CN112999409B - 一种蛋白质/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，公开了一种蛋白质/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用。该蛋白质/壳聚糖水凝胶，包括蛋白质、壳聚糖和有机酸。该蛋白质/壳聚糖水凝胶中的蛋白质具有一定的缓释作用，随着时间的增加，蛋白质逐渐溶出，所以蛋白质/壳聚糖水凝胶对酪氨酸酶的抑制率逐渐增加，同时提高了蛋白质/壳聚糖水凝胶的美白效果。另外，该蛋白质/壳聚糖水凝胶具有优异的美白效果和抗氧化性，而且还具有抗菌性，良好的抗菌性有助于稳定蛋白质/壳聚糖水凝胶的美白效果和抗氧化性。

Description

一种蛋白质/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，特别涉及一种蛋白质/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，是内部和外部环境之间的必要屏障，因此其每天都会受到外源性刺激的袭击。有害外源性刺激，例如有害微生物、紫外线(UV)辐射、过敏原等会导致皮肤受伤和/或感染，从而导致伤口、炎性皮肤病、皮肤老化或皮肤癌变(参见文献International Journal of Molecular.Science,2018:19(1),70.)。
鲑鱼(salmon salar)，俗称“三文鱼”，由“Salmon”音译而来，是世界著名的多脂鱼类，主要分布在太平洋北部及欧洲、亚洲、美洲的北部地区。三文鱼中蛋白质含量高，具有很高的营养价值，享有“水中珍品”的美誉。三文鱼鱼籽形似红色珍珠，是深海冷水鱼卵，营养十分丰富，含有各种氨基酸，具有很好的保湿、抗氧化、美白等效果。但现有技术中，单独的三文鱼鱼籽提取液的抗氧化和美白效果没有得到充分的发挥。而且单独的三文鱼鱼籽提取液稳定性较差，容易受细菌污染，进一步也会降低三文鱼鱼籽提取液的抗氧化和美白效果。
因此，提供一种新的产品，该产品能充分发挥鱼类蛋白质的作用，特别是充分发挥三文鱼鱼籽提取液的抗氧化和美白效果，是十分有必要的。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种蛋白质/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用，所述蛋白质/壳聚糖水凝胶具有优异的美白效果和抗氧化性，而且还具有抗菌性，良好的抗菌性有助于稳定蛋白质/壳聚糖水凝胶的美白效果和抗氧化性。所述蛋白质主要来源于鱼籽，可充分利用和发挥鱼籽提取液的抗氧化和美白效果。
本发明的第一方面提供一种蛋白质/壳聚糖水凝胶(蛋白质/壳聚糖水凝胶简称Pro/CS水凝胶)。
具体的，一种蛋白质/壳聚糖水凝胶，包括蛋白质、壳聚糖和有机酸。
优选的，所述蛋白质为鱼籽蛋白质。所述鱼籽蛋白质可通过对鱼籽进行水提取法提取制得。
进一步优选的，所述蛋白质选自三文鱼鱼籽蛋白质、黑鱼鱼籽蛋白质或鲟鱼鱼籽蛋白质中的至少一种。
壳聚糖的加入可以提高蛋白质的稳定性，进一步提高蛋白质/壳聚糖水凝胶整体的抗菌性能。
优选的，所述壳聚糖的脱乙酰度≥90％；进一步优选的，所述壳聚糖的脱乙酰度≥91％。
优选的，所述壳聚糖在20℃下，粘度<200mPa·s；进一步优选的，所述壳聚糖在20℃下，粘度<170mPa·s。
优选的，所述有机酸选自乙酸和/或柠檬酸；进一步优选的，所述有机酸为乙酸。本发明所述有机酸有助于壳聚糖的溶解，由于壳聚糖具有大量亲水性基团，在酸性环境中，有助于亲水性较强的蛋白质通过氢键或静电相互作用与壳聚糖结合，因此，蛋白质/壳聚糖水凝胶中的蛋白质具有一定的缓释作用，随着时间的增加，蛋白质逐渐溶出，使得蛋白质/壳聚糖水凝胶对酪氨酸酶的抑制率逐渐增加，同时提高了蛋白质/壳聚糖水凝胶的美白效果。
优选的，所述蛋白质/壳聚糖水凝胶还包括水；进一步优选的，所述水为去离子水。
优选的，一种蛋白质/壳聚糖水凝胶，按重量份数计，包括蛋白质0.1-10份、壳聚糖90-99.9份。
进一步优选的，一种蛋白质/壳聚糖水凝胶，按重量份数计，包括蛋白质1.94-4.0份、壳聚糖96-98.06份。
本发明的第二方面提供一种蛋白质/壳聚糖水凝胶的制备方法。
具体的，一种蛋白质/壳聚糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将各组分混合，制得所述蛋白质/壳聚糖水凝胶。
优选的，一种蛋白质/壳聚糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将所述壳聚糖溶解在有机酸的水溶液中，制得壳聚糖溶液，然后加入蛋白质，搅拌混合，制得所述蛋白质/壳聚糖水凝胶。
优选的，所述有机酸的水溶液的体积浓度为1-5％(即有机酸在水中的体积浓度为1-5％)；进一步优选的，所述有机酸溶液的体积浓度为1-4％。
优选的，所述蛋白质以鱼籽提取液的形式加入。即所述鱼籽提取液含蛋白质。
优选的，所述鱼籽提取液的制备过程为：将鱼籽加入水中搅拌、破碎，然后过滤，取滤液，制得所述鱼籽提取液。
优选的，所述鱼籽提取液中蛋白质的浓度为60-95μg/mL；进一步优选的，所述鱼籽提取液中蛋白质的浓度为80-85μg/mL。所述鱼籽提取液中蛋白质的浓度可通过BCA试剂盒(市售的用于测定蛋白质浓度的试剂盒)测定，如果鱼籽提取液中蛋白质的浓度过大，可通过添加去离子水进行稀释。满足该蛋白质浓度的鱼籽提取液，有助于提高复合水凝胶材料的抗氧化性和美白效果。
优选的，所述鱼籽提取液的制备过程，所述鱼籽与水的质量比为1:(5-25)；进一步优选的，所述鱼籽提取液的制备过程，所述鱼籽与水的质量比为1:(10-18)；更优选的，所述水为去离子水。
优选的，所述壳聚糖溶液与蛋白质的体积比为1:(0.1-2.5)；进一步优选的，所述壳聚糖溶液与蛋白质的体积比为1:(0.5-2)。
本发明的第三方面提供一种蛋白质/壳聚糖水凝胶的应用。
上述蛋白质/壳聚糖水凝胶在制备抗菌、抗氧化或美白产品中的应用。
优选的，所述抗菌、抗氧化或美白产品包括医用产品或化妆品。
优选的，所述医用产品为医用敷料。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明所述蛋白质/壳聚糖水凝胶包括蛋白质、壳聚糖和有机酸，所述有机酸有助于壳聚糖的溶解，壳聚糖具有大量亲水性基团，在酸性环境中，亲水性较强的蛋白质通过氢键或静电相互作用与壳聚糖结合，因此，蛋白质/壳聚糖水凝胶中的蛋白质具有一定的缓释作用，随着时间的增加，蛋白质逐渐溶出，使得蛋白质/壳聚糖水凝胶对酪氨酸酶的抑制率逐渐增加，从而显著提高了蛋白质/壳聚糖水凝胶的美白效果。
(2)本发明所述蛋白质/壳聚糖水凝胶具有优异的美白效果和抗氧化性，而且还具有抗菌性。所述蛋白质主要来源于鱼籽，可充分利用和发挥鱼籽提取液的抗氧化和美白效果。
(3)本发明所述蛋白质/壳聚糖水凝胶绿色环保、可生物降解。
(4)本发明所述制备蛋白质/壳聚糖水凝胶的步骤简单、反应条件温和、安全无毒。
附图说明
图1为实施例1制备蛋白质/壳聚糖水凝胶的流程示意图；
图2为实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对酪氨酸酶抑制率图；
图3为实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对DPPH自由基清除率图；
图4为实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对ABTS清除率示意图；
图5为实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1：蛋白质/壳聚糖水凝胶的制备
一种蛋白质/壳聚糖水凝胶，包括蛋白质3.846份、壳聚糖96.154份、乙酸1000份。
一种蛋白质/壳聚糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取200mg壳聚糖溶解在100mL体积浓度为2％的乙酸溶液中，20℃下搅拌12h形成均匀溶液，得到壳聚糖溶液；
(2)将三文鱼鱼籽从-20℃冰箱中取出并解冻后，精确称取1g，用去离子水清洗后放置于装有20mL去离子水的烧杯中，用悬臂式搅拌器搅拌30min，将溶液用滤纸过滤以除去不溶杂质，取滤液，即得到三文鱼鱼籽提取液(三文鱼鱼籽提取液含三文鱼鱼籽蛋白质)，用BCA试剂盒确定蛋白质浓度，并用去离子水稀释到80μg/mL，得到含三文鱼鱼籽蛋白质的三文鱼鱼籽提取液(即采用水提取法得到含三文鱼鱼籽蛋白质的三文鱼鱼籽粗提液)；
(3)吸取5mL壳聚糖溶液和5mL三文鱼鱼籽提取液搅拌混匀，即得到蛋白质/壳聚糖水凝胶(蛋白质/壳聚糖水凝胶中，蛋白质以三文鱼鱼籽提取液的形式加入，其中，三文鱼鱼籽提取液中蛋白质的浓度为80μg/mL)。
图1为实施例1制备蛋白质/壳聚糖水凝胶的流程示意图。
产品效果测试
1.美白效果测试
酪氨酸酶，是一种含铜的金属酶，广泛分布于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶主要参与两个反应过程：催化L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列反应后，形成黑色素。因此酪氨酸酶与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关，因此对实施例1制得的蛋白质/壳聚糖水凝胶进行了体外酪氨酸酶抑制活性的考察，具体内容如下：
根据表1，取96孔板，加入pH为6.5的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)、样品及浓度为0.2mg/mL的酪氨酸，在37℃培养箱中保温10min后取出96孔板，加入浓度为80μg/mL的酪氨酸酶，马上放置在37℃培养箱中保温；定时用酶标仪在475nm处定时测定吸光值；阳性对照是浓度为280μg/mL的熊果苷；
根据以下公式计算酪氨酸酶抑制率：
酪氨酸酶抑制率(％)＝[1-(A1-A2)/(A3-A4)]*100％；
A1表示样品管吸光值，即样品与酪氨酸酶反应后溶液吸光值；
A2表示样品本底吸光值；
A3表示酶反应管吸光值的3次平均值；
A4表示溶剂本底吸光值。
表1：样品加液要求
Figure BDA0002937880350000051
Figure BDA0002937880350000061
图2为实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对酪氨酸酶抑制率图；从图2可知，随着时间的增加，实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对酪氨酸酶抑制率也是增加的，在15min时，阳性对照熊果苷对酪氨酸酶抑制率仅为90％，而实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对酪氨酸酶抑制率达到196％；在75min和130min时，熊果苷对酪氨酸酶抑制率分别为149％、152％，而实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对酪氨酸酶抑制率分别为247％、272％，这表明实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶具有优异的长时间美白效果。
2.抗氧化性效果测试
2.1.DPPH自由基清除实验
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(简称DPPH)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。DPPH含有三个苯环、一个带孤对电子的氮原子，其乙醇溶液呈紫红色，在517nm处有强吸收，当加入自由基清除剂时，DPPH孤对电子被配对使其颜色由紫色向黄色变化，在517nm处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈定量关系，通过检测生物试剂对DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。以下测试实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对DPPH自由基的清除率，具体内容如下：
利用96孔板法，根据表2，设置样品孔(T)、样品本底(T0)、DPPH孔(C)和溶剂本底(C0)，每组实验(T)需设立3个平行，同时DPPH管(C)也需设立3个平行；吸取100μL相同浓度的样品溶液加入到在样品孔(T)和样品本底(T0)中；阳性对照是浓度为10μg/mL的VC(维生素C，纯度≥96％)；吸取100μL无水乙醇加入到DPPH孔(C)和溶剂本底(C0)中；吸取100μL浓度为0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液加入到样品孔(T)和DPPH孔(C)中；吸取100μL无水乙醇加入到样品本底(T0)和溶剂本底(C0)，用手轻轻摇匀，室温下避光静置；定时在517nm处测定吸光值；
根据以下公式计算DPPH自由基清除率：
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(T-T0)/(C-C0)]*100％；
T表示样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；
T0表示样品本底吸光值；
C表示DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；
C0表示溶剂本底吸光值。
表2：样品加液要求
T-样品管 T<sub>0</sub>-样品底本 C-DPPH管 C<sub>0</sub>-溶剂本底
样品溶液(μL) 100 100 - -
无水乙醇(μL) - - 100 100
DPPH·乙醇溶液(μL) 100 - 100 -
无水乙醇(μL) - 100 - 100
平行次数 3 1 3 1
图3为实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对DPPH自由基清除率图；由图3可知，VC和实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对DPPH自由基清除率均随着时间的增加而增加，VC变化幅度较小，清除率在50％左右浮动，而实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对DPPH自由基清除率从55％上升到72％，这表明实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶能够有效清除DPPH自由基，且表现出了一定的缓释效果。
2.2.ABTS清除实验
ABTS(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基对大多数抗氧化剂具有反应性，包括酚类、硫醇和抗坏血酸等。ABTS法测定总抗氧化能力的原理是，ABTS在相应的氧化剂作用下会氧化成ABTS+，其颜色呈绿色。在抗氧化剂存在的条件下，ABTS+的产生则会被抑制，在734nm或405nm测定ABTS的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。具体内容如下：
准确配制浓度为7.0mmol/L的ABTS溶液和2.45mmol/L的过硫酸钾溶液，将二者在室温下等体积混合后避光反应12h，形成ABTS母液；0.8mL ABTS工作液用10mmol/L pH为7.4的PBS稀释(40-50倍)，要求在常温下734nm处吸光值为0.7±0.02；取800μL ABTS母液与300μL样品混合，在室温下避光反应6min后测定其在734nm处的吸光度。空白对照组用PBS缓冲液替代样品，阳性对照用0.3mmol/L的Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)标准液。
按以下公式计算ABTS清除率：ABTS清除率(％)＝[Aj-(Ai-A0)]/Aj*100％；
A0为加入样品和无水乙醇的吸光度；
Ai为加入样品和ABTS工作液的吸光度；
Aj为不加样品，加入95％乙醇与ABTS工作液的吸光度。
图4为实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对ABTS清除率示意图，阳性对照Trolox对ABTS清除率为57％，实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对ABTS清除率为38％。
3.抗菌效果测试
选取金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表，用于测试实施例1制备得到的蛋白质/壳聚糖水凝胶的杀菌作用。
细菌生长曲线：细菌生长曲线是将少量的单细胞微生物接种到一定容积的液体培养基后，在适宜的条件下培养，定时取样测定细胞数量。以时间为横坐标，以吸光度为纵坐标，可得出一条生长曲线，曲线显示了细菌生长繁殖的四个时期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。样品杀菌效果越好，细菌含量越低，以此来判断样品的杀菌效果。具体步骤为(下述所用器材及液体均事先灭菌)：
细菌的培养：从-20℃冰箱中取出装有菌株的冻存管，使之融化，然后接种于胰蛋白胨大豆肉汤(Lysogeny Broth，LB)培养基中，并在37℃摇床培养，备用。一般提前一天培养。
在96孔板中每孔加入100μL细菌溶液，在600nm波长下测定其OD值(光密度，光密度可对应出活菌数)，OD值为1时对应每毫升溶液有1×109个细菌；将菌株用10mmol/L的PBS稀释到每毫升溶液有1×105个细菌；在标记好的1.5mL的离心管中加入200μL细菌溶液和400μL样品溶液，混合均匀，37℃恒温培养箱中培养2h；取4mL的离心管对应做好标记，各加入2mLLB培养基，吸取100μL培养2h后的细菌/样品混合溶液加入到对应编号离心管中，漩涡震荡10s混合均匀；精确吸取100μL上述离心管的混合溶液加入到96孔板中，一个样一列，然后置于37℃恒温培养箱中培养，每间隔一定的时间测其OD值，直至细菌生长进入衰亡期；以时间为横坐标，以吸光度为纵坐标，做细菌生长曲线。
图5为实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的生长曲线；从图5中可以看出，相比于对照组，实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)均显示出了杀菌效果，对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于对大肠杆菌的抑制效果。在上述实验条件下，实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶可完全抑制金黄色葡萄球菌的生长。此差异可能与细菌细胞壁结构有关。与金黄色葡萄球菌相比，大肠杆菌的细胞壁具有额外的脂多糖外膜层，可作为屏障保护大肠杆菌免受实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶的损伤。
为了进一步验证实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶的杀菌效果，通过涂板计数的方式计算抑菌率，具体步骤为(下述所用器材及液体均事先灭菌)：
将金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)用PBS稀释至每毫升约5.0×106-5.0×107个细菌；将5.0mL样品置20℃水浴锅中水浴5min后，再加入0.1mL菌悬液，迅速混匀并立即计时；共培养2h后，吸取混合溶液，用PBS进行10倍系列稀释；涂板，置于37℃培养箱中24h，计数；用PBS代替样品，作为阳性对照；按照以下公式计算抑菌率：
X＝(A-B)/B*100％；
其中，X：抑菌率，％；
A：阳性对照组菌落数量；
B：试验组菌落数量；
判定标准为：抑菌率≥50-90％，视为具有抑菌作用；抑菌率≥90％，判为较强抑菌作用。在上述实验条件下，实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶对金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)均有较强抑菌作用：对大肠杆菌(E.coli)的抑菌率为99.17％，对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌率为99.99％，与生长曲线实验结果保持一致。
应用例1
一种化妆品，包括实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶。该化妆品具有良好的抗菌、抗氧化和美白效果。
应用例2
一种医用敷料，包括实施例1制备的蛋白质/壳聚糖水凝胶。该医用敷料具有良好的抗菌和抗氧化效果。
另外，在本发明所记载的技术方案内，例如，用黑鱼鱼籽提取液或鲟鱼鱼籽提取液代替三文鱼鱼籽提取液，或者改变有机酸的种类，都能获得与实施例1相类似的技术效果，本发明实施例1记载的技术方案对应的技术效果较佳。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制本发明的技术方案，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，在不偏离本发明权利要求书所限定的范围内，都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种蛋白质/壳聚糖水凝胶，其特征在于，由蛋白质、壳聚糖、有机酸和水组成；
所述蛋白质为鱼籽蛋白质；
按重量份数计，包括蛋白质0.1-10份、壳聚糖90-99.9份；
所述蛋白质/壳聚糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将所述壳聚糖溶解在所述有机酸的水溶液中，制得壳聚糖溶液，然后加入蛋白质，搅拌混合，制得所述蛋白质/壳聚糖水凝胶；
所述蛋白质以鱼籽提取液的形式加入；
所述鱼籽提取液的制备过程为：将鱼籽加入水中搅拌、破碎，然后过滤，取滤液，制得所述鱼籽提取液。
2.根据权利要求1所述的蛋白质/壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述蛋白质选自三文鱼鱼籽蛋白质、黑鱼鱼籽蛋白质或鲟鱼鱼籽蛋白质中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的蛋白质/壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述有机酸选自乙酸和/或柠檬酸。
4.根据权利要求3所述的蛋白质/壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述有机酸为乙酸。
5.权利要求1-4中任一项所述的蛋白质/壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述壳聚糖溶解在所述有机酸的水溶液中，制得壳聚糖溶液，然后加入蛋白质，搅拌混合，制得所述蛋白质/壳聚糖水凝胶；
所述蛋白质以鱼籽提取液的形式加入。
6.权利要求1-4中任一项所述的蛋白质/壳聚糖水凝胶在制备抗菌、抗氧化或美白产品中的应用。
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