CS216173B2

CS216173B2 - Method of making the new mononuclear mycelium coriolus versicolor

Info

Publication number: CS216173B2
Application number: CS775667A
Authority: CS
Inventors: Chikao Yoshikumi; Yoshio Omura; Toshihiko Wada; Hiromitsu Makita; Takao Ando; Noriyuki Toyoda; Kenichi Matsunaga
Original assignee: Kureha Chemical Ind Co Ltd
Priority date: 1976-08-30
Filing date: 1977-08-30
Publication date: 1982-10-29
Also published as: BG37999A3; BE858097A; JPS5329977A; ZA774989B; JPS57789B2; US4159225A; HU175950B; SU991954A3

Description

Vynález se týká způsobu výroby nového jednojaderného mycelia Coriolus versicolor (Fr.) Quél., patřícího do známých Basidiomycetes rodu Coriolus z Polyporacese.

V současné době je již známo, že polysacharidy, které je možno isolovat extrakcí Coriolus versicolor (Fr.) Quél. nebo z odpovídajících kultur, mohou být základní složkou při přípravě léků, potravy a nápojů, a bylo navrženo mnoho způsobů výroby Basidiomycetes v umělých kulturách ve vysokém výtěžku. Nicméně až dosud není známa výhodná metoda, jež by byla schopná propagovat růst Basidiomycet ve vysokém výtěžku.

Během našich studií zaměřených na uskutečnění propagování růstu Coriolus versicolor (Fr.) Quél ve vysokém výtěžku jsme zjistili, že při pěstování Basidiomycetes v submersní kultuře za mechanické úpravy, jako je drcení nebo střižní síly v kapalném prostředí, ztrácejí Basidiomycety soudržnost, jež patří k jejich morfologickým charakteristikám, a mění se na monojaderné mycelium, přičemž toto monojaderné mycelium je stálé a vyznačuje se specifickými vlastnostmi potud, že mimořádně rychle roste a srovnání se známým dijaderným myceliem.

Předmětem vynálezu je způsob výroby no2 vého monojaderného mycelia Coriolus versicolor (Fr.) Quél, vyznačený tím, že se mechanicky · zpracuje dvojjaderné mycelium Coriolus versicolor (Fr.) Quél stříháním nebo drcením · v běžném živném prostředí, které obsahuje 5 hmot. % glukózy a 0,75 hmot, proč, · extraktu z kvasnic, přičemž mechanické · zpracování se provádí před pěstováním · nebo současně s ním v submersní kultuře. · v · živném prostředí s obsahem 5 až 10 hmot.·. · · % glukóz.y a 0,75 až 1,5 hmot. % extraktu z kvasnic při pH 4 až 5 a při teplotě 25 ± 5 °C po dobu 3 až 15 dní.

Další · předměty tohoto vynálezu budou zcela jasné z následujícího podrobného popisu ..vynálezu · a · jeho provedení.

Na · obr. · 1 . připojených výkresů je graf, zachycující ve srovnání křivku propagování v .. provzdušněné · a · míchané kultuře monojaderného mycelia Coriolus versicolor (Fr.) Quél. . za použití postupu podle tohoto vynálezu a podobné propagování podle křivky za použití známého dijaderného mycelia.

Na grafu z obr. 1 se koncentrace mycelia (g/1) nanáší na úsečku a doba kultivování v hodinách na pořadnici. Tamže znamená (I) křivku propagování dijaderného mycelia a (II) křivku propagování monojaďerného mycelia.

Má se . obecně za to, že houby podmiňující růst basidiospor a podobných vyzrálých spor dokončí zrání za tvorby primárního mycelia, jímž je obvykle monojaderné mycelium, a taková mycelia se spojují dohromady za vzniku sekundárních mycelií, obsahující dvě jádra. Obvykle se má za to, že monojaderné mycelium nemá schopnost tvořit plodnice, ale dvojjaderné mycelium se touto schopností vyznačuje.

Zatím není k disposici zpráva, jež by se týkala vzniku monojaderného mycelia ze spor Coriolus versicolor (Fr.). Quél. Avšak bílé vzdušné mycelium získané při našich pokusech kultivováním spor bylo dijaderné, a má se za to, že je to podmíněno skutečností v tom směru, že monojaderné mycelium ze spor se rychle mění na dijaderné.

Monojaderné mycelium, které se získá z dijaderného mycelia postupem podle tohoto vynálezu, se může získat ve stálé formě s nápadnými rozdíly ve srovnání se stávajícím . dijaderným myceliem. V tabulce 1 jsou uvedeny rozdíly mezi jednojaderným myceliem Coriolus versicolor (Fr.) Quél. podle tohoto vynálezu a dijaderným myceliem.

TABULKA 1

Předmět	Diiaderné mycelium	Monoladerné mycelium (podle tohoto vynálezu)
Vzezření:
1. Submersní kultura	nesuspendovaný stav	suspendovaný stav
2. Stacionární kultura	vzniká vzdušné mycelium	nevzniká
Mikroskopická pozorování
3. Tvorba propojení	pozorováno	ne
4. Tvar mycelia Fysiologické a biochemické vlastnosti:	dlouhé a jemné	kratší a mnohem tlustší ve srovnání s dijaderným myceliem
5. Rychlost propagace růstu	malá	vysoká
6. Asimilování celulosy 7. Dusičnan draselný jako	kladné	mírně kladné
jediný zdroj dusíku	bez vzrůstu	vzrůst
8. Thiamin	nutný	nikoli nutný
9. Lakmusové mléko	kyselá reakce	nikoli

Je třeba zaznamenat ještě další skutečnosti ve spojitosti s vlastnostmi a tím nebo oním myceliem z tabulky. Obvyklé dvoujaderné mycelium, získané kultivováním Coriolus versicolor (Fr.) Quél. podle běžných postupů, se obvykle získá ve formě tabletek. Na druhé straně monojaderné mycelium se při kultivování netvoří ve formě peletů a kultura se rychle zakaluje, jako když . se nějaká drť suspenduje ve vodě, a to představuje jasné rozdíly od obvyklého dijaderného mycelia. Způsob počítání jader v buňce byl proveden současnými vynálezci poprvé a postup zahrnuje dále uvedené . prostředky a techniku.

K myceliu Basidiomycetes se nejprve ’ přidá Hellyho fixační kapalina ' a mycelium se ponechá stát obvykle 24 hodin, načež se promývá vodou až do odbarvení. Takto upravené mycelium se ponoří do 1 N roztoku chlorovodíkové kyseliny a roztok se zahřeje na teplotu 60 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti a promytí vodou se ponoří dále do dvacetkrát až padesátkrát zředěného’ roztoku dusičné kyseliny, načež následuje další promývání vodou. Doba ponořování činí 10 až 20 minut v roztoku chlorovodíkové kyseliny a několik minut v roztoku dusičné kyseliny. Takto získané vláknité buňky se nanesou na podložní sklíčko a ponechají se tam až do odpaření vlhkosti, načež se při kapává Giemsaův roztok. Ve chvíli, kdy se dosáhne zbarvení roztoku (asi za 10 minut později), se buňky mírně promyjí vodou a vysuší se. Po vysušení se buňky testují pod mikroskopem za zvětšení 1000 a kruhové, červeně zbarvené skvrny (pokládané za jádra) se počítají. Lze tedy počet jader stanovit sečtením červeně zbarvených skvrn v jedné buňce.

Fixační kapalina Hellyho, jak se zde používá, je roztok, jehož základ se připraví rozpuštěním 2,5 g dvojchromanu draselného, 1 g síranu sodného a 5 g chloridu rtuťnatého v ’ 100 ml vody, a bezprostředně před použitím se takový základní roztok zředí přidáním formaldehydu v množství 5 ml na 100 ml roztoku.

Roztok podle Giemsy je roztok vybarvující jádra, který se připraví rozpuštěním 3,0 g azur II eosinu a 0,8 g azuru v 250 ml glycerolu zahříváním směsi na 60 ^CC s následujícím přidáním 250 ml methylalkoholu. Smíšený roztok se ponechá stát 24 hodin a filtruje se. Při použití se takto připravený zásobní roztok zředí přidáním pufrovacího roztoku kyseliny fosforečné (pH 6,4 — 6,8) v množství 100 ml na 3 ml zásobního roztoku.

Měřením za .použití výše popsaného postupu bylo zjištěno, že počet jader v jedné

218173 buňce obvyklého mycelia tabletkového typu činí 2, přičemž mycelium suspensního typu podle tohoto vynálezu obsahuje 1 jádro,

Monojaderné mycelium se zvláštními vlastnostmi, jak je to uvedeno zde výše, se může vyrobit postupem podle tohoto vynálezu tak, že se zpracuje dijaderné mycelium Cariolus versicolor (Fr,) Quél, mechanickým (fyzikálním) působením, jako je drcení nebo střižní síly v kapalném prostředí, nebo že so pěstuje dijaderné mycelium v submersní kultuře za mechanického zpracování mycelia, Přesněji řečeno, tento postup se dá provádět takto:

(1) V případě, že se dijaderné mycelium Coriolus versicolor (Fr,) Quél, zpracovává v potrepávané kultuře, rozdrtí se mycelium přidáním inaktivního granulovaného materiálu, jako jsou skleněné střepy, (2) V případě, že se pěstuje dijaderné mycelium kontinuálně v submersní kultuře, nechá se taková kultura růst za působení střižních sil na mycelium použitím míchání.

(3) V případě pěstování dijaderného mycelia v submersní kultuře se mycelium dělí nebo drtí homogenisačním zařízením do takové míry, že zevním pozorováním nelze zaznamenat vznik mycelia, tvarovaného do formy tabletek,

Při vzniku monojaderného mycelia za výše uvedených podmínek je výhodné používat dále tento postup:

i) Použije se obohacené prostředí s tím, že se použije prostředí s 1,5 až 3krát vysokou koncentrací ve srovnání s obvyklým prostředím, například prostředí s glukosou a extraktem z kvasnic, obsahující 5 % glukosy a 0,75 % extraktu z kvasnic, ii) Atmosféra, submersní kultury se udržuje za sníženého parciálního tlaku kyslíku, přičemž podmínku tohoto sníženého parciálního tlaku kyslíku lze splnit tím, že se fermentační zařízení udržuje za vzduchotěsného stavu, nebo tím, že se vpouští do fermentačního zařízení inertní plyn, jako je dusík nebo kysličník uhličitý, iii) Submersní kultivování se provádí kontinuálně za dalšího přidávání kapalného prostředí.

Dijaderné mycelium Coriolus versicolor (Fr,) Quél, se může snadno převést na monojaderné mycelium za použití výše uvedených způsobů (1) — e) buď, že se použije některý z postupů i) až iii), nebo jejich vhodná kombinace, V případě, že nelze získat dostačující množství monojaderného mycelia v jedné dávce kultury, pokračuje se ve výše uvedeném postupu po homogenisování kultury, až se získá očekávané množství monojaderného mycelia, Kultivování se provádí obvykle za teploty 25 ± 5 °C po dobu 3 až 15 dní,

Bylo zjištěno, že monojaderné mycelium Coriolus versicolor (Fr,) Quél, získané postupem podle tohoto vynálezu obsahuje vždy týž _stav a má stejné vlastnosti, provádí-li se kultivování za výše uvedených podmínek pro výrobu monojaderného mycelia, To znamená, že se monojaderné mycelium získané postupem podle tohoto vynálezu získává jako · stejné monojaderné mycelium v následující generaci za uchování vlastností monojaderného mycelia, jak je to uvedeno v tabulce 1,

Při kultivování v Petriho misce nebo v povrchové kultuře (stacionární kultura) monojaderného mycelia lze pozorovat nechuť ke vzniku vzdušného mycelia, ale k tvorbě vzdušného mycelia ' dochází, provádí-li se kultivování po několik měsíců, Vzdušné mycelium · je dijaderné, a očkuje-li se dále tak, aby došlo ke · vzniku zralých plodů, dochází ke · vzniku vlastního Coriolus versicolor (Fr,) Quél, Tím je dokázáno, že vzniklé mycelium je totožné s originálním,

Z těchto· údajů je jasné, že monojaderné mycelium Coriolus versicolor (Fr,) Quél, podle .· tohoto vynálezu je odvozeno z p, vodního dijaderného mycelia Coriolus versicolor (Fr,) Quél,

Monojaderné . mycelium podle tohoto vynálezu je · · nové mycelium, jež se vyvinulo poprvé za použití postupu podle tohoto vynálezu, . a toto nové mycelium bylo označeno . Coriolus versicolor (Fr,) Quél, GX-101-3 a uloženo pod označením FERM-P č, 3686 25, VIII, 1976 ve „Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology . (Chiba-shi), Japonsko, což je vládní japonský úřad,

Charakteristické vlastnosti monojaderného mycelia Coriolus versicolor (Fr,) Quél, podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v tabulce 1, ale největším průmyslovým významem této houby je vysoká rychlost propagace růstu, Rychlost propagace růstu u této houby je l,5krát až lOkrát vyšší ve srovnání s růstem originálního dijaderného mycelia, a je zcela jasné, že taková vysoká propagace růstu je z hlediska průmyslové výroby mimořádně blahodárná,

Monojaderné mycelium se dá použít přesně pro tytéž . účely jako dijaderné mycelium Coriolus versicolor (Fr,) Quél, Tak například je možno získat z těchto mycelií polysacharidy · obsahující dusík, a to extrakcí vodným prostředím, jako je voda, zředěný alkalický nebo zředěný kyselý roztok, a tyto polysacharidy obsahující dusík je možno použít pro přípravu léčiv a protivředových činidel,· látek · aktivujících imunitu, protivirových léčiv, fungicid, léčiv proti lepře, látek podporujících chuť k jídlu atd,

Také je možno isolovat extrakcí za nízké teploty různé druhy enzymů, jako jsou proteasy, · amylasy atd, Dále se mohou mycelia jako taková · nebo odpovídající extrakty z mycelií nebo .· zbytků mycelií použít pro přípra216173 vu potravin a nápojů, krmiv pro zvířata a hnojiv pro rostliny.

Kromě všech - zmíněných - aspektů je možno mycelium podle tohoto vynálezu použít pro všechny jiné účely, kdy se používá Coriolus versicolor (Fr.) Quél.

Vynález je nyní blíže podrobněji popsán pomocí výhodných provedení postupu, ale tato provedení nemají znamenat jakékoli omezování rozsahu vynálezu. Všechny údaje v procentech jsou míněny hmotnostně, pokud není výslovně uvedeno jinak.

Příklad 1

Příprava monojaderného mycelia

100 ml kapalného prostředí, obsahujícího 5 % glukosy a 0,75 % extraktu z kvasnic, se napipetuje do kuželovité baňky objemu 500 ml a za 20 minut sterilisování párou za teploty 120 °C v autoklávu se prostředí očkuje za použití 1 ml suspense mycelia, připravené dispergováním mycelia Coriolus versicolor (Fr.) Quél. Toto mycelium se získá ze stacionární kultury, staré 20 dní a pěstované za teploty 25 °C na 50 ml kapalného prostředí s- obsahem 3 % glukózy a- 0,5 °/o extraktu z kvasnic v 60 ml fyziologického roztoku chloridu sodného rozdrcením základu mycelií míchačkou s 6000 otáček za minutu po 3 minuty. Očkovaná kultura se protřepává za 200 kyvů za minutu při 25 °C a za 3 dny se kultivovaný materiál přenese asepticky do míchacího pohárku objemu 200 ml, a po rozdrcení materiálu v homogenizátoru za rychlosti míchadla 10 000 otáček za minutu po 10 minut se obnoví protřepávání kultury bezprostředně tak, že kultura je v pohybu celkem po - 7 dní. Takto kultivované mycelium je bez propojení mezi vlákny a vzdušné mycelium se tvoří velmi chabě na obvyklých destičkách -s agarovým prostředím. Výsledek mikroskopického testování po vybarvení, jak je popsáno dále, lze shrnout v tom směru, že všechna mycelia jsou monojaderná.

Vybarvování:

Κ 1 ml zápary, obsahující mycelium získané výše uvedeným způsobem, se přidá 10 ml vody a vše se odstřeďuje za 2000 až 5000 G po 5 minut. Kapalina nad sedlinou se oddělí a mycelium se přepraví do zkumavky, kam se přidá fixující kapalina podle Hellyho.

Za 24 hodin stání se oddělené buňky promyjí za použití 10 ml vody, až se odbarví, potom se vnesou do 10 ml 1 N roztoku chlorovodíkové kyseliny, vše se zahřívá 15 minut na 60 °C s následujícím ochlazením na teplotu místnosti; po promytí za použití 10 ml vody se vlákna ponoří na 2 minuty do 10 ml 20krát až 50krát zředěného - roztoku kyseliny dusičné, promyjí se dvakrát až třikrát za použití 10 ml vody, načež se vláknité buňky rozprostřou na krycím sklíčku, vlhkost se odpaří a na buňky se přidá několik málo kapek roztoku podle Giemsy. Za 15 minut stání se buňky lehce opláchnou vodou a vysuší se.

Buňky s takto vybarvenými jádry se testují pod mikroskopem za zvětšení 1000, přičemž každé jádro je pozorovatelné jako kruhově vybarvená červená skvrna. Lze tedy počet jader snadno vyhodnotit spočítáním řečených červených skvrn v jedné buňce mycelia. Získané mycelium neokyseluje lakmusové mléko a nemá schopnost zkapalňovat želatinu.

Propagace monojaderného mycelia:

Monojaderné mycelium získané výše uvedeným postupem so očkuje do 12 litrů kapalného prostředí, obsahujícího 5 % glukózy a 0,75 % extraktu z kvasme ve dvacetilitrovém zásobníku pro fermentaci s tím, že se přímo do fermentačního zařízení zavede pára v množství 2 kg na cm². Po sterilizování párou za teploty 120 °C po 20 minut a po ochlazení se očkuje prostředí litrem suspenze, obsahující monojaderné mycelium (poměr 0,5 g na litr], a ihned potom se započne s kultivováním za rychlosti provzdušňování 0,5 objemu vzduchu na objem prostředí za minutu a za rychlosti míchání 550 otáček za minutu. Pro srovnání se kultivuje dijaderné mycelium za přesně shodných podmínek, jako byly ty, za kterých se kultivuje monojaderné mycelium. Srovnávají-li se propagační rychlosti růstu monojaderných a dijaderných mycelií ve formě času, jehož je třeba k dosažení koncentrace mycelia 8 g na litr, je třeba konstatovat, že monojaderné mycelium potřebuje pouze čtvrtinu kultivační doby ve srovnání s dijaderným myceliem (viz obr. 1). Bylo rovněž potvrzeno, že propagační výtěžek monojaderného mycelia se zvýší asi o 20 % ve srovnání s propagačním výtěžkem dijaderného mycelia.

Příklad 2

Propočet počtu jader se provede za použití postupu z příkladu 1 u mycelia získaného z řezu kultury Coriolus versicolor (Fr.) Quél. V důsledku toho bylo nalezeno, jak je to patrné z fotografie na vyobrazení 2, -že jsou všechny buňky dljaderné a nelze vůbec zjistit přítomnost monojaderného mycelia.

Tato původní houba byla označena Coriolus versicolor (Fr.) Quél. CB-101 a byla založena pod označením FERM-P č. 2412 25. XII. 1973 u výše uvedené vládní instituce.

100 ml kapalného prostředí s obsahem 5 procent glukózy a 0,75 % extraktu z kvasnic se vnese do kuželovité baňky objemu 500 ml a vše se sterilizuje za zahřívání. Sterilizované prostředí se potom očkuje výše uvedeným dijaderným myceliem za použití platinového očka a vše se kultivuje ve formě předkultury třídenním potřásáním za teplo218173 ty v rozmezí 25 . ± 2 °C. Vznikne přitom mycelium tvaru tabletek.

Zápara obsahující tyto tabletky mycelia se homogenizuje -na homogenizační míchačce po 5 minut, načež se tabletky mycelia rozdrtí. V kultivování se pokračuje za výše uvedených podmínek ' a za 4 dny později (to je již hlavní kultura) se vzniklé mycelium tvaru tabletek znovu homogenizuje 5 minut a znovu se mycelium tvaru tabletek rozdrtí. Koncentrace buněk houby v tomto stadiu činí 11 g na litr.

ml zápary, obsahující homogenizované mycelium, se přidá do téhož kapalného prostředí, jak bylo použito v prvé fázi kultivování, a druhá fáze kultivování se provede za . týchž podmínek jako prvá fáze. Avšak doba kultivování se mírně změní, to jest . doba přípravy předkultury trvá 3 dny a doba přípravy hlavní kultury rovněž 3 dny. Koncentrace buněk houby byla v podstatě totožná jako v prvé fázi třepání kultury.

Třetí fáze kultivování se provádí podobným způsobem, přičemž koncentrace buněk hub dosahuje v podstatě stejné hladiny, jako tomu bylo v prvé fázi třepání kultury za 2 dny v případě předkultury a 3 dny v případě hlavní kultury.

Podobně se provede . čtvrtá fáze kultivování, kdy se získá zápara s koncentrací buněk houby 12 g na litr, tedy vyšší než v prvé fázi kultivování, při srovnávání s 2 dny předkultury a 2 dny hlavní kultury.

Získané mycelium nebylo ve formě tabletek a zůstalo dispergováno ve formě drtě, aniž vyžadovalo homogenizování.

Při pozorování pod mikroskopem není mezi buňkami houby propojení,' jako je tomu v případě běžného dijaderného mycelia, přičemž bylo zjištěno, že jsou mono.jaderné buňky dvojnásobně široké ve srovnání s dijadernými.

Ze zjištění počtu jader za použití postupu popsaného v příkladu 1 vyplynulo, že všechny tyto buňky jsou monojadeřné mycelium.

Jestliže se mycelium dále kultivuje za stejných podmínek, jak to bvlo uvedeno v předchozích fázích kultivování, získá se monojaderné mycelium se všemi vlastnostmi, jak byly uvedeny pro monojaderné mycelium v tabulce I.

Bylo rovněž nalezeno, že propagační rychlost růstu monojaderného mycelia byla dvojnásobná ve srovnání s dijaderným.

g sušeného produktu monojaderného mycelia, jak se získá výše uvedeným - postupem, se extrahuje za použití 300 ml horké vody (95 až 100 cc) po 3 hodiny. Extrahovaný roztok se zahustí za sníženého tlaku za teploty 30 °C, přidá se čistý ethanol tak, aby jeho koncentrace činila 90 °/o, a vzniklá sraženina se po odsátí vysuší. Ve výtěžku 0,2 g se získá šedý prášek.

Z chemické analýzy vyplynulo, že šedou látkou je vysokomolekulární polysacharid, obsahující dusík. Podává-li se tato látka myším s transplantovaným typem Sarcoma-180, ukáže se, - že se látka vyznačuje vysokou protivředovou účinností.

Příklad 3

100 ml - kapalného prostředí s obsahem 5 procent glukózy a 0,75 % extraktu z kvasnic se vnese do kuželovité baňky objemu 500 ml, kde je již 5 g skleněných kuliček o průměru 2 až 5 mm, a toto živné prostředí se po. sterilizaci očkuje dijaderným myceliem Coriolus versicolor (Fr.) Quél., týmž, jak bylo použito v příkladu 1, a to za použití platinového -očka, načež se kultivování -provádí sedmidenním třepáním za teploty 25 ± 2 C.

ml zápary obsahující takto připravené mycelium se přidá do prostředí se skleněnými kuličkami, jak to bylo uvedeno výše, a kultura se znovu protřepává 6 dní. A vzniklý produkt se kultivuje - potřetí za protřepávání kultury po dobu 5 dnů.

Mycelium, které se takto připraví, je prosté propojení mezi vlákny, a je asi l.Škrát širší ve srovnání s původním dijaderným myceliem, přičemž z výsledků propočtení jader za použití postupu z příkladu 1 je patrné, že jde o monojaderné mycelium.

Za použití 1 ml této zápary se očkuje - 100 ml kapalného prostředí, obsahujícího 5 ml glukózy a 0,75 % extraktu - z kvasnic, aniž jsou tamže jakékoli skleněné kuličky; kultivování se provádí za teploty 25 ± 2 °C. Koncentrace připraveného mycelia za 3 dny po zahájení byla 10,5 g na litr, zatím co při podobném kultivování dijaderného - mycelia lze zaznamenat za 4 dny koncentraci - mycelia 7 g na litr.

Příklad 4

100 ml kapalného prostředí s obsahem 5 procent glukózy a 0,75 % extraktu z - kvasnic se vnese do 500 ml kuželovité baňky a toto prostředí se po sterilizování očkuje dijaderným myceliem Coriolus versicolor (Fr.l Quél., stejným jako v příkladu 1, za použití platinového očka, načež se kultura protřepává po 3 dny. Po úpravě homogenizováním se celé fermentační zařízení pokryje polyethylenovým pytlem a uzavře se těsně vůči vnějšímu vzduchu; následuje kultivování po 4 dny.

Po skončení doby kultivace se zjistí v atmosféře fermentačního zařízení obsah 5,0 % kysličníku uhličitého.

ml zápary obsahující takto připravené mycelium se očkuje do prostředí za použití postupu z prvé fáze kultivování, načež se provede druhá fáze kultivování protřepáváním kultury stejným způsobem, jako tomu bylo v prvé fázi. Toto kultivování se provede ještě dvakrát. Výsledkem měření a zjištění, provedených stejně jako v příkladu 1, je uzávěr, ze všechno mycelium vzniklé při tomto postupu kultivování je monojaderné.

Příklad 5

Mycelium získané z řezové kultury Coriolus' versicolor (Fr.) Quél. se vzorkuje a stanoví se počet jader za použití postupu popsaného v příkladu 1. Zjistí se tím, že všechna mycelia jsou dijaderná a není mezi nimi žádné monojaderné mycelium. Z toho je jasné, že mycelium získané v této fázi kultivování je dijaderné.

Použitou houbou byl Coriolus versicolor (Fr.) Quél. GM-103, uložený pod označením FERM-P č. 2414 25. XII. 1973 ve výše uvedené sbírce vládní instituce.

100 ml kapalného prostředí s obsahem 5 procent glukózy a 0,75 % extraktu z kvasnic se vlije do kuželovité baňky objemu 500 ml a po sterilizování se prostředí očkuje myceliem Coriolus versicolor (Fr.) Quél. CM-103 za použití platinového očka, s tím, že se kultura dále potřepává 7 dní za teploty 25 ± ± 2°C. Mycelium z této kultury bylo dijaderné a bylo obsaženo v koncentraci 10,8 g na litr.

Takto získaným dijaderným myceliem se očkuje v množství 0,01 % 20 litrů kapalného prostředí, kde je rozpuštěno 10 % glukózy a 1,5 % extraktu z kvasnic, a kultivování se provádí v submerzní kultuře za míchání ve fermentačním zařízení při teplotě 25 ± 2° Celsia za použití lopatkového míchadla s 500 otáčkami za minutu. Po sedmi dnech kultivování vzniklo mycelium v koncentraci

10,2 g na litr zápary. Za použití 20 ml této zápary se očkuje stejné prostředí, . provede se druhá fáze kultivování za stejných podmínek po 6 dní. Podobné kultivování . se znovu opakuje 5 dní ve třetí fázi a 4 dny ve čtvrté fázi.

Po skončení čtvrté fáze kultivování se získá zápara ve formě jednotné plsti, obsahovala mycelium v koncentraci 11,5 g na litr. Mycelium bylo prosté propojení mezi vlákny a — jak bylo zjištěno — šlo výlučně o monojaderné mycelium.

Claims

1. Způsob výroby nového monojaderného mycelia Coriolus versicolor (Fr.) Quél, vyznačený tím, že se mechanicky zpracuje dvojjaderné mycelium Coriolus versicolor (Fr.) Quél stříháním nebo drcením v běžném¹ živném . prostředí, které obsahuje 5 hmot. % glukózy a 0,75 hmot. % extraktu z kvasnic, přičemž mechanické zpracování se provádí před pěstováním nebo současně s ním v submerzní kultuře v živném prostředí s' obsahem 5 až 10 hmot. % glukózy a 0,75 až 1,5 hmot. % extraktu z kvasnic při pH 4 až 5 a při teplotě 25 ± 5 °C po dobu 3 až 15 dní.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se drcení provádí v homogenizačním zařízení.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím,

YNÁLEZU že se drcení provádí za použití neaktivního pevného granulovaného 'materiálu.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se submerzní kultivování provádí v prostředí, jehož koncentrace je 1,5 až 3,Okr<át vyšší než koncentrace běžného živného prostředí.

5. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se submerzní kultivování provádí v plynotěsně uzavřeném fermentoru nebo ve fermentoru, do něhož se přivádí inertní plyn.

6. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se submerzní kultivování provádí kontinuálně po dobu 3 až 15 dní za dalšího přidávání živného prostředí.

7. Způsob podle bodu 3, vyznačený tím, že se jako inaktivní pevný granulovaný materiál používají skleněné kuličky.