/ml的水溶液。
装CG161(陶氏化学，粒径为120μm)层析柱床30ml，用含8％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH2.3)平衡3倍柱体积后，取2ml样品上柱，再用含8％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH2.3)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，收集多黏菌素B1峰纯度大于98％的部分，得到的多黏菌素B1纯度为98.2％，收率为25％。
实施例9：
按照201110385129.5实施例1所述的方法制备得到纯度为86.4％的硫酸多黏菌素B粉末560mg，加水溶解配置成50mg/ml的水溶液。
装PS30-300层析柱床30ml，用含8％乙腈(V/V)的酸性水溶液(甲酸调pH2.3)平衡3倍柱体积后，取10ml样品上柱，再用含8％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH2.3)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，收集多黏菌素B1峰纯度大于98％的部分，得到的多黏菌素B1纯度为99.6％，收率为59％。
实施例10：
按照201110385129.5实施例1所述的方法制备得到纯度为83.4％的硫酸多黏菌素B粉末515mg，加水溶解配置成50mg/ml的水溶液。
装PS30-300层析柱床30ml，用含8％乙腈(V/V)的酸性水溶液(甲酸调pH4.3)平衡3倍柱体积后，取10ml样品上柱，再用含8％乙腈的酸性水溶液(甲酸调pH4.3)洗脱，洗脱液经HPLC分析后，得到的多黏菌素B1纯度为98.3％，收率为31％。
Claims (5)
1.从多黏菌素B的混合组分中分离纯化多黏菌素B1的方法，包括如下步骤：
(a)将大孔型吸附树脂的层析介质装成层析柱，其中大孔型吸附树脂的层析介质为以聚苯乙烯/二乙烯苯或聚丙烯酸酯为骨架的小颗粒反相层析介质，且所述小颗粒反相层析介质的粒径为20-120μm，其中所述大孔型吸附树脂选自PS30-300或PS25-300；
(b)将多黏菌素B溶液上样，用含有机溶剂的酸性水溶液作为洗脱液，把多黏菌素B的各组分依次洗脱下来，获得多黏菌素B1的洗脱液，其中所述有机溶剂选自乙腈、乙醇或异丙醇，且有机溶剂的浓度为5-15％(V/V)；和其中所述酸性水溶液选自H2SO4、醋酸或甲酸，且所述酸性水溶液的pH为2.0-3.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(a)还包括在上样前先用洗脱液将层析柱平衡。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(b)的洗脱过程中，采用色谱分析法对各组分浓度进行测定。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述色谱分析法为欧洲药典7.0所规定的液相分析法。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)中获得的多黏菌素B1洗脱液用色谱分析法进行测定，收集多黏菌素B1峰纯度大于98％的部分。
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