일반적으로 식품은 그 구성성분이 복잡 다양하고 유통기간 및 저장조건에 따라 세균, 효모 및 곰팡이 등의 미생물에 의해서 쉽게 부패 또는 오염될 수 있는 가능성이 많아, 식품을 보존하는데 많은 제약이 따르고 있다. 현재까지 식품의 보존성을 증진시키기 위한 천연 보존료 개발에 여러가지 문제점들이 따르기 때문에 소르빈산 칼륨, 안식향산 나트륨, 프로피온산 칼륨 등의 화학적 합성 보존료를 많이 사용하고 있는 실정이다. 그러나 이들 화학적 합성 보존료는 인체에 해로운 독성물질이 함유될 수 있기 때문에 그 허용량이 엄격이 규제될 뿐 만 아니라, 사용대상 식품도 제한되는 등의 많은 제약이 따른다. 또한 화학적 합성 보존료를 장기간 사용할 경우 체내에 지속적으로 축적되며, 급만성 독성, 발암성 및 돌연변이 유발성 등의 새로운 위험이 대두되고 있는 실정이다. 이러한 문제점과 더불어 현재 일반적인 소비자들의 추세가 점점 고급화, 천연지향적, 건강 지향적으로 바뀜에 따라 제품의 안전성과 경제성이 우수한 천연 유래의 식품용 항균제에 대한 연구가 지속되고 있는 실정이다.
상기와 같은 요구와 필요성으로 인하여, 식품 및 식기용 항균제를 제조함에 있어, 미생물 유래의 폴리리신을 함유시키는 방법이 개발되었으며, 공지된 기술로는 다음과 같은 것이 있다.
폴리리신을 적용한 공지된 기술로 일본의 칫소사가 미생물을 이용하여 폴리리신을 제조하였으며(일본특허공개 소59-20359호), 폴리리신, 유기산, 저급지방산 모노 글리세라이드, 비타민B, 초산소다 등을 병용할 경우 항균 상승효과가 있음이 게시되어 있으며(일본특허공개 소62-58975호), 또한 폴리리신, 중쇄지방산 모노글리세라이드 및 리소자임을 병용한 식품용 항균제가 공지되었다(일본특허공개 평6-225740호). 그러나 상기한 기술들은 그 효과가 미약하여 식품을 보다 효과적으로 보존하기 위해서는 첨가되는 항균제의 함량을 과다하게 증가시켜야 하는 단점이 있으며, 특히 인산염이 많이 함유된 육가공 식품 등에 사용할 경우에는 폴리리신의 양이온과 인산의 음이온이 반응을 일으켜 항균력이 저하되는 문제가 있어 사용이 제한된다는 지적이 있다. 또한 효소인 리소자임을 혼합한 경우에는 리소자임이 열에 약하기 때문에 식품용으로 사용하는데 다소 부적합한 문제점을 가지고 있다.
유산균(lactic acid bacteria)은 글루코오스 등 당류를 이용하여 젖산을 생 성하는 미생물로, 생성된 젖산은 중성 및 알칼리성에서 잘 생육하는 부패성 미생물의 생육을 저지한다. 따라서 식품의 보존수단으로 널리 이용해 왔으며, 특히 우유, 유제품 및 각종 젓갈류의 가공에 이용되어 왔다. 우리나라에서는 김치 등에, 서양에서는 유가공 발효에 많이 이용되고 있다. 유산균은 보통 젖산균이라고도 칭하며 최종 대사산물로 젖산을 상당량 생산하는 세균을 일컫는다. 최근에는 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되어 일반식품뿐만 아니라 건강식품 및 약품으로서 이용되는 등 그 응용범위가 넓어지고 있으며 여기에 속하는 세균들로는 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 페디오코커스 속 (Pediococcus sp.), 류코노스톡 속 (Leuconostoc sp.), 락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.), 스포로락토바실러스 속 (Sporolactobacillus sp.), 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.) 등이 있다. 이러한 균들은 그람양성균으로 혐기성이거나 편 혐기성인 성질을 지니고 있으며, 동물의 장내에 서식하면서 동물이 섭취한 영양분 및 섬유소 등을 분해시켜 에너지원으로 사용하고, 젖산 및 항생물질을 생산하여 장내 유해세균의 발육을 억제함으로써 장내 건강유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 유산균의 식품보존에 관여하는 물질에는 일차적으로 당 발효에 따른 유산 및 초산 등의 생성에 의한 것이고, 과산화수소, 디아세틸, 박테리오신등의 항균물질에 의한 것이다. 박테리오신은 세균이 생산하는 단백질 또는 단백질과 탄수화물의 복합체로 구성되어 있는 항균성단백질이며 일반적으로 박테리오신은 고온에서 활성을 유지하며 광범위한 pH에서 안정하고 무독, 무색, 무취이다. 박테리오신은 각종발효식품 중 흔히 존재하고 일상 식생활을 통해 섭취하고 있는 유산균 에 의해 생산이 되며, 인체에 섭취되면 단백질 가수분해효소에 의해 분해되므로 기존 항생제와 달리 인체에 무독하고 잔류성이 없다는 이유로 식품 등의 생물학적 보존제(biopreservative) 및 발효식품의 생물제어제(bioregulator)로서 이용이 증대되고 있다. 가장 널리 알려진 박테리오신인 나이신(nisin)은 락토코커스 락티스의 발효산물로 광범위한 항균 범위와 안전성 때문에 오래 전부터 식품방부제로서 상용화되어 왔으며, 1988년 미국에서도 식품의약안전본부(FDA)가 그라스(GRAS, generally recognized as safe) 식품 첨가물로 인정하게 되었다.
우리나라 대표적인 전통식품인 김치의 주요 유산균은 락토바실러스 및 류코노스탁, 페디오코커스, 웨이셀라 속이 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 균주 중 락토바실러스는 여분의 당류를 이용하여 젖산을 많이 생산하므로 김치를 시게 하는 원인균, 즉 김치의 산패균으로 잘 알려져 식품 보존의 여러 장점으로 이용될 가능성이 있어 과학적, 산업적 응용기술의 개발은 중요하다.
본 발명은 락토바실러스 펜토서스 3090 (KCCM 10950P)을 배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 수득한 배양상등액 및 폴리리신을 함유하는 항균제 조성물을 그 특징으로 한다.
락토바실러스 펜토서스 3090 은 갓김치에서 분리한 유산균이다.
상기 유산균을 생화학적 동정방법인 API키트 및 분자생물학적 동정 방법인 16S rDNA서열분석(sequencing)을 이용하여 동정한 결과, API 키트 분석에 의해서는 락토바실러스 속 (Lacctobacillus sp.)임을 확인하였으며, 특히 신뢰도 96.2%로 락토바실러스 펜토서스 (Lactobacillus pentosus)에 가까운 균으로 확인되었다. 16S rDNA 염기서열 분석에서도 락토바실러스 펜토서스 (Lactobacillus pentosus)와 99%이상 동질성을 나타내었다. 본 발명의 미생물은 분류학상 락토바실러스 플랜타륨과 락토바실러스 펜토서스 중간에 위치하지만 보다 바람직하게는 락토바실러스 펜토서스와 동질성이 크기 때문에, 본 발명에서 상기 미생물을 락토바실러스 펜토서스 3090으로 명명하고 한국미생물보존센터에 2008년 5월 16일자로 기탁하였다. (수탁번호 : KCCM 10950P).
본 발명에서 분리· 동정된 락토바실러스 펜토서스 3090 은 그람 양성 간균으로서 45℃ 이하, pH 3.0 ~ 8.5의 조건에서 배양될 수 있고, 헤테로 발효(heterofermentative) 를 한다.
본 발명의 주요성분인 락토바실러스 펜토서스 3090 배양상등액은 MRS 액체배지에서 배양 후 원심분리하여 상등액을 제균한 뒤, 이를 감압농축한 것을 사용한 다.
또한 본 발명의 주요성분인 폴리리신은 필수아미노산인 L-라이신으로 연결된 직쇄상의 염기성 폴리펩타이드로서, 방선균의 일종인 스트랩토마이세스 알불루스(Streptomyces albulus)를 호기 배양함으로써 얻을 수 있다(shoji, 1981). 상기 폴리리신은 분자 중에 에틸렌기를 중심으로 하는 소수성 영역과 아미노기와 카르복실기를 중심으로 하는 친수성 영역을 가지고 있기 때문에, 수용액 중에서 아미노기가 양전하를 띠게 되고 양이온계의 계면활성제로 작용한다. 그리고 폴리리신의 항균 작용 기작은 이러한 양이온계의 계면활성에 의하여 폴리리신의 아미노산기가 미생물의 세포벽에 흡착되어 증식을 저해한다고 알려져 있다.
폴리리신과 락토바실러스 펜토서스 배양상등액의 고형분의 중량비는 1 : 80 ~ 1 : 400, 바람직하게는 1 : 200 ~ 1 : 300 범위에 있도록 첨가한다. 1 : 80 미만인 경우 유의적인 항균효과를 갖기 위해 필요한 폴리리신의 양이 과량이어서 경제적이지 못하며, 1 : 400 을 초과하는 경우 락토바실러스 펜토서스 배양상등액이 과량으로 첨가되어 침전물이 생성되고, 폴리리신의 양이 적어 향균효과가 미미하므로 바람직하지 않다.
상기 항균성을 가지는 물질을 혼합하여 사용함에 있어, 이를 구성하는 함량비를 특이성있게 구성하는 것이 본 발명의 특징인바, 폴리리신에 적당한 락토바실러스 펜토서스 3090 배양상등액을 적당한 비율로 혼합하여 기존 항균물질인 폴리리신을 단독으로 사용한 경우보다 혼합시 더 높은 항균력을 나타낼 수 있도록 하였으며, 조합된 각 구성성분들의 고유한 항균 기작이 복합적으로 발현되면서 폴리리신 단독으로 사용할 수 없는 햄, 소시지 등 인산염이 많이 함유된 식품에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 식품의 적용 범위를 넓혀 식품용 항균제와 식기용 항균제 조성물에도 무리없이 사용할 수 있도록 하였다.
한편, 본 발명에서는 락토바실러스 펜토서스 3090, 폴리리신 이외에 글리세린, 알코올, 젖산 및 정제수를 항균제 조성물의 성분으로 포함한다.
알코올은 항균효과 및 항균제 조성물의 수분 함량 조절 등을 위해 사용되는데, 상기 알코올을 전체 항균제 조성물에 5 ~ 50 중량% 사용한다. 이때, 알코올의 첨가량이 5 중량% 미만이면 수분이 과다하여 바람직하지 않고, 반면에 50 중량%를 초과하면 침전 등의 물성변화를 일으켜 바람직하지 않다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예
1 : 균주의 동정
갓김치에서 분리한 3090 선발균주에 대하여 API 50CHL 키트(API bioMerieux, France)를 이용해 49종의 당발효 시험을 실시하였다. 구체적으로 3090 균주의 배양액을 식염수 희석액에 현탁한 후 API 키트에 접종하여 36 ~ 60시간 동안 키트내에 있는 기질의 발효능을 검사하고, 이로부터 얻은 결과를 하기 표 1에 나타내었다. API-PLUS 동정 프로그램에 입력한 결과 신뢰도 96.2%로 3090 균주는 락토바실러스 펜토서스와 상동성을 나타내었다.
당
|
대사능
|
대조구 |
비발효 |
글리세롤( Glycerol ) |
발효 |
에리스리톨( Erythritol ) |
비발효 |
디-아라비노스( D-Arabinose ) |
비발효 |
엘-아라비노스( L-Arabinose ) |
발효 |
리보스( Ribose ) |
발효 |
디-자일로스( D-Xylose ) |
비발효 |
엘-자일로스( L-Xylose ) |
비발효 |
아도니톨( Adonitol ) |
비발효 |
베타-메틸 자일로사이드( β- Methyl-xyloside ) |
비발효 |
갈락토스( Galactose ) |
발효 |
디-글루코스( D-Glucose ) |
발효 |
디-프록토스( D-Fructose ) |
발효 |
디-만노스( D-Mannose ) |
발효 |
엘-솔보스( L-Sorbose ) |
비발효 |
람노스( Rhamnose ) |
발효 |
둘시톨( Dulcitol ) |
비발효 |
이노시톨( Inositol ) |
비발효 |
만니톨( Mannitol ) |
발효 |
솔비톨( Sorbitol ) |
발효 |
알파-메틸 디 만노사이드( α-Methyl-D-mannoside ) |
비발효 |
알파-메틸 디 글루코사이드( α-Methyl-D-glucoside ) |
비발효 |
엔-아세틸 글루코사민( N-Acetyl glucosamine ) |
발효 |
아미그달린( Amygdaline) |
발효 |
알부틴( Arbutine ) |
발효 |
에스큘린( Esculin ) |
발효 |
살리신( Salicine ) |
발효 |
셀비오스( Cellobiose ) |
발효 |
말토스( Maltose ) |
발효 |
락토스( Lactose ) |
발효 |
멜리비오스( Melibiose ) |
비발효 |
사카로스( Saccharose ) |
발효 |
트레할로스( Trehalose ) |
발효 |
이눌린( Inulin) |
비발효 |
멜레치토스( Melezitose ) |
비발효 |
디-라피노스( D-Raffinose ) |
비발효 |
아미돈( Amidon ) |
비발효 |
글리코겐( Glycogen ) |
비발효 |
자일리톨( Xylitol ) |
비발효 |
베타-젠티오비오스( β-Gentiobiose ) |
발효 |
디-튜라노스( D-Turanose ) |
발효 |
디-라이조스( D-Lyxose ) |
비발효 |
디-타가토스( D-Tagatose ) |
비발효 |
디-퓨코스( D-Fucose ) |
비발효 |
엘-퓨코스( D-Fucose ) |
비발효 |
디-아라비톨( D-Arabitol ) |
비발효 |
엘-아라비톨( L-Arabitol ) |
비발효 |
글루코네이트( Gluconate ) |
발효 |
2-케토글루코네이트( 2-keto-gluconate ) |
비발효 |
5 케토글루코네이트( 5-keto-gluconate ) |
비발효 |
유산균의 16S rDNA를 분리하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction)에 따라 염기서열을 분석하고 데이터베이스에 입력하여 최종적으로 동정하였다. 그 결과 16S rDNA 염기서열에 의해서도 3090이 락토바실러스 펜토서스와 99%의 상동성을 나타내는 서열번호:1로 기재되는 염기서열로 이루어져 있음이 확인되었다. 따라서 락토바실러스 펜토서스로 동정하였고, 락토바실러스 펜토서스 3090으로 명하여 이를 한국미생물보전센터에 2008년 5월 16일자로 기탁하였다. (수탁번호 : KCCM 10950P)
제조예
1 :
배양상등액의
제조
락토바실러스 펜토서스 3090을 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48시간 배양하였다. 상기 배양액을 6000 x g로 5분간 원심분리하여 상등액을 취하고, 이 상등액을 pore 크기가 0.45인 여과막으로 여과하여 제균한 배양상등액을 수득하였다. 이어서 배양상등액을 회전농축기(Rotary evaporator)로 감압농축하여 항균제 조성물에 사용될 배양상등액을 얻었다. 감압농축한 배양상등액은 고형분 46% 를 나타내었다.
실시예
1 및
비교예
1 ~ 4 : 항균제 조성물의 제조
상기 제조예 1에 의해 제조된 락토바실러스 펜토서스 3090 배양상등액과 폴리리신을 혼합하여 항균제 조성물을 제조하였으며 하기 표 2에 각 조성물질과 성분비를 나타내었다. 다만 비교예 4에서는 표준균주인 락토바실러스 펜토서스 (KCCM 40997)를 폴리리신과 혼합하여 항균제 조성물을 제조하였다. 혼합시 각 조성물질을 혼합기에 투입한 후, 실온에서 100rpm으로 45분간 교반 처리하여 항균제 조성물을 제조하였다.
|
사용량(단위:중량%) |
실시예1 |
비교예1 |
비교예2 |
비교예3 |
비교예4 |
락토바실러스 펜토서스3090 배양상등액 1)(고형분 46 %) |
15 |
- |
15 |
- |
- |
락토바실러스 펜토서스(KCCM40997) 배양상등액2 ) (고형분 46 %) |
- |
- |
- |
- |
15 |
폴리리신 |
0.024 |
0.024 |
- |
- |
0.024 |
젖산 |
0.002 |
0.002 |
- |
- |
0.002 |
알코올 |
10.002 |
10.002 |
10.002 |
10.002 |
10.002 |
글리세린 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
정제수 |
71.973 |
86.973 |
71.998 |
86.998 |
71.9 |
1)MRS 액체배지에 락토바실러스 펜토서스 3090 접종, 48시간 후 제균한 배양상등액 2)MRS 액체배지에 락토바실러스 펜토서스 (KCCM40997) 접종, 48시간 후 제균한 배양상등액 |
실험예
2 : 항균 효과 비교 실험
상기 실시예 1 및 비교예 1 ~ 4 에서 제조한 항균제의 항균효과를 알아보았다. 각 항균제의 항균력 측정은 최저 성장억제 농도(MIC)를 측정하였고 그 결과는 각각 다음 표 3에 나타나내었다.
이 때, 최저 성장 억제 농도(MIC)는 멸균된 영양 배지(Nutrient Broth: NB)에 E. coli(KCCM 11591), B.subtili(KCCM 11314)와 S. aureus(KCCM 12103)를 접종하여 37℃에서 8시간 배양한 후 이 균주를 멸균된 NB 배지에 상기 실시예 1 및 비교예 1 ~ 4 에서 제조한 항균제와 같이 첨가한 후 37℃에서 24 시간 배양한 다음 균의 혼탁유무로 측정하였다.
구분 |
최저 성장 억제 농도(%) |
실시예1 |
비교예1 |
비교예2 |
비교예3 |
비교예4 |
E. coli
|
0.5 |
2 |
8 |
40 |
2 |
B. subtilis
|
0.5 |
1 |
4 |
50 |
1.2 |
S. aureus
|
0.5 |
1 |
4 |
50 |
1 |
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 펜토서스 3090 배양상등액, 폴리리신 각각 단독으로 사용할 때도 균 억제 효과가 있지만, 동시에 혼합 사용할 경우 보다 월등히 높은 항균력에 대한 시너지 효과가 나타남을 알 수 있다. 또한 표준균주를 사용한 비교예 4보다도 우수한 항균력을 나타내었다.
실험예
3 : 보관시간에 따른 일반 세균수 측정
가래떡을 구입하여 상기 실시예 1 및 비교예 1 ~ 4 에서 제조된 항균제 조성물에 침지한 후 상온에서 보관하면서 보관시간에 따른 일반 세균수를 측정하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
보관시간 |
일반 세균수(단위 : CFU/ml) |
무처리구 |
실시예1 |
비교예1 |
비교예2 |
비교예3 |
비교예4 |
0 일 |
2.1 × 10 3 |
2.1 × 10 3 |
2.1 × 10 3 |
2.1 × 10 3 |
2.1 × 10 3 |
2.1 × 10 3 |
1 일 |
8.9 × 10 6 |
3.0 × 10 5 |
1.1 × 10 6 |
4.4 × 10 6 |
7.6 × 10 6 |
1.5 × 10 6 |
2 일 |
1.9 × 10 7 |
8.0 × 10 5 |
5.1 × 10 6 |
9.5 × 10 6 |
1.0 × 10 7 |
5.6 × 10 6 |
표 4에 나타난 바와 같이, 가래떡을 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 3090 배양상등액과 폴리리신을 동시에 함유하는 항균제 조성물에 침지한 후 보관하였을 경우, 무처리구나 다른 비교예와 비교하여 현저한 일반 세균의 생육 저해 효과가 나타남을 확인할 수 있었다.