KR101802447B1 - 김치 및 된장 유래 젖산균을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

김치 및 된장 유래 젖산균을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 김치 및 된장 유래 젖산균을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주 또는 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) 균주를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 보호 효과를 가지는 조성물에 관한 것이다.본 발명의 김치 유래 유산균 중 L.sakei와 된장 유래 유산균 중 P.acidilactici는 비강 투여와 경구 투여에서 모두 높은 인플루엔자에 대한 방어 효율을 보였다. 상기 유산균의 사용을 통하여 인플루엔자 감염을 예방할 수 있는 가능성이 있다.

Description

김치 및 된장 유래 젖산균을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 예방 및 치료용 조성물{A COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING INFLUENZA VIRUS COMPRISING LACTIC ACID BACTERIA ORIGINATED FROM KIMCHI AND SOYBEAN PASTE}
본 발명은 김치 및 된장 유래 젖산균을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 사람에서 전염성이 매우 높은 급성 호흡기 질환의 원인체이다. 매년 유행하는 크고 작은 계절성 독감부터 때로는 범세계적 유행으로 많은 사회적 비용을 발생시킨다. 인플루엔자 바이러스는 표면 단백질의 구성에 따라 현재 144가지의 혈청형을 가진다고 알려져 있다. 20세기 이후 대유행한 바이러스주는 1918년 스페인독감 A/H1N1, 1968년 홍콩독감 A/H3N2, 1997년 홍콩조류독감 A/H5N1 등으로 다양한 혈청형이 유행하였으며, 최근에도 홍콩에서 A/H9N2 등의 바이러스가 사람에 감염된 사례가 있다.
현재 인플루엔자 바이러스에 감염될 경우 몇 가지 치료제가 사용되고 있다. 이 치료제들은 바이러스가 생물체 내에서 증식하는 기전 중 일부를 차단하는 방식으로 바이러스 감염을 억제한다. 아만타딘, 오셀타미비르(타미플루, Tamiflu), 자나미비어(리렌자, Relenza) 등이 주로 사용된다. 이 중 아만타딘은 인플루엔자바이러스의 수소이온통로를 차단하여 바이러스의 유전물질이 숙주세포 안으로 노출되는 것을 막아 감염을 억제하는 물질이다. 최근 유행하는 대부분의 A형 인플루엔자는 내성 유전자변이를 가지고 있고, B형과 C형 바이러스에는 효과가 없으며, 오심, 현기증, 불면증 등의 부작용을 유발할 가능성이 있다. 인산오셀타미비르, 자나미비어는 인플루엔자 바이러스 표면 당단백질인 뉴라미니데이즈의 기능을 억제하는 약물로, 현재 임상에서 가장 많이 사용되고 있으나, 바이러스에 감염이 시작된 지 48시간 이내에 투여하여야 치료 효과를 기대할 수 있으며, 아주 치명적인 바이러스 감염시 소화기 장애를 동반하기 때문에 약물 흡수가 어렵고, 최근 이 약물에 저항성을 가지는 바이러스가 속속 발견되는 등의 문제점을 보이고 있다.
인플루엔자 대유행은 그 시기와 유행하는 혈청형을 예측할 수 없지만 반복해서 발생하고 있는 것이 사실이다. 인플루엔자 발생을 막는 가장 좋은 방책으로 생각되는 것은 백신 접종을 통한 면역력의 증진이다. 그러나 매번 유행하는 바이러스의 종류가 다르기 때문에 적절한 시기에 정확한 백신을 공급하는 것이 매우 어렵다. . 또 대유행 상황에서는 백신 공급의 지연 및 부족 등의 문제가 나타날 수 있다. 항바이러스제의 사용은 감염 이후 즉시 사용할 경우 감염의 확산을 막는데 효율적이지만, 선제적 투여로 감염의 예방은 어렵다.
이에 인플루엔자를 효과적으로 예방 또는 치료하고, 일상적으로 안전하게 이용될 수 있는 항인플루엔자 물질의 개발이 필요하다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허공개번호 1020040080078
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 인플루엔자를 효과적으로 예방 또는 치료하고, 안전하게 이용될 수 있는 신규한 항인플루엔자 물질을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주 또는 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) 균주를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 보호 효과를 가지는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주는 기탁번호 KCTC13031BP이고, 상기 페디오코커스(Pediococcus) 균주는 기탁번호 KCTC13032BP인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 두 미생물 균주는 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181 (신정동) 한국생명공학연구원 전북분원 생물자원센터에 2016년 6월1일자로 기탁하였다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 비강 또는 경구 투여용인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 약학, 식품 또는 사료 조성물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주[기탁번호 KCTC13031BP] 및 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) 균주[기탁번호 KCTC13032BP] 또는 그들의 단편을 포함하는 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 사료 조성물의 항바이러스로부터 보호효과는 매우 우수하였다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 생약 제제는 이 기술 분야에서 일반적인 방식으로 만들어질 수 있다. 적합한 고체 또는 액체 생약 제형은 예를 들어 과립, 분말, 당의정, 태블릿, (마이크로)캡슐, 좌약, 시럽, 즙, 현탁액 또는 유화액이고, 그 제조를 위해 담체 물질, 폭약, 결합제, 코팅제, 팽창제, 윤활제, 미각제,감미료 및 용액 매개제와 같은 통상의 수단이 사용된다. 보조 물질로 여기에서 탄산 마그네슘, 이산화 티타늄,락토오스, 만니톨 및 다른 당, 활석, 우유 단백질, 젤라틴, 녹말, 셀룰로오스 및 유도체, 대구 간유, 해바라기유, 땅콩 기름 또는 참기름과 같은 동물성 및 식물성 기름, 폴리에틸렌 글리콜 및 멸균수와 같은 용매 및 일가 또는 다가 알콜, 예를 들어 글리세린이 나열된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 젖산 박테리아가 약학적으로 적합하고 생리학적으로 내성 좋은 담체 및 임의로 추가적인 적합한 활성, 첨가 또는 보조 물질과 정해진 양으로 혼합되고, 원하는 투여형으로 제제됨으로써 제조할 수 있다.
조성물은 세포 및 담체의 총량 대비 0.1 내지 95 중량% 담체 및 5 내지 99.9 중량% 동결건조된 젖산 박테리아를 함유하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 발명의 젖산 박테리아는 직접 접종 제품으로 사용될 수 있다. 따라서 박테리아는 임의의 선행 가공 단계 없이 식품, 또는 약학적 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 박테리아가 그들 자신의 발효 상청액에 저온 보존되는 것이 바람직하다. 이는 제품의 생산을 용이하게 하고 따라서 시간 및 비용 절약에 도움이 된다.
식품 조성물, 동물 사료, 약학적 조성물이 절대값으로, 또는 세포를 함유하는 100 g의 식품, 동물 사료, 또는 약학적 조성물에 대해 10^2 내지 10^15, 바람직하게는 10^6 또는 10^8 내지 10^12, 젖산 박테리아 세포 또는 그의 단편을 함유하는 것이 바람직하다.
"본 발명의 미생물의 단편"은 본 발명의 미생물의 세포의 임의의 부분을 포괄한다. 바람직하게는, 상기 단편은 막 제제로부터 얻어지는 막 단편이다. 락토바실러스 속에 속하는 미생물의 막 제제는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 문헌 [Rollan et al., Int. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-301], 문헌 [Matsuguchi et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003), 259-266] 또는 문헌 [Stentz et al., Appl.Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278] 또는 문헌 [Varmanen et al., J. Bacteriology 182 (2000), 146-154]에 기술된 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
전통 식품 유래 유산균의 비강 투여시 인플루엔자 방어 효과
마우스에서 인플루엔자 바이러스 A/NWS/33 (H1N1)에 대한 김치 유래 LABS 방어 효과를 평가하였다. 6번의 유산균 비강내 투여 후 같은 경로로 공격접종하였고, 감염 후 마우스에서 매일 체중 변화, 임상증상 및 생존율를 기록하였다. 양성 대조군의 모든 마우스는 죽고 음성 대조군의 모든 마우스는 죽지 않았다. L.plantarum- 2, P.pentosaceus-2, L. sakei가 각각 80%, 70%, 70%로 높은 수준의 방어 효율을 나타내었다. 다음으로 P.pentosaceus-1이 60%, L.plantarum -1, L.plantarum -3, L.brevis-3이 50%의 생존율을 보였다. L.brevis-4, L. brevis-1, L.brevis-2는 각각 40%, 20%, 10%로 낮은 생존율을 보였다.(도 1)
공격접종하지 않은 마우스 그룹(음성 대조군)은 체중의 변화가 거의 없지만, 양성 대조군 및 실험군의 체중은 바이러스 공격접종 후 감소하였다. 체중은 공격접종 후 1일부터 감소하여 대부분 8일까지 감소한 다음 9일 이후 원래 상태와 가깝게 회복하거나 더 이상 감소하지 않았다. 임상 증상의 평균 시작 시간은 모든 군에서 3일이었다. 관찰된 임상적 증상 체온(열), 눈꺼풀 이상 및 털 이상이 양성대조군에서 보다 LAB 처리된 군에서 더 나았다.(도 2)
마우스에서 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009 (H1N1)에 대한 된장 유래 LABS 방어 효과를 평가하였다. 양성 대조군의 모든 마우스는 죽고 음성 대조군의 모든 마우스는 죽지 않았다. 30 P.acidilactici or P.lolii와 23 E.faecium은 90%의 생존율로 가장 높은 보호 수준을 나타내었고, 그 다음이 35 B.linchenformis와 22 L.mesenteroides로 80%, 21 B.coagulans, 17 S.nakayamae, 18 B.coagulans, 46 B.coagulans, 28 L.alimentarius이 각각 60%, 55%, 50%, 40% 및 25%의 생존율을 나타내었다.(도 3)
공격접종하지 않은 마우스 그룹(음성 대조군)은 체중의 변화가 거의 없지만, 양성 대조군 및 실험군의 체중은 바이러스 공격접종 후 감소하였다. 체중은 공격접종 후 1일부터 감소하여 대부분 8일까지 감소한 다음 8일 이후 원래 상태와 가깝게 회복하거나 더 이상 감소하지 않았다. 임상 증상의 평균 시작 시간은 모든 군에서 3일이었다. 관찰된 임상적 증상 체온(열), 눈꺼풀 이상 및 털 이상이 양성대조군에서 보다 LAB 처리된 군에서 더 나았다.(도 4)
또한 하기 본 발명의 유산균을 덱스트린 첨가제와 섞어서 먹이고 방어율을 관찰하였더니, E.faecium은 등의 균주는 공격접종 대조군의 결과와 같이 전수폐사하였으나, P.acidilactici는 10마리 중 최종적으로 6마리가 살아남는 결과를 보였다(자료 미첨부).
투여 경로에 따른 유산균의 인플루엔자 방어 효과
비강 투여 결과 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어 효과가 좋은 균주를 선발하여 (L. plantarum-2, L. brevis-5 및 L. sakei) 이 균주의 경구 및 비강 투여 후 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009 (H1N1)에 대한 보호 효과를 평가하였다. 대조군은 PBS 투여 후 실험군과 동시에 공격접종하였다. 그 후 체중 변화, 임상 증상 및 사망 저해 효과를 2 주 동안 관찰하였다. 비강 처리된 Lactobacillus는 완화된 임상 증상을 가지고 현저한 체중 감소가 억제되었다.(도 5)
감소된 체중은 비강 투여된 L.plantarum-2 및 L. brevis-5 에서 공격접종 10일 후 증가하였고, L. sakei에서 9일부터 증가하였다. 경구 투여된 Lactobacillus와 비교하여 비강 처리된 Lactobacillus 는 인플루엔자 바이러스 A/H1N1에 대한 더 높은 보호 효과를 나타내었다.(도 6)
임상 증상의 평균 시작 시간은 음성 대조군을 제외하고 모든 군에서 3일이었다. 이것 외에도, 관찰된 임상적 증상 체온(열), 눈꺼풀 이상 및 털 이상이 양성 대조군에서 보다 LAB 처리된 군에서 더 나아졌다.
비강 투여시 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009 (H1N1)에 대한 항바이러스 효과가 우수한 세 후보 균주 P.acidilactici, E.faecium, B.linchenformis를 선택하고 균주의 경구 투여 후 마우스에서 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009 (H1N1)에 대한 보호 효과를 평가하였다. 양성 대조군 및 E.faecium, B.linchenformis를 경구 투여한 그룹의 마우스는 공격접종 후 12일 이내에 전수 폐사하였으나 P.acidilactici를 투여한 그룹은 40%의 보호 효과를 보였다.(도 7)
임상 증상의 평균 시작 시간은 음성 대조군을 제외하고 모든 군에서 3일이었다. 특히 P.acidilactici의 경우 생존 개체에서 정상 체중 가까이 회복하는 것을 보였다.(도 8)
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 김치 유래 유산균 중 L.sakei와 된장 유래 유산균 중 P.acidilactici는 비강 투여와 경구 투여에서 모두 높은 인플루엔자에 대한 방어 효율을 보였다. 상기 유산균의 사용을 통하여 인플루엔자 감염을 예방할 수 있는 가능성이 있다.
도 1은 김치 유래 유산균 비강 투여 후 인플루엔자 바이러스 공격접종시 생존율 그림,
도 2는 김치 유래 유산균 비강 투여 후 인플루엔자 바이러스 공격접종시 체중 변화 그림,
도 3은 된장 유래 유산균 비강 투여 후 인플루엔자 바이러스 공격접종시 체중 변화 그림,
도 4는 된장 유래 유산균 비강 투여 후 인플루엔자 바이러스 공격접종시 생존율 그림,
도 5는 김치 유래 유산균 비강 및 경구 투여 후 인플루엔자 바이러스 공격접종시 체중 변화 그림,
도 6은 김치 유래 유산균 비강 및 경구 투여 후 인플루엔자 바이러스 공격접종시 생존율 그림,
도 7은 된장 유래 유산균 경구 투여 후 인플루엔자 바이러스 공격접종시 생존율 그림,
도 8은 된장 유래 유산균 경구 투여 후 인플루엔자 바이러스 공격접종시 체중변화 그림,
도 9 및 도 10은 각각 본 발명의 김치 유래 L.sakei와 된장 유래 유산균 P.acidilactici의 16s rRNA 유전자 서열 정보이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1:사용 동물
6주령 SPF BALB/c 마우스 암컷(Orient Bio Laboratories, Seoul, Korea)으로 체중 18-20 g을 사용하였다. 모든 실험을 건국대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인을 얻어 프로토콜에 따라 수행하였다.
실시예 2: 유산균의 분리
한국의 여러 지역에서 수집한 김치(배추, 깍두기 및 동치미)와 된장으로부터 유산균을 분리하였다. 유산균 분리를 위하여, 먼저 1 ml 발효 수프를 30 ml MRS 액체 배지에 첨가하고 24 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 1 루프의 배양된 액체배지를 Rogosa 고체배지에 스트리킹하고 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 각 성장한 집락들을 MRS 고체배지에서 더 스트리킹하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 젖산균 균주의 동정을 위하여, 각 시료로부터 분리된 단일 집락을 시퀀싱을 하고 16s rRNA 유전자 서열 분석에 의하여 LAB를 동정하였다. 동정된 유산균은 다시 MRS 액체배지에서 배양하여 동결보존제와 혼합하여 영하 70℃에서 보관하였다. 분리한 유산균은 표 1(김치유래), 표 2(된장유래)와 같다.

그룹

유산균

G1

L. plantarum - 1

G2

L.plantarum- 2

G3

L. plantarum - 3

G4

L. brevis -1

G5

L. brevis -2

G6

L. brevis -3

G7

L. brevis -4

G8

P. pentosaceus -1

G9

P. pentosaceus -2

G10

L. sakei

G11

공격접종 양성대조군

G12

공격접종 음성대조군

그룹

유산균

G1

18 B. coagulans

G2

37 S. nakayamae

G3

17 S. nakayamae

G4

46 B. coagulans

G5

21 B. coagulans

G6

35 B. linchenformis

G7

30 P . acidilactici

G8

28 L. alimentarius

G9

23 E. faecium

G10

22 L. mesenteroides

G11

공격접종 양성대조군

G12

공격접종 음성대조군
실시예 3: 바이러스
인플루엔자 바이러스 A/NWS/33 (H1N1), 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009 (H1N1)를 3일 동안 37℃에서 11일령 계태아의 요막강에서 성장시켰다. 요막액(allantoic fluid)을 모아서 사용시까지 영하 70℃에 저장하였다. 요막액에서 얻은 바이러스의 역가는 연속적으로 10-배 희석된 요막액을 발육계란(embryonated eggs)에 주사하고, 각 계란의 요막액에서 바이러스의 존재를 바이러스의 혈구응집 능력에 기초하여 결정하였다. 마우스에 적응된 바이러스를 만들기 위해, 바이러스를 먼저 마우스 폐에서 분리하여 SPF 계란에서 증식시키고 다시 마우스에 재접종하였다. 공격접종 연구에서, Avertin (375 mg/kg)을 복강내 주사 경로로 주입하여 마우스를 마취한 뒤 90μL의 10^4.5 EID50 인플루엔자 바이러스로 비강내 경로로 공격접종하였다.
실시예 4: 실험 설계
인플루엔자 바이러스 type A, H1N1에 대한 LABS 방어 효과
김치와 된장에서 분리한 여러 유산균의 인플루엔자 바이러스에 대한 방어 효과를 확인하기 위하여 마우스에 유산균 투여 후 바이러스를 공격 접종하여 관찰하였다. 10마리를 한 그룹으로 하여, 그룹당 한 가지 유산균을 각각 바이러스 공격접종 전 비강 내 경로(1x 10^8 cfu/마리)로 6회 투여하였다. 양성 대조군 및 음성 대조군 그룹은 테스트 그룹과 동일한 형식으로 PBS를 접종하였다. 김치 유래 유산균과 된장 유래 유산균은 각각 인플루엔자 바이러스 A/NWS/33 (10^4.5/ 90μL/ dose)와 A/Korea/01/2009 (H1N1) (10^4.5/ 90μL/ dose)으로 공격 접종한 후, 임상 증상, 사망률 및 체중 변화를 2주 동안 관찰하여 비강 투여된 유산균에서 인플루엔자 바이러스의 보호 효과를 평가하였다.
투여 경로에 따른 인플루엔자 바이러스 type A, H1N1에 대한 Lactobacillus의 보호 효과
인플루엔자 바이러스 감염에 저항이 있는 균주를 선택하여 유산균의 투여 경로에 따른 방어 효과에 차이가 있는지 확인하기 위하여 마우스에 1x 10^8cfu/마리의 농도로 3주간 경구(300ul) 투여를 수행하였다. 양성 대조군 및 음성 대조군을 테스트 군과 동일한 형식으로 PBS로 접종하였다. 김치 유래 유산균과 된장 유래 유산균은 각각 인플루엔자 바이러스 A/NWS/33 (10^4.5/ 90μL/ dose)와 A/Korea/01/2009 (H1N1) (10^4.5/ 90μL/ dose)으로 공격 접종한 후, 임상 증상, 사망률 및 체중 변화를 2주 동안 관찰하여 비강 투여된 유산균에서 인플루엔자 바이러스의 보호 효과를 평가하였다.
한국생명공학연구원 KCTC13031 20160601 한국생명공학연구원 KCTC13032 20160601

Claims (4)

  1. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주(기탁번호 KCTC13031BP)를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 타입 A에 대한 보호 효과를 가지는 비강 투여용 조성물.
  2. 삭제
  3. 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) 균주(기탁번호 KCTC13032BP)를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 H1N1에 대한 보호 효과를 가지는 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) 균주는 비강 또는 경구 투여하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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