CN112266937B - 一种适用于香灰菌生物发酵合成2-苯乙醇的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种适用于香灰菌生物发酵合成2‑苯乙醇的培养基。本配方为每1000 mL水中含有马铃薯200～800 g，L‑苯丙氨酸2～8 g，麦芽糖20～100 g，硫酸镁0.1～0.4 g，pH值自然，各成分均溶解121℃灭菌20 min即可使用。采用本培养基香灰菌合成2‑苯乙醇的产量高，本培养基制作简单，操作方便，易于实现工厂化。
Description
技术领域
本发明涉及涉及微生物发酵领域，具体涉及一种适用于香灰菌生物发酵合成2-苯乙醇的培养基。
背景技术
2-苯乙醇是一种玫瑰香型的风味物质，世界每年产量约10000吨。能够抑制革兰氏阴性菌、球菌、杆菌以及部分真菌；它还是合成一些高附加值药物比如苯乙醇苷的底物，具有抗菌、抗肿瘤、强心等作用，故 2-苯乙醇在医药卫生领域也有重要应用。在饮料行业，2-苯乙醇是一种重要的食品添加剂，用于调节饮料的风味，除此之外它也是化妆品或者香水中的重要香味物质之一。2-苯乙醇可以在玫瑰花瓣中提取得到，但是成本过高，得率较低，因此目前主要通过化工合成的方式来获得，由于化工合成的过程中会含有苯类以及乙烯类有毒有害物质，添加到食品中会对食品安全造成一定的威胁，因此生物合成2-苯乙醇的方式成为当今研究的热点。
目前发现生物合成2-苯乙醇的方式是利用酿酒酵母的艾里希通路（Ehrlichpathway）通过L-苯丙氨酸生物转化合成2-苯乙醇或者利用碳源从头合成。天然的2-苯乙醇供不应求，开发新的菌种用于生产2-苯乙醇尤为重要。本发明则是一种适用于香灰菌生物发酵合成2-苯乙醇的培养基，香灰菌是银耳的伴生菌，无毒无害，对于食品添加剂而言，安全性是评价食品添加剂质量的重要因素，因此该菌株对食品添加剂天然2-苯乙醇的生产具有很重要的意义，本配方可以提高金鸡岭菌株2-苯乙醇的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于香灰菌生物发酵合成2-苯乙醇的培养基。
实现本发明目的的技术解决方案为：
一种适用于香灰菌生物发酵合成2-苯乙醇的培养基，每1000 mL水中含有马铃薯200～800 g，L-苯丙氨酸2～8 g，麦芽糖20～100 g，硫酸镁0.1～0.4 g，pH值自然。
优选的，每1000 mL水中含有马铃薯600 g，L-苯丙氨酸6 g，麦芽糖40g，硫酸镁0.3g，pH值自然。
所述香灰菌为暗色环纹炭团菌（Annulohypoxylon stygium）金鸡岭，已于2020年9月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020504，地址为武汉大学。
所述香灰菌分离至古田县金鸡岭分离得到的。
其具体实施步骤如下：
（1）培养基制备：按照上述培养基配方称取马铃薯，加水浸提25 min，6层纱布过滤，滤液加入一定比例的麦芽糖、L-苯丙氨酸、硫酸镁混匀充分溶解，高温121℃灭菌20min。
（2）菌种活化：香灰菌菌种在PDA试管培养基上转接活化2次，将香灰菌菌种用接种针挖取约1 cm3的小块接种到含有PDA培养基的培养皿中培养4 d，在培养皿同一半径上用直径0.5 cm的打孔器打孔制备菌种块，接种至含有100 mLPDB培养基的三角瓶中，每瓶接种两块，置于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养4d得到活化菌液。
（3）接种：准确量取10 mL菌液接种到含有100 mL上述配方培养基的三角瓶中，至于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养6 d，将发酵液4000 r/min离心10 min，取上清液0.22 um尼龙微孔滤膜过滤，滤液即为香灰菌发酵液样品，待上机检测。
（4）检测：采用高效液相色谱法进行香灰菌发酵液样品中2-苯乙醇含量的检测。
本发明的优点：
1、提供一种适用于香灰菌生物发酵合成2-苯乙醇的培养基配方，为2-苯乙醇产业发展提供技术依据。
2、培养基成分简单，便宜，操作方便，成本低，便于工厂化实施。
附图说明
图1为不同马铃薯添加量生物转化生成2-苯乙醇的含量柱形图。
图2为不同L-苯丙氨酸添加量生物转化生产2-苯乙醇的含量柱形图。
图3为不同麦芽糖添加量生物转化生产2-苯乙醇的含量柱形图。
图4为不同硫酸镁添加量生物转化生产2-苯乙醇的含量柱形图。
具体实施方式
实施例1菌株的获得
（1）形态学鉴定
将古田县金鸡岭分离得到的香灰菌金鸡岭菌株进行活化1次，用直径0.5 cm的打孔器按同一半径打孔制备菌种块，配制PDA培养基，将培养基121℃20 min高压灭菌后倒平皿，将金鸡岭菌株的菌种块接种到培养皿上28℃恒温培养4 d，观察菌丝生长情况。结果得出金鸡岭为白色丝状真菌。
（2）ITS分子鉴定
方法与结果：采用ILLUMINA测序，拼接获得金鸡岭菌株全基因组序列；到NCBI中下载Annulohypoxylon stygium（香灰菌）的ITS序列作为参照；通过本地blast定位并抽取基因组中对应的ITS序列（结果中的金鸡岭ITS序列）；将抽取的序列在NCBI中的nt库进行比对，找到匹配最好的序列（Annulohypoxylon stygium isolate XH10，登录号：FJ848859），两个序列相似性为100%，说明金鸡岭与Annulohypoxylon stygium isolate XH10属于同一个种，即为暗色环纹炭团菌（Annulohypoxylon stygium）金鸡岭。
金鸡岭菌株的ITS序列：
CCGTTGGTGA ACCAGCGGAG GGATCATTAC TGAGTTATCA AAAACTCCAA
CCCTTTGTGA ACCTACCTAT GTTTCCTCCG GCGTACCGCT TTAGCCTACC
CACAGGGCTC CCCTAAGGGG GGGTTCTGCT GGGGAGGTGC CTGAGTGCTA
CCCATCCTTC GGGGTACGGT TAGTGCAGTG AAGGTGCTGA CCAAGGCCTC
GGCGGCGCCG AGTAGGACCG CTCCAAACTT AAGCACCTAG TGCATCCAAC
CCCGCGTTGA ACAACTATCG AAAATCTGCT TTTGCTTTTT TTCTTTACGC
TAAAACGTCT TTCCTGGTTG GAATTATTGC TCGAAATAAT AATTTCTTTA
CCCTGCAGTCGTTTGTTTTCAAGCTACAATATCTGCTCGAAAATTGTTCAAAGCTCTGAG GGGTCTGAATGAATTCATAAAATTGGCAAAAGCCACCTATAAACTACGGTTCTTAGGGGG TGATCAAACCAAGGTTTTAAAAACCAAATCGTTAAAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGG GCATGCCTATTCGAGCGTCATTACAACCCTTAAGCCTTGTAGCTTAGCGTTGGGAATCTACCCCTCACTG AGGGGTAGTTCCTTAAATTTAGTGGCGGGGTTATAGCACACTCTAAGCGT AGTAGTTTAA CTCGCTTTCAGGGAGGCTGTAGCTGCTTGCCGTAAAACCCCCTATAACTT ATAGTGGTTG ACCTCGGATT AGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCA。
实施例2
一种适用于香灰菌金鸡岭菌株生物发酵合成2-苯乙醇的培养基配方，每1000 mL水中包括马铃薯添加量分别为200、400、600、800、1000 g，L-苯丙氨酸4 g，麦芽糖20 g，硫酸镁0.1 g，PH值自然，各成分溶解均匀高温121℃灭菌20 min即可。
其具体实施步骤如下：
（1）培养基制备：按照上述培养基配方称取马铃薯，加水浸提25 min，6层纱布过滤，滤液加入一定比例的麦芽糖、L-苯丙氨酸、硫酸镁混匀充分溶解，高温121℃灭菌20min。
（2）菌种活化：香灰菌菌种在PDA试管培养基上转接活化2次，将香灰菌菌种用接种针挖取约1 cm3的小块接种到含有PDA培养基的培养皿中培养4 d，在培养皿同一半径上用直径0.5 cm的打孔器打孔制备菌种块，接种至含有100 mLPDB培养基的三角瓶中，每瓶接种两块，置于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养4 d得到活化菌液。
（3）接种：准确量取10 mL菌液接种到含有100 mL上述配方培养基的三角瓶中，至于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养6 d，将发酵液4000 r/min离心10 min，取上清液0.22 um尼龙微孔滤膜过滤，滤液即为香灰菌发酵液样品，待上机检测。
（4）检测：采用高效液相色谱法进行香灰菌发酵液样品中2-苯乙醇含量的检测。
结果为马铃薯添加量为600 g时2-苯乙醇的合成量为1.6589 g/L，产量最高。
实施例3
一种适用于香灰菌金鸡岭菌株生物发酵合成2-苯乙醇的培养基配方，每1000 mL水中包括马铃薯200 g，L-苯丙氨酸添加量分别为0、2、4、6、8 g，麦芽糖20 g，硫酸镁0.1 g，PH值自然，各成分溶解均匀高温121℃灭菌20 min即可。
其具体实施步骤如下：
（1）培养基制备：按照上述培养基配方称取马铃薯，加水浸提25 min，6层纱布过滤，滤液加入一定比例的麦芽糖、L-苯丙氨酸、硫酸镁混匀充分溶解，高温121℃灭菌20min。
（2）菌种活化：香灰菌菌种在PDA试管培养基上转接活化2次，将香灰菌菌种用接种针挖取约1 cm3的小块接种到含有PDA培养基的培养皿中培养4 d，在培养皿同一半径上用直径0.5 cm的打孔器打孔制备菌种块，接种至含有100 mLPDB培养基的三角瓶中，每瓶接种两块，置于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养4 d得到活化菌液。
（3）接种：准确量取10 mL菌液接种到含有100 mL上述配方培养基的三角瓶中，至于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养6 d，将发酵液4000 r/min离心10 min，取上清液0.22 um尼龙微孔滤膜过滤，滤液即为香灰菌发酵液样品，待上机检测。
（4）检测：采用高效液相色谱法进行香灰菌发酵液样品中2-苯乙醇含量的检测。
结果为L-苯丙氨酸添加量为4 g时2-苯乙醇的合成量为1.4815 g/L，产量最高。
实施例4
一种可以适用于香灰菌金鸡岭菌株生物发酵合成2-苯乙醇的培养基配方，每1000mL水中包括马铃薯200 g，L-苯丙氨酸4 g，麦芽糖添加量分别为20、40、60、80、100、120 g，硫酸镁0.1 g，PH值自然，各成分溶解均匀高温121℃灭菌20 min即可。
其具体实施步骤如下：
（1）培养基制备：按照上述培养基配方称取马铃薯，加水浸提25 min，6层纱布过滤，滤液加入一定比例的麦芽糖、L-苯丙氨酸、硫酸镁混匀充分溶解，高温121℃灭菌20min。
（2）菌种活化：香灰菌菌种在PDA试管培养基上转接活化2次，将香灰菌菌种用接种针挖取约1 cm3的小块接种到含有PDA培养基的培养皿中培养4 d，在培养皿同一半径上用直径0.5 cm的打孔器打孔制备菌种块，接种至含有100 mLPDB培养基的三角瓶中，每瓶接种两块，置于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养4 d得到活化菌液。
（3）接种：准确量取10 mL菌液接种到含有100 mL上述配方培养基的三角瓶中，至于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养6 d，将发酵液4000 r/min离心10 min，取上清液0.22 um尼龙微孔滤膜过滤，滤液即为香灰菌发酵液样品，待上机检测。
（4）检测：采用高效液相色谱法进行香灰菌发酵液样品中2-苯乙醇含量的检测。
结果为麦芽糖添加量为60 g时2-苯乙醇的合成量为1.5912 g/L，产量最高。
实施例5
一种适用于香灰菌金鸡岭菌株生物发酵合成2-苯乙醇的培养基配方，每1000 mL水中包括马铃薯200 g，L-苯丙氨酸4 g，麦芽糖20 g，硫酸镁添加量分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4 g，PH值自然，各成分溶解均匀高温121℃灭菌20 min即可。
其具体实施步骤如下：
（1）培养基制备：按照上述培养基配方称取马铃薯，加水浸提25 min，6层纱布过滤，滤液加入一定比例的麦芽糖、L-苯丙氨酸、硫酸镁混匀充分溶解，高温121℃灭菌20min。
（2）菌种活化：香灰菌菌种在PDA试管培养基上转接活化2次，将香灰菌菌种用接种针挖取约1 cm3的小块接种到含有PDA培养基的培养皿中培养4 d，在培养皿同一半径上用直径0.5 cm的打孔器打孔制备菌种块，接种至含有100 mLPDB培养基的三角瓶中，每瓶接种两块，置于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养4 d得到活化菌液。
（3）接种：准确量取10 mL菌液接种到含有100 mL上述配方培养基的三角瓶中，至于28℃恒温摇床中，以160 r/min的振荡速度培养6 d，将发酵液4000 r/min离心10 min，取上清液0.22 um尼龙微孔滤膜过滤，滤液即为香灰菌发酵液样品，待上机检测。
（4）检测：采用高效液相色谱法进行香灰菌发酵液样品中2-苯乙醇含量的检测。
结果为硫酸镁添加量为0.2 g时2-苯乙醇的合成量为1.5641 g/L，产量最高。
实施例6
由上述实施例所述的单因素实验的结果做正交，得到最优培养基配方。选取正交实验的条件如表1所示，马铃薯添加量：400、600、800 g/L；麦芽糖添加量：40、60、80 g/L；L-苯丙氨酸添加量：2、4、6 g/L；硫酸镁添加量：0.1、0.2、0.3 g/L；对培养基的配方进行四因素三水平的正交实验优化。正交实验如表2所示：由极差分析可得影响2-苯乙醇产量因素的顺序是C>A>D>B，即l-苯丙氨酸添加量>马铃薯添加量>硫酸镁添加量>麦芽糖添加量，并且通过方差分析可得培养基的最优配方为L-苯丙氨酸添加量为6 g/L、马铃薯添加量为600g/L、硫酸镁添加量为0.3 g/L、麦芽糖添加量为40 g/L。最终通过最优组合验证实验得出在该配方下香灰菌金鸡岭菌株生物合成2-苯乙醇的含量为2.2166 g/L，与其他的因素组合相比达到2-苯乙醇最高产量，证明此条件下为金鸡岭利用L-苯丙氨酸生物合成2-苯乙醇的最优组合。
表1 正交实验因素水平
表2 L9（34）正交实验结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种适用于香灰菌生物发酵合成2-苯乙醇的培养基
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgttggtga accagcggag ggatcattac tgagttatca aaaactccaa ccctttgtga 60
acctacctat gtttcctccg gcgtaccgct ttagcctacc cacagggctc ccctaagggg 120
gggttctgct ggggaggtgc ctgagtgcta cccatccttc ggggtacggt tagtgcagtg 180
aaggtgctga ccaaggcctc ggcggcgccg agtaggaccg ctccaaactt aagcacctag 240
tgcatccaac cccgcgttga acaactatcg aaaatctgct tttgcttttt ttctttacgc 300
taaaacgtct ttcctggttg gaattattgc tcgaaataat aatttcttta ccctgcagtc 360
gtttgttttc aagctacaat atctgctcga aaattgttca aagctctgag gggtctgaat 420
gaattcataa aattggcaaa agccacctat aaactacggt tcttaggggg tgatcaaacc 480
aaggttttaa aaaccaaata cgttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc 540
gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg 600
aatctttgaa cgcacattgc gcccattagt attctagtgg gcatgcctat tcgagcgtca 660
ttacaaccct taagccttgt agcttagcgt tgggaatcta cccctcactg aggggtagtt 720
ccttaaattt agtggcgggg ttatagcaca ctctaagcgt agtagtttaa ctcgctttca 780
gggaggctgt agctgcttgc cgtaaaaccc cctataactt atagtggttg acctcggatt 840
aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata tca 873
Claims (1)
1.一种香灰菌生物发酵合成2-苯乙醇的方法，其特征在于：使用如下培养基：每1000mL水中含有马铃薯600 g，L-苯丙氨酸6 g，麦芽糖40g，硫酸镁0.3g，pH值自然；所述香灰菌为暗色环纹炭团菌（Annulohypoxylon stygium）金鸡岭，已于2020年9月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020504。
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2020
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