KR810000944B1 - 구름버섯의 단핵 균사체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

구름버섯의 단핵 균사체의 제조방법

제1도 : 본 발명의 방법에 따라 구름버섯으로부터 제조한 단핵균사체를 공기를 주입하며 교반 배양할 때의 번식 속도 곡선(Ⅱ)과 기지의 이핵 균사체의 번식속도 곡선(Ⅰ)

제2도 및 제4도 : 구름버섯을 사면 배양시 얻어지는 이핵 균사체의 형태

제3도 : 본발명에 따라 얻어진 단핵 균사체의 형태

본 발명은 구멍장이 버섯과(Polyporacege)에 속하는 구름버섯(Coriolus verscolor(Fr.) Quel)의 이핵 균사체를 액체 배지중에서 기계적 처리를 하여 번식율이 특히 높은 신규의 단핵 균사체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

구름버섯 또는 그의 배양물의 추출물로부터 얻은 다당류가 의약품 또는 식품 및 음료수의 기본성분으로써 매우 유용함은 최근에 알려진 사실이며 이리하여 이러한 버섯을 인공적으로 배양하여 고수율로 얻을 수 있는 여러가지 방법을 시도해 왔다. 그럼에도 불구하고 아직도 이 담자균류를 고수율로 번식시킬 수 있는 유용한 방법을 찾아내지 못했었다.

구름버섯을 고수율로 번식시키는 방법을 실현키 위해 연구한 결과 우리는 이 담자균류를 액체 배지중에 서 마쇄 또는 전단과 같이 기계적 처리를 하며 심부 배양하면 담자균류는 원래의 형태학적 특징인 연결부위(Clamp)를 잃어버리고 단핵 균사체로 변환되며 이렇게 생성된 단핵 균사체는 안정하며 또한 기지의 이 핵균사체와 비교해 볼때 번식률에 있어서 월등하게 높은 특징을 지니고 있다.

본 발명은 이핵으로 되어 있는 기지의 담자균류인 구름버섯을 액체 매질중에서 기계적 처리를 하거나 또는 기계적 처리를 하면서 이 담자균류를 심부 배양하여 연결부위를 갖지 않는 신규의 단핵 균사체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

제1도는 매질중의 균사체 농도(g/ )를 종축으로 하고 배양시간(hr)을 횡축으로 하여 그린 것이다.

또한, (Ⅰ)은 이핵균사체의 번식 속도 곡선이며(Ⅱ)는 단핵 균사체의 번식속도 곡선이다.

일반적으로 버섯이 되는 진균은 담자포자를 생성하며 니러한 포자는 발아하여 보통 단상 세포로 되어있는 일차 균사체를 형성하며 이러한 균사체가 혼융되어 함께 이단상세포로 되어 있는 2차균사체를 생성한다. 단핵 균사체는 자실체를 생성할 능력이 없으나 이핵 균사체는 이러한 능력이 있다. 구름버섯에 있어서 포자로부터 단핵 균사체가 발생했다는 보고문은 없다. 더우기 포자를 배양하여 한 우리의 실험에서 얻어지는 백색 기생(氣生)균사체는 이핵이었으며 이것은 포자로부터의 단핵균사체가 급속히 이핵균사체로 전환된 사실 때문이다.

본 발명에 따라 이핵 균사체로부터 얻어지는 단핵 균사체는 매우 안정하게 유지시킬 수 있으며 이핵 균사체와는 대단히 다르다. 아래 표1은 구름버섯의 발명에 따른 단핵 균사체와 이핵 균사체의 상이점을 들어 본 것이다.

[표 1]

다음 사실은 상기 표의 각각의 균사체와 연결지워 볼 때 또한 괄목할 만하다. 통상의 방법에 따라 구름버섯을 배양하여 얻는 통상의 이핵 균사체는 보통 펠렛 형태이다. 반면에 단핵 균사체를 배양하면 펠렛 형태로 되지 않고 배지가 마치 펄프가 물에 현탁되어 있듯이 혼탁된 상태로 되며 이리하여 통상의 이핵 균사체와는 뚜렷한 차를 보인다. 세포내의 핵을 세는 방법은 본 발명자에 의해 최초로 완결되었으며 이 방법은 다음과 같은 방법이다.

헬리씨(Helly's) 고정액을 먼저 담자균 균사체에 가한후 이 균사체를 통상 24시간 동안 방치하고 탈색이될 때까지 물로 세척한다. 이렇게 얻어진 균사체를 1N염산 용액중에 침지시키고 용액을 60℃로 가열해준다. 실온으로 냉각하고 물로 세척한 후 20내지 50배로 희석한 희 질산 용액에 침지시킨다. 염산에는 20내지 40분간 침지시키고 질산용액에는 수분침지시킨다. 이렇게 얻어진 섬유질상 세포를 슬라이드 글래스에 펼쳐 놓고 수분이 증발될때까지 그위에 방치해 둔후 김자(Giemsa's)용액을 이에 적가해 준다. 염색이 용액으로 완결될 때 (약 10분 후) 세포를 물로 가볍게 세척한 후 건조시킨다. 건조후 세포를 1,000배의 광학 현미경으로 관찰하고 원형이며 붉게 염색된 점(핵으로 사료됨)을 센다. 이렇게 핵의 수효는 한 세포내의 붉게 염색된 점을 셈으로하여 결정할 수 있다.

본 명세서에서의 ＂헬리씨 고정액＂이란 2.5g의 중크롬산 칼륨, 1g의 황산 나트륨과 5g의 염화 제2수은을 100ml의 물에 용해시켜 제조한 염기의 용액이며 사용직전에의 염기성용액을 용액 100ml당 5ml양의 포르말린에 가해 준다.

＂김자 용액＂이란 3.0g의 아주르 Ⅱ 예오진과 0.8g의 아주르를 250ml의 글리세린에 용해시키고 이를 60℃로 가열하고 여기에 또 250ml의 메틸 알코올을 가하고 혼액을 24시간 방치해 둔후 용액을 여과하여 제조한 핵 염색용액이다. 사용할 때는 이렇게 제조한 원액은 3ml당 100ml양의 인산 완충용액(pH6.4내지 6.8)을 가하여 희석시킨다.

상기 기술된 방법에 의해 측정한 결과 보통의 펠렛형의 균사체중의 한개의 세포에 있는 핵은 2개이나 반면에 본 발명에 따른 현탁형의 균사체중의 한개의 세포에는 핵이 하나이다.

상기에 언급한 특징을 지닌 단핵 균사체는 본 발명에 따라 구름버섯의 이핵 균사체를 액체 배지중에서 마쇄 또는 전단과 같은 기계적(물리적) 처리를 하거나 또는 이핵 균사체를 기계적 처리를 하면서 심부 배양하여 제조할 수 있다. 더욱 자세히 본 발명의 방법을 언급하면 다음과 같다.

1) 구름버섯의 이핵 균사체를 진탕 배양시킬 경우에는 균사체는 유리알과 같은 불활성인 고체 원형 물질을 가하여 마쇄한다.

2) 이핵 균사체를 연속 심부 배양할 경우에는 균사체를 교반장치로 전단시키면서 배양을 실시한다.

3) 이핵 균사체를 심부 배양할 경우에는 균사체를 외관으로 보아 펠렛형의 균사체가 보이지 않을 정도로 균질기로 전단시키거나 또는 마쇄시킨다.

상기 언급한 조건하에서 단핵 균사체를 생성시킬 경우에는 덧붙여서 다음 방법을 적용시키는 것이 바람직하다.

ⅰ) 예를 들어 5%포도당과 0.75%효모 추출물을 함유한 포도당 효모 추출물과 같은 통상보다 1.5내지 3배정도 높은 농도를 지닌 배지를 사용하여 영양조건을 해 준다.

ⅱ) 심부 배양의 압력은 산소분압을 감소시킨 상태에서 시킨다. ＂산소분압을 감소시킨 상태＂란 발효기를 밀폐시키거나 또는 질소 가스 또는 이산화탄소와 같은 불활성 가스를 발효기내에 흘러 보내주어서 되게 한다.

ⅲ) 심부 배양은 액체 배지를 더 가해 주어서 연속적으로 진행시킨다.

구름 버섯의 이핵 균사체는 상기 1)-3)방법을 단독 또는 적당히 혼합하여 ⅰ-ⅲ) 방법과 함께 사용함에 의해 단핵균사체로 쉽게 전환시킬 수 있다. 충분량의 단핵 균사체를 일회배양하여 얻을 수 없을 경우에는 상기 언급한 조작을 원하는 양의 단핵 균사체를 얻을 수 있을때까지 배양물을 균질화시킨 후에 계속해 준다. 배양은 보통 3내지 15일 동안 25±5℃의 온도에서 실시한다.

본 발명에 따라 얻어진 구름 버섯의 단핵 균사체는 만일 배양을 단핵 균사체를 제조키 의한 상기 언급한 조건하에서 계속한다면 항상 같은 상태와 같은 성질을 지니고 있음을 발견했다. 이것은 본 발명의 방법에 따라 얻어진 단핵 균사체는 다음세대에서도 표Ⅰ에서 본 것과 같은 단핵균사체의 성질을 지닌 단핵균사체로써 생성됨을 의미한다.

단핵 균사체를 평판 배양 또는 표면 배양(교정 배양)시킬 경우에는 기생균사체를 잘 생성치 않으나 만일 배양을 몇 달을 계속하면 기생 균사체가 생성되기 된다. 이 기생 균사체는 이핵이며 이것을 판상 통나무 이식시켜 자실체를 형성시키게 하면 그 하체가 구름버섯임이 밝혀 졌다. 이것은 생성된 균사체가 원래의 것과 꼭 같음을 보여 준다.

이 사실은 본 발명에 따른 구름버섯의 균사체는 원래 구름버섯의 이핵 균사체에서부터 얻은 것임을 보여주는 것이다.

본 발명의 단핵 균사체는 본 발명의 방법에 의해 최초로 개발된 신규의 균사체는 구름버섯 GX-101-3(Coriolus Versicolor (Fr.) Quel. GX-101-3)으로 명명하며 일본 정부 기관인 산업과학 기술처에 있는 발효연구소(일본 치바시에 있음)에 1976년 8월 25일에 FERM-P No. 3686으로 보관되어 있다.

본 발명에 따른 구름버섯의 단핵 균사체의 특징은 표 Ⅰ에서 본 바와 같으며 가장 산업적으로 이 담자균류가 뜻이 깊은 까닭은 그의 높은 번식률에 있다. 이 담자균류의 번식률은 통상의 이핵 균사체의 번식률보다 1.5내지 10배가 높으며 분명히 이러한 높은 번식률은 산업적 제조면에서 대단히 유용한 것이다.

이 단핵 균사체는 구름버섯의 이핵 균사체와 같은 목적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 수용성 용매(예:물, 회 알카리용액 또는 회 산용액)로 추출하여 질소를 함유한 다당류를 얻을 수 있으며 이러한 질소를 함유한 다당류를 물질을 항암제, 면역 활성체, 항비루스제, 항진균제, 나병 치료제, 식욕촉진제 등으로 사용할 수 있다.

낮은 온도에서 추출하면 포로데이즈, 아밀레이즈와 같은 여러가지 효소도 얻을 수 있다. 또한 균사체자체 또는 그의 추출물 또는 잔사를 식품과 음료수 및 동물의 사료와 식물의 비료로 사용할 수 있다.

상기 언급한 외에도 이 발명의 균사체는 구름버섯의 용도에 모두 사용할 수 있다.

본 발명을 다음 구체적 예로 더욱 상세히 기술키로 하나 구체적 예로 본 발명을 국한시키지는 않는다.

다음 실시예에서 백분율은 다른 언급이 없으면 중량비이다.

[실시예 1]

단핵 균사체의 제조

5% 포도당(소와 산업주식회사 제품)과 0.75%효모 추출물(쿄쿠또 제약공업 주식회사 제품임)을 함유한 100ml의 액체배지를 500ml의 원뿔상 플라스크에 피펫으로 넣어 주고 20분간 120℃의 오토클레이브로 증기밀균한 후 배지에 구름버섯의 균사체를 (60ml의 생리 식염수중의 3% 포도당과 0.5%의 효모 추출물을 함유한 50ml의 액체 배지를 사용하여 20일 일간 25℃에서 고정배양하고 6,000r.p.m. 속도의 혼합기로 3일간 균사체 괴를 마쇄시켜 얻음) 분산시켜 제조한 1ml의 균사체 현탁액을 접종시키고 그후에 진탕배양을 200r.p.m.의 속도로 25℃에서 시킨다. 3일간 배양하고 배양물을 200ml 짜리의 혼합기 컵(사꾸마 세이사꾸조 제품임)에 무균적으로 옮겨담고 물질을 10,000r.p.m.으로 10분간 호모믹서(사꾸마 세이사꾸조 제품임)로 마세한 후 진탕배양 곧 다시 시작하여 총 7일간 시킨다. 이렇게 얻어진 균사체는 연결부위가 없으며 표준 한천 판상 배지에 기생 균사체가 거의 생기지 않는다. 다음과 이 염색한 후 현미경으로 검사한 결과 얻어진 균사체는 모두 단핵이었다:

염색:

상기 기술한 대로 얻어진 균사체를 함유한 1ml의 육즙을 10ml의 물에 가한후 5분간 2,000내기 5,000G에서 원심 분리시킨다. 상등액을 제거하고 균사체를 시험관에 옮기고 여기에 헬리씨 고정액을 가한다. 24시간 방치 한 후 불리괸 세포를 10ml의 물로 탈색될때까지 세척해 준다. 그후에 세포를 10ml의 1N염산에 가하고 60℃에서 15분간 가열하고 실온으로 냉각하고 10ml의 물로 세척하고 10ml의 20내지 50배로 희석한 질산 용액에 2분간 침지시키고 10ml의 물로 2내지 3회세척한다.

얻어진 섬유상인 세포를 슬라이드 글라스에 펼쳐놓아 수분을 제거하고 몇 방울의 김자용액을 세포위에 떨어뜨리고 15용간 방치한 후 물로 가볍게 세척하고 그후에 건조시킨다.

이렇게 얻어진핵이 염색된 세포를 1,000배의 망원경으로 검사하며 각 핵은 환상이며 붉은색으로 염색된 점으로 관찰되는 것이다. 그러므로 핵의 수효는 균사체중의 한개의 세포중의 환상인 붉은색을 염색된점을 세어 쉽게 결정할 수 있다. 얻어진 균사체는 리트머스 우유를 산성화시키지 않으며 제라틴을 액화시키는 능력이없다.

단핵 균사체의 번식:

상기 언급된 방법으로 얻어진 단핵 균사체를 5%의 포도당과 0.75%의 효모 추출물을 함유한 12ℓ의 액체배지를 20ℓ짜리의 발효기(교리쭈 티코 주식회사 제품임)에 가하고 이어서 2kg/㎠의 증기를 직접 발효기에 불어 넣어 준다. 20분간 120℃에서 증기 멸균시키고 냉각한 후 단핵 균사체를 포함한 1ℓ의 현탁액을 접종시키고(0.5g/ℓ속도로) 곧 0.5v.v.m.의 속도로 공기를 주입하고 550r.p.m.의 속도로 교반하면서 배양시킨다. 이러한 단핵과 이핵 균사체를 단핵 균사체를 배양하는데 사용하는 것과 완전히 같은 조건하에서 배양시킨다. 이러한 단핵과 이핵 균사체의 번식율을 8g/ℓ의 균사체 농도를 얻을 때에 필요한 시간을 측정하여 비교할 때 단핵 균사체는 단지 이핵 균사체를 배양하는데 걸리는 시간의

밖에 안 걸린다. (참조:표Ⅰ) 단핵 균사체의 번식 수윤도 또한 이핵 균사체의 번식 수율보다 약 20%가 증가하게 됨을 확인되었다.

[실시예 2]

핵의 수효를 실시예 1의 방법에 따라 구름 버섯을 사면 배양하여 얻은 균사체에 대해 세어 본다. 그 결과 제2도의 사진에서 본 바와 같이 모든 세포는 2핵이었으며 단핵 균사체는 발견되지 않았다.

이 원래의 담자균류를 구름 버섯 CM-101로 명명하며 이는 상기 원급한 정부기관에 FERM-P No. 2412로 1973년 12월 25일에 보관되어 있다.

5%의 포도당과 0.75의 효모추출물을 함유한 100ml의 액체 배지를 500ml짜리의 원추형 플라스크에 넣어 주고 그안에서 가열하면서 멸균해 준다. 그후에 이 배지에 상기 언급한 이핵 균사체를 백금 루프를 사용하여 접종하고 25+2℃로 온도를 맞춘 방에서 3일간 진탕 배양시킨다. (전 배양)

이렇게 하여 펠렛형의 균사체가 생성된다. 이 펠렛형 균사체를 함유한 육즙을 혼합기(사꾸마 세이사꾸조 제품)로 5분간 균질화 시킨후 전단 처리하여 펠렛형을 실질적으로 없어지게 한다. 배양은 상기 언급한 조건하에서 계속해 주고 4일후(주 배양)생성된 펠렛형 균사체를 다시 5분간 균질화시킨후 전단 처리해 준다. 이 단계에 있는 담자균류의 세포의 농도는 11g/ℓ이다.

균질화된 균사체를 함유한 1ml의 육즙을 첫번째 배양에 사용한 것과 같은 액체배지에 가한 후 첫번째 배양과 같은 조건하에서 2번째 배양을 시킨다. 그러나 배양기간은 약간 변경시키며, 즉 전배양은 3일간 실시하고 주배양도 역시 3일간 배양시킨다. 담자균류 세포 농도는 실질적으로 첫회 진탕 배양시와 같다.

3회 배양은 같은 방법으로 담자균 세포 농도가 실질적으로 2일간 전배양하고 3일간 주배양하여 첫회 진탕 배양시와 같은 농도가 될때까지 계속시킨다.

마찬가지로 4회 배양은 2일간 전배양하고 2일간 주배양하여 첫회 배양시의 농도보다 높은 12g/ℓ의 담자균류 세포 농도를 함유한 육즙을 얻는다. 얻어진 균사체는 펠렛형이 아니며 균질화 처리를 필요치 않는 펄프상태로 분산되어 있다.

현미경으로 관찰한 바와 같이 담자균류 세포는 통상의 이핵균사체에서 발견되는 연결부위가 없으며 이핵 세포보다 넓이에 있어 2배가 크다.

실시예 1에 기술된 방법에 의해 핵의 수효를 세어본 결과 이러한 세포는 제3도 현미경 사진에서 본 바와 같이 모두 단핵 균사체임이 확인되었다.

균사체를 전회의 배양시와 같은 조건하에서 배양시킬 때 번식된 균사체는 단핵 균사체이며 표 1에서 보인 단핵 균사체가 지닌 성질을 모두 지니고 있다.

역시 단핵 균사체는 번식률에 있어서 이핵 균사체보다 2배가 높다.

상기에서 언급한 방법에 따라 얻어진 10g의 건조 단핵균사체를 95 내지 100℃에서 3시간동안 300ml의 뜨거운 물로 추출한다. 추출액을 30℃의 감압하에서 농축시킨후 순수한 에탄올을 가하여 90%농도가 되게하고 생성된 침전물을 건조시켜 0.2g의 회색 분말을 화학적으로 분석한 결과 이 물질은 질소를 함유한 고분자 다당류임이 밝혀졌다. 이 물질을 육아종-180을 이식시킨 쥐에게 투여한 결과 이 물질은 높은 항암작용이 있음을 보여준다.

[실시예 3]

5%의 포도당과 0.75% 효모 추출물을 함유한 100ml의 액체배지를 이미 2 내지 5mm의 직경을 갖는 8g의 유리알을 넣은 500ml짜리 원추형 플라스크에 가하고 이 혼합된 배지에 가열 멸균한 후 실시예 1에서 사용한 것과 같은 구름 버섯의 이핵 균사체를 백금 투표로 접종한 후 25+2℃에서 7일간 진탕 배양시킨다.

이렇게 얻어진 균사체를 함유한 1ml의 육즙을 상기에 언급한 바와 같은 유리알을 가한 배지에 가해주고 6일간 2회째 진탕 배양시킨다.

생성물을 또 5일간 3회째 진탕 배양을 시킨다.

이렇게 얻어진 균사체는 연결 부위가 없고 원래의 이핵균사체보다 넓이에 있어 1.5배가 크며 실시예 1에 따라 핵을 세어본 결과 단핵 균사체이었다.

1ml의 이 육즙을 유리알을 포함하고 있지 않은 0.75%의 효모 추출물을 함유한 100ml의 액체 배지에 접종하고 25±2℃에서 배양시킨다. 생성된 균사체 농도는 배양을 시작한후 3일만에 10.5g/ℓ가 되나, 반면에 유사한 방법으로 이 핵 균사체를 배양한 결과는 배양을 시작한후 4일만에 7g/ℓ가 된다.

[실시예 4]

5%의 포도당과 0.75%의 효모 추출물을 함유한 100mℓ의 액체 배지를 500mℓ의 원추형 플라스크게 가하고 가열 멸균한후 이 배지에 실시예 1에서 사용한 것과 같은 구름 버섯의 이핵 균사체를 백금 루프를 사용하여 접종한후 3일간 진탕 배양한다. 균질화처리를 한후 발효기 전체를 폴리에틸렌 백으로 덮어 주어 외부 공기에대해 밀폐시킨후 4일간 배양시킨다.

배양을 완결시킨후 5.0%의 탄산가스를 발효기 내의 공간에 함유시킨다.

이렇게 제조한 균사체를 함유한 1ml의 육즙을 첫회 배양한 방법에 따라 배지에 접종한후 첫회째와 마찬가지로 2회째 진탕 배양을 시킨다. 이렇게 배양을 또 2번 반복 실시한다. 실시예 1과 같은 방법으로 균사체의 핵수를 세어본 결과 이 배양과정에서 생성된 균사체는 모두 단핵임이 확인되었다.

[실시예 5]

구름 버섯을 사면배양하여 얻은 균사체를 채취하여 실시예 1에 기술된 방법에 따라 핵의 수효를 측정하여 제4도의 사진에서 본 바와 같이 균사체 모두가 이핵이며 단핵 균사체가 없음을 확인한다. 이것은 이렇게 배양하여 얻는 균사체가 이핵 균사체임을 시사해 주는 것이다.

이 담자균류는 구름 버섯 CM-103이며 상기 언급한 정부기관에 FERM-P No. 2414로 1973년 12월 25일에 보관되어 있다.

5%의 포도당과 0.75의 효모추출물을 함유한 100ml의 액체 배지를 500ml짜리의 원추형 플라스크에 가하고 가열 멸균한 후 이것에 백금 루프를 사용하여 구름 버섯 CM-103의 균사체를 접종하고 이어서 25±2℃에서 7일간 진탕 배양시킨다. 이 배지중의 균사체는 이핵이며 10.8g/ℓ의 농도로 함유되어 있다.

이렇게 얻어진 이핵 균사체를 10%의 포도당과 1.5%의 효모추출물을 용해시킨 20ℓ의 액체 배지에 접종시키고 페들형의 교반기를 사용하여 500r.p.m의 속도로 25±2℃로 온도를 맞춘 발효기에서 교반시켜가며 심부 배양시킨다. 7일간 배양시킨후에는 균사체는 육즙내에 10.2g/ℓ의 농도로 생성된다. 20ml의 이 육즙을 같은 배지에 접종하고 2회째 배양은 같은 조건하에서 6일간 실시한다. 유사한 배양을 3회째에는 5일간하고 4회째에는 4일간 배양시킨다.

4회째 배양을 완결시킨후 육즙은 균질한 펄프형태이며 이에는 생성된 균사체가 11.5g/ℓ의 농도로 함유되어 있다. 균사체에는 연결부위가 없으며 모두 단핵 균사체이었다.

Claims (1)

1. 구름 버섯(Coriolus Versicolor(Fr.)Quel)의 이핵 균사체를 액체 배지중에서 마쇄, 전단 처리한후 심부 배양하거나 또는 이핵 균사체에 마쇄, 전단 처리를 하면서 심부배양시킴을 특징으로 하는 구름 버섯의 신규의 단핵 균사체의 제조방법.

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