CN111437237A

CN111437237A - 一种具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物及其应用

Info

Publication number: CN111437237A
Application number: CN202010487646.2A
Authority: CN
Inventors: 周心慧; 张继勇; 程建华; 杨弘浩; 吴崇财
Original assignee: Guangzhou Yanjuyuan Technology Co ltd; South China Institute of Collaborative Innovation
Current assignee: Dongguan Juwei New Material Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-02
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2040-06-02
Also published as: CN111437237B

Abstract

本发明属于日用化妆品技术领域，公开了一种具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物及其应用。该组合物主要包括肌肽，超低分子量铁皮石斛多糖提取物和二裂酵母发酵产物溶胞物，还可以包括溶剂和防腐剂。本发明通过肌肽、超低分子量铁皮石斛多糖提取物和二裂酵母发酵产物溶胞物三种成分的黄金配比组合使用从而达到协同增效的功效，使组合物具有抗氧化、抗糖基化、抑制光损伤后人角质形成细胞对炎症因子的释放，促进屏障修复基因的表达，以及促进胶原蛋白的合成，起到全面的抗衰老作用。此外，本发明的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物成分类型简单、易于制备，易于与其他成分混配到化妆品中，具有易于加入各种类型配方的明显优势。

Description

一种具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物及其应用

技术领域

本发明属于日用化妆品技术领域，特别涉及一种具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物及其应用。

背景技术

皮肤老化是一种与皮肤超微结构和生物化学紧密相连的复杂过程，它的主要临床表现为皮肤皱纹、粗糙、干燥、松弛、皮肤下垂、毛细血管扩张和色素沉淀等。人类的皮肤老化分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是随着年龄增长而发生的老化过程，受每个人的遗传因素影响。但随着年龄的增长，肌肤的新陈代谢变缓慢，导致糖化终产物(AGEs)在皮肤蓄积，导致皮肤更新周期延长、皮肤重生的代谢机能下降，加速皮肤的老化。外源性老化是指皮肤受环境因素影响而引起的衰老变化，主要以紫外线辐射的影响为主。但是随着科技的发展，现代人时刻生活在数码化环境下，导致皮肤暴露在手机、电视、电脑、各种照明灯等中不断受到蓝光的辐射。当皮肤长期暴露在长波紫外线(UVA)、中波紫外线(UVB)和蓝光中，会使皮肤产生活性氧物质(ROS)，引起一系列的氧化损伤，导致线粒体损伤凋亡、细胞核内DNA链断裂、刺激细胞分泌大量炎症因子而诱发炎症反应、胶原合成减少、皮肤屏障破坏等，加速皮肤的老化。此外，现代人的高糖高脂的饮食习惯，熬夜的不规律作息以及紫外线的照射，也使得皮肤的糖化反应增加，加快皮肤的衰老。因此，现在很多20岁及以上的年轻都市女性，也开始关注抗衰老类产品。

目前，市场上具有很多不同类型的抗衰老化妆品，其功效成分也各有特点。主要的抗衰活性成分一为抗氧化剂或抗糖化剂，如中国专利公开文本CN109125205A，利用抗氧化剂维生素C乙基醚、富勒烯衍生物以消除活性氧(ROS)和自由基来实现抗衰老的功效；二为保湿类物质，如中国专利公开文本CN107582424A公开使用不同分子量复配的透明质酸混合物起到全面保湿、增加皮肤含水量来实现抗衰老的功效；三为多肽蛋白类物质，如中国专利公开文本CN109771323A，利用乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-5和水解弹性蛋白为抗衰老成分；四为植物提取物，如中国专利公开文本CN105748343A，涉及到西柚萃取物、天门冬提取液、银杏萃取物、灵芝提取液、牛蒡提取液的抗衰老成分；五为益生菌成分，如中国专利公开文本CN110464693A，利用双岐杆菌获得的生理溶胞产物来抗击皮肤老化。在应用中，护肤品通常同时结合使用多种活性成分，以期达到更优的抗衰效果。但是研究发现，很多的活性成分不具有协同增效的作用，难以达到预期的最佳抗衰效果，或者成分组成过多，成本高。因此寻找一种组分简单、并能够针对皮肤外源老化原因起到全面抗衰老效果的组合物就十分必要。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，且该组合物成分类型简单、活性成分之间可以协同增效、安全性高，可以全面提供皮肤抗衰老作用。

本发明另一目的在于提供上述具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物的制备方法。

本发明再一目的在于提供上述具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物在化妆品中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，其主要包括肌肽，超低分子量铁皮石斛多糖提取物，和二裂酵母发酵产物溶胞物；其中肌肽、超低分子铁皮石斛多糖提取物和二裂酵母发酵产物溶胞物的重量比为1-20:5-65:10-65，优选为5-20:5-55:10-50，最优选为5:30:35。

所述的超低分子量铁皮石斛多糖提取物中的超低分子量是指分子量低于10000道尔顿。

所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物还包括基础组分，基础组分为溶剂和防腐剂，溶剂为本领域常规使用的溶剂，如水、甘油、丁二醇、丙二醇、戊二醇、己二醇、辛二醇等中的至少一种；防腐剂也为本领域常规使用的具有防腐效果的防腐剂及防腐助剂，如丁二醇、丙二醇、戊二醇、己二醇、辛二醇、苯氧乙醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、乙基己基甘油、辛酰羟肟酸、对羟苯乙酮、双(羟甲基)咪唑烷基脲、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、咪唑烷基脲、甲基异噻唑啉酮、天然植物防腐剂(连翘提取物，花椒果提取物、红葱提取物、百里香提取物等)、抗菌肽等市面上可得的防腐剂或防腐助剂中的至少一种；

所述的基础组分优选为水、戊二醇和己二醇的混合物，在具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物中，戊二醇的用量为2％(重量百分数)，己二醇的用量为2％(重量百分数)，余量为水。

优选的，所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，包括以重量百分比计的以下组分：肌肽5-20％，超低分子量铁皮石斛多糖提取物5-65％，二裂酵母发酵产物溶胞物10-65％，基础组分20-80％。

更优选的，所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，包括以重量百分比计的以下组分：肌肽5-20％，超低分子量铁皮石斛多糖提取物5-55％，二裂酵母发酵产物溶胞物10-50％，基础组分30-80％。

最优选的，所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，包括以重量百分比计的以下组分：肌肽5％，超低分子量铁皮石斛多糖提取物30％，二裂酵母发酵产物溶胞物35％，基础组分占30％。

所述的肌肽为抗氧剂和抗糖化剂，是活性氧自由基(ROS)淬灭剂和金属离子螯合剂，能有效阻止皮肤中的过氧化反应，降低皮肤的氧化损伤；能阻止真皮层中导致皱纹生成和弹性损失的大分子交联和固化，淬灭糖基化末端(AGE)产物。本发明中肌肽复配超低分子量铁皮石斛多糖、二裂酵母发酵产物溶胞物后，使组合物还具有抑制光损伤后人角质形成细胞对炎症因子的释放，促进屏障修复基因的表达，重建皮肤屏障以及促进胶原蛋白的合成，起到多方位抗衰老的作用。

肌肽原料为粉末状，原料为水溶性的，25℃下溶解度为20g/100g，因此它的最大添加量仅为20％；且肌肽原料价格昂贵，市售价格6000元/kg，它在化妆品中的使用量一般建议0.05-2％。

所述超低分子量铁皮石斛多糖提取物为利用发酵工程技术获得分子量低于10000道尔顿的铁皮石斛多糖提取物，其中超低分子量铁皮石斛多糖提取物中超低分子量铁皮石斛多糖的含量为10mg/mL。具体参考中国专利公开文本CN108823261A(申请号为CN201810743725.8)产品，研究发现，与大分子量相比，超低分子量铁皮石斛多糖能跨越多重细胞膜障碍进入生物体，增强其生物活性；渗透性更佳，能直达细胞层面，具有深层补水、嫩滑肌肤和延缓衰老的能力；同时能够抑制炎症因子释放，重建皮肤屏障，起到改善和修复皮肤及提高机体免疫力的功效。

所述的二裂酵母发酵产物溶胞物由双歧杆菌经过特殊发酵工艺提取的一种富含多肽、核酸、氨基酸及多糖的复合体，是一款生物细胞修复剂，具有清空紫外线累积损伤，激活成纤维细胞活力，激活肌肤自身修复力，修复紫外线造成的皮肤DNA损伤，使肌肤“唤活生机”。

一种上述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物的制备方法，包括以下步骤：将肌肽按配比加入去离子水中，加热至40～60℃搅拌直至肌肽全部溶解，冷却至25～30℃；按配比加入二裂酵母发酵产物溶胞物、超低分子铁皮石斛多糖提取物，混合并搅拌均匀；再加入提前混合均匀的戊二醇和己二醇，搅拌均匀，即得到具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物。

上述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物在制备化妆品中的应用，如化妆水、精华液、乳液、膏霜、面膜等。

具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物在制备化妆品中的应用中，所述的化妆品中具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物的施用量为重量百分数1-40wt％，优选为10-40wt％。

本发明的机理为：

本发明选择复配肌肽、超低分子量铁皮石斛多糖提取物和二裂酵母发酵产物溶胞物三种成分作为抗衰老因子，通过这三者的黄金配比组合使用从而达到协同增效的功效，起到全面的抗衰老作用。本发明组合物主要在三个层次上起着调节作用，首先通过消除皮肤氧自由基、抑制糖基化作用和处理糖基化蛋白；其次控制和调节与免疫-激励有关的炎症传递介质，抑制炎症因子的释放，促进屏障修复相关基因的表达，修复皮肤屏障；最后，修复紫外线造成的皮肤DNA损伤，激活成纤维细胞活力，促进胶原蛋白的表达，重构真皮胞外基质。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

本发明将肌肽、超低分子量铁皮石斛多糖提取物和二裂酵母发酵产物溶胞物进行黄金配比作为抗衰老因子，从三个层次上起着调节作用：1)清除自由基、抗氧化反应、抗糖化反应；2)改善肌肤的水合作用、抑制炎症因子释放、修复皮肤屏障功能；3)促进成纤维细胞合成胶原蛋白以及DNA修复等皮肤生理作用，从而达到较全面抗衰老的作用。本发明的复合抗衰老组合物可以作为抗衰老组分用于化妆品中，对于本发明的复合抗衰老组合物在化妆品中的应用也在保护范围之内。所述化妆品可以包括化妆水、精华液、乳液、膏霜、面膜等。此外，本发明的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物成分类型简单、易于制备，易于与其他成分混配到化妆品中，具有易于加入各种类型配方的明显优势。

附图说明

图1为实施例1组合物不同浓度对IL-6炎症因子的抑制效果图。

图2为实施例1组合物不同浓度对IL-8炎症因子的抑制效果图。

图3为实施例1组合物对屏障相关基因荧光定量PCR检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

实施例和对比例中，肌肽购自东莞华工创为生物科技有限公司，商品名：DIP-SCAVA；注意，肌肽为粉末，纯度>99％。超低分子铁皮石斛多糖提取物购自东莞华工创为生物科技有限公司，商品名：PHYTOBIO DCP；注意，其INCI名称为铁皮石斛(DENDROBIUMCANDIDUM)茎提取物。二裂酵母发酵产物溶胞物，商品名：Rejuvactor NP。

实施例和对比例中，具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物由肌肽，超低分子铁皮石斛多糖提取物，二裂酵母发酵产物溶胞物以及基础组分(戊二醇、己二醇、水的混合物)构成，其中戊二醇为2％(w/w)、己二醇为2％(w/w)。实施例与对比例中具体的组成配比见表1。

表1 不同抗衰老护肤组合物的组成配比

实施例与对比例中，具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物的制备工艺如下所述：

将肌肽加入去离子水中，加热至50℃搅拌10-20min，直至肌肽全部溶解，冷却至25～30℃；依次加入超低分子量铁皮石斛多糖提取物、二裂酵母发酵产物溶胞物，混合并搅拌均匀；将戊二醇和己二醇混合均匀后加入上述溶液中，即得到具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物。

功效测试

对实施例1-4与对比例1-7的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物的效果进行检验对比：

一、抗氧化性能测试

利用DPPH法测试本发明中具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物对自由基的清除效果。DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，具有单电子，在517nm处有一强吸收，其无水乙醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。

测试方法：

按以下表2依次加样，其中，DPPH-乙醇溶液由以下步骤制备得到：称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(Macklin，纯度>96％)12mg溶解于无水乙醇中，加入乙醇定容至250mL棕色容量瓶。DPPH-乙醇溶液临用时现配。样品溶液由以下步骤制备得到：分别移取实施例1-4及对比例1-7的组合物1mL，加入去离子水定容至10mL棕色容量瓶，得到稀释10倍后的样品溶液。

表2 样品加液要求

试剂	T-样品管	T<sub>0</sub>-样品本底	C-DPPH管	C<sub>0</sub>-溶剂本底
					样品溶液(mL)	1	1	—	—
水(mL)	2	2	3	3
					DPPH-乙醇溶液(mL)	1	—	1	—
无水乙醇(mL)	—	1	—	1

扫描C-DPPH组的最大吸收波长，在最大吸收波长处检测吸光度值。测量结果显示，溶液在517nm处有最大吸收峰。将各支试管反应溶液混匀后，移入3cm比色皿中，测量每组溶液在517nm的吸光度。

清除率计算公式为：

式中：

T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；

T₀—样品本底吸光值；

C—DPPH管吸光值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；

C₀—溶剂本底吸光值。

取三次测量平均值，测试结果如下表3所示：

表3 不同样品的清除自由基效果

从表3可以看出，本发明实施例1-4对自由基的清除率均≥60％，其中实施例1、3、4的清除率≥90％；对比实施例1-2、对比例1以及对比例5可知，肌肽具有优异的抗氧化性能，组合物中肌肽的含量高低直接影响抗氧化性。但是化妆品原料需要考虑它的价格，肌肽原料价格昂贵，市售价格6000元/kg，而肌肽原料为粉末状，25℃水中溶解度为20g/100g，因此对比例5中肌肽的最大用量也仅加至16％，而非70％。因此本发明实施例1使用低剂量的肌肽与二裂酵母溶胞物及超低分子铁皮石斛多糖的混合达到高抗氧化性能，具有实际市场价值。

将实施例1与实施例3、4进行对比，实验证明组合物中合理比例的二裂酵母溶胞物及超低分子铁皮石斛多糖将提高组合物的抗氧化性能。将实施例1与对比例2、3、4、6、7进行比较，实验证明肌肽、二裂酵母发酵产物溶胞物及超低分子铁皮石斛多糖之间将协同作用，显著提高组合物的抗氧化性能。

二、抗糖化性能测试

糖基化反应是皮肤衰老的重要机制，发生在皮肤内部的还原糖与基质蛋白之间。非酶糖基化是一系列复杂的非酶促反应，蛋白质和葡萄糖在体内发生非酶促反应形成Schiff碱和Amadori产物等早期糖基化产物，进而经过氧化、重排、交联等过程，形成不可逆的非酶糖基化终产物(AGEs)，其储存在组织中与其受体(RAGE)连接，损伤皮肤的形态和生理活动。因此，能够有效清除AGEs的物质提示具有抗衰老的功效。AGEs可自发荧光，在特定波长下检测荧光强度，可以得到化妆品原料的抗糖基化效果。

测试方法:

(1)BSA-葡萄糖建模：将0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.4)，8mg/mL的牛血清白蛋白溶液(BSA)及0.2mol/L的葡萄糖溶液在60℃下避光反应40h，得到BSA-葡萄糖糖化模型溶液(注意，PBS、牛血清白蛋白和葡萄糖浓度为混合溶液中的终浓度)；

(2)取样：准确移取200μL不同样品溶液(样品溶液为抗氧化性能测试里面稀释10倍后得到的样品溶液)与300μLBSA-葡萄糖糖化模型溶液混合均匀，避光反应0.5-1h；

(3)FAGEs的检测：AGEs衍生的荧光可以通过酶标仪在370nm激发波长和440nm发射波长条件下检测；

(4)数据分析:

FAGEs抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100％

其中：A——添加受试物的葡萄糖溶液的荧光强度；

B——添加受试物的超纯水溶液的荧光强度，即将步骤(2)中的300μLBSA-葡萄糖糖化模型溶液替换为300μL的超纯水；

C——没有受试物，但有葡萄糖溶液的荧光强度；即将步骤(2)中的200μL不同样品溶液替换为200μL的超纯水；

D——没有受试物，没有葡萄糖溶液的荧光强度，即为超纯水的荧光强度。

取三次测量平均值，测试结果如下表4所示：

表4 不同样品的抗糖基化效果

从表4可以看出，本发明实施例1-4对糖基化反应的抑制率均≥70％，其中实施例1、3、4的抑制率均≥90％。对比实施例1-2、对比例1以及对比例5，实验证明肌肽具有优异的抗糖基化效果，组合物中肌肽的含量高低直接影响抗糖基化效果。因肌肽的成本问题，低使用量的实施例已可以实现100％的抗糖基化效果。将实施例1与实施例3、4进行对比，实验证明组合物中合理比例的二裂酵母溶胞物及超低分子铁皮石斛多糖将提高组合物的抗糖基化性能。实施例1与对比例2、3、4、6、7进行比较，实验证明肌肽、二裂酵母发酵产物溶胞物及超低分子铁皮石斛多糖将协同作用，显著提高组合物的抗糖基化性能。

三、抑制炎症因子

1.细胞毒理性测试

使用人角质形成细胞(HaCat细胞，购买至北京协和细胞资源中心)为模型，考察不同浓度的实施例1样品对人角质形成细胞的相对细胞活性情况，表征试样的细胞毒性，并筛选出试样的最大安全给药浓度。试验步骤如下：

(1)细胞培养：试验前24h制备细胞悬液，调整HaCat细胞浓度为0.8～1.0×10⁵个/mL，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，在37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养24h。

(2)暴露：弃去孔中原培养液，每孔加入100μL不同浓度的测试样品(测试样品是指将实施例1的组合物加入适量完全培养基(MEM+10％FBS)，配置成体积百分数为0.5％、1.0％、5.0％、10％、15％、20％、30％、40％的测试样品溶液)，以及阴性对照(完全培养基组)。培养箱孵育24h±0.5h。相差倒置显微镜下观察细胞形态和特性。

(3)MTT测试：每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液，培养箱孵育3±0.5h。去除孔中液体，每孔加入100μLDMSO，置于振荡器振荡10～15min后，在酶标仪570nm波长处测定吸收值。

(4)数据处理：各组数据以均值±标准差表示，以对照组细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性(Viability)。

因化妆品中本发明组合物的建议添加量为1～40％，研究该浓度范围内，不同浓度实施例1试样下人角质形成细胞的相对细胞活性情况如表5所示。在试样为40％本发明组合物时，人角质形成细胞的相对细胞活性为70.23％(行业认为相对细胞活性高于70％为安全浓度)；对比阴性对照组，人角质形成细胞的相对细胞活性为100％。因此，本发明组合物添加量1～40％为安全添加量。

表5 不同浓度实施例1试样下人角质形成细胞的相对细胞活性情况

2.抗炎功效测试

角质形成细胞是一种存在于表皮中的免疫活性细胞，可分泌至少9种白细胞介素(IL)，这些因子对淋巴细胞增殖、活化炎症细胞等有重要作用。已有研究发现，紫外线辐射后角质形成细胞分泌的IL-6可促进成纤维细胞产生细胞外基质金属蛋白酶(MMP)，细胞外基质金属蛋白酶可导致胶原蛋白降解，细胞外基质的损伤而致皮肤老化的产生；此外，UVB可促使角质形成细胞分泌更多的IL-8，促使中性粒细胞在皮肤局部的聚集，诱导后续的炎症反应，从而进一步影响皮肤的免疫功能。

因此，本发明使用人角质形成细胞(HaCat细胞)为模型，将实施例1的组合物用完全培养基(MEM+10％FBS)配置成体积百分数为1.0％、3.0％、5.0％的测试样品溶液，利用脂多糖LPS(10ug/mL，终浓度)刺激，角质形成细胞孵育24h后，研究对炎症因子(IL-6、IL-8)的释放情况，进而评价浓度为1.0％、3.0％、5.0％的本实施例1组合物的抗炎效果。以LPS(10ug/mL)作为刺激物，1％+LPS、3％+LPS、5％+LPS三个浓度的实施例1的组合物溶液与LPS的混合物为受试样品，以正常培养的角质形成细胞为空白对照。

试验步骤具体如下所示:

(1)细胞培养：将HaCat细胞以密度为2.0～3.0×10⁵个/mL/孔接种于12孔板，返回培养箱培养18～24h，培养基为在2～8℃下保存2周的含10％FBS的MEM培养基。

(2)暴露：取出培养板，弃去孔中原培养液，每孔加入1mL测试样品溶液(实施例1的组合物用完全培养基(MEM+10％FBS)配置成体积百分数为1.0％、3.0％、5.0％的测试样品溶液)，并利用脂多糖LPS(10ug/mL，终浓度)刺激；同时设置模型组和空白对照组，模型组为仅利用脂多糖LPS(10μg/mL，终浓度)刺激，空白对照组为加入1mL完全培养基，不加脂多糖LPS刺激。培养24±1h。

(3)加样：去除原培养液，加入1mL新鲜培养液，继续培养24±1h。

(4)检测：收集上清液，-80℃保存，细胞因子采用ELISA试剂盒进行测定，测试条件为：温度37±0.5℃，湿度>90％和5％CO₂浓度。

(5)数据分析：数据以均值±标准差表示，数据采用SPSS进行分析，如果p<0.05考虑差异具有统计学意义。

实施例1中的组合物不同浓度对IL-6炎症因子的抑制效果见图1及表6所示：空白为正常细胞内的IL-6炎症因子相对含量为100％，经LPS刺激角质形成细胞后，模型组的IL-6水平较对照组(正常细胞)显著升高至181.80％，约为对照组的1.81倍。经统计学分析，与模型组对比，1％、3％和5％含量的实施例1组合物对LPS诱导的巨噬细胞分泌的炎性细胞因子IL-6有显著下调作用，且差异具有统计学意义，添加5％的实施例1组合物，使IL-6的含量接近至对照组的水平，表明较高浓度(≥5％)的实施例1组合物的抗炎活性更好。

表6 不同组别IL-6差异比较

表7 不同组别IL-8差异比较

*：与模型组对比，差异具有统计学意义

实施例1组合物不同浓度对IL-8炎症因子的抑制效果见图2及表7所示：空白为正常细胞内的IL-8炎症因子相对含量为100％，经LPS刺激角质形成细胞后，模型组的IL-8水平较对照组(正常细胞)显著升高至520.80％，约为对照组的5.2倍。经统计学分析，与模型组对比，1％低浓度的实施例1组合物对IL-8的抑制作用不具有显著性差异；而3％和5％含量的实施例1组合物对LPS诱导的巨噬细胞分泌的炎性细胞因子IL-8有显著下调作用，且差异具有统计学意义，添加5％的实施例1组合物，使IL-8的含量接近至对照组的水平，表明较高浓度(≥5％)的实施例1组合物的抗炎活性更好。

四、屏障基因的修复

使用人角质形成细胞(HaCat细胞)为模型，以屏障修复相关基因(TGM1、FLG、LOR、IVL和ABCA12)进行测试。转谷氨酰胺酶1基因TGM1：编码与膜相连的钙依赖性硫醇酶，可以抵抗蛋白酶的水解作用，是角质形成细胞终末分化组成角质包膜的关键步骤，是皮肤屏障功能的物质基础。丝聚合蛋白FLG：是皮肤屏障的关键，可减少抗原的入侵和TEWL，并可释放酸性物质致皮肤pH值下降，抑制细菌的生长。兜甲蛋白LOR：是表皮颗粒细胞角质透明蛋白颗粒的主要成分，FLG基因突变影响角质形成细胞的终末分化及其表达异常使皮肤屏障功能受损。内披蛋白IVL：在转谷酰胺酶TGK的催化作用下交叉连接并沉积在细胞膜内侧而形成不溶于水的角质化包膜。ABCA12基因：作为一种ABC家族脂质体运体，位于板层小体界膜，参与板层小体形成，对维持正常的皮肤屏障功能起着重要作用。试验步骤具体如下所示:

(1)细胞接种：按2.5×10⁵个/孔的密度接种细胞至6孔板中，于培养箱(37℃、5％CO₂、95％RH)中培养过夜。

(2)配液：利用完全培养基(MEM+10％FBS)为溶剂，将实施例1组合物配制成体积分数为5％的溶液作为荧光定量PCR测试的受试物工作液。

(3)给药：每组设置3个重复孔，待6孔板中细胞的铺板率达到40％～50％时，进行分组给药，于培养箱(37℃、5％CO₂、95％RH)中培养24h。

(4)收集细胞：样品孵育培养24h后，进行PBS清洗操作，1mL/孔，清洗两次。清洗结束后，每孔加入1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收集至1.5mL无酶EP管中，并保存至-80℃冰箱。

(5)荧光定量PCR测试：根据RNAiso Plus说明书进行RNA提取操作，根据反转录试剂盒进行反转录操作，根据SYBR Premix Ex TaqTM II荧光染料(TaKaRa DRR081A)产品说明书进行荧光定量PCR反应体系配置及上机检测。

(6)结果计算：采用2^-△△CT方法进行结果计算。

实施例1组合物对屏障相关基因荧光定量PCR检测结果如图3所示，根据图3所示，实施例1组合物在浓度为5％时，对屏障修复相关基因TGM1、FLG、LOR、IVL和ABCA12的表达有显著的促进作用，上调倍数分别为2.7倍、2.1倍、2.64倍、2.6倍、以及2.65倍。

五、胶原蛋白的合成

当皮肤受到紫外线辐射后，细胞内会产生过量的活性氧，引起衰老相关基因表达，诱发炎症级联反应并降低弹力蛋白和胶原蛋白的表达量，导致皮肤出现松弛、皱纹等老化现象。UVA刺激人皮肤成纤维细胞，会导致胶原特别是I型胶原(COL-I)的降解。本试验拟通过检测UVA刺激后成纤维细胞中的COL-I含量，与溶剂对照组比较其含量变化，评价实施例1组合物样品是否对COL-I的分泌有促进作用。

具体测试步骤如下：

成纤维细胞毒性测试：

(1)细胞培养：试验前24h制备细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每孔细胞数为8000个，37℃，5％CO₂培养24h。

(2)暴露：弃去孔中原培养液，每孔加入100μL不同浓度的测试样品(测试样品为实施例1的组合物加入适量完全培养基(DMEM+10％FBS)，配置成体积百分数为0.5％、1.0％、5.0％、10％、15％、20％、30％、40％的测试样品溶液)，阴性对照组加入100μL完全培养基(DMEM+10％FBS)。37℃，5％CO₂培养箱孵育24h。相差倒置显微镜下观察细胞形态和特性。

(3)MTT测试：每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，培养箱孵育3±0.5h。去除孔中液体，每孔加入100μL DMSO，置于振荡器振荡10～15min后，在酶标仪570nm波长处测定吸收值。

本次测试所用细胞为人皮肤成纤维细胞(HFF-1)，购自中国科学院上海生命科学研究院上海细胞库。人皮肤成纤维细胞的细胞毒理性测试如上述所示，不同浓度的实施例1试样下人皮肤成纤维细胞的相对细胞活性情况如表8所示，对比空白样品组，人皮肤成纤维细胞的相对细胞活性为100％，在试样为40％实施例1组合物时，人皮肤成纤维细胞的相对细胞活性为71.30％(行业认为相对细胞活性高于70％为安全浓度)。因此，本发明组合物添加量1～40％为安全添加量。根据人皮肤成纤维细胞毒性实验结果，结合抗氧化、抗炎症因子及屏障基金修复测试需求，选择本发明实施例1组合物给药浓度为5％、10％。

表8 不同浓度实施例1试样下人皮肤成纤维细胞的相对细胞活性情况

COL-I含量的检测：

(1)接种：将人皮肤成纤维细胞以5.0×10⁴的密度接种至6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱孵育过夜；

(2)给药：待6孔板中细胞铺板率达到50％～60％时，进行分四组(阴性对照组、空白对照组、受试样品组1、受试样品组2)给药，每组设3个复孔。阴性对照组和空白对照组中分别加入完全培养基(DMEM+10％FBS)，受试样品组1和2中分别加入含有5％(v/v)和10％(v/v)浓度受试物的完全培养基(DMEM+10％FBS)。37℃，5％CO₂培养箱继续培养24h。

(3)照射：对受试样品组1、受试样品组2、阴性对照组进行40mJ·cm^-2的UVA照射，紫外线照射剂量(mJ·cm^-2)＝辐射强度(mW/cm²)×照射时间(min)，空白组无需照射。照射后将各组培养基更换为完全培养基(DMEM+10％FBS)，37℃，5％CO₂培养箱培养24h。

(4)COL-I含量检测：收集上清液，-80℃保存，细胞因子采用ELISA试剂盒进行测定。

实验结果见表9所示，本发明实施例1组合物在5％的给药剂量下，与阴性对照(UVA+)(接受UVA照射)相比，试样对COL-I蛋白的表达量有显著提升作用(p<0.05)，说明本发明实施例1组合物对COL-I蛋白的表达量有显著提升作用。当实施例1组合物在10％的给药剂量下，试样对COL-I蛋白的表达量可与空白对照组(UVA-)(不接受UVA照射)相当，即可以恢复到正常水平。

表9 COL-I含量检测结果

样品名称	COL-I含量(ng/mL)
		空白对照组(UVA-)	331±11.4
阴性对照组(UVA+)	164±13.1
		受试样品组1	237±10.0
受试样品组2	328±10.2

根据抗氧化、抗糖基化、抑制炎症因子表达、促进屏障修复基因表达以及促进胶原蛋白的形成测试，证明了本发明的这种组合物具有全面抗衰老的功效。根据实验结果显示，本发明的这种组合物的最低起效浓度为1％，因此本发明的建议添加浓度为1-40％，最优选择为10-40％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，其特征在于主要包括肌肽，超低分子量铁皮石斛多糖提取物和二裂酵母发酵产物溶胞物，其中肌肽、超低分子量铁皮石斛多糖提取物和二裂酵母发酵产物溶胞物的重量比为1-20:5-65:10-65，优选为5:30:35。

2.根据权利要求1所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，其特征在于：

所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物还包括基础组分，基础组分为溶剂和防腐剂。

3.根据权利要求2所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，其特征在于：

所述的溶剂为水、甘油、丁二醇、丙二醇、戊二醇、己二醇、辛二醇中的至少一种；

所述的防腐剂为丁二醇、丙二醇、戊二醇、己二醇、辛二醇、苯氧乙醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、乙基己基甘油、辛酰羟肟酸、对羟苯乙酮、双(羟甲基)咪唑烷基脲、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、咪唑烷基脲、甲基异噻唑啉酮、天然植物防腐剂、抗菌肽中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，其特征在于：

所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，包括以重量百分比计的以下组分：肌肽5-20％，超低分子铁皮石斛多糖提取物5-65％，二裂酵母发酵产物溶胞物10-65％，基础组分20-80％。

5.根据权利要求2所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，其特征在于：

所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，包括以重量百分比计的以下组分：肌肽5-20％，超低分子量铁皮石斛多糖提取物5-55％，二裂酵母发酵产物溶胞物10-50％，基础组分30-80％。

6.根据权利要求2所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，其特征在于：

所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，包括以重量百分比计的以下组分：肌肽5％，超低分子量铁皮石斛多糖提取物30％，二裂酵母发酵产物溶胞物35％，基础组分占30％。

7.根据权利要求4-6任一项所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物，其特征在于：

所述的基础组分为水、戊二醇和己二醇的混合物，其中，戊二醇在具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物中的重量百分数为2％，己二醇在具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物中的重量百分数为2％，余量为水。

8.一种根据权利要求7所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

按配比将肌肽加入去离子水中，加热至40～60℃搅拌直至肌肽全部溶解，冷却至25～30℃；按配比加入二裂酵母发酵产物溶胞物、超低分子铁皮石斛多糖提取物，混合并搅拌均匀；再加入提前混合均匀的戊二醇和己二醇，搅拌均匀，即得到具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物。

9.根据权利要求1-7任一项所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物在制备化妆品中的应用，其特征在于：

所述的化妆品为化妆水、精华液、乳液、膏霜或面膜。

10.根据权利要求9所述的具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物在制备化妆品中的应用，其特征在于所述的化妆品中具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物的施用量为1-40wt％。