CN113265393A - 一种选育多粘菌素e低耗糖菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，包括以下步骤：A、ARTP诱变菌株保藏，B、验证并确定低耗糖菌株，C、选育验证，D、遗传性检测；利用此方案得到的新菌株对碳源的利用量更低，可以直接降低生产成本，带来直接的经济效益；且获得的菌株在发酵中剩余的残糖量更低，可以一定程度上缓解三废处理的压力，本方法获得的菌种具有遗传稳定性，可供给大规模生产使用。

Description

一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法。
背景技术
硫酸粘杆菌素(Colistin Sulfate)又名粘杆菌素、抗敌素、多粘菌素E，是从多粘芽胞杆菌变种(Bacillus polymyxa var.colistimus)的培养液中提取的一种碱性多肽类抗生素。近十几年来，由于药物残留和耐药问题对人类产生的潜在危害日益突出，发达国家相继禁用了若干种饲用抗生素。硫酸粘杆菌素因内服胃肠道不易吸收，不易产生耐药性，对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、绿脓杆菌等有强大的抗菌作用而引起畜牧兽医工作者的关注。美国和欧盟将其批准作为兽药使用，在日本还被用作饲料添加剂。我国在20世纪90年代末由山东鲁抗医药集团成功研制了硫酸粘杆菌素及其制剂，并于2002年被农业部批准为国家三类新兽药。
尽管基因工程技术已经开始用于工业生产高产菌株的构建，但是物理、化学诱变因子如紫外线、高频电子流、亚硝基胍等仍然是遗传育种不可或缺的手段。为了提高诱变后高产菌株的筛选效率，人们设计了各种筛选方案，如川氏设计了琼脂块法，Elander RP.等人提出利用前体及结构类似物抗性的筛选方法，它们在菌种选育中取得了较好的效果。周希贵、戴鹏高等公开了一种“粘杆菌素高产菌株的选育”方法(中国知网)，用亚硝基胍对多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)AS1 5 4 1进行诱变，采用其自身次生代谢产物粘杆菌素进行筛选时正突变率为32.3％。目前进行的相关研究多是围绕提高效价为目的，但是随着环境管理的升级，危废的安全治理，生产成本的增加，成为企业生存的命脉，成本的节降成为目前大多数企业解决的头等大事。
发明内容
本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，针对影响粘菌素生产成本最大的关键因素-碳源的用量，进行了根本性的解决，提供了一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，提不仅提高了效价，降低了碳源的使用量，而且残糖的降低，直接减少了对尾废治理的压力。
本发明采用的具体技术方案是：一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，关键是，包括以下步骤：
A、ARTP诱变菌株保藏
1)、将生产使用的多粘菌素E菌种接种活化瓶进行培养
所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g，培养基pH7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h；
2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心，倒出上清液，加入10％甘油溶液混匀再次离心，倒出上清液后，加入5mL10％甘油溶液，摇匀成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108；进行ARTP诱变，得到诱变菌株，
所用10％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取100mL甘油，纯化水定容到1000mL摇匀；
3)、将2)中的诱变菌株稀释分离到平板培养基上进行培养，
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3.0，琼脂20.0，培养基pH7.0-7.2；培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h；
4)、在3)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，活化培养基及培养条件同1)，得到成熟的活化液种子；
5)、将4)中活化液和40％甘油1:1混合，得到终浓度20％的混合液；
40％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取400mL甘油，纯化水定容到1000mL即可；
6)、将5)混匀的20％甘油浓度的活化培养液分装，在-80℃超低温冰箱中进行保藏为活化冻存液；
B、验证并确定低耗糖菌株
7)、将6)中保藏的活化冻存液接种到Z培养基中，进行培养，
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L)：淀粉90.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h；
8)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D2和Z培养基中，进行培养，
所用发酵瓶D2培养基成分及配比为(g/L)：淀粉54.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；
9)、将8)中培养到周期的发酵液接种到Z培养基中，进行考察，
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L)：同7)；
10)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D1、D2、D3和Z培养基中，进行培养，
所用发酵瓶D1培养基成分及配比为(g/L)：淀粉72.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；
所用发酵瓶D2培养基成分及配比及培养条件：同8)
所用发酵瓶D3培养基成分及配比为(g/L)：淀粉27.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；
11)、将10)中生长到周期的D3进行稀释分离并接种Z培养基进行验证，
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3..0，琼脂20.0；培养基pH7.0-7.2，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h；
所用发酵瓶Z培养基及培养条件：同7)；
12)、在11)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，活化培养基及培养条件同1)，得到成熟的活化液种子；
13)、将12)中活化液和40％甘油1:1混合，得到终浓度20％的混合液；
14)、将13)混匀的20％甘油浓度的活化培养液分装，在-80℃超低温冰箱中进行保藏；
15)、将11)中培养到周期的发酵液使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法检测残糖；
16)、根据15)中检测结果确定低耗糖菌株；
C、选育验证
17)、将16)中确定的低耗糖菌株进行自然分离到平板培养基上进行培养，
平板培养基及培养条件同11)；
18)、在17)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，生长16h后得到活化液；
19)、将18)中的活化液接种Z发酵瓶，所用发酵瓶Z培养基及培养条件同7)；
20)、对19)中使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法检测残糖。
优选的，还包括步骤D、遗传性检测
21)、将16)中验证确定的低耗糖的菌株冻存液接种活化瓶，
活化瓶培养基及培养条件同1)
22)、对21)中活化瓶接种发酵瓶Z1培养基
所用发酵瓶Z1培养基成分及配比为(g/L)：淀粉70.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h；
23)、将22)中的发酵瓶使用液相色谱法检测效价，考察菌种的遗传特性。
一种多粘菌素E低耗糖菌株，菌株的名称为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)，SD-1908，该菌株保藏在CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.21363，保藏日期为2020年12月14日。
本发明的有益效果是：以生产中使用的多粘菌素E菌种为出发菌株，首先采用ARTP诱变，然后接种到逐步降低碳源含量的发酵瓶中，经过3次转接之后，分离单菌落，选取生长正常的单菌落进行保存。并且经过验证发现，经过降低碳源诱导的菌株普遍具有明显的耗糖低的特点，而且能够更充分的利用培养基里的碳源。经过自然分离，确定本方案获得的低耗糖菌株具有遗传稳定性，可以满足大生产长期稳定使用的要求。
产生相同效价的情况下，本发明的新菌株对碳源的利用量更低，可以直接降低生产成本，带来直接的经济效益。本发明的另一个有益效果是，获得的菌株在发酵中剩余的残糖量更低，可以一定程度上缓解三废处理的压力，本方法获得的菌种具有遗传稳定性，可供给大规模生产使用。
附图说明
图1为本发明生产流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：
ARTP诱变
1)、将生产使用的多粘菌素E菌种SC1605接种活化瓶进行培养
所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g，培养基pH7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h。
2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心，倒出上清液，加入10％甘油溶液混匀再次离心，倒出上清液后，加入5mL10％甘油溶液，摇匀成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108。在无菌条件下，滴加到诱变使用的无菌铁片上，进行ARTP诱变，以高纯氦气作为气源，处理功率80W，气流量10SLM(standardliterperminute)，等离子体发射源与样品之间的距离为3mm，照射时间为30s、45s、60s、80s。
所用10％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取100mL甘油，纯化水定容到1000mL摇匀即可。
3)、诱变液分离到平板培养基上，获得单菌落，
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3.0，琼脂20.0；培养基pH7.0-7.2，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h。
4)、在3)中挑选大小适中，颜色阴白单菌落，接种到活化瓶培养基中，活化瓶培养基及培养条件同1)得到成熟的活化液种子。
5)、将4)中活化液和40％甘油1:1混合，得到终浓度20％的混合液，
所用40％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取400mL甘油，纯化水定容到1000mL混匀，121℃湿热灭菌30分钟。
6)、将5)中混合均匀甘油活化液分装1mL/2mL冻存管中，在-80℃超低温冰箱中进行保藏，为活化冻存液。
实施例2：
1)、将实施例1里面6)中保藏的活化冻存液接种到Z培养基中，
所用发酵瓶基础培养基(Z)成分及配比为(g/L)：淀粉90.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h。
2)、将1)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法进行残糖检测。
表1：ARTP诱变获得菌株在Z培养基上的效价及残糖数据。
Figure BDA0002961982580000081
如表1可见，经过ARTP诱变后的菌种耗糖和出发菌株持平，效价普遍高于出发菌株。
实施例3：
1)、将实施例1里面6)中保藏的活化冻存液接种到D2培养基中，
所用D2发酵瓶培养基成分及配比为(g/L)：淀粉54，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
D2培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h。
2)、将1)中生长到周期的D2发酵液接种Z培养基，
所用发酵瓶基础培养基(Z)成分及配比为(g/L)：淀粉90.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h。
3)、将2)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法进行残糖检测。
表2：ARTP诱变获得菌株进行D2低糖诱导的菌株在Z培养基上的效价及残糖数据。
Figure BDA0002961982580000091
如表2可见，经过ARTP诱变和碳源降低一半左右的低碳源诱导后的菌种，耗糖普遍有下降的趋势，耗糖量低于出发菌株，效价也优于出发菌株。
实施例4：
1)、将实施例1里面6)中保藏的活化冻存液接种到D1培养基中，
所用D1发酵瓶培养基成分及配比为(g/L)：淀粉72，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
D1培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h。
2)、将1)中长好的发酵液接种D2培养基中，
所用D2发酵瓶培养基成分及配比为(g/L)：淀粉54，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
D2培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h。
3)、将2)中长好的发酵液接种到D3培养基中
所用D3发酵瓶培养基成分及配比为(g/L)：淀粉27，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
D3培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h。
4)、将3)中生长到周期的D3进行稀释分离，得到单菌落，
所用平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3.0，琼脂20.0；培养基pH7.0-7.2，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h。
5)、在4)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，
所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g，培养基pH7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h。
6)、将5)中活化液和40％甘油1:1混合，得到终浓度20％的混合液，
所用40％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取400mL甘油，纯化水定容到1000mL混匀，121℃湿热灭菌30分钟。
7)将6)中混合均匀甘油活化液分装1mL/2mL冻存管中，在-80℃超低温冰箱中进行保藏，为活化冻存液。
8)、在菌种保藏的同时，将5)中的活化液接种Z发酵瓶中，
所用发酵瓶基础培养基(Z)成分及配比为(g/L)：淀粉90.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h。
9)、将8)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法进行残糖检测。
表3A：RTP诱变获得菌株进行3级低糖诱导后菌株在Z培养基上的效价及残糖数据。
Figure BDA0002961982580000111
如表3所示，经过ARTP诱变和3次逐级降低碳源诱导后得到的菌种耗糖普遍低于对照，其中编号“3”的菌株最优，进行专利菌株保藏，专利菌种保藏号为SD-1908菌株，效价高出对照7.19％，耗糖低于对照17.34％，判定为低耗糖特性菌株。
实施例5：
1)、将SD-1908菌株自然分离，考察遗传稳定性，接种活化瓶进行培养
所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g；培养基pH7.0-7.2。
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h。
2)、将1)中生长到周期的活化液进行稀释分离，得到单菌落，
所用平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3.0，琼脂20.0；培养基pH7.0-7.2，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h。
3)、在2)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，培养基和培养条件同1)
4)、将3)中的活化液接种Z发酵瓶中。
所用发酵瓶基础培养基(Z)成分及配比为(g/L)：淀粉90.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h。
5)、将4)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法进行残糖检测，确定SD-1908菌株的遗传稳定性。
表4：低耗糖菌株分离后与出发菌株在Z培养基上的考察的效价及残糖结果。
随机菌株 分离1 分离2 分离3 分离平均 SD-1908 SC1605
诱变实验发酵结果(万u/mL) 50.8 49.8 49.8 50.1 50.6 47.9
残糖(g/100mL) 2.37 2.45 2.61 2.34 2.57 1.31
耗糖量(g/100mL) 6.63 6.55 6.39 6.52 6.43 7.69
效价高出对照％ 6.07 3.89 4.00 4.65 5.74 /
耗糖高于对照％ -13.78 -14.82 -16.91 -15.17 -16.38 /
如表4所示，低耗糖菌株进行分离后仍然保持了低耗糖的特点，和低耗糖出发菌株特点一致，比诱变前出发菌株效价平均高出4.65％，耗糖平均低于对照15.17％；专利菌株SD-1908效价高出对照5.74％，耗糖低于对照16.38％。
对获得的低耗糖特性菌株SD-1908进行了专利菌株保藏。专利菌株保藏号：21363
实施例6：
1)、将保藏的SD-1908活化冻存液接种活化瓶，所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g，琼脂20.0；培养基pH7.0-7.2，培养条件：培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h。
2)、将1)中成熟活化瓶和实施例5中3)中的活化液接种到Z1发酵瓶，所用Z1发酵瓶培养基成分及配比为(g/L)：淀粉70，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，Z1培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h。
3)将2)中培养到期的发酵液使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法进行残糖检测。
表5：低耗糖菌株分离后与出发菌株在Z1培养基上的考察的效价及残糖结果。
随机菌株 分离1 分离2 分离3 分离平均 SD-1908 SC1605
诱变实验发酵结果(万u/mL) 52.9 52.5 53.757 53.0 53.4 48.8
残糖(g/100mL) 0.20 0.23 0.21 0.21 0.21 0.43
效价高出对照％ 8.38 7.49 10.16 8.67 9.49 /
如表5所示，使用Z1培养基进行验证，结果表明：(1)降低碳源加量后，筛选得到的菌株效价与原配方持平偏高，即显著降低了生产成本；(2)降低碳源加量后，筛选得到的菌株几乎耗尽了所有的碳源，残糖为0.21g/100mL，比出发菌株更低，这可以降低废液的处理难度，节降废水处理的成本。
综上所述，可知本发明的新菌株对碳源的利用量更低，可以直接降低生产成本，带来直接的经济效益。且获得的菌株在发酵中剩余的残糖量更低，可以一定程度上缓解三废处理的压力，本方法获得的菌种具有遗传稳定性，可供给大规模生产使用。

Claims (3)

1.一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、ARTP诱变菌株保藏
1)、将生产使用的多粘菌素E菌种接种活化瓶进行培养
所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g，培养基pH7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h；
2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心，倒出上清液，加入10％甘油溶液混匀再次离心，倒出上清液后，加入5mL10％甘油溶液，摇匀成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108；进行ARTP诱变，得到诱变菌株，
所用10％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取100mL甘油，纯化水定容到1000mL摇匀；
3)、将2)中的诱变菌株稀释分离到平板培养基上进行培养，
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3.0，琼脂20.0，培养基pH7.0-7.2；培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h；
4)、在3)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，活化培养基及培养条件同1)，得到成熟的活化液种子；
5)、将4)中活化液和40％甘油1:1混合，得到终浓度20％的混合液；
40％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取400mL甘油，纯化水定容到1000mL即可；
6)、将5)混匀的20％甘油浓度的活化培养液分装，在-80℃超低温冰箱中进行保藏为活化冻存液；
B、验证并确定低耗糖菌株
7)、将6)中保藏的活化冻存液接种到Z培养基中，进行培养，
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L)：淀粉90.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h；
8)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D2和Z培养基中，进行培养，
所用发酵瓶D2培养基成分及配比为(g/L)：淀粉54.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；
9)、将8)中培养到周期的发酵液接种到Z培养基中，进行考察，
所用发酵瓶Z培养基成分及配比为(g/L)：同7)；
10)、将6)中保藏的活化冻存液依次接种到D1、D2、D3和Z培养基中，进行培养，
所用发酵瓶D1培养基成分及配比为(g/L)：淀粉72.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；
所用发酵瓶D2培养基成分及配比及培养条件：同8)
所用发酵瓶D3培养基成分及配比为(g/L)：淀粉27.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4，
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养18-22h；
11)、将10)中生长到周期的D3进行稀释分离并接种Z培养基进行验证，
平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3..0，琼脂20.0；培养基pH7.0-7.2，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h；
所用发酵瓶Z培养基及培养条件：同7)；
12)、在11)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，活化培养基及培养条件同1)，得到成熟的活化液种子；
13)、将12)中活化液和40％甘油1:1混合，得到终浓度20％的混合液；
14)、将13)混匀的20％甘油浓度的活化培养液分装，在-80℃超低温冰箱中进行保藏；
15)、将11)中培养到周期的发酵液使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法检测残糖；
16)、根据15)中检测结果确定低耗糖菌株；
C、选育验证
17)、将16)中确定的低耗糖菌株进行自然分离到平板培养基上进行培养，
平板培养基及培养条件同11)；
18)、在17)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，生长16h后得到活化液；
19)、将18)中的活化液接种Z发酵瓶，所用发酵瓶Z培养基及培养条件同7)；
20)、对19)中使用液相色谱法检测效价，使用甲醛法检测残糖。
2.根据权利要求1所述的一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，其特征在于，还包括步骤D、遗传性检测：
21)、将16)中验证确定的低耗糖的菌株冻存液接种活化瓶，
活化瓶培养基及培养条件同1)
22)、对21)中活化瓶接种发酵瓶Z1培养基
所用发酵瓶Z1培养基成分及配比为(g/L)：淀粉70.0，黄豆饼粉20.0，碳酸钙14.0，硫酸铵20.0，磷酸二氢钾1.2，淀粉酶0.05，大豆油10.0，pH7.2-7.4；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，温度30.0-32.0℃，周期培养96-120h；
23)、将22)中的发酵瓶使用液相色谱法检测效价，考察菌种的遗传特性。
3.一种多粘菌素E低耗糖菌株，其特征在于，菌株的名称为多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)，SD-1908，该菌株保藏在CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.21363，保藏日期为2020年12月14日。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974452A (zh) * 2010-09-17 2011-02-16 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种粘杆菌素高产菌株及其筛选方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙仲奇等: "碳源对多粘类芽孢杆菌生长和多粘菌素E合成的影响", 《浙江农业学报》 *
张金峰等: "低能等离子诱变选育杆菌肽高产菌株及发酵条件优化研究", 《粮油食品科技》 *
闵勇 等: "多粘类芽孢杆菌ARTP诱变及高产菌株的选育", 《研究报告》 *

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