CN109536540A - 一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种使用酿酒酵母高产2‑苯乙醇的生物培养方法，将从啤酒厂分离获得的酿酒酵母菌接种于优化的YEPD培养基中并依次经过斜面培养、固体平皿培养、液体培养、菌种放大培养和发酵培养后，转化L‑苯丙氨酸发酵生产2‑苯乙醇。本发明对对酿酒酵母菌种进行优化培养，进而提高L‑苯丙氨酸发酵生产2‑苯乙醇的转化率和产量。

Description

一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法
技术领域
本发明属于生物工程与技术领域，尤其是涉及一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法。
背景技术
2-苯乙醇(2-Phenylethyl alcohol，2-PE)又叫β-苯乙醇，是一种具有玫瑰花香的芳香醇，天然存在于许多花和植物精油中，如玫瑰、风信子、茉莉、百合等，大量应用于日用化学和食品工业，是化妆品中用量最大的玫瑰香型配方。作为香料添加剂，2-苯乙醇也是面包、奶酪、饼干、葡萄酒等食品中的风味物质，也可用于玫瑰、焦糖、蜂蜜及其他果香型食品香精及各种烟用香精、皂用香精的配制，其使用量仅次于香兰素，是世界第二大香料成分。
目前，全球2-苯乙醇的年产量近万吨，绝大部分都是采用化学或生物合成方法生产，仅有很少一部分从天然玫瑰油中提取。1907年Ehrlich发现在一些酵母细胞中，L-苯丙氨酸通过转氨作用生成苯丙酮酸、再脱羧形成苯乙醛，苯乙醛经氧化脱氢酶作用生成2-苯乙醇，这条途径后来以Ehrlich的名字命名。利用这条途径通过生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇是目前生物合成法制备2-苯乙醇的主要方法。常见的2-苯乙醇酵母生产菌株包括：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等，Albertazzi等人用异常汉逊酵母(Hansenula anomala CBS 110)在含2g/L的L-苯丙氨酸而不含其他氮源的培养基中培养24小时得到1.7g/L的2-苯乙醇；Huang等人用发酵毕赤酵母(Pichia fermentans L-5)转化L-苯丙氨酸16天可得到453mg/L的2-苯乙醇；Stark等人采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Giv 2009)进行两相补料分批转化，最终2-苯乙醇浓度可达到12.6g/L；采用这种方法虽然2-苯乙醇产量得到较大的提高，但同时给产物的分离提取带来了很多困难，也增加了生产成本。研究发现，高浓度的2-苯乙醇对酵母细胞具有一定的毒性，会抑制酵母的生产，同时，酿酒酵母在生产过程中积累的乙醇和2-苯乙醇的联合作用比起单独2-苯乙醇的毒性要大得多，因此会影响生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇的产量和转化率，要解决这个问题，可通过菌株改造来提高生产菌株对2-苯乙醇的耐受能力，因此，通过优化酿酒酵母菌的生物培养基和培养方法对于提高2-苯乙醇产物浓度和生产强度具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，对酿酒酵母菌种进行优化培养，进而提高L-苯丙氨酸发酵生产2-苯乙醇的转化率和产量。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，将从啤酒厂分离获得的酿酒酵母菌接种于优化的YEPD培养基中并依次经过斜面培养、固体平皿培养、液体培养、菌种放大培养和发酵培养后，转化L-苯丙氨酸发酵生产2-苯乙醇。
进一步的，所述菌种放大培养使用优化的YEPD种子培养基；所述YEPD种子培养基的配方为：蛋白胨18～22g/L、酵母浸出物8.5～12g/L、葡萄糖19～23g/L和硫酸镁0.35～0.62g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述YEPD液体种子培养基的pH＝6.0。
进一步的，所述发酵培养使用优化的发酵培养基；所述发酵培养基的配方为：L-苯丙氨酸17.3～22.6g/L、酵母浸出物3.2～6.8g/L、葡萄糖23～26g/L、硫酸镁0.5～0.6g/L和磷酸二氢钾4.2～6.7g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述发酵培养基的配方pH＝5.8。
进一步的，使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法具体包括如下步骤：
(1)斜面培养：将所分离出的酿酒酵母菌种接种于YEPD固体培养基上，在30℃下培养48h后降温至4℃并保存，对酿酒酵母菌种进行活化；
(2)固体平皿培养：将经过步骤(1)活化的酿酒酵母菌种再次划线接种于YEPD固体培养基上，在30℃下培养48h后分离单菌落，并对单菌落的菌株进行保藏；
(3)液体培养：将经过步骤(2)分离出的单菌落接种于YEPD液体培养基中，在30℃的条件下，以120r/min在培养箱中振荡培养18h后保种；
(4)菌种放大培养：将经过步骤(3)液体培养后的液体菌种按体积比为5％的接种量再次接入YEPD液体培养基中，在30℃的条件下，以300r/min在培养箱中振荡培养20h后，即得一级种子培养液；将一级种子培养液按体积比为5％的接种量接种入YEPD种子培养基中，在30℃的条件下，以280r/min在培养箱中振荡培养24h后，即得二级种子培养液；
(5)发酵培养：将二级种子培养液按体积比为10％接种量接入发酵培养基中，以300r/min的搅拌速率搅拌培养，同时通入空气，空气的通气量为0.5V/V·min，搅拌24～30h后终止发酵，制得2-苯乙醇。
进一步的，在所述步骤(5)发酵培养过程中控制发酵培养基的pH恒定在5.8～5.9；当pH降低至5.5时，补加25％的氨水做发酵中和剂。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法培养的2-苯乙醇的产量达到5.18～5.21g/L、转化率达到0.78～0.82g/g。本发明的微生物培养方法具有反应条件温和、产品绿色天然、生产成本较低、成本低、环境友好、工业化应用前景广等特点。
2、本发明综合了斜面培养、固体平皿培养、液体培养、菌种放大培养和发酵培养的多重培养方式，其中斜面培养能够起到活化菌株的作用，固体平皿培养为后能够挑选出单菌落，液体培养能够为菌种提供液体的环境，保证菌种保种同时便于菌种的接种和培养工作顺利过渡到后期菌种放大培养和发酵培养。
3、本发明中的菌种放大培养能够根据需要对菌种起到逐级放大扩充的作用，使得菌种经过放大过程最终能够在较大体积的液体培养基中生长，进而提高2-苯乙醇的转化率和产量，缩短发酵时间。
附图说明
图1是酵母菌在含不同浓度2-苯乙醇培养基中的生长情况；
图2是酵母菌产2-苯乙醇产量图；
图3是利用实施例1中培养基培养酵母菌和对比实施例培养酵母菌后不同批次2-苯乙醇产量对比情况图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中研究了不同浓度的2-苯乙醇对酵母菌生长情况的影响，具体操作步骤如下：
首先，将从啤酒厂中分离出的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种接种于YEPD固体培养基上，在30℃下培养48h后分离单菌落，并对单菌落的菌株进行保藏；
其次，将分离出的单菌落接种于YEPD液体培养基中，在30℃的条件下，以120r/min在培养箱中振荡培养18h后保种；
接着，将经过液体培养后的液体菌种按体积比为5％的接种量再次接入YEPD液体培养基中，在30℃的条件下，以300r/min在培养箱中振荡培养20h后，即得一级种子培养液；将一级种子培养液按体积比为5％的接种量接种入YEPD种子培养基中，在30℃的条件下，以280r/min在培养箱中振荡培养24h后，即得二级种子培养液；
最后，将得到的二级种子培养液按体积比为2％的接种量分别接种至接入含有不同浓度的2-苯乙醇培养基中，2-苯乙醇的浓度分别为0g/L，1.0g/L，2.0g/L，3.0g/L，3.5g/L，4.0g/L，二级种子培养液与2-苯乙醇之间的装液量为50mL：250mL，控制培养温度为37℃，转速为300r/min，在不同时间取样测定酵母菌的生长量OD600(参见附图1)，如图1所示，根据实验数据可知，在培养基中未添加2-苯乙醇时为酵母菌自然生长曲线，添加2-苯乙醇后，该酵母菌株生长受到抑制，其中2-苯乙醇浓度为1.0～3.0g/L时，抑制作用较弱，浓度为3.5g/L、4.0g/L时抑制作用明显。
实施例1
一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，将从啤酒厂分离获得的酿酒酵母菌接种于YEPD培养基中并依次经过斜面培养、固体平皿培养、液体培养、菌种放大培养和发酵培养后，转化L-苯丙氨酸发酵生产2-苯乙醇。
进一步的，所述菌种放大培养使用优化的YEPD种子培养基；所述YEPD种子培养基的配方为：蛋白胨20g/L、酵母浸出物10g/L、葡萄糖20g/L和硫酸镁0.5g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述YEPD液体种子培养基的pH＝6.0。
进一步的，所述发酵培养使用优化的发酵培养基；所述发酵培养基的配方为：L-苯丙氨酸15g/L、酵母浸出物5g/L、葡萄糖25g/L、硫酸镁0.5g/L和磷酸二氢钾5g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述发酵培养基的配方pH＝5.8。
最终，发酵液中2-苯乙醇的含量为5.21g/L，转化率达到0.81g/g。
实施例2
一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，将从啤酒厂分离获得的酿酒酵母菌接种于YEPD培养基中并依次经过斜面培养、固体平皿培养、液体培养、菌种放大培养和发酵培养后，转化L-苯丙氨酸发酵生产2-苯乙醇。
进一步的，所述菌种放大培养使用优化的YEPD种子培养基；所述YEPD种子培养基的配方为：蛋白胨18g/L、酵母浸出物8.5g/L、葡萄糖19g/L和硫酸镁0.35g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述YEPD液体种子培养基的pH＝6.0。
进一步的，所述发酵培养使用优化的发酵培养基；所述发酵培养基的配方为：L-苯丙氨酸17.3g/L、酵母浸出物3.2g/L、葡萄糖23g/L、硫酸镁0.5g/L和磷酸二氢钾4.2g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述发酵培养基的配方pH＝5.8。
最终，发酵液中2-苯乙醇的含量为5.19g/L，转化率达到0.82g/g。
实施例3
一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，将从啤酒厂分离获得的酿酒酵母菌接种于YEPD培养基中并依次经过斜面培养、固体平皿培养、液体培养、菌种放大培养和发酵培养后，转化L-苯丙氨酸发酵生产2-苯乙醇。
进一步的，所述菌种放大培养使用优化的YEPD种子培养基；所述YEPD种子培养基的配方为：蛋白胨22g/L、酵母浸出物12g/L、葡萄糖23g/L和硫酸镁0.62g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述YEPD液体种子培养基的pH＝6.0。
进一步的，所述发酵培养使用优化的发酵培养基；所述发酵培养基的配方为：L-苯丙氨酸22.6g/L、酵母浸出物6.8g/L、葡萄糖26g/L、硫酸镁0.6g/L和磷酸二氢钾6.7g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述发酵培养基的配方pH＝5.8。
最终，发酵液中2-苯乙醇的含量为5.20g/L，转化率达到0.79g/g。
上述实施例1-3采用均采用以下生物培养方法生产2-苯乙醇，具体步骤如下：
(1)斜面培养：将所分离出的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种接种于YEPD固体培养基上，在30℃下培养48h后降温至4℃并保存，对酿酒酵母菌种进行活化；
(2)固体平皿培养：将经过步骤(1)活化的酿酒酵母菌种再次划线接种于YEPD固体培养基上，在30℃下培养48h后分离单菌落，并对单菌落的菌株进行保藏；
(3)液体培养：将经过步骤(2)分离出的单菌落接种于YEPD液体培养基中，在30℃的条件下，以120r/min在培养箱中振荡培养18h后保种；
(4)菌种放大培养：将经过步骤(3)液体培养后的液体菌种按体积比为5％的接种量再次接入YEPD液体培养基中，在30℃的条件下，以300r/min在培养箱中振荡培养20h后，即得一级种子培养液；将一级种子培养液按体积比为5％的接种量接种入YEPD种子培养基中，在30℃的条件下，以280r/min在培养箱中振荡培养24h后，即得二级种子培养液；
(5)发酵培养：将二级种子培养液按体积比为10％接种量接入发酵培养基中，以300r/min的搅拌速率搅拌培养，同时通入空气，空气的通气量为0.5V/V·min，30h后终止发酵，制得2-苯乙醇。
进一步的，所述斜面培养和固体平皿培养使用现有的YEPD固体培养基；所述YEPD固定培养基的配方为：酵母浸出物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/和琼脂20g/L；所述液体培养使用YEPD液体培养基；所述YEPD液体培养基的配方为：酵母浸出物10g/L、蛋白胨20g/L和葡萄糖20g/L，以1L为标准进行配置，余量为水。
进一步的，在所述步骤(5)发酵培养过程中控制发酵培养基的pH恒定在5.8～5.9；当pH降低至5.5时，补加25％的氨水做发酵中和剂。
实施例4
实施例4用于研究不同发酵培养时间对最终产物含量的影响，实施例4以实施例1培养基为标准，与实施例1的不同之处在于：发酵培养时间分别不同，分别研究了发酵24h、28h和30h的发酵时间的2-苯乙醇含量。
对比实施例1(培养基优化前)
将从啤酒厂分离获得的酿酒酵母菌接种于YEPD培养基中并依次经过固体平皿培养、菌种放大培养和发酵培养后，转化L-苯丙氨酸发酵生产2-苯乙醇；所述菌种放大培养使用的种子培养基中各组分终浓度为：蛋白胨10g/L、酵母浸出物10g/L、葡萄糖20g/L，以1L为标准进行配置，余量为水，pH＝6.0；所述发酵培养使用的发酵培养基中各组分终浓度为：L-苯丙氨酸20g/L、酵母浸出物5g/L、葡萄糖25g/L、磷酸二氢钾5g/L，以1L为标准进行配置，余量为水，pH＝5.8。
参数测试方法：
最终产物2-苯乙醇确认采用高效液相色谱检测，将实施例1-3和对比实施例1-3制得的发酵液冷却至4℃，以10000r/min的转速旋转离心10min，取发酵液的上清液稀释100倍，以10000r/min的速度再次离心后用0.45μm微孔滤膜过滤处理，送入液相色谱检测。
液相色谱参数：色谱柱：Waters XBridge C-18 3.5μm column(2.1*150mm)，两侧柱温25℃；流动相：水：乙腈＝70：30，流速0.6mL/min；二极管阵列检测器，检测波长214nm，检测时间12min。
由附图2可知，以实施例1的培养基为标准，生物培养中的发酵时间对最终产物含量的影响不大，发酵时间为24h时，最终2-苯乙醇的含量为5.20g/L，发酵时间为28h时，最终2-苯乙醇的含量为5.18g/L，发酵时间为30h时，最终2-苯乙醇的含量为5.21g/L。
表1发酵液中2-苯乙醇含量和转化率
参数 实施例1 实施例2 实施例3 对比实施例
2-苯乙醇含量(g/L) 5.21 5.19 5.20 3.80
转化率(g/g) 0.81 0.79 0.82 0.67
附图3中白色立柱表示种子放大培养基和发酵培养基组份优化前，经过固体平皿培养、菌种放大培养和发酵培养后的2-苯乙醇含量，附图3中的黑色立柱表示种子放大培养基和发酵培养基组份优化后，经过斜面培养、固体平皿培养、液体培养、菌种放大培养和发酵培养后的2-苯乙醇含量，综上所述，由附图3和表1可知，种子放大培养基和发酵培养基优化前，酵母菌经过固体平皿培养、菌种放大培养和发酵培养后发酵液中2-苯乙醇的含量低于4.0g/L，转化率低于0.7g/g；在优化种子放大培养基和发酵培养基后，经过斜面培养、固体平皿培养、液体培养、多次的菌种放大培养和发酵培养后，发酵液中2-苯乙醇的含量高于5.0g/L，转化率高于0.75g/g，同时通过不同批次试验的验证均满足同样的效果，因此，使用本发明的酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法培养2-苯乙醇的含量较高，转化率较高。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，其特征在于：将从啤酒厂分离获得的酿酒酵母菌接种于YEPD培养基中并依次经过斜面培养、固体平皿培养、液体培养、菌种放大培养和发酵培养后，转化L-苯丙氨酸发酵生产2-苯乙醇。
2.如权利要求1所述的一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，其特征在于：所述菌种放大培养使用优化的YEPD种子培养基；所述YEPD种子培养基的配方为：蛋白胨18~22g/L、酵母浸出物8.5~12g/L、葡萄糖19~23g/L和硫酸镁0.35~0.62g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述YEPD液体种子培养基的pH=6.0。
3.如权利要求1所述的一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，其特征在于：所述发酵培养使用优化的发酵培养基；所述发酵培养基的配方为：L-苯丙氨酸17.3~22.6g/L、酵母浸出物3.2~6.8g/L、葡萄糖23~26g/L、硫酸镁0.5~0.6g/L和磷酸二氢钾4.2~6.7g/L，以1L为标准进行配置，余量为水；所述发酵培养基的配方pH=5.8。
4.如权利要求1至3任一所述的一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）斜面培养：将所分离出的酿酒酵母菌种接种于YEPD固体培养基上，在30℃下培养48h后降温至4℃并保存，对酿酒酵母菌种进行活化；
（2）固体平皿培养：将经过步骤（1）活化的酿酒酵母菌种再次划线接种于YEPD固体培养基上，在30℃下培养48h后分离单菌落，并对单菌落的菌株进行保藏；
（3）液体培养：将经过步骤（2）分离出的单菌落接种于YEPD液体培养基中，在30℃的条件下，以120r/min在培养箱中振荡培养18h后保种；
（4）菌种放大培养：将经过步骤（3）液体培养后的液体菌种按体积比为5％的接种量再次接入YEPD液体培养基中，在30℃的条件下，以300r/min在培养箱中振荡培养20h后，即得一级种子培养液；将一级种子培养液按体积比为5％的接种量接种入YEPD种子培养基中，在30℃的条件下，以280r/min在培养箱中振荡培养24h后，即得二级种子培养液；
（5）发酵培养：将二级种子培养液按体积比为10%接种量接入发酵培养基中，以300r/min的搅拌速率搅拌培养，同时通入空气，空气的通气量为0.5V/V•min，搅拌24~30h后终止发酵，制得2-苯乙醇。
5.如权利要求4所述的一种使用酿酒酵母高产2-苯乙醇的生物培养方法，其特征在于：在所述步骤（5）发酵培养过程中控制发酵培养基的pH恒定在5.8~5.9；当pH降低至5.5时，补加25%的氨水做发酵中和剂。
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