CN110903994A - 产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物筛选及发酵工程领域，涉及一株产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌及其应用；本发明首先提供一株产高温蛋白酶菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)YYC4，保藏编号为CCTCC NO:M 2019599；然后将地衣芽孢杆菌YYC4应用于油料饼粕发酵制备生物活性肽饲料，步骤为：将油料饼粕加入水中，搅拌混合，得到混合液；然后接种地衣芽孢杆菌发酵种子液，在一定湿度和温度条件下进行发酵，发酵后得到活性肽生物饲料；本发明提供的产高温蛋白酶菌株能够在60℃条件下较好地生长，在油料饼粕蛋白在不灭菌条件下，直接高温固态发酵制备生物活性肽饲料，效果显著，成本极低，应用前景广阔。

Description

产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物筛选及发酵工程领域，具体涉及一株产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌及利用该菌株高温发酵饼粕制备多肽生物饲料的用途。
背景技术
高温菌是一类最适生长温度大于50℃的重要微生物，能产生特殊功能的酶类及其它活性物质，在生存机制和应用方面越来越受到关注。将高温菌应用于发酵工业可有效解决中温微生物最适生长温度(25～37℃)与发酵过程高温环境(50～65℃)不匹配的问题。另外，高温菌种世代时间短，合成次级代谢物速度快，可明显缩短发酵周期；发酵过程中产生的高温，可减少杂菌污染并能够杀死致病菌和病毒，省去高温高压灭菌步骤，简化发酵工艺，降低生产成本。由此看出，利用高温菌进行发酵具有广阔的发展前景。
近年来，研究者陆续从火山口、堆肥、温泉等极端环境中筛选出了高温菌。据报道，常温环境(如土壤、湖水及废水等)中也存在一定数量的高温菌。续钊从高温堆肥土样中分离到两株可以在70℃生长的菌株，经鉴定与嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)具有99％的相似性，将两菌株以外源嗜热菌的形式单一或组合添加到以城市污泥为原料的好氧堆肥中，堆肥温度比对照提前4d到达高温期,并且维持时间长；含水量、有机质及植物毒性大幅降低，嗜热菌数量和过氧化氢酶活增加。田康明等人利用产乳酸嗜热菌Bacilluscoagulans进行发酵，55℃发酵54h，总乳酸产量最高可达74.80g/L。李世林等人从烟叶中筛选出耐高温蛋白酶产生菌，用该枯草芽孢杆菌GW-3发酵烟叶，蛋白质降解率为16.74％。Wang等人在家禽排泄物堆肥过程中筛选出的嗜热放线菌Thermoactinomyces sp.strainYT06在60℃下能高效降解鸡羽毛。
目前，利用油料饼粕发酵制备多肽生物饲料多采用中温微生物，需要对底物进行灭菌处理，并需严格控制发酵温度及条件，生产成本较高。目前，对于利用高温产蛋白酶菌株，在底物不灭菌条件直接固态发酵油料饼粕生产生物饲料的研究还较少。本发明对于简化饼粕发酵生物饲料的生产工艺，降低生产成本等具有一定的意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明旨在解决所述问题之一，本发明提供一株产高温蛋白酶菌株地衣芽孢杆菌YYC4，本发明所提供的产高温蛋白酶菌株能够在60℃条件下较好地生长，在油料饼粕蛋白不灭菌条件下，直接高温固态发酵制备生物活性肽饲料方面具有潜在的应用价值。该方法操作简便，效果显著，成本极低，经济效益显著，获得的生物饲料品质佳，活性肽含量明显提高。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案具体如下：
本发明首先提供一株产高温蛋白酶菌株，保藏编号为CCTCC NO:M 2019599，建议的分类命名为Bacillus licheniformis YYC4地衣芽孢杆菌YYC4；
本菌株是从红云红河烟草(集团)有限责任公司生产的盒装云烟(市售)中分离得到的，于2019年08月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学；
此外，本发明还提供一种产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌YYC4的应用，将地衣芽孢杆菌YYC4应用于油料饼粕发酵制备生物活性肽饲料，按照下述步骤进行：
(1)地衣芽孢杆菌YYC4的活化培养：将分离得到的地衣芽孢杆菌YYC4接种到液体培养基进行活化培养，得到地衣芽孢杆菌发酵种子液；
具体操作：无菌条件下将地衣芽孢杆菌YYC4接种至斜面培养基，60℃培养24h复苏菌种，再在平板上划线培养(60℃，24h)，挑取单菌落菌种分别接种到装有100mL液体培养基的摇瓶(250mL)中，160r/min，60℃培养24h，得到芽孢杆菌YYC4发酵液；按实际需要再以1％的接种量接种到大量液体培养基中扩大培养，得到地衣芽孢杆菌发酵种子液；
(2)将油料饼粕加入水中，搅拌混合，得到混合液；然后在混合液中接入步骤(1)制备的地衣芽孢杆菌发酵种子液，在一定湿度和温度条件下进行发酵，发酵后得到活性肽生物饲料。
优选的，步骤(1)中所述液体培养基为LB培养基，培养基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH为7.0。
优选的，步骤(2)中所述的油料饼粕包括豆粕、菜籽粕或葵花籽粕的一种或多种。
优选的，步骤(2)中所述油料饼粕与水的用量比为1g：0.8～2.0mL。
优选的，步骤(2)中所述地衣芽孢杆菌发酵种子液与混合液的用量比为2～10mL：100g。
优选的，步骤(2)中所述的湿度为40～80％，温度为50～60℃。
优选的，步骤(2)中所述的发酵时间为36～72h。
有益效果：
(1)目前，利用油料饼粕发酵制备多肽生物饲料多采用中温微生物，需要对底物进行灭菌处理，并需严格控制发酵温度及条件，生产成本较高；本发明所提供的产高温蛋白酶菌株能够在60℃条件下较好地生长，在油料饼粕蛋白不灭菌条件下，直接高温固态发酵制备生物活性肽饲料方面具有潜在的应用价值。
(2)本发明提供的饼粕发酵生物饲料的生产工艺简单，操作简便，效果显著，成本极低，经济效益显著，获得的生物饲料品质佳。
(3)本发明利用地衣芽孢杆菌YYC4发酵油料饼粕制备的生物饲料中粗蛋白及活性肽含量明显提高；经实验数据显示，发酵豆粕得到的生物饲料中粗蛋白及活性肽含量分别为50.23％～53.50％和16.50～19.75％；发酵葵花籽粕得到的生物饲料中粗蛋白及活性肽含量分别为33.08％～36.115％和11.21％～13.96％；发酵菜籽粕得到的生物饲料中粗蛋白及活性肽含量分别为40.11％～44.62％和9.66％～13.35％。
附图说明
图1为本发明地衣芽孢杆菌YYC4的菌落形态。
图2为本发明地衣芽孢杆菌YYC4革兰氏染色图。
图3为本发明地衣芽孢杆菌YYC4在初筛平板上产生的水解圈。
图4为本发明地衣芽孢杆菌YYC4基于16S rDNA序列构建的系统发育树。
图5为本发明地衣芽孢杆菌YYC4在30℃和60℃下的生长曲线。
具体实施方式
地衣芽孢杆菌YYC4的序列信息：
Figure BDA0002198294880000031
Figure BDA0002198294880000041
地衣芽孢杆菌YYC4的分离：
(1)于镇江市烟草销售点购置红云红河烟草(集团)有限责任公司生产的盒装云烟，随机取两根香烟的烟丝与100mL无菌水充分混合，静置30min；
(2)取1mL上清液于100mL富集培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，pH7.0，121℃灭菌20min)中，60℃、160r/min培养24h，10倍梯度稀释后，取100μL稀释菌液涂布于筛选平板培养基(K2HPO4 0.1％、KCl 0.5％、MgSO4﹒7H2O 0.05％、FeSO4﹒7H2O0.01％、脱脂乳1％、琼脂1.8％，pH自然，脱脂乳115℃灭菌15min，其他均121℃灭菌20min)中，60℃静置培养24h。挑取产生透明圈且表观不一的单菌落划线于LB固体平板培养基，培养至显微观察为单一菌；
(3)初筛：用接种环挑取单个菌落接种于50mL LB液体培养基中，60℃、160r/min培养24h，取2μL菌液点种于筛选平板培养基中，60℃静置培养24h，该菌株在初筛平板上产生的水解圈如图3所示，计算水解圈直径与菌落直径之比(K值)；经测定，K值最大为3.50，说明该菌株具有较强的产高温蛋白酶能力，能降解培养基中的大分子蛋白质。
(4)复筛：取粉碎过40目筛豆粕20g，豆粕与水按照质量体积比为1g：1.4mL的比例混合，并按照种子液：(饼粕+水)体积质量比为6％(v/w)的比例接入地衣芽孢杆菌扩大培养后的种子液，在湿度60％，温度55℃条件下发酵54h，烘干并粉碎。
分别参照《GB/T 6432-2018饲料中粗蛋白的测定》及《GB/T 22492-2008大豆肽粉》测定发酵豆粕粗蛋白和活性肽含量；经测定，该菌株发酵的豆粕粗蛋白和活性肽含量分别为52.19％和18.06％，获得具有生产生物活性肽能力的地衣芽孢杆菌YYC4。
地衣芽孢杆菌YYC4的鉴定：
(1)菌落形态及革兰氏染色：将上述分离到的菌株制备成合适浓度的菌液涂布于LB固体平板培养基，60℃培养24h；菌落形态如图1所示，菌落浅黄色，菌落形态圆形、表面光滑、不透明、边缘清晰、粘稠，易挑取。革兰氏染色图如图2所示，菌体经革兰氏染色后在光学显微镜下观察，呈革兰氏阳性且菌体为杆状；
(2)分子生物学鉴定：对分离出的菌株进行16S rDNA序列分析，将测序结果经NCBI比对后用MEGA软件构建系统进化树如图4；该菌株与Bacillus licheniformis strainTCCC 11148(CP033218.1:323374-323573)聚在同一分支上，且同源性高达100％，该菌属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；
上述地衣芽孢杆菌YYC4于2019年08月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2019599，建议的分类命名为Bacilluslicheniformis YYC4地衣芽孢杆菌YYC4。
地衣芽孢杆菌YYC4的嗜热性验证(30℃和60℃条件下的生长曲线)：
挑取一环菌体于50mL LB液体培养基中，60℃、160r/min培养12h后，按2％的接种量转接至新的LB培养基中，前5h每隔0.5h取样一次，5～10h每隔1h取样一次，之后每隔2h取样一次，经测定，该菌在30℃下生长不稳定，且延滞期较长，在60℃下培养，2h后进入对数生长期，如图5所示。
实施例1：
(1)菌种活化：无菌条件下将地衣芽孢杆菌YYC4接种至LB斜面培养基，60℃培养24h复苏菌种，再在LB平板培养基上划线培养，60℃培养24h，然后挑取单菌落菌种分别接种到装有100mL液体培养基的摇瓶(250mL)中，160r/min，60℃培养24h，得到芽孢杆菌YYC4发酵液；按实际需要再以1％的接种量接种到大量液体培养基中扩大培养，得到地衣芽孢杆菌发酵种子液；
其中LB培养基的配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH为7.4；
(2)饼粕发酵：油料饼粕选取豆粕、葵花籽粕和菜籽粕；分别取豆粕、葵花籽粕或菜籽粕各20g，油料饼粕与水按照质量体积比为1g：0.8mL的比例混合，得到混合液；然后在混合液中接入步骤(1)制备的地衣芽孢杆菌发酵种子液，其中地衣芽孢杆菌发酵种子液与混合液的用量比为2mL：100g，在湿度40％，温度50℃条件下发酵36h，得到活性肽生物饲料。
对照组1：操作实施例1的步骤(2)，区别是不接种地衣芽孢杆菌发酵种子液。
发酵饼粕及对照粗蛋白及活性肽含量见表1。
实施例2：
(1)菌种活化：具体步骤同实施例1的步骤(1)；
(2)油料饼粕发酵：油料饼粕选取豆粕、葵花籽粕和菜籽粕；分别取豆粕、葵花籽粕或菜籽粕各20g，油料饼粕与水按照质量体积比为1g：2mL的比例混合，得到混合液；然后在混合液中接入步骤(1)制备的地衣芽孢杆菌发酵种子液，其中地衣芽孢杆菌发酵种子液与混合液的用量比为10mL：100g，在湿度80％，温度60℃条件下发酵72h，得到活性肽生物饲料。
对照组2：操作同实施例2的步骤(2)，区别是不接种地衣芽孢杆菌发酵种子液。
发酵饼粕及对照粗蛋白及活性肽含量见表1。
实施例3：
地衣芽孢杆菌YYC4在油料饼粕发酵制备生物活性肽饲料中的应用：
(1)菌种活化：具体步骤同实施例1的步骤(1)；
(2)油料饼粕发酵：油料饼粕选取豆粕、葵花籽粕和菜籽粕；分别取豆粕、葵花籽粕或菜籽粕各20g，油料饼粕与水按照质量体积比为1g：1.4mL的比例混合，得到混合液；然后在混合液中接入步骤(1)制备的地衣芽孢杆菌发酵种子液，其中地衣芽孢杆菌发酵种子液与混合液的用量比为6mL：100g，在湿度60％，温度55℃条件下发酵54h，得到活性肽生物饲料。
对照组3：操作同实施例3的步骤(2)，区别是不接种地衣芽孢杆菌发酵种子液。
发酵饼粕及对照粗蛋白及活性肽含量见表1。
表1蛋白及活性肽含量(％)
Figure BDA0002198294880000061
从表1可以看出，经发酵后，饼粕中活性肽含量明显增加，说明该菌发酵油料饼粕的效果良好，具有大规模生产生物活性肽饲料的潜力。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1414
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 1
tggctccaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga 120
ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga 180
ttggcttagc ctcgcggctt cgctgccctt tgttctgccc attgtagcac gtgtgtagcc 240
caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300
cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg 360
cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact 420
ctgcccccga aggggaagcc ctatctctag ggttgtcaga ggatgtcaag acctggtaag 480
gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccactg cttgtgcggg cccccgtcaa 540
ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgtttgct 600
gcagcactaa agggcggaaa ccctctaaca cttagcactc atcgtttacg gcgtggacta 660
ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca gttacagacc 720
agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac cgctacacgt 780
ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc ctccccggtt 840
gagccggggg ctttcacatc agacttaaag aaccgcctgc gcgcgcttta cgcccaataa 900
ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg 960
ctttctggtt aggtaccgtc aaggtaccgc cctgttcgaa cggtacttgt tcttccctaa 1020
caacagagtt ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt 1080
tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag 1140
tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccgtt 1200
accccaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagcga aaagccacct 1260
tttatgtttg aaccatgcgg ttcaaacaag catccggtat tagccccggt ttcccggagt 1320
tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg ctgacctaag 1380
ggagcaagct cccgtcggtc cgctcgactg catg 1414

Claims (8)

1.一株产高温蛋白酶菌株，其特征在于，所述菌株为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)YYC4，保藏编号为CCTCC NO:M 2019599。
2.权利要求1所述的产高温蛋白酶菌株用于油料饼粕蛋白发酵制备生物活性肽饲料的用途，其特征在于，具体步骤如下：
(1)地衣芽孢杆菌YYC4的活化培养：将分离得到的地衣芽孢杆菌YYC4接种到液体培养基进行活化培养，得到地衣芽孢杆菌发酵种子液；
(2)将油料饼粕加入水中，搅拌混合，得到混合液；然后在混合液中接入步骤(1)制备的地衣芽孢杆菌发酵种子液，在一定湿度和温度条件下进行发酵，发酵后得到活性肽生物饲料。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，步骤(1)中所述液体培养基为LB培养基，培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH为7.0。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述的油料饼粕包括豆粕、菜籽粕或葵花籽粕的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述油料饼粕与水的用量比为1g：0.8～2.0mL。
6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述地衣芽孢杆菌发酵种子液与混合液的用量比为2～10mL：100g。
7.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述的湿度为40～80％，温度为50～60℃。
8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述的发酵时间为36～72h。
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