CN112322567B - 一株耐酸高产ε-聚赖氨酸的突变菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐酸高产ε‑聚赖氨酸的突变菌株及其应用，属于微生物育种领域。本发明通过对链霉菌进行基因工程改造并结合诱变育种，获得高产菌株PL‑2‑AH66。该菌株在摇瓶水平发酵的ε‑聚赖氨酸较出发菌株提高150％，在5L发酵罐水平的ε‑聚赖氨酸产量可以达到42.69g/L，生产强度7.115g/L/d。本发明的高产菌株PL‑2‑AH66具有良好的耐酸性能及耐受抗生素的性能，在pH2.0～3.0仍有较高的存活率，且遗传稳定性好，传代9传代后的ε‑聚赖氨酸产量与初代产量基本一致。该菌株发酵流程简单，工艺易于控制，ε‑聚赖氨酸产量提升幅度大，为ε‑聚赖氨酸的工业化生产及应用奠定了坚实的基础。

Description

一株耐酸高产ε-聚赖氨酸的突变菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株耐酸高产ε-聚赖氨酸的突变菌株及其应用，属于微生物育种领域。

背景技术

ε-聚赖氨酸是一种天然的聚合物，它主要由链霉菌产生，是L-赖氨酸上的α-氨基与ε-羧基脱水缩合而成的一种次级代谢产物，聚合度一般为25–35。其具有很广的抑菌性能，能抑制大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及酵母和部分病毒，因此在食品保鲜行业应用广泛。截至目前，美国、日本、韩国、中国等国家已陆续批准ε-聚赖氨酸作为食品防腐剂应用于食品中。此外，ε-聚赖氨酸具有水溶性好、热稳定强、安全性能高等优点，在医学、农药等领域具有很好的应用潜力。

ε-聚赖氨酸野生型产生菌产量一般都很低，无法满足工业化生产。如Shima和Sakai等筛选得到的一株白色链霉菌S.albulus，经过96h的摇瓶发酵后，产量达到0.2g/L。根据已有的文献报道，目前较通用的方法是采用基因工程或诱变的手段选育高产菌株，提升ε-聚赖氨酸产量。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产ε-聚赖氨酸的链霉菌(Streptomycesalbulus) PL-2-AH66，已于2020年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61191。

本发明的第二个目的是提供含有所述链霉菌的微生物制剂，所述微生物制剂中的链霉菌孢子数量≥1×10⁶个/mL。

本发明的第三个目的是提供一种生产ε-聚赖氨酸的方法，是应用所述链霉菌进行发酵。

在一种实施方式中，所述发酵以葡萄糖为碳源，以酵母粉和/或硫酸铵为氮源。

在一种实施方式中，所述发酵是在含葡萄糖、酵母粉、铵盐、钾盐和金属离子的培养基中发酵。

在一种实施方式中，在发酵过程中补料碳源和/或氮源。

在一种实施方式中，所述发酵是在28～30℃发酵至少24h。

在一种实施方式中，所述发酵接种种子液；所述种子液是将单菌落在培养基中，30℃， 200rpm培养24–26h。

在一种实施方式中，所述发酵培养基含有：葡萄糖50g/L，酵母粉5g/L，硫酸铵10g/L，磷酸二氢钾1.4g/L，磷酸氢二钾0.8g/L，硫酸锌0.04g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.03g/L。

在一种实施方式中，所述发酵还进行两阶段控制发酵；所述两阶段是第一阶段不控制pH，第二阶段控制pH为3.6～4.0；所述第二阶段自pH下降至2.8起算。

在一种实施方式中，所述补料是：当葡萄糖含量降至5–10g/L，补料葡萄糖溶液维持发酵糖浓度在5–15g/L；当铵态氮浓度降至≤0.25g/L时，补料无机氮源维持铵态氮浓度为 0.1–0.5g/L。

在一种实施方式中，所述无机氮源包括但不限于硫酸铵。

在一种实施方式中，所述发酵还在发酵第96h后开始补料有机氮源。

在一种实施方式中，所述有机氮源为浓度120～150g/L的酵母粉。

本发明还要求保护所述链霉菌或所述微生物菌剂在制备防腐剂等抑菌产品中的应用。

有益效果：

(1)本发明使用外源启动子转录表达ε-聚赖氨酸聚合酶(Pls)基因，并首次尝试将另外一种链霉菌启动子SF14p来表达Pls基因，获得了ε-聚赖氨酸产量提升40％的重组菌株。其操作性强，转化效率高；并在原有传统诱变技术的基础上进行改进，对菌株进行等离子束诱变和化学诱变剂亚硝酸复合诱变方法，并结合林肯霉素抗性筛选，林肯霉素抗性的加入提高筛选正突变率，省略中间筛选的复杂过程，进行两次诱变，一次筛选，可以简化筛选流程；其次，这种一次筛选方法可以创造更丰富的突变文库，在诱变过程中可以增加突变体之间的组合，有利于达到最佳“效果”。最终获得一株ε-聚赖氨酸产量提升150％的突变株PL-2-AH66；为ε-聚赖氨酸的工业化生产及应用奠定了较坚实的基础。

(2)本发明的菌株PL-2-AH66在摇瓶水平的ε-聚赖氨酸产量可达2.5g/L，较出发菌株提高了150％；在发酵罐水平的产量达到42.69g/L，生产强度7.115g/L/d，可生产出聚合度25～32 的ε-聚赖氨酸。

(3)本发明的菌株具有良好的传代稳定性，传代9代后的ε-聚赖氨酸产量与初代产量基本一致。

(4)本发明的菌株具有良好的耐酸能力，在pH2.0的环境下具有32.5％的存活率，在pH3.0 的环境下具有54.2％的存活率。

(5)本发明的菌株对于抗生素的耐受性及抑菌能力得到增强，相对于出发菌株，对链霉素、庆大霉素、巴龙霉素以及遗传霉素的耐受性增强，可以耐受10mg/L的链霉素，2mg/L的庆大霉素，6mg/L的巴龙霉素及10mg/L的遗传霉素。

(6)本发明对筛选获得的ε-聚赖氨酸产量提升的突变株PL-2-AH66实施pH两阶段补料分批发酵及后期流加有机氮源，显著提升了菌株产ε-聚赖氨酸能力。发酵144h，ε-聚赖氨酸产量达到了42.69g/L，生产强度7.115g/L/d；该工艺发酵流程较简单，容易控制，便于放大操作，对其工业化生产有一定的指导价值。

生物材料保藏

一种链霉菌PL-2-AH66，分类命名为Streptomyces albulus，已于2020年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61191。

附图说明

图1为PL-2ARTP诱变致死率曲线；

图2为PL-2亚硝酸诱变致死率曲线；

图3为突变株PL-2-AH66遗传稳定性曲线；

图4为突变株PL-2-AH66在5L发酵罐pH两阶段分批发酵曲线；

图5为突变株PL-2-AH66在5L发酵罐pH两阶段补料-分批发酵曲线；

图6为突变株PL-2-AH66在5L发酵罐pH两阶段补料-分批发酵结合后期流加有机氮源曲线。

具体实施方式

培养基：

LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，自然pH，121℃灭菌20min；

MS培养基：甘露醇20g/L，黄豆饼粉20g/L，琼脂20g/L，自然pH，121℃灭菌20min；

ISP-2培养基：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽粉10g/L，琼脂15g/L，pH 7.3，121℃灭菌20min；

ISP-4培养基：可溶性淀粉10g/L，硫酸镁1g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙2g/L，硫酸亚铁0.001g/L，氯化锰0.001g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；

贝特纳平板(BNT)：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物(酵母粉)1g/L，琼脂20g/L，pH7.5，115℃灭菌20min；

种子培养基(M₃G)：葡萄糖50g/L，酵母粉5g/L，硫酸铵10g/L，磷酸二氢钾1.4g/L，磷酸氢二钾0.8g/L，硫酸锌0.04g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.03g/L，pH6.8，115℃灭菌20min；

发酵培养基(优化培养基)：葡萄糖60g/L，酵母粉8g/L，硫酸铵5g/L，七水合硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸锌0.03g/L，硫酸铁0.04g/L，pH 6.8，115℃灭菌15min；

补料碳源：800g/L葡萄糖，115℃灭菌20min；

补料无机氮源：220g/L硫酸铵，121℃灭菌20min；

补料有机氮源与无机氮源：200g/L硫酸铵，150g/L酵母粉，121℃灭菌20min。

ε-聚赖氨酸含量测定方法(甲基橙法)：取发酵液1mL，于5000rpm/min离心15min，用pH 6.9的磷酸缓冲液稀释发酵上清液，取2mL稀释液与等体积的甲基橙溶液反应，30℃下反应30min，5000rpm离心15min，取上清液0.5mL稀释20倍，取稀释液200μL加入到96 孔板中，465nm下测其OD值，根据标准曲线计算其含量。

所述溶液配制方法为：

1mmol/L甲基橙溶液：指示剂型甲基橙在分析天平上称量0.327g，用去离子水定容至1L。

0.7mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.9)：配制0.2606g/L的磷酸氢二钠溶液，再配制0.1092 g/L的磷酸二氢钠溶液，两者混合至pH 6.9。

ε-聚赖氨酸标准品：称取0.4gε-聚赖氨酸标准品，用蒸馏水定容至100mL。配成4g/L 的标准溶液。

pH7.0磷酸缓冲液(1L)：磷酸氢二钾9.39g，磷酸二氢钾3.5g，蒸馏水定容至1L，121℃， 20min灭菌备用。

25％硫代硫酸钠：称取25g硫代硫酸钠溶于100mL蒸馏水中。

实施例1重组菌株的构建及筛选

首先选取了整合型质粒pSET152，构建含有启动子SF14p(SEQ ID NO.1所示)的重组质粒。以菌株BNCC 18622的Pls基因(SEQ ID NO.2)为模板，通过引物pls-F2(SEQ IDNO.3)与pls-R (SEQ ID NO.4)扩增Pls基因，以Nde I和Xba I为酶切位点设计简并引物，双酶切Pls基因，同时切割整合型质粒pSET152(携带启动子SF14p)，将切割后的Pls基因连接至质粒，转化至大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性转化子进行DNA测序验证，提取目的质粒转化至E.coli ET12567/pUZ8002。pUZ8002是含有tra基因的一个质粒，tra基因编码转移蛋白Tra，使得质粒DNA可以从大肠杆菌转化至链霉菌。E.coli ET12567/pUZ8002是一株甲基化缺陷型菌株。大部分链霉菌能通过甲基修饰系统来辨识自身DNA与外源DNA，所以，要想将质粒转入链霉菌中，必须将质粒转入E.coli ET12567/pUZ8002中，然后通过接合转移的方法转入链霉菌中。将含有目的质粒的大肠杆菌E.coli ET12567/pUZ8002在含有抗生素(卡那霉素，氯霉素，阿泊拉美素，终浓度均为50μg/ml)的LB液体培养基培养至OD₆₀₀为0.6。用0.85％的生理盐水洗涤细胞两次，除去抗生素后，在500μl的LB培养基中重悬，同时将Streptomyces albulus BNCC 186223(也即CICC 11022)的孢子液(浓度约为10⁸CFU/ml)加入到同等体积的LB培养基中重悬，将两者充分混匀，涂布含10mM MgCl₂的MS或ISP-2或ISP-4固体平板中，30℃培养 18h后，取1ml含有0.05mg萘啶酸和0.1mg阿泊拉霉素的无菌水覆盖在平板上，继续培养 3d，得到重组菌株PL-2，通过甲基橙法测定重组菌株的ε-聚赖氨酸摇瓶产量。得到重组菌株 PL-2的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到1.4g/L，较原始菌株提升40％。

单孢子悬浮液的制备：将出发菌株接种在贝特纳斜面上，30℃生长5–7天，待菌落长出孢子后，平板经15％的灭菌甘油反复冲洗，用涡旋振荡器充分打散，经8层无菌纱布过滤，采用血球计数板计数，稀释至孢子悬液浓度在10⁸CFU/mL左右，保存备用。

重组菌株PL-2的复合诱变：将出发菌株孢子悬液经中、高个致死率的等离子诱变处理，得到等离子诱变突变菌株文库。根据亚硝酸致死率曲线，选育高致死率剂量直接诱变经等离子诱变过的孢子悬液，并涂布林肯霉素抗性平板。待长出单个菌落后，挑取菌落进行下一步的初筛与复筛。具体步骤为：

以PL-2为出发菌株，制备单孢子悬浮液。将孢子悬浮液稀释至10⁶CFU/mL左右，根据等离子诱变致死率曲线，取20μL单孢子悬液于无菌诱变片上，置于常压室温等离子体诱变系统(ATRP)中分别处理120s和240s。将处理完的小铁片置于装有2mL的0.85％生理盐水的 EP管中，充分混匀。于恒温摇床30℃、转速200rpm/min条件下孵育1h。

取孵育的孢子悬液0.5mL，用0.0125mol/L浓度的亚硝酸，于26℃恒温培养25min后，取亚硝酸钠处理过的孢子悬液100μL，在无菌操作台中稀释涂布于含有林肯霉素(lincomycin， Lin)的抗性平板中。

初筛(孔板发酵)：挑选抗性平板上与原始菌株形态差异较大、孢子丰满的菌落进行扩大培养，并于48深孔板中进行发酵，发酵液采用甲基橙测定法，结合酶标仪快速测定。根据ε- 聚赖氨酸标准曲线计算其含量，筛选ε-聚赖氨酸产量提升的菌株。

复筛(摇瓶发酵)：对(4)中获得的高产菌株进行摇瓶培养，采用250mL的三角瓶对其进行发酵，测定发酵液中的ε-聚赖氨酸含量，挑选ε-聚赖氨酸产量提升的菌株保藏，并进行传代培养，测试其遗传稳定性。

经过数轮初筛，共筛选菌株1045株，得到59株ε-聚赖氨酸产量得到提升的突变株。进一步的复筛得到20株ε-聚赖氨酸产量提升的突变株，其中突变菌株PL-2-AH66的ε-聚赖氨酸产量达到2.5g/L，且遗传性能稳定(连续传代9次产量较稳定)，比出发菌株的ε-聚赖氨酸产量提高150％。

表1复合诱变部分高产菌株测试结果

由表1的复筛结果可知，突变株的ε-聚赖氨酸产量提升福大较大提升，幅度在100％–150％之间，其中突变株PL-2-AH66的ε-聚赖氨酸产量达到2.5g/L，较出发菌株提高了150％。

实施例2菌株传代稳定性的测定

对突变株PL-2-AH66进行传代培养，对1、3、5、7、9代菌株进行摇瓶发酵测试，图3为遗传稳定曲线，可以看出曲线较平缓，说明ε-PL产量变化幅度低。由表2可知，每一代的产量ε-PL产量相差不大(小于0.05g/L),第九代产量为2.51±0.01g/L，与第一代产量基本无差，可见其遗传稳定性较好。

表2 PL-2-AH66遗传稳定性测试

实施例3菌株两阶段分批发酵

将实施例1获得的菌株PL-2-AH66在5L发酵罐中pH两阶段分批发酵：

种子液采用500mL三角瓶培养，装液量为100mL，培养条件为30℃，200rpm时间为24–26h。

按照体积比8％的接种量接种至含有2.76L发酵培养基的(初始pH 6.8)发酵罐中，初始转速200rpm，通气量1vvm。发酵过程中当pH降至2.8±0.1，维持此pH值至菌体生物量开始下降，通过流加氨水调整pH至3.8±0.1直至发酵结束。发酵过程通过转速和通气量的改变维持溶氧(DO)在15％–25％。由图4可知，整个发酵过程持续54h，发酵结束ε-聚赖氨酸含量达到9.68g/L。

实施例4菌株两阶段补料分批发酵

突变菌株PL-2-AH66在5L发酵罐中pH两阶段补料分批发酵：种子液培养、发酵罐初始参数设定及pH控制同分批发酵流程。发酵过程中，当葡萄糖含量降至5–10g/L，通过补料葡萄糖溶液维持发酵糖浓度在5–15g/L；当铵态氮浓度降至0.25g/L时，通过补料无机氮源(主要为硫酸铵等成分)维持铵态氮浓度为0.1–0.5g/L。发酵曲线如图5所示，整个发酵过程持续144h，发酵结束ε-聚赖氨酸含量达到33.0g/L，pH两阶段分批发酵结合补料显著提升了ε- 聚赖氨酸产量。

实施例5菌株两阶段补料分批发酵结合后期补料有机氮源

突变菌株PL-2-AH66在5L发酵罐中pH两阶段补料分批发酵结合后期补料有机氮源：种子液培养、发酵罐初始参数设定、pH控制及同分批发酵流程。发酵过程中，当葡萄糖含量降至5–10g/L，通过补料葡萄糖溶液维持发酵糖浓度在5–15g/L；当铵态氮浓度降至0.25g/L时，通过补料无机氮源(主要为硫酸铵等成分)维持铵态氮浓度为0.1–0.5g/L。发酵至96h，开始补料有机氮源(主要为酵母粉)与无机氮源，维持发酵液的铵态氮浓度在适合范围。由图 6可知，在96h开始流加有机氮源之后，菌体活力明显上升，菌体合成ε-聚赖氨酸的能力得到增强，发酵144h，ε-聚赖氨酸产量达到42.69g/L，生产强度7.115g/L/d。对合成的ε-聚赖氨酸进行质谱分析，发现其聚合度为25–32之间。

实施例6高产菌株PL-2-AH66与出发菌株耐酸性比较

对菌株PL-2-AH66以及原始菌株进行了耐酸性比较。ε-聚赖氨酸主要是在酸性条件下 (pH4.0左右)合成，而菌株对酸的耐受性可能直接影响着ε-聚赖氨酸的合成。因此，设置了不同的pH条件，分别将野生型链霉菌和突变后的高产菌PL-2-AH66以OD_0.8的菌浓加入至不同pH的发酵培养基中，培养1d后，涂布贝特纳固体平板，培养5-7d后通过平板计数法计算其存活率，探究高产菌株与出发菌株的耐酸性。设置了7个pH条件(pH2.0、3.0、4.0、 5.0、6.0、7.0)，由表3可知，在pH5.0以上，两个菌都能很好的生长。pH5.0以下，能看出来高产菌株PL-2-AH66对酸的耐受性增强。在pH2.0时，出发菌株已经完全受到抑制，而高产菌株PL-2-AH66存活率还可以达到32.5％，说明其耐酸性更强，在分批发酵过程中应对酸胁迫的能力也会更强，合成ε-聚赖氨酸的过程得到加强。

表3高产菌株PL-2-AH66与出发菌株耐酸性对比

实施例7高产菌株PL-2-AH66与出发菌株抗生素耐受性比较

对实施例1获得的重组菌株PL-2和筛选获得的高产菌株PL-2-AH66进行抗生素耐受性实验，将出发菌株与高产菌株的孢子悬液稀释至相同浓度(1×10⁵CFU/mL)，均匀涂布于含不同抗生素且不同抗生素浓度的BNT固体平板。结果如表4所示，相比出发菌株，高产菌株PL-2-AH66对抗生素的耐受性均得到不同程度增强，由表可知，高产菌株分别可以耐受10mg/L 的链霉素，2mg/L的庆大霉素，6mg/L的巴龙霉素及10mg/L的遗传霉素。

表4高产菌株PL-2-AH66与出发菌株抗生素耐受性对比

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株耐酸高产ε-聚赖氨酸的突变菌株及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 358

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgacctgac agagggcgag aaggcggagt ttggggaact cctctccagg tacatcgagt 60

agcactaacc cgcaatgacc ctctcctctt tgcttggctc tatctccctc atcacctgac 120

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aaggtctcta caggcttcca gtgcacctgt acgtcttccg cgaatccggc tgattcga 358

<210> 2

<211> 3960

<212> DNA

<213> Streptomyces albulus

<400> 2

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ctgtaccgca ccgccggcaa cccggccccg cggaccctgc tcgacgtgct cgatgccacc 120

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ccggcccgcc cggccggcgc cgccgagcgg atggccggcg ccgcctggcc cgcccccgcc 2520

tggcagcgct cgcgccgctg gagcgccgcc tacggactga ccctgctggg cctgccgctg 2580

ctggccctgc tgtccaccgc gcccgccctg gtcggcgcgt acttcctgct ccgcgacagc 2640

ggcaccctcg ccacagccgg gcttcgcctg ctgctggccg tcccggtctt cacgctcctg 2700

accactggct gctccctcct cgtcaccgcc gccgtggtgc gcctcctcgg ccgcggcatc 2760

acgccgggac tgcaccccgc gagcggtggc gtcgcctggc gcgcctggct ggtcacccgc 2820

ctcctggacg gcgcccgcgg cagcctcttc ccgctctacg ccagcctcgg caccccgcac 2880

tggctgcggc tgctcggcgc caaggtcggc cggcacgcgg agatctccac cgtgctgccg 2940

ctgccctccc tgctgcacgt cgaggacggc gcgttcctcg ccgacgacac cctggtggcg 3000

cccttcgaac tccgcggcgg ctggctgcgg ttggggaccg tccggatcgg tcgccgggcc 3060

ttcgtcggca actccggcat cgtcgacccc ggccacgacg tgcccgatca cagcctggtc 3120

ggcgtgctct ccaacgcccc cgccgacggc gagcccggct cgtcctggct gggccggccc 3180

gccatgccgc tgccccgggt ggcgacccag gccgacccgg cgcgcacctt cgcaccgccg 3240

cgcaggctgg tccgggcccg cgccgccgtc gagctgtgcc gggtgctgcc gctgatgtgc 3300

ggcctggcgc tcgccgaggg cgtgttcctc accgagcagg acgccttcgc ccagggcggc 3360

ctcggtctcg ccgcactggt cggcgccccg ctgctgctgg cctcgggcct cgtggcgctg 3420

ctcgtcacca ccctcgcgaa gtggctgctg gtcggccgct tcacggtgag cgagcacccc 3480

ctgtggtcgt cgttcgtgtg gcgcaacgag ctctacgaca ccttcgtcga atcgctcgcc 3540

gtgccgtcga tggccggcgc gttcaccggc accccggtcc tgaactggtg gctgcgcacc 3600

ctcggcgcca agatcgggcg cggggtctgg ttggagagct actggctgcc ggagaccgac 3660

ctgatcaccg tcgccgacgg cgtcagcgtc aaccgcggct gcgtcctgca gacccacctc 3720

ttccacgacc ggatcatgcg gctggacacc gtccgcctcg ccgaaggctc ctcgctcggc 3780

ccgcacggca tcgtgctccc cggcaccgag gtcggggcgc gcgcctcgat cgcgccgtcg 3840

tccctggtca tgcgcggcga gagcgtcccg gcccacaccc ggtgggccgg caacccgatc 3900

gccggcgaac gccccgcccg ccccgtcccg gcacgcgcgg agggaggtgc ggccgcgtga 3960

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tactagatct aagtaaggag tgtccatatg tcgtcgcccc ttctcgaatc gtccttc 57

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggaaacag ctatgacatg attacgaatt ctcacgcggc cgcacctccc tccgcgcg 58

Claims (10)

1.一株链霉菌(Streptomyces albulus)，已于2020年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61191。

2.含有权利要求1所述链霉菌的微生物制剂。

3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，链霉菌孢子数量≥1×10⁶个/mL。

4.一种生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，应用权利要求1所述链霉菌进行发酵；所述发酵是在28～30℃发酵至少24h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵以葡萄糖为碳源，以酵母粉和/或硫酸铵为氮源。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵是在含葡萄糖、酵母粉、铵盐、钾盐和金属离子的培养基中发酵。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在发酵过程中补料碳源和/或氮源。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述补料是：当葡萄糖含量降至5–10g/L，补料葡萄糖溶液维持发酵糖浓度在5–15g/L；当铵态氮浓度降至≤0.25g/L时，补料无机氮源维持铵态氮浓度为0.1–0.5g/L。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵还进行两阶段控制发酵；所述两阶段是第一阶段不控制pH，第二阶段控制pH为3.6～4.0；所述第二阶段自pH下降至2.8起算。

10.权利要求1所述的链霉菌，或权利要求2或3所述的微生物菌剂在制备抑菌产品中的应用；所述抑菌产品包括防腐剂。

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