SU991954A3

SU991954A3 - Способ получени монокариотического мицели гриба coRIoLUS VeRSIcoLoR (FR) QUeL

Info

Publication number: SU991954A3
Application number: SU772515254A
Authority: SU
Inventors: Есикуми Тикао; Омура Есио; Вада Тосихико; Макита Хиромицу; Андо Такао; Тоеда Нориюки; Мацунага Кенити
Original assignee: Куреха Кагаку Когио Кабусики Кайся (Фирма)
Priority date: 1976-08-30
Filing date: 1977-08-30
Publication date: 1983-01-23
Also published as: HU175950B; CS216173B2; JPS57789B2; ZA774989B; US4159225A; BE858097A; BG37999A3; JPS5329977A

Description

не определ лось наличие мицели в виде пластинок.

Создают обогащенные питательные услови применением среды с 1,5-3 раза более высокой концентрацией ,чем в обычной среде, например глюкозо-дрожжевым экстрактом ,содержащим О, 75% дрожжевого экстракта и 5% глюкозы.

Атмосферу погруженной культуры поддерживают при сниженном парциальном давлении кислорода. Такое сниженное давление кислорода создают -при воздушной герметизации ферментора нли подачей в ферментатор инертного газа, например газообразного азота или двуокиси углерода. Выраццивание ведут непрерывно при дополнительной подаче культуральной среды.

Свойства

Внешний вид;

погружна культура

плоска культура

Микроскопические наблюдени :

образование сцепл ющих соединений

форма мицели

Физиологический и биохимические свойства:

скорость размножени

ассимил ци целлншозы

единственный источник азота-нитрат кали

тиамин

среда лакмусового молока

Скорость размножени монокариотического мицели в 1,5-10 раз больше скорости размножени исходного дикариотнчвского мицели , высока скорость размножени имеет важное значение дл промышленного производства .

Этот Монокариотический мицелий можно применить дл тех же цеЛей,

ЕСУ1И нельз получить достаточного количест&а монокариотического мицели за один опыт выращивани ,то обработку ведут после гомогенизации культуры до получени нужного количества монокариотического мицели . Выращивание ведут при температуре 25± 5®С в течение от 3 до 15 дней.

Монокариотический мицелий гриба Corlofus versl-color (Fr) Quef хранихС в Исследовательском институте ферментации , Агенства промышленной науки и техники (Циба-ШИу Япони ) под номером FERM-P 3686,

СвЬйства мойокариотического мицели гриба Сог1 о (us versicoPor (Fr) Uuet представлены в табл, 1.

Таблица 1

Ионокариотический мицелий

Суспендированное состо ние Не образуетс

Не наблюдаютс

Более короткий и толще, чем дикариотический мицелий

Высока

Слегка положительна

Есть рост Не требуетс

Не кисла

что и дикариотический мицелий Corlofus versIcoPq/ (Fr) QueP. Например , можно получать азотсодержащие полисахариды путем его экстракции водной средой, например водой, разбавленным щелочным раствором или разбавленным кислотным раствором, такое азотсодержащее полисахаридное вещество можно примен ть дл получени

лекарств, например( противоопухолевых препаратов, активирующих иммунитет препаратов, противовирусных лекарств , противогрибковых препаратов, противопрокаэных лекарств, усиливакхцих аппетит препаратов.

Можио также получить различные виды энзимов, напрИАюр протеазу, амилазу путем низкотемпературной экстракции. Кроме тога, сам мицелий или его. Экстракты 11пи остатки можно примен ть в пи1це и напитках на корм скоту и удобрени х дл растений.

П р и мер 1. Получение моно кариотического мицели .

100 МП жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта пипеткой загружают в коническую колбу на 500 МП и после паровой сте1рш1изации в течение 20 Мин при 120 С в авто1славе, среду инокулируют 1 МП суспензии мицели , полученного диспергированием мицели CorfoBus verslcotor IFr) Quef, полученного из 20-дневной стационарной культу :, вкгращенной при 25с с ис-. псхльзованием жидкой среды, содержащей . 3% глюкозы и 0,5% дрожжевого экстракта в 60 мл физиологического солевого раствора путем дроблени мицелиального мешалкой при скорост и ее 6000 об/NOiH в течение 3 мин, затем начинают вырахцивание при встр хивании при скорости мешалки 200 об/мин при . Череа 3 дн после начала культивгщии кфащешшй материап перенос т в асептических услови х в смеситель на 200 мл и после измельчени вещества гомсмиксером пр скорости 10.000 об/мин в течение 10 мин возобновл ют сразу выращивание при встр хивании и продолжают в течение 7 дней. Полученный таким способом мицелий не имеет сцепл ющихс соединений и плохо дает воздушный мицелий в стандартной среде из агара Результаты микроскопического исследо вани после окраски, приведенные ниже , показали, что весь полученный м целий вл етс кюнокариотическим.

1 мл бульона,содержащего мицелий попученный как указано выше, добавл ют к 10 МП воды, затем ведут центрифугирование при 2000-5000°С в течение 5 мин. Верхний слой жидкости удал ют и мицелий перенос т в пробирку, в которую добавл ют-фиксирующую жидкость Хелли. После выдержки в течени 24 ч отделенные клетки промывают 10 мл воды до их обесцвечивани . Затем клетки помещают в 10 мл 3 Н сол ной кислоты и нагревают при в течение 15 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, промывают 10 МП воды, затем на 2 мин погружают в 10 ivin разбавленной в 20-50 раз азотной кислоты и 2-3 раза промывают по 10 мл воды.

Полученные волокнистые клетки раскладывают на стекл нной пластине дл испарени влаги, затем на. волокна нанос т несколько капель раствора Гимса и после 15-минутного выстаивани , их. npoMJB ajoT слегка водой, затем сушат .

При изучении окрашенных таким образом дер клетки под хшкроскопом с увеличением 1000,раз, каждое дро видно в виде красной круглой точки. Поэтому можИо легко определить .число дер подсчетом круглых окрашенных в красный цвет точек в одной клетке aIцeли . Полученный мицелий не подкисл ет лакмусовое молоко и не разжижает желатин.

Размножение монокариртического мицели .

МонркаЕ ютический мицелий, полученный описанным вьвае способом, добавл ют в 12 л жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экртракта, и загружают в чашечный ф ментатор на 20 л, затем пр мо в ферментатор подают вод ной пар под давлением 2 кг/см. После паровой стерилизации при в течение 20 мин и охлаждени , 1 л суспензии, содержащей монокариотически мицелий инокулируют (со скоростью 0,5 г/л) сразу вслед за этим ведут культивирование при скорости аэрировани 0,5. объем.объем/мин и скорости перемешивани 550 об/мин. Дл сравнени ведут культивирование дикариотического мицели полностью при таких же услови х как и дл МО нокариотического мицели . При сравнении скорости размножени этих моно- и дикариотического мицели , по времени, требующемс дл достижени концентраций мицели 8 г/л бьшо установлено, что монокариотический мицелий требует aqero 1/4 част времени культивировани по сравненики со временем дл культивировани дикариотического мицели . Выло также подтверждено, что выход монокариотического мицели выше на 20% по сравнению с дикариотическим мицелием.

Пример 2. Производ т подсчет числа дер по методике из примера . 1 в мицелии, полученном из культуры скошенного агара Coriofus verslcofor (Fr) QueP. В результате было установлено, что все эти клетки были дикариотические, моыокариотические не были обнаружены.

100 мл жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта , помещают в коническую колбу на 500 мл.и стерилизуют ее там при нагреваний. Затем эту среду инокулируют дикариотическим мицелием с помощью платиновой петли, затем ведут выращивацие при встр хивании в течение 3 дней (предварительное выращивание ) при температуре 25 ± . Таким образом, получают мицелий в форме

пластинок. Бульон, содержащий этот пластинчатый мицелий, .гомогенизируют гомосмесителем в течение 5 мин, затем обрабатывают на срезывание,при этом пластинчата форма почти исчезла . Культивирование ведут при вышеуказанных услови х и через 4 дн (основное культивирование полученный пластинчатый мицелий снова гомогенизируют в течение 5 мин и снова обрабатывают срезом. Концентраци клеток грибка на этой стадии составл ет 11 г/л.

1 мл бульона, содержащего гомогенизированный мицелий, добавл ют в ту же жидкую среду, которую примен ют в первом опыте культивировани , затем ведут второй опыт культивировани при таких же услови х как и в первом опыте. Период культивировани несколько измен ют, предварительное культивирование ведут в течение 3 дней, а врем основного сокращает до 3 дней. Концентраци грибковых клеток почти така же, как и в первом опытейыращивани при встр хивании .

Третий опыт выращивани продолжают таким же образом, причем концентраци грибковых клеток достигает почти такого же уровн , как в первом опыте выращивани при встр хивании в течение 2 дней предварительного культивировани и 3 дней основного культивировани .

Аналогично ведут четвертый опыт культивировани и получгиот бульон с концентрацией грибковых клеток 12 г/л, выше чем в первом опыте,но при двухдневном предварительном культивировании и при двухдневном основном культивировании. Полученный мицелий не имеет формы пластинок и находитс диспергированным в виде пульпы и не требует гомогенизационной обработки .

Как установлено микроскопом грибкова клетка не имеет сдепл н цих соединений , которые имеютс в обычном дикариотическом мицелии, она почти вдвое шире по сравнению с дикариотическим мицелием.

При определении числа дер по описанному в примере 1 способу, было подтверждено, что эти клетки полностью представл ют собой монокариотический мицелий,

При дальнейшем размножении мицели при таких же услови х, как в предьадущем опыте, размноженный мицелий состоит из монокариотического мицели и обладает всеми свойствами монокариотикеского мицели , показанным в табл. 1.

Также установлено, что скорость размножени монокариотического мицели более чем в два раза превосходит

скорость размножени дикариотического мицели ..

10 г высушенного продукта монокариотического мицели , полученного /по примеру 1, экстрагируют 300 мл 5 гор чей врды при 95-100 С в течение 3 ч. Экстрактный раствор концентрируют при пониженном давлении при 30, затем к нему добавл ют чистый зтанол с концентрацией 90% образовав0 шийс осадок оушат и получают 0,2 г Серого порошка.

Химический анализ этого серого порошка подтверждает, что это вещество представл ет собой азотсодержащий

5 высокомолекул рный полисахарид. При введении этого вещества мышам с трансплантированной опухолью саркомы -189 твердого типа, оно показывает высокую противоопухолевую актив0 ность.

Пример 3. 100 мл жидкой среды , содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, помещают в кое ническую колбу на 500 мл, в которой .уже находилось 8 г стекл нных шариков диаметром 2-5 мм, эту смешанную среду после тепловой стерилизации заражают дикариотическим мицелием CorloTus verslco or (Fr) Quel, таким же как примен ли в примере 1, с по- . мощью платиновой петли, затем ведут выращивание при встр хивании в течение 7 дней при .

5 1 МП бульона,содержащего полученный таким образом мицелий, добавл ют в среду, содержащую стекл нные бусы и ведут выращивание при встр хивании в течение б дней. Получен0 ный продукт дальше подвергают третьему опыту выращивани при встр хивании влечение 5 дней. Полученный при этом продукт мицелий не имеет скрепл ющих соединений, он в 1,5 раза

5 шире, чем дикариотический мицелий, подсчет дер по способу из примера 1 показал, что это монокариотический мицелий.

1 мл этого бульона инокулируют

П в 100 мл жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта , и не содержащей стекл нных бус, .и культивируют при 25 ± .Концентраци мицели через 3 дн после

начсша культивировани составл ет

10,5 г/л, в то врем как результат подобного выращивани дикариотического мицели привел через 4 дн после начала культивировани к концентргщии всего 7 г/л.

О Пример 4. 100 мл жидкой

среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, загружают в коническую колбу на 500 мл эту среду после тепловой стерилизации инокули5 руют дикариотическим мицелием CorloCus versicotor (Fr) Que. из примера 1 с помощью платиновой петли затем ведут выращивание при встр хивании в тёчеиие 3 дней. После гомоге низации содержимое ферментатора накрывают полиэтиленовым мешком и герме тизируют от воздуха, затем культивируют в течение 4 дней. По окончании культивировани в атмосфере ферментатора содерзЕИТс 5,0% 1 МП бульона, содержащего полученный таким образом мицелий, инокулируют в среду по способу из первого опыта, затем ведут втррой. .опыт выращивани при вcтp xивaнииV. как в n piBOM опыте. Такое культивит рование повтор ют еще раза. В. результате определений проведенных как в примере 1, установлено, что весь полученный по этому способу мицелий представл ет собой монокарв тический мицелий. Пример 5. Мицелий, получен ный из скошенной агаровой культуры Corlofus versicotor (Fr) Quef отбир ют дп пробы и определ ют качество дер по методике, описанной в приме ре 1, при этом установлено, что вес мицелий представл ют собой дикариот ческий мицелийJ отсутствует монокариотический мицелий. Это показыва ет, что полученный в этом опыте мицелий вл етс дикариотическим ми целием. 100 мл жидкой среды,,содержащей 5% Глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта , помещают в коническую колбу на 500 мл после тепловой стерилизации , затем инокулируют мицелием Corlotus verslcofor (Fr) Quel СМ-10 с помощью платиновой петли, затем ведут выращивание при встр хивании при 25 в течение 7 дней. Мицелий этйй культуры оказываетс дикариотическим , концентраци составл ет 10,8 г/л. Полученный таким образом дикарио тический мицелий инокулируют в коли честве 0,01% 20 л жидкой среды, в которой растворено 10% глюкозы и 1,5% дрожжевого экстракта, и ведут ,погружное выращивание при перемешивании в ферментаторе при 25 i с помощью лопастной мешалки при ско рости 500 .об/мин. После выращивани в течение 7 дней концентраци мицеЛИЯ в,бульоне составл ет 10,2 г/л, 20 мл этого бульона внос т в такую же среду, второй опыт культивировани ведут при таких же услови х в течение б дней. Такое же культивиро вание еще повтор ют в течение 5 дне в третьем опыте и в течение 4 дней в четвертом опыте. По окончании четвертого культивировани бульон находитс в виде равномерной пульпы, концентраци мицели в нем составл ет 11,5 г/л. Мицелий не содержит сцепл ющих соединений и весь представл ет собой монокариотический мицелий. П р и м е р 6. Инокулируют в каждые 100. мл стерилизованной жидкой среды. Содержащей ингредиенты, соот-ветственно показанные в табл. 2 и сохран емые кажда в 500,мл конической колбе, по 1 мл водной суспензии мицели , приготовленного диспергированием мицели .Cor I of us versicotor (Fr): Quef, .полученного при культивировании грибов в жидкой питательной среде, содержащий 3 вес.% глюкозы и О,5 вес.% экстракта дрожжей, при в течение 20 дней, разбавлении полученной таким образом культивированной культуры гриба 6/5-кратным объемом водного физиологического солевого раствора и измельчении смеси в смесителе в течение 3 мин при скорости 600 об/мин дл получени гомогенизированной дисперсии мицели грибов , в. которой не замечено мицели в форме шариков и инокулированную питательную среду культивируют при встр хи вании при при перемешивании со скоростью 200 об/мин в течение 3 дней. Затем полученную таким образом культивированную среду эсептически перенос т в смеситель емкостью 200 мл и подвергают измельчению при скорости 10000 об/мин в течение 10 мин. Измельченную таким образом питатеЛ ную среду снова пускаютна культивирование при 25 С в соот ветст;вующих атмосферных услови х. В этих опытах погружного культивировани при встр хивании было отмечено , что образование монокариотического мицели протекает более интен-, сивно в случа х, когда аэральна фаза ферментера (в этих случа х колт бы) содержит другое количество кислорода , чем азота по сравнению со случа ми, когда атмосфера не содержит количество кислорода, другого, чем количество азота, или в случае, когда атмосфера содержит слишком большое количество кислорода по сравнению с азотом. Концентра.ци 5- 20 об.%, предпочтительно 5-15 вл етс подход щей дл этой цели. Услови -.погружного культивировани при:встр хивании Cor)о Pus verstcoCor l-Fr) Quel представлены в табл. 2.

: Т а б л и ц а

Claims

Формула изобретения

1. Способ получения монокариотического мицелия гриба Corlofus versI со for (Fr) Quef, заключающийся в том, что дикариотический мицелий гриба измельчают в жидкой среде, затем измельченный мицелий вносят в жидкую питательную среду, содержащую 510% глюкозы и 0,75-1,5% экстракта дрожжей, культивируют в аэробных условиях при концентрации кислорода

5-20 об.% и температуре 25±5*С до образования монокариотического мицелия, далее полученную культуральную жидкость гомогенизируют и культивируют в.тех же условиях до образования гомогенной пульпы.
2. Способ поп. 1, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта,’часть гомогенизированной культуральной среды, полученной от предыдущей культивации, многократно пересевают в свежую питательную среду и культивируют в тех же условиях.