CN112342146A - 一种利用l-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的香灰菌株 - Google Patents
一种利用l-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的香灰菌株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种利用L‑苯丙氨酸生物发酵合成2‑苯乙醇的香灰菌株，所述香灰菌株为暗色环纹炭团菌（Annulohypoxylon stygium）金鸡岭，已于2020年9月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020504，属于微生物技术领域。本发明的香灰菌株可以利用L‑苯丙氨酸生物发酵合成2‑苯乙醇，可以在含有2‑苯乙醇的培养基中生长对2‑苯乙醇具有耐受性，有利于提高2‑苯乙醇的合成量。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种利用L-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的香灰菌株。
背景技术
2-苯乙醇是一种玫瑰香型的风味物质，世界每年产量约10000吨。能够抑制革兰氏阴性菌、球菌、杆菌以及部分真菌；它还是合成一些高附加值药物比如苯乙醇苷的底物，具有抗菌、抗肿瘤、强心等作用，故 2-苯乙醇在医药卫生领域也有重要应用。在饮料行业，2-苯乙醇是一种重要的食品添加剂，用于调节饮料的风味，除此之外它也是化妆品或者香水中的重要香味物质之一。2-苯乙醇可以在玫瑰花瓣中提取得到，但是成本过高，得率较低，因此目前主要通过化工合成的方式来获得，由于化工合成的过程中会含有苯类以及乙烯类有毒有害物质，添加到食品中会对食品安全造成一定的威胁，因此生物合成2-苯乙醇的方式成为当今研究的热点。
目前发现生物合成2-苯乙醇的方式是利用酿酒酵母的艾里希通路（Ehrlichpathway）通过L-苯丙氨酸生物转化合成2-苯乙醇或者利用碳源从头合成。天然的2-苯乙醇供不应求，开发新的菌种用于生产2-苯乙醇尤为重要。本发明则发现了一种可以利用L-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的香灰菌菌株金鸡岭，香灰菌是银耳的伴生菌，无毒无害，对于食品添加剂而言，安全性是评价食品添加剂质量的重要因素，因此该菌株对食品添加剂天然2-苯乙醇的生产具有很重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用L-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的香灰菌株，从而目前天然的2-苯乙醇供不应求的问题。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
所述香灰菌株为暗色环纹炭团菌（Annulohypoxylon stygium）金鸡岭，于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：湖北省武汉市武汉大学保藏中心，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2020504。
本发明与现有技术相比的优点：
1、该菌种是一种可以利用L-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的菌种；
2、生物发酵合成的2-苯乙醇属于天然产物，安全性高；
3、生物发酵的方式合成2-苯乙醇效率比直接植物提取得率高。
附图说明
图1 27株野生菌株产2-苯乙醇含量结果图。
图2为本发明金鸡岭菌株与其他四个菌株对2-苯乙醇耐受性的对比图。
图3为本发明金鸡岭菌株在PDA培养基上培养的菌丝形态特征。
图4金鸡岭菌株生长到中后期由内而外会发生转色，最终变为黑褐色。
图5为金鸡岭菌株生长至中后期的菌丝电镜照片。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行简单的改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1菌株筛选
对27株野生香灰菌菌株（其中金鸡岭菌株采集于福建省宁德市古田县大桥镇沽洋村金鸡岭腐木中）在PDA（马铃薯200 g/L；葡萄糖20 g/L；琼脂20 g/L；水1000 mL）试管培养基上转接活化2次，将香灰菌菌种用接种针挖取约1 cm3的小块接种到含有PDA培养基的培养皿中培养4 d，在培养皿同一半径上用直径0.5 cm的打孔器打孔制备菌种块，接种至含有100mL发酵培养基（马铃薯200 g/L；葡萄糖20 g/L；L-苯丙氨酸4 g/L；水1000 mL）的三角瓶中，每瓶接种两块，置于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养6 d，将发酵液4000 r/min离心10 min，取上清液0.22 um尼龙微孔滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪检测L-苯丙氨酸和2-苯乙醇的含量。
高效液相色谱条件为色谱柱：C18（5 um，250 mm×4.6 mm）；柱温30 ℃；进样量10uL；流速0.7 mL/min；DAD检测器，检测波长258 nm；流动相A：0.6 %乙酸水溶液；流动相B：甲醇，流动相洗脱梯度见表1。
表1 流动相洗脱梯度表
通过对27个野生菌株的筛选，其中S1、HPSP0032B、HPSP0032W、金鸡岭、古田极乐5个菌株2-苯乙醇含量均高于1.0 g/L（图1）。
对5个菌株以同样条件进行2次复筛，结果为金鸡岭菌株产2-苯乙醇含量最高为1.2113 g/L。
实施例2 对5个高产菌株对2-苯乙醇耐受性对比试验
对S1、HPSP0032B、HPSP0032W、金鸡岭、古田极乐5个菌株进行活化1次，用直径0.5 cm的打孔器按同一半径打孔制备菌种块，配制含有浓度分别为0 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L 2-苯乙醇的PDA培养基，将培养基121℃20 min高压灭菌后倒平皿，将制备的5个菌株的菌种块分别接种到对应的培养皿上，28℃恒温培养4 d，观察菌丝生长情况。
结果表明香灰菌金鸡岭菌株在含有浓度为2 g/L 2-苯乙醇的PDA培养基上仍能生长，但生长速度较慢，其他4个菌株均不生长，在同一浓度时，香灰菌金鸡岭菌株生长速度最快（图2）。
实施例3 香灰菌金鸡岭菌株可以利用L-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的验证实验
香灰菌金鸡岭菌株在PDA（马铃薯200 g/L；葡萄糖20 g/L；琼脂20 g/L；水1000 mL）试管培养基上转接活化2次，将香灰菌菌种用接种针挖取约1 cm3的小块接种到含有PDA培养基的培养皿中培养4 d，在培养皿同一半径上用直径0.5 cm的打孔器打孔制备菌种块，分别接种至含有100 mL的发酵培养基（马铃薯200 g/L；葡萄糖20 g/L；L-苯丙氨酸4 g/L；水1000 mL）和PDB培养基（马铃薯200 g/L；葡萄糖20 g/L；水1000 mL）的三角瓶中，每瓶接种两块，置于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养6 d，将发酵液4000 r/min离心10min，取上清液0.22 um尼龙微孔滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪检测L-苯丙氨酸和2-苯乙醇的含量，检测条件与实施例1相同。
实验结果表明PDB培养基发酵液中2-苯乙醇的含量较低为0.1002 g/L，发酵培养基发酵液中2-苯乙醇的含量为1.2732 g/L，L-苯丙氨酸含量由4 g/L降为2.0232 g/L。说明香灰菌金鸡岭菌株利用L-苯丙氨酸生物发酵合成了2-苯乙醇。
实施例4 菌种鉴定
（1）形态学鉴定
将筛选获得的香灰菌金鸡岭菌株进行活化1次，用直径0.5 cm的打孔器按同一半径打孔制备菌种块，配制PDA培养基，将培养基121℃20 min高压灭菌后倒平皿，将金鸡岭菌株的菌种块接种到培养皿上28℃恒温培养4 d，观察菌丝生长情况。图3所示，香灰菌金鸡岭生长初期为白色丝状真菌；图4所示，生长到中后期由内而外会发生转色，最终变为黑褐色；图5所示为生长至中后期的菌丝电镜照片。
（2）ITS分子鉴定
方法与结果：采用ILLUMINA测序，拼接获得金鸡岭菌株全基因组序列；从NCBI中下载Annulohypoxylon stygium（香灰菌）的ITS序列作为参照；通过本地blast定位并抽取基因组中对应的ITS序列（结果中的金鸡岭ITS序列）；将抽取的序列在NCBI中的nt库进行比对，找到匹配最好的序列（Annulohypoxylon stygium isolate XH10，登录号：FJ848859），两个序列相似性为100%，说明金鸡岭与Annulohypoxylon stygium isolate XH10属于同一个种，即为暗色环纹炭团菌（Annulohypoxylon stygium）金鸡岭。
金鸡岭菌株的ITS序列：
CCGTTGGTGA ACCAGCGGAG GGATCATTAC TGAGTTATCA AAAACTCCAA
CCCTTTGTGA ACCTACCTAT GTTTCCTCCG GCGTACCGCT TTAGCCTACC
CACAGGGCTC CCCTAAGGGG GGGTTCTGCT GGGGAGGTGC CTGAGTGCTA
CCCATCCTTC GGGGTACGGT TAGTGCAGTG AAGGTGCTGA CCAAGGCCTC
GGCGGCGCCG AGTAGGACCG CTCCAAACTT AAGCACCTAG TGCATCCAAC
CCCGCGTTGA ACAACTATCG AAAATCTGCT TTTGCTTTTT TTCTTTACGC
TAAAACGTCT TTCCTGGTTG GAATTATTGC TCGAAATAAT AATTTCTTTA
CCCTGCAGTC GTTTGTTTTC AAGCTACAAT ATCTGCTCGA AAATTGTTCA
AAGCTCTGAG GGGTCTGAAT GAATTCATAA AATTGGCAAA AGCCACCTAT
AAACTACGGT TCTTAGGGGG TGATCAAACC AAGGTTTTAA AAACCAAATA
CGTTAAAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATC GATGAAGAAC
GCAGCGAAAT GCGATAAGTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG
AATCTTTGAA CGCACATTGC GCCCATTAGT ATTCTAGTGG GCATGCCTAT
TCGAGCGTCA TTACAACCCT TAAGCCTTGT AGCTTAGCGT TGGGAATCTA
CCCCTCACTG AGGGGTAGTT CCTTAAATTT AGTGGCGGGG TTATAGCACA
CTCTAAGCGT AGTAGTTTAA CTCGCTTTCA GGGAGGCTGT AGCTGCTTGC
CGTAAAACCC CCTATAACTT ATAGTGGTTG ACCTCGGATT AGGTAGGAAT
ACCCGCTGAA CTTAAGCATA TCA
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种利用L-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的香灰菌株
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgttggtga accagcggag ggatcattac tgagttatca aaaactccaa ccctttgtga 60
acctacctat gtttcctccg gcgtaccgct ttagcctacc cacagggctc ccctaagggg 120
gggttctgct ggggaggtgc ctgagtgcta cccatccttc ggggtacggt tagtgcagtg 180
aaggtgctga ccaaggcctc ggcggcgccg agtaggaccg ctccaaactt aagcacctag 240
tgcatccaac cccgcgttga acaactatcg aaaatctgct tttgcttttt ttctttacgc 300
taaaacgtct ttcctggttg gaattattgc tcgaaataat aatttcttta ccctgcagtc 360
gtttgttttc aagctacaat atctgctcga aaattgttca aagctctgag gggtctgaat 420
gaattcataa aattggcaaa agccacctat aaactacggt tcttaggggg tgatcaaacc 480
aaggttttaa aaaccaaata cgttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc 540
gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg 600
aatctttgaa cgcacattgc gcccattagt attctagtgg gcatgcctat tcgagcgtca 660
ttacaaccct taagccttgt agcttagcgt tgggaatcta cccctcactg aggggtagtt 720
ccttaaattt agtggcgggg ttatagcaca ctctaagcgt agtagtttaa ctcgctttca 780
gggaggctgt agctgcttgc cgtaaaaccc cctataactt atagtggttg acctcggatt 840
aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata tca 873
Claims (2)
1.一种利用L-苯丙氨酸生物发酵合成2-苯乙醇的香灰菌株，其特征在于，所述香灰菌株为暗色环纹炭团菌（Annulohypoxylon stygium）金鸡岭，已于2020年9月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020504。
2.如权利要求1所述的香灰菌株在制备2-苯乙醇中的应用。
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| 贺新生，等: "一种椴木栽培银耳新病原菌——暗色环纹炭团菌的鉴定", 《中国菌物学会2009学术年会论文摘要集》 * |
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