KR20140039548A - 락토바실러스 펜토서스 균주, 그 배양액을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP) 및 그 배양액을 포함하는 피부 미백용 조성물, 상기 균주 배양액으로부터 분리된 미백 활성 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 피부 미백용 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명을 통하여 타이로시나아제 활성 억제효능 및 멜라닌 합성 억제효능이 우수하여 피부 미백 기능이 현저하게 우수하면서도 피부 자극이 없는 피부 미백용 조성물을 제공할 수 있다.

Description

락토바실러스 펜토서스 균주, 그 배양액을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 그 제조방법{Lactobacillus pentosus strain, skin whitening composition having culture fluid thereof and preparation method of the same}

본 발명은 락토바실러스 펜토서스 균주, 그 배양액을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) Miev L1207(KCTC12155BP) 균주, 그 배양액을 포함하는 피부 미백용 조성물, 그 배양액으로부터 분리된 미백 활성 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

최근 삶의 질을 향상시키고자 하는 경향이 뚜렷해지며 외모에 대한 관심이 높아지고 있다. 이에 따라 성형, 미용, 화장에 대한 일반 대중의 관심이 급속도로 높아지고 있다. 특히 동안 열풍 및 하얀 얼굴에 대한 선호 현상으로 인하여 미백화장품 및 주름개선화장품에 대한 관심이 지속적이면서도 폭발적으로 증가하고 있다.

이러한 미백화장품 및 주름개선화장품에 대한 관심은 미백 및 주름개선 소재에 대한 수요의 증가와 효소, 유산균 등의 미생물을 이용한 화장품의 개발로 이어지고 있다. 특히 주요한 미생물로 사용되는 유산균에는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 비피도박테리움 롱검(Bipidobacterium longum) 등이 있으며, 상기 균주들은 항균 활성, 항산화 활성, 항염증 활성을 가진다고 보고된 바 있다.

최근 각국의 전통 발효식품에 다양한 기능이 있다는 학계의 결과가 발표되면서 국내외적으로 많은 관심을 불러일으키고 있다. 발효식품은 유산균이 풍부하여 생활 습관병(고혈압, 비만, 당뇨 등)을 예방할 뿐 아니라, 항암, 소화, 강장, 뇌기능 활성화 등에 효과가 있다는 점이 지속적으로 밝혀지고 있다.

피부의 색은 주로 피부 속에 존재하는 멜라닌(melanin)이라는 색소의 함량에 의해 결정된다. 멜라닌은 피부의 기저층에 존재하는 멜라닌 생성세포(멜라노사이트, melanocyte)에 의해서 생합성되고 세포질 돌기를 통하여 각질형성세포(keratinocyte)의 각화과정에 의해서 표피의 기저층에서 각질층으로 이동하게 된다. 이 멜라닌을 형성하는 주효소인 타이로시나아제(tyrosinase)는 속도결정단계(rate-limiting step)인 타이로신(tyrosine)에서 디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA, 도파)으로의 전환단계와 이후 단계인 도파(DOPA)에서 도파퀴논(DOPA quinone)으로의 전환단계를 매개한다. 따라서 타이로시나아제 효소의 활성을 저해하고 멜라닌 생성을 억제시켜 피부 미백 효과를 확인할 수 있다.

현재 미백제로 가장 많이 사용되는 알부틴은 L-타이로신과 경쟁적으로 작용하는 저해제이다. 또한 미백제로 많이 사용되는 코직산(Kojic acid)는 타이로시나아제 활성 부위의 구리를 킬레이팅(chelating)하여 타이로신에서 도파로, 그리고 도파에서 도파퀴논으로 진행되는 과정을 저해한다.

대표적인 발효식품인 김치에서 분리된 유산균은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 람노스(Lactobacillus rhamnosus) 등이 있다. 이들 중 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)는 면역활성 증진 및 항암효과를 나타낸다고 알려져 있고, 프로바이오틱 유산균으로 이용될 수 있는 항균력, 내산성, 내담즙성 등의 기능을 가진 것으로 조사되었다(특허문헌 1 참조). 그러나 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)의 피부에 대한 효과에 관한 연구는 미흡한 실정이며, 미백 기능에 대한 연구는 아직 알려진 바가 없었다.

1. 한국등록특허 제0991456호

1. Foote CS. 1976. Photosensitized oxidation and singlet oxygen; consequences in biological systems. Pryor WA, ed. 2nd ed. Academic press, New York, USA. p 31 2. Tomita, K., N. Oda, M. Ohbayashi, H. Kamei, T. Miyaki and T. Oki. : A new screening method for melanin biosynthesis inhibitiors using Streptomyces bikiniensis. J. Antibiot. 44"1601~1605(1990) 3. Mosmann, T. : Rapid colorimetric assay for the cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxic assay. J. Immum methos 65, 55(1983) 4. Hosoi, J., Abe, E., Suda, T. and Kuroki, T. :Refulation of melanin systhesis of B16 mouse melanoma cells by 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid. Cancer Res. 45, 564(1985)

본 발명의 목적은 타이로시나아제 활성 억제효능 및 멜라닌 합성 억제효능이 우수하여 피부 미백 기능이 현저하게 우수한 락토바실러스 펜토서스 균주, 그 배양액을 포함하는 피부 미백용 조성물, 그 배양액으로부터 분리된 미백 활성 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 그 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피부 자극이 없고 화학적 합성품이 아닌 미백 화장품 소재 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)를 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)를 배양한 균주 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 피부 미백용 조성물은 상기 균주 배양액이 피부 미백용 조성물 총중량 대비 0.001 내지 50 중량% 포함된 것을 특징을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 균주 배양액은 10kDa 이하의 분자량을 갖는 입자만을 함유하도록 여과한 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)를 배양한 균주 배양액으로부터 분리된 10kDa 이하의 분자량을 갖는 미백 활성 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 피부 미백용 조성물에 포함되는 미백 활성 물질은 숙신산인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 피부 미백용 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)를 배양하는 단계를 포함하는 피부 미백용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 피부 미백용 조성물의 제조방법은 균주를 배양하는 단계에서 수득한 배양액을 여과과정, 농축과정, 추출과정 및 건조과정 중 어느 하나 이상의 과정으로 처리하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 피부 미백용 조성물의 제조방법의 여과 또는 추출과정은 상기 배양액에서 10kDa 이하의 분자량을 갖는 미백 활성 물질을 분리하는 과정인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 펜토서스 균주, 그 배양액을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 그 배양액으로부터 분리된 미백 활성 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물은 타이로시나아제 활성 억제효능 및 멜라닌 합성 억제효능이 우수하여 피부 미백 기능이 현저하게 우수하면서도 피부 자극이 없는 우수한 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207의 16s RNA의 염기서열을 기초로 한 다른 미생물과의 계통발생론적 관계를 나타낸 거리 기반 계통수(Neighbor-joining phylogenetic tree)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액의 타이로시나아제 효소 활성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액을 분자량 크기별로 분리한 후 타이로시나아제 효소 활성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액의 멜라닌 합성 억제 정도를 나타낸 세포주 배양 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액에서 멜라노마 세포를 배양한 경우의 세포 생존률을 나타낸 그래프이다. a)는 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액 원액, b)는 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양 농축액을 실험한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액이 멜라노마 세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액이 멜라노마 세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 락토바실러스 카세이 배양액과 대비하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액이 멜라노마 세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 숙신산과 대비하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액의 크로마토그래피 결과 사진이다.
도 10은 HPLC 크로마토그래피 사진이다. a)는 유기산, b)는 대조군인 MRS 브로스, c)는 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액.

상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP), 그 배양액을 포함하는 피부 미백용 조성물, 상기 균주 배양액으로부터 분리된 미백 활성 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 피부 미백용 조성물의 제조방법을 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)를 제공한다.

상기 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)는 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16S 라이보좀 DNA를 갖는 균주로서, 김치로부터 분리될 수 있으며, 타이로시네이즈 활성 억제 물질 및 멜라닌 합성 억제 물질을 생산한다. 상기 균주를 순수 분리하여, 16S rDNA 염기서열 분석과 생화학적 특성 분석을 통하여 동정한 결과, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)에 속하는 것으로 동정되었다. 이를 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207로 명명하고, 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2012년 3월 5일자로 KCTC(Korean Collection for Type Culture, 한국생명공학원)에 수탁번호 KTCT12155BP로 기탁하였다.

본 발명은 상기 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)를 배양한 균주 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

상기 배양액은 특정 미생물을 배양 배지에서 배양하여 수득한 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물을 의미하는 것으로, 균주를 포함하는 것 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거한 배양여액일 수 있다. 또한 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 예를 들면 액체, 에멀젼, 또는 고체일 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 상기 균주 배양액이 피부 미백용 조성물 총중량 대비 0.0001 내지 100 중량%로 포함될 수 있다. 본 발명의 균주 배양액이 피부 미백용 조성물의 총중량에 대하여 0.001 내지 50.0 %(w/w)로 포함되는 경우가 더 바람직하고, 0.001 내지 10%(w/w)로 포함되는 경우 가장 바람직하다. 균주 배양액의 함량이 0.001 %(w/w) 이상인 경우 본 발명이 목적하는 타이로시나아제 활성 억제 및 멜라닌 합성 억제를 통한 피부 미백 효과를 나타나는데 바람직하고, 균주 배양액의 함량이 50.0% 이하인 경우 균주 배양액의 함유량 증가에 따른 뚜렷한 미백 효과의 증가 및 제형의 안정성을 나타나는데 바람직하다.

본 발명에 따라 피부 미백용 조성물은 화장료로 제형될 수 있다. 화장료로 사용시 본 발명에 따른 유산균 배양액 외에 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 여러 물질이 첨가될 수 있다. 예를 들어, 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH조절제, 향료 등이 첨가될 수 있다.

상기 유분으로는 미네랄오일, 사이클로메치콘, 스쿠알란, 옥틸도데실 미리스테이트, 올리브오일, 마카다미아 너트오일,　글리세릴옥타노에이트, 캐스터오일, 에칠헥실 이소노나노에이트, 디메치콘, 사이크로펜타실록산, 선플라워씨드오일 등이 사용될 수 있다.　상기 계면활성제로는 소르비탄세스퀴놀리에이트, 폴리솔베이트 60, 글리세릴 스테아레이트, 친유형 글리세릴스테아레이트, 소르비탄 올리에이트, 소르비탄 스테아레이트, 디이에이-세틸포스페이트, 소르비탄스테아레이트/슈크로스코코에이트, 글리세릴스테아레이트/폴리에틸렌글라이콜-100 스테아레이트, 세테아레스-6 올리베이트, 아라키딜알코올/베헤닐알코올/아라키딜 글루코사이드. 폴리프로필렌글라이콜-26-부테스-26/폴리에틸렌글라이콜-40하이드로제네이티드 캐스터오일 등이 사용될 수 있다.

상기 보습제로는 글리세린, 솔비톨, 프로필렌 글라이콜, 부틸렌 글라이콜, 헥실렌 글라이콜, 디글리세린, 베타인, 글리세레스-26, 메칠글루세스-20 등이 사용될 수 있다.

상기 고급 알코올로는 세틸알코올, 스테아릴 알코올, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴 알코올 등이 사용될 수 있다. 상기 증점제로는 산탄검, 카보머, 마그네슘알루미늄실리케이트, 셀룰로오스검, 덱스트린 팔미테이트 등이 사용될 수 있다.　상기 킬레이트제로는 디소듐이디티에이, 테트라소듐이디티에이 등이 사용될 수 있다. 상기 색소로는 청색1호, 적색40호, 황색4호, 황색 5호 등이 사용될 수 있다.

상기 지방산으로는 스테아릭애씨드, 미리스틱애씨드, 팔미틱애씨드, 이소스테아릭애씨드, 라우릭애씨드 등이 사용될 수 있다.　상기 산화방지제로는 토코페릴아세테이드, 부틸레이티드하이드록시톨루엔 등이 사용될 수 있다.

상기 방부제로는 메칠파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올, 이미다졸리디닐우레아, 클로르페네신 등이 사용될 수 있다.　상기 왁스로는 카나우바왁스, 칸데닐라왁스, 밀납, 경납 등이 사용될 수 있다.　상기 pH 조절제로는 트리에탄올아민, 씨트릭애씨드 등이 사용될 수 있다.　상기 향료로는 천연향료, 조합향료 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 균주 배양액은 10kDa 이하의 분자량을 갖는 입자만을 함유하도록 여과한 것일 수 있다.

본 발명은 상기 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)를 배양한 균주 배양액으로부터 분리된 10kDa 이하의 분자량을 갖는 미백 활성 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 상기의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)를 배양한 균주 배양액으로부터 분리된 10kDa 이하의 분자량을 갖는 미백 활성 물질은 숙신산일 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 이 경우 화장료 조성물의 제형에 통상적으로 사용되는 담체 등을 포함하여 제조된다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용될 경우에는 화장수, 에멀젼, 크림, 에센스, 젤, 팩 및 클렌징크림으로부터 선택되는 기초 화장료용 제형; 화운데이션 등의 메이크업 화장료용 제형으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 페이스트, 크림 또는 겔로 제형되는 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 파우더 또는 스프레이로 제형되는 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 용액 또는 유탁액으로 제형되는 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 조성물이 현탁액으로 제형되는 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제; 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제; 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물은 각각의 제형에 상기 기재한 성분들 이외에 일반 피부 화장료에 배합되는 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 또는 향료 등을 필요에 따라 적절히 배합하여 사용할 수 있다.

예컨대, 유연화장수는 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 다가알콜류(프로필렌글리콜, 글리세린 등) 1∼10 중량% 및 계면활성제(폴리에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 등) 0.05∼2 중량%를 함유하도록 제조될 수 있다. 또한, 영양화장수 및 영양크림은 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 오일류(스쿠알란, 바셀린, 옥틸도데칸올 등) 5∼20 중량% 및 왁스성분(세탄올, 스테아릴알콜, 밀납 등) 3∼15 중량%를 함유하도록 제조될 수 있다. 에센스는 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 글리세린, 프로필렌글리콜 등의 다가알콜류 5∼30 중량%를 함유하여 제조될 수 있다. 마사지 크림은 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 유동파라핀, 바셀린, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일 30∼70 중량%를 함유하여 제조될 수 있다. 팩은 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 폴리비닐알콜 5∼20 중량%를 함유하는 필 오프(peel off) 팩으로 제조되거나 또는 일반유화형 화장료에 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 5∼30 중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조될 수 있다.

본 발명은 상기 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP)를 배양하는 단계를 포함하는 피부 미백용 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 락토바실러스 속 균주의 배양은 당업계에 일반적으로 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있으며 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.

배양 방법은 락토바실러스 속 균주에 일반적으로 사용되는 방법이 적용될 수 있으며, 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

배양 배지는 통상의 미생물 배양 배지를 사용할 수 있으며, 특히 락토바실러스 속 균주의 생장에 적합한 것으로 통상의 기술자에게 알려진 다양한 배지가 선택될 수 있다. 상기의 배양 배지는 락토바실러스 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 포함하나, MRS(deMan Rogosa Sharpe) 브로스 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI (Brain Heart Infusion) 배지 등을 사용하는 경우 락토바실러스 속 균주의 성장이 우수하고, 그 중에서도 MRS 브로스 배지를 사용하는 경우 락토바실러스 속 균주의 성장이 가장 우수하다.

배양 시간은 미생물의 생존을 고려하여 12시간 내지 72시간 정도 배양하는 것이 락토바실러스 속 균주의 증식으로 인한 균체 성장 저하를 최소화하면서 그 배양액의 타이로시나아제 활성 억제 능력이 우수하고, 더욱 바람직하게는 24시간 내지 48시간이며, 가장 바람직하게는 24시간 배양하는 것이다.

배양 온도는 20 내지 45℃의 온도 범위 내에서 배양하는 것이 균체 성장 및 타이로시나아제 활성 억제 능력면에서 바람직하고, 특히 25 내지 35℃, 그 중에서도 30℃에서 배양하는 경우 균체 성장 및 타이로시나아제 활성 억제 능력이 가장 우수하다.

상기 피부 미백용 조성물의 제조방법은 균주를 배양하는 단계에서 수득한 배양액을 여과과정, 농축과정, 추출과정 및 건조과정 중 어느 하나 이상의 과정으로 처리하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 여과과정, 농축과정, 추출과정 및 건조과정은 통상의 기술자가 미생물 배양액에 사용할 수 있는 통상적인 방법이 모두 적용될 수 있다. 따라서, 통상적으로 사용되는 필터여과, 막여과, 한외여과, 원심분리, 가열농축, 동결건조, 파쇄, 분쇄, 용매추출 및 열수추출 등이 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다.

상기 피부 미백용 조성물의 제조방법의 상기 여과 또는 추출과정은 상기 배양액에서 10kDa 이하의 분자량을 갖는 미백 활성 물질을 분리하는 과정일 수 있다. 상기에서 '분리'는 충분히 정제된 해당 화합물을 수득하는 정제 단계를 포함하는 공정을 말한다. 일 실시태양에서 상기 10kDa 이하의 분자량을 갖는 미백 활성 물질은 숙신산이다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

1. 유산균 분리

유산균의 분리에 사용한 배추김치로 가정에서 직접 담근 2년 이상 된 묵은 김치를 사용하였다. 미생물 분리, 배양 및 보존에 사용된 배지는 Lactobacilli MRS Broth Difco사(Detroit, Ml, USA)의 제품이었다.

유산균을 분리하기 위하여, 8000rpm, 5분 동안 원심분리기에서 원심분리하여 상기 배추김치로부터 김치의 액상부분만을 분리하였다. 분리된 상등액 20㎖를 취하여 20% 탈지분유(skim milk) 1ℓ에 접종한 후 37℃ 배양기에서 커드(curd)가 생성되는 시점까지 배양을 하여 5~7일 배양 후 커드가 생성되는 시료를 선별하였다.

시료 1㎖를 취하여 십진 희석법으로 희석한 후, 상기 희석액 100㎕를 MRS 아가 접시(agar plate)에 도말(spread)하여 37℃ 배양기에 48시간 동안 배양한 후, 균을 관찰하였다. 균이 생성된 아가 접시에서 콜로니(colony) 1개를 선별하여 20% 탈지분유에 접종한 후 커드 생성 여부를 관찰하였다. 커드가 잘 생성되는 배양액을 1가지 선정하고 계대 배양 횟수와 시간을 조절하여 균의 활성도를 높였다. 활성도가 높아진 균을 MRS 배지에 배양하여 이를 유산균으로서 실험에 사용하였다.

2. 유산균 동정

실험을 위하여 먼저 세균의 genomic DNA를 추출한 후, 하기의 프라이머 세트를 이용하여 16S rRNA 유전자 영역을 PCR(MJ Research PTC 225, Ramsey, Minnesota, USA)로 증폭하였다.

(1) 프라이머 세트 1(27F, 서열목록 2) : 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'

(2) 프라미터 세트 2(1492R, 서열목록 3) : 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3'

PCR 조건은 어닐링 온도 60℃이며, 증폭된 PCR 생산물은 QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다.

정제된 PCR 산물의 염기서열을 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)와 ABI 310 DNA sequencer(Applied Biosystems, Foster City, California, USA) 2를 이용하여 분석하였다.

분석된 각 균주의 염기서열을 NCBI Blast 검색을 통해 GenBank에 등록된 염기서열들과 비교하여 가장 높은 유사도를 나타내는 표준 균주를 기준으로 각 균주를 동정하였다. 또한 EzTaxon server 2.1^* 시스템을 보충하여 사용하였다(비특허문헌 1).

3. 실시예 및 비교예의 제조

김치에서 분리한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) Miev L1207 균주를 37℃에서 24시간 전 배양한 후 100㎖의 MRS 액체배지에 2% 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 원심분리(8,000rpm, 10min)하고 0.45㎛ membrane filter(advantec inc., USA)로 제균하여 유산균 배양액 원액(실시예 1)을 제조하였다.

실시예 1에서 제조된 유산균 배양액 원액을 8000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 얻었다. 상기 상등액을 60℃로 가열하여 감압농축하고 처음 부피의 1/10(v/v)이 될 때까지 농축하여 농축액(실시예 2)을 제조하였다.

실시예 1에서 제조된 유산균 배양액 원액에서 미백 활성 물질을 얻기 위해 60℃에서 감압농축하였고, 이 농축액을 각각 Amicon Ultra 100K filter device로 분리여과하여 분자량 100K 이상의 입자를 포함하는 여과액(실시예 3)을 제조하였다.

실시예 1에서 제조된 유산균 배양액 원액에서 미백 활성 물질을 얻기 위해 60℃에서 감압농축하였고, 이 농축액을 각각 Amicon Ultra 30K filter device로 분리여과하여 분자량 30K 내지 100K의 입자를 포함하는 여과액(실시예 4)을 제조하였다.

실시예 1에서 제조된 유산균 배양액 원액에서 미백 활성 물질을 얻기 위해 60℃에서 감압농축하였고, 이 농축액을 각각 Amicon Ultra 10K filter device로 분리여과하여 분자량 10K 내지 30K의 입자를 포함하는 여과액(실시예 5)을 제조하였다.

실시예 1에서 제조된 유산균 배양액 원액에서 미백 활성 물질을 얻기 위해 60℃에서 감압농축하였고, 이 농축액을 각각 Amicon Ultra 10K filter device로 분리여과하여 분자량 10K 이하의 입자를 포함하는 여과액(실시예 6)을 제조하였다. 또한 상기 여과액을 HPLC 분석(한국고분자시험연구소)으로 성분 확인하였다.

[비교예]

균주를 접종하지 않는 MRS 액체배지를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하여 비접종 배양액 원액(비교예 1)을 제조하였다.

비교예 1에서 제조된 비접종 배양액 원액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 농축방법과 동일한 방법으로 농축하여 농축액(비교예 2)을 제조하였다.

비교예 2에서 제조된 배양 농축액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 농축방법과 동일한 방법으로 여과하여 분자량 10K 이하의 입자를 포함하는 여과액(비교예 3)을 제조하였다.

락토바실러스 카제이(Lactobacillus Casei)균주를 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 대신 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하여 비접종 배양액 원액(비교예 4)을 제조하였다.

비교예 4에서 제조된 배양액 원액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 농축방법과 동일한 방법으로 농축하여 농축액(비교예 5)을 제조하였다.

4. 실험방법

(1) 세포 배양

실험에 사용된 멜라노마 세포는 B16F10 melanoma를 한국세포주은행에서 구입하였고, Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM, ATCC, USA)에 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum, Lonza, USA)과 페니실린/스트렙토마이신(100IU/50㎍/㎖, Lonza, USA)을 첨가하여 37℃로 유지되는 5% CO₂ 배양기에서 이를 배양하였다. 상기 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 내의 멜라닌과 타이로시나아제의 생성 억제 실험을 수행하였다.

(2) 타이로시나아제 활성 측정

타이로시나아제는 인체 내의 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소로서, 많은 미백 성분들이 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다. 본 실험에서는 시험관 내(in vitro)에서 타이로시나아제 효소의 활성을 저해하는 정도로 미백 활성을 평가하였으며, 타이로시나아제 효소 활성은 Tomita(비특허문헌 2) 등을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.

반응액은 0.1M 인산완충액(phosphate buffer, pH 6.5) 1.1㎖, 버섯 타이로시나아제(mushroom tyrosinase, 250u/㎖) 0.1㎖, 1.5mM L-타이로신(tyrosine) 0.2㎖, 유산균(Miev L1207)배양액 0.3㎖로 구성하였고, 이를 시험관에 첨가하여 37℃ water bath에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 얼음상에서 효소 반응을 정지시킨 후, UV-Vis spectrophotometer(Thermo Genesys 10UV, USA)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 유산균(Miev L1207)배양액은 각 실시예별로 구성하였다.

양성대조군으로 유산균(Miev L1207)배양액 대신 증류수에 희석한 알부틴(Arbutin, 1㎎/㎖ 또는 5㎎/㎖)를 처리하여 사용하였고, 대조군으로는 유산균(Miev L1207)배양액 대신 MRS 배지를 사용한 비교예(비교예 1, 비교예 2)를 처리하여 사용하였고, 타이로시나아제 대신 0.1M 인산완충액(pH 6.5) 0.1㎖를 가하여 Blank로 사용하였다.

(3) 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis)를 이용한 멜라닌 합성 측정

멜라닌 생성 억제효능은 멜라닌 생산 균주인 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) KCTC 9171 균주를 배양하여 생성된 포자를 이용하였다. 상기 균주가 생성한 포자를 아가 배지 위에 도말한 후 유산균(Miev L1207)배양액을 점적한 다음, 종이디스크(paper disk) 주위의 억제영역(inhibition zone)의 크기를 육안으로 관찰하여 멜라닌 생성 정도를 측정하는 Tomita(비특허문헌 2) 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.

멜라닌 생산 균주인 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) KCTC 9172는 한국생명공학연구원(Korean Collection for Type Cultures)로부터 입수하였다. V-8 juice(Campbell soup company) 200㎖, 포도당 2g, 효모추출물 2g, CaCO₃ 1g, 아가 20g, 증류수 800㎖ 에 용해시킨 후 멸균하여 Papavizas' VDYA agar를 제조하였다.

상기 마련된 Papavizas' VDYA agar 배지에 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) KCTC9172를 계대배양하여 28℃에서 2주간 배양하였다. 회색의 포자가 형성되면 멸균수 10㎖에 적당한 농도로 포자를 현탁시키고, 상기 현탁액을 박토효모추출물(bacto-yeast extract, Difco)을 0.2% 함유하는 ISP NO. 7 배지(글리세롤(Glycerol) 15g, L-타이로신(Tyrosine) 0.5g, 아스파라긴(Asparagine) 1g, 제일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.5g, 마그네슘황산염(MgSO₄H₂O) 0.5g, 염화나트륨(NaCl) 0.5g, Iron(Ⅱ)FeSO₄H₂O 0.01g, 박토효모추출물 2g, 아가(Agar) 15g, 증류수 1000㎖에 용해시킨 후 멸균하여 제조하였다)로 제조한 아가 접시에 도말하여 흡수시켰다. 배지 표면이 완전히 마른 후 유산균(Miev L1207)배양액 30㎕를 중앙에 올린 8mm paper disc에 분주하였다. 상기 분주한 접시를 배양기에 넣고 28℃에서 48시간 동안 배양한 후 억제영역의 크기를 측정하였다. 유산균(Miev L1207)배양액은 각 실시예별로 처리하였다.

양성대조군으로 유산균(Miev L1207)배양액 대신 증류수에 희석한 알부틴(Arbutin, 0.1㎎/㎖)를 처리하여 사용하였고, 대조군으로는 유산균(Miev L1207)배양액 대신 MRS 배지를 사용한 비교예(비교예 1, 비교예 2)를 처리하여 사용하였다.

(4) 멜라노마 세포에서의 세포 생존율 측정

유산균 배양액의 세포 독성을 확인하기 위해 멜라노마 세포에서의 세포 생존율을 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 분석법 중 Mosmann(비특허문헌 3 참조)의 방법을 변형하여 측정하였다.

96웰접시(96 well plate)에 각각 Murine B16F10 melanoma cell를 1×10⁴cells/well 농도로 분주하고, 세포가 바닥에 부착할 수 있도록 24시간 동안 배양하였다. 유산균(Miev L1207)배양액(실시예 1)을 0.5%, 1%, 5%, 10% 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양한 배지를 제거하고, 각 웰(well)당 MTT용액(0.33 mg/㎖) 100㎕를 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 후 형성된 불용성 포르마잔(formazan)을 0.04N 염산/이소프로판올(HCl/Isoprophanol) 혼합액에 녹이고, ELISA reader를 통해 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 배양액 대신 증류수를 첨가한 군(Blank)의 흡광도를 비교하여 생존율(%)을 나타냈다.

유산균(Miev L1207)배양액의 농축액(실시예 2)에 대해서도 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1% 농도로 처리하여 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

대조군으로는 상기 유산균(Miev L1207)배양액 대신 MRS 배지를 사용한 비교예(비교예 1, 비교예 2)를 처리하여 사용하였다. 즉, 배양원액에 대해서는 MRS 배양원액, 농축액에 대해서는 MRS 농축액을 대조군으로 사용하였다.

(5) 멜라노마 세포에서의 멜라닌 생합성 측정

피부 조직 내 멜라닌은 멜라노사이트에서 생성되어 세포 내부와 세포 밖으로 분비되고 이는 피부 내의 색소 침착 등을 유도한다. 따라서 유산균(Miev L1207) 배양액이 멜라노사이트에서의 멜라닌 합성을 억제하는지 평가하였으며, 멜라노마 세포에서의 멜라닌 생합성 정량은 Hosoi(비특허문헌 4) 등의 방법을 변형하여 사용하였다.

6웰접시(6 well plate)에 Murine B16F10 melanoma cell을 2×10⁵ cells/well로 분주하고, 세포가 바닥에 부착될 수 있도록 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고, 1μM α-멜라닌자극호르몬(melanin stimulation hormone, MSH)가 처리된 배지에 유산균(Miev L1207)배양액을 1% 농도(10㎕/㎖)로 처리하였다. 상기 처리한 배지를 온도 37℃, 5% CO₂ 농도에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 배지를 제거하고 세포를 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척한 후 세포를 수거하여 펠렛(pellet)을 얻었다.

펠렛을 10% 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, in 1M 수산화 나트륨(NaOH))에 녹여 60℃ 항온수조에서 1시간 동안 배양하여 세포내 멜라닌을 합성시켰다. 상기 샘플을 ELISA 판독기(Tecan infinite 200pro, Australia)를 이용해 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1μM α-MSH 무첨가군의 흡광도를 비교하여 저해율(%)을 나타냈다.

유산균(Miev L1207)배양액은 각 실시예별로 구성하였다. 양성대조군으로 유산균(Miev L1207)배양액 대신 증류수에 희석한 알부틴(Arbutin, 0.1㎎/㎖)를 처리하여 사용하였고, 대조군으로는 유산균(Miev L1207)배양액 대신 MRS 배지를 사용한 비교예(비교예 1, 비교예 2)를 처리하여 사용하였다.

또한, 본 발명에 따른 유산균 배양액(Miev L1207)의 미백 효능을 대비하기 위하여, 실시예 1에서 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 균주 대신 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei)를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 배양(MRS broth, 37℃, 24시간)한 락토바실러스 카세이 배양액을 제조하여 대비 실험하였다.

또한, 후술한 실험 결과에 따라 본 발명에 따른 유산균 배양액(실시예 6)을 숙신산과 대비실험하였다. 이 경우 숙신산은 실시예 6에 대한 HPLC 실험 결과에 따라 알려진 숙신산의 농도와 동일한 농도로 처리하였다.

(6) 박층크로마토그래피 ( TLC )에 의한 유기산 성분 분석

본 발명에 따른 유산균(Miev L1207)배양액 내 미백 활성 성분을 규명하기 위하여, 박층크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC)를 수행하였다. 박층크로마토그래피 분석은 실리카겔(silica gel)이 도포되어 있는 알루미늄 판에 분석하고자 하는 샘플을 점적한 후, 상기 판에 용매가 위로 흡수되며 이동할 때 샘플에 함유된 성분들이 특성에 따라 각각 다른 속도로 이동하면서 분리되도록 하는 실험이다.

박층크로마토그래피 분석에는 TLC silica gel(60F, Merck)을 사용하였다. Plate의 끝에서 15mm 되는 위치에 유산균(Miev L1207)배양액 1㎕를 점적하였다. 점적 직경은 되도록 최소가 되게 하며, 각 시료 용액 간의 간격은 10mm이상을 유지하였다. TLC plate를 용매증기로 포화된 밀폐된 용기 속의 용매를 이용하여 전개시켰다. 전개가 끝난 TLC plate는 건조시킨 후, 준비된 발색 시약으로 발색시켜 120℃ 오븐에서 15분간 건조시켰다. 니트로에탄:니트로메탄:에탄올:물:1-프로판올(Nitroethane:Nitromethane:ethanol:water:1-propanol)을 1:2:3:4:5(V/V)로 혼합한 분리 용매로 실리카겔을 전개하였고, 발색시약은 브로모크레솔퍼플(Bromocresol purple, 40㎎ in 100㎖ 에탄올)를 사용하였다.

유산균(Miev L1207)배양액은 각 실시예별로 구성하였으며, 대조군으로는 MRS 배지를 사용한 비교예(비교예 1, 비교예 2)를 처리하여 사용하였다.

(7) 고성능액체크로마토그래피 ( HPLC ) 이용한 유기산 분석

본 발명에 따른 유산균(Miev L1207) 배양액 내 미백 활성 성분을 확인하기 위하여, 유산균(Miev L1207)배양액을 Amicon Ultra 10K filter device로 분리여과한 실시예 6을 Waters 717 Automatic Sample Injection System, Waters 996 PDA Detector, Waters 515 pump를 이용하여 분석하였다.

이동상은 5mM 황산을 용매로 사용하였으며, 칼럼은 PL Hi-plex H (4.6 x 300 ㎜)을 사용하여 분석하였다. 유기산 7종, 아세트산(Acetic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 숙신산(Succinic acid), 락트산(Lactic acid), 포름산(Formic acid), 옥살산(Oxalic acid)을 표준물질(Standard)로 사용하였다.

5. 실험 결과

(1) 미생물 분리 동정

유산균 분리 동정 결과, 서열목록 1 서열에 기재된 것과 같은 16S RNA의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다.

이를 기초로 계통수 연구한 결과, 분리된 균주는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) JCM 1558과 100%의 염기서열 유사도를 나타내어 락토바실러스 펜토서스 종에 속하는 락토바실러스 펜토서스 L1207 균주로 동정할 수 있었다(도 1 참조).

상기 분리된 균주를 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) Miev L1207로 명명하여 한국생명공학연구원에 2012년 3월 5일, 기탁번호 KCTC12511BP로 기탁하였다.

(2) 타이로시나아제 활성 저해효과

본 발명에 따른 유산균 배양액이 시험관 내에서 타이로시나아제 효소의 활성을 저해하는 정도로 미백 활성을 측정한 결과를 도 2 및 도 3에 나타냈다.

도 2에 도시된 바와 같이 배양원액(실시예 1, 비교예 1) 및 농축액(실시예2, 비교예2)의 미백 활성을 측정한 결과, 실시예 2의 농축액이 타이로시나아제 활성 억제 정도가 111.382%로서 가장 우수한 것으로 나타났다.

도 3에 도시된 바와 같이 실시예 3 내지 실시예 6의 여과액별로 미백 활성을 측정한 결과, 실시예 3 및 실시예 6에서 타이로시나아제 활성 억제 정도가 각각 101.76%, 100.41%로서 우수한 것으로 나타났다.

이를 통해 유산균(Miev L1207)배양액 내에서 미백 활성을 나타내는 물질은 실시예 6에 포함되어 있는 분자량 10kDa 이하의 물질임을 확인할 수 있었다.

(3) 멜라닌 합성 억제 효과

본 발명에 따른 유산균 배양액이 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis KCTC 9171 균주)에서의 멜라닌 합성에 미친 영향을 평가한 결과를 도 4에 도시하였다.

실험 결과, 실시예 1을 점적한 종이 디스크 주변에는 스트렙토마이세스 비키니엔시스가 자라지 못하는 억제영역(inhibition zone)이 직경 2.8cm로, 실시예 2를 점적한 종이 디스크 주변에는 억제영역이 직경 5.6cm로 명확하게 나타났다. 반면, 비교예 1을 점적한 종이 디스크(paper disc) 주변에는 스트렙토마이세스 비키니엔시스 균주가 두텁게 자랐으며, 직경 1cm 주변이 밝게 나타났다. 비교예 2를 처리한 플레이트는 종이 디스크 주변이 비교예 1보다 더욱 두껍게 균이 자랐으며, 지름이 약 5cm 정도의 흰색 포자의 환이 형성되었고, 디스크의 주변으로 2.5cm 직경의 진한 회색 포자의 환이 형성되었으나, 이는 멜라닌 형성을 저해하는 억제영역으로 보기는 어렵다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 유산균 배양액(실시예)의 멜라닌 합성 억제 능력이 우수한 것을 알 수 있었다.

(4) 세포 안정성 효과

본 발명에 따른 유산균 배양액이 세포 안전성에 미친 영향을 평가한 결과는 도 5a 및 도 5b에 도시하였다.

실험 결과, 실시예 1 및 실시예 2 모두 각각의 시료를 처리한 모든 농도 범위에서 90% 이상의 생존율을 나타내어, 본 발명에 따른 유산균 배양액 모두 세포 생장에 안전한 것을 확인할 수 있었다.

(5) 세포내 ( in vivo ) 멜라닌 생성 억제 활성 확인

본 발명에 따른 유산균 배양액이 멜라노마 세포에서의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 평가한 결과를 도 6 내지 도 8에 도시하였다.

도 6에 도시된 바와 같이 배양원액(실시예 1, 비교예 1) 및 농축액(실시예2, 비교예2)의 멜라닌 합성 억제 정도를 측정한 결과, 실시예 1은 멜라닌 생성을 52.33% 억제하고, 실시예 2는 멜라닌 생성을 127.69% 억제하여 우수한 미백 효과를 보였다. 비교군으로 사용한 비교예 1은 멜라닌 생성을 36.66% 억제하였고, 비교예 2는 멜라닌 생성이 전혀 억제되지 않았고(0%),양성대조군인 알부틴(Arbutin)은 멜라닌 생성을 46.19% 억제한 것으로 나타났다. 이에 따라 본 발명에 따른 유산균 배양액의 미백 효과가 현저히 우수한 것을 알 수 있다.

다른 유산균인 락토바실러스 카세이 배양액과 대비한 실험결과(도 7)에서는, 실시예 1(배양액)은 멜라닌 생성을 60.7% 억제하고, 실시예 2(농축액)는 멜라닌 생성을 117.1% 억제한 반면 락토바실러스 카세이 배양액(L.Casei 배양액)은 멜라닌 생성을 37.8% 억제하였고, 락토바실러스 카세이 배양 농축액(L.Casei 농축액)은 멜라닌 생성을 79.4% 억제하였고, 양성대조군인 알부틴(Arbutin)은 멜라닌 생성을 39.3% 억제한 것으로 나타났다. 이에 따라 본 발명에 따른 유산균 배양액의 미백 효과가 다른 유산균에 비해서도 현저히 우수한 것을 알 수 있다.

숙신산과 대비한 실험결과(도 8)에서는, 실시예 6이 멜라닌 생성을 217.3% 억제하여 멜라닌 생성 억제 정도가 가장 우수한 것으로 나타났다. 비교군으로 사용한 숙신산을 처리한 경우(실시예 6에 포함된 숙신산의 농도와 동일한 농도) 멜라닌 생성을 79.22% 억제하였고, MRS 배지를 실시예 6과 동일하게 여과처리한 비교예 3을 처리한 경우에는 103.54% 억제하였고, 양성대조군인 알부틴(Arbutin)을 처리한 경우에는 55.06% 억제한 것으로 나타나, 본 발명에 따른 유산균 배양액의 미백 효과가 현저히 우수한 것을 알 수 있다.

이러한 결과들은 본 발명에 따른 유산균 배양액이 세포의 멜라닌 생성을 유도하는 멜라닌 자극호르몬의 작용을 방해하였으며, 세포 자체의 멜라닌 생성도 저해하여 나타난 것으로 판단된다.

(6) TLC 분석 결과

본 발명에 따른 유산균 배양액에서 미백 활성 물질을 규명하기 위한 박층크로마토그래피 실험 결과를 도 9에 도시하였다.

실험 결과, 비교군인 MRS 배지(비교예 1, 비교예 2)와 달리 실시예(실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6)에서는 유기산에 해당하는 부위에서 노란색 스팟이 공통적으로 확인되었다. 특히 10kda 이하의 분자량을 가진 실시예 6에서 가장 진한 노란색 스팟이 확인되었다(도면상의 spot 생성 확인 영역 참조).

(7) HPLC 분석 결과

본 발명에 따른 유산균 배양액에서 미백 활성 물질을 규명하기 위한 HPLC 실험 결과를 도 10 및 표 1에 도시하였다.

도 10a는 표준물질인 7가지 유기산에 대한 HPLC 실험결과를 나타내고, 도 10b는 대조군인 MRS 배지 분획에 대한 HPLC 실험결과를 나타내고, 도 10c는 락토바실러스 펜토서스 Miev L1207 배양액(실시예 6) 분획물에 대한 HPLC 실험결과를 나타낸다.

대조군인 MRS 배지에서는 여러 개의 피크를 확인할 수 있는 반면, 실시예 6에서는 보존시간(retention time) 12.9 분에서 단일 피크를 확인할 수 있었으며(도 10c 참조), 이를 여러 유기산의 HPLC 실험 결과와의 대비를 통하여 상기 물질이 숙신산(Succinic acid) 임을 확인하였다(도 10a 대비).

구체적으로 각 유기산의 함량을 HPLC로 정량한 결과를 살펴보면(표 1 참조), 실시예 6에는 숙신산이 10,050.28 mg/L(약 1%) 함유되었다(검출한계 1㎎/ℓ).

구분	단위	대조군 (MRS 배지)	실시예 6
옥살산(Oxalic acid)	㎎/ℓ	불검출	불검출
시트르산(Citric acid)	㎎/ℓ	불검출	불검출
말릭산(Malic acid)	㎎/ℓ	불검출	불검출
숙신산(Succic acid)	㎎/ℓ	불검출	불검출
락트산(Lactic acid)	㎎/ℓ	1,810.93	10,050.28
포름산(formic acid)	㎎/ℓ	불검출	불검출
아세트산(acetic acid)	㎎/ℓ	불검출	불검출

[ 제형예 ]

1. 수렴 화장수

통상의 방법에 따라 하기 표 2의 조성으로 수렴 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
유산균 배양액	0.10
글리세린	2.00
1,3 부틸렌글리콜	3.00
EDTA	0.05
에탄올	7.00
캐스터오일	0.40
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합	100.00

2. 유연 화장수

통상의 방법에 따라 하기 표 3의 조성으로 유연 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
유산균 배양액	0.10
1,3 부틸렌글리콜	3.00
EDTA	0.05
피이지 1500	4.00
카보머	0.16
캐스터오일	0.45
트리에탄올아민	0.12
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100.00

3. 로션

통상의 방법에 따라 하기 표 4의 조성으로 로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
유산균 배양액	0.20
글리세린	8.00
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	8.00
베타글루칸	7.00
히아루론산 추출물	5.00
스쿠알란	5.00
1,3 부틸렌글리콜	4.00
세테아릴 글루코사이드	1.50
세테아릴 알코올	1.00
소르비탄 스테아레이트	0.40
카보머	0.10
트리에탄올아민	0.10
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100.00

4. 영양크림

통상의 방법에 따라 하기 표 5의 조성으로 영양크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
유산균 배양액	0.50
유동파라핀	7.00
베타글루칸	7.00
스쿠알란	5.00
부틸렌글리콜	3.00
글리세린	3.00
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	3.00
세테아릴 글루코사이드	1.50
폴리솔베이트 60	1.20
소르비탄 스테아레이트	0.40
카보머	0.10
트리에탄올아민	0.10
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100.00

5. 에센스

통상의 방법에 따라 하기 표 6의 조성으로 에센스를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
유산균 배양액	0.10
글리세린	5.00
글리세릴폴리메타아크릴레이트/프로필렌 글라이콜	5.00
1,3 부틸렌글리콜	4.00
디메치콘	3.00
에탄올	3.00
폴리아크릴아마이드/C13-14 이소파라핀/라우레쓰-7	1.50
글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	0.50
호호바 오일	0.50
마카데미아 넛 오일	0.50
토코페릴아세테이트	0.50
소르비탄스테아레이트	0.30
부틸레이티드하이드록시 톨루엔	0.05
EDTA	0.05
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100.00

6. 팩

통상의 방법에 따라 하기 표 7의 조성으로 팩을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
유산균 배양액	0.10
폴리비닐알콜	15.00
베타글루칸	7.00
에탄올 방부제	6.00
히아루론산 추출물	5.00
글리세린	4.00
폴리솔베이트 60	1.20
노닐 페닐에테르	0.40
알란토인	0.10
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100.00

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC12155BP 20120305

<110> Miev Co.Ltd <120> Lactobacillus pentosus strain, skin whitening composition having culture fluid thereof and preparation method of the same <130> DP120324 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1403 <212> DNA <213> Lactobacillus pentosus Miev L1207 <400> 1 gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg 60 tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa 120 taccgcataa caacttggac cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt 180 ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat 240 acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 300 acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc 360 gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga 420 gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480 gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca 540 ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac 600 tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag 660 atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct 720 cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa 780 tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc 840 ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 900 tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat 960 gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt gcatggttgt 1020 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc 1080 agttgccagc attaagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140 ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1200 tggtacaacg agttgcgaac tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc 1260 ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1320 tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg 1380 taacacccaa agtcggtggg gta 1403 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1. 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus Pentosus) Miev L1207 균주(기탁번호 KCTC 12155BP).
   
2. 제1항에 따른 락토바실러스 펜토서스 균주를 배양한 균주 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 피부 미백용 조성물은 상기 균주 배양액이 피부 미백용 조성물 총중량 대비 0.001 내지 50 중량% 포함된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 균주 배양액은 10kDa 이하의 분자량을 갖는 입자만을 함유하도록 여과한 것임을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
   
5. 제1항에 따른 락토바실러스 펜토서스 균주를 배양한 균주 배양액으로부터 분리된 10kDa 이하의 분자량을 갖는 미백 활성 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 미백 활성 물질은 숙신산인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
   
7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 피부 미백용 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
   
8. 제1항에 따른 락토바실러스 펜토서스 균주를 배양하는 단계를 포함하는 피부 미백용 조성물의 제조방법.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 균주를 배양하는 단계에서 수득한 배양액을 여과과정, 농축과정, 추출과정 및 건조과정 중 어느 하나 이상의 과정으로 처리하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물의 제조방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 여과과정 또는 추출과정은 상기 배양액에서 10kDa 이하의 분자량을 갖는 미백 활성 물질을 분리하는 과정인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법.

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