KR101955275B1 - 식도 손상을 예방하는 효능을 갖는 락토바실러스 파라카제이 hy7013 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013은 위액에 의한 식도세포 사멸을 억제하고, 위액에 의해 증가하는 식도세포의 IL-8(Interlukin-8) 유전자 발현을 억제하며, 위장 세포에서의 가스트린(gastrin) 발현을 저해하는 효능을 가지므로 역류성 식도염 등 위식도 역류질환에 의한 식도 상피세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하기 위한 건강기능식품, 기능성 음료, 발효제품 등 식품조성물로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 식도 손상을 예방하는 효능을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 위액에 의한 식도세포 사멸을 억제하고, 위액에 의해 증가하는 식도세포의 IL-8(Interlukin-8) 유전자 발현을 억제하며, 위장 세포에서의 가스트린(gastrin) 발현을 저해하여 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하는 효능을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것이다.
역류성 식도염을 포함하는 위식도 역류질환은 위 내용물(염산, 펩신, 담즙산)이 식도로 역류하여 다양한 임상 증상과 점막의 변화를 가져오는 질환으로서 산에 노출되는 시간이 길수록 심한 병변을 보이며 만성적인 경과를 밟는다. 대개는 산성의 위액이 역류하면서 식도를 자극하기 때문에 가슴 부위부터 목까지 타들어가는 듯한 느낌을 받고, 이로 인해 가슴의 답답함과 더불어 호흡곤란까지 올 수 있으며, 심한 경우에는 통증이 느껴지기도 한다. 이러한 증상을 속쓰림(Heartburn)이라고 한다. 음식을 삼킬 때 불편감이 느껴질 수도 있고, 기침을 자주 한다거나 역류하는 분비물 때문에 입안에 쓴 맛이 계속 남아있고, 합병증으로 폐렴(aspiration pneumonia)이 발생하기도 한다(F.Rieder, P. Biancani, K. Harnett, L. Yerian, and G. W. Falk, "Inflammatory mediators in gastroesophageal reflux disease: impact on esophageal motility, fibrosis, and carcinogenesis,"American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology, vol. 298, no. 5, pp. G571-G581, 2010).
위식도 역류질환의 원인으로는 잘못된 식습관을 들 수 있다. 육식, 고지방, 인스턴트 식품 등은 위산 분비를 상승시키며, 과식이나 급하게 먹는 식습관은 위장내압을 상승시켜 위산의 중화를 어렵게 만든다. 위산분비가 증가하고 중화에 지장이 생기면 역류성 식도염 원인이 된다. 다른 역류성 식도염 원인으로는 식후에 눕는 습관이 있다. 식후에 눕거나 구부리는 자세를 취하면 위 내용물이 식도 가까이로 쏠려 역류가 더 일어나기 쉬워진다. 특히, 과식 후에 바로 누워 자는 버릇은 역류성 식도염으로 직결되는 경우가 많다. 그 외에 담배를 피우거나, 커피·차·콜라·초콜릿·박하·오렌지 주스 등의 음식도 유문괄약근의 조이는 힘을 약화시켜 역류성 식도염을 유발한다.
위식도 역류질환이 계속 지속되다 보면 식도가 위액에 의한 자극을 계속 받게 되고, 식도 손상과 함께 역류성 식도염으로 발전하게 된다. 지속되는 위액의 자극에 식도는 스스로를 산성 자극에 버티게 하기 위해 상피를 식도점막이 아닌 위나 장 점막과 같은 상피로 바꾸게 된다. 이 과정을 화생(Metaplasia)이라고 하며, 이 과정을 통해 상피의 종류가 변한 식도를 바렛 식도(Barrett's esophagus)라고 한다. 일반적인 식도에 비해 바렛식도는 식도암이 생길 위험이 훨씬 높아진다. 바렛 식도의 길이가 3cm 이상일 경우에는 특정 식도암의 발병률이 3~40배 높아진다(N. Vakil, S.V. van Zanten, P. Kahrilas et al., "The Montreal definition and classification of gastroesophageal reflux disease: a global evidence-based consensus," The American journal of gastroenterology, vol. 101, no. 8, pp. 1900-1920, 2006).
케모카인(chemokine) IL-8(Interlukin-8)은 정상인의 식도세포에 비해 역류성 식도염 환자의 식도세포에서 높게 발현되며, 바렛식도와 식도선암(esophageal adenocarcinoma)에서 더욱 높게 발현되는 것으로 알려져 있다. 특히, 역류성 식도염, 바렛식도, 식도선암 순으로 IL-8의 발현이 높게 관찰되며, 수술을 통해 역류성 식도염이 개선되면 그 정도가 감소하나 식도암이나 식도세포 변이가 있다면 IL-8의 발현정도가 정상으로 감소하지는 않는 것으로 보고되어 있다. 따라서, IL-8은 역류성 식도염에서의 식도점막의 염증정도를 나타낼 뿐만이 아니라 식도세포가 역류된 위액에 의해 바렛식도나 식도암으로 변이되고 있음을 나타내는 지표로 사용될 수 있다(Yoshida N et al.,"Interleukin-8 expression in the esophageal mucosa of patients with gastroesophageal reflux disease"Scand J Gastroenterol. Sep;39(9):816-22, 2004, Oh DS et al., "Reduction of interleukin 8 gene expression in reflux esophagitis and Barrett's esophagus with antireflux surgery esophageal adenocarcinoma" Arch Surg, Jun;142(6):554-9; discussion 559-60, 2007).
대표적인 프로바이오틱스(probiotic)인 락토바실러스 속(Lactobacilli) 유산균들 중 일부는 소화불량(dyspeptic symptoms)과 만성 위염(chronic gastritis)의 치료 및 예방에 효과가 있고, 헬리코박터 파일로리(H. pylori)의 감염과 그로 인한 위점막의 염증반응을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 하지만, 아직까지 락토바실러스 속 유산균의 직접적인 식도세포의 손상 및 변이(화생)억제 효과에 대한 연구는 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 인체에 무해한 식품 미생물 유래의 식도세포 보호 및 식도세포 변이 억제 효과를 갖는 물질을 탐색하던 중 본 발명의 동동주에서 분리된 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013이 위 역류액의 주성분인 염산과 담즙산에 의한 식도세포의 손상 및 식도세포 변이인자인 IL-8을 억제할 뿐만 아니라 위액의 산도를 높이는 가스트린(gastrin) 유전자의 발현을 억제하여 위액 역류시 위산에 대한 식도 자극을 줄여 역류성 식도염 등 위식도 역류질환으로 인한 가슴쓰림(흉통) 및 바렛식도 등을 예방할 수 있다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 위액에 의한 식도세포 사멸을 억제하고, 위액에 의해 증가하는 식도세포의 IL-8(Interlukin-8) 유전자 발현을 억제하며, 위장 세포에서의 가스트린(gastrin) 발현을 저해하여 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하는 효능을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 및 이를 유효성분으로 함유하는 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등 식품조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 위액에 의한 식도세포 사멸을 억제하고, 위액에 의해 증가하는 식도세포의 IL-8(Interlukin-8) 유전자 발현을 억제하며, 위장 세포에서의 가스트린(gastrin) 발현을 저해하여 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하는 효능을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 제공하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013를 유효성분으로 함유하는 위식도 역류질환에서 역류한 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하는 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등 식품조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 유효성분으로 함유하는 위식도 역류질환에서 역류한 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하기 위한 식품조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유, 건강기능식품 등으로 사용될 수 있다. 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 또는 건강기능식품으로 사용되는 경우, 각종 식품류, 발효유, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 유효성분으로 함유하는 위식도 역류질환에서 역류한 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하기 위한 발효유는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 유산균 배양액 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 발효유를 제조한다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 유효성분으로 함유하는 위식도 역류질환에서 역류한 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하기 위한 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조한다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 유효성분으로 함유하는 위식도 역류질환에서 역류한 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하기 위한 건강기능식품은 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 포함하는 것 이외에 영양보조 성분으로 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
본 발명은 위액에 의한 식도세포 사멸을 억제하고, 위액에 의해 증가하는 식도세포의 IL-8(Interlukin-8) 유전자 발현을 억제하며, 위장 세포에서의 가스트린(gastrin) 발현을 저해하여 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하는 효능을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 유효성분으로 함유하는 위식도 역류질환에서 역류한 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하기 위한 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등 식품조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 위산에 의해 유도되는 식도세포의 사멸을 억제하는 유산균을 선별하기 위해 식도세포에 유산균과 위산의 주성분인 염산을 처리한 후 식도세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 2는 담즙산에 의해 유도되는 식도세포의 사멸을 억제하는 유산균을 선별하기 위해 식도세포에 유산균과 담즙산의 주성분인 데옥시콜릭산을 처리한 후 식도세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 3은 인공위액에 의한 식도세포 손상을 억제하는 유산균을 선별하기 위해 식도세포에 유산균과 펩신, 염산 및 데옥시콜릭산이 함유된 인공위액을 처리한 후 식도세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013이 식도세포에서 인공위액에 의해 증가하는 IL-8을 억제하는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013이 위 상피세포에서 위액의 분비를 증가시키는 가스트린의 발현을 억제하는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 담즙산에 의해 유도되는 식도세포의 사멸을 억제하는 유산균을 선별하기 위해 식도세포에 유산균과 담즙산의 주성분인 데옥시콜릭산을 처리한 후 식도세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 3은 인공위액에 의한 식도세포 손상을 억제하는 유산균을 선별하기 위해 식도세포에 유산균과 펩신, 염산 및 데옥시콜릭산이 함유된 인공위액을 처리한 후 식도세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013이 식도세포에서 인공위액에 의해 증가하는 IL-8을 억제하는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013이 위 상피세포에서 위액의 분비를 증가시키는 가스트린의 발현을 억제하는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7013의 분리 및 동정
1-1. 균주의 분리
본 발명에 따른 식품유래 신규 유산균주를 분리하기 위하여 전국 전통시장에서 전통발효식품(장류, 젓갈) 및 전통발효주(막걸리, 동동주) 120종을 수집한 후 각각을 분쇄하여 호기희석액 5㎖에 희석하였다. 상기 희석액을 0.1% CaCO3를 함유하는 MRS 고체배지(Difco Laboratory, Detroit, MI, US)에 도말한 후 AnaeroGenTM gas pack(Oxoid Inc.)을 사용하여 혐기적인 조건에서 37℃에서 48시간 배양한 후 젖산 생성에 의해 투명환을 형성한 콜로니를(colony)를 백금이(loop)로 취하여 BCP 고체배지에 접종하고 24시간 후 노란색 환을 형성한 콜로니를 유산균으로 순수 분리하여 총 93개의 유산균을 얻을 수 있었다. 이렇게 분리된 각각의 유산균을 0.05% L-시스테인을 첨가하여 만든 MRS 액체배지(Lactobacilli MRS broth)에 접종하여 24시간 배양 후 원심분리를 통해 균체를 회수하여 인산완충용액(PBS, pH 7.0)으로 세척 후 PBS에 현탁하였다.
1-2. 염산에 의한 식도세포 손상을 억제하는 유산균 선발
염산(HCl)은 위산의 주성분으로 위식도 역류병에서 역류된 위액 내의 위산은 식도세포를 자극하여 식도세포의 손상(사멸)을 일으키고, 이로 인해 식도조직의 염증반응이 증가하여 역류성 식도염, 식도변이, 바렛식도 및 식도 선암 등이 발생한다. 따라서, 전국 전통 발효식품 및 전통주에서 분리한 상기 실시예 1-1의 각각의 유산균이 염산에 의한 식도세포 손상을 억제하는지 다음과 같이 시험하였다.
인간 식도 세포 Het-1a는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 BEGM™ 배지(Lonza)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 상기 배양된 인간 식도 세포인 Het-1a 세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 2ㅧ104cells/well로 분주하여 24시간 배양한 후, 상기 실시예 1-1의 각각의 유산균 현탁액을 1x107CFU/well이 되도록 처리하였다. 상기 각각의 유산균 현탁액 처리 6시간 후에 위산의 주성분인 염산을 최종농도가 20mM이 되도록 처리하였다. 그런 다음, 상기 염산 처리 6시간 후, MTT 용액(SIGMA, M5655)을 넣고 1시간 더 배양한 다음, 생성된 포르마잔(formazan)을 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)를 첨가하여 용해시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 측정하였다.
한편, 대조군은 상기 유산균 현택액과 염산 대신에 동량의 PBS(phosphate buffered saline)을 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였고, 음성대조군은 상기 유산균 현택액 대신에 동량의 PBS(phosphate buffered saline)을 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인간 식도 세포인 Het-1a 세포에 염산만을 처리한 음성대조군에서는 식도세포 생존율이 45%로 감소한 반면, 상기 실시예 1-1의 유산균 현탁액 중에서 37번, 38번, 53번 및 70번 유산균 현탁액을 처리한 실험군에서는 식도세포 생존율이 약 58~61%로 증가하는 것으로 나타났다.
1-3. 데옥시콜릭산에 의한 식도세포 손상을 억제하는 유산균 선발
데옥시콜릭산(Deoxycholic acid)은 답즙산의 주성분으로 위식도 역류병에서 역류된 위액 내에 존재하는 담즙산에 의해 식도 손상과 식도 상피세포의 장세포화(Intestinal metaplasia) 변이를 일으킨다. 따라서, 상기 실시예 1-1의 각각의 유산균이 답즙산의 주성분인 데옥시콜릭산에 의한 식도세포 손상을 억제하는지 다음과 같이 시험하였다.
상기 실시예 1-2의 배양된 인간 식도 세포인 Het-1a 세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 2×104cells/well로 분주하여 24시간 배양한 후, 상기 실시예 1-1의 각각의 유산균 현탁액을 1x107CFU/well이 되도록 처리하였다. 상기 각각의 유산균 현탁액 처리 6시간 후에 담즙산의 주성분인 데옥시콜린산을 최종농도가 300μM이 되도록 처리하였다. 그런 다음, 상기 데옥시콜린산 처리 6시간 후, MTT 용액(SIGMA, M5655)을 넣고 1시간 더 배양한 다음, 생성된 포르마잔(formazan)을 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)를 첨가하여 용해시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 측정하였다.
한편, 대조군은 상기 유산균 현택액과 데옥시콜린산 대신에 동량의 PBS(phosphate buffered saline)을 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였고, 음성대조군은 상기 유산균 현택액 대신에 동량의 PBS(phosphate buffered saline)을 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인간 식도 세포인 Het-1a 세포에 데옥시콜린산만을 처리한 음성대조군에서는 식도세포 생존율이 35%로 감소한 반면, 상기 실시예 1-1의 유산균 현탁액 중에서 37번, 38번, 53번 및 70번 유산균 현탁액을 처리한 실험군에서는 식도세포 생존율이 약 44~48%로 증가하는 것으로 나타났다.
1-4. 위액에 의한 식도세포 손상을 억제하는 유산균 선발
상기 실시예 1-2와 1-3의 위산의 주성분인 염산과 담즙산의 주성분인 데옥시콜린산에 의한 식도세포 사멸을 모두 억제하는 것으로 나타난 상기 4종의 균주에 대하여 소화효소인 펩신, 위산의 주성분 염산 및 담즙산의 주성분인 데옥시콜린산을 모두 포함하는 인공위액(0.3% pepsin, 0.5% NaCl, 20mM HCl, 100μM Deoxycholic acid)에 의한 식도세포 손상을 억제하는지 다음과 같이 시험하였다.
상기 실시예 1-2의 배양된 인간 식도 세포 Het-1a를 6 웰 플레이트(well plate)에 1×106cells/well로 분주하여 24시간 배양한 후, 상기 4종의 유산균 현탁액을 1x108CFU/well이 되도록 처리하였다. 상기 4종의 유산균 처리 6시간 후에 배지를 제거하고, 인간 식도 세포 Het-1a 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 3회 세척한 다음, 상기 인공위액 100μM을 처리하였다. 상기 인공위액 처리 1시간 후, 다시 인공위액을 제거하고, BEGM™ 배지(Lonza)로 교환한 다음, 37℃, 5% CO2 배양기에서 인간 식도 세포 Het-1a 세포를 배양하였다. 그런 다음, 배양 6시간 후에 MTT 용액(SIGMA, M5655)을 넣고 1시간 더 배양한 다음, 생성된 포르마잔(formazan)을 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)를 첨가하여 용해시킨 후에 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 측정하였다.
한편, 대조군은 상기 유산균 현택액과 인공위액 대신에 동량의 PBS(phosphate buffered saline)을 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였고, 음성대조군은 상기 유산균 현택액 대신에 동량의 PBS(phosphate buffered saline)을 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인간 식도 세포인 Het-1a 세포에 인공위액만을 처리한 음성대조군에서는 식도세포 생존율이 약 41%로 감소한 반면, 상기 4종의 37번 균주, 38번 균주, 53번 균주 및 70번 균주의 유산균 현탁액을 처리한 실험군에서는 식도세포 생존율이 약 59~65%로 증가하는 것으로 나타났다.
1-5. 본 발명의 신균주의 선발
상기 실시예 1-2의 배양된 인간 식도 세포 Het-1a를 6 웰 플레이트(well plate)에 1×106cells/well로 분주하여 24시간 배양한 후, 상기 실시예 1-4의 4종의 유산균 현탁액을 1x108CFU/well이 되도록 처리하였다. 상기 4종의 유산균 현탁액 처리 6시간 후 배지를 제거하고 염산과 데옥시콜릭산을 모두 첨가하여 배지의 pH를 7.2에서 4.5로 낮춘 배지로 교환하였다. pH4.5 배지 처리 1시간 후 다시 배지를 제거하고 pH7.2의 일반배지로 교환한 다음 6시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 인간 식도 세포 Het-1a을 배양하였다. 배양 6시간 후 인간 식도 세포 Het-1a을 PBS(phosphate buffered saline)로 3회 세척한 다음, trizol reagent(sigma)를 각 well에 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA는 정량 후 동량을 취하여 High Capacity cDNA Kit(thermofisher)를 이용하여 cDNA를 합성한 다음, 인터루킨 8(IL-8) primer(Hs00174103_m1, thermofisher)를 사용하여 qPCR을 시행하여 식도세포 염증 및 변이 인자인 IL-8의 상대적 발현량을 측정하였다(ABI PRISM 7500 Sequence Detection System). 염산과 데옥시콜릭산에 의해 증가하는 IL-8을 효과적으로 억제하는 70번 균주를 최종적으로 선발하였다.
1-6. 본 발명의 신균주의 동정
상기 실시예 1-5의 70번 균주의 종을 정하기 위하여 16S rRNA 유전자 분석과 Biomerieux 사의 API 50 CHL kit 동정 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
상기의 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 70번 균주의 16S rRNA 유전자는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)의 16S rDNA 유전자와 99% 일치하는 것으로 나타났으며, 각종 당 분해능을 API 아이덴티피케이션 소프트웨어 프로그램(API identification software program)으로 분석한 결과도 락토바실러스 파라카제이 서브스패 시즈 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)와 89.3%의 유사성을 가진 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명자들은 70번 균주를 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013으로 명명하고, 2018년 10월 26일에 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC13688BP).
본 발명에 따른 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013의 균학적 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성
①세포의 형태: 간균
②운동성: 없음
③포자형성능: 없음
④그람(Gram) 염색: 양성
2)균락의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태
①형상: 원형
②융기: 볼록
③표면: 매끄러움(slime)
3)생리적 성질
①생육온도: 생장가능 생육온도 20~40℃
최적 생장온도 37℃
②생육 pH: 생장가능 생육 pH 4.5~10
최적 pH 5.0~6.0
③산소에 대한 영향: 통성혐기성
4)카탈라제: -
5)가스형성여부: -
6)15℃에서 생육: -
7)45℃에서 생육: +
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
10)당 분해 이용성
Biomerieux 사의 API 50 CH kit를 이용하여 당 발효 실험을 한 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.
| 당 0-24 | 사용여부 | 당 25-49 | 사용여부 |
| 0 Control | - | 25 에스큘린 | + |
| 1 글리세롤 | - | 26 살리신 | + |
| 2 Erythritol | - | 27 셀로비오스 | + |
| 3 D 아라비노스 | - | 28 말토스 | - |
| 4 L 아라비노스 | - | 29 유당 | + |
| 5 리보스 | + | 30 멜리비오스 | - |
| 6 D 크실로스 | - | 31 자당 | + |
| 7 L 크실로스 | - | 32 트레할로스 | + |
| 8 아도니톨 | - | 33 이눌린 | - |
| 9 β 메틸-D-크실로시드 | - | 34 멜레지토스 | - |
| 10 갈락토스 | + | 35 라피노스 | - |
| 11 포도당 | + | 36 전분 | - |
| 12 과당 | + | 37 글리코겐 | - |
| 13 만노스 | + | 38 크실리톨 | - |
| 14 소르보스 | - | 39 겐티오비오스 | + |
| 15 람노스 | - | 40 D 투라노스 | + |
| 16 둘시톨 | - | 41 D 라이소스 | - |
| 17 이노시톨 | - | 42 D 타가토스 | + |
| 18 만니톨 | + | 43 D 푸코스 | - |
| 19 소르비톨 | - | 44 L 푸코스 | - |
| 20 α-메틸-D-만노시드 | - | 45 D 아라비톨 | - |
| 21 α-메틸-D-클루코시드 | + | 46 L 아라비톨 | - |
| 22 N-아세틸-글루코사민 | + | 47 글루코나테 | + |
| 23 아미그달린 | - | 48 2-케토-글루코나테 | - |
| 24 아르부틴 | + | 49 5-케토-글루코나테 | - |
<실시예 2>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7013 농축균의 제조
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013를 순수 배양한 콜로니를 각각 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 정치배양(batch culture)하였다. 이것을 4,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)를 이용하여 4,000rpm에서 다시 원심분리하여 세척한 뒤 상등액을 제거하고 2.5~5% 멸균탈지유(Skim milk)를 보호제로 사용하여 펠렛을 풀어주었다. 이렇게 제조한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 농축균의 생균수는 1010CFU/㎖ 이상으로 나왔다. 상기 농축균 제조에 사용하는 보호제는 멸균탈지유 이외에 덱스트린, 유당, 올리고당, 포도당 및 트레할로스 중 어느 하나이거나 이의 혼합물일 수 있다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 농축균은 상기와 같은 액상농축균 형태 외에 동결 건조된 분말형태로 제공될 수도 있다.
<실시예 3>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7013을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.55~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix0)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 적정온도 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP배지에서의 총 유산균 수가 1.0X109cfu/㎖이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다. 그런 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다. 그런 다음, 상기 유산균 배양액 69.5중량%와 상기 실시예 1의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 농축균 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7013을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix0 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고, 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 1의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 농축균 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 5>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7013을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 농축균 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기의 실시예 1의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013 농축균 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<시험예 1>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7013의 식도세포 변이 억제 효과
케모카인 IL-8은 염증 매개인자로 작용할 뿐만 아니라 식도 상피세포의 바렛식도 및 식도선암으로의 변이정도를 나타내는 지표로 사용될 수 있으므로 발명은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013이 식도 상피세포에서 위액의 자극에 의한 IL-8의 증가를 억제하는지 다음과 같이 시험하였다.
상기 실시예 1-2의 배양된 인간 식도 세포 Het-1a를 6 웰 플레이트(well plate)에 1×106cells/well로 분주하여 24시간 배양한 후, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013의 유산균 현탁액을 1x108CFU/well이 되도록 처리하였다. 상기 유산균 현탁액 처리 6시간 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 3회 세척한 다음, 소화효소인 펩신, 위산의 주성분 염산 및 담즙산의 주성분인 데옥시콜린산을 모두 포함하는 인공위액(0.3% pepsin, 0.5% NaCl, 20mM HCl, 100μM Deoxycholic acid)을 처리하였다. 상기 인공위액 처리 30분 후 다시 인공위액을 제거하고, BEGM™ 배지(Lonza)로 교환한 다음, 37℃, 5% CO2 배양기에서 인간 식도 세포 Het-1a를 배양하였다. 그런 다음, 배양 6시간 후, 인간 식도 세포 Het-1a를 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 다음, trizol reagent(sigma)를 각 웰에 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA는 정량 후 동량을 취하여 High Capacity cDNA Kit(thermofisher)을 이용하여 cDNA를 합성한 다음, IL-8 primer(Hs00174103_m1, thermofisher)를 사용하여 qPCR을 시행하여 IL-8의 상대적 발현량을 측정하였다(ABI PRISM 7500 Sequence Detection System).
한편, 대조군은 상기 유산균 현택액과 인공위액 대신에 동량의 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였고, 음성대조군은 상기 유산균 현택액 대신에 동량의 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인간 식도 세포인 Het-1a 세포에 인공위액만을 처리한 음성대조군에서는 IL-8의 발현이 대조군과 대비하여 8배 이상 증가한 반면, 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013의 유산균 현탁액을 처리한 실험군에서는 IL-8의 발현이 음성대조군과 대비하여 약 50% 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 사실은 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013이 위액이 식도로 역류하는 위식도 역류 상황에서 위액에 의한 식도조직의 염증반응과 식도 상피세포의 변이를 예방할 수 있다는 것을 시사한다.
<시험예 2>
락토바실러스 파라카제이(
Lactobacillus paracasei
) HY7013의 가스트린 생성 억제 효과
가스트린(gastrin)은 위 유문부에서 생성되어 위액 중의 산 농도(수소이온 농도)의 상승 및 위액의 증가 효과를 가진 호르몬으로서, 가스트린의 생성을 억제하면 위액 중의 산 농도를 감소시키고, 위액의 분비량을 조절할 수 있다. 위액의 높은 산 농도는 위액 역류시 식도세포에 더욱 큰 자극을 주어 역류성 식도염과 바렛식도 등 식도세포 변이를 더욱 가속시키게 되므로 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013이 상기 시험예 1과 같은 직접적인 식도세포 보호효과 이외에 위장에서의 가스트린의 생성을 억제하는 효과가 있는지 다음과 같이 시험하였다.
사람 위 상피세포주인 AGS 세포(human gastric adenocarcinoma epithelial cell line)는 한국세포주은행으로부터 분양 받아 10% FBS, 1% antibiotics가 포함된 F-12 배지(Lonza)를 이용하여 6 웰 플레이트(well plate)에 1x106cells/well이 되도록 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 상기 배양된 AGS 세포에 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013를 1x107CFU/well로 처리 후, 12시간 동안 배양한 다음, trizol reagent(sigma)를 각 웰에 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA는 정량 후 동량을 취하여 High Capacity cDNA Kit(thermofisher)을 이용하여 cDNA를 합성한 다음, 가스트린 특이 primer(Hs01099852_g1)를 사용하여 qPCR을 시행하여 가스트린 유전자의 발현을 측정하였다.
한편, 대조군은 상기 유산균 현택액 대신에 동량의 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 사람 위 상피세포주인 AGS 세포에 PBS(phosphate buffered saline)만을 처리한 대조군과 대비하여 AGS 세포에 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013의 유산균 현탁액을 처리한 실험군에서는 가스트린 유전자의 발현이 약 40% 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 사실은 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013이 시험예 1에서와 같은 직접적인 위액에 의한 식도세포 보호 및 변이억제 효과 이외에 위장 내에서의 산의 농도 및 위액 분비량을 조절하여 역류성 식도염에 효과가 있을 수 있다는 것을 시사한다.
Claims (6)
- 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013(수탁번호: KCTC13688BP).
- 청구항 1에 있어서,
상기 유산균은 위산 및 담즙산에 의한 직접적인 식도세포 사멸을 억제함으로써 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013(수탁번호: KCTC13688BP).
- 청구항 1에 있어서,
상기 유산균은 식도세포의 IL-8(Interlukin-8)의 발현을 억제함으로써 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013(수탁번호: KCTC13688BP).
- 청구항 1에 있어서,
상기 유산균은 가스트린(gastrin) 유전자의 발현을 억제함으로써 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013(수탁번호: KCTC13688BP).
- 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7013(수탁번호: KCTC13688BP)을 유효성분으로 함유하는 위액에 의한 식도세포 손상 및 화생(Metaplasia)을 예방하기 위한 식품조성물.
- 청구항 5에 있어서,
상기 식품조성물은 발효유, 건강기능식품, 기능성 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 식품조성물.
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