CN112111413A - 一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基及发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基及发酵方法，涉及微生物发酵技术领域，其技术方案要点是：经本发明设计的发酵培养基和发酵方法所制备的木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为2.98‑6.50cm，普遍低于已有木霉菌培养基所制备的木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径7.0cm；其中，最优发酵培养基配比为：马铃薯200g/L、葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L。在此条件下，木霉菌发酵液处理后茶炭疽菌菌落直径为3.01cm，比未优化前的菌落直径缩小了13％。本发明对一株具有拮抗茶炭疽病菌作用的木霉菌进行液体发酵培养基设计，提高木霉菌发酵液中抑制茶炭疽病菌生长的物质含量，在一定程度上节约成本，提高发酵效率。

Description

一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基及发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体地说，它涉及一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基及发酵方法。
背景技术
茶炭疽病是一种由真菌引起的，茶树上常见的叶部病害。在我国各个茶区均有发生，通常在贵州、浙江、福建等雨水多、湿度大的省份发生较多。该病主要由炭疽菌(Collectotrichums spp.)引起。病菌多从嫩叶侵入，在茶树成叶上发病，使得叶片焦枯、掉落，影响茶树光合作用，导致茶叶减产。目前，防治炭疽病主要是利用抗病品种，但是当病害发生严重时，仍旧采用传统的化学农药防治方法为主。然而，农药残留不仅对茶叶品质造成严重影响，而且还造成生态系统恶化等严重问题，因此寻求新的防治措施和方法势在必行。在这种形势下，研究开发和使用无毒、无污染、环境相容性好的生物农药是大势所趋，生物防治是实现农业可持续发展的重要途径。
木霉菌(Trichoderma spp.)作为生防菌剂是近年来研究开发的热点。木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科的真菌，广泛存在于土壤、空气和植物体表面等生态环境中。目前，通过大量研究，已经成功鉴定得到了21个种类。国内外许多学者将木霉菌制剂于防治植物病害，并取得了较好的效果，如纹枯病(Rhizoctonia solani)、稻瘟病(Pyricularia grisea)、水稻恶苗病(Fusarium moniliforme)。
然而，现有的木霉菌作为防治炭疽病的制剂时，其抑制效率相对较低，且木霉菌投入成本高。因此，如何研究设计一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基及发酵方法是我们目前急需解决的问题。
发明内容
为解决现有木霉菌在作为防治炭疽病的制剂时，其抑制效率相对较低，且木霉菌投入成本高的问题，本发明的目的是提供一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基及发酵方法，能够提高木霉菌发酵液中抑制茶炭疽病菌生长的物质含量，在一定程度上节约成本，提高发酵效率。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
第一方面，提供了一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基，该培养基应用于具有拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养，由以下成分组成：马铃薯、葡萄糖、酵母浸膏、磷酸氢二钾、硫酸亚铁。
进一步的，所述发酵培养基由以下成分组成：马铃薯200g/L、葡萄糖15-20g/L、酵母浸膏1-2g/L、磷酸氢二钾0.8-1.2g/L、硫酸亚铁0.5-0.7g/L，余量为水。
进一步的，所述发酵培养基由以下成分组成：马铃薯200g/L、葡萄糖18-19g/L、酵母浸膏1.5-2g/L、磷酸氢二钾0.8-1.0g/L、硫酸亚铁0.6-0.7g/L，余量为水。
进一步的，所述发酵培养基由以下成分组成：马铃薯200g/L、葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L，余量为水。
进一步的，所述发酵培养基为液体发酵培养基。
第二方面，提供了一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵方法，包括以下步骤：
S101、平板活化：在PDA培养基上接种直径5mm木霉菌菌饼，28℃恒温培养，培养7d；PDA培养基配置：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml；
S102、种子液培养：在500mL锥形瓶中装100mLPDB培养基，从平板上挑取菌落接种于摇瓶中，培养温度28℃，摇床转速120r/min，培养3d后进行接种发酵；PDB培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml；
S103、发酵培养基制备：将第一方面中任意一项的发酵培养基配置为液体发酵培养基，配置完成的液体发酵培养基在115℃灭菌30min后备用；
S104、发酵生长和产孢：在500mL锥形瓶中装100mL液体发酵培养基，向培养基中接种2mL步骤S102中的种子液，培养温度28℃，摇床转速120r/min，培养7d后用10mL灭菌ddH2O洗脱菌落孢子制成孢子悬浮液。
进一步的，所述液体发酵培养基在发酵培养具有拮抗茶炭疽病菌的木霉菌过程中，对木霉菌发酵液抑菌效果的影响大小降序依次为：葡萄糖、酵母浸膏、硫酸亚铁、磷酸氢二钾。
进一步的，所述木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为2.98-6.50cm。
第三方面，提供了一种如第一方面所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基在培养拮抗茶炭疽病菌的木霉菌中的应用。
第四方面，提供了一种如第二方面所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵方法在制备拮抗茶炭疽病菌的木霉菌制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明对一株具有拮抗茶炭疽病菌作用的木霉菌进行液体发酵培养基设计，提高木霉菌发酵液中抑制茶炭疽病菌生长的物质含量，在一定程度上节约成本，提高发酵效率；其中，经本发明设计的发酵培养基和发酵方法所制备的木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为2.98-6.50cm，普遍低于已有木霉菌培养基所制备的木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径7.0cm；其中，最优发酵培养基配比为：马铃薯200g/L、葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L。在此条件下，木霉菌发酵液处理后茶炭疽菌菌落直径为3.01cm，比未优化前的菌落直径(约为3.46cm)缩小了13％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明中不同碳源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响对比图；
图2是本发明中木霉菌发酵液葡萄糖添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响对比图；
图3是本发明中不同氮源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响对比图；
图4是本发明中木霉菌发酵液酵母浸膏添加量对茶炭疽病菌菌落长的影响对比图；
图5是本发明中不同磷源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响对比图；
图6是本发明中木霉菌发酵液磷酸氢二钾添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响对比图；
图7是本发明中不同微量元素对木霉菌菌丝生长和产孢的影响对比图；
图8是本发明中木霉菌发酵液硫酸亚铁添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响对比图；
图9是本发明中各因素交互作用对木霉菌液体发酵液抑菌效果的影响效果图，a以葡萄糖、酵母浸膏为影响因素，b以磷酸氢二钾、葡萄糖为影响因素，c以硫酸亚铁、葡萄糖为影响因素，d以磷酸氢二钾、酵母浸膏为影响因素，e以硫酸亚铁、酵母浸膏为影响因素，f以磷酸氢二钾、硫酸亚铁为影响因素。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图1-9及实施例1-4，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1：一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基，该培养基应用于具有拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养，发酵培养基为液体发酵培养基，由以下成分组成：马铃薯、葡萄糖、酵母浸膏、磷酸氢二钾、硫酸亚铁。
作为优选的，所述发酵培养基由以下成分组成：马铃薯200g/L、葡萄糖15-20g/L、酵母浸膏1-2g/L、磷酸氢二钾0.8-1.2g/L、硫酸亚铁0.5-0.7g/L，余量为水。
作为优选的，所述发酵培养基由以下成分组成：马铃薯200g/L、葡萄糖18-19g/L、酵母浸膏1.5-2g/L、磷酸氢二钾0.8-1.0g/L、硫酸亚铁0.6-0.7g/L，余量为水。
作为优选的，所述发酵培养基由以下成分组成：马铃薯200g/L、葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L，余量为水。
实施例2：一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵方法，包括以下步骤：
S101、平板活化：在PDA培养基上接种直径5mm木霉菌菌饼，28℃恒温培养，培养7d；PDA培养基配置：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。
S102、种子液培养：在500mL锥形瓶中装100mLPDB培养基，从平板上挑取菌落接种于摇瓶中，培养温度28℃，摇床转速120r/min，培养3d后进行接种发酵；PDB培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000m。
S103、发酵培养基制备：将第一方面中任意一项的发酵培养基配置为液体发酵培养基，配置完成的液体发酵培养基在115℃灭菌30min后备用。
S104、发酵生长和产孢：在500mL锥形瓶中装100mL液体发酵培养基，向培养基中接种2mL步骤S102中的种子液，培养温度28℃，摇床转速120r/min，培养7d后用10mL灭菌ddH2O洗脱菌落孢子制成孢子悬浮液。
实施例3：单因素实验
一、木霉菌发酵液碳源的筛选及浓度确定
(1)不同碳源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响
基本培养基为PDA培养基，分别添加20g/L葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖替代PDA培养基中的碳源，并设置无糖作为对照。在制备好的中央接种直径5mm木霉菌菌饼(每组实验设3次生物学重复)28℃恒温培养。48h后采用“十”字交叉法测量菌落生长直径作为菌丝生长状况指标，培养7d后用10mL灭菌ddH2O洗脱菌落孢子制成孢子悬浮液，用血球计数板计数孢子产量，公式如下：
1mL孢子悬浮中的总孢子数＝A/5×25×104×B
其中，A：5个中格的总孢子数；B：稀释倍数。
(2)木霉菌发酵液最佳碳源添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响
基本发酵培养基为PDB培养基，最佳碳源添加量分别为0、5、10、15、20、25、30、35g/L，配置完成的培养基115℃灭菌30min。在500mL锥形瓶中装100mL发酵培养基，向培养基中接种2mL种子液，培养温度28℃，摇床转速120r/min，培养5d。
将上述发酵液经抽滤、微滤后取滤液。将滤液与灭菌好的PDA培养基1：9混合均匀，不添加滤液的PDA培养基作为对照实验。在平板中央接种直径5mm茶炭疽菌菌饼(每组实验设3次生物学重复)，25℃黑暗培养，5d。采用“十”字交叉法测量并记录茶炭疽病菌菌落生长直径。
(3)结果与分析
碳源为菌体的生长代谢提供细胞的基本骨架，也是细胞生命活动的能量来源，碳源会影响次级代谢产物的产量。如图1可知，五种碳源中，添加葡萄糖，木霉菌菌丝生长较快，产孢量较多。
由图2可知，选择葡萄糖为最佳碳源，随着木霉菌发酵液葡萄糖添加量的增大，发酵液抑制茶炭疽菌菌落的直径先减小后增大。在葡萄糖添加量为20g/L时，经木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径最小，抑菌效果最好，为4.11cm。后续单因素实验中，选择葡萄糖添加量为20g/L。
二、木霉菌发酵液氮源的筛选及浓度确定
(1)不同氮源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响
在基本培养基PDA中采用最佳碳源添加及其最佳添加量，分别添加硝酸钠，蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、丙氨酸、尿素、硫酸铵，设无氮源为对照，添加量为2g/L，方法同上。
(2)木霉菌发酵液最佳氮源添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响
在基本发酵培养基中添加最佳碳源添加量，最佳氮源添加量分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5g/L，方法同上。
(3)结果与分析
菌体的生长和各种初级、次级代谢产物等含氮物质的合成都需要氮源，在发酵过程中，氮源还起着调节菌体生长及生物量的作用。如图3表明，木霉菌对有机氮源利用比无机氮源的利用效果好，其中酵母浸膏效果最好。
在选择酵母浸膏为最佳氮源的条件下，在木霉菌发酵培养基中加入不同浓度的酵母浸膏进行发酵，结果如图4所示。木霉菌发酵液的抑菌活性在酵母浸膏浓度为1.5g/L时最强，抑菌效果最好，经木霉菌发酵液处理后的茶炭疽病菌菌落直径为3.89cm，之后随着酵母浸膏浓度的进一步增加，抑菌效果反而会降低。因此，选择最佳酵母浸膏浓度为1.5g/L。
三、木霉菌发酵液磷源的筛选及浓度确定
(1)不同磷源对木霉菌菌丝生长和产孢的影响
在基本培养基PDA中采用最佳碳源添加及其最佳添加量，分别添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，设置无磷源为对照，添加量为1g/L，方法同上。
(2)木霉菌发酵液最佳磷源添加量对茶炭疽病菌菌落生长的影响
在基本发酵培养基中添加最佳碳源添加量，最佳磷源添加量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4g/L，方法同上。
(3)结果与分析
磷源主要的作用是维持菌体细胞结构的稳定性。如图5表明，添加磷酸氢二钾对木霉菌菌丝生长和产孢有促进作用，添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾对菌丝生长及产孢略有抑制作用。
由图6可知，选择磷酸氢二钾为最佳发酵磷源，木霉菌发酵液的抑菌活性在磷酸氢二钾浓度为1g/L时最高，经木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径最小为4.02cm，抑菌效果最好。因此，选择最佳酵母浸膏浓度为1g/L。
四、木霉菌发酵液微量元素的筛选及浓度确定
(1)不同微量元素对菌丝生长和产孢的影响
在基本培养基PDA中采用最佳碳源及其最佳添加量，分别添加硫酸钠、硫酸亚铁、硫酸钙、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰，并设无微量元素作对照，添加量为0.5g/L，方法同上。
(2)木霉菌发酵液最佳微量元素添加量茶炭疽病菌菌落生长的影响
在基本发酵培养基中添加最佳碳源添加量，最佳微量元素添加量分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L，方法同上。
(3)结果与分析
菌体的生长和发酵产物的形成需要一些微量元素，作为酶的辅基或激活剂。如图7表明，微量元素的添加对木霉菌菌丝生长及产孢影响不大，其中添加硫酸亚铁对菌丝生长和产孢略有促进作用，而添加硫酸锌、硫酸锰、硫酸钙、硫酸铜，硫酸钠，硫酸镁略有抑制作用。
由图8可知，选择硫酸亚铁为最佳发酵微量元素，木霉菌发酵液的抑菌活性在硫酸亚铁浓度为0.6g/L时最高，经木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径最小为3.52cm，抑菌效果最好，因此选择最佳硫酸亚铁浓度为0.6g/L。
实施例4：响应面优化实验结果
一、根据单因素实验结果和Box-Behnken试验设计原理。以最佳碳源、氮源、磷源、微量元素添加量为响应面考察因素。每个因素设计3个水平，用(-1，0，1)作为编码，以木霉菌菌发酵液处理后的茶炭疽病菌菌落生长直径作为响应值(Y)，使用Design-Expert 10软件进行四因素三水平进行实验优化，每个处理进行3次重复。培养基因素水平表如表1所示。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Figure BDA0002704802030000071
Figure BDA0002704802030000081
二、根据单因素实验结果和Box-Behnken试验设计原理。选择葡萄糖、酵母浸膏、磷酸氢二钾、硫酸亚铁作为自变量，以经木霉菌发酵液处理后茶炭疽病菌菌落生长直径作为响应值，进行四因素三水平响应面优化实验。实验设计方案及结果如表2所示。
表2 Box-Behnken试验设计结果
Figure BDA0002704802030000082
Figure BDA0002704802030000091
三、模型的建立及显著性分析
根据表2的实验结果，运用Design expert 10.0软件对结果进行回归拟合，得到如下回归方程：
Y＝3.37+0.85A-0.42B+0.087C+0.29D-0.058AB-0.087AC-0.29AD+1.15BC-0.43BD+0.79CD+0.98A2+1.01B2+0.64C2+0.32D2；
由表3可知，该模型P＜0.0001，说明模型是极显著的。模型相关系数R2＝0.9508，表明模型拟合较好。模型失拟项的P值为0.7556，差异不显著，表明该模型符合实际情况。实验结果表明，4个因素对木霉菌发酵液抑菌效果的影响大小依次为：葡萄糖＞酵母浸膏＞硫酸亚铁＞磷酸氢二钾。由回归方程系数显著性检验可知：A、B、BC、CD、A2、B2、C2差异极显著(P＜0.01)，D、BD、D2差异显著(P＜0.05)，其余不显著。
表3回归模型方差分析
Figure BDA0002704802030000092
Figure BDA0002704802030000101
四、最佳木霉菌发酵培养基的确定及验证实验
通过Design-expert软件绘制响应面图对实验结果进行可视化分析。如图9所示，从响应面三维图可以看出，该方程的抛物线图形开口均向上，说明方程存在最小值。由软件分析得到木霉菌发酵培养基中添加葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L时木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为2.98cm。
为验证响应面法所得结果的可靠性，按照响应面确定的各因素最优浓度配制木霉菌发酵培养基，进行3次实验验证，在实际实验条件下，木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为3.01cm，与预测值接近，说明响应面可运用于实际预测。
五、结论
通过响应面实验得到的木霉菌液体发酵培养基的最优配比为：马铃薯200g/L、葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L。在此条件下，木霉菌发酵液处理后茶炭疽菌菌落直径为3.01cm，与未优化的发酵培养基处理后的茶炭疽菌菌落直径(约为3.46cm)相比，茶炭疽菌菌落直径缩小了13％。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基，其特征是，该培养基应用于具有拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养，由以下成分组成：马铃薯、葡萄糖、酵母浸膏、磷酸氢二钾、硫酸亚铁。
2.根据权利要求1所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基，其特征是，所述发酵培养基由以下成分组成：马铃薯200g/L、葡萄糖15-20g/L、酵母浸膏1-2g/L、磷酸氢二钾0.8-1.2g/L、硫酸亚铁0.5-0.7g/L，余量为水。
3.根据权利要求1所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基，其特征是，所述发酵培养基由以下成分组成：马铃薯200g/L、葡萄糖18-19g/L、酵母浸膏1.5-2g/L、磷酸氢二钾0.8-1.0g/L、硫酸亚铁0.6-0.7g/L，余量为水。
4.根据权利要求1所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基，其特征是，所述发酵培养基由以下成分组成：马铃薯200g/L、葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氢二钾0.86g/L、硫酸亚铁0.63g/L，余量为水。
5.根据权利要求1所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基，其特征是，所述发酵培养基为液体发酵培养基。
6.一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵方法，其特征是，包括以下步骤：
S101、平板活化：在PDA培养基上接种直径5mm木霉菌菌饼，28℃恒温培养，培养7d；PDA培养基配置：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml；
S102、种子液培养：在500mL锥形瓶中装100mLPDB培养基，从平板上挑取菌落接种于摇瓶中，培养温度28℃，摇床转速120r/min，培养3d后进行接种发酵；PDB培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml；
S103、发酵培养基制备：将权利要求1-4任意一项的发酵培养基配置为液体发酵培养基，配置完成的液体发酵培养基在115℃灭菌30min后备用；
S104、发酵生长和产孢：在500mL锥形瓶中装100mL液体发酵培养基，向培养基中接种2mL步骤S102中的种子液，培养温度28℃，摇床转速120r/min，培养7d后用10mL灭菌ddH2O洗脱菌落孢子制成孢子悬浮液。
7.根据权利要求6所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵方法，其特征是，所述液体发酵培养基在发酵培养具有拮抗茶炭疽病菌的木霉菌过程中，对木霉菌发酵液抑菌效果的影响大小降序依次为：葡萄糖、酵母浸膏、硫酸亚铁、磷酸氢二钾。
8.根据权利要求6所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵方法，其特征是，所述木霉菌发酵液处理后的茶炭疽菌菌落直径为2.98-6.50cm。
9.一种如权利要求1所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵培养基在培养拮抗茶炭疽病菌的木霉菌中的应用。
10.一种如权利要求6所述的一种拮抗茶炭疽病菌的木霉菌发酵方法在制备拮抗茶炭疽病菌的木霉菌制剂中的应用。
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