CN113265393A - 一种选育多粘菌素e低耗糖菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药技术领域,具体涉及一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法,包括以下步骤:A、ARTP诱变菌株保藏,B、验证并确定低耗糖菌株,C、选育验证,D、遗传性检测;利用此方案得到的新菌株对碳源的利用量更低,可以直接降低生产成本,带来直接的经济效益;且获得的菌株在发酵中剩余的残糖量更低,可以一定程度上缓解三废处理的压力,本方法获得的菌种具有遗传稳定性,可供给大规模生产使用。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域,具体涉及一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法。
背景技术
硫酸粘杆菌素(Colistin Sulfate)又名粘杆菌素、抗敌素、多粘菌素E,是从多粘芽胞杆菌变种(Bacillus polymyxa var.colistimus)的培养液中提取的一种碱性多肽类抗生素。近十几年来,由于药物残留和耐药问题对人类产生的潜在危害日益突出,发达国家相继禁用了若干种饲用抗生素。硫酸粘杆菌素因内服胃肠道不易吸收,不易产生耐药性,对革兰氏阴性菌,如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、绿脓杆菌等有强大的抗菌作用而引起畜牧兽医工作者的关注。美国和欧盟将其批准作为兽药使用,在日本还被用作饲料添加剂。我国在20世纪90年代末由山东鲁抗医药集团成功研制了硫酸粘杆菌素及其制剂,并于2002年被农业部批准为国家三类新兽药。
尽管基因工程技术已经开始用于工业生产高产菌株的构建,但是物理、化学诱变因子如紫外线、高频电子流、亚硝基胍等仍然是遗传育种不可或缺的手段。为了提高诱变后高产菌株的筛选效率,人们设计了各种筛选方案,如川氏设计了琼脂块法,Elander RP.等人提出利用前体及结构类似物抗性的筛选方法,它们在菌种选育中取得了较好的效果。周希贵、戴鹏高等公开了一种“粘杆菌素高产菌株的选育”方法(中国知网),用亚硝基胍对多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)AS1 5 4 1进行诱变,采用其自身次生代谢产物粘杆菌素进行筛选时正突变率为32.3%。目前进行的相关研究多是围绕提高效价为目的,但是随着环境管理的升级,危废的安全治理,生产成本的增加,成为企业生存的命脉,成本的节降成为目前大多数企业解决的头等大事。
发明内容
本发明为了解决上述现有技术中存在的问题,针对影响粘菌素生产成本最大的关键因素-碳源的用量,进行了根本性的解决,提供了一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法,提不仅提高了效价,降低了碳源的使用量,而且残糖的降低,直接减少了对尾废治理的压力。
本发明采用的具体技术方案是:一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法,关键是,包括以下步骤:
A、ARTP诱变菌株保藏
1)、将生产使用的多粘菌素E菌种接种活化瓶进行培养
所用活化培养基成分为(g/L):酵母粉30.0g,麦芽提取物30.0g,氯化钠5g,培养基pH7.0-7.2;
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期16h;
2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心,倒出上清液,加入10%甘油溶液混匀再次离心,倒出上清液后,加入5mL10%甘油溶液,摇匀成孢子悬液,使孢子浓度达到107-108;进行ARTP诱变,得到诱变菌株,
所用10%甘油溶液的配制方法(mL/L):量取100mL甘油,纯化水定容到1000mL摇匀;
3)、将2)中的诱变菌株稀释分离到平板培养基上进行培养,
平板培养基成分为(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨15.0,酵母粉2.0,氯化钠3.0,琼脂20.0,培养基pH7.0-7.2;培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期48h;
4)、在3)中挑选单菌落,大小适中,颜色阴白,接种到活化瓶培养基中,活化培养基及培养条件同1),得到成熟的活化液种子;
5)、将4)中活化液和40%甘油1:1混合,得到终浓度20%的混合液;
40%甘油溶液的配制方法(mL/L):量取400mL甘油,纯化水定容到1000mL即可;
6)、将5)混匀的20%甘油浓度的活化培养液分装,在-80℃超低温冰箱中进行保藏为活化冻存液;
B、验证并确定低耗糖菌株
7)、将6)中保藏的活化冻存液接种到Z培养基中,进行培养,
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L):淀粉90.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养96-120h;
8)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D2和Z培养基中,进行培养,
所用发酵瓶D2培养基成分及配比为(g/L):淀粉54.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h;
9)、将8)中培养到周期的发酵液接种到Z培养基中,进行考察,
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L):同7);
10)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D1、D2、D3和Z培养基中,进行培养,
所用发酵瓶D1培养基成分及配比为(g/L):淀粉72.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4;
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h;
所用发酵瓶D2培养基成分及配比及培养条件:同8)
所用发酵瓶D3培养基成分及配比为(g/L):淀粉27.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h;
11)、将10)中生长到周期的D3进行稀释分离并接种Z培养基进行验证,
平板培养基成分为(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨15.0,酵母粉2.0,氯化钠3..0,琼脂20.0;培养基pH7.0-7.2,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期48h;
所用发酵瓶Z培养基及培养条件:同7);
12)、在11)中挑选单菌落,大小适中,颜色阴白,接种到活化瓶培养基中,活化培养基及培养条件同1),得到成熟的活化液种子;
13)、将12)中活化液和40%甘油1:1混合,得到终浓度20%的混合液;
14)、将13)混匀的20%甘油浓度的活化培养液分装,在-80℃超低温冰箱中进行保藏;
15)、将11)中培养到周期的发酵液使用液相色谱法检测效价,使用甲醛法检测残糖;
16)、根据15)中检测结果确定低耗糖菌株;
C、选育验证
17)、将16)中确定的低耗糖菌株进行自然分离到平板培养基上进行培养,
平板培养基及培养条件同11);
18)、在17)中挑选单菌落,大小适中,颜色阴白,接种到活化瓶培养基中,生长16h后得到活化液;
19)、将18)中的活化液接种Z发酵瓶,所用发酵瓶Z培养基及培养条件同7);
20)、对19)中使用液相色谱法检测效价,使用甲醛法检测残糖。
优选的,还包括步骤D、遗传性检测
21)、将16)中验证确定的低耗糖的菌株冻存液接种活化瓶,
活化瓶培养基及培养条件同1)
22)、对21)中活化瓶接种发酵瓶Z1培养基
所用发酵瓶Z1培养基成分及配比为(g/L):淀粉70.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4;
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养96-120h;
23)、将22)中的发酵瓶使用液相色谱法检测效价,考察菌种的遗传特性。
一种多粘菌素E低耗糖菌株,菌株的名称为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa),SD-1908,该菌株保藏在CGMCC,保藏编号为CGMCC NO.21363,保藏日期为2020年12月14日。
本发明的有益效果是:以生产中使用的多粘菌素E菌种为出发菌株,首先采用ARTP诱变,然后接种到逐步降低碳源含量的发酵瓶中,经过3次转接之后,分离单菌落,选取生长正常的单菌落进行保存。并且经过验证发现,经过降低碳源诱导的菌株普遍具有明显的耗糖低的特点,而且能够更充分的利用培养基里的碳源。经过自然分离,确定本方案获得的低耗糖菌株具有遗传稳定性,可以满足大生产长期稳定使用的要求。
产生相同效价的情况下,本发明的新菌株对碳源的利用量更低,可以直接降低生产成本,带来直接的经济效益。本发明的另一个有益效果是,获得的菌株在发酵中剩余的残糖量更低,可以一定程度上缓解三废处理的压力,本方法获得的菌种具有遗传稳定性,可供给大规模生产使用。
附图说明
图1为本发明生产流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明:
实施例1:
ARTP诱变
1)、将生产使用的多粘菌素E菌种SC1605接种活化瓶进行培养
所用活化培养基成分为(g/L):酵母粉30.0g,麦芽提取物30.0g,氯化钠5g,培养基pH7.0-7.2;
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期16h。
2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心,倒出上清液,加入10%甘油溶液混匀再次离心,倒出上清液后,加入5mL10%甘油溶液,摇匀成孢子悬液,使孢子浓度达到107-108。在无菌条件下,滴加到诱变使用的无菌铁片上,进行ARTP诱变,以高纯氦气作为气源,处理功率80W,气流量10SLM(standardliterperminute),等离子体发射源与样品之间的距离为3mm,照射时间为30s、45s、60s、80s。
所用10%甘油溶液的配制方法(mL/L):量取100mL甘油,纯化水定容到1000mL摇匀即可。
3)、诱变液分离到平板培养基上,获得单菌落,
平板培养基成分为(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨15.0,酵母粉2.0,氯化钠3.0,琼脂20.0;培养基pH7.0-7.2,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期48h。
4)、在3)中挑选大小适中,颜色阴白单菌落,接种到活化瓶培养基中,活化瓶培养基及培养条件同1)得到成熟的活化液种子。
5)、将4)中活化液和40%甘油1:1混合,得到终浓度20%的混合液,
所用40%甘油溶液的配制方法(mL/L):量取400mL甘油,纯化水定容到1000mL混匀,121℃湿热灭菌30分钟。
6)、将5)中混合均匀甘油活化液分装1mL/2mL冻存管中,在-80℃超低温冰箱中进行保藏,为活化冻存液。
实施例2:
1)、将实施例1里面6)中保藏的活化冻存液接种到Z培养基中,
所用发酵瓶基础培养基(Z)成分及配比为(g/L):淀粉90.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养96-120h。
2)、将1)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价,使用甲醛法进行残糖检测。
表1:ARTP诱变获得菌株在Z培养基上的效价及残糖数据。
如表1可见,经过ARTP诱变后的菌种耗糖和出发菌株持平,效价普遍高于出发菌株。
实施例3:
1)、将实施例1里面6)中保藏的活化冻存液接种到D2培养基中,
所用D2发酵瓶培养基成分及配比为(g/L):淀粉54,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
D2培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h。
2)、将1)中生长到周期的D2发酵液接种Z培养基,
所用发酵瓶基础培养基(Z)成分及配比为(g/L):淀粉90.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养96-120h。
3)、将2)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价,使用甲醛法进行残糖检测。
表2:ARTP诱变获得菌株进行D2低糖诱导的菌株在Z培养基上的效价及残糖数据。
如表2可见,经过ARTP诱变和碳源降低一半左右的低碳源诱导后的菌种,耗糖普遍有下降的趋势,耗糖量低于出发菌株,效价也优于出发菌株。
实施例4:
1)、将实施例1里面6)中保藏的活化冻存液接种到D1培养基中,
所用D1发酵瓶培养基成分及配比为(g/L):淀粉72,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
D1培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h。
2)、将1)中长好的发酵液接种D2培养基中,
所用D2发酵瓶培养基成分及配比为(g/L):淀粉54,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
D2培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h。
3)、将2)中长好的发酵液接种到D3培养基中
所用D3发酵瓶培养基成分及配比为(g/L):淀粉27,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
D3培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h。
4)、将3)中生长到周期的D3进行稀释分离,得到单菌落,
所用平板培养基成分为(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨15.0,酵母粉2.0,氯化钠3.0,琼脂20.0;培养基pH7.0-7.2,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期48h。
5)、在4)中挑选单菌落,大小适中,颜色阴白,接种到活化瓶培养基中,
所用活化培养基成分为(g/L):酵母粉30.0g,麦芽提取物30.0g,氯化钠5g,培养基pH7.0-7.2;
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期16h。
6)、将5)中活化液和40%甘油1:1混合,得到终浓度20%的混合液,
所用40%甘油溶液的配制方法(mL/L):量取400mL甘油,纯化水定容到1000mL混匀,121℃湿热灭菌30分钟。
7)将6)中混合均匀甘油活化液分装1mL/2mL冻存管中,在-80℃超低温冰箱中进行保藏,为活化冻存液。
8)、在菌种保藏的同时,将5)中的活化液接种Z发酵瓶中,
所用发酵瓶基础培养基(Z)成分及配比为(g/L):淀粉90.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养96-120h。
9)、将8)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价,使用甲醛法进行残糖检测。
表3A:RTP诱变获得菌株进行3级低糖诱导后菌株在Z培养基上的效价及残糖数据。
如表3所示,经过ARTP诱变和3次逐级降低碳源诱导后得到的菌种耗糖普遍低于对照,其中编号“3”的菌株最优,进行专利菌株保藏,专利菌种保藏号为SD-1908菌株,效价高出对照7.19%,耗糖低于对照17.34%,判定为低耗糖特性菌株。
实施例5:
1)、将SD-1908菌株自然分离,考察遗传稳定性,接种活化瓶进行培养
所用活化培养基成分为(g/L):酵母粉30.0g,麦芽提取物30.0g,氯化钠5g;培养基pH7.0-7.2。
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期16h。
2)、将1)中生长到周期的活化液进行稀释分离,得到单菌落,
所用平板培养基成分为(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨15.0,酵母粉2.0,氯化钠3.0,琼脂20.0;培养基pH7.0-7.2,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期48h。
3)、在2)中挑选单菌落,大小适中,颜色阴白,接种到活化瓶培养基中,培养基和培养条件同1)
4)、将3)中的活化液接种Z发酵瓶中。
所用发酵瓶基础培养基(Z)成分及配比为(g/L):淀粉90.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养96-120h。
5)、将4)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价,使用甲醛法进行残糖检测,确定SD-1908菌株的遗传稳定性。
表4:低耗糖菌株分离后与出发菌株在Z培养基上的考察的效价及残糖结果。
随机菌株 | 分离1 | 分离2 | 分离3 | 分离平均 | SD-1908 | SC1605 |
诱变实验发酵结果(万u/mL) | 50.8 | 49.8 | 49.8 | 50.1 | 50.6 | 47.9 |
残糖(g/100mL) | 2.37 | 2.45 | 2.61 | 2.34 | 2.57 | 1.31 |
耗糖量(g/100mL) | 6.63 | 6.55 | 6.39 | 6.52 | 6.43 | 7.69 |
效价高出对照% | 6.07 | 3.89 | 4.00 | 4.65 | 5.74 | / |
耗糖高于对照% | -13.78 | -14.82 | -16.91 | -15.17 | -16.38 | / |
如表4所示,低耗糖菌株进行分离后仍然保持了低耗糖的特点,和低耗糖出发菌株特点一致,比诱变前出发菌株效价平均高出4.65%,耗糖平均低于对照15.17%;专利菌株SD-1908效价高出对照5.74%,耗糖低于对照16.38%。
对获得的低耗糖特性菌株SD-1908进行了专利菌株保藏。专利菌株保藏号:21363
实施例6:
1)、将保藏的SD-1908活化冻存液接种活化瓶,所用活化培养基成分为(g/L):酵母粉30.0g,麦芽提取物30.0g,氯化钠5g,琼脂20.0;培养基pH7.0-7.2,培养条件:培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期16h。
2)、将1)中成熟活化瓶和实施例5中3)中的活化液接种到Z1发酵瓶,所用Z1发酵瓶培养基成分及配比为(g/L):淀粉70,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,Z1培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养96-120h。
3)将2)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价,使用甲醛法进行残糖检测。
表5:低耗糖菌株分离后与出发菌株在Z1培养基上的考察的效价及残糖结果。
随机菌株 | 分离1 | 分离2 | 分离3 | 分离平均 | SD-1908 | SC1605 |
诱变实验发酵结果(万u/mL) | 52.9 | 52.5 | 53.757 | 53.0 | 53.4 | 48.8 |
残糖(g/100mL) | 0.20 | 0.23 | 0.21 | 0.21 | 0.21 | 0.43 |
效价高出对照% | 8.38 | 7.49 | 10.16 | 8.67 | 9.49 | / |
如表5所示,使用Z1培养基进行验证,结果表明:(1)降低碳源加量后,筛选得到的菌株效价与原配方持平偏高,即显著降低了生产成本;(2)降低碳源加量后,筛选得到的菌株几乎耗尽了所有的碳源,残糖为0.21g/100mL,比出发菌株更低,这可以降低废液的处理难度,节降废水处理的成本。
综上所述,可知本发明的新菌株对碳源的利用量更低,可以直接降低生产成本,带来直接的经济效益。且获得的菌株在发酵中剩余的残糖量更低,可以一定程度上缓解三废处理的压力,本方法获得的菌种具有遗传稳定性,可供给大规模生产使用。
Claims (3)
1.一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、ARTP诱变菌株保藏
1)、将生产使用的多粘菌素E菌种接种活化瓶进行培养
所用活化培养基成分为(g/L):酵母粉30.0g,麦芽提取物30.0g,氯化钠5g,培养基pH7.0-7.2;
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期16h;
2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心,倒出上清液,加入10%甘油溶液混匀再次离心,倒出上清液后,加入5mL10%甘油溶液,摇匀成孢子悬液,使孢子浓度达到107-108;进行ARTP诱变,得到诱变菌株,
所用10%甘油溶液的配制方法(mL/L):量取100mL甘油,纯化水定容到1000mL摇匀;
3)、将2)中的诱变菌株稀释分离到平板培养基上进行培养,
平板培养基成分为(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨15.0,酵母粉2.0,氯化钠3.0,琼脂20.0,培养基pH7.0-7.2;培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期48h;
4)、在3)中挑选单菌落,大小适中,颜色阴白,接种到活化瓶培养基中,活化培养基及培养条件同1),得到成熟的活化液种子;
5)、将4)中活化液和40%甘油1:1混合,得到终浓度20%的混合液;
40%甘油溶液的配制方法(mL/L):量取400mL甘油,纯化水定容到1000mL即可;
6)、将5)混匀的20%甘油浓度的活化培养液分装,在-80℃超低温冰箱中进行保藏为活化冻存液;
B、验证并确定低耗糖菌株
7)、将6)中保藏的活化冻存液接种到Z培养基中,进行培养,
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L):淀粉90.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养96-120h;
8)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D2和Z培养基中,进行培养,
所用发酵瓶D2培养基成分及配比为(g/L):淀粉54.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h;
9)、将8)中培养到周期的发酵液接种到Z培养基中,进行考察,
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L):同7);
10)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D1、D2、D3和Z培养基中,进行培养,
所用发酵瓶D1培养基成分及配比为(g/L):淀粉72.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4;
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h;
所用发酵瓶D2培养基成分及配比及培养条件:同8)
所用发酵瓶D3培养基成分及配比为(g/L):淀粉27.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4,
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养18-22h;
11)、将10)中生长到周期的D3进行稀释分离并接种Z培养基进行验证,
平板培养基成分为(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨15.0,酵母粉2.0,氯化钠3..0,琼脂20.0;培养基pH7.0-7.2,培养温度30.0℃-32.0℃,培养周期48h;
所用发酵瓶Z培养基及培养条件:同7);
12)、在11)中挑选单菌落,大小适中,颜色阴白,接种到活化瓶培养基中,活化培养基及培养条件同1),得到成熟的活化液种子;
13)、将12)中活化液和40%甘油1:1混合,得到终浓度20%的混合液;
14)、将13)混匀的20%甘油浓度的活化培养液分装,在-80℃超低温冰箱中进行保藏;
15)、将11)中培养到周期的发酵液使用液相色谱法检测效价,使用甲醛法检测残糖;
16)、根据15)中检测结果确定低耗糖菌株;
C、选育验证
17)、将16)中确定的低耗糖菌株进行自然分离到平板培养基上进行培养,
平板培养基及培养条件同11);
18)、在17)中挑选单菌落,大小适中,颜色阴白,接种到活化瓶培养基中,生长16h后得到活化液;
19)、将18)中的活化液接种Z发酵瓶,所用发酵瓶Z培养基及培养条件同7);
20)、对19)中使用液相色谱法检测效价,使用甲醛法检测残糖。
2.根据权利要求1所述的一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法,其特征在于,还包括步骤D、遗传性检测:
21)、将16)中验证确定的低耗糖的菌株冻存液接种活化瓶,
活化瓶培养基及培养条件同1)
22)、对21)中活化瓶接种发酵瓶Z1培养基
所用发酵瓶Z1培养基成分及配比为(g/L):淀粉70.0,黄豆饼粉20.0,碳酸钙14.0,硫酸铵20.0,磷酸二氢钾1.2,淀粉酶0.05,大豆油10.0,pH7.2-7.4;
培养条件:摇床振幅5cm,转速为200-220rpm,温度30.0-32.0℃,周期培养96-120h;
23)、将22)中的发酵瓶使用液相色谱法检测效价,考察菌种的遗传特性。
3.一种多粘菌素E低耗糖菌株,其特征在于,菌株的名称为多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa),SD-1908,该菌株保藏在CGMCC,保藏编号为CGMCC NO.21363,保藏日期为2020年12月14日。
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