MXPA04012978A

MXPA04012978A - Proceso y material para la produccion de glucosamina y n-acetilglucosamina.

Info

Publication number: MXPA04012978A
Application number: MXPA04012978A
Authority: MX
Inventors: Cyron Don
Original assignee: Arkion Life Sciences Llc D B A
Priority date: 2002-07-01
Filing date: 2003-07-01
Publication date: 2005-09-12
Also published as: AU2003280305A1; EP1576106A4; EP1576106A2; US8124381B2; EP1576106B1; WO2004003175A2; WO2004003175A3; KR101035043B1; AU2003280305B2; US20120009627A1; JP2013009690A; CA2488853A1; CN105039464A; JP2006508643A; JP2010259449A; ZA200410246B; CN101365785A; CA2488853C; US20040091976A1; IL166024A0

Abstract

Se describe un metodo biosintetico para producir glucosamina y N-acetilglucosamina. Dicho metodo incluye la fermentacion de un cicroorganismo modificado geneticamente para producir glucosamina y N-acetilglucosamina. Tambien se describen microorganismo modificados geneticament que son utiles para la produccion de glucosamina y N-acetilglucosarnina. Ademas, se describen metodos de recuperacion de la N-acetilgiucosamina que ha sido producida mediante un proceso de fermentacion, incluyendo metodos que dan como resultado N- acetilgiucosamina de alta pureza. Tambien se describe un metodo para producir glucosamina a partir de N-acetilgucosamina.

Description

PROCESO Y MATERIALES PARA LA PRODUCCIÓN DE GLUCOSAMINA Y N-ACETILG LUCOS AMI A Campo del Invento La presente invención se refiere a un método para producir glucosamina y N-acetilglucosamina mediante fermentación. La presente invención también se refiere a cepas de microorganismos modificadas en forma genética útiles para producir glucosamina y N-acetilglucosamina. La presente invención también se refiere a un método para recuperar N-acetilglucosamina o glucosamina, a partir de un proceso de fermentación. La presente invención también se refiere a un método para producir glucosamina a partir de una fuente de N-acetilglucosamina. Antecedentes del Invento Los aminoazúcares normalmente se encuentran en la forma de residuos de monómero en oligosacáridos y polisacáridos complejos. La glucosamina es un derivado amino de la glucosa, de azúcar simple. La N-acetilglucosamina es un derivado de glucosamina acetilado. La glucosamina, N-acetilglucosamina y otros aminoazúcares, son constituyentes importantes de muchos polisacáridos naturales. Por ejemplo, los polisacáridos que contienen aminoazúcares pueden formar materiales estructurales para células, análogos a proteínas estructurales.

La glucosamina se fabrica en la forma de un producto nutracéutico con aplicaciones en el tratamiento de condiciones osteoartríticas en animales y humanos, entre otras condiciones. El mercado de la glucosamina está experimentando un importante crecimiento. Además, no se espera una erosión importante del precio en el mercado mundial de la glucosamina. La N-acetilglucosamina también es un agente farmacológico valioso en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades. La N-acetilglucosamina no tiene efectos secundarios negativos establecidos. Ya que la N-acetilglucosamina es un componente valioso e importante de la síntesis de proteína en el cuerpo animal, tiene un efecto positivo en la regeneración de tejido, la N-acetilglucosamina tiene un potencial terapéutico en la prevención y/o tratamiento de una amplia variedad de enfermedades tales como artritis, alergias por alimentos, enfermedad de intestino inflamatorio (IBD), diverticulitis, formas agudas y crónicas de artritis reumatoide y osteoartritis, así como las condiciones patológicas que surgen a partir de padecimientos metabolicos de los tejidos osteoarticulares. La glucosamina se obtiene normalmente a través de hidrólisis de quitina, un carbohidrato complejo derivado de N-acetil-D-glucosamina. Como alternativa, la glucosamina también puede producirse en forma diversa mediante hidrólisis de ácido de quitosanos acetilados. La quitina, un copolímero de N-acetilglucosamina y glucosamina, es una substancia natural común que se encuentra en artrópodos y hongos. Se puede obtener a partir de fuentes costosas como desechos de artrópodos, por ejemplo: crustáceos (exoesqueletos de langosta, camarón, kril, cangrejo y gambas); insectos utilizados para biodegradar asados de cerdo, como las larvas de mosca; y más recientemente a partir de la biomasa fúngica de desperdicio que se utiliza en la producción de ácido cítrico. El producto final, sales de glucosamina, es relativamente costoso debido al contenido de quitina relativamente bajo en fuentes de desechos que requieren que se procesen grandes volúmenes de desperdicio con el objeto de obtener cantidades de producto relativamente pequeñas, y debido a que el propio procesamiento tiene una producción y energía relativamente baja y es químicamente intenso. La práctica industrial común, es purificar la quitina tratándola con combinaciones de ácidos y bases para eliminar minerales, proteínas y otras impurezas que acompañan el material de partida de asaduras, y posteriormente despolimerizar y desacetilar la quitina en un solo paso para obtener la glucosamina, a través del uso de ácido clorhídrico concentrado en condiciones de altas temperaturas, tiempos prolongados y bajas producciones. La glucosamina en la forma de una base libre, es muy inestable y está sujeta a degradación. En consecuencia, se producen sales estables tales como clorhidrato. Se ofrecen otras combinaciones de sales, que normalmente utilizan el clorhidrato como una base, con el objeto de mimetizar formas que han sido probadas con respecto a su eficacia en preparaciones clínicas, como Viartril y DONA® 200-S. Estas composiciones toman la forma de sales mezcladas con una fórmula molecular de (giucosamina)2 sulfato-(NaCI)2, y (glucosamina)2 sulfato -(KCI)2. Más recientemente, se han investigado las sales de la estructura de (glucosamina)2 bisulfato de sodio - (HCI)2, (glucosamina)2 bisulfato de potasio - (HCI)2), como un medio para proporcionar sales de glucosamina estables, en dosificaciones de sodio y potasio inferiores. La N-acetilglucosamina no está ampliamente disponible en el mercado. Normalmente se produce mediante acetilación de glucosamina utilizando un reactivo de acetilación orgánico, tal como anhídrido acético, un paso costoso y difícil. Estos procesos sufren de producciones deficientes del producto (dentro un rango de conversión de 50% del substrato a glucosamina). Las formas comunes de glucosamina, que se derivan de crustáceos, llevan etiquetas que alertan a los consumidores del potencial de reacciones alérgicas en las personas sensibles a los crustáceos. Los consumidores están buscando cada vez con más frecuencia tener acceso a productos que estén libres de subproductos animales. Además, la disponibilidad del material sin procesar (es decir, una fuente de quitina, tal como costras de cangrejos) se está volviendo cada vez más limitadas. Por consiguiente, existe la necesidad en la industria de un método efectivo en costo para producir altas producciones de giucosamina y N-acetilglucosamina para venta y uso comercial. La Publicación PCT WO 02/66667 describe giucosamina y un método para elaborar giucosamina a partir de biomasas microbianas. Este método de producción supera los problemas asociados con alergias por crustáceos, pero sufre del importante problema de baja producción. Más particularmente, ya que el método depende del desperdicio de biomasa generado en una fermentación que está dedicada a la producción de otros productos, tales como ácido cítrico, dicha cantidad de desperdicio no es suficiente para producir cantidades de giucosamina que cumplan con la creciente demanda del producto en el mercado . La Patente Norteamericana No. 6,372,457, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia, describe un proceso y materiales para la producción de giucosamina mediante fermentación microbiana. Sin embargo, la Patente Norteamericana No. 6,372,457 no describe método alguno para la producción de N-acetilglucosamina.

Sumario del Invento Una modalidad de la presente invención se refiere a un método para producir N-acetilglucosamina mediante fermentación. El método incluye los pasos de: (a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo el cual comprende por lo menos una modificación genética que incrementa la actividad de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; y (b) recolectar un producto producido a partir del paso de cultivo, el cual se selecciona a partir del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina. En un aspecto, la modificación genética para incrementar la actividad de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato proporciona un resultado seleccionado del grupo que consiste de: actividad enzimática incrementada de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; sobreexpresión de acetiltransferasa de gIucosamina-6-fosfato mediante el microorganismo; inhibición reducida del producto de N-acetilglucosamina-6-fosfato de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; y una afinidad incrementada de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato para glucosamina-6-fosfato. En otro aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica una acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato. En otro aspecto, la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica, o al menos aproximadamente el 50% idéntica, o al menos aproximadamente el 70% idéntica con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:34, en donde la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática. En otro aspecto, la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:34. En otro aspecto de esta modalidad de la presente invención, el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que disminuye la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato. La modificación genética para disminuir la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato puede incluir, pero no se limita a, una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la deaminasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo.

En un aspecto de esta modalidad de la presente invención, el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la sintasa de glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la sintasa de glucosamina-6-fosfato. Dicha sintasa de glucosamina-6-fosfato puede incluir una sintasa de glucosamina-6-fosfato que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica, o al menos aproximadamente el 50% idéntica, o al menos aproximadamente el 70% idéntica con una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, y SEQ ID NO:20, en donde la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática. En un aspecto, la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, y SEQ ID NO:20. En un aspecto, la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene una modificación para reducir la inhibición de producto de la sintasa de glucosamina-6-fosfato, tal como se compara con la sintasa de glucosamina-6-fosfato tipo natural. Dicha sintasa de glucosamina-6-fosfato puede incluir, pero no se limita a, una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, y SEQ ID NO:14. En un aspecto adicional, este microorganismo comprende además al menos una modificación genética que disminuye la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato. La modificación genética para disminuir la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato puede incluir, pero no se limita a, una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la deaminasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo. Otra modalidad de la presente invención, se refiere a un método para producir glucosamina ó N-acetilglucosamina mediante fermentación, en donde el método comprende: (a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato; y (b) recolectar un producto producido a partir del paso de cultivo, el cual se selecciona del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina. En este aspecto, la modificación genética proporciona preferentemente un resultado seleccionado del grupo que consiste de la: sobreexpresión de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato mediante el microorganismo, actividad enzimática incrementada de la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato, reacción inversa incrementada de la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato para formar glucosamina-6-fosfato incrementada, una reacción directa reducida de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato para formar fructosa-6-fosfato reducida, afinidad incrementada de la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato para f ructosa-6-fosfato, afinidad reducida de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato para glucosamina-6-fosfato, y una inhibición reducida del producto de gIucosamina-6-fosfato de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una deaminasa de g!ucosamina-6-fosfato. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica una deaminasa de glucosamina-6-fosfato tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, la deaminasa de glucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica, o al menos aproximadamente el 50% idéntica, o al menos aproximadamente el 70% idéntica, a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:42, en donde la deaminasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática. En un aspecto, la deaminasa de glucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:42. En un aspecto de esta modalidad, el microorganismo comprende además una modificación genética para disminuir la actividad de la sintasa de glucosamina-6-fosfato. Por ejemplo, la modificación genética para disminuir la actividad de la sintasa de glucosamina-6-fosfato puede incluir, pero no se limita a, una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica una sintasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo. En otro aspecto de esta modalidad, el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de la N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato. La modificación genética puede proporcionar un resultado seleccionado de: actividad enzimática incrementada de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; sobreexpresión de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato mediante el microorganismo; inhibición reducida del producto de N-acetiIglucosamina-6-fosfato de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; y afinidad incrementada de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato para glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, ei microorganismo se transforma con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato, tal como se describe para la modalidad previa de la presente invención. Se han descrito varios aspectos de la N-acetiltransferasa de giucosamina-6-fosfato en la modalidad anterior y están comprendidos en la presente invención. En un aspecto, el microorganismo comprende además una modificación genética para disminuir la actividad de la sintasa de glucosamina-6-fosfato. Dicha modificación puede incluir, pero no se imita a, una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la sintasa de gIucosamina-6-fosfato en el microorganismo. Aún en otro aspecto de esta modalidad, el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de la N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato. La modificación genética puede proporcionar un resultado seleccionado del grupo que consiste de: actividad enzimática incrementada de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato; actividad enzimática reducida de uridiltransferasa de N-acet¡Iglucosamina- -fosfato; sobreexpresión de una enzima que tiene actividad de N-acetiitransferasa de glucosamina-1 -fosfato mediante el organismo, afinidad incrementada de N-acetiltransferasa de glucosamina-1-fosfato para glucosamina-1-fosfato; afinidad reducida de una uridiltransferasa de N- aceti ltransferasa/N-acet¡lglucosam¡n a- 1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato para N-acetiIglucosamina-1 -fosfato; y una inhibición reducida del producto de N-acetilglucosamina-1-fosfato de la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato. En un aspecto, el microorganismo comprende una uridiltransferasa bifuncional de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato, en donde se incrementa la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato. En otro aspecto, el microorganismo se transforma con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato o una secuencia de ácido nucleico que codifica una N-acetiltransferasa de glucosamina- -fosfato. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que codifica una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato o una N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato o la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato, respectivamente. En otro aspecto, la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:56, en donde la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato tiene actividad enzimática de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato. En otro aspecto, la uridiltransferasa de N-acetiitransferasa/N-acetilgIucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato, tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:56. En otro aspecto, la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina- -fosfato de glucosamina-1 -fosfato truncada tiene actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato y una actividad reducida de uridiltransferasa de N- acetilglucosamina-1 -fosfato o ninguna actividad, que incluye pero no se limita a, una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1-fosfato truncada, que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos de aproximadamente el 35% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:58. En un aspecto, la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de gluctisamina-1 -fosfato truncada tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:58. En este aspecto, el microorganismo puede comprender además una modificación genética para disminuir la actividad de la sintasa de gIucosamina-6-fosfato, tal como se describió anteriormente. Aún otra modalidad de la presente invención, se refiere a un método para producir glucosamina ó N-acetilglucosamina mediante fermentación, en donde el método comprende: (a) cultivar en el medio de fermentación un microorganismo que comprende al menos una modificación genética que disminuye la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato y al menos una modificación genética que incrementa la actividad de N-acetíltransferasa de glucosamina-1 -fosfato; y (b) recolectar un producto producido a partir de un paso de cultivo, en donde el producto se selecciona del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina. En un aspecto, la modificación genética para disminuir la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato comprende una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la deaminasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo. En otro aspecto, la modificación genética para incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato proporciona resultados seleccionados del grupo que consiste de: actividad enzimática incrementada de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato, actividad enzimática reducida de uridiltransferasa de N-acetilglucosamina-1 -fosfato; sobreexpresión de una enzima que tiene actividad de N-acetiitransferasa de glucosamina-1 -fosfato mediante el microorganismo; afinidad incrementada de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato para glucosamina-1 -fosfato; afinidad reducida de una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato para N-acetilglucosamina-1-fosfato; y una inhibición reducida del producto de N-acetilglucosamina-1-fosfato de la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato. Se han descrito en las modalidades anteriores, y están también comprendidos en la presente invención, diversos aspectos de una uridiltransferasa de N-aceti Itransferasa/N-acetilglucosam i na- 1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato b ¡funcional. En un aspecto de esta modalidad, el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la sintasa de glucosamina-6-fosfato. Se han descrito en las modalidades anteriores y están comprendidos en la presente invención, diversos aspectos de dicha modificación. Aún otra modalidad de la presente invención, se refiere a un método para producir glucosamina ó N-acetilglucosamina mediante fermentación, en donde el método comprende: (a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que comprende una acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato endógena y al menos una modificación genética para incrementar la actividad de la sintasa de glucosamina-6-fosfato; y (b) recolectar un producto producido a partir de un paso de cultivo, en donde el producto se selecciona del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina, gIucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetiiglucosamina. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la sintasa de glucosamina-6-fosfato. Se han descrito anteriormente y están comprendidos en la presente invención, diversos aspectos de esta modificación. En un aspecto, el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que disminuye la actividad de la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato, tal como se describió anteriormente. En un aspecto, el método es un método para producir N-acetilglucosamina mediante fermentación, y en donde el paso de recolección, comprende recolectar un producto producido a partir de un paso de cultivo, en donde el producto se selecciona del grupo que consiste de: N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina. En un aspecto de cualesquiera de las modalidades antes descritas, la expresión de cualesquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinante referenciadas anteriormente es inducible mediante, pero sin limitarse a, lactosa. En un aspecto, el microorganismo comprende además una modificación genética para reducir la inhibición de la inducción de transcripción mediante lactosa. Dicha modificación genética puede incluir, pero no se limita a, eliminación o desactivación parcial o total de un gen que codifica una proteína de represión Lacl. En cualesquiera de las modalidades de la presente invención antes identificadas relacionadas con un método para producir glucosamina ó N-acetilglucosamina mediante fermentación, puede aplicar la descripción que se encuentra a continuación. En un aspecto, el paso de cultivo incluye el paso de mantener la fuente de carbono a una concentración de desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 5% en el medio de fermentación. En otro aspecto, el paso de cultivo se lleva a cabo en un medio de fermentación que comprende extracto de levadura. Aún en otro aspecto, el paso de cultivo se lleva a cabo en un medio de fermentación que comprende una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste de glucosa, fructosa, azúcar de pentosa, lactosa y ácido glucónico. El azúcar de pentosa puede incluir, pero no se limita a, ribosa, xilosa y arabinosa. En otro aspecto, el paso de cultivo se lleva a cabo en un medio de fermentación que comprende glucosa y ribosa, y en otro aspecto, el paso de cultivo se lleva a cabo en un medio de fermentación que comprende glucosa y ácido glucónico. En un aspecto, el paso de cultivo se lleva a cabo a una temperatura de desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 45°C, y en otro aspecto, a una temperatura de aproximadamente 37°C. En un aspecto, el paso de cultivo se lleva a cabo en un pH de desde aproximadamente pH 4 hasta aproximadamente pH 7.5, y en otro aspecto, en un pH de desde aproximadamente pH 6.7 hasta aproximadamente pH 7.5, y aún en otro aspecto, en un pH de desde aproximadamente pH 4.5 hasta aproximadamente pH 5. En cualesquiera de las modalidades antes descritas de un método para producir glucosamina ó N-acetilglucosamina mediante un proceso de fermentación, el microorganismo puede incluir cualesquiera de uno o más de las siguientes modificaciones. En un aspecto, el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de fosfoglucoisomerasa en el microorganismo. Por ejemplo, el microorganismo puede transformarse con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la fosfoglucoisomerasa, la cual puede incluir una fosfoglucoisomerasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:105. En otro aspecto, el microorganismo comprende además una eliminación o desactivación parcial o total de fosfofructocinasa en el microorganismo. En otro aspecto, el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de sintasa de glutamina. Por ejemplo, el microorganismo puede transformarse con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la sintetasa de glutamina, la cual puede incluir una sintetasa de glutamina que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89. En otro aspecto, el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato. Por ejemplo, el microorganismo puede transformarse con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, la cual puede incluir una deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:95. En otro aspecto, el microorganismo comprende además una eliminación o desactivación parcial o total de genes que codifican enzimas responsables de la síntesis de glicógeno o en el microorganismo, incluyendo pero sin limitarse a, pirofosforilasa de ADP-glucosa, sintasa de glicógeno y una enzima de ramificación. Preferentemente, ninguna de las modificaciones antes descritas inhibe la capacidad del microorganismo para metabolizar galactosa. En cualesquiera de las modalidades antes descritas de un método para producir glucosamina y/o N-acetilglucosamina mediante fermentación, el paso de recolección puede incluir recuperar un producto intracelular a partir del microorganismo seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y glucosamina o recuperar un producto extracelular a partir del medio de fermentación seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina y N-acetilglucosamina. En un aspecto, este paso incluye un paso seleccionado de: (a) purificar un producto seleccionado del grupo que consiste de glucosamina y N-acetilglucosamina a partir del medio de fermentación; (b) recuperar un producto seleccionado del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina-1 -fosfato a partir de los microorganismos; (c) desfosforilar un producto seleccionado del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato y glucosamina-1 -fosfato para producir glucosamina; y (d) desfosforilar un producto seleccionado del grupo que consiste de N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1 -fosfato para producir N-acetilglucosamina; (e) tratar un producto seleccionado del grupo que consiste de N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1-fosfato para producir un producto de glucosamina seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina, glucosamina-6-fosfato, y glucosamina-1 -fosfato. En un aspecto, el paso (e) comprende hidrolizar el producto seleccionado del grupo que consiste de: N-acetilglucosamina, N-aceti!glucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina-1 -fosfato, bajo condiciones de ácido y calor o mediante desacetilación enzimática. En un aspecto, la N-acetilglucosamina producida mediante el método de fermentación, se recupera precipitando sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación. En otro aspecto, la N-acetilglucosamina producida a través del método de fermentación se recupera mediante cristalización de sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación . Otra modalidad de la presente invención, se refiere a cualesquiera de los microorganismos modificados en forma genética antes descritos. El microorganismo modificado en forma genética en cualesquiera de las modalidades antes descritas, puede incluir, pero no se limita a, bacterias y hongos. En un aspecto, el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de bacterias y levadura. Las bacterias adecuadas incluyen, pero no se limitan a, bacterias de un género seleccionado del grupo que consiste de: Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, y Streptomyces. Las bacterias adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, bacterias procedentes de una especie seleccionada del grupo que consiste de: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacülus Hcheniformis, Lactobacillus brevis, Pseudomonas aeruginosa y Streptomyces lividans. Las levaduras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, levadura de un género seleccionado del grupo que consiste de: Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluveromyces, y Phaffia. La levadura adecuada adicional incluye, pero no se limita a, levadura procedente de una especie seleccionada del grupo que consiste de: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, P. canadensis, Kluyveromyces marxianus y Phaffia rhodozyma. Los hongos adecuados incluyen, pero no se limitan a, hongos procedentes de un género seleccionado del grupo que consiste de: Aspergillus, Absidia, Rhizopus, Chrysosporium, Neurospora y Trichoderma . Los hongos adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a, hongos procedentes de una especie seleccionada del grupo que consiste de Aspergillus niger, A. nidulans, Absidia coerulea, Rhizopus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, N- intermedia y Trichoderm reesei. Aún otra modalidad de la presente invención, selecciona un método para producir N-acetilglucosamina, en donde el método comprende: (a) obtener un caldo de fermentación que contiene N-acetilglucosamina solubilizada que es un producto de un proceso de fermentación; y (b) recuperar sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación. En un aspecto, el método incluye además eliminar material celular del caldo de fermentación. En un aspecto, el método incluye además decolorar el caldo de fermentación. Dicho paso de decoloración puede incluir, pero no se limita a, cristalizaciones múltiples de N-acetilglucosamina, tratamiento de carbono activado y decoloración cromatográfica. En un aspecto, el método incluye además el paso de contactar el caldo de fermentación con una resina de intercambio de iones. Por ejemplo, el paso de contactar el caldo de fermentación con una resina de intercambio de iones puede incluir, pero no se limita a, contactar el caldo de fermentación con una resina de intercambio de aniones de una resina de intercambio de cationes. El paso de contactar el caldo de fermentación con una resina de intercambio de aniones de una resina de intercambio de cationes puede incluir contactar el caldo de fermentación con una cama mezclada de resinas de intercambio de aniones y cationes. En un aspecto de esta modalidad, el paso de recuperación comprende precipitar sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación. En un aspecto de esta modalidad, el paso de recuperación comprende cristalizar sólidos que contienen N- acetilglucosamina del caldo de fermentación. En un aspecto de esta modalidad, el paso de recuperación comprende concentrar el caldo de fermentación que contiene N-acetilglucosamina solubilizada. En un aspecto, el paso de concentración se lleva a cabo en una presión menor a la presión atmosférica. En otro aspecto, el paso de concentración se lleva a cabo mediante separación de membrana. En otro aspecto, el paso de concentración se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 75°C. En otro aspecto, el paso de concentración se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 55°C. En otro aspecto, el paso de concentración se lleva a cabo para lograr un contenido de sólidos en el caldo de fermentación de al menos aproximadamente el 30% de sólidos. En otro aspecto, el paso de concentración se lleva a cabo para lograr un contenido de sólidos en el caldo de fermentación de al menos aproximadamente 40% de sólidos. En otro aspecto, el paso de concentración se lleva a cabo para lograr un contenido de sólidos en el caldo de fermentación de al menos un 45% de sólidos. En otro aspecto, el método incluye además enfriar el caldo de fermentación después del paso de concentración. Por ejemplo, el caldo de fermentación puede enfriarse a una temperatura de aproximadamente -5°C y aproximadamente 45°C, o en otro aspecto, a una temperatura de entre aproximadamente -5°C y aproximadamente temperatura ambiente, o en otro aspecto, aproximadamente a temperatura ambiente. Otro aspecto del paso de concentración incluye además, después del paso de enfriamiento, sembrar en el caldo de fermentación cristales de N-acetilglucosamina. En un aspecto, los cristales de semillas de N-acetilglucosamina se seleccionan del grupo que consiste de cristales de N-acetilgiucosamina formados mediante nucleación en el caldo de fermentación y cristales de N-acetilglucosamina proporcionados en forma externa. En cualesquiera de los diversos aspectos de esta modalidad, el paso de recuperación puede incluir el paso de contactar N-acetilglucosamina con un solvente mezclable en agua. El solvente mezclable en agua puede incluir, pero no se limita a, alcohol isopropílico (IPA), etanol, metanol, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dioxano y acetonitrilo. En cualesquiera de los diversos aspectos de esta modalidad, el método puede incluir además un paso de secar los sólidos que contienen N-acetilglucosamina recuperados. El paso puede incluir lavar los sólidos que contienen N-acetilglucosamina secos con un solvente mezclable en agua. En cualesquiera de los diversos aspectos de esta modalidad, el método puede incluir disolver los sólidos que contienen N-acetilglucosamina recuperados para formar una solución de N-acetilglucosamina y recuperar sólidos que contienen N-acetilglucosamina de la solución. En cualesquiera de los diversos aspectos de esta modalidad, el método puede incluir además filtrar el caldo de fermentación para eliminar endotoxinas bacterianas. Aún otra modalidad de la presente invención, se refiere a un método para producir glucosamina a partir de una fuente de N-acetilglucosamina, en donde el método comprende: (a) obtener una fuente de N-acetilglucosamina seleccionada del grupo que consiste de: N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1 -fosfato; y (b) tratar la fuente de N-acetilglucosamina de (a) para producir un producto de glucosamina seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina, glucosamina-6-fosfato, y glucosamina-1 -fosfato, a partir de la fuente de N-acetilglucosamina. En un aspecto, la fuente de N-acetilglucosamina es al menos aproximadamente el 40% de N-acetilglucosamina como un porcentaje de los sólidos secos en la fuente. En otro aspecto, la fuente de N-acetilglucosamina es N-acetilglucosamina que ha sido producida mediante un proceso de fermentación. En aún otro aspecto, la fuente de N-acetilglucosamina es un caldo de fermentación que contiene la N-acetilglucosamina que fue producida mediante un proceso de fermentación, en donde el caldo de fermentación ha sido tratado para eliminar substancialmente el material celular. En otro aspecto, se proporciona la fuente de N-acetilglucosamina en la forma de un sólido en una solución. En otro aspecto, la fuente de N-acetilglucosamina se suspende en un alcohol primario o secundario acuoso de baja ebullición. En un aspecto de esta modalidad, el paso (b) de tratamiento, comprende hidrolizar la fuente de N-acetilglucosamina bajo condiciones de ácido y calor. En un aspecto, el paso de hidrolización se lleva a cabo a una temperatura de desde aproximadamente 60°C hasta aproximadamente 100°C. En otro aspecto, el paso de hidrolización se lleva a cabo a una temperatura de desde aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 90°C. En otro aspecto, el paso de hidrolización se lleva a cabo utilizando una solución clorhídrica a una concentración de desde aproximadamente el 10% en peso hasta aproximadamente el 40% en peso. En otro aspecto, la proporción de peso de la solución de ácido clorhídrico a la fuente de N-acetilglucosamina en la forma de peso seco puro, es desde aproximadamente 1:1 en peso hasta aproximadamente 5:1 en peso. En otro aspecto, el paso de hidrolización se lleva a cabo desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 24 horas. En un aspecto, el paso de hidrolización comprende: (a) hidrolizar la fuente de N-acetilglucosamina combinando la fuente de N-acetilglucosamina con una solución de ácido clorhídrico o un licor madre de hidrólisis reciclado bajo condiciones de calor para producir una solución que contiene clorhidrato de glucosamina; (b) enfriar la solución de (a) para precipitar el clorhidrato de glucosamina; y (c) recuperar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina precipitado de (b). En un aspecto, el paso (a) de hidrolización , se lleva a cabo mediante una combinación continua de la fuente de N-acetilglucosamina con una solución de ácido clorhídrico o un licor madre de hidrólisis reciclado para mantener la fuente de N-acetilglucosamina en la forma de una solución disuelta, seguido de la adición de ácido clorhídrico anhidro bajo condiciones de calor para la solución de (a), para iniciar la hidrólisis y convertir la N-acetilglucosamina en clorhidrato de glucosamina. En otro aspecto, el licor madre de hidrólisis es una solución de hidrólisis que permanece después de la recuperación del clorhidrato de glucosamina precipitado en el paso (c), en donde se agrega un alcohol primario o secundario a la solución de hidrólisis antes de, durante o después de que se llevó a cabo el paso de hidrólisis. Dicho alcohol primario o secundario puede incluir, pero no se limita a, metanol, isopropanol, etanol, n-propanol, n-butanol, y seg-butanol. En un aspecto, el paso de enfriamiento se lleva a cabo hasta que la solución está a una temperatura desde aproximadamente -5°C hasta aproximadamente 40°C. En otro aspecto, el paso de recuperación comprende: (i) recolectar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina; (ii) lavar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina con un solvente mezclable en agua; y (iii) secar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina. En aún otro aspecto, el paso de recuperación comprende: (i) recolectar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina precipitada; (ii) disolver los sólidos de (i) en agua para formar una solución en agua; (¡ii) ajustar el pH de la solución de (ii) a entre aproximadamente 2.5 y 4; (iv) contactar la solución de (¡ii) con carbono activado para decolorar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina; (v) remover el carbono activado de la solución de (iv); (vi) cristalizar el clorhidrato de glucosamina de la solución de (v). En este aspecto, el paso de cristalización comprende concentrar el clorhidrato de glucosamina a una temperatura menor a aproximadamente 70°C. En un aspecto, el paso de cristalización comprende concentrar el clorhidrato de glucosamina a una temperatura de aproximadamente 50°C. En otro aspecto, el paso de cristalización comprende concentrar el clorhidrato de glucosamina a una presión menor a presión atmosférica. En otro aspecto, el método incluye además reciclar la solución restante después del paso de cristalización (vi) para el paso (i) de un proceso de recuperación subsecuente. En otro aspecto, el método incluye además reciclar la solución restante después del paso de cristalización (vi) para un paso de cristalización subsecuente. En este aspecto, el método puede incluir lavar el clorhidrato de glucosamina cristalizado procedente del paso (vi) con un solvente mezclable en agua, que incluye, pero no se limita a, metanol, isopropanol, etanol, acetonitrilo, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida y dioxano. En un aspecto, el método incluye además secar el clorhidrato de glucosamina cristalizado después del lavado a una temperatura menor a aproximadamente 70°C durante un período menor a aproximadamente 6 horas. El paso de secado puede llevarse a cabo a una presión menor a presión atmosférica. En un aspecto, el paso de secado se lleva a cabo con un barrido de aire. En otro aspecto de esta modalidad, se suspende la fuente de N-acetilglucosamina en un alcohol primario o secundario acuoso de baja ebullición y en donde el método comprende un paso adicional entre los pasos (a) y (b) para eliminar el éster de ácido acético formado con el alcohol después de la hidrólisis o antes de reciclar la solución de hidrólisis para utilizarse nuevamente. En un aspecto, el éster de ácido acético se elimina mediante un proceso seleccionado del grupo que consiste: destilación, proceso intermitente y concentración a una presión menor a la presión atmosférica. En otro aspecto, el paso de hidrolización se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 60°C y aproximadamente 100°C. En otro aspecto, el paso de hidrolización se lleva a cabo a un punto de ebullición de solución a una atmósfera. En otro aspecto, se lleva a cabo un paso de hidrolización a una proporción de solución de ácido clorhídrico a la fuente de N-acetilglucosamina en la forma de un peso seco desde aproximadamente 3:1 en peso hasta aproximadamente 5:1 en peso, y a una temperatura menor a aproximadamente 80°C. En un aspecto, el método incluye además los pasos de lavar el clorhidrato de glucosamina recuperado en el paso (c) con un solvente mezclabie en agua y/o secar el clorhidrato de glucosamina cristalizado, tal como se describió anteriormente. En aún otro aspecto de esta modalidad de la presente invención, el paso (b) de tratamiento comprende contactar la fuente de N-acetilglucosamina con una enzima de desacetilación para producir el producto de glucosamina. Dicha enzima de desacetilación puede incluir, pero no se limita a, desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-?, desacetilasa de N-acetilglucosamina, y/o desacetilasa de quitina que ha sido modificada a, o seleccionada por su capacidad de desacetilar un monómero de N-acetilglucosamina para producir glucosamina. En un aspecto, el producto de glucosamina se produce mediante cristalización. En un aspecto, el método incluye recuperar el producto de glucosamina mediante precipitación. En un aspecto, la enzima de desacetilación se inmoviliza en un substrato. En un aspecto, el paso de contactar comprende contactar la fuente de N-acetilgiucosamina con la enzima de desacetilación en la presencia de una solución acuosa de cloruro de sodio o calcio. En este aspecto, el método puede incluir además recuperar el producto de glucosamina mediante cristalización o precipitación. En un aspecto, el paso de contactar comprende contactar la fuente de N-acetilglucosamina con la enzima de desacetilación en la presencia de un alcohol para esterificar el mismo. En otro aspecto, el método incluye además mezclar una sal con el producto de glucosamina y contactar la mezcla con un medio de intercambio de iones, que incluye, pero no se limita a, una sal de cloruro, un fosfato, un yoduro, y un bisulfato. Aún otra modalidad de la presente invención, se refiere a un método para producir glucosamina mediante fermentación, en donde el método comprende: (a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo el cual ha sido transformado con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica sintasa de glucosamina-6-fosfato, en donde la expresión de la molécula del ácido nucleico recombinante se controla mediante una inducción de lactosa, y en donde el paso de cultivo comprende: (i) crecer el microorganismo en el medio de fermentación que comprende glucosa en la forma de una fuente de carbono a un pH de desde aproximadamente pH 4.5 hasta aproximadamente pH 7 y a una temperatura de desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 37°C; (ii) inducir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico mediante adición de lactosa al medio de fermentación eliminando la adición de glucosa adicional al medio; (iii) fermentar el microorganismo después del paso (ii) en la presencia de glucosa a un pH de desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 6.7 y a una temperatura de desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 37°C; y (b) recolectar un producto producido a partir de un paso de cultivo, en donde el producto se selecciona del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato y glucosamina. En un aspecto, se agrega una fuente de oligoelementos al paso (iii) de fermentación, que incluye, pero no se limita a hierro. En un aspecto, el paso (ii) comprende crecer el microorganismo en el medio de fermentación que comprende glucosa en la forma de una fuente de carbono a un pH de aproximadamente pH 6.9. En un aspecto, el paso (iii) comprende fermentar el microorganismo después del paso (ii) en la presencia de glucosa a un pH desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 5. En un aspecto, el paso (iii) comprende fermentar el microorganismo después del paso (ii) en la presencia de glucosa, a un pH de aproximadamente 6.7. Breve Descripción de las Figuras La figura 1, es una representación esquemática de las trayectorias de la biosíntesis y metabolismo de glucosamina en Escherichia coli recombinante. La figura 2, es una representación esquemática de las modificaciones novedosas para las trayectorias de la sobreproducción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina en E. coli recombinante. La figura 3, es un bosquejo de la trayectoria a partir de glucosa hasta glucosamina y otras trayectorias competitivas (PGI = fosfoglucoisomerasa; PGM = fosfoglucomutasa; PFK = fosfofructocinasa; zwf = deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato; GImS = sintasa de gIucosamina-6-?; fosfatasa = actividades de fosfatasa involucradas en la hidrólisis de glucosamina-6-fosfato). La figura 4, es una gráfica de líneas que muestra los efectos de glucosamina-6-fosfato en la actividad de la enzima Bacillus subtilis GImS recombinante. La figura 5, es una gráfica que muestra la actividad de sintasa de glucosamina de diversas proteínas GImS en bajos niveles de gIucosamina-6-fosfato. La figura 6, es una gráfica que muestra los cambios de las actividades enzimáticas con el tiempo en un cultivo en frasco de agitación. La figura 7, es una gráfica de barras que muestra los niveles de la producción de glucosamina inducida mediante lactosa bajo diferentes condiciones en frascos de agitación (la cepa inducible mediante lactosa es de 7107-16 y la cepa de control es de 2123-54). La figura 8, es una gráfica de líneas que muestra los efectos de oiigoelementos en la producción de glucosamina en cultivos celulares inducidos mediante lactosa después de una fase de crecimiento inicial. La figura 9, es una gráfica de líneas que muestra los efectos de los niveles de fosfato y alimentación de hierro en producción de glucosamina en fermentadores. La figura 10, es una gráfica de líneas que muestra las pruebas de crecimiento de 7107-18 con glucosamina 20 g I1 a diferentes pHs. La figura 11, es una gráfica de líneas que muestra la producción de glucosamina con la cepa 2123-54 en fermentadores de 1 litro bajo diferentes condiciones ambientales. La figura 12, es una gráfica de líneas que ¡lustra la degradación de glucosamina a diferentes pHs (60 g I1 en medio de M9A-glucosa). La figura 13, es una gráfica de líneas que ilustra la estabilidad de N-acetilglucosamina en un medio M9A (sin glucosa) - la estabilidad se probó en dos concentraciones de N-acetilglucosamina (40 y 80 g I1) y dos pHs (5.5 y 7.0). La figura 14, es un bosquejo de la trayectoria alternativa de la producción de N-acetilglucosamina. La figura 15, es una gráfica de líneas que muestra el efecto de aminoazúcares fosforilados en actividad de fosfoglucoisomerasa (Pg i). La figura 16, es una gráfica de líneas que muestra el efecto de aminoazúcares fosforilados en glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. La figura 17, es una gráfica de líneas que muestra los niveles de las actividades enzimáticas durante una fermentación de N-acetilglucosamina. La figura 18, es una gráfica de líneas que muestra los efectos de pentosa y gluconato en la producción de N-acetilglucosamina en experimentos de frascos de agitación (siendo agregado cada azúcar al medio a 10 g 1 en frascos de agitación). La figura 19, es una gráfica de líneas que muestra la producción de N-acetilglucosamina mediante 7107-87#25 con inducción temprana y tardía de IPTG en fermentadores. La figura 20, es una gráfica de líneas que muestra los efectos de las concentraciones de zinc y hierro en la producción de N-acetilglucosamina, y que muestra particularmente el efecto benéfico de eliminar el zinc.

La figura 21, es una gráfica de líneas que muestra la hidrólisis de ácido/calor de N-acetilglucosamina (10 g/l en medio M9A). La figura 22, es una gráfica de líneas que muestra la estabilidad de glucosamina bajo condiciones de hidrólisis de ácido/calor (10 g/l en medio M9A). La figura 23, es una gráfica de líneas que muestra la hidrólisis de ácido de N-acetilglucosamina (20 g/l en medio M9A) utilizando ácido clorhídrico 0.1N a diferentes temperaturas. La figura 24, es una gráfica de líneas que muestra la hidrólisis de N-acetilglucosamina/glucosamina a una temperatura de 90°C. La figura 25, es una gráfica de líneas que muestra la formación de amonia a partir de hidrólisis de N-acetílglucosamina/glucosamina a una temperatura de 90°C. Descripción Detallada del Invento La presente invención se refiere a un método biosintetico para producir glucosamina y N-acetilglucosamina. Dicho método incluye la fermentación de un microorganismo modificado en forma genética para producir glucosamina y/o N-acetilglucosamina. La presente invención también se refiere a microorganismos modificados en forma genética que son útiles para producir glucosamina y N-acetilglucosamina. Además, la presente invención se refiere a métodos para recuperar N-acetiIglucosam¡na que ha sido producida a través de un proceso de fermentación, incluyendo métodos que dan como resultado N-acetilglucosamina de alta pureza. La presente invención también se refiere a un método para producir glucosamina a partir de N-acetilglucosamina. Antes de la presente invención, la N-acetilglucosamina se producía mediante la acetilación de glucosamina, y por consiguiente, no se creía que un método produjera glucosamina comercialmente útil a partir de N-acetilglucosamina o que incluso fuera comercialmente factible. La presente invención demostró por primera vez la producción directa de N-acetilglucosamina a través de un proceso biológico totalmente natural. En forma más específica, la presente invención se refiere de manera general a métodos para producir glucosamina y N-acetilglucosamina mediante fermentación de un microorganismo. Los métodos incluyen un primer paso de cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que tiene una fermentación genética en una trayectoria metabólica de aminoazúcar que incluye: una trayectoria para convertir glucosamina-6-fosfato, gIucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, ó N-acetilglucosamina-1 -fosfato en otros compuestos; una trayectoria para sintetizar glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato ó N-acetilglucosamina-1 -fosfato; una trayectoria para transportar glucosamina, glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato, ó N-acetiIglucosamina-1 -fosfato fuera del microorganismo; una trayectoria para transportar glucosamina ó N-acetilglucosamina en un microorganismo y una trayectoria que compite con los substratos involucrados en la producción de glucosamina-6-fosfato, para producir un producto que pueda incluir glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina intracelulares, y/o glucosamina ó N-acetilglucosamina extracelular a partir del organismo. Los métodos también incluyen un segundo paso para recolectar el producto mediante la recuperación de glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina intracelular a partir del microorganismo y/o recolectar y/o recuperar glucosamina ó N-acetilglucosamina extracelular a partir del medio de fermentación, el cual puede incluir los pasos de recuperación y purificación (que se describirán y definirán con mayor detalle más adelante). N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina- -fosfato recuperados a partir del proceso de fermentación de la presente invención, pueden ser desacetilados utilizando los métodos aquí descritos para producir glucosamina, glucosamina-6-fosfato, y glucosamina-1 -fosfato. Los métodos novedosos de la presente invención para la producción de glucosamina y N-acetilglucosamina mediante fermentación, son poco costosos y pueden producir una producción de glucosamina y N-acetilglucosamina que excede la producción de glucosamina y N-acetilglucosamina producida a través de métodos normales. Además, al utilizar un microorganismo modificado en forma genética tal como se describe en la presente invención, el método de la misma puede modificarse fácilmente para adaptarse a problemas particulares o cambiar las necesidades relativas con la producción de glucosamina y N-acetilglucosamina. Además, el proceso y materiales descritos en la presente invención, pueden ser utilizados y/o modificados por los expertos en la técnica, para producir otros aminoazúcares tales como poli-N-acetilglucosamina, poli-glucosamina, galactosamina, manosamina, N-acetil-galactosamina, N-acetilmanosamina y sus derivados. Los aminoazúcares, N-acetilglucosamina (GIcNAc) y glucosamina (GlcN), son moléculas fundamentalmente importantes en microorganismos, debido a que son los precursores de la biosíntesis de macromoléculas mayores, y en particular, glucoconjugados (por ejemplo, macromoléculas que contienen cadenas de oligosacáridos enlazadas en forma covalente). Por ejemplo, en Escherichia coli, N-acetilglucosamina y glucosamina son precursores de dos macromoléculas de la envoltura celular, peptidoglicano y lipopolisacárido. Las mutaciones que bloquean la biosíntesis de peptidoglicano o lipopolisacáridos son letales, dando como resultado la pérdida de integridad de la envoltura celular y finalmente la lisis celular. Tal como se utiliza en la presente invención, los términos glucosamina, D-glucosamina y N-glucosamina se pueden utilizar en forma intercambiable. En forma similar, los términos glucosamina-6-fosfato y N-glucosamina-6-fosfato pueden utilizarse en forma intercambiable, y los términos glucosamina-1 -fosfato y N-glucosamina-1 -fosfato pueden utilizarse en forma intercambiable. Glucosamina, glucosamina-6-fosfato y glucosamina-1 -fosfato pueden abreviarse como GIcN, GlcN-6-? y GlcN-1-?, respectivamente. N-acetilglucosamina también puede denominarse 2-acetamido-2-desoxi-D-glucosa. N-acetilglucosamina también puede escribirse como glucosamina N-acetilo. En forma similar a la glucosamina y sus derivados, los términos N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1 -fosfato pueden abreviarse como GIcNAc (o D-GIcNAc), GlcNAc-6-? y GlcNAc-1-?, respectivamente. N-acetilglucosamina también se abrevia como NAG.

En la presente invención se hace referencia a las enzimas en una trayectoria metabólica de aminoazúcar relacionada con la producción de los productos de glucosamina y N-acetilglucosamina identificados anteriormente. Un aminoazúcar es un derivado de amino-sacárido (por ejemplo, un sacárido que tiene un grupo amino en lugar de un grupo hidroxilo). De acuerdo con la presente invención, una trayectoria metabólica de aminoazúcar es cualquiera trayectoria bioquímica involucrada en, o que afecta la biosíntesis, anabolismo o catabolismo de un aminoazúcar. Tal como se utiliza en la presente invención, las trayectorias metabólicas de aminoazúcar incluyen trayectorias implicadas en el transporte de aminoazúcares y sus precursores dentro y fuera de una célula, y también pueden incluir trayectorias bioquímicas que compiten con substratos implicados en la biosíntesis o catabolismo de un aminoazúcar. Por ejemplo, el precursor intermedio de uno de los aminoazúcares formados en forma más temprana es fructosa-6-fosfato (F-6-P), el cual, en una reacción bioquímica (catalizada por sintasa de glucosamina) o en una reacción bioquímica con amonio (catalizada por deaminasa de glucosamina) forma glucosamina-6-fosfato. La fructosa-6-fosfato también es un intermedio de la trayectoria de glicólisis. Por consiguiente, la trayectoria glicolítica compite con la trayectoria biosintética de glucosamina-6-fosfato compitiendo con un substrato, fructosa-6-fosfato. Además, la gIucosamina-6-fosfato se puede convertir a otros aminoazúcares y formar constituyentes en diversas macromoléculas mediante una serie de reacciones bioquímicas. Por lo tanto, la trayectoria de fructosa-6-fosfato/glucosamina-6-fosfato, la trayectoria glicolítica, hasta el punto en que afecta la biosíntesis de glucosamina-6-fosfato, y la trayectoria de biosíntesis de gIucosamina-6-fosfato/macromolécula, se consideran todas trayectorias metabólicas de aminoazúcares en la presente invención. Las trayectorias para la síntesis y metabolismo de glutamina determinan la disponibilidad de la glutamina (donante de amino para la síntesis de glucosamina-6-fosfato), y por lo tanto afectan la biosíntesis de glucosamina-6-fosfato. Por consiguiente, todas estas trayectorias se consideran como trayectorias metabólicas de aminoazúcares en la presente invención. La síntesis de N-acetilglucosamina-6-fosfato a partir de glucosamina-6-fosfato y la síntesis de N-acetilglucosamina-1 -fosfato a partir de glucosamina-1 -fosfato requieren el suministro de acetil-CoA, el cual también es el substrato para el ciclo de Krebs. Por lo tanto, el ciclo de Krebs compite con las trayectorias de síntesis de N-acetilglucosamina para un substrato, acetil-CoA. Por lo tanto, las trayectorias para la síntesis y metabolismo de acetil-CoA afectan la biosíntesis de N-acetilglucosamina y por lo tanto, se consideran como trayectorias metabólicas de aminoazucares en la presente invención. Para una variedad de microorganismos, muchas de las trayectorias metabólicas de aminoazúcar han sido eliminadas. En particular, las trayectorias de la biosíntesis y catabolismo de glucosamina y N-acetilglucosamina y sus derivados fosforilados han sido eliminados en Escherichia coli. Estas trayectorias incluyen múltiples sistemas de transporte para la utilización de estos aminoazucares en la forma de fuentes de carbono. Los genes que codifican las enzimas y proteínas directamente relacionadas con el transporte, catabolismo y biosíntesis de aminoazúcares en Escherichia coli, han sido clonados y secuenciados. Además, las cepas mutantes de Escherichia coli bloqueadas substancialmente en cada paso del metabolismo de aminoazúcar han sido aisladas.. Las trayectorias conocidas para el metabolismo de aminoazúcar de Escherichia coli se ilustran en la figura 1. La Patente Norteamericana No. 6,372,457 describió por primera vez un microorganismo de producción de glucosamina que tiene capacidades de producción de glucosamina que exceden por mucho la capacidad de producción de glucosamina de cualesquiera de los microorganismos mutantes o de tipo natural conocidos. Tal como se describió en la Patente Norteamericana No. 6,372,457, algunos pasos de la trayectoria catabólica fueron bloqueados mediante desactivación genética (indicado mediante cruces) y la sintasa FlcN-6-? de enzima, la cual cataliza la síntesis de GlcN 6-P, se sobreexpresó (indicado mediante una línea gruesa) en una célula huésped recombinante. La presente invención proporciona procesos de fermentación novedosos para la producción de glucosamina que no se describieron en la Patente Norteamericana No. 6,372,457, incluyendo modificaciones genéticas de microorganismos de producción, así como combinaciones de modificaciones genéticas que no se describieron en la Patente Norteamericana No. 6,372,457 para la producción de glucosamina. La presente invención también se considera como la primera descripción de modificaciones genéticas de microorganismos y procesos de fermentación para la producción de N-acetilglucosamina. Tal como se describirá con mayor detalle, incluso cuando se han eliminado muchas de las trayectorias y genes implicados en las trayectorias metabólicas de aminoazúcares, hasta la elaboración de la presente invención, no se conocía cuál de las muchas posibles modificaciones genéticas podrían ser necesarias para generar un microorganismo que produjera cantidades comercialmente importantes de N-acetilglucosamlna. Además, las modificaciones y combinaciones genéticas novedosas de las mismas para la producción de glucosamina, tal como se describe en la presente invención, no se habían considerado previamente.

De hecho, algunas de las modificaciones genéticas para la producción de glucosamina aquí descrita, son lo opuesto a lo que se describió en la descripción anterior de un método de fermentación para la producción de glucosamina, la Patente Norteamericana No. 6,372,457, supra. Las trayectorias metabólicas de aminoazúcares del microorganismo, Escherichia coli, se dirigirá en la forma de modalidades específicas de la presente invención. Los aspectos importantes de las modificaciones genéticas en las trayectorias metabólicas de aminoazúcares descritas en la presente invención para la sobreproducción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina se ilustran en la figura 2. Haciendo referencia a la figura 2, las flechas gruesas indican la creación de y/o incremento del flujo metabólico mediante ingeniería genética, las cuales se contemplan a través de la presente invención. Se describen diversos métodos diferentes para la síntesis de N-acetilglucosamina, que incluyen pero no se limitan a, modificaciones a GNA1 y/o NagB, e incluyen además combinaciones de modificaciones para GImS y GNA1, GImS y GlmU, NagB y GNA1, y NagB y GlmU, solos o en combinación adicional con otras modificaciones genéticas. A manera de ejemplo, la presente invención contempla la sobreexpresión o eliminación de genes adicionales para optimizar la producción de glucosamina/N-acetilglucosamina. Haciendo referencia a la figura 3 y a la tabla que se encuentra más adelante, esta figura ilustra la implicación de diversas otras enzimas en el metabolismo de glucosa y la formación de N-glucosamina, y la tabla muestra diversas modificaciones que podrían elaborarse adicionalmente para los huéspedes de microorganismos de la presente invención con el objeto de optimizar la producción de giucosamina y/o N-acetilglucosamina. Todas estas modalidades se describen con mayor detalle más adelante. Se apreciará que otros microorganismos tienen trayectorias metabólicas de aminoazúcar similares, así como genes y proteínas que tienen la estructura y función similar dentro de dichas trayectorias. Por lo tanto, los principios descritos más adelante con respecto a Escherichia coli, son aplicables a otros microorganismos y están expresamente comprendidos en la presente invención.

Objetivo Modificación Objetivo Sintasa de glutamina (glnA) Sobreexpresión Incrementar el conjunto de glutamina Fosfoglucoisomerasa (pgl) Sobreexpresión Incrementar el conjunto de fructosa-6-? Transportador de lactosa Sobreexpresión Incrementar la eficacia en la captación de (lacY) lactosa y reducir la represión de lactosa en la inducción de lactosa Deshi Sobreexpresión Liberar los efectos inhibidores de drogenasa de glucosa-6-? aminoazúcares fosforilados en la trayectoria (zwf) de fosfato de pentosa Represor operón lac (lacl) Eliminación Eliminar uno de los genes lacl para reducir la represión de glucosa en la inducción de lactosa promotor lac Reemplazo reemplazar el promotor lac con el promotor lacUV5 para disminuir la represión de glucosa en la inducción de lactosa Enzima de síntesis de Eliminación/Inserción Bloquear síntesis de glicógeno glicógeno (operón glg) Operón galactosa (gal) Eliminación/Inserción Producción inducible de galactosa Fosfofructocinasa A (pfkA) Eliminación Desacoplar la síntesis de glucosamina/N- acetilglucosamina a partir del metabolismo de energía celular y formación de acetato En la técnica se sabe que las enzimas que tienen la misma actividad biológica pueden tener diferentes nombres dependiendo de qué organismos se deriven. A continuación se encuentra una lista general de nombres alternativos para muchas de las enzimas aquí referenciadas y los nombres específicos de ios genes que codifican dichas enzimas a partir de algunos organismos. Los nombres de las enzimas se pueden utilizar de manera intercambiable, o según sea adecuado para una secuencia u organismo determinado, aunque la presente invención pretende comprender enzimas de una función determinada procedente de cualquier organismo. Por ejemplo, la enzima generalmente referida en la presente invención como "sintasa de glucosamina-6-fosfato" cataliza la formación de glucosamina-6-fosfato y glutamato a partir de fructosa-6-fosfato y glutamina. La enzima también se conoce como aminotransferasa de glucosamina-fructosa-6-fosfato (isomerización); aminotransferasa de hexosefosfato; amidotransferasa de D-fructosa-6-fosfato; isomerasa de glucosamina-6-fosfato (formación de glutamina); amidotransferasa de L-gIutamina-fructosa-6-fosfato; y sintasa GlcN6P. La sintasa de glucosamina-6-fosfato procedente de E. coli y otras bacterias, es generalmente referida como GlmS. La sintasa de glucosamina-6-fosfato procedente de levadura y otras fuentes es generalmente referida como GFA ó GFAT. La sintasa de glucosamina-6-fosfato procedentes de una variedad de organismos, es conocida en la técnica y se contempla para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética de la presente invención. Por ejemplo, la sintasa de glucosamina-6-fosfato procedente de Escherichia coli, se describe en la presente invención. La sintasa de glucosamina-6-fosfato procedente de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante SEQ ID NO:2, la cual se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención a través de SEQ ID NO:1. También descrita en la presente invención, se encuentra la sintasa de glucosamina-6-fosfato procedente de BacHlus subtilis, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante SEQ ID NO:16, codificada por una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante SEQ ID NO:15. También descrita en la presente invención, se encuentra la sintasa de glucosamina-6-fosfato procedente de Saccharomyces cerevisiae, la cual es conocida en dicho organismo como aminotransferasa de glucosamina-fructosa-6-fosfato (GFA1), y la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención a través de la SEQ ID NO:18, codificada mediante una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención a través de la SEQ ID NO:17. También descrita en la presente invención, se encuentra la sintasa de glucosamina-6-fosfato procedente de Candida albicans, la cual también es conocida en dicho organismo como aminotransferasa de gluccsamina-fructosa-6-fosfato (GDA1), y la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante SEQ ID NO:20, codificada con la secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:19. También incluidas en la presente invención, se encuentran las sintasas de glucosamina-6-fosfato, las cuales tienen una o más modificaciones genéticas que producen un resultado elegido de: actividad enzimática incrementada de sintasa de glucosamina-6-fosfato; inhibición reducida del producto de la sintasa de glucosamina-6-fosfato, y afinidad incrementada de sintasa de glucosamina-6-fosfato para sus substratos. En general, de acuerdo con la presente invención, se realiza un incremento o una disminución en una característica determinada de una enzima muíante modificada, con referencia a la misma característica de una enzima tipo natural (normal, no modificada) a partir del mismo organismo que se mide o establece bajo las mismas condiciones o condiciones equivalentes (descritas con mayor detalle más adelante). También descritas en la presente invención, están diversas sintasas de · glucosamina-6-fosfato con modificaciones genéticas que dan como resultado una inhibición de producto reducida de la actividad enzimática. Dichas modificaciones a una sintasa de glucosamina-6-fosfato también se describieron con detalle en la Patente Norteamericana No. 6,372,457 aunque en la presente invención se describe (SEQ ID NO:14) al menos un muíante GlmS disfinto, adicional, que tiene inhibición de producto reducida. Las enzimas de sintasa de glucosamina-6-fosfato procedentes de E. coli que han íenido una inhibición reducida del producto, tienen secuencias de aminoácidos que incluyen, pero no se limitan a las representadas mediante las SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:14 (codificada por la SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:7, z11, y SEQ ID N0:13, respectivamente). Además, se proporciona como la tabla 7, una tabla que describe las posiciones de aminoácido en la SEQ ID NO:14 con relación a la secuencia de tipo natural (SEQ ID NO:2) que da como resultado una enzima con una inhibición del producto reducida. La SEQ ID NO:4 tiene las siguientes mutaciones con respecto a la SEQ ID NO:2: lie a Thr en la posición 4, lie a Thr en la posición 272 y Ser a Pro en la posición 450. La SEQ ID NO:6, tiene las siguientes mutaciones con respecto a la SEQ ID NO:2: Ala a Thr en la posición 39, Arg a Cys en la posición 250, y Gly a Ser en la posición 472. La SEQ ID NO:8 tiene las siguientes mutaciones con respecto a la SEQ ID NO:2: Leu a Pro en la posición 469. Las SEQ ID NOs:10 y 12 tienen cada una al menos las siguientes mutaciones con respecto a la SEQ ID NO:2: Gly a Ser en la posición 472. En la presente invención se contempla una sintasa de glucosamina-6-fosfato que tiene una mutación en cualesquiera de una o más de las posiciones descritas en la tabla 7, incluyendo cualquier combinación de las mutaciones ahí mostradas, o una sintasa de glucosamina-6-fosfato que tiene cualesquiera de las mutaciones adicionales representadas en cualesquiera de las SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, ó 14, que incluyen cualesquiera de las combinaciones de las mismas. Además, las modificaciones homologas se pueden realizar en sintasas de glucosamina-6-fosfato a partir de otros microorganismos. Finalmente, algunas sintasas de glucosam¡na-6-fosfato que ocurren en la naturaleza tienen menos inhibición de producto que las sintasas de glucosamina-6-fosfato procedentes de otros microorganismos. Por ejemplo, los inventores de la presente invención han demostrado que la sintasa de glucosamina-6-fosfato tipo natural procedente de Bacillus subtilis exhibe una resistencia al producto no comparable con las enzimas GImS mutantes de E. coli (ver sección de ejemplos). La enzima generalmente referida en la presente invención como acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato convierte glucosamina-6-fosfato y acetil-CoA a N-acetilglucosamina-6-fosfato, liberando CoA. La enzima también se conoce como N-acetiltransferasa de glucosamina-fosfato, transacetilasa de fosfoglucosamina y acetilasa de fosfoglucosamina. La enzima de levadura es referida generalmente como GNA1. Las acetiltransferasas de gIucosamina-6-fosfato procedentes de una variedad de organismos son conocidas en la técnica y se contemplan para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética de la presente invención. Por ejemplo, la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato procedente de Saccharomyces cerevisiae , se describe en la presente invención. La acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato procedente de Saccharomyces cerevisiae tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:30, la cual se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:29. También descrita en la presente invención está la acetiltransferasa de gIucosamina-6-fosfato procedente de Candida albicans, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:32, codificada mediante una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:31. También descrita en la presente invención está la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato procedente de Arabidopsis thaliana, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:34, codificada por una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:33. También incluidas en la presente invención, están las acetiltransferasas de glucosamina-6-fosfato, que tienen una modificación genética que produce un resultado seleccionado de: actividad enzimática incrementada de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; sobreexpresión de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato mediante el microorganismo; inhibición reducida del producto de N-acetilglucosamina-6-fosfato de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; y afinidad incrementada de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato para glucosamina-6-fosfato. La enzima referida generalmente en la presente invención como deaminasa de glucosamina-6-fosfato, cataliza una reacción reversible de glucosamina-6-fosfato y agua para formar fructosa-6-fosfato y amonio. La enzima también se conoce como isomerasa de glucosamina-6-fosfato; deaminasa GlcN6P; fosfoglucosaminisomerasa; isomerasa de fosfoglucosamina; deaminasa de fosfato de glucosamina; isomerasa de cetol de 2-amino-2-desoxi-D-gIucosa-6-fosfato (desaminación). En E. coli y otras bacterias, la enzima se conoce generalmente como NagB. Las deaminasas de glucosamina-6-fosfato procedentes de una variedad de organismos, se conocen en la técnica y se contemplan para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética en la presente invención. Por ejemplo, la desaminasa de glucosamina-6-fosfato procedente de Escherichia coli, se describe en la presente invención. La deaminasa de glucosamina-6-fosfato procedente de E. coli, tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:42, la cual está codificada por una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:41. También incluidas en la presente invención, están las deaminasas de glucosamina-6-fosfato que tienen una modificación genética que produce un resultado seleccionado de: deaminasa de glucosamina-6-fosfato para formar glucosamina-6-fosfato incrementada (más cantidad), reacción directa reducida de deaminasa de glucosamina-6-fosfato para formar fructosa-e-fosfato reducida (menor cantidad), afinidad incrementada de deaminasa de glucosamina-6-fosfato para fructosa-6-fosfato, afinidad reducida de deaminasa de glucosamina-6-fosfato para glucosamina-6-fosfato, e inhibición reducida del producto de glucosamina-6-fosfato de la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato. La enzima generalmente referida en la presente invención como N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato convierte glucosamina-1 -fosfato y acetil-CoA a N-acetilgIucosamina-1 -fosfato, liberando CoA. La enzima se conoce en E. coli y otras bacterias como GlmU. La enzima GlmU bacteriana es una enzima bifuncional (por ejemplo, tiene dos funciones enzimáticas - también tiene la función de uridiltransferasa de N-acetilglucosamina-1 -fosfato, la cual es conocida como pirofosforilasa UDP-N-acetilglucosamina, difosforilasa UDP-N-acetilglucosamina). Las N-acetiltransferasas de glucosamina-1 -fosfato procedentes de una variedad de organismos, son conocidas en la técnica y se contemplan para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética de la presente invención. Por ejemplo, la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato procedente de Escherichla coli, la cual es realmente la uridiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato de N-acetiltransferasa/N-acetilgIucosamina- -fosfato bifuncional, se describe en la presente invención. La uridiltransferasa de glucosamina-1-fosfato de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina procedente de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:56, la cual está codificada por una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:55. También descrita en la presente invención, está la uridiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina mutante truncada de E. coli, en donde la parte que codifica la uridiltransferasa de N-acetilglucosamina-1 -fosfato ha sido eliminada, abandonando en forma efectiva una enzima únicamente con la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1-fosfato. Esta uridiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina truncada tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:58, modificada mediante una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:57. También incluidas en la presente invención, están las N-acetiltransferasas de glucosamina-1 -fosfato, que tienen una modificación genética que produce un resultado seleccionado de: actividad enzimática incrementada de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato; actividad enzimática reducida de uridiltransferasa de N-acetiIglucosamina-1 -fosfato (si la enzima es una enzima bifuncional); afinidad incrementada de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato para glucosamina-1 -fosfato; actividad reducida de una uridiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina para N-acetilglucosamina-1 -fosfato (si la enzima es una enzima bifuncional); y una inhibición reducida del producto de N-acetilglucosamina-1 -fosfato de la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato. La enzima generalmente referida en la presente invención como desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato, hidroliza N-acetilglucosamina-6-fosfato a glucosamina-6-fosfato y acetato. La enzima se conoce en E. coli y otras bacterias como NagA. Las desacetilasas de N-acetilglucosamina-6-fosfato procedentes de una variedad de organismos son conocidas en la técnica y se contemplan para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética de la presente invención. Por ejemplo, la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato procedente de Escherichia coli se describe en la presente invención. La desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato procedente de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:84, la cual es codificada por una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:85. También incluidas en la presente invención, están las desacetilasas de N-acetilglucosamina-6-fosfato que tienen una modificación genética que produce un resultado seleccionado de: actividad incrementada de desacetilasa de glucosamina-6-fosfato; reacción inversa incrementada de desacetilasa de glucosamina-6-fosfato para formar N-acetilglucosamina-6-fosfato; reacción directa reducida de desacetilasa de glucosamina-6-fosfato para formar glucosamina-6-fosfato; afinidad incrementada de desacetilasa de glucosamina-6-fosfato para N-acetilgIucosamina-6-fosfato; inhibición reducida del producto de N-acetilglucosamina-6-fosfato de desacetilasa de glucosamina-6-fosfato. La enzima generalmente referida en la presente invención como mutasa de fosfoglucosamina, cataliza la conversión entre glucosamina-6-fosfato y gIucosamina-1 -fosfato. La enzima se conoce generalmente en E. coli y otras bacterias como GIm . Las mutasas de fosfoglucosamina procedentes de una variedad de organismos, son conocidas en la técnica y se contemplan para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética de la presente invención. Por ejemplo, la mutasa de fosfoglucosamina procedente de Escherichia coli se describe en la presente invención. La mutasa de fosfoglucosamina procedente de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:54, la cual se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:53. También incluida en la presente invención, están las mutasas de fosfoglucosamina que tienen una modificación genética que produce un resultado seleccionado de: actividad incrementada de mutasa de fosfoglucosamina; reacción directa incrementada de mutasa de fosfoglucosamina para formar glucosamina-1 -fosfato incrementada; reacción inversa reducida de mutasa de fosfoglucosamina para formar glucosamina-6-fosfato reducida; afinidad incrementada de mutasa de fosfoglucosamina para glucosamina-6-fosfato; afinidad reducida de mutasa de fosfoglucosamina para glucosamina-1 -fosfato; e inhibición reducida del producto de glucosamina-1 -fosfato de la mutasa de fosfoglucosamina. La enzima generalmente referida en la presente invención como fosfoglucoisomerasa, cataliza la interconversión de glucosa-6-fosfato a fructosa-6-fosfato. La enzima es conocida generalmente en E. coli y otras bacterias como fosfoglucoisomerasa ó Pgi. Las fosfoglucoisomerasas procedentes de una variedad de organismos son conocidas en la técnica y se contemplan para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética de la presente invención. Por ejemplo, la fosfoglucoisomerasa de Escherichia coli se describe en la presente invención. La fosfoglucoisomerasa de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:105, la cual se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:104. La enzima generalmente referida en la presente invención como fosfofructocinasa, cataliza la formación de fructosa-1 ,6-bifosfato procedente de fructosa-6-fosfato (F-6-P). La fosfofructocinasa mayor en E. coli, codificada mediante pfkA, proporciona el 90% de la actividad de fosfofructocinasa. El 10% restante de la actividad se suministra a través de la fosfofructocinasa menor, codificada mediante pfkB. La enzima de fosfofructocinasa es conocida generalmente en E. coli y otras bacterias como fosfofructocinasa ó Pfk. Las fosfofructocinasas procedentes de una variedad de organismos son conocidas en la técnica y se contemplan para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética de la presente invención. Por ejemplo, la PfkA procedente de Escherichia coli, se describe en la presente invención. La enzima generalmente referida en la presente invención como sintetasa de glutamina, cataliza la conversión de L-glutamato a L-glutamina en una reacción que requiere NH3 y ATP. La enzima es conocida generalmente en E. coli y otras bacterias como sintetasa de glutamina, o GlnA. La sintetasas de glutamina procedentes de una variedad de organismos con conocidas en la técnica y se contemplan para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética de la presente invención. Por ejemplo, la sintetasa de glutamina procedente de Escherichia coli se describe en la presente invención. La sintetasa de glutamina procedente de E. coli, tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:89, la cual se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO-.88. La enzima referida generalmente en la presente invención como deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, cataliza el primero paso en la trayectoria de fosfato de pentosa, convirtiendo la glucosa-6-fosfato en glucono-1 ,5-lactona. La enzima es generalmente conocida en E. coli y otras bacterias como deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, codificada mediante zwf. Las deshidrogenases de glucosa-6-fosfato procedentes de una variedad de organismos son conocidas en la técnica y se contemplan para utilizarse en las estrategias de ingeniería genética de la presente invención. Por ejemplo, la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato procedente de Escherichia coli, se describe en la presente invención. La deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato procedente de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:95, la cual se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico representada en la presente invención mediante la SEQ ID NO:94. Un número de enzimas son responsables de la síntesis de glicógeno en un microorganismo. Dichas enzimas incluyen, pero no se limitan a, pirofosforilasa de ADP-glucosa, sintasa de glicógeno y una enzima de ramificación. Otros genes referenciados en la presente invención, incluyen pero no se limitan a: transportador de N-acetilglucosamina (llNa9), transportador de mañosa (EIIM, P/l llman), transportador de glucosa (IIG|C), y/o una fosfatasa. Los genes en E. coli corresponden a nagC, nagD, nagE (transportador de N-acetilglucosamina (llNa9)); manXYZ (transportador de mañosa (EIIM, P/lllman)); ptsG (transportador de glucosa (llGI°)) o un gen de fosfatasa, respectivamente. El gen nagC codifica una proteína reguladora que actúa como un represor del regulador nag, así como tanto un activador como un represor del operón glmU. La función del gen nagD no se conoce, pero se considera que está relacionada con el metabolismo de aminoazúcar, ya que reside dentro del regulador nag. Los genes nag (nagA, nagB, nagC, nagD, nagE) implicados en la degradación de glucosamina y N-acetilglucosamina, existen en la forma de un regulador (es decir, regulador nag), localizado a 15 min en el cromosoma de Escherichia coli. El transportador de mañosa (EIIM, P/lllman) (manXYZ) es el responsable del transporte de glucosamina en la célula. El transportador de glucosamina (IIG|C) (ptsG) transporta la glucosa en la célula, pero puede servir como un transportador secundario de glucosamina. Las fosfatasas son bien conocidas en la técnica como catalizadores de la desfosforilación de fosfatos de azúcar y proteínas. Una modalidad de la presente invención se refiere a un método para producir glucosamina y/o N-acetilglucosamina mediante fermentación. Dicho método incluye generalmente los pasos de (a) cultivo en un medio de fermentación de un microorganismo que comprende al menos una modificación genética que se describe en la presente invención, como útil para incrementar la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina del microorganismo; y (b) recolectar un producto producido a partir de un paso de cultivo, en donde el producto se selecciona del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina, glucosamina-1 -fosfato, N-aceti Ig lucos a mi n a- 1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina. Más particularmente, los productos pueden incluir giucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-aceti lglucosamina-6-fosfato, N-aceti lglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina intracelular, los cuales se recolectan a partir del microorganismo y/o glucosamina ó N-acetilglucosamina extracelular, los cuales se recolectan a partir del medio de fermentación. En un aspecto, N-acetilglucosamina, -acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1 -fosfato se hidrolizan bajo condiciones de ácido/calor en donde los productos de la hidrólisis (glucosamina, glucosamina-6-fosfato y glucosamina-1 -fosfato) son estables. En otro aspecto, N-acetilglucosamina, N-acetiIglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina-1 -fosfato son desacetilados utilizando una enzima de desacetilación. Los métodos de recuperación y purificación se describen con mayor detalle más adelante. En general, un microorganismo modificado en forma genética útil en un método de la presente invención, normalmente tiene al menos un gen modificado implicado en al menos una trayectoria metabólica de aminoazúcar que da como resultado: (a) una habilidad reducida de convertir la glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato en otros compuestos (por ejemplo, inhibición de trayectorias catabólicas o anabólicas de glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilgIucosamina-6-fosfato, y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato), (b) una habilidad mejorada para producir (por ejemplo sintetizar) glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato, (c) una habilidad reducida para transportar glucosamina y/o N-acetilglucosamina en la célula, (d) una habilitad mejorada para transportar glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, glucosamina y/o N-acetilglucosamina fuera de la célula, y/o (e) una habilidad reducida para utilizar substratos involucrados en la producción de glucosamina-6-? para competir con una reacción bioquímica y/o (f) una habilidad reducida para utilizar acetil-CoA (implicada en la producción de N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1 -fosfato) para competir con reacciones bioquímicas. En general, un microorganismo que tiene una trayectoria metabólica de aminoazucar modificada en forma genética tiene al menos una modificación genética, tal como se describe con detalle más adelante, que da como resultado un cambio en una o más trayectorias metabólicas de aminoazucar, tal como se describió anteriormente, en comparación con un microorganismo tipo natural cultivado bajo las mismas condiciones. Dicha modificación en una trayectoria metabólica de aminoazúcar cambia la capacidad del microorganismo para producir un aminoazúcar. Tal como se describe con detalle más adelante, de acuerdo con la presente invención, un microorganismo modificado en forma genética tiene preferentemente una habilidad mejorada para producir glucosamina y/o N-acetilglucosamina, en comparación con un microorganismo tipo natural de la misma especie (y preferentemente la misma cepa), el cual se cultiva bajo las mismas condiciones o condiciones equivalentes. Las condiciones equivalentes, son condiciones de cultivo que son similares, pero no necesariamente idénticas (por ejemplo, se pueden tolerar algunos cambios en la composición, temperatura, pH, y otras condiciones del medio), y que no cambian substancialmente el efecto en el crecimiento o producción de microbios de glucosamina ó N-acetilglucosamina a través del microbio. Una trayectoria metabólica de aminoazúcar que afecta la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina, generalmente puede categorizarse en al menos uno de los siguientes tipos de trayectorias: (a) trayectorias para convertir glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina-1-fosfato en otros compuestos, (b) trayectorias para sintetizar glucosamina-6-fosfato, (c) trayectorias para transportar glucosamina y/o N-acetilglucosamina en una célula, (d) trayectorias para transportar glucosamina, glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetílglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato y/o N-acetilglucosamina fuera de una célula, y (e) trayectorias que compiten con substratos implicados en la producción de glucosamina-6-fosfato. El desarrollo de un microorganismo con habilidad mejorada para producir glucosamina y/o N-acetilglucosamina mediante modificación genética puede lograrse utilizando tanto un desarrollo de cepa clásica como técnicas genéticas moleculares. En general, la estrategia para crear un microorganismo con producción mejorada de glucosamina y/o N-acetilglucosamina es (1) desactivar o eliminar al menos una y preferentemente más de una de las trayectorias metabólicas de aminoazúcar en la cual la producción de glucosamina-6-fosfato se afecta en forma negativa (por ejemplo, inhibe), (2) amplificar al menos una y preferentemente más de una de las trayectorias metabólicas de aminoazúcar en las cuales se mejora la producción de glucosamina-6-fosfato. En una modalidad de la presente invención, se puede lograr el aumento de la capacidad de un microorganismo para sintetizar glucosamina-6-fosfato, gIucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato mediante la amplificación de la expresión (por ejemplo, sobreexpresión) del gen de sintasa de glucosamina-6-fosfato (g/mS), y/o mediante amplificación de la expresión de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato, el cual en Escherlchla coll es el gen nagB, cuyo producto es deaminasa de glucosamina-6-fosfato. La deaminasa de glucosamina-6-fosfato cataliza la reacción directa en la cual se desamina la glucosamina-6-fosfato para formar fructosa-6-fosfato y amonio. La deaminasa de glucosamina-6-fosfato también cataliza la reacción inversa en la cual la fructosa-6-fosfato y el amonio forman glucosamina-6-fosfato. La reacción inversa de la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato es diferente a la acción de la sintasa de glucosamina-6-fosfato debido a que en la reacción de sintasa, la fructosa-6-fosfato y la glutamina forman glucosamina-6-fosfato y ácido glutámico. Es importante un adecuado suministro intracelular de glutamina para la reacción de sintasa de glucosamina-6-fosfato. La inspección de las trayectorias sintéticas y de degradación de la glucosamina-6-fosfato, revela la presencia de un ciclo fútil potencial mediante el cual la interconversión continua de fructosa-6-fosfato y glucosamina-6-fosfato da como resultado un agotamiento de glutamina desperdiciado. Por consiguiente, el uso de la acción inversa de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato tiene una ventaja con respecto a la sintasa de glucosamina-6-fosfato debido a que la deaminasa utiliza amonio, como el donante de amino, en lugar de un aminoácido (glutamina). La deaminasa de glucosamina-6-fosfato cataliza la reacción reversible con un equilibrio cinético en favor de la degradación de glucosamina-6-fosfato en fructosa-6-fosfato y amonio. Por consiguiente, tal como otra modalidad de la presente invención, se utiliza una forma mutagenizada de deaminasa de glucosamina-6-fosfato o una deaminasa de glucosamina-6-fosfato sobreexpresada, con una actividad incrementada de la acción inversa de una actividad disminuida de la reacción directa, para la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. Otra modalidad de la presente invención, es proporcionar un microorganismo que tiene una deaminasa de glucosamina-6-fosfato con Vmax incrementado, actividad específica incrementada, estabilidad incrementada, afinidades incrementadas con substratos de fructosa-6-fosfato y amonio, e inhibición producida del producto mediante glucosamina-6-fosfato. Una deaminasa de glucosamina-6-fosfato con dichas mejoras, puede aislarse de la naturaleza y producirse a través de cualquier método adecuado de modificación genética o ingeniería de proteínas. Por ejemplo, se puede utilizar la ingeniería de proteína a base de computadora para este propósito. Ver por ejemplo la Publicación de aulik y Asociados, 1997, Molecular Blotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., la cual está incorporada en su totalidad como referencia a la presente invención. La amplificación de la expresión de deaminasa de glucosamina-6-fosfato puede lograrse en Escherichia coli, por ejemplo, mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica el gen nagB. Ya que la sintasa de glucosamina-6-fosfato en la cepa huésped puede catalizar la síntesis de glucosamina-6-fosfato, la amplificación de la expresión de deaminasa de glucosamina-6-fosfato debe analizarse en una cepa mutante de Escherichia coli, la cual tiene un gen glmS desactivado. Aunque la eliminación de la actividad de sintasa de gIucosamina-6-fosfato en este organismo no es requerida, es una modalidad de la presente invención. A manera de ejemplo para otras enzimas y otras proteínas aquí descritas, una deaminasa de glucosamina-6-fosfato modificada puede ser un gen de deaminasa de glucosamina-6-fosfato mutado (por ejemplo, modificado en forma genética), por ejemplo, y puede producirse mediante un método adecuado de modificación genética. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica deaminasa de glucosamina-6-fosfato, puede modificarse a través de cualquier método para insertar, eliminar y/o substituir nucleótidos, tal como mediante PCR propenso a error. En este método, el gen se amplifica bajo condiciones que conducen a una alta frecuencia de errores de desincorporación a través de la polimerasa de ADN utilizada para la amplificación. Como resultado, se obtiene una alta frecuencia de mutaciones en los productos PCR. Los mutantes del gen de deaminasa de glucosamina-6-f osfato resultantes, pueden clasificarse posteriormente mediante elaboración de pruebas de los genes mutantes con respecto a la capacidad de conferir una producción de glucosamina incrementada en un microorganismo de prueba, tal como se compara con un microorganismo que transporta la molécula de ácido nucleico de deaminasa de glucosamina-6-fosfato recombinante no mutada. Por consiguiente, es una modalidad de la presente invención, proporcionar un microorganismo el cual se transforma con una molécula de ácido nucleico recombinante modificada en forma genética que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de deaminasa de glucosamina-6-fosfato mutante, u homologa. Dichas proteínas de deaminasa de glucosamina-6-fosfato pueden referirse en la presente invención, como homólogos de deaminasa de gIucosamina-6-fosfato (que se describen con detalle más adelante). En un aspecto de la presente invención, es crucial la sobreexpresión ya sea de glmS ó nagB para la acumulación intracelular de glucosamina-6-fosfato y finalmente para la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina, ya que el nivel de sintasa de glucosamina-6-fosfato/o deaminasa de glucosamina-6-fosfato en la célula, controlará la redirección del flujo de carbono lejos de la glicólisis y dentro de la síntesis de glucosamina-6-fosfato. Para la producción de N-acetilglucosamina, glucosamina-6-fosfato debe convertirse a N-acetiIglucosamina-6-fosfato ó N-acetilglucosamina-1 -fosfato, el cual posteriormente es desfosforilado y/o segregado en el caldo de cultivo. En una modalidad de la presente invención, el aumento de la capacidad de un microorganismo para sintetizar N-acetilglucosamina-6-fosfato y N- acetilglucosamina se logra mediante la amplificación de la expresión del gen de acetiltransferasa de g!ucosa-6-fosfato, el cual, únicamente a manera de ejemplo, en Saccharomyces cerevisiae es el gen GNA1, cuyo producto es acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato. En otra modalidad de la presente invención, el aumento en la habilidad de un microorganismo para sintetizar N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina se logra mediante la amplificación de la expresión del gen de desacetilasa de N-acetilglucosa-6-fosfato, el cual en Escherichia coli es el gen nagA, cuyo producto es desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato. La desacetilasa cataliza la conversión de N-acetilglucosamina-6-fosfato a glucosamina-6-fosfato en la reacción directa. También cataliza la reacción inversa para convertir glucosamina-6-fosfato en N-acetilglucosamina-6-fosfato. La desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato, cataliza la reacción reversible con un equilibrio cinético en favor de la desacetilación de N-acetilgIucosamina-6-fosfato a gIucosamina-6-fosfato. Por consiguiente, como otra modalidad de la presente invención, se utiliza una forma mutagenizada de desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato con una actividad incrementada de la acción inversa y una actividad disminuida de la reacción directa, para la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. Ya que la sintasa de glucosamina-6-fosfato (GlmS) se inhibe fuertemente mediante el producto de glucosamina-6-fosfato, la amplificación de la expresión del gen de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato (GNA1) y/o el gen de desacetilasa de N-acetilgIucosamina-6-fosfato (nagA) puede reducir el nivel intracelular de glucosamina-6-fosfato, reducir la inhibición del producto de la enzima GlmS, e incrementar por lo tanto la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. En otra modalidad de la presente invención, el aumento de la capacidad de un microorganismo para sintetizar glucosamina y N-acetilglucosamina, se logra mediante la amplificación de la expresión del gen de mutasa de fosfoglucosamina, el cual en Escherichia coli es el gen glmM, cuyo producto es la mutasa de fosfoglucosamina. La mutasa de fosfoglucosamina cataliza la conversión de glucosamina-6-fosfato a glucosamina-1 -fosfato. Ya que la sintasa de glucosamina-6-fosfato (GlmS) se inhibe fuertemente a través del producto de glucosamina-6-fosfato, la amplificación de la expresión del gen de mutasa de fosfoglucosamina puede reducir el nivel intracelular de glucosamina-6-fosfato, reducir la inhibición del producto de la enzima GlmS, e incrementar de este modo la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. En otra modalidad de la presente invención, el aumento de la capacidad de un microorganismo para sintetizar glucosamina y/o N-acetilglucosamina, se logra mediante la amplificación de la expresión del gen de uridiitransferasa de glucosamina-1 -fosfato de N-acetiltransferasa/N-acetilgIucosamina-1 -fosfato bifuncional, el cual en Escherichia coli es el glmU, cuyo producto es uridiitransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato. La presente invención también incluye la amplificación de la expresión o la actividad incrementada de una proteína que tiene actividad de N-acetiitransferasa de glucosamina-1 -fosfato. La enzima bifuncional cataliza la conversión de glucosamina-1 -fosfato a N-acetilglucosamina-1 -fosfato (en la forma de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato) y convierte el producto en forma adicional a UDP-N-acetilglucosamina (en la forma de uridiitransferasa de N-acetilglucosamina-1 -fosfato). Por consiguiente, como otra modalidad de la presente invención, se utiliza una forma mutagenizada de uridiitransferasa de glucosamina-1 -fosfato de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato con una actividad incrementada de la acción de acetiitransferasa y una actividad disminuida de la acción de uridiitransferasa, para la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. El gen glmU es un gen esencial para el crecimiento de Escherichia coli, ya que la uridiitransferasa de glucosamina- -fosfato de N-acetiltransferasa/N-acetiIgIucosamina-1 -fosfato funciona dentro de la trayectoria metabóiica de aminoazúcar en la cual está incorporada la glucosamina-6-fosfato, a través de una serie de reacciones bioquímicas dentro de macromoléculas. Es necesario utilizar una forma mutagenizada de enzima GImU con una actividad incrementada de la acción de acetiltransferasa y una actividad disminuida de la acción de uridiltransferasa, en la cepa huésped con un gen glmU tipo natural, de modo que las macromoléculas derivadas de glucosamina, puedan sintetizarse para soportar el crecimiento celular. La síntesis de glucosamina y/o N-acetilglucosamina, está relacionada de manera cercana con muchas diferentes trayectorias del metabolismo de glucosa, tal como se indica en la figura 3. La glucosa es tomada por la célula y se convierte simultáneamente a glucosa-6-?. La glucosa se metaboliza mediante un número de trayectorias, que incluyen las que se muestran en la figura. En la trayectoria de la síntesis de glucosamina, la glucosa-6-? es isomerizada para fructosa-6-fosfato, seguido de conversión transmitida por GlmS de fructosa-6-fosfato a glucosamina-6-fosfato. Finalmente, la gIucosamina-6-fosfato es desfosforilada y segregada. Una ruta alternativa de competencia importante para la glucosa-6-fosfato, es su entrada en la glicólisis mediante fosfofructocinasa. Otras rutas alternativas importantes para glucosa-6-fosfato, es su oxidación a glucoIactona-6-fosfato (la entrada en la trayectoria de fosfato de pentosa). Adicionalmente, la glucosamina-6-fosfato podría convertirse a glucosa-1 -fosfato, a partir de lo cual se elabora el glicógeno y se almacena en la célula). Este es el alcance de la presente invención para modular otras trayectorias de competición, para maximizar la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina, tal como se describe con detalle más adelante. Las células bacterianas acumulan glicógeno, como la forma principal de reservas de carbono almacenadas. La síntesis de glicógeno comprende tres enzimas: pirofosforilasa de ADP-glucosa, también conocida como adeniltransferasa de glucosa-1 -fosfato), sintasa de glicógeno y enzima de ramificación. Estas enzimas catalizan, respectivamente, la síntesis del donante de monosacárido (ADP-glucosa) procedente de glucosa-1-fosfato, la polimerización de estas unidades de monosacáridos para formar un polímero de glucosa (1,4), y el reajuste de este polímero para generar ramificaciones (1-6) en la cadena. La pirofosforilasa de ADP-glucosa es una enzima pivotai en la síntesis de glicógeno y se modula fuertemente mediante efectos alostéricos. Por ejemplo, 3-fosfoglicerato estimula la actividad enzimática, en tanto que ortofosfato inhibe la actividad. Estos efectores pueden jugar papeles importantes in vivo en el control de la síntesis de glicógeno. La cantidad de glicógeno en las células cuenta del 10 al 60% de su peso seco, de acuerdo con las condiciones de crecimiento. Generalmente, el glicógeno se acumula bajo condiciones en donde el suministro de carbono y energía fue el nutriente abundante y el nitrógeno fue el nutriente limitado. Una eliminación de fosfato en el medio de crecimiento, también da como resultado una cantidad superior de glicógeno en la célula. La única función de ADP-glucosa en la bacteria, es servir como un precursor para la síntesis de glicógeno. Loa mutantes E. coli con crecimiento celular bloqueado por síntesis de glicógeno, no se afectaron en forma perjudicial. El bloqueo de la síntesis de glicógeno puede hacer que las fuentes de carbono estén más disponibles para la producción de glucosamina/N-acetilglucosamina. Para maximizar la producción de glucosamina/N-acetilglucosamina se puede manipular la fosfoglucoisomerasa (codificada mediante el gen pgi). La sobreexpresión del gen pgi puede incrementar la conversión de glucosa-6-? a fructosa-6-?, el substrato directo para la síntesis de gIucosamina-6-?. La glucosa se necesita para soportar el crecimiento celular y la síntesis de glucosamina. Las fosfofructocinasas (PfkA y PfkB, siendo la primera la isoenzima mayor), catalizan la conversión de fructosa-6-? a fructosa-1 ,6-bifosfato. La reacción opera en competición con la síntesis de glucosamina-6-?. En el control del flujo de carbono, podría ser deseable modular la expresión de PfkA y/o PfkB para elaborar más glucosa-6-? dirigida hacia la trayectoria de glucosamina. Para maximizar la síntesis de glucosamina, no se debe de limitar el suministro de glucosa, aunque un exceso de glucosa normalmente conduce a la formación de acetato. Ya que la acumulación de acetato inhibe el crecimiento celular y las señales, se debe evitar un descenso del metabolismo celular en general. Un método para administrar el suministro de carbono es desacoplar el flujo de carbono para la síntesis de glucosamina del crecimiento celular y la formación de acetato. Esto debe lograrse eliminando el gen pfkA y suministrando células con fructosa para el crecimiento. En mutantes knockout pfkA, se restringirá en gran medida el flujo de fructosa-6-fosfato a la glucólisis. Por consiguiente, virtualmente toda la glucosa puede ser utilizada para la síntesis de glucosamina, en tanto que el crecimiento celular y la producción de energía será suministrado mediante alimentación de fructosa, la cual se transporta en la célula y se fosforila a fructosa-1 -fosfato. Posteriormente, será fosforilada en forma adicional a fructosa-1 ,6-difosfato. La literatura sugiere que los aminoazúcares fosforilados fueron inhibidores para enzimas de la trayectoria de fosfato de pentosa. De hecho, la producción de N-acetilglucosamina originó la inhibición del crecimiento celular que podría haber sido liberado alimentando intermedios de la trayectoria, tales como gluconato y ribosa. El suplemento con compuestos de gluconato y pentosa, también se descubrió como un incremento en la producción de N-acetamilglucosamina. Para superar la inhibición mediante aminoazúcares, se pueden sobreexpresar las enzimas de la trayectoria de fosfato-pentosa, tal como la deshidrogenasa de glucosa-6-? (codificada mediante el gen zwf). La síntesis de glucosamina/N-acetilglucosamina consume glutamina, el donante de aminoácidos. La síntesis de glutamina comprende sintasa de glutamina codificada mediante el gen glnA. La sobreexpresión del gen glnA podría incrementar el conjunto de glutamina, e incrementar de este modo la glucosamina/N-acetilglucosamina. Por consiguiente, habiendo descrito en forma general alguna de las modificaciones preferidas de acuerdo con la presente invención, en una modalidad, el microorganismo comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la acetiltranferasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo. Preferentemente, la modificación genética para incrementar la actividad de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato proporciona un resultado seleccionado de: actividad enzimática incrementada de acetiltransferasa de glutamina-6-fosfato; sobreexpresión de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato a través del microorganismo; inhibición reducida del producto de N-acetilglucosamina-6-fosfato de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; y/o afinidad incrementada de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato para glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato. Dicha molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato que tiene al menos una modificación genética, que incrementa la actividad enzimática de la acetiltranferasa de glucosamina-6-fosfato, o produce cualesquiera de los resultados antes descritos. La función y secuencias representativas de acetiltransferasas de glucosamina-6-fosfato, han sido descritas anteriormente. En otra modalidad, el microorganismo comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la sintasa de glucosamina-6-fosfato. Preferentemente, la modificación genética que incrementa la actividad de la sintasa de glucosamina-6-fosfato; produce un resultado seleccionado de: actividad enzimática incrementada de la sintasa de glucosamina-6-fosfato; sobreexpresión de la sintasa de glucosamina-6-fosfato; inhibición reducida del producto de la sintasa de glucosamina-6-fosfato; y afinidad incrementada de la sintasa de glucosamina-6-fosfato para sus sustratos. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la sintasa de glucosamina-6-fosfato. Dicha molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una sintasa de glucosamina-6-fosfato que tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la sintasa de glucosamina-6-fosfato, que reduce la inhibición del producto de la sintasa de glucosamina-6-fosfato, o produce cualesquiera de los resultados antes descritos. La función y secuencia representativas de las sintasas de glucosamina-6-fosfato, han sido descritas anteriormente. En otra modalidad, el microorganismo comprende al menos una modificación genética que disminuye la actividad de la sintasa de glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, la modificación genética para disminuir la actividad de la sintasa de gIucosamina-6-fosfato, es una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la sintasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo. En aún otra modalidad, el microorganismo comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad deaminasa de glucosamina-6-fosfato. Preferentemente, la modificación genética para incrementar la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato produce un resultado seleccionado de: la sobreexpresión de deaminasa de glucosamina-6-fosfato mediante el microorganismo, actividad enzimática incrementada de la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato, reacción inversa incrementada de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato para formar glucosamina-6-fosfato incrementada (más cantidad), reacción directa disminuida de deaminasa de glucosamina-6-fosfato para formar fructosa-e-fosfato reducido (menor cantidad), afinidad incrementada de deaminasa de glucosamina-6-fosfato para fructosa-6-fosfato, afinidad reducida de deaminasa de glucosamina-6-fosfato para glucosamina-6-fosfato, e inhibición reducida del producto de glucosamina-6-fosfato de la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la deaminasa de g!ucosamina-6-fosfato. Dicha molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una deaminasa de glucosamina-6-fosfato que tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato, o produce cualesquiera de los resultados antes descritos. La función y secuencias representativas de las deaminasas de glucosamina-6-fosfato han sido descritas anteriormente.

En otra modalidad, el microorganismo comprende al menos una modificación genética que disminuye la actividad de la deamlnasa de glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, la modificación genética para disminuir la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato es una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la deaminasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo.

En aún otra modalidad, el microorganismo comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato. Preferentemente, la modificación genética proporciona un resultado seleccionado de: actividad enzimática incrementada de la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato; actividad enzimática reducida de uridiltransferasa de N-acetilglucosamina-1-fosfato; sobreexpresión de una enzima que tiene actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato mediante el microorganismo; afinidad incrementada de N-acetiltranferasa de glucosamina- -fosfato para glucosamina-1 -fosfato; afinidad reducida de una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetil lucosamina de N-acetilglucosamina-1 -fosfato para N-acetilglucosamina-1 -fosfato; y/o inhibición reducida del producto de N-acetilglucosamina- -fosfato de la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato o una enzima que comprende la actividad de una N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato. Dicha molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una N-acetiltransferasa de glucosamina-1-fosfato que tiene al menos una modificación genética, la cual incrementa la actividad enzimática de la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato, o produce cualesquiera de los resultados antes descritos. La función y secuencias representativas de las N-acetiltransferasas de glucosamina-1 -fosfato, han sido descritas anteriormente. En otra modalidad, el microorganismo modificado en forma genética comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato. Preferentemente, la modificación genética que incrementa la actividad de desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato produce un resultado seleccionado de: actividad incrementada de la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato; sobreexpresión de la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato; acción inversa incrementada de la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato para formar N-acetilglucosamina-6-fosfato; acción directa reducida o más preferentemente eliminada de la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato para formar glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato. Dicha molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato que tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato, o produce cualesquiera de los resultados antes descritos. La función y secuencias representativas de la desacetilasas de N-acetilglucosamina-6-fosfato han sido descritas anteriormente. En otra modalidad, el microorganismo modificado en forma genética comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de mutasa de fosfoglucosamina. Preferentemente, la modificación genética que incrementa la actividad de mutasa de fosfoglucosamina produce un resultado seleccionado de: actividad incrementada de mutasa de fosfoglucosamina; sobreexpresión de mutasa de fosfoglucosamina; acción incrementada de la mutasa de fosfoglucosamina para formar glucosamina-6-fosfato y/o acción reducida o más preferente eliminada de la mutasa de fosfoglucosamina para formar glucosamina-6-fosfato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la mutasa de fosfoglucosamina. Dicha molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una mutasa de fosfoglucosamina que tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la mutasa de fosfoglucosamina, o produce cualesquiera de los resultados antes descritos. La función y secuencias representativas de las mutasas de fosfoglucosamina, han sido descritas anteriormente. En cualesquiera de las modalidades antes descritas, el microorganismo modificado en forma genética puede tener al menos una modificación genética adicional para incrementar la actividad de fosfoglucoisomerasa en el microorganismo. Preferentemente, el microorganismo modificado en forma genética puede tener al menos una modificación genética adicional para incrementar la fosfoglucoisomerasa que produce resultados seleccionados de: actividad incrementada de fosfoglucoisomerasa, sobreexpresión de fosfoglucoisomerasa, afinidad incrementada de la fosfoglucoisomerasa conpara sustrato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la fosfoglucoisomerasa. La molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una fosfoglucoisomerasa que tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la fosfoglucoisomerasa o produce cualesquiera de los resultados antes descritos. La función y secuencias representativas de la fosfoglucoisomerasa han sido descritos anteriormente. En cualesquiera de las modalidades aquí descritas, el microorganismo modificado en forma genética puede tener al menos una modificación genética adicional para disminuir la actividad de fosfofructocinasa en el microorganismo. En un aspecto, la modificación genética para disminuir la actividad de fosfofructocinasa es una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la fosfofructocinasa en el microorganismo. La función y secuencias representativas para las fosfofructocinasas han sido descritas anteriormente. En cualesquiera de las modalidades antes descritas, el microorganismo modificado en forma genética puede tener al menos una modificación genética adicional para incrementar la actividad de sintetasa de glutamina en el microorganismo. Preferentemente, el microorganismo modificado en forma genética puede tener al menos una modificación genética adicional para incrementar la sintetasa de glutamina que produce resultados seleccionados de: actividad incrementada de sintetasa de glutamina, sobreexpresión de sintetasa de glutamina, afinidad incrementada de la sintetasa de glutamina con su sustrato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la sintetasa de glutamina. La molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una sintetasa de glutamina que tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la sintetasa de glutamina o produce cualesquiera de los resultados antes descritos. La función y secuencias representativas de la sintetasa de glutamina han sido descritos anteriormente. En cualesquiera de las modalidades antes descritas, el microorganismo modificado en forma genética puede tener al menos una modificación genética adicional para incrementar la actividad de deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato en el microorganismo. Preferentemente, el microorganismo modificado en forma genética puede tener al menos una modificación genética adicional para incrementar la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato que produce resultados seleccionados de: actividad incrementada de deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato sobreexpresión de deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, afinidad incrementada de la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato con su sustrato. En un aspecto, el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato. La molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato que tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato o produce cualesquiera de los resultados antes descritos. La función y secuencias representativas de la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato han sido descritos anteriormente. En cualesquiera de las modalidades aquí descritas, el microorganismo modificado en forma genética puede tener al menos una modificación genética adicional para disminuir la actividad de una o más enzimas responsables de la síntesis de glicógeno en el microorganismo. Dichas enzimas incluyen, pero no se limitan a, síntesis de glicógeno que comprende fosforilasa de ADP-glucosa, sintasa de glicógeno y una enzima de ramificación. En un aspecto, la modificación genética para disminuir la actividad de las enzimas responsables de la síntesis de glicógeno, es una eliminación o desactivación parcial o total de una o más enzimas de codificación genética endógena responsables de la síntesis de glicógeno en el microorganismo. En cualesquiera de las modalidades aquí descritas, el microorganismo modificado en forma genética puede tener al menos una modificación genética adicional para incrementar la actividad de una fosfatasa. Los productos intracelulares iniciales en el microorganismo modificado en forma genética aquí descrito son glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1-fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina. En muchos microorganismos, incluyendo Escherichla col¡, es importante un suministro intracelular adecuado de amonio para la reacción de deaminasa de glucosamina-6-fosfato. GIucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1 -fosfato normalmente son desfosforilados a glucosamina y/o N-acetilglucosamina antes del transporte fuera de la célula. Sin embargo, es aún otra modalidad de la presente invención proporcionar un microorganismo el cual se modifique en forma genética para tener una actividad de fosfatasa adecuada para la desfosforilación de gIucosamina-6-fosfato, glucosamina-1-fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato. Dicha fosfatasa, puede incluir pero no se limita a, por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa de ácido, fosfatasa de fosfo-azúcar y fosfatasa de fosfo-aminoazúcar. En una modalidad preferida, dicha Escherichia coli tiene un nivel mejorado (es decir, incrementado) de actividad de fosfatasa (por ejemplo, acción de fosfatasa).

En cualesquiera de las modalidades antes descritas, el microorganismo puede tener al menos una modificación genética adicional para incrementar o disminuir la actividad de una enzima seleccionada del grupo de desacetilasa de N-acetilglucosamina, deaminasa de glucosamina-6-fosfato, transportador (llNag) de N-acetilglucosamina, sintasa de glucosamina, mutasa de fosfoglucosamina, uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetiIglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato, transportador (EIIM,P/lllman) de mañosa, fosfofructocinasa, transportador (IIG|C) de glucosa, acetiltranferasa de glucosamina-6-fosfato, y/o una fosfatasa. Los genes en E. coli corresponden a NagA, nagB, nagC, nagD, nagE, glmS, glmM, glmU, manXYZ, pfkA, pfkB, ptsG, GNA1 o un gen de fosfatasa, respectivamente. Se pueden combinar diversas de las modificaciones genéticas antes identificadas, para producir microorganismos que tienen más de una modificación, según se desee aumentar la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina a través del organismo. Por ejemplo, en una modalidad, el microorganismo tiene las siguientes modificaciones genéticas: (1) una modificación genética para Incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-fosfato; y (2) una modificación genética para incrementar la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato. En una modalidad más preferida, el microorganismo también tiene una modificación genética para disminuir la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato. En otra modalidad, ei microorganismo tiene las siguientes modificaciones genéticas: (1) una modificación genética para incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-fosfato; y (2) una modificación genética para incrementar la actividad de deaminasa de gIucosamina-6-fosfato. En una modalidad más preferida, el microorganismo también tiene una modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato. En otra modalidad, el microorganismo tiene las siguientes modificaciones genéticas: (1) una modificación genética para incrementar la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato; y (2) una modificación genética para incrementar la actividad de uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato, y preferentemente para incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de gIucosamina-1 -fosfato y/o reducir la actividad de uridiltransferasa de N-acetilglucosamina-1 -fosfato. En una modalidad más preferida, el microorganismo también tiene una modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato. En otra modalidad, el microorganismo tiene las siguientes modificaciones genéticas: (1) una modificación genética para incrementar la actividad de la sintasa de g!ucosamina-6-fosfato; y (2) una modificación genética para incrementar la actividad de uridiltransferasa de N-acetiltra nsferasa/N-acetilglucosam i na- 1 -fosfato de giucosamina-1 -fosfato, y preferentemente para incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato y/o reducir la actividad de uridiltransferasa de N-acetilglucosamina-1-fosfato. En una modalidad más preferida, el microorganismo también tiene una modificación genética para disminuir la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato. En otra modalidad, un microorganismo modificado en forma genética útil en un método de fermentación de la presente invención, tiene una acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato endógena (por ejemplo, levadura que tiene una acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato endógena) y también al menos una modificación genética para incrementar la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato. En una modalidad más preferida, el microorganismo también tiene una modificación genética para disminuir la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato. En otra modalidad, el microorganismo modificado en forma genética útil en un método de fermentación de la presente invención, se transforma con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una sintasa de glucosamina-6-fosfato, una deaminasa de glucosamina-6- fosfato, acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato, desacetilasa de N-acetilgiucosamina-6-fosfato, mutasa de fosfoglucosamina o uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato enlazado en forma operativa a una secuencia de control de transcripción. La molécula de ácido nucleico recombinante puede tener una modificación genética que afecta la acción de la enzima. La expresión de la molécula de ácido nucleico recombinante incrementa la expresión y/o actividad biológica de la sintasa de glucosamina-6-fosfato, deaminasa de glucosamina-6-fosfato, acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato, desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato, mutasa de fosfoglucosamina o uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato mediante el microorganismo, tal como se compara con el nivel de expresión o actividad biológica de la proteína en la ausencia de la molécula de ácido nucleico recombinante. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico recombinante está integrada en el genoma del microorganismo. En una modalidad adicional, el microorganismo tiene al menos una modificación genética adicional en un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo de sintasa de gIucosamina-6-fosfato, deaminasa de glucosamina-6-fosfato, desacetilasa de N-acetilglucosamina, enzima ||Nag específica de N-acetil-glucosamina, mutasa de fosfoglucosamina, uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosam¡na-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato, fosfof ructocinasa, Enzima IIG|C de la PEP: glucosa PTS, EII ,P/lllMan de la PEP: mañosa PTS, acetil transferasa de glucosamina-6-fosfato y/o una fosfatasa. La modificación genética incrementa o disminuye la acción de la proteína, excepto en el caso de la fosfatasa, en la cual la acción de la fosfatasa se incrementa preferentemente. En otra modalidad preferida, el microorganismo tiene una modificación en genes que codifican la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato, deaminasa de gIucosamina-6-fosfato y enzima ||Nag específica de N-acetil-glucosamina, en donde la modificación genética disminuye o incrementa la acción de la proteína. En una modalidad, la modificación genética es una eliminación de al menos una parte de los genes. En otra modalidad, un microorganismo de modificación genética de la presente invención tiene una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica sintasa de glucosamina-6-fosfato, deaminasa de glucosamina-6-fosfato, acetiltransferasa de gIucosamina-6-fosfato, desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato, mutasa de fosfoglucosamina o uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato dé glucosamina-1 -fosfato enlazados en forma operativa a una secuencia de control de transcripción; y al menos una modificación genética en un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo de desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato, deaminasa de glucosamina-6-fosfato, enzima específica ||Nas de N-acetil-glucosamina, mutasa de fosfoglucosamina, uridiltransferasa de N-acetiltransferasa-N-acetilgIucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato, fosfofructocinasa, acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato, Enzima IIG|C de la PEP: PTS glucosa, y/o EII ,P/lll an de la PEP: mañosa PTS. La modificación genética incrementa o disminuye la acción de la proteína y la expresión de la molécula de ácido nucleico recombinante incrementa la expresión de las enzimas mediante el microorganismo. En otra modalidad, el microorganismo tiene al menos una modificación genética en un gen de fosfatasa, de modo que la fosfatasa codificada mediante el gen, tiene acción incrementada. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico recombinante esta integrada en el genoma del microorganismo. Diversas de otras combinaciones de las mutaciones aquí descritas, están comprendidas a través de la presente invención, y muchas se describen en la sección de ejemplos. Además, el proceso y materiales descritos en la presente invención, pueden ser utilizados y/o modificados por los expertos en la técnica para producir otros aminoazúcares, tal como poli-N-acetilglucosamina, poli-glucosamina, galactosamina, manosamina, N-acetilgalactosamina, N-acetilmanosamina y sus derivados. Tal como se describió anteriormente, para producir producciones de glucosamina y/o N-acetilglucosamina significativamente superiores a través del método de fermentación de la presente invención, se modifica en forma genética un microorganismo para aumentar la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. Tal como se utiliza en la presente invención, un microorganismo modificado en forma genética tiene un genoma el cual se modifica (por ejemplo, se muta o cambia) de su forma normal (es decir, tipo natural o que ocurre en la naturaleza). En un aspecto, dicho organismo puede comprender y expresar en forma endógena un gen que codifica la proteína de interés, y la modificación genética puede ser una modificación genética del gen, mediante lo cual la modificación tiene cierto efecto (por ejemplo, incremento, disminución, eliminación) en la expresión y/o actividad del gen. En otro aspecto, dicho organismo puede contener y expresar en forma endógena un gen que codifica la proteína de interés, y la modificación genética puede ser una introducción de al menos una secuencia de ácido nucleico exógena (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante), en donde la secuencia de ácido nucleico exógena codifica la proteína de interés y/o una proteína que afecta la actividad de la proteína o gen que codifica la protefna. La molécula de ácido nucleico exógena que será introducida en el microorganismo, puede codificar una proteína tipo natural o puede tener una o más modificaciones que afectan la expresión y/o actividad de la proteína modificada, tal como se compara con la proteína tipo natural o normal. Aún en otro aspecto, los organismos no contienen necesariamente en forma endógena (natural) el gen que codifica la proteína de interés, sino que está modificados en forma genética para introducir al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína que tiene la actividad biológica de la proteína de interés. Nuevamente la molécula de ácido nucleico recombinante puede codificar una proteína tipo natural o la secuencia de ácido nucleico recombinante puede ser modificada para afectar la expresión y/o actividad de la proteína codificada, tal como se compara con una proteína tipo natural. En otras modalidades, se pueden introducir diversas secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores) en el microorganismo, para efectuar la expresión de un gen endógeno en el microorganismo. Diversas modalidades asociadas con cada uno de estos aspectos, se describirán con mayor detalle más adelante. Tal como se utiliza en la presente invención, un microorganismo modificado en forma genética puede incluir cualquier microorganismo modificado en forma genética, incluyendo una bacteria, un protista, una microalga, un hongo u otro microbio. Dicho microorganismo modificado en forma genética tiene un genoma el cual se modifica (es decir muta o cambia) de su forma normal (es decir tipo natural o que ocurre en la naturaleza) y/o se modifica para expresar material genético extra cromosómico (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante) de modo que se logre el resultado deseado por ejemplo, incremente, disminuya o modifique de otra manera la expresión y/o la actividad enzimática y/o producción modificada de glucosamina o N-acetilglucosamina como resultado de la modificación (s)). En forma más particular, la modificación para el microorganismo puede lograrse mediante modificación del genoma del microorganismo (genes endógenos) y/o mediante la introducción de material genético (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante) dentro del microorganismo, el cual puede permanecer extracromosomal o puede integrarse dentro del genoma microbiano huésped. Por lo tanto, la modificación genética puede incluir la introducción o modificación de secuencias reguladoras que regulan la expresión de secuencias de ácido nucleico endógenas o introducidas en forma recombinante en el microorganismo, la introducción de moléculas de ácido nucleico recombinante tipo natural o modificadas (por ejemplo, que codifican proteínas tipo natural o modificadas) la modificación de genes endógenos en el microorganismo, o cualquier otra modificación que de cómo resultado que el microorganismo tenga las características específicas con respecto a la expresión enzimática y/o actividad biológica. La modificación genética de un microorganismo, puede lograrse utilizando técnicas de desarrollo de cepa y/o de genética molecular clásicas. Dichas técnicas son conocidas en el arte, y se describen de manera general para microorganismos, por ejemplo en la publicación de Sambrook y asociados, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press. La referencia de Sambrook y asociados, ¡bid, se incorpora en su totalidad a la presente invención como referencia. Un microorganismo modificado en forma genética puede incluir un microorganismo en el cual se han insertado, eliminado y/o modificado (es decir, mutado; por ejemplo, mediante inserción, eliminación, sustitución y/o inversión de nucleótidos), moléculas de ácido nucleico, de forma tal que las modificaciones proporcionan el efecto deseado dentro del microorganismo. De acuerdo con la presente invención, un microorganismo modificado en forma genética incluye un microorganismo que ha sido modificado utilizando tecnología recombinante. En una modalidad de la presente invención, una modificación genética de un microorganismo incrementa o disminuye la actividad de una proteína implicada en una trayectoria metabolica de aminoazúcares, de acuerdo con la presente invención. Dicha modificación genética incluye cualquier tipo de modificación, e incluye en forma específica modificaciones realizadas mediante tecnología recombinante y/o mediante mutagénesis clásica. Tal como se utiliza en la presente invención, las modificaciones genéticas que dan como resultado una disminución en la expresión genética, en la función del gen, o en la función del producto de gen (es decir, la proteína codificada por el gen) pueden referirse como una desactivación (total o parcial), eliminación, interrupción, bloqueo, silenciación o inactivación de un gen. Por ejemplo, una modificación genética en un gen que da como resultado una disminución en la función de la proteína codificada por dicho gen, puede ser el resultado de una eliminación total del gen (es decir, el gen no existe, y por consiguiente no existe la proteína), una mutación en el gen que da como resultado la traducción incompleta o la no traducción de la proteína (por ejemplo, la proteína no se expresa) o una mutación en el gen la cual disminuye o elimina la función natural de la proteína (una proteína expresada, la cual tiene actividad o acción enzimática disminuida o no la tiene). En forma más específica, la referencia a la disminución de la acción o actividad de enzimas aquí mencionada, se refiere de manera general a cualquier modificación genética en el microorganismo en cuestión, que de como resultado la expresión y/o funcionalidad disminuida (actividad biológica) de las enzimas e incluye actividad disminuida de las enzimas (por ejemplo, actividad específica) inhibición o degradación incrementada de las enzimas, así como una reducción o eliminación de expresión de las enzimas. Por ejemplo, la acción o actividad de una enzima de la presente invención puede disminuirse bloqueando o reduciendo la producción de la enzima, reduciendo la actividad enzimática o inhibiendo la actividad de la enzima. Las combinaciones de algunas de estas modificaciones también son posibles. El bloqueo o reducción de la producción de una enzima puede incluir colocar el gen que codifica la enzima bajo el control de un promotor que requiere la presencia de un compuesto de inducción en el medio de crecimiento. Al establecer condiciones para que se elimine el inductor del medio, podría terminarse la expresión del gen que codifica la enzima (y por consiguiente, la síntesis de enzimas). El bloqueo o reducción de la actividad de una , enzima, también podría incluir utilizar un método con tecnología de excisión similar al que se describe en la Patente Norteamericana No. 4,743,546, incorporada a presente invención como referencia. Para utilizar este método, el gen que codifica la enzima de interés se clona entre secuencias genéticas específicas que permiten la excisión específica, controlada del gen procedente del genoma. La excisión podría ser estimulada, por ejemplo, mediante un cambio en la temperatura de cultivo, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 4,743,546 o a través de alguna otra señal física o de nutrición. Las modificaciones genéticas que dan como resultado un incremento en la expresión o función del gen, pueden referirse como una amplificación, sobre producción, sobreexpresión, activación, aumento, adición o activación de un gen. Más específicamente, la referencia para incrementar la acción (o actividad) de las enzimas u otras proteínas descritas en la presente invención se refiere generalmente a cualquier modificación genética en el microorganismo en cuestión, que de cómo resultado la expresión y/o funcionalidad incrementada (actividad biológica) de las enzimas o proteínas e incluye una mayor actividad de las enzimas (por ejemplo actividad específica o actividad enzimática in. vivo), inhibición o degradación reducida de las enzimas y sobreexpresión de las mismas. Por ejemplo, se puede incrementar un número de copias del gen, se puede incrementar los niveles de expresión a través del uso de un promotor que proporcione mayores niveles de expresión que el del promotor nativo, o se puede alterar un gen mediante ingeniería genética o mutagénesis clásica para incrementar la actividad biológica de una enzima. También son posibles combinaciones de algunas de estas modificaciones.

En general, de acuerdo con la presente invención un incremento o disminución en una característica determinada de un mutante o enzima modificada (por ejemplo, actividad enzimática), se hace con referencia a la misma característica de una enzima de tipo natural (es decir, normal, no modificada) que se deriva del mismo organismo (a partir de la misma fuente o secuencia paterna) la cual se mide o establece bajo las mismas condiciones o condiciones equivalentes. En forma similar, un incremento o disminución en una característica de un microorganismo modificado en forma genética (por ejemplo, sobreexpresión y/o actividad biológica de una proteína, o producción de un producto) se realiza con referencia a la misma característica de un microorganismo tipo natural de la misma especie, y preferentemente la misma cepa bajo las mismas condiciones o condiciones equivalentes. Dichas condiciones incluyen las condiciones de ensayo o cultivo (por ejemplo componentes, temperatura, pH, etc, del medio) bajo las cuales se mide la actividad de la proteína (por ejemplo, expresión o actividad biológica) u otra característica del microorganismo así como el tipo de ensayo utilizado, el microorganismo huésped que se evalúa, etc. Tal como se describió anteriormente, las condiciones equivalentes son condiciones (por ejemplo, condiciones de cultivo) que son similares, aunque no necesariamente idénticas (por ejemplo se pueden tolerar algunos cambios conservadores), y que no cambian sustancialmente el efecto en el crecimiento de microbios o expresión enzimática o actividad biológica, comparado con una comparación realizada bajo las mismas condiciones. Preferentemente, un microorganismo modificado en forma genética que tiene una modificación genética que incrementa o disminuye la actividad de una proteína determinada (por ejemplo, una enzima) tiene un incremento o disminución, respectivamente, en la actividad (por ejemplo, expresión, producción y/o actividad biológica) de la proteína, tal como se compara con la actividad de la proteína tipo natural en un microorganismo tipo natural, de al menos aproximadamente el 5%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 10%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 15%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 20%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 25%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 30%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 35%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 40%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 45%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 50%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 55%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 60%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 65%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 70%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 75%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 80%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 85%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 95%, o cualquier porcentaje, en enteros totales entre 5% y 100% (por ejemplo, 6%, 7%, 8%, etc.). Las mismas diferencias se prefieren cuando se compara una molécula o proteína de ácido nucleico modificada aislada directamente con la molécula o proteína de ácido nucleico tipo natural aislada (por ejemplo, si la comparación se realiza in vitro, tal como se compara con ¡n vivo). En otro aspecto de la presente invención, un microorganismo modificado en forma genética que tiene una modificación genética que incrementa o disminuye la actividad de una proteína determinada (por ejemplo, una enzima), tiene un incremento o disminución de al menos aproximadamente 2 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 5 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 10 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 20 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 30 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 40 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 50 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 75 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 100 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 125 dobleces, y más preferentemente al menos aproximadamente 150 dobleces, o cualquier incremento de entero que comience a partir de al menos aproximadamente 2 dobleces (por ejemplo, 3 dobleces, 4 dobleces, 5 dobleces, 6 dobleces, etc.) en la actividad (por ejemplo, expresión, producción y/o actividad biológica) de la proteína, tal como se compara con la actividad de la proteína tipo natural en un microorganismo tipo natural,. La modificación genética de un microorganismo para proporcionar actividad incrementada o disminuida (incluyendo expresión, actividad específica, actividad ¡n vivo, etc.) afecta preferentemente la actividad de una trayectoria biosintética de glucosamina y/o N-acetilglucosamina una trayectoria metabólica de aminoazúcares en el organismo, ya sea que la trayectoria sea endógena y modificada en forma genética, endógena con la introducción de una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes en el organismo, o que se proporcione completamente mediante tecnología recombinante. De acuerdo con la presente invención, para "afectar la actividad de una trayectoria biosintética de glucosamina y/o N-acetilglucosamina", se incluye cualquier modificación genética que origine cualquier cambio o modificación detectable o medible en la trayectoria biosintética de glucosamina y/o N-acetilglucosamina expresada a través del organismo, tal como se compara en la ausencia de la modificación genética. Un cambio o modificación detectable en la trayectoria biosintética de glucosamina y/o N-acetilglucosamina puede incluir pero no se limita a, un cambio detectable en la producción de al menos un producto en la trayectoria biosintética de glucosamina y/o N-acetilglucosamina, o un cambio detectable en la producción de glucosamina o N-acetilglucosamina intracelular y/o extracelular mediante el microorganismo. En una modalidad de la presente invención, una modificación genética incluye una modificación y una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima en particular u otra proteína, tal como se describe en la presente invención. Dicha modificación puede ser para la enzima o proteína endógena, mediante lo cual un microorganismo que contiene en forma natural dicha proteína se modifica en forma genética, por ejemplo, mediante mutagénesis y técnicas de selección clásicas y/o técnicas de genética molecular, que incluyen técnicas de ingeniería genética. Las técnicas de ingeniería genética pueden incluir, por ejemplo, utilizar un vector recombinante de dirección para eliminar una parte de un gen endógeno o para reemplazar una parte de un gen endógeno con una secuencia heteróloga, tal como una secuencia que codifica una enzima mejorada u otra proteína o un promotor diferente que incrementa la expresión de la enzima endógena u otra proteína. Las técnicas e ingeniería genética también pueden incluir la sobreexpresión de un gen utilizando tecnología recombinante. Por ejemplo, se puede introducir un promotor no nativo en la corriente ascendente de al menos un gen que codifica una enzima u otra proteína de interés en la trayectoria metabólica de aminoazúcares descrita en la presente invención. Preferentemente, la secuencia de corriente ascendente 5' de un gen endógeno, se reemplaza por un promotor constitutivo, un promotor inducible, o un promotor con expresión óptima bajo las condiciones de crecimiento utilizadas. Este método es especialmente útil cuando el gen endógeno no es activo o no es lo suficientemente activo bajo las condiciones de crecimiento utilizadas. En otro aspecto de esta modalidad de la presente invención, la modificación genética puede incluir la introducción de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una enzima o proteína de interés en un huésped. El huésped puede incluir: (1) una célula huésped que no expresa la enzima o proteína en particular, o (2) una célula huésped que no expresa la enzima o proteína en particular, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante introducida cambia o aumenta la actividad de la enzima u otra proteína en el microorganismo. La presente invención pretende abarcar cualquier microorganismo modificado en forma genética, en donde el microorganismo comprende al menos una modificación adecuada para que un proceso de fermentación produzca glucosamina o N-acetilglucosamina de acuerdo con la presente invención. Un microorganismo modificado en forma genética puede modificarse mediante tecnología recombinante, tal como mediante introducción de una molécula de ácido nucleico aislada en un microorganismo. Por ejemplo, un microorganismo modificado en forma genética puede ser transfectado con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de interés, tal como una proteína para la cual se desea una expresión incrementada. La molécula de ácido nucleico transfectada puede permanecer extracromosomal o puede integrarse en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula huésped transfectada (por ejemplo, recombinante), de forma tal que se retenga su habilidad para ser expresada. Preferentemente, una vez que una célula huésped de la presente invención se transfecta con una molécula de ácido nucleico, la molécula de ácido nucleico se integra en el genoma de la célula huésped. Una ventaja significativa de integración, es que la molécula de ácido nucleico se mantiene en forma estable en la célula. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico integrada se enlaza en forma operativa a una secuencia de control de transcripción (descrita más adelante) la cual puede ser inducida para controlar la expresión de la molécula de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico puede integrarse en el genoma de la célula huésped, ya sea mediante integración aleatoria o dirigida. Dichos métodos de integración son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la cepa E. coli ATCC 47002 contiene mutaciones que confieren en la misma, una incapacidad para mantener plásmidos que contienen un origen de réplica Co1E1. Cuando dichos plásmidos se transfieren a esta cepa, la selección de marcadores genéticos contenidos en el plásmido, da como resultado la integración del plásmido en el cromosoma. Esta cepa puede ser transformada, por ejemplo, con plásmidos que contienen el gen de interés y un marcador seleccionado flanqueado por los términos 5' y 3' del gen lacZ de E. coli. Las secuencias lacZ dirigen el ADN de entrada al gen lacZ contenido en el cromosoma. La integración en el locus lacZ reemplaza el gen lacZ intacto, que codifica la ß-galatosidasa enzimática con un gen lacZ parcial interrumpido por el gen de interés. Se pueden seleccionar integrantes exitosos para la negatividad de ß-galatosidasa. También se puede producir un microorganismo modificado en forma genética mediante la introducción de moléculas de ácido nucleico en un genoma de célula receptora a través de un método, tal como la utilización de un bacteriófago de transducción . El uso de una tecnología recombinante y tecnología de bacteriófago de transducción para producir diversos microorganismos modificados en forma genética de la presente invención, son conocidos en la técnica y se describen con detalle en la sección de ejemplos. Los vectores y métodos fueron descritos por Hamilton y asociados (1989, J. Bacterial. 171: 4617-4622) para elaborar una eliminación de gen dirigido y una integración genética en el cromosoma E. col¡ mediante cambio de temperatura. El método se adaptó para desarrollar diferentes cepas E. coíi de producción de glucosamina. Los protocolos para la integración genética incluyen los siguientes pasos importantes. El primer paso es clonar la secuencia del sitio de dirección y elaborar una eliminación y/o inserción interna del gen externo que será integrado en el sitio de eliminación. El segundo paso es subclonar el fragmento que contiene estas secuencias en un vector de integración sensible a la temperatura que contiene un origen de réplica sensible a la temperatura y un marcador de seleccionar antibiótica. El tercer paso, es transformar el vector de integración en la cepa huésped de E. coli y seleccionar los clones con todo el plásmido integrado en el cromosoma a través de un solo caso de recombinación cruzada, bajo una temperatura no permitible (42°C). El cuarto paso es crecer las células de clones seleccionados en un cultivo líquido a una temperatura permitible (30°C). Las células con el plásmido integrado tienen tendencia a perder el plásmido. Las células que han perdido la parte del origen de réplica y el gen de resistencia a antibióticos o todo el plásmido, crecerán fuera del cultivo. Normalmente, este paso se logra inoculando un medio LB de 50-ml con células procedentes de un conjunto de dos a diez clones y creciendo el cultivo durante 24 horas. El cultivo se pasa a un medio fresco en una dilución de 1000 veces y se crece durante otro período de 24 horas. En el quinto paso, las células se plaquean y se seleccionan los clones que perdieron la resistencia a antibióticos. Se pueden utilizar procedimientos de selección específica de gen, dependiendo de la naturaleza del gen Integrado o gen eliminado. Normalmente para clasificación de clones, se lleva a cabo PCR utilizando un cebador que puede distinguir los clones con el cambio proyectado dentro del cromosoma, de su forma nativa a través del tamaño de los productos PCR. Los clones se confirman mediante análisis de Manchado Southern, utilizando sondas específicas para la secuencia de ADN integrada o eliminada. Quedará entendido que la presente invención describe un método que comprende el uso de un microorganismo con una capacidad para producir cantidades comercialmente útiles de glucosamina y/o N-acetilglucosamina en un proceso de fermentación (por ejemplo, preferentemente una capacidad mejorada para producir glucosamina y/o N-acetilglucosamina en comparación con un microorganismo tipo natural cultivado bajo las mismas condiciones. Tal como se describe en la presente invención, un proceso de fermentación es un proceso de cultivo de células, tal como microorganismos, en un contenedor, bioreactor, termentador u otra cama de cultivo adecuada, con el objeto de producir un producto a partir de las células (por ejemplo, las células producen un producto durante el proceso de cultivo). El producto es normalmente un producto útil para propósitos experimentales o comerciales. El método de fermentación se logra mediante la modificación genética de uno o más genes que codifican una proteína involucrada en una trayectoria metabólica de aminoazúcares, que da como resultado la producción (expresión) de una proteína que tiene una función alterada (por ejemplo, incrementada o disminuida) comparada con una proteína tipo natural correspondiente. Dicha función alterada mejora la actividad del microorganismo construido en forma genética para producir glucosamina y/o N-acetilglucosamina. Los expertos en la técnica podrán apreciar que la producción de microorganismos modificados en forma genética que tienen una función alterada en particular, tal como se describe en la presente invención (por ejemplo una capacidad mejorada para producir glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato y/o N-acetilgIucosamina-1-fosfato) tal como mediante técnica de selección específicas descritas en los ejemplos, pueden producir muchos organismos que cumplen con el requerimiento funcional determinado, a pesar de una gran variedad de diferentes modificaciones genéticas. Por ejemplo, las diferentes eliminaciones y/o sustituciones de nucleotidos aleatorios en una secuencia de ácido nucleico determinada pueden dar surgimiento al mismo resultado fenotípico (por ejemplo, acción disminuida de la proteína codificada por la secuencia). La presente invención contempla cualquier modificación genética que de cómo resultado la producción de un microorganismo que tenga las características aquí establecidas. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, un microorganismo modificado en forma genética incluye un microorganismo que tiene una capacidad mejorada para sintetizar glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato. De acuerdo con la presente invención una "capacidad mejorada para sintetizar" un producto, se refiere a cualquier aumento, o activación, en una trayectoria metabólica del amino azúcar relacionado con la síntesis del producto, de modo que el microorganismo produzca una cantidad incrementada del producto comparada con el microorganismo tipo natural cultivado bajo las mismas condiciones. En un aspecto de la presente invención, un microorganismo modificado en forma genética útil en un método de fermentación, produce 1 g/L y más preferentemente al menos aproximadamente 5 g/L, y más preferentemente, al menos aproximadamente 10 g/L, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente 20 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 30 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 40 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 50 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 60 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 70 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 80 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 90 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 100 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 110 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 120 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 150 g/L, y más preferentemente al menos aproximadamente 180 g/L, o cualquier cantidad superior, o cualquier cantidad entre al menos aproximadamente 1 g/L y al menos aproximadamente 500 g/L, en enteros completos (por ejemplo, 2 g/L, 3 g/L, etc.) de: glucosamina, glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 - fosfato, N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato y/o N-acetilglucosamina-1-fosfato, cuando se cultiva bajo cualesquiera condiciones de cultivo adecuadas, y particularmente bajo cualesquiera de las condiciones de cultivo aquí descritas. En otro aspecto, un microorganismo modificado en forma genética útil en un método de fermentación de la presente invención, produce al menos aproximadamente 20 veces más de glucosamina, gIucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato, y preferentemente al menos aproximadamente 5 veces, y más preferentemente al menos aproximadamente 10 veces, y más preferentemente al menos aproximadamente 25 veces, y más preferentemente al menos aproximadamente 50 veces, y más preferentemente al menos aproximadamente 100 veces, y más preferentemente al menos aproximadamente 200 veces, incluyendo cualquier incremento entre al menos 2 veces y al menos 200 veces, en incrementos de enteros completos (por ejemplo, al menos 3 dobleces, al menos 4 dobleces, etc.), más de glucosamina, glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato que un microorganismo de tipo natural (por ejemplo, no modificado, que ocurre en la naturaleza) de la misma especie (y preferentemente y la misma cepa) cultivado bajo las misma condiciones o condiciones equivalentes que el microorganismo modificado en forma genética. En la sección de ejemplos, se identifica un número de microorganismos específicos que tiene dichas características. En un aspecto, un microorganismo modificado en forma genética útil en un método de fermentación de la presente invención, produce al menos aproximadamente 1 g/L de glucosamina cuando se cultiva durante aproximadamente 24 horas, a una temperatura de 37°C, a una densidad celular de al menos aproximadamente 8 g/L por peso de célula seca, en un medio de fermentación con un pH de 7.0 que comprende: 14 g/L K2HP04, 16 g/L KH2P04, 1 g/L Na3Citrato2H20, 5 g/L (NH4)2S04, 20 g/L glucosa, 10 mM gS04, 1 mM CaCI2, y 1 m IPTG. En otro aspecto, un microorganismo modificado en forma genética útil en un método de fermentación de la presente invención, produce al menos 1 g/L de glucosamina cuando se cultiva durante aproximadamente de 10 hasta aproximadamente 60 horas a una temperatura desde aproximadamente 28°C hasta aproximadamente 37°C a una densidad celular de al menos aproximadamente 8 g/L por peso de célula seca, en un medio de fermentación con un pH de 7.0 que comprende: 14 g/L K2HP04, 16 g/L KH2P04, 1 g/L Na3Citrato2H20, 5 g/L (NH4)2S04, 20 g/L glucosa, 10 mM MgS04, 1 mM CaCI2, y desde aproximadamente 0.2 mM hasta aproximadamente 1 mM de IPTG. En una modalidad preferida la cantidad de IPTG es de aproximadamente 0.2 m . Un microorganismo que será utilizado en el método de fermentación de la presente invención (por ejemplo una célula huésped u organismo de producción) es cualquier microorganismo (por ejemplo una bacteria, un protista, una alga, un hongo u otro microbio) y más preferentemente es una bacteria, una levadura o un hongo. Los géneros de bacteria adecuados incluyen, pero no se limitan a, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, y Streptomyces. Las especies de bacteria adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus lincheniformis, Lactobacillus brevis, Psudomonas aeruginosa y Streptomyces lividans. Los géneros adecuados de levadura incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, y Phaffia. Las especies de levadura adecuada incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, P. canadensis, Kluveromyces marxianus y Phaffia rhodozyma. Los géneros de hongos adecuados incluyen, pero no se limitan a, Aspergillus, Absidia, Rhizopus, Chrysosporlum, Neurospora y Trlchoderma. Las especies fúngicas adecuadas incluyen, pero no limitan a, Aspergillus crassa, N. intermedia y Trichoderm reesei. Las cepas particularmente preferidas de Escherichia coli incluyen K-12, B y W, y más preferentemente K-12. Aunque Escherichia coli es una bacteria preferida y se utiliza para ejemplificar diversas modalidades de la presente invención, quedará entendido que en el método de la presente invención, se puede utilizar cualquier microorganismo que produzca glucosamina y/o N-acetilglucosamina, y pueda ser modificado en forma genética para aumentar la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. Un microorganismo para utilizarse en el método de fermentación de la presente invención también puede ser referido como un organismo de producción. En una modalidad preferida, el microorganismo modificado en forma genética es una bacteria o una levadura, y más preferentemente, una bacteria del género Escherichia, e incluso más preferentemente Escherichia coli. Una Escherichia coli modificada en forma genética, tiene preferentemente una modificación en un gen que incluye pero no se limita a, nagA, nagB, nagC, nagD, nagE, manXYZ, glmM, pfkB, pfkA, glmU, glmS, GNA1, ptsG o un gen de fosfatasa. En otra modalidad, dicha Escherichia coli modificada en forma genética tiene una eliminación de los genes de regulación nag, y en aún otra modalidad, una eliminación de los genes de regulación nag y una modificación genética en genes manXYZ, de modo que las proteínas codificadas por los genes manXYZ tienen acción disminuida.

De acuerdo con la presente invención, la referencia a una enzima u otra proteína en particular en la presente invención se refiere a cualquier proteína que tenga al menos una actividad biológica de la proteína de referencia de tipo natural, incluyendo proteínas de longitud total, proteínas de función o cualquier homologo de una proteína que ocurra en la naturaleza (incluyendo variantes alélicas naturales, fragmentos, proteínas relacionadas procedentes de diferentes organismos y variantes derivadas en forma sintética o artificial (homólogos)). Un homólogo (muíante, variante, forma modificada) de una proteína de referencia incluye proteínas que difieren de la proteína de referencia que ocurre en la naturaleza, en cuanto a que al menos uno o algunos, pero no se limitan a uno o algunos, aminoácidos han sido eliminados (por ejemplo, una versión truncada de la proteína tal como un péptido o fragmento), insertados, invertidos, substituidos y/o derivados (por ejemplo, mediante glucosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o inositol de glucosilfosfatidilo). Un homólogo preferido es un fragmento biológicamente activo de una proteína que ocurre en forma natural. Otros homólogos preferidos de proteínas que ocurren en forma natural útiles en la presente invención, se describen con mayor detalle más adelante. Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención puede codificar el producto de traducción de cualquier estructura de lectura abierta, dominio, fragmento biológicamente activo de la proteína específica, o cualquier homólogo de una proteína o dominio que ocurre en forma natural, el cual tenga actividad biológica. Una proteína aislada, de acuerdo con la presente invención, es una proteína que ha sido eliminada de su medio natural, (por ejemplo, que ha sido sometido a manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas producidas en forma recombinante, y proteínas producidas en forma sintética, por ejemplo. En la sección de ejemplos, se describen diversas proteínas producidas en forma recombinante. Por lo tanto, el término "aislado" no refleja el punto hasta el cual la proteína ha sido purificada. Además, y a manera de ejemplo y haciendo referencia a una proteína hipotética denominada "proteína X" (por ejemplo, cualquier enzima o proteína utilizada en la presente invención puede ser sustituida para el término) una "proteína X E. col¡", se refiere a una proteína X (que incluye un homólogo de una proteína X que ocurre en forma natural) de E. coli o a una proteína X que ha sido producida de otra manera a partir del conocimiento de la estructura (por ejemplo secuencia) y posiblemente la función de una proteína X que ocurre en forma natural procedente de E. coli. En otras palabras, una proteína X de E. coli incluye cualquier proteína X que tiene una estructura y función sustancialmente similar a la de una proteína X de E. coli que ocurre en forma natural o que es biológicamente activa (por ejemplo, tiene actividad biológica), homologa a una proteína X de E. coli que ocurre en forma natural, tal como se describe con detalle en la presente invención. Por lo tanto, una proteína X de E. coli puede incluir, proteínas purificadas, o parcialmente purificadas, recombinantes, mutadas/modificadas y sintéticas. Esta descripción aplica en forma similar a la proteína X procedente de otros microorganismos, como los que se describen en la presente invención. Los homólogos pueden ser el resultado de variación alélica natural o mutación natural. Un variante alélico que ocurre en forma natural de un ácido nucleico que codifica una proteína, es un gen que ocurre esencialmente en el mismo Iocus (o loci) en el genoma, que el gen que codifica dicha proteína, pero el cual, debido a las variaciones naturales originadas, por ejemplo, mediante la mutación o recombinación, tienen una secuencia similar pero no idéntica. Las variantes alélicas normalmente codifican proteínas que tienen actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con el cual están siendo comparadas. Una clase de variantes alélicas puede codificar la misma proteína pero tener las diferentes secuencias de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético. Las variantes alélicas también pueden comprender alteraciones en las regiones no traducidas 5' ó 3' del gen (por ejemplo, en regiones de control de regulación). Las variantes alélicas, son bien conocidas para los expertos en la técnica. Los homólogos que pueden ser producidos utilizando técnicas conocidas en el arte para la producción de proteínas incluyen, pero no se limitan a, modificaciones directas a la proteína aislada que ocurre en forma natural, síntesis de proteína directa o modificaciones a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína, utilizando, por ejemplo, técnicas de ADN clásicas o recombinantes, para efectuar la mutagénesis aleatoria o dirigida. Las modificaciones en homólogos, tal como se compara con la proteína tipo natural, ya sea agonizan, antagonizan o no cambian sustancialmente, la actividad biológica básica del homólogo, como se compara con la proteína que ocurre en forma natural. En general, la actividad biológica o acción biológica de una proteína se refiere a cualquier función(es) exhibida o llevada a cabo por la proteína que se adscribe a la forma que ocurre en forma natural de la proteína, tal como se mide u observa in vivo (por ejemplo, en el ambiente fisiológico natural de la proteína) o in vitro (por ejemplo, bajo condiciones de laboratorio). La actividad biológica de las enzimas y proteínas utilizadas en la presente invención han sido descritas con detalle anteriormente. Por ejemplo, la enzima referida generalmente en la presente invención, "sintasa de glucosamina-6-fosfato", cataliza la formación de glucosamina-6-fosfato y glutamato a partir de fructosa-6-fosfato y glutamina. Las modificaciones de una proteína, tal como en un homólogo, pueden dar como resultado proteínas que tienen el mismo nivel de actividad biológica que la proteína que ocurre en forma natural, o proteínas que tienen actividad biológica disminuida o incrementada, tal como se compara con proteínas que ocurren en forma natural. Las modificaciones que dan como resultado una disminución en expresión o una disminución en actividad de la proteína, pueden ser referidas como una inactivación (completa o total), desactivación, o acción disminuida de una proteína. En forma similar, las modificaciones que dan como resultado un incremento en una expresión o un incremento en la actividad de la proteína, pueden ser referidas como una amplificación, sobreproducción, activación, aumento, o acción incrementada de una proteína. Una subunidad, homólogo o fragmento funcional de una proteína determinada, tienen preferentemente, la capacidad de llevar a cabo sustancialmente la misma función biológica (por ejemplo, al menos cualitativamente la misma) de la proteína nativa (es decir, tiene la actividad biológica). Se debe observar que una subunidad, fragmento u otro homólogo funcional de una proteína no tiene que tener necesariamente el mismo nivel de actividad biológica que la proteína de referencia o tipo natural, con el objeto de considerarse que tiene la actividad biológica de la proteína de referencia o tipo natural (por ejemplo, una similitud cualitativa es suficiente). En una modalidad, es preferible que las modificaciones en homólogos, tal como se compara con la proteína tipo natural, no disminuyan sustancialmente la actividad biológica básica de la proteína tal como se compara con la proteína que ocurre en forma natural. La actividad biológica incrementada (es decir, actividad enzimática incrementada), puede ser deseable en un homólogo. Los homólogos también pueden tener características diferentes a la actividad funcional, o enzimática de la proteína, tal como se compara con la forma que ocurre en forma natural, tal como una sensibilidad disminuida para inhibir ciertos compuestos tal como se compara con la proteína que ocurre en forma natural. De acuerdo con la presente invención, una proteína aislada, que incluye un homólogo o fragmento biológicamente activo del mismo, tiene al menos una característica de actividad biológica del tipo natural, o proteína que ocurre en forma natural. Los métodos para detectar y medir la expresión de proteínas y actividad biológica incluyen, pero no se limitan a, medida de transcripción de la proteína, medida de traducción de la proteína, medida de la localización celular de la proteína, medida del enlace o asociación de la proteína con otra proteína, medida del enlace o asociación del gen que codifica la secuencia reguladora de proteínas con una proteína u otro ácido nucleico, medida de un incremento, disminución o inducción de la actividad biológica de la proteína en una célula que expresa la proteína. Los métodos para medir los niveles de expresión de proteína de una proteína de acuerdo con la presente invención, incluyen pero no se limitan a manchado Western, ¡nmunohistoquímica, citometría de flujo, u otros ensayos a base de inmunología, ensayos a base de una propiedad de la proteína que incluyen pero no se limitan a, enlace de ligante, actividad enzimática o interacción con otras partes de la proteína. Los ensayos de enlace también son conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar una máquina BIAcore para determinar la constante de enlace de un complejo entre dos proteínas. La constante de disociación de! complejo, puede determinarse monitoreando cambios en el índice de refracción con respecto al tiempo conforme el regulador pasa a través del chip (O'Shannessy y asociados. Anal. Biochem, 212: 457-468 (1993); Schuster y asociados., Nature 365: 343-347 (1993)). Otros ensayos adecuados para medir el enlace de una proteína a otra, incluyen, por ejemplo, inmunoensayos tales como ensayos inmunoabsorbentes enlazados por enzima (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA), o determinación de enlace monitoreando el cambio en las propiedades espectroscópicas u ópticas de las proteínas a través de fluorescencia, absorción UV, dicrosismo circular, resonancia magnética nuclear (NMR). Los ensayos para medir la actividad enzimática de la proteína utilizada en la presente invención, son bien conocidos en la técnica y muchos se describen en la sección de ejemplos. Muchas de las enzimas y proteínas implicadas en la trayectoria metabólica de aminoázucares, y que representan objetivos deseables para modificación y uso en los procesos de fermentación aquí descritos, han sido descritos anteriormente en términos de su función y secuencia de aminoácidos (y secuencia de ácidos nucleicos que codifican la misma) de proteínas mutantes o tipo natural representativas. En una modalidad de la presente invención, los homólogos de una proteína determinada (los cuales pueden incluir proteínas relacionadas de otros organismos o formas modificadas de la proteína determinada) están comprendidos para utilizarse en un organismo modificado en forma genética de la presente invención. Los homólogos de una proteína comprendidos a través de la presente invención, pueden comprender una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente el 35% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 40% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 45% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 50% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 55% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 60% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 65% idéntica, y más preferentemente ai menos aproximadamente el 70% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 75% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 80% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 85% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 90% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 95% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 96% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 97% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 98% idéntica, y más preferentemente al menos aproximadamente el 99% idéntica, y cualquier porcentaje de identidad entre el 35% y el 99%, en enteros completos (es decir, 36%, 37%, etc.) con una secuencia de aminoácidos descrita en la presente invención que representa la secuencia de aminoácidos de una enzima o proteína que puede ser modificada o sobreexpresada de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos del homólogo tiene una actividad biológica de la proteína tipo natural o de referencia.

Tal como se utiliza en la presente invención, a menos que se especifique lo contrario, la referencia a un porcentaje (%) de identidad se refiere a una evaluación de homología la cual se lleva a cabo utilizando: (1) una búsqueda de homología BLAST 2.0 Basic BLAST utilizando blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácidos nucleicos con parámetros por omisión estándar, en donde la secuencia de consulta se filtra para regiones de baja complejidad por omisión (descrito en la publicaciónde Altschul, S.F., Madden, T.L., Scháfer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs.". La publicación de Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia), (2) una alineación BLAST 2, (utilizando los parámetros descritos más adelante); (3) y/o PSI-BLAST con los parámetros por omisión estándar (Position-Specific lterated BLAST). Se debe observar que debido a algunas diferencias en los parámetros estándar entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, se deben reconocer dos secuencias específicas, como teniendo una homología significativa utilizando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda llevada a cabo en BLAST 2.0 Basic BLAST utilizando una de las secuencias como la secuencia de consulta, puede no identificar la segunda secuencia en las partidas superiores.

Además, PSI-BLAST proporciona una versión automatizada, fácil de utilizar de una búsqueda de "perfil", la cual es una forma sensible para buscar los homólogos de la secuencia. El programa lleva a cabo primero una búsqueda de datos BLAST abierta. El programa PSI-BLAST utiliza la información procedente de cualesquiera alineaciones significativas regresadas para construir una matriz de calificación específica de posición, que reemplaza la secuencia de consulta para la siguiente vuelta de la búsqueda de base de datos. Por consiguiente, quedará entendido que el porcentaje de identidad puede determinarse utilizando cualesquiera de uno de estos programas. Se pueden alinear dos secuencias específicas a otra, utilizando la secuencia BLAST 2, tal como se describe en la publicación de Tatusova y Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. La alineación de secuencia BLAST 2 se lleva a cabo en blastp o blastn utilizando el algoritmo BLAST 2.0 para llevar a cabo una búsqueda BLAST abierta (BAST 2.0) entre las dos secuencias que permiten la introducción de brechas (eliminaciones e inserciones) en la alineación resultante. Para propósitos de claridad en la presente invención, se lleva a cabo una alineación de secuencia BLAST 2 utilizando los parámetros por omisión estándar que se encuentran a continuación. Para blastn, utilizando la matriz 0 BLOSUM62: Regresar a correspondencia = 1 Penalidad por falta de correspondencia = -2 Penalidades por abrir brecha (5) y extensión de brecha (2) gap x_dropoff (50) expect (10) tamaño de palabra (11) filtro (on) Para blastp, utilizando matriz 0 BLOSUM62: Penalidades por abrir brecha (11) y extensión de brecha (1) gap x_dropoff (50) expect (10) tamaño de palabra (3) filtro (encendido). Una proteína referenciada y/o utilizada en la presente invención, también puede incluir proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que comprenden ai menos 30 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia (es decir, 30 residuos de aminoácidos contiguos que tienen 100% de identidad con 30 aminoácidos contiguos de cualesquiera de las secuencias identificadas anteriormente). En una modalidad preferida, una proteína referenciada y/o utilizada en la presente invención, incluye proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que comprenden al menos aproximadamente 50, y más preferentemente al menos 75, y más preferentemente al menos 100, y más preferentemente al menos 115, y más preferentemente al menos 130, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 200, y más preferentemente al menos 250, y más preferentemente al menos 300, y más preferentemente al menos 350, residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia. En una modalidad, dicha proteína tiene una actividad biológica de la proteína de referencia. De acuerdo con la presente invención, el término "contiguo" o "consecutivo", con respecto a las secuencias de ácido nucleico ó aminoácidos aquí descritas, significa que será conectado en una secuencia no rota. Por ejemplo, para una primera secuencia que comprende 30 aminoácidos contiguos (o consecutivos) de una segunda secuencia, significa que la primera secuencia incluye una secuencia no rota de 30 residuos de aminoácidos que es el 100% idéntica a una secuencia no rota de 30 residuos de aminoácidos en la segunda secuencia. En forma similar, para una primera secuencia que tiene el "100% de identidad" con una segunda secuencia, significa que la primera secuencia corresponde en forma exacta con la segunda secuencia sin brechas entre los nucleótidos o aminoácidos. En otra modalidad, una proteína referenciada o utilizada en la presente invención, que incluye un homólogo, incluye una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es lo suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos de proteína que ocurre en forma natural, a una secuencia de ácido nucleico que codifica el homólogo que tiene la capacidad de hibridar bajo condiciones estrictas moderadas, altas o muy altas (descritas más adelante) para (por ejemplo con), una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que ocurre en forma natural (es decir, con el complemento de la hebra de ácido nucleico que codifica la proteína que ocurre en forma natural). Preferentemente, un homólogo determinado se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico que híbrida bajo condiciones estrictas moderadas, altas o muy altas para el complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de referencia o tipo natural. Un complemento de la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico de referencia, se refiere a la secuencia de ácido nucleico de la hebra de ácido nucleico que es complementaria con la hebra que codifica una proteína. Se apreciará que un ADN de hebra doble que codifica una secuencia de aminoácidos determinada, comprende un ADN de una sola hebra y su hebra de complementariedad que tiene una secuencia que es un complemento con el ADN de una sola hebra. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser ya sea de hilo doble o de un solo hilo, e incluyen las moléculas de ácido nucleico que forman híbridos estables bajo condiciones de hibridación estrictas con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína, y/o con el complemento de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína. Los métodos para deducir una secuencia complementaria son conocidos por los expertos en la técnica. Se debe observar que debido a que las tecnologías de secuenciación de aminoácidos y secuenciación de ácido nucleico no están completamente libres de errores, las secuencias aquí presentadas, cuando mucho, representan secuencias aparentes de las proteínas referenciadas de la presente invención. Ta! como se utiliza en la presente invención, la referencia a condiciones de hibridación se refiere a condiciones de hibridación estándar bajo las cuales, se utilizan las moléculas de ácido nucleico para identificar moléculas de ácido nucleico similares. Dichas condiciones estándar se describen, por ejemplo, en la publicación de Sambrook y Asociados, Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. La publicación de Sambrook y Asociados, ibid., está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia (ver específicamente las páginas 9.31-9.62). Además, las fórmulas para calcular la hibridación adecuada y condiciones de lavado para lograr una hibridación que permita diversos grados de no correspondencia de nucleótidos, se describen por ejemplo en la publicación de Meinkoth y Asociados, 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284, Meinkoth y Asociados, ibid., la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Más particularmente, las condiciones de hibridación y lavado estrictas moderadamente, tal como se refiere en la presente invención, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente el 70% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que está siendo utilizada para probar la reacción de hibridación (por ejemplo, condiciones que permiten aproximadamente el 30% o menos de no correspondencia de nucleótidos). Las condiciones de hibridación y lavado altamente estrictas, tal como se refiere en la presente invención, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente el 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que está siendo utilizada para probarse en la reacción de hibridación (por ejemplo, condiciones que permiten aproximadamente el 20% o menos de no correspondencia de los nucleótidos). Las condiciones de hibridación y lavado muy estrictas, tal como se refiere en la presente invención, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que está siendo utilizada para probarse en la reacción de hibridación (por ejemplo, condiciones que permiten aproximadamente el 10% o menos de no correspondencia de los nucleótidos). Tal como se describió anteriormente, un experto en la técnica puede utilizar las fórmulas que se describen en la publicación de Meinkoth y Asociados, ibid., para calcular las condiciones de hibridación y lavado adecuadas para lograr estos niveles particulares de no correspondencia de nucleótidos. Dichas condiciones variarán, dependiendo de los híbridos de ADN.ARN ó ADN:ADN que estén siendo formados. Las temperaturas de fusión calculadas para los híbridos de ADN:ADN son de 10°C menos que los híbridos de ADN:ARN. En las modalidades particulares, las condiciones de hibridación estrictas para los híbridos de ADN:ADN incluyen hibridación en una resistencia iónica de 6X SSC (0.9 M Na+) a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 35°C (condiciones estrictas bajas) más preferentemente entre 28°C y aproximadamente 40°C (condiciones más estrictas) e incluso más preferentemente, entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 45°C (condiciones incluso más estrictas, con condiciones de lavado adecuadas. En modalidades particulares, las condiciones de hibridación estrictas para los híbridos de ADN:ARN incluyen hibridación en una fuerza iónica de 6X SSC (0.9 M Na+) a una temperatura de entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 45°C, más preferentemente entre aproximadamente 38°C y aproximadamente 50°C, e incluso más preferentemente, entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 55°C, con condiciones de lavado similarmente estrictas. Estos valores se basan en cálculos de una temperatura de fusión para moléculas más grandes a aproximadamente 100 nucleótidos, 0% de formamida y un contenido G + C de aproximadamente 40%. Como alternativa, Tm se puede calcular en forma empírica tal como se establece en la publicación de Sambrook y Asociados, supra, páginas 9.31 a 9.62. En general, las condiciones de lavado deben ser tan estrictas como sea posible, y deben ser adecuadas para elegir condiciones de hibridación. Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de sal y condiciones de temperatura que son de aproximadamente de 20°C a 25°C debajo de la Tm calculada de un híbrido en particular, y condiciones de lavado que incluyen normalmente una combinación de sal y condiciones de temperatura que son de aproximadamente 12°C a 20°C debajo de la Tm calculada del híbrido en particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación adecuadas para utilizarse con híbridos de ADN:ADN incluyen hibridación de 2 a 24 horas en 6X SSC (50% de formamida), a una temperatura de al menos aproximadamente 42°C, seguido de pasos de lavado que incluyen uno o más lavados a temperatura ambiente y en aproximadamente 2X SSC, seguido de lavados adicionales a temperaturas mayores y una resistencia iónica inferior (por ejemplo, al menos un lavado a una temperatura de aproximadamente 37°C en aproximadamente 0.1X-0.5X SSC, seguido de al menos un lavado a una temperatura de aproximadamente 68°C en aproximadamente 0.1X-0.5X SSC).

En una modalidad, los homólogos pueden ser el resultado de una variación alélica natural o una mutación natural. Los homólogos de una proteína determinada también pueden ser proteínas que ocurren en forma natural que tienen substancialmente la misma función de los organismos diferentes con al menos una similitud estructural (por ejemplo, al menos aproximadamente el 35% de identidad) con otra en el nivel de ácido nucleico o aminoácido, tal como se describe en la presente invención. Los homólogos de la presente invención también pueden producirse utilizando técnicas conocidas en el arte, que incluyen pero no se limitan a, modificaciones directas a la proteína o modificaciones al gen que codifica la proteína, utilizando por ejemplo, técnicas de ADN clásicas o recombinantes para efectuar mutagénesis aleatoria o dirigida. Una variante alélica que ocurre en forma natural de un ácido nucleico que codifica una proteína determinada, es un gen que ocurre esencialmente en el mismo locus (o loci) en el genoma, el cual codifica la proteína determinada, pero el cual, debido a las variaciones naturales originadas, por ejemplo, por la mutación o recombinación, tiene una secuencia similar pero no idéntica. Las variantes alélicas naturales normalmente codifican proteínas que tienen actividad similar con la de la proteína codificada por el gen con el cual están siendo comparadas. Una clase de variantes alélicas puede codificar la misma proteína pero tener diferentes secuencias de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético. Las variantes alélicas también pueden comprender alteraciones en las regiones no traducidas 5' o 3' del gen (por ejemplo, en regiones de control reguladoras). Las variantes alélicas son bien conocidas para los expertos en la técnica. El tamaño mínimo de una proteína y/o homólogo de la presente invención, es en un aspecto, un tamaño suficiente para tener la actividad biológica deseada de la proteína. En otra modalidad, una proteína de la presente invención tiene al menos 30 aminoácidos de longitud, y más preferentemente, al menos aproximadamente 50, y más preferentemente al menos 75, y más preferentemente al menos 100, y más preferentemente al menos 115, y más preferentemente al menos 130, y más preferentemente al menos 150, y más preferentemente al menos 200, y más preferentemente al menos 250, y más preferentemente al menos 300, y más preferentemente al menos 350 aminoácidos de longitud. No existe límite, o diferente límite práctico, en cuanto al tamaño máximo de dicha proteína, ya que la proteína puede incluir una parte de una proteína determinada o una proteína de longitud total, además de la secuencia adicional (por ejemplo, una secuencia de proteína de fusión) si se desea. Los segmentos de fusión adecuados para utilizarse con la presente invención, incluyen pero no se limitan a, segmentos que pueden: aumentar la estabilidad de una proteína; proporcionar otra actividad biológica deseable (por ejemplo, una segunda fusión de enzima) y/o ayudar con la purificación de una proteína (por ejemplo, mediante cromatografía por afinidad). En una modalidad de la presente invención, cualesquiera de las secuencias de aminoácidos aquí descritas pueden producirse con desde al menos 1, y hasta aproximadamente 20 aminoácidos heterólogos adicionales que flanquean cada uno los extremos de terminal C y/o N de la secuencia de aminoácidos específica. La proteína o polipéptido resultante, puede referirse como "que consiste esencialmente de" la secuencia de aminoácidos específica. De acuerdo con la presente invención, los aminoácidos heterólogos son una secuencia de aminoácidos que no se encuentran naturalmente (por ejemplo, no se encuentran en la naturaleza, ¡n vivo) que flanquean la secuencia de aminoácidos específica, o que no están relacionados con la función de aminoácidos específica, o que podrían no codificarse a través de los nucleótidos que flanquean las secuencias de ácidos nucleicos que ocurren en forma natural que codifican la secuencia de aminoácidos específica conforme ocurre en el gen, si dichos nucleótidos en la secuencia que ocurre en forma natural fueron traducidos utilizando el uso de un codón estándar para el organismo del cual se deriva la secuencia de aminoácidos determinada. En forma similar, la frase "que consiste esencialmente de", cuando se utiliza con referencia a una secuencia de ácido nucleico en la presente invención, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos específica que puede estar flanqueada por desde al menos 1, y hasta tantos como 60 nucleótidos heterólogos adicionales en cada uno de los extremos 5' y/o 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos específica. Los nucleótidos heterólogos no se encuentran en forma natural (por ejemplo, no se encuentran en la naturaleza, ¡n vivo) que flanquean la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido específica conforme ocurre en el gen natural o no codifica en una proteína que imparte cualquier función adicional a la proteína o cambia la función de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos específica. Las modalidades de la presente invención, incluyen el uso y/o manipulación de moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas u otras proteínas en las trayectorias metabólicas de aminoazúcares descritas en la presente invención. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, incluye una molécula de ácido nucleico que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de, una secuencia de ácido nucleico que codifica cualesquiera de las enzimas u otras proteínas aquí descritas.

De acuerdo con la presente invención, una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que ha sido eliminada de su medio natural (por ejemplo, que ha sido sometida a manipulación humana), siendo su medio natural el genoma o cromosoma en el cual se encuentra en la naturaleza la molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, el término "aislado" no refleja necesariamente el grado en el cual ha sido purificada la molécula de ácido nucleico, sino que indica que la molécula no Incluye un genoma completo o un cromosoma completo en el cual se encuentra en forma natural la molécula de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir un gen, tal como un gen de sintasa de gIucosamina-6-fosfato descrito en la presente invención. Una molécula de ácido nucleico aislada que incluye un gen, no es un fragmento de un cromosoma que incluye dicho gen, sino más bien incluye la región de codificación y regiones reguladoras asociadas con el gen, aunque no se encuentran naturalmente genes adicionales en el mismo cromosoma. Una molécula de ácido nucleico aislada también puede incluir una secuencia de ácido nucleico específica flanqueada por (por ejemplo, en el extremo 5' y/o 3' de la secuencia) ácidos nucleicos adicionales que normalmente no flanquean la secuencia de ácido nucleico específica en la naturaleza (es decir, son secuencias heterólogas). Las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden incluir ADN, ARN (por ejemplo mARN), o derivados ya sea de ADN ó ARN (por ejemplo, cADN). Aunque la frase "molécula de ácido nucleico" se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física, y la frase "secuencia de ácido nucleico" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos que se encuentra en la molécula de ácido nucleico, las dos frases se pueden usar en forma intercambiable, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o a una secuencia de ácido nucleico, que tienen la capacidad de codificar una proteína. Preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención, se produce utilizando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación de reacción de cadena de polimerasa (PCR), clonación) síntesis química. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas de ácido nucleico natural y homólogos de las mismas, que incluyen pero no se limitan a, variantes alélicas naturales y moléculas de ácido nucleico modificadas en las cuales los nucleótidos han sido insertados, eliminados, substituidos y/o invertidos de tal forma que dichas modificaciones proporcionan el efecto deseado en la actividad biológica de la proteína. Las variantes alélicas y homólogos de proteína (por ejemplo, proteínas codificadas por homólogos de ácido nucleico) se han descrito con mayor detalle anteriormente. Se puede producir un homólogo de molécula de ácido nucleico utilizando un número de métodos conocidos para los expertos en la técnica (ver por ejemplo la publicación de Sambrook y Asociados, ibid.). Por ejemplo, se pueden modificar las moléculas de ácido nucleico utilizando una variedad de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, técnicas de mutagénesis clásicas y técnicas de ADN recombinantes, tal como mutagénesis dirigida al sitio, tratamiento químico de una molécula de ácido nucleico para inducir mutaciones, disociación enzimática o restricción de un fragmento de ácido nucleico, ligación de fragmentos de ácido nucleico, amplificación PCR y/o mutagénesis de regiones seleccionadas de una secuencia de ácido nucleico, síntesis de mezclas de oligonucleótidos y ligación de mezcla de grupos para "construir" una mezcla de moléculas de ácido nucleico y combinaciones de las mismas. Los homólogos de molécula de ácido nucleico pueden ser seleccionados de una mezcla de ácidos nucleicos modificados clasificando de acuerdo con la función de la proteína modificada por el ácido nuclíco y/o mediante hibridación con un gen tipo natural. El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico de la presente invención, es un tamaño suficiente para codificar una proteína que tiene la actividad biológica deseada o suficiente para formar una sonda o cebador de oligonucleótidos que tenga la capacidad de formar un híbrido estable con la secuencia complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína natural (por ejemplo, bajo condiciones moderadas, estrictas o altamente estricas, y preferentemente bajo condiciones muy estrictas). Por lo tanto, el tamaño de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, puede dependenr de la composición de ácido nucleico y porcentaje de homología o identidad entre la molécula de ácido nucleico y la secuencia complementaria, así como de las condiciones de hibridación por si mismas (por ejemplo, temperatura, concentración de sal y concentración de formamida). El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico que se utiliza en la forma de un cebador de oligonucleótidos o en la forma de una sonda, normalmente es de al menos aproximadamente 12 hasta aproximadamente 15 nucleótidos de longitud si las moléculas de ácido nucleico son ricas en GC, y de al menos aproximadamente 15 hasta aproximadamente 18 bases de longitud si son ricas en AT. No existe límite, o diferente límite práctico, en cuanto al tamaño máximo de una molécula de ácido nucleico de la presente invención, ya que la molécula de ácido nucleico puede incluir una parte de una secuencia de codificación de proteína, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de longitud total (que incluye un gen completo). Al conocer las secuencias de ácido nucleico de ciertas moléculas de ácido nucleico de la presente invención, y particularmente cualesquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas con detalle en la presente invención, se permite que un experto en la técnica, realice, por ejemplo, (a) copias de dichas moléculas de ácido nucleico y/o (b) obtenga moléculas de ácido nucleico que incluyen al menos una parte de las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que incluyen genes de longitud completa, regiones de codificación de longitud completa, secuencias de control y regulación, regiones de codificación truncada). Dichas moléculas de ácido nucleico se pueden obtener en una variedad de formas que incluyen técnicas de clonación adicional, utilizando sondas para clasificar bibliotecas ó ADN adecuadas, y amplificación PC de bibliotecas ó ADN adecuados utilizando cebadores de oligonucleótidos. Las bibliotecas preferidas para clasificación o de las cuales se amplifica la molécula de ácido nucleico, incluyen bibliotecas de ADN genómico de bacterias y levadura, y en particular, bibliotecas de ADN genómico de Escherichia col¡. Las técnicas para clonar y amplificar genes se describen, por ejemplo, en la publicación de Sambrook y Asociados, ibid. Otra modalidad de la presente Invención incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un vector recombinante y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad biológica de cualesquiera de las enzimas u otras proteínas en una trayectoria metabólica de aminoazúcar, tal como se describe en la presente invención. De acuerdo con la presente invención, un vector recombinante es una molécula de ácido nucleico construida (por ejemplo, producida en forma artificial) que se utiliza como una herramienta para manipular una secuencia de ácido nucleico de elección, y para introducir dicha secuencia de ácido nucleico en una célula huésped. Por consiguiente, el vector recombinante es adecuado para utilizarse en clonar, secuenciar y/o manipular de otra forma la secuencia de ácido nucleico de elección, tal como mediante expresión y/o suministro de la secuencia de ácido nucleico de elección dentro de una célula huésped para formar una célula recombinante. Dicho vector contiene normalmente secuencias de ácido nucleico heterólogas, que son secuencias de ácido nucleico que no se encuentran naturalmente en forma adyacente a la secuencia de ácido nucleico que será clonada o suministrada, aunque el vector también puede contener secuencias de ácido nucleico reguladoras (por ejemplo, promotores, regiones no traducidas, que se encuentran naturalmente en forma adyacente a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención o las cuales son útiles para expresar las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (que se describe con mayor detalle más adelante). El vector puede ser ya sea A N ó ADN, cualquier célula procariótica o eucariótica, y normalmente es un plásmido. El vector puede mantenerse en la forma de un elemento extracromosomal (por ejemplo, un plásmido), o puede integrarse dentro del cromosoma de un organismo recombinante (por ejemplo, un microbio o planta). El vector completo puede permanecer en su lugar dentro de la célula huésped, o bajo ciertas condiciones, se puede eliminar el ADN del plásmido, dejando atrás la molécula de ácido nucleico de la presente invención. La molécula de ácido nucleico integrada puede estar bajo el control del promotor cromosomal, bajo control del promotor nativo o de plásmido, o bajo una combinación de diversos controles del promotor. Una sola copia o múltiples copias de la molécula de ácido nucleico pueden integrarse dentro del cromosoma. Un vector recombinante de la presente invención, puede contener al menos un marcador seleccionable. En una modalidad, un vector recombinante utilizado en la molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención, es un vector de expresión. Tal como se utiliza en la presente invención, la frase "vector de expresión" se utiliza para referirse a un vector que es adecuado para la producción de un producto codificado (por ejemplo, una proteína de interés). En esta modalidad, una secuencia de ácido nucleico que codifica el producto que será producido, se inserta dentro del vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que será producida, se inserta dentro del vector de tal forma que enlace en forma operativa la secuencia de ácido nucleico con las secuencias reguladoras dentro del vector, lo cual permite la transcripción y traducción de la secuencia de ácido nucleico dentro de la célula huésped recombinante. En otra modalidad, un vector recombinante utilizado en una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención, es un vector de dirección. Tal como se utiliza en la presente invención, la frase "vector de dirección" se utiliza para referirse a un vector que se utiliza para suministrar una molécula de ácido nucleico en particular dentro de una célula huésped recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico se utiliza para eliminar o desactivar un gen endógeno dentro de la célula huésped o microorganismo (por ejemplo, utilizado para tecnología de interrupción o eliminación de gen dirigida). Dicho vector también puede ser conocido en la técnica como un vector "knock-out". En un aspecto de esta modalidad, una parte del vector, aunque más normalmente, la molécula de ácido nucleico insertada en el vector (por ejemplo, el inserto) tiene una secuencia de ácido nucleico que es homologa con una secuencia de ácido nucleico de un gen objetivo dentro de la célula huésped (por ejemplo, un gen el cual se dirige para ser eliminado o desactivado). La secuencia de ácido nucleico del inserto del vector, se diseña para enlazar al gen objetivo de modo que el gen objetivo y el inserto pasen por recombinación homologa, mediante lo cual se elimina, desactiva o atenúa el gen objetivo endógeno (por ejemplo, mediante al menos una parte del gen objetivo endógeno que está siendo mutado o eliminado). Normalmente, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención enlazada en forma operativa a una o más secuencias de control de expresión, que incluyen secuencias de control de transcripción y secuencias de control de traducción. Tal como se utiliza en la presente invención, la frase "molécula recombinante" o "molécula de ácido nucleico recombinante" se refiere principalmente a una molécula de ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico enlazada en forma operativa a una secuencia de control de expresión, pero que puede utilizarse en forma intercambiable con la frase "molécula de ácido nucleico", cuando dicha molécula de ácido nucleico es una molécula recombinante, como se describe en la presente invención. De acuerdo con la presente invención, la frase "enlazada en forma operativa" se refiere a un enlace de una molécula de ácido nucleico a una secuencia de control de expresión (por ejemplo, una secuencia de control de transcripción y/o una secuencia de control de traducción) en una forma tal que la molécula tiene la capacidad de ser expresada cuando se transfecta (por ejemplo, transformada, transducida, transfectada, conjugada o conducida) en una célula huésped. Las secuencias de control de transcripción son secuencias que controlan el inicio, prolongación o término de la transcripción. Las secuencias de control de transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de transcripción, tal como secuencias promotoras, aumentadoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de transcripción que pueda funcionar en una célula huésped u organismo, en el cual se introduzca la molécula de ácido nucleico recombinante. Las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención, también pueden contener secuencias reguladoras adicionales, tal como secuencias reguladoras de traducción, orígenes de réplica y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante. En una modalidad, una molécula recombinante de la presente invención, que incluye aquellas que están integradas en el cromosoma de la célula huésped, también contiene señales de segregación (es decir, secuencias de ácido nucleico de segmento de señal) para permitir que una proteína expresada sea segregada de la célula que produce la proteína. Los segmentos de señal adecuados incluyen un segmento de señal que están naturalmente asociados con la proteína que será expresada o cualquier segmento de señal heterologa que tenga la capacidad de dirigir la secreción de la proteína de acuerdo con la presente invención. En otra modalidad, Una molécula recombinante de la presente invención comprende una secuencia principal para permitir que una proteína expresada sea suministrada e insertada dentro de la membrana de la célula huésped. Las secuencias principales adecuadas incluyen una secuencia principal que está asociada en forma natural con la proteína, o cualquier secuencia principal heterologa con la capacidad de dirigir el suministro e inserción de la proteína en la membrana de una célula. De acuerdo con la presente invención, el término "transfección" se utiliza para referirse a cualquier método mediante el cual se puede insertar en una célula una molécula de ácido nucleico exógena (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante). El término "transformación" se puede utilizar de manera intercambiable con el término "transfección", cuando dicho término se utilice para referirse a la introducción de moléculas de ácido nucleico dentro de células microbianas, tal como algas, bacterias y levaduras, o dentro de células de plantas. En sistemas microbianos y sistemas de plantas, el término "transformación" se utiliza para describir un cambio inherente debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por los organismos o plantas y es esencialmente sinónimo con el término "transfección". Por consiguiente, las técnicas de transfección incluyen, pero no se limitan a, transformación, tratamiento químico de células, bombardeo de partículas, electroporación, microinyección , lipofección, absorción, infección y fusión de protoplasto. Una célula recombinante se produce preferentemente transformando una célula de bacteria o levadura (por ejemplo, una célula huésped) con una o más moléculas recombinante, comprendiendo cada una, una o más moléculas de ácido nucleico enlazadas en forma operativa a un vector de expresión que contiene una o más secuencias de control de transcripción. La frase, "enlazada en forma operativa" se refiere a la inserción de una molécula de ácido nucleico en un vector de expresión de tal forma que la molécula tenga la capacidad de ser expresada cuando se transforme en una célula huésped. Tal como se utiliza en la presente invención, un vector de expresión es un vector de ARN ó ADN que tiene la capacidad de transformar una célula huésped y de efectuar la expresión de una molécula de ácido nucleico específica. Preferentemente, el vector de expresión también tiene la capacidad de duplicarse dentro de la célula huésped. En la presente invención, los vectores de expresión normalmente son plásmidos. Los vectores de expresión de la presente invención incluyen cualesquiera vectores que funcionan (por ejemplo, dirigen la expresión genética) en una célula huésped de levadura o en una célula huésped de bacteria, preferentemente una célula huésped Escherichia coli. Las células recombinantes preferidas de la presente invención, se establecen en la sección de ejemplos. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden enlazarse en forma operativa a vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras, tal como secuencias de control de transcripción, secuencias de control de transducción, orígenes de réplica y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante y que controlan la expresión de moléculas de ácido nucleico de la presente invención. En particular, las moléculas recombinantes de la presente invención incluyen secuencias de control de transcripción. Las secuencias de control de transcripción son secuencias que controlan el inicio, prolongación y término de la transcripción. Las secuencias de control de transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de transcripción, tal como secuencias promotoras, aumentadoras, operativas y represoras. Las secuencias de control de transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de transcripción que pueda funcionar en células de levadura o bacterias, y preferentemente, Escherichia coli. Una variedad de secuencias de control de transcripción son conocidas para los expertos en la técnica. Se prefiere que las moléculas de ácido nucleico recombinante que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican varias enzimas y proteínas aquí descritas (incluyendo homólogos de las mismas) sean clonadas bajo el control de un promotor artificial. El promotor puede ser cualquier promotor adecuado que proporcione un nivel de expresión genética requerido para mantener un nivel suficiente de proteína codificada dentro del organismo de producción. Dichos promotores pueden ser promotores inducibles mediante diferentes químicos (tal como lactosa, galactosa, maltosa y sal) o cambios en las condiciones de crecimiento (tal como temperatura). El uso de un promotor inducible puede conducir a un desempeño óptimo del proceso de expresión y fermentación genética. Los promotores preferidos también pueden ser promotores constitutivos, ya que se elimina de este modo la necesidad de agregar inductores costosos. Dichos promotores incluyen normalmente sistemas de promotor inducible que han sido elaborados como funcionalmente constitutivos o con fugas mediante modificación genética, tal como utilizando un gen represor de muíante, debilitador. Los promotores particularmente preferidos que serán utilizados son lac, PL y T7. Se puede variar la dosis del gen (número de copias) de acuerdo con los requerimientos de formación del producto máxima. En una modalidad, los genes recombinantes se integran dentro del genoma huésped. Los expertos en la técnica podrán apreciar que el uso de tecnologías de ADN recombinante puede mejorar la expresión de moléculas de ácido nucleico transformadas mediante manipulación, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de ácido nucleico dentro de la célula huésped, la eficacia con la cual se transcriben dichas moléculas de ácido nucleico, la eficacia con la cual se traducen las transcripciones resultantes, y la eficacia de modificaciones post-traducción. Las técnicas recombinantes útiles para incrementar la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, incluyen pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico enlazadas en forma operativa a plásmidos con un número de copias superior, integración de moléculas de ácido nucleico dentro del cromosoma de la célula huésped, adición de secuencias de estabilidad de vector a plásmidos, substituciones o modificaciones de señales de control de transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, aumentadores, substituciones o modificaciones de señales de control de traducción, modificación de moléculas de ácido nucleico de la presente invención que corresponden al uso de codón de la célula huésped, eliminación de secuencias que desestabilizan las transcripciones, y uso de señales de control que separan temporalmente el crecimiento de célula recombinante de la producción de enzima recombinante durante la fermentación. La actividad de una proteína recombinante expresada de la presente invención, puede mejorarse mediante fragmentación, modificación, o derivatización de moléculas de ácido nucleico que codifican dicha proteína. Dichas modificaciones se describen con detalle en la sección de ejemplos. Se puede utilizar una o más moléculas recombinantes de la presente invención, para producir un producto codificado de la misma. En una modalidad, se produce un producto codificado mediante la expresión de una molécula de ácido nucleico tal como se describe en la presente invención, bajo condiciones efectivas para producir la proteína. Un método preferido para producir una proteína codificada, es transfectando una célula huésped con una o más moléculas recombinantes para formar una célula recombinante. Las células adecuadas son cualesquiera microorganismos (por ejemplo, una célula huésped u organismo de producción) que es cualquier microorganismo (por ejemplo, bacteria, protista, alga, hongo, u otro microbio), y más preferentemente es una bacteria, una levadura o un hongo. Los géneros de bacteria adecuados incluyen pero no se limitan a, Escherichia, BacHlus, Lactobacillus, Pseudomonas, y Streptomyces. Las especies de bacteria adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus brevis, Pseudomonas aeruginosa, y Streptomyces lividans. Los géneros de levadura adecuados incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, y Phaffa. Las especies de levadura adecuadas incluyen pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, P. canadensis, Kluyveromyces marxianus y Phaffia rhodozyma. Los géneros fúngicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, Aspergillus, Absidia, Rhizopus, Chrysosporium, Neurosporium, Neurospora y Trlchoderma. Las especies fúngicas adecuadas incluyen, pero no se limita a, Aspergillus niger, A. nidulans, Absidia coerulea, Rhizopus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, N. intermedia y Trichoderm reesei. Las células huésped pueden ser ya sea células no transfectadas o células que ya están transfectadas con al menos otra molécula de ácido nucleico recombinante. Las modalidades adicionales de la presente invención, incluyen cualesquiera de los microorganismos modificados en forma genética aquí descritos, y microorganismos que tienen las características de identificación de los microorganismos identificados en forma específica en los ejemplos. Dichas características de identificación pueden incluir cualesquiera o todas las características genotípicas y/o fenotípicas de los microorganismos que se encuentran en los ejemplos, incluyendo sus capacidades para producir giucosamina y/o N-acetilglucosamina. Tal como se describió anteriormente, en el método de producción de giucosamina y/o N-acetilglucosamina de la presente invención, un microorganismo que tiene una trayectoria metabólica de aminoazúcar modificada en forma genética se cultiva en un medio de fermentación para la producción de giucosamina y/o N-acetilglucosamina. Un medio de fermentación adecuado, o efectivo se refiere a cualquier medio en el cual el microorganismo modificado en forma genética de la presente invención, cuando se cultiva, tiene la capacidad de producir glucosamina y/o N-acetilglucosamina. Dicho medio normalmente es un medio acuoso que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables. Dicho medio también puede incluir sales, minerales, metales y otros nutrientes adecuados. Una ventaja de las modificaciones genéticas a un microorganismo descrito en la presente invención, es que aunque dichas modificaciones genéticas alteran en forma significativa el metabolismo de los aminoazúcares, no crean requerimientos nutricionales algunos para el organismo de producción. Por lo tanto, un medio de sales mínimas que contiene glucosa, fructosa, lactosa, glicerol o una mezcla de dos o más diferentes compuestos en la forma de la única fuente de carbono, se utiliza preferentemente como el medio de fermentación. El uso de un medio de glucosa-sales mínimas es el medio más preferido para la fermentación de glucosamina y/o N-acetilglucosamina, y también facilita la recuperación y purificación de los productos. En un aspecto, el extracto de levadura es un componente de medio. Los microorganismos de la presente invención pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales. Los microorganismos pueden cultivarse a través de cualquier proceso de fermentación que incluya, pero no se limita a, fermentación por lotes, alimentación por lotes, reciclado celular y continuo. Preferentemente, los microorganismos de la presente invención se crecen mediante procesos de fermentación por lotes o de alimentación por lotes. En una modalidad de la presente invención, antes de la inoculación, el medio de fermentación se lleva a la temperatura deseada, normalmente una temperatura desde aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 45°C, preferentemente desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 45°C, o desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 40°C, con temperaturas de desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 37°C, y en algunas modalidades, desde aproximadamente 30°C o aproximadamente 37°C como las más preferidas. Las condiciones de fermentación pueden incluir cultivo de microorganismos de la presente invención a cualquier temperatura entre desde aproximadamente 20°C y aproximadamente 40°C, en incrementos completos (por ejemplo, 21°C, 22°C, etc.). Se debe observar que la temperatura de crecimiento óptima y la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina a través del microorganismo de la presente invención, puede variar de acuerdo con una diversidad de factores. Por ejemplo, la selección de un promotor particular para la expresión de una molécula de ácido nucleico recombinante en el microorganismo puede afectar la temperatura de cultivo óptima. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente el crecimiento óptimo y la temperatura de producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina para cualquier microorganismo de la presente invención, utilizando técnicas estándar, tal como las que se describen en la sección de ejemplos para un microorganismo de la presente invención. El medio se inocula con un cultivo de crecimiento en forma activa del microorganismo modificado en forma genética en una cantidad suficiente para producir, después de un período de crecimiento razonable, una densidad celular superior. Las células se crecen hasta una densidad celular de al menos aproximadamente 10 g/l, preferentemente entre aproximadamente 10 g/l y aproximadamente 40 g/l, y más preferentemente al menos aproximadamente 40 g/l. Este proceso requiere normalmente aproximadamente de 10 a 60 horas. Se debe agregar suficiente oxígeno al medio durante el curso de la fermentación, para mantener el crecimiento celular durante el crecimiento celular inicial y para mantener el metabolismo y la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. El oxígeno se proporciona de manera conveniente mediante agitación y aereación del medio. Se pueden utilizar métodos convencionales, tales como agitación o sacudida, para agitar y aerear el medio. Preferentemente la concentración de oxígeno en el medio es mayor a aproximadamente el 15% del valor de saturación (por ejemplo, la solubilidad de oxígeno en el medio a presión atmosférica y a una temperatura de aproximadamente 30 a 40°C, y más preferentemente mayor a aproximadamente el 20% del valor de saturación, no obstante que pueden ocurrir excursiones a concentraciones más bajas si la concentración no se afecta de manera adversa. Quedará entendido en forma adicional, que se puede dejar que el nivel de oxígeno alcance niveles muy bajos de cualquier cantidad de tiempo adecuada durante la fermentación, si aumenta la estabilidad y formación de glucosamina y/o N-acetilglucosamina durante el proceso de producción. La concentración de oxígeno del medio puede monitorearse a través de métodos convencionales, tal como con un electrodo de oxígeno. Se pueden utilizar otras fuentes de oxígeno, tal como gas de oxígeno no diluido y gas de oxígeno diluido con un gas inerte diferente a nitrógeno. Ya que la producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina mediante fermentación se basa preferentemente en la utilización de glucosa como la única fuente de carbono, en una modalidad preferida, en Escherichia coli, se inducirá el PEP:PTS de glucosa. Por consiguiente, incluso en la ausencia de un EII ,P/lllMan funcional de PEP:PTS de mañosa (por ejemplo, en un Escherlchia coli que tenga una mutación manXYZ) el producto, glucosamina, será tomado por las células a través del sistema de transporte de glucosa inducido. Sin embargo, en la presencia de glucosa en exceso, la captación de glucosamina se reprime en forma severa. Por lo tanto, es una modalidad de la presente invención prevenir la captación del producto de glucosamina, manteniendo un exceso de glucosa en el biorreactor de fermentación. Tal como se utiliza en la presente invención, "un exceso" de glucosa, se refiere a una cantidad de glucosa arriba de la que se requiere para mantener el crecimiento del microorganismo bajo condiciones normales, tal como las condiciones de cultivo que se describen anteriormente. Preferentemente, la concentración de glucosa se mantiene a una concentración de desde aproximadamente 0.05% hasta aproximadamente 15% peso/volumen del medio de fermentación. En otra modalidad, la concentración de glucosa se mantiene a una concentración de desde aproximadamente 0.5 g/L hasta aproximadamente 150 g/L del medio de fermentación, e incluso más preferentemente, desde aproximadamente 5 g/L hasta aproximadamente 100 g/L del medio de fermentación, e incluso más preferentemente desde aproximadamente 5 g/L hasta aproximadamente 20 g/L. En una modalidad, la concentración de glucosa del medio de fermentación se monitorea a través de cualquier método adecuado (por ejemplo, utilizando tiras de prueba de glucosa) y cuando la concentración de glucosa está en, o cerca del agotamiento, se puede agregar glucosa adicional al medio. En otra modalidad, la concentración de glucosa se mantiene mediante alimentación semicontinua o continua del medio de fermentación. Los parámetros aquí descritos para glucosa pueden aplicar para cualquier fuente de carbono utilizada en el medio de fermentación de la presente invención. Quedará entendido en forma adicional, que se puede dejar que la fuente de carbono alcance niveles no detectables de cualquier cantidad de tiempo adecuada durante la fermentación, si aumenta el proceso de producción de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. Otras fuentes de carbono que pueden utilizarse en el método de fermentación de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, fructosa, un azúcar de pentosa, lactosa y ácido glucónico. Los azúcares de pentosa incluyen, pero no se limitan a, ribosa, xilosa y arabinosa. En un aspecto, el paso de cultivo se lleva a cabo en un medio de fermentación que comprende glucosa y ribosa. Es una modalidad adicional de la presente invención, para suplementar y/o controlar otros componentes y parámetros del medio de fermentación, según sea necesario para mantener y/o aumentar la producción y estabilidad de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. Por ejemplo, en una modalidad, el medio de fermentación incluye sulfato de amonio, y la concentración de sulfato de amonio en el medio de cultivo se suplementa mediante la adición de sulfato de amonio en exceso. Preferentemente, la cantidad de sulfato de amonio se mantiene en un nivel de desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 1% (peso/volumen) en el medio de fermentación, y preferentemente, aproximadamente 0.5%. Aún en otra modalidad, el pH del medio de fermentación se monitorea con respecto a fluctuaciones en el pH. En el método de fermentación de la presente invención, el pH se mantiene preferentemente a un pH de desde aproximadamente pH 4.0 hasta aproximadamente pH 8.0, y en un aspecto, a un pH de desde aproximadamente pH 4 hasta aproximadamente pH 7.5, y en otro aspecto, a un pH de desde aproximadamente pH 6.7 hasta aproximadamente pH 7.5, y en otra modalidad, a un pH de desde aproximadamente pH 4.5 hasta aproximadamente pH 5. Aunque se describen modalidades preferidas anteriormente, el proceso de fermentación se puede llevar a cabo a cualquier pH entre pH 4 y pH 8, en incrementos de 0.1 (por ejemplo, pH 4.1, pH 4.2, pH 4.3, etc.). En el método de la presente invención, si el pH de partida del medio de fermentación es pH 7.0, a manera de ejemplo, el pH del medio de fermentación se monitorea con respecto a variaciones significativas del pH 7.0, y se ajusta de manera correspondiente, por ejemplo, mediante la adición de hidróxido de sodio. Ya que el pH óptimo para los rangos de estabilidad y formación de glucosamina y/o N-acetilglucosamina pueden ser diferentes al pH óptimo para el crecimiento celular, se puede utilizar un protocolo de dos fases (o más de dos fases). Con dichos protocolos, las células se crecen inicialmente a un pH óptimo para una rápida producción de biomasa, posteriormente se utiliza un pH diferente para maximizar la síntesis de glucosamina y/o N-acetilglucosamina mientras se minimiza la degradación de glucosamina y/o N-acetilglucosamina. Una modalidad adicional de la presente invención, es redirigir el flujo de carbono procedente de la producción de acetato para la producción de subproductos menos tóxicos. A través de dichos métodos, se pueden evitar problemas de toxicidad asociados con un exceso de glucosa en el medio de fermentación. Los métodos para redirigir el flujo de carbono de la producción de acetato, son conocidos en la técnica. En un proceso de fermentación por lotes, de alimentación por lotes y/o continua de la presente invención, la fermentación se continúa hasta que termina esencialmente la formación de glucosamina y/o N-acetilglucosamina, tal como se puede evidenciar a través de la acumulación de glucosamina y/o N-acetilglucosamina extracelular. El tiempo de fermentación total normalmente es desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 60 horas, y más preferentemente, aproximadamente 48 horas. En un proceso de fermentación continua, glucosamina y/o N-acetilglucosamina se puede eliminar del biorreactor conforme se acumula en el medio. El método de la presente invención da como resultado la producción de un producto el cual puede incluir glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-aceti Iglú eos a mi na- 1 -fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina intracelulares; o glucosamina o N-acetilglucosamina extracelulares. Para la síntesis de glucosamina y/o N-acetilglucosamina, se sobreexpresaron diferentes genes utilizando el sistema de expresión pET E. coli. La expresión genética es inducible mediante IPTG y lactosa. El costo de IPTG podría hacer la fabricación de glucosamina prohibitivamente costosa. Por consiguiente, el uso de IPTG podría eliminarse idealmente del proceso de fermentación. La lactosa es relativamente menos costosa y se puede utilizar en un proceso de producción a gran escala. Para la inducción de lactosa, la lactosa necesita convertirse primero a alolactosa, el inductor real, mediante ß-galactosidasa en la célula. Con las cepas de producción de glucosamina, tal como 2123-54, la lactosa podría no ser utilizada como el inductor ya que la cepa es negativa para ß-galactosidasa. Estos se debe a la eliminación e interrupción del gen lacZ mediante la inserción de la cinta de expresión T7-glmS*54 en el locus.

En principio, se podrían utilizar diferentes métodos para eliminar la dependencia de IPTG. Un método ilustrado en la presente invención, es restaurar el gen lacZ. Esto se logró integrando la cinta de expresión T7-glmS*54 en un sitio diferente a lacZ en el cromosoma. La integración del sitio galK podría dejar intacto el gen lacZ. Las cepas Lac+ son potencialmente inducibles mediante lactosa, la cual es mucho menos costosa que IPTG. El sitio galK se eligió para la integración de la cinta de expresión T7-glmS*54 debido a que las cepas integrantes también podrían ser Gal". Si se reportó que en dichas cepas la galactosa podría utilizarse en la forma de un inductor para ios promotores lac. Por consiguiente, además de inducción mediante alolactosa, la galactosa generada a través de la hidrólisis de lactosa podría aumentar en forma adicional la inducción. Esto podría ser benéfico cuando se utiliza una cantidad subóptima de lactosa en el proceso de producción de glucosamina. La integración también podría ser cualquier otro sitio en donde la inserción no pudiera originar algún impacto negativo en el crecimiento celular y en la producción de N-acetiiglucosamina y/o glucosamina. La inducción de lactosa se somete a represión de glucosa. La producción de glucosamina no ocurrió cuando estuvo presente un alto nivel de glucosa en el cultivo. Sin embargo, una vez que se consumió la glucosa, se utilizó la lactosa y se indujo la producción de glucosamina. La producción de glucosa versus lactosa, demostró afectar la expresión enzimática y la producción de glucosamina/N-acetilglucosamina. La represión de glucosa tiene lugar reprimiendo el operón lac nativo. En la presencia de glucosa, se reprimió la síntesis del transportador de lactosa (LacY) y ß-galactosidasa (LacZ), por lo cual se produjeron pocas moléculas inductoras (alolactosa y galactosa) para la inducción de polimerasa de ARN T7. El mecanismo detallado de la represión de glucosa, aún es sujeto de investigación. Al parecer la represión de glucosa actúa en dos niveles. Un nivel de represión es a través de la acción transmitida por cAMP en la secuencia promotora lac. El otro es a través de la inhibición de la captación de lactosa, la cual se origina mediante proteínas transportadoras de glucosa, es decir, la enzima IIAG|C (codificada por el gen crr) y IICBG|C (codificada por el gen ptsG). El promotor lacUV5 no es sensible a represión de glucosa, aunque el evitar que la lactosa (el inductor) entre a las células evita la inducción. La represión de glucosa puede minimizarse utilizando protocolos de crecimiento e inducción optimizados. También se podrían introducir diferentes modificaciones genéticas para minimizar la represión de glucosa. Un método fue reemplazar el promotor lac nativo en el operón lac mediante el promotor lacUV5, el cual se considera no ser reprimido por la glucosa. La represión de glucosa también podría minimizarse mediante modificaciones genéticas del gen crr. Otro método fue eliminar uno de los genes represores lacl. En algunas cepas E. coli de producción de glucosamina y N-acetilglucosamina, existen dos copias del gen represor lacl, uno en el operón lac nativo, el otro en el elemento DE3. La eliminación de cualquier gen lacl incrementó la resistencia a represión de glucosa y la producción de glucosamina/N-acetilglucosamina. Ya que la lactosa se transporta en las células a través de permeasa de lactosa codificada mediante lacY, la inducción de lactosa podría verse afectada por la sobreexpresión de !acY. Los niveles de glucosamina y/o N-acetilglucosamina no se determinan únicamente a través del rango de síntesis, sino también a través del rango del metabolismo de degradación celular, si el producto no es estable bajo las condiciones de fermentación. Tal como se describió en la presente invención, se descubrió que la glucosamina es muy estable en un rango de pH típico utilizado para el crecimiento de E. coli. La glucosamina y/o sus productos de degradación también originan efectos tóxicos en las cepas 7107-18. Se observó toxicidad incluso cuando la glucosamina a una concentración tan baja como de 20 g 1 se incubó previamente en el medio (pH 7.0) durante 3.5 horas antes de la inoculación celular. La toxicidad se atribuyó al menos parcialmente a los productos de degradación GlcN en el medio con un pH de partida de 7.0. GlcN es más estable en un pH más bajo, la glucosamina no se degrada en un pH de 4.7 o menor. Para desarrollar un proceso económico, la síntesis de glucosamina se debe maximizar en tanto que se minimiza la degradación del producto. Además, el protocolo de producción GlcN operado en fermentadores a un pH relativamente bajo, podría no únicamente conservar el GlcN sintetizado, sino que este proceso también podría proteger las células mediante la reducción de la concentración de productos de rompimiento tóxicos. Estos beneficios se deben equilibrar contra el rango de crecimiento reducido y la actividad metabólica de células crecidas de esta forma. La síntesis GlcN continua requiere la generación constante de energía en las células, y que las células crezcan lentamente en estos pHs inferiores, puede no dar la capacidad de generar suficiente de la energía requerida. Generalmente, E. coli crece muy lentamente a un pH menor a 6-7. Podría ser útil aislar mutantes £. coli que exhiban características de crecimiento mejoradas en un pH bajo. Como alternativa, se podría construir una trayectoria de síntesis de glucosamina mejorada en otras especies de bacterias y levaduras a las que normalmente bajo condiciones de pH bajo. Por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae crece óptimamente a un pH de entre 4 y 5.

Se desarrolló una estrategia novedosa para superar el problema de la degradación del producto. La trayectoria de la síntesis de glucosamina en E. coli se prolongó mediante la sobreexpresión de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-? (GNA1) que conduce a la síntesis de N-acetilglucosamina-6-P. Con esta cepa, se podría demostrar que N-acetilglucosamina-6-? se produjo y segregó en forma eficiente para el medio como N-acetilglucosamina. N-acetilglucosamina es muy estable en un amplio rango de pHs y temperaturas. El producto se puede convertir fácilmente nuevamente a glucosamina utilizando condiciones de ácido leves. Utilizando esta estrategia, el titulador de N-acetilglucosamina se elevó varias veces más que en la cepa de producción de glucosamina. N-acetilglucosamina también se recuperó en la forma de un producto final. Diversos factores pueden contribuir a una titulación mayor de la producción de N-acetilglucosamina en el medio mineral simple. El primer factor es la estabilidad de N-acetilglucosamina. Esto no únicamente conserva el producto sino que también evita los efectos tóxicos de los productos de degradación de glucosamina. En segundo lugar, el paso de N-acetilación sirve como una fuerza para extraer el flujo de la trayectoria a este destino. Es interesante observar que cuando la enzima NagB se sobreexpresó en la ausencia de las enzimas GlmS y GNA1, no únicamente funciona hasta un grado suficiente para proporcionar aminoazúcares para la supervivencia y crecimiento celular. Cuando la enzima GNA1 se coexpresó con NagB, se obtuvo como resultado una producción de N-acetilglucosamina de nivel multi-gram que demuestra la potencia de conducción de la reacción de acetilación en la trayectoria. Tercero, la síntesis de N-acetilglucosamina utiliza acetil-CoA como el donante del grupo de acetilo. Aunque esto se puede considerar como un tipo de carga metabolica a las células, realmente sirve para evitar la formación de acetato, y evitar de este modo los efectos negativos originados por la acumulación de acetato en el cultivo celular. La formación de acetato también podría minimizarse mediante modificación genética de las enzimas involucradas en la síntesis de acetato. La combinación de NagB y GNA1 ofrece una trayectoria interesante procedente de fructosa-6-? a N-acetilglucosamina-6-?. A diferencia de GImS que utiliza glutamina y fructosa-6-? como substratos, la enzima NagB cataliza la asimilación directa de amonio en N-acetilglucosamina-6-?. Además, la proteína NagB tiene aproximadamente 30 kDa, mucho menos que la proteína GImS (aproximadamente 70 kDa). Se descubrió que ta! como se compara con la proteína GImS, una mayor parte de proteína NagB estuvo en la fracción de proteína soluble cuando se sobreexpresó en E. coli.

La enzima GlmS generalmente se somete a una fuerte inhibición del producto. El uso de una enzima GlmS resistente al producto, juega un papel importante en la elevación del titulador de glucosamina y probablemente también en la elevación del titulador de N-acetilglucosamina. Se crearon mutantes GlmS resistentes al producto mediante mutagénesis in vitro. Dichos mutantes también podrían aislarse de la naturaleza. Esto se ilustró demostrando la resistencia al producto de un GlmS B. subtilis nativo. Los siguientes, son protocolos de ejemplo para una producción optimizada de glucosamina y N-acetilglucosamina. Estos son meramente ejemplos de algunas modalidades operables y preferidas de la presente invención, y no se construyen como las únicas modalidades de la misma. Algunos protocolos de fermentación preferidos y parámetros del proceso de fermentación, tanto para cultivos en frasco como cultivos en fermentador, se describen con detalle en la sección de ejemplos. Lo que se encuentra a continuación es una descripción de un protocolo típico para el proceso de fermentación de glucosamina inducida mediante lactosa, de acuerdo con la presente invención: Cepa: E. coli recombinante. Inducción: se agregan 30 g/l de lactosa (en la forma de una alimentación al 35% elevada lentamente durante un período de 10 horas) después de que se alcanza una densidad celular de 10 g/l. La alimentación de glucosa se suspende durante este procedimiento para evitar la represión de glucosa. Una vez que se ha agregado toda la lactosa, se reinicia la alimentación de glucosa. Alimentación: 50% de glucosa con 5 pg FeS04-7H20/g de glucosa y 0.33 pg MnS04- H20/g de glucosa, glucosa alimentada en concentraciones limitadas.

Tiempo de 72 horas. fermentación: Modo de fermentación: Alimentación por lotes, con 50% de glucosa agregada según se requieran, manteniendo concentraciones de límite de glucosa. Inoculo: 5% por volumen. pH: 6.9 durante el crecimiento, posteriormente 6.7 después de la inducción, controlado mediante 10 N de NH4OH. Temperatura: 30°C, cambiada a 25°C después de la inducción. Oxígeno: O2 disuelto al 20% 0 más, controlado mediante agitación. Aireación: 0.5 a 1 wm.

En el medio descrito anteriormente, se agregaron todos los componentes antes de la esterilización, excepto la glucosa (agregada en incrementos) y oligoelementos de Fe, Zn, Mn, Cu, B, Mo, Co (agregados después de la esterilización). Lo que se encuentra a continuación es una descripción de un protocolo típico para un proceso de fermentación de N- acetilglucosamina de acuerdo con la presente invención: Cepa: E. coli recombinante. Inducción: se agregaron 5 a 10 g G1 de lactosa en una adición de un solo punto después de que se alcanzó una densidad celular de 15 a 20 g G1. La alimentación de glucosa no se suspendió durante este procedimiento, pero permaneció constante a 5 g I"1 hr"1 (con base en el volumen inicial). Alimentación: 65% de glucosa sin cualesquiera enmiendas, alimentación de glucosa en concentraciones de límite. Tiempo de fermentación: 60 a 72 horas. Modo de fermentación: Alimentación por lotes, con el 65% de glucosa agregada según se requiera, manteniendo concentraciones límite de glucosa. Inoculo: 2.5% a 5% por volumen. pH: 6.9 a lo largo del protocolo, controlado con 12 N NH4OH. Temperatura: 37°C a lo largo del protocolo. Oxígeno: O2 disuelto al 20% más, controlado mediante agitación. Aireación: 0.5 a 1 wm.

Medio: Componente Concentración (cantidad por litro) KH2P04 6.67 g G' ácido cítrico 3.25 g G1 CaCI2-H20 0.05 g G1 MgS04-7H20 2.5 g G1 FeS04-7H20 5gr1 ZnS04-7H20 3.8 gr MnS0-H20 0.33 mg G1 CuS04-5H2O 0.1 mg G1 CoCI2-6H20 0.1 mg G1 glucosa >200 g, según se necesite eliminador de espuma Mazu 204 En el medio descrito anteriormente, se agregaron todos los componentes antes de la esterilización excepto la glucosa (agregada en incrementos). El pH inicial es cercano a 3.0 después de la esterilización y se ajustó a 6.9 con NH4OH antes de la inoculación. El método de la presente invención incluye además el paso de recolectar el producto, el cual puede ser glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N -a ce ti Iglú cosa m i na-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina intracelulares y/o glucosamina extracelular y/o N-acetilglucosamina extracelular. El paso general de recolectar, puede incluir los pasos de recuperar el producto (que se define más adelante) y también de purificar el producto, según se desee. La descripción detallada de los métodos de recuperación y purificación se proporciona más adelante. Para "recolectar" un producto tal como glucosamina o N-acetilglucosamina, se puede hacer referencia simplemente a recolectar el producto procedente del blorreactor de fermentación y no necesita implicar pasos adicionales de separación, recuperación o purificación. Por ejemplo, el paso de recolección se puede referir para eliminar todo el cultivo (es decir, el microorganismo y el medio de fermentación) del biorreactor, eliminar el medio de fermentación que contiene glucosamina y/o N-acetilglucosamina extracelular del biorreactor, y/o eliminar el microorganismo que contiene glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina intracelular del biorreactor. El término "recuperación" o "recuperar", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a la reducción de las condiciones de solubilidad de la solución de glucosamina o N-acetilglucosamina hasta el punto en donde glucosamina o N-acetilglucosamina, respectivamente, se vuelvan insolubles y ya sea que se precipiten fuera de la solución o se cristalicen. Estos pasos pueden seguirse mediante pasos de purificación adicionales. La glucosamina y N-acetilglucosamina son preferentemente recuperados en formas substancialmente puras. Tal como se utiliza en la presente invención, "substancialmente puro" se refiere a una pureza que permite el uso efectivo de la glucosamina y/o N-acetilglucosamina en la forma de un compuesto nutracéutico para venta comercial. En una modalidad, los productos de glucosamina y/o N-acetilglucosamina son preferentemente separados del organismo de producción y otros constituyentes del medio de formación. Más adelante se describen métodos para lograr dicha separación. Preferentemente, a través del método de la presente invención, se recolectan o recuperan del microorganismo y/o medio de fermentación al menos aproximadamente 1 g/L de producto (por ejemplo, glucosamina, N-acetilglucosamina, glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato). Más preferentemente, a través del método de la presente invención se recuperan al menos aproximadamente 5 g/L e incluso más preferentemente al menos aproximadamente 10 g/L, e incluso más preferentemente, al menos 20 g/L, e incluso más preferentemente, al menos 50 g/L, e incluso más preferentemente, al menos 75 g/L, e incluso más preferentemente, al menos 100 g/L, e incluso más preferentemente, al menos 120 g/L de producto, y cualquier incremento completo entre al menos aproximadamente 1 g/L y al menos aproximadamente 120 g/L (por ejemplo, 2 g/L, 3 g/L, etc.)- En una modalidad, el producto se recupera en una cantidad desde aproximadamente 1 g/L hasta aproximadamente 120 g/L. Normalmente, la mayor parte de la glucosamina y/o N-acetilglucosamina producida a través del proceso de la presente invención, es extracelular. El microorganismo puede ser eliminado del medio de fermentación a través de métodos convencionales, tales como mediante filtración o centrifugación. En una modalidad, el paso de recolección o de recuperación del producto, incluye la purificación de glucosamina y/o N-acetilglucosamina del medio de fermentación. La glucosamina y/o N-acetilglucosamina pueden ser recuperados del medio de fermentación libre de célula a través de métodos convencionales, tales como cromatografía, extracción, cristalización (por ejemplo, cristalización por evaporación), separación de membrana, osmosis inversa y destilación. En una modalidad preferida, glucosamina y/o N-acetilglucosamina se recuperan del medio de fermentación libre de células mediante cristalización. En otra modalidad, el paso de recuperación del producto incluye el paso de concentrar la glucosamina y/o N-acetilglucosamina extracelular. En una modalidad, glucosamina-6-fosfato, glucosamina- 1-fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina se acumulan en forma intracelular, y el paso de recuperación de los productos incluye aislar glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina del microorganismo. Por ejemplo, los productos pueden ser recolectados lisando las células del microorganismo a través de un método que no degrada los productos (glucosamina, N-acetilglucosamina, glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetiIglucosamina-6-fosfato, y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato), centrifugando el Usado para eliminar residuos celulares insolubles, y posteriormente recuperar la glucosamina, N-acetilglucosamina, glucosamina-6-fosfato, glucosam¡na-1-fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato de los productos a través de un método convencional, tal como el que se describió anteriormente. Los productos ¡ntracelulares iniciales en el microorganismo modificado en forma genética aquí descrito, son glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetiiglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y/o glucosamina. Generalmente es aceptado que los intermediarios fosforilados se desfosforilen durante la exportación de los microorganismos, debido lo más probable a la presencia de fosfatasa alcalina, fosfatasa de ácido, fosfatasa de azúcar o fosfatasa de aminoazúcar en el espacio periplásmico del microorganismo. En una modalidad de la presente invención, glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato se desfosforilan después o durante la exportación de la célula a través de fosfatasas que ocurren en forma natural, con el objeto de facilitar la producción de los productos deseados, glucosamina y/o N-acetilglucosamina. En esta modalidad, se elimina la necesidad de amplificación de una actividad de fosfatasa proporcionada en forma recombinante en la célula o tratamiento del medio de fermentación con una fosfatasa. En otra modalidad, se incrementa el nivel de fosfatasa en el organismo de producción a través de un método que incluye, pero no se limita a, modificación genética de un gen de fosfatasa endógeno o mediante modificación recombinante del microorganismo para expresar un gen de fosfatasa. Aún en otra modalidad, el medio de fermentación recolectado se trata con una fosfatasa después de que glucosamina-6-fosfato, giucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y/o N-acetilglucosamina-1 -fosfato se liberan en el medio, tal como cuando las células se Usan tal como se describió anteriormente. Tal como se observó anteriormente, el proceso de la presente invención produce cantidades significativas de glucosamina y/o N-acetilglucosamina extracelulares. En particular, el proceso produce glucosamina y/o N-acetilglucosamina extracelular, de modo que más de aproximadamente el 50% de la glucosamina y/o N-acetilglucosamina total sea extracelular, más preferentemente de aproximadamente 75% de la glucosamina y/o N-acetilglucosamina total sea extracelular, y más preferentemente más de aproximadamente el 90% de glucosamina y/o N-acetilglucosamina total sea extracelular. A través del método de la presente invención, se puede lograr la producción de una concentración de glucosamina y/o N-acetilglucosamina extracelular, la cual es mayor de aproximadamente 1 g/l, más preferentemente mayor a aproximadamente 5 g/l, incluso más preferentemente mayor a aproximadamente 10 g/l, e incluso más preferentemente mayor a aproximadamente 20 g/l, e incluso más preferentemente mayor a aproximadamente 50 g/l, e incluso más preferentemente mayor a aproximadamente 75 g/l, e incluso más preferentemente mayor a aproximadamente 100 g/l, e incluso más preferentemente mayor a aproximadamente 120 g/l. Otra modalidad de la presente invención se refiere a un medio novedoso para producir N-acetilglucosamina. El método incluye obtener un caldo de fermentación que contiene N- acetilglucosamina solubilizado producido mediante un proceso de fermentación, tal como se describió anteriormente, y recuperar sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación. De acuerdo con la presente invención, la N-acetilglucosamina que se produce mediante un proceso de fermentación, es N-acetilglucosamina que es un producto del proceso de fermentación. En otras palabras, el proceso de fermentación de cultivo de células da como resultado la producción de N-acetilglucosamina mediante las células. El término "recuperación" o "recuperar", se refiere a la reducción de condiciones de solubilidad de la solución de N-acetilglucosamina hasta el punto en donde N-acetilglucosamina se convierte en soluble y ya sea se precipite fuera de la solución o se cristalice. El caldo fermentador que contiene la N-acetilglucosamina, el medio residual y la materia celular puede tratarse primero eliminando la materia celular y endotoxinas bacterianas. Antes de la eliminación de la materia celular, las células que se encuentran en el caldo de fermentación pueden ser Usadas utilizando diferentes métodos, que incluyen pero no se limitan a, sonicación, interrupción osmótica, molido/elaboración de gránulos, prensado French, homogeneización, descompresión explosiva, tratamientos mediante solvente, extracción de punto crítico y congelación/descongelación. La eliminación de material celular y endotoxinas, se puede lograr a través de micro o ultrafiltración o una combinación de los mismos. Otras técnicas conocidas en el arte incluyen centrifugación y diafiltración. Después de la eliminación de materia celular, la solución puede probarse para verificar la eliminación adecuada de las endotoxinas. Antes del paso de recuperación de los sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación, el caldo de fermentación se decolora y/o se le extrae la ceniza. Si ambos de estos procesos se llevan a cabo, se puede llevar primero cualquiera de ellos. Sin embargo, al llevar a cabo primero el paso de extracción de cenizas, se reducen los requerimientos de decoloración, debido a la eliminación de color a través del proceso de extracción de cenizas, tal como mediante el uso de resinas de intercambio de iones. El paso de decoloración puede llevarse a cabo a través de múltiples cristalizaciones de N-acetilglucosamina, tratamiento de carbono activado y decoloración cromatográfica. El uso de decoloración cromatográfica puede incluir el uso de resinas de intercambio de iones (no para intercambio de iones, sino solo para absorción de color), resina Dow Optipore SD-2 y medios cromatográficos a base de sílice clásicos. El paso de extracción de cenizas puede llevarse a cabo contactando el caldo de fermentación con una resina de intercambio de iones, el cual puede incluir contactar el caldo de fermentación con una resina de intercambio de aniones y/o una resina de intercambio de cationes. En una modalidad preferida, se utiliza una cama mezclada tanto de una resina de intercambio de aniones como de cationes. La eliminación de cationes puede llevarse a cabo en resinas de intercambio de iones ya sea de ácido fuerte o ácido débil, en tanto que se prefieren las resinas de base débil debido a su capacidad mejorada de eliminar ácidos orgánicos producidos en la fermentación. La eliminación de cationes normalmente se elige para proceder la eliminación de aniones, debido al efluente que procede del intercambio de cationes tiene un pH reducido, en tanto que el efluente procedente del intercambiador de aniones tiene un pH elevado. N-acetilglucosamina ha demostrado tendencia a epimerizarse con un pH alto, produciendo niveles medibles de N-acetilmanosamina. La eliminación de aniones se puede llevar a cabo con resinas ya sea con base fuerte o base débil. La solución purificada resultante lleva muy poco material iónico y consiste principalmente de agua, N-acetilglucosamina y carbohidratos procedentes de la alimentación del fermentador no consumidos durante la fermentación. La pureza de N-acetilglucosamina de este producto intermedio normalmente es mayor a aproximadamente 90% del contenido de sólidos secos totales de la corriente. Si se desea un pulido adicional para completar la extracción de cenizas, entonces se puede aplicar un paso de intercambio de iones de cama mezclada.

En este caso, las resinas tanto catiónicas como amónicas ocupan el mismo intercambiador de iones, y el caldo termentador que ha pasado por extracción de cenizas se pasa a través de esta cama. Aunque un intercambio de iones de cama mezclada también toma el lugar de los intercambiadores de cationes y aniones por separado, y aunque esto ofrece el beneficio agregado de minimizar la magnitud de los cambios en el pH del caldo, es más conveniente operar camas separadas debido a la necesidad de separar las resinas de intercambio de iones antes de la regeneración, con el alto riesgo concomitante de la pérdida de resina. El paso de recuperación de sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación puede incluir precipitar y/o cristalizar sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación. Normalmente, antes del paso de recuperación, se concentra el caldo de fermentación para proporcionar una mayor concentración de N-acetilglucosamina solubilizada para permitir la precipitación o cristalización. El paso de concentración puede llevarse a cabo bajo vacío (es decir, a una presión menor a la presión atmosférica) o mediante separación de membranas. En modalidades preferidas, el paso de concentración se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 75°C, y más preferentemente a una temperatura de entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 55°C. El paso de concentración se lleva a cabo normalmente para lograr un contenido de sólidos en el caldo de fermentación de al menos aproximadamente el 30% de sólidos, más preferentemente aproximadamente el 40% de sólidos, y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 45% de sólidos. Después de la concentración, el caldo de fermentación normalmente se enfría. Dicho enfriamiento puede ser pasivo, es decir, simplemente dejar que el caldo regrese a temperatura ambiente, o puede ser activo, tal como mediante el uso de secadores por congelación, enfriadores por rocío, máquina para elaborar glóbulos, elaboradores de hojuelas y mezcladores o extrusores equipados con chaquetas de enfriamiento. El paso de enfriar un caldo concentrado, solo, puede ser suficiente para recuperar los sólidos que contienen N-acetilglucosamina. Por ejemplo, el caldo de fermentación puede ser enfriado a una temperatura de entre aproximadamente -5°C y aproximadamente 45°C, a una temperatura de entre -5°C y aproximadamente temperatura ambiente, o a aproximadamente temperatura ambiente. La recuperación de los sólidos que contienen N-acetilglucosamlna del caldo de fermentación, también incluye el paso de cosechar el caldo de fermentación con cristales de N-acetilglucosamina para promover la recuperación mediante el crecimiento de los cristales existentes. Los cristales pueden ser proporcionados mediante nucleacion en el caldo de fermentación o como cristales de N-acetilglucosamina proporcionados en forma externa. En el primer caso, el caldo de fermentación se concentra y/o enfría hasta que ocurre cierta nucleacion, forzando la solución supersaturada en él régimen lábil, aunque posteriormente enfriando más lentamente para evitar la nucleacion adicional y promover el crecimiento de los cristales existentes. Como alternativa, los cristales de N-acetilglucosamina, producidos a través de cualquier método, pueden ser introducidos en el caldo de fermentación en la forma de cristales de siembra. La recuperación de sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación, se puede mejorar contactando la N-acetilglucosamina en el caldo con un solvente mezclable en agua. Se ha descubierto que la N-acetilglucosamina es muy insoluble en solventes mezclables en agua, tal como alcohol isopropílico (IPA), etanol, metanol, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dioxano y acetonitrilo. Por consiguiente, mediante la introducción de dicho solvente mezclable en agua dentro del caldo, la N-acetilglucosamina se vuelve menos soluble y se recuperará más cantidad. El proceso de recuperación de la presente invención, puede llevarse a cabo ya sea en la forma de lotes o cristalizaciones continuas del caldo fermentador. Los cristales formados durante el proceso de concentración, pueden recolectarse en forma continua mediante filtro o centrifugación, en tanto que el licor madre se recicla para una concentración adicional, o pueden permanecer con el licor madre hasta que el nivel de sólidos indique su eliminación. Después de la recuperación de los sólidos que contienen N-acetilglucosamina, los sólidos pueden ser separados del caldo de fermentación, tal como mediante centrifugación o filtración. La pasta sólida resultante puede secarse a través de cualquier variedad de técnicas conocidas para los expertos en el arte, tal como secado por vacío, aunque dicho paso se logra preferentemente a una temperatura reducida para evitar la degradación y formación de color. El producto seco final normalmente tendrá al menos el 50% de sólidos secos, más preferentemente al menos aproximadamente el 70% de sólidos secos y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 85% de sólidos secos. Antes del secado, los sólidos recuperados pueden lavarse con un solvente mezclable en agua, tal como los descritos anteriormente. Dicho paso de lavado, da como resultado la estabilización del producto, por ejemplo, para evitar la formación de color. En otra modalidad, ios sólidos que contienen N-acetilglucosamina recuperada se purifican en forma adicional, disolviendo los sólidos y recuperándolos en un segundo paso de recuperación. El segundo paso de recuperación puede incluir cualesquiera de los pasos del proceso de recuperación descritos anteriormente. Se determina la necesidad de un segundo ciclo de recuperación, a través de la pureza del producto final deseada y la pureza inicial. Al emplear los diversos procesos de recuperación antes descritos, se puede preparar N-acetilglucosamina de alta pureza. En particular, los procesos de la presente invención pueden producir una N-acetilglucosamina que sea al menos aproximadamente el 70% pura, más preferentemente al menos aproximadamente el 90% pura, y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 99% pura. Se prefieren diversas modalidades del proceso de recuperación. Por ejemplo, el caldo libre de células puede utilizarse para producir N-acetilglucosamina sólida sin eliminación de iones adicional, decolorando con carbono activado; concentrando hasta aproximadamente el 45% de sólidos secos o más en un evaporador de vacío, el cual puede ser de etapas múltiples para eficiencia de energía (por ejemplo, las condiciones preferidas son temperaturas del licor de entre 45°C y 55°C con un vacío de aproximadamente 600 mm Hg); cosechando del concentrado caliente con N-acetilglucosamina pura, y dejándolo enfriar con agitación. El caldo enfriado se filtra o centrifuga y se recupera la pasta sólida. El sólido recuperado puede ser secado con vacío y utilizado como un intermedio en la producción de sales de N- acetilglucosamina o glucosamina pura; y si la pureza de la N-acetilglucosamina es del 87% o más, se puede producir N-acetilglucosamina pura a partir de una sola cristalización. Como alternativa para cosechar, enfriar y recuperar sólidos del licor madre, la corriente supersaturada puede ser empujada para solidificarse mediante enfriamiento. Los aparatos de enfriamiento adecuados incluyen secadores por congelación, enfriadores por rocío, máquina para elaborar glóbulos, elaboradores de hojuelas, y mezcladores o extrusores equipados con chaquetas de enfriamiento. El sólido resultante puede ser secado en forma adicional. En otra modalidad de recuperación preferida, la N-acetiiglucosamina recuperada puede disolverse nuevamente en agua sin un secado previo, y someterse a un segundo ciclo: concentración, cosecha, enfriamiento y recolección de sólidos. Los sólidos recolectados se lavan con un solvente mezclable en agua y se secan bajo vacío. Se determina la necesidad de doble cristalización a través de la pureza de inicio de la N-acetilglucosamina. Cuando la pureza, en la forma de un porcentaje de sólidos secos, es del 87% o más, se requiere una sola cristalización. Cuando la pureza es del 70%, se requiere una doble cristalización. Otra modalidad de recuperación preferida es una sola cristalización para generar N-acetilglucosamina pura utilizando material que ha sido decolorado y concentrado a temperaturas que alcanzan los 70°C, o disolviendo nuevamente un material parcialmente purificado a una temperatura de 70°C y dejándolo enfriar a temperatura ambiente. Los sólidos recuperados se lavan con un solvente mezclable en agua y se secan. En una modalidad de recuperación preferida, el caldo fermentador libre de células al cual se le ha extraído las cenizas, se purifica en forma adicional mediante separación en un sistema cromatográfico con cámara y movimiento simulado, utilizando un medio cromatográfico, que incluye resinas de intercambio de cationes. Una vez que se obtiene aproximadamente el 98% de la corriente pura, la concentración de vacío prepara el material para el tratamiento de estabilización que se describirá más adelante. En otra modalidad de recuperación preferida, con el objeto de lograr recuperaciones superiores de N-acetilglucosamina que tienen una pureza superior y color estable, exhibiendo menos del 1% en peso de pérdida debido a la descomposición durante el secado a una temperatura de 105°C, se emplea un solvente mezclable en agua. Iniciando con N-acetilglucosamina con una pureza relativamente superior, por ejemplo, 93% logrado mediante decoloración y extracción de cenizas, es posible eliminar agua mediante concentración al vacío y posteriormente agregar un solvente soluble en agua, para precipitar el producto puro adicional. El proceso de tratar el producto precipitado con solventes mezclables que contienen agua facilita el paso de secado subsecuente, en donde se evita que el agua residual potencialice una reacción de degradación. Otra modalidad de la presente invención se refiere a un método para producir glucosamina a partir de N-acetüglucosamina. Para la producción de glucosamina como un producto final, se puede hidrolizar la N-acetilglucosamina para producir glucosamina como un producto final. La hidrólisis se puede llevar a cabo directamente con la N-acetilglucosamina producida en la fermentación sin ser aislada primero de la fermentación o, como alternativa, se puede llevar a cabo la hidrólisis en la N-acetilglucosamina después de ser aislada de la fermentación, tal como la N-acetilglucosamina recuperada utilizando cualesquiera de los métodos descritos anteriormente. Además, se puede utilizar cualquier otra fuente disponible de N-acetilglucosamina en este método de la presente invención. Antes de la presente invención, la N-acetilglucosamina se producía mediante la acetilación de glucosamina utilizando un reactivo de acetilación orgánica, o mediante la hidrolización enzimática de N-acetilglucosamina directamente de quitina, lo cual es paralelo al proceso de hidrólisis con ácido que se utiliza tradicionalmente para producir glucosamina a partir de quitina. Por consiguiente, no existía la necesidad de la reacción inversa para producir glucosamina como un producto final a partir de N-acetilglucosamina. Por consiguiente, una fuente de N-acetilglucosamina tal como se describe en la presente invención, no necesita referirse a una fuente pura de N-acetilglucosamina, sino más bien a cualquier fuente (sólida o solución) que contenga una cantidad de N-acetilglucosamina para la conversión de glucosamina. Se puede producir clorhidrato de glucosamina a partir tanto de la N-acetilglucosamina que ha sido producida mediante un proceso de fermentación, tal como el que se describió anteriormente, y posteriormente recuperarse del caldo de fermentación, tal como se describió con detalle anteriormente, o el proceso puede utilizar la N-acetilglucosamina producida mediante fermentación directamente como un concentrado fermentador al cual se le ha eliminado material celular, pero sin eliminar cualesquiera constituyentes iónicos o de color residual. Como alternativa, se puede utilizar cualquier otra fuente adecuada de N-acetilglucosamina en el método de la presente invención, incluyendo la N-acetilglucosamina producida a través de otros métodos, tal como la hidrólisis enzimática de quitina. En una modalidad preferida, el clorhidrato de glucosamina se produce a partir de una fuente de N-acetilglucosamina que comprende al menos aproximadamente el 30% de N-acetilglucosamina como un porcentaje de los sólidos totales en la fuente, y más preferentemente, la fuente comprende al menos aproximadamente el 35%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 40%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 45%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 50%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 55%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 60%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 65%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 70%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 75%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 80%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 85%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 95% en la forma de un porcentaje de sólidos totales en la fuente. En general, se produce el clorhidrato de glucosamina a partir de una fuente de N-acetilglucosamina que comprende cualquier porcentaje de N-acetilglucosamina a partir de al menos aproximadamente 1% hasta 100%, en enteros totales (por ejemplo, 1%, 2%, 3%, ... 98%, 99%, 100%). La N-acetilglucosamina puede utilizarse en la reacción en la forma de un sólido o en la forma de una solución en agua, o en la forma de una solución en un alcohol primario o secundario acuoso de baja ebullición, que incluye, pero no se limita a, etanol, metanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, ó sec-butanol. En una modalidad preferida, la fuente de N-acetilglucosamina comprende al menos aproximadamente el 40% de N-acetilglucosamina como un porcentaje de los sólidos secos totales en la fuente. En una modalidad, el clorhidrato de glucosalina se puede producirse a partir de una fuente de N-acetilglucosamina utilizando hidrólisis bajo condiciones de ácido y calor. Las técnicas de hidrólisis de ácido son conocidas en el arte. La presente invención proporciona una adaptación específica de esta reacción química para la conversión de N-acetilglucosamina a clorhidrato de glucosamina. La reacción de hidrólisis libera un mol de ácido acético y consume un mol de cada ácido clorhídrico y agua por cada mol de N-acetilglucosamina convertida a clorhidrato de glucosamina. Muchas combinaciones de agua, ácido clorhídrico y N-acetilglucosamina llevan a cabo en forma exitosa la reacción, por lo que es posible utilizar ácido clorhídrico anhidro, N-acetilglucosamina seca y agua como los reactivos, o llevar agua con cualquiera o ambos de N-acetilglucosamina y ácido clorhídrico. La reacción se lleva a cabo con agua en exceso y ácido clorhídrico. Los parámetros importantes son el tiempo y temperatura de reacción, así como la concentración de ácido clorhídrico residual. La reacción se enfría después de que se completa la conversión, y la concentración residual de ácido clorhídrico en exceso, así como la temperatura final, establecen la solubilidad del producto de clorhidrato de glucosamina. Los niveles de solubilidad en exceso, originan una recuperación reducida por pase de clorhidrato de glucosamina y reducen la producción. La glucosamina puede degradarse y las acciones que logran esto, ocurren en la solución. El rango de reacción se relaciona con la temperatura, la concentración de N-acetilglucosamina y/o glucosamina en la solución, y la concentración de ácido clorhídrico en la concentración. Las condiciones exitosas incluyen temperaturas desde 60°C hasta 100°C, con temperaturas desde 70°C hasta 90°C siendo las preferidas. Las proporciones aceptables de solución de ácido clorhídrico a N-acetilglucosamina sólida fluctúan desde 1:1 en peso hasta 5:1 en peso, siendo la preferida 3:1 y la más preferida 2.5:1. Las concentraciones aceptables de la solución de ácido clorhídrico fluctúan desde 10 hasta 40% p/p, y más preferentemente desde aproximadamente 10% p/p hasta 37% p/p. El ácido clorhídrico anhidro puede substituirse por acuoso, siempre que se maneje el calor de la dilución y exista una solución adecuada para disolver completamente la N-acetilglucosamina. La secuencia de adición y temperatura de adición, son de menor importancia, ya que todas las combinaciones son exitosas. El tiempo para llevar a cabo la reacción varía con la temperatura de reacción y la concentración de ácido, y fluctúa desde 10 minutos para un ácido concentrado a altas temperaturas hasta 3 horas o más (por ejemplo, hasta 24 horas) para ácidos diluidos a bajas temperaturas. La solución se enfría a una temperatura de 4°C con el objeto de precipitar el clorhidrato de glucosamina. Son aceptables temperaturas más altas y más bajas (por ejemplo, cualquier temperatura entre aproximadamente -5°C y aproximadamente 40°C), aunque se eligió una temperatura de 4°C como conveniente para minimizar el clorhidrato de glucosamina residual en la solución de hidrólisis en condiciones comercialmente convenientes. Para soluciones de hidrólisis más impuras, que son soluciones en donde la composición de sólidos secos relativa de clorhidrato de glucosamina es inferior, se requiere un rango de enfriamiento y un tiempo de manutención adicional inferiores a la temperatura final, para regresar la solución de hidrólisis a saturación. La agitación de solución mitiga, aunque no supera el impedimento impuesto por impurezas al proceso de cristalización. Ya que la reacción de hidrólisis se lleva a cabo con ácido clorhídrico en exceso, la solución de hidrólisis después del enfriamiento y eliminación del proceso de clorhidrato de glucosamina, tiene la capacidad de utilizarse nuevamente para hidrólisis. Conforme incrementa en concentración el coproducto de ácido acético y se consume el cloruro de hidrógeno del reactivo en cada ciclo de hidrólisis, la solución de hidrólisis se vuelve menos activa y las reacciones toman más tiempo en completarse. Es posible rellenar el cloruro de hidrógeno suministrándolo en su forma gaseosa para reconstituir este reactivo, aunque el incremento del coproducto de ácido acético procedente de cada ciclo de reacción posee un obstáculo cada vez mayor para el reciclado simple de la solución de hidrolizado. Esto se puede superar esterificando el ácido acético a través de la adición de un alcohol primario o secundario, ya sea antes, durante o después del paso de hidrólisis. El ácido acético forma un éster con el alcohol el cual posteriormente puede ser eliminado mediante destilación, centelleo o evaporación al vacío antes de, o después de la hidrólisis de N-acetilglucosamina. N-acetilglucosamina puede combinarse en forma continua con un licor madre de hidrólisis reciclado con el objeto de asegurar que se disuelva o que permanezca disuelto. En forma subsecuente, se agrega ácido clorhídrico anhidro de reemplazo, el cual eleva la temperatura de la solución para iniciar la reacción de hidrólisis y mantener una concentración de ácido residual adecuada para minimizar la solubilidad del clorhidrato de glucosamina. La presión puede controlarse arriba de presión atmosférica, y se selecciona a una temperatura elevada para permitir el uso de un tiempo mínimo de residencia en el reactor. Después de completar la conversión de N-acetilglucosamina a clorhidrato de glucosamina, se enfría la reacción y el clorhidrato de glucosamina se recupera mediante filtración o centrifugación. El filtrado o concentrado se reciclan a través del enfriador hasta que se alcanza la temperatura objetivo de aproximadamente 4°C, y se recupera la mayor parte del clorhidrato de glucosamina. El concentrado o filtrado se reciclan posteriormente para volverse a utilizar. El agua adecuada para cubrir las pérdidas de la reacción, viene con la N-acetilglucosamina. La acumulación de los coproductos de reacción como ácido acético, se eliminan llevando a cabo una purga continua de licor madre, separando el ácido clorhídrico residual de la corriente de purga y regresándola para una nueva utilización subsecuente, esterificándola con un alcohol primario o secundario y secándola en forma de ésteres. Los detalles con respecto a la recuperación de glucosamina del proceso de hidrólisis aquí descrito, son similares a los que se describieron anteriormente para la recuperación de N-acetilglucosamina y están incorporados a la presente invención para la recuperación de glucosamina. Algunos aspectos preferidos de la recuperación de glucosamina, se describen más adelante en la sección de ejemplos. Posteriormente la filtración o centrifugación puede recuperar la sal de glucosamina sólida. Las producciones molares recuperadas fluctúan desde el 50% hasta el 90% con base en N-acetilglucosamina. La pureza de la glucosamina después del lavado y secado con alcohol, normalmente fluctúa desde el 96% hasta el 100%. La pasta húmeda recuperada del centrifugador o filtro, se lava con alcohol para minimizar la tendencia del producto a formar bordes durante el secado. El producto se seca posteriormente bajo vacío en un secador al vacío o en un secador tipo Wyssmont hasta que la pérdida durante el secado cumple con las especificaciones del producto. Es posible iniciar con una pasta de filtro o centrifugación de hidrólisis de N-acetilglucosamina recuperada, la cual puede ser lavada o no. La pasta se disuelve en agua a una concentración de aproximadamente el 25% (p) a temperatura ambiente bajo agitación. Se agrega una base, tal como hidróxido de sodio o hidróxido de potasio para llevar el pH hasta aproximadamente 2.5-4. Una vez que se ajusta el pH, la solución completamente disuelta se trata con carbono activado. Por ejemplo, en un modo por lotes, se agregan 0.02 gramos de Darco G-60 o carbono activado equivalente por gramo de clorhidrato de glucosamina y se mezcla durante un mínimo de 30 minutos. La mezcla se filtra para eliminar el carbono. El carbono se enjuaga posteriormente con una cantidad de agua posteriormente igual a la cantidad de clorhidrato de glucosamina que está siendo recristalizada para eluir cualquier clorhidrato de glucosamina que entre en el carbono y equipo del filtro. Como alternativa, la solución puede pasarse a través de una cama de carbono activado empacada para gránulos, con un paso de elución subsecuente para recuperar el clorhidrato de glucosamina que entra antes de la regeneración o desecho del carbono activado gastado. La solución aclarada se calienta posteriormente a una temperatura de 50°C bajo vacío y agitación. Se ha utilizado un vacío de 50-60 cm Hg. Se elimina aproximadamente la mitad del volumen mediante evaporación y los sólidos se recuperan de la solución restante mediante filtración, centrifugación u otro medio adecuado para recuperar clorhidrato de glucosamina recristalizado. La solución restante se regresa para recuperación adicional. Los sólidos se recolectan, enjuagan con un solvente mezclable en agua, incluyendo pero sin limitarse a: metanol, etanol, n-propanol, ¡sopropanol, n-butanol, sec-butanol, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, ó dioxano, y se secan. Cuando se recristaliza a partir de un hidrolizado de un solo uso, el líquido se evapora en forma adicional hasta un punto en donde son visibles los sólidos y se estima el volumen para ser alrededor del 20 al 30% del volumen de inicio. Se agrega un volumen igual de solvente mezclable en agua como el precipitante líquido, se recuperan los sólidos de la solución resultante mediante filtración, centrifugación, u otros medios adecuados para recuperar el clorhidrato de glucosamina recristalizado. Posteriormente se enfría la solución restante, por ejemplo a una temperatura de 4°C, y se filtra para recuperar el clorhidrato de glucosamina restante. Cuando se recristaliza a partir de un hidrolizado con múltiples usos, el hidrolizado tratado con carbono activado del ciclo subsecuente se agrega a la solución recuperada del ciclo corriente para cubrir el volumen eliminado mediante evaporación y recuperación de sólidos. Aproximadamente la mitad del volumen se elimina posteriormente mediante evaporación y se repite el ciclo. La pureza del clorhidrato de glucosamina recristalizado depende de la cantidad de sales debido a la neutralización del ácido en exceso y otras impurezas que se llevan desde el primer paso de cristalización, hidrolizado. Esto se controla substituyendo un paso de recristalización de hidrólisis de un solo uso para el paso de cristalización de hidrólisis de múltiples usos, cuando el clorhidrato de glucosamina recuperado termina de cumplir con las especificaciones de pureza. El clorhidrato de glucosamina precipitado resultante recuperado durante la precipitación con un solvente mezclable, se disuelve nuevamente y se incorpora como parte de una serie de recristalizaciones subsecuentes. La pasta húmeda de clorhidrato de glucosamina recuperada, debe contener alcohol para minimizar la tendencia del producto a formar bordes y oscurecerse durante el secado. Posteriormente se seca bajo vacío en un secador de vacío o en un secador tipo Wyssmont, hasta que la pérdida durante el secado cumple con las especificaciones del producto. En una modalidad, el paso de hidrolización comprende los pasos de: (a) hidrolizar la fuente de N-acetilglucosamina combinando la fuente de N-acetilglucosamina con una solución de ácido clorhídrico o un licor madre de hidrólisis reciclado bajo condiciones de calor para producir una solución que contiene clorhidrato de glucosamina; (b) enfriar la solución de (a) para precipitar el clorhidrato de glucosamina; e (c) recuperar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina precipitado de (b). En un aspecto, el paso de hidrolización puede llevarse a cabo mediante mezclado continuo de la fuente de N-acetilglucosamina con una solución de ácido clorhídrico o un licor madre de hidrólisis reciclado para mantener la fuente de N-acetilglucosamina como una solución disuelta, seguido de la adición de ácido clorhídrico anhidro bajo condiciones de calor para que la solución de (a) inicie la hidrólisis y convierta la N-acetilglucosamina a clorhidrato de glucosamina. En otro aspecto, el licor madre de hidrólisis reciclado es una solución de hidrólisis que permanece después de la recuperación del clorhidrato de glucosamina precipitado en el paso (c), en donde se agrega un alcohol primario o secundario a la solución de hidrólisis antes, durante o después de que se lleva a cabo el paso de hidrólisis. En este aspecto, el paso de enfriamiento se puede llevar a cabo hasta que la solución tiene una temperatura de desde aproximadamente -5°C hasta aproximadamente 40°C. El paso de recuperación puede comprender: (i) recolectar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina precipitada; (ii) lavar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina con un solvente mezclable en agua (que incluye pero no se limita a, metanol, isopropanol, etanol, acetonitrilo, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfoxido, dimetilformamida y dioxano); y (iii) secar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina. En otro aspecto, el paso de recuperación puede incluir: (i) recolectar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina precipitado; (ii) disolver los sólidos procedentes del (i) en agua para formar una solución; (iii) ajustar el pH de la solución de (¡i) a entre aproximadamente 2.5 y 4 (por ejemplo, agregando una base, lavando para eliminar el ácido, pasando a través de un medio de intercambio de iones, o cualquier otro método adecuado); (iv) contactar la solución de (iii) con carbono activado para decolorar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina; (v) eliminar el carbono activado de la solución de (iv); y (vi) cristalizar el clorhidrato de glucosamina de la solución de (v). En este aspecto, el paso de cristalización comprende concentrar el clorhidrato de glucosamina a una temperatura menor a aproximadamente 70°C, y más preferentemente a una temperatura menor a aproximadamente 50°C. En un aspecto, el paso de cristalización comprende concentrar el clorhidrato de glucosamina a una presión menor a presión atmosférica. En otro aspecto, el proceso incluye además reciclar la solución restante después del paso de cristalización (vi) para utilizarla en el el paso (i) de un proceso de recuperación subsecuente o para un paso de cristalización subsecuente (por ejemplo, recristalización). En otro aspecto, cuando se suspende la fuente de N-acetilglucosamina en un alcohol primario o secundario acuoso de baja ebullición, el método de hidrólisis puede incluir un paso adicional, antes de enfriar la solución, para eliminar el éster de ácido acético formado con el alcohol después de la hidrólisis o antes de reciclar la solución de hidrólisis para volverse a utilizar. Se elimina el éster de ácido acético mediante un proceso que incluye, pero no se limita a: destilación, centelleo y concentración a una presión menor a presión atmosférica. En esta modalidad, el paso de hidrólisis se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 60°C y aproximadamente 100°C, y preferentemente en el punto de ebullición de la solución a una atmósfera. En otro aspecto, cuando se lleva a cabo la hidrólisis bajo proporciones relativamente altas de ácido a N-acetilglucosamina (por ejemplo desde aproximadamente 3:1 hasta aproximadamente 5:1) y a una temperatura relativamente baja (por ejemplo, menos de aproximadamente 80°C), la calidad del cristal de la glucosamina producida puede ser lo suficientemente alta para evitar la necesidad de recristalizar la glucosamina. En esta modalidad, el único paso de recristalización es seguido de un lavado en un solvente mezclable en agua, tal como se describió anteriormente en la presente invención, y posteriormente un paso de secado, como el descrito anteriormente. De hecho, cualesquiera de los métodos de hidrólisis y recuperación aquí descritos pueden incluir adicionalmente un paso de lavado del clorhidrato de glucosamina cristalizada del paso (vi) con un solvente mezclable en agua, tal como se describió anteriormente en la presente invención, seguido de un paso de secado. En un aspecto, el clorhidrato de glucosamina se seca a una temperatura menor a aproximadamente 70°C durante menos de aproximadamente 6 horas, y en otra modalidad, a una temperatura menor a aproximadamente 50°C durante menos de aproximadamente 3 horas. El paso de secado se puede llevar a cabo en la presencia o ausencia de vacío, y en la presencia o ausencia de un barrido de aire o gas inerte. Otro método para convertir N-acetilglucosamina a glucosamina, es utilizar un procedimiento de hidrólisis de enzimas. Los procesos de enzimas para hidrolizar N-acetilglucosamina que se encuentra en el caldo de fermentación o después de su recuperación, se describen en la sección de ejemplos. Tres tipos de enzimas son candidatos: desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-? (EC 3.5.1.25, NagA), desacetilasa de N-acetilglucosamina (EC 3.5.1.33) y desacetilasa de quitina. Las desacetilasas descritas en la publicación de Fujishima y asociados, se identificaron como desacetilasas de N-acetilglucosamina-6-? (EC 3.5.1.25, NagA). Su afinidad y eficacia con N-acetilglucosamina-6-? fueron mucho mayores que con N-acetilglucosamina. Sin embargo, la desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-? purificada a partir de E. coli, no actúa en N-acetilglucosamina. La enzima de desacetilasa de N-acetilglucosamina (EC 3.5.1.25, NagA) es bien conocida por su desempeño en convertir N-acetilglucosamina-6-? a glucosamina-6-?, un paso necesario en el metabolismo celular de N-acetilglucosamina, N-acetilmanosamina y ácido neuramínico. Normalmente, esta enzima de la proteína NagA E. coli recombinante, no es activa en N-acetilglucosamina no fosforilada. Las secuencias de ADN que codifican la desacetilasa de N-acetilglucosamina- 6-P (gen nagA) se determinaron en muchos diferentes organismos. No se sabe si existe una desacetilasa que sea únicamente activa en N-acetilglucosamina (por lo tanto diferenciable de NagA). La desacetilasa de quitina (EC 3.5.1.41) cataliza la desacetilación de las unidades de N-acetilglucosamina en quitina, dando como resultado quitosán. La actividad de desacetilasa de quitina normalmente se determina utilizando como substrato quitina de glicol (quitina parcialmente O-hidroxietilada) radioetiquetada en grupos N-acetilo. La enzima también actúa en quitina microcristalina y carboximetilquitina (derivados solubles). Sin embargo, se reportó que la desacetilasa de quitina procedente de Mucor rouxii no desacetila el monómero de N-acetilglucosamina o 2-3 oligómeros (Araki e Ito, 1975. Eur. J. Biochem. 55:71-78, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia). Aunque no hubieron indicaciones de que la desacetilasa de quitina normal, desacetilará el monómero de glucosamina, las variantes de desacetilasa de quitina con dicha actividad podrían aislarse de la naturaleza y crearse in vi tro . Un número de aciltransferasas pueden eliminar el grupo acetilo de un substrato y transferirlo a otro substrato (Konecny y Asociados). Aunque no hubieron indicaciones de que dichas enzimas puedan desacetilar N-acetilglucosamina, las variantes de aciltransferasa con dicha actividad podrían ser aisladas de la naturaleza o generarse in vitro. La desacetilación de N-acetilglucosamina puede llevarse a cabo a través de una acetiltransferasa contenida en, o aislada de, organismos con una aciltransferasa nativa u organismos con una aciltransferasa recombinante. La aciltransferasa recombinante puede mejorarse mediante mutagénesis aleatoria o dirigida y/o mediante ingeniería de proteínas. En aplicaciones de aciltransferasa o tecnología de desacetilasa para convertir N-acetilglucosamina a glucosamina, existe el potencial de la degradación del producto a través de una variedad de mecanismos debido a una inestabilidad bien conocida de la glucosamina en solución, especialmente cuando está fuera de un ambiente con pH bajo que podría protonar de otra forma el átomo de nitrógeno. Una reducción de pH simple, aunque adecuada para la hidrólisis de ácido, se vuelve problemática para la catalización de enzimas. Es más probable que las enzimas sean desnaturalizadas cuando se exponen a un ambiente no regulado o con un pH no neutral. Además, las altas cargas de sal con frecuencia están asociadas con la desnaturalización de enzimas. En consecuencia, se propone emplear una tecnología de inmovilización de enzimas (que se describe más adelante) para fijar la conformación de enzimas y reducir el impacto de exposición a altas concentraciones iónicas y reducir el consumo de enzimas costosas. Además, se propone tomar ventaja de la solubilidad relativamente baja de clorhidrato de glucosamina en comparación con otras sales, tal como acetato de sodio, acetato de calcio, cloruro de sodio, y cloruro de calcio. Al presentar una enzima adecuada con una solución acuosa de cloruro de sodio o calcio y N-acetilglucosamina, la reacción de equilibrio procederá para formar acetato de sodio o calcio altamente soluble, que sirve como un regulador de pH para la enzima. La reacción también produce clorhidrato de glucosamina relativamente insoluble, aunque estable, el cual puede ser cristalizado o precipitado de la solución, mediante concentración evaporativa o uso de precipitantes líquidos. Conforme la glucosamina se separa de la solución, se extraer la reacción de equilibrio, consumiendo la N-acetilglucosamina adicional. El licor madre restante contendrá clorhidrato de glucosamina disuelta residual, acetato de sodio o calcio, cloruro de sodio o calcio y una cantidad menor de N-acetilglucosamina no reactivada. El tratamiento de este licor madre con alcohol, en la forma de un precipitante líquido, separa el acetato de sodio o calcio soluble del clorhidrato de glucosamina menos soluble, cloruro de sodio o calcio, y N-acetilglucosamina, el cual puede ser reciclado para el comienzo del proceso de conversión enzimática. Aún otro método para convertir en forma enzimática N-acetilglucosamina a clorhidrato de glucosamina, es utilizar la enzima catalítica para esterificar un alcohol, transfiriendo el grupo de acetilo de la N-acetilglucosamina a un alcohol agregado. Al eliminar el éster formado durante la hidrólisis, se conduce la reacción para consumir N-acetilglucosamina, generando una base libre de glucosamina. La base libre de glucosamina formada a partir de la hidrólisis enzimática puede ser estabilizada pasándola en la forma de una mezcla con una solución de sal de cloruro, por ejemplo, cloruro de sodio, a través de una resina de intercambio de cationes en la forma de hidrógeno, en donde el catión de sal se intercambia por un ión de hidrógeno, y se forma el clorhidrato de glucosamina estable, en tanto que la resina de intercambio de iones retiene los cationes de sal. En esta misma forma, se puede combinar una selección de cualesquiera de una variedad de sales, que incluyen pero no se limitan a fosfatos, sulfatos, yoduros y bisulfatos, con la base libre de glucosamina, la cual al pasar a través de una columna de intercambio de cationes se convertirá en sales de ácido estable conocidas, que incluyen sulfato de (gIucosamina)2 - (NaCI)2, sulfato de (glucosamina)2 - (KCI)2, sulfato de (glucosamina)2, clorhidrato de glucosamina, yodihidrato de glucosamina, fosfato de glucosamina, bisulfato de potasio de (gIucosamina)2 - (HCI)2, y bisulfato de sodio de (glucosamina)2 - (HC1)2. Por consiguiente, en un aspecto, la enzima de desacetilación recombinante descrita anteriormente se enlaza a un soporte sólido, es decir, una enzima inmovilizada. Tal como se utiliza en la presente invención, una enzima (por ejemplo, una desacetilasa) enlazada a un soporte sólido incluye la enzima aislada inmovilizada, células inmovilizadas, que contienen la enzima, tal como una enzima recombinante (incluyendo células de bacterias, hongos (por ejemplo, levaduras), microalgas, insectos, plantas o mamíferos inmovilizadas) células intactas estabilizadas y homogenados de célula/membrana estabilizados. Las células intactas estabilizadas y los homogenados de célula/membrana estabilizados incluyen células y homogenados procedentes de microorganismos que ocurren en forma natural que expresan la enzima o procedentes de microorganismos modificados en forma genética células de insectos o células de mamíferos, tal como se describe en la presente invención, los cuales han sido modificados en forma genética para expresar la enzima (por ejemplo, mediante tecnología recombinante). Por lo tanto, aunque los métodos de inmovilización de enzimas se describirán más adelante, se apreciará que dichos métodos son igualmente aplicables para inmovilizar bacterias y otras células, y en dicha modalidad, las células pueden ser lisadas.

Una variedad de métodos para inmovilizar la enzima, se describen en la publicación de Industrial Enzymology 2da Edición, Godfrey, T. y West, S. eds. Stockton Press, Nueva York, N.Y., 1996, páginas 267-272; Inmobilized Enzymes, Chibata, I. Ed., Halsted Press, Nueva York, N.Y. 1978; Enzymes and Inmobilized Cells ¡n Biotechnology, Laskin, A. Ed. Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, California, 1985; y Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 4, Chibata, I. and Wingard, Jr., L. Eds. Academic Press, Nueva York, N.Y. 1983, la cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. En síntesis, un soporte sólido se refiere a cualesquiera soportes orgánicos sólidos, membranas artificiales, soportes de biopolímero o soportes inorgánicos que pueden formar un enlace con la enzima sin afectar en forma significativa la actividad de la enzima aislada. Los soportes sólidos orgánicos de ejemplo incluyen polímeros tales como poliestireno, nylon, resinas de fenol-formaldehído, copolímeros acrílicos (por ejemplo, poliacrilamida), células completas intactas estabilizadas y homogenados de célula/membrana completos crudos estabilizados. Los soportes de biopolímero de ejemplo incluyen celulosa, polidextranos (por ejemplo Sephadex®), agarosa, colágeno y quitina. Los soportes inorgánicos de ejemplo incluyen granos de vidrio (porosos y no porosos), acero inoxidable, óxidos de metal (por ejemplo, cerámicas porosas tales como Zr02, Ti02, AI2O3, y NiO) y arena. Preferentemente, el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste de células intactas estabilizadas y/o homogenados de célula cruda. La preparación de dichos soportes requiere un manejo y costo mínimo. Además, dichos soportes proporcionan excelente estabilidad de la enzima. Las enzimas pueden ser enlazadas a un soporte sólido a través de una variedad de métodos que incluyen adsorción, reticulación (incluyendo enlace covalente) y atrapamiento. La adsorción puede ser a través de fuerzas de Van del Waal, enlace de hidrógeno, enlace Iónico o enlace hidrofóbico. Los soportes sólidos de ejemplo para inmovilización de adsorción incluyen adsorbentes poliméricos y resinas de intercambio de iones. Los soportes sólidos en forma de gránulos, son particularmente bien adecuados. El tamaño de partícula de un soporte sólido de adsorción puede seleccionarse de modo que la enzima inmovilizada se retenga en el reactor a través de un filtro de malla en tanto que el sustrato (por ejemplo, el aceite), se deje fluir a través del reactor en un rango deseado. Con soportes de particulado porosos es posible controlar el proceso de adsorción y permitir que las enzimas o células de bacterias se incrusten dentro de la cavidad de la partícula, proporcionando de éste modo protección sin una pérdida de actividad inaceptable. Cada publicación y referencia mencionada descrita en la presente invención, esta incorporada en su totalidad como referencia. Los siguientes resultados experimentales se proporcionan con propósitos de ilustración, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Ejemplos La siguiente es una lista de diversos microorganismos modificados en forma genética referenciados y/o descritos en la presente invención. Algunas de las cepas se describen en la Patente Norteamericana No. 6,372,457, supra, y se utilizaron como cepas paternas para las modificaciones genéticas descritas en forma específica en la presente invención .

Cepa E. coli Cepa No. Descripción Referencia W3110 F mcrA mcrB IN(rmD-rrnE) 1?" ATCC ATCC25947, un derivado de E. coli K-12 Patente Norteamérica 7101-17 TetR::Anag manXYZ DE3 na 6,372,457 (DE3) 2123-4 TetR::Anag manXYZ DE3 T7lac-glmS*4::AlacZ CamR ib. 2123-12 TetR::Anag manXYZ DE3 T7lac-glmS::AlacZ CamK ib. 2123-54 TetR:.Anag manXYZ DE3 T7lac-glmS*54::AlacZ CamR ib. 2123-59 TetR:.Anag manXYZ DE3 T7lac-glmS*59::AlacZ CamR ib. 2123-64 TetR:.Anag manXYZ DE3 T7lac-glmS*64::AlacZ CamR ib. 2123-72 TetR:.Anag manXYZ DE3 T7lac-glmS*72::AlacZ CamR ib. 2123-103 TetR:.Anag manXYZ DE3 T7lac-glmS*103::AlacZ CamR ib. 2123-124 TetR:.Anag manXYZ DE3 T7lac-glmS*124::AlacZ CamR ib. 7107-16 TetR:.Anag manXYZ DE3 T7-glmS*54::galK Ejemplo 6 7107-18 TetR:.Anag manXYZ DE3 T7-glmS*54::galK ib. 7107-22 TetR:.Anag manXYZ DE3 pET24d(+) KanR Ejemplo 2 7107-23 TetR:.Anag manXYZ DE3 pET24d(+)/T7-CaGFA1 KanR ib. 7107-24 TetR:.Anag manXYZ DE3 pET24(d+) T7-BsglmS KanK ib. 7107-58 TetR:.Anag manXYZ DE3 pET23b(+)/T7-CaGFA1 KanR Ejemplo 2 7107-60 TetR:.Anag manXYZ DE3 pET23b(+)/T7-CaGFA1-M KanR ib. 7107-84 7107-18, Alacl(DE3) Ejemplo 28 7107-88 7107-18, pET24d(+) KanR Ejemplo 13 7107-87 7107-18, pET24d(+]/T7-ScGNA1 Kan ib. 7107-90 7107-18, ApfkA Ejemplo 22 7107-92 7107-18, T7-ScGNA1 ::AmanXYZ Ejemplo 16 7107-93 7107-18, pET24d(+)/T7-AtGNA1 KanR Ejemplo 13 7107-95 7107-18, T7-SCGNA1 "AmanXYZ pET24d(+) KanR Ejemplo 24 7107-96 7107-18, T7-ScGNA1::AmanXYZ pET24d(+)/T7-zwf KanR ib. 7107-101 TetR::Anag manXYZ DE3 pET24(+ T7-ScGFA1 Kan Ejemplo 2 7107-117 7 07-18, pET24d(+)/T7-CaGNA1 KanR Ejemplo13 7107-118 7107-18, T7-glnA::ApfkB Ejemplo 23 7107-119 ib. ib. 7107-120 ib. ib. 7107-124 7107-18, T7-SCGNA1 "AmanXYZ pET24d(+) T7-pgi Kan" Ejemplo 26 7107-125 7 07-18, T7-glnA::ApfkB T7-ScGNA::AmanXYZ Ejemplo 23 7107-126 7107-18, T7-glnA::ApfkB T7-ScGNA1 "AmanXYZ ib. 7107-133 7107-18, T7-glnA::ApfkB, T7-ScGNA1::AmanXYZ ib. 7107-136 7107-18, T7-SCGNA1 ::AmanXYZ T7-pgl::AaraBAD Ejemplo 26 7107-141 ib. ib. 7107-163 7107-18, pET24d(+)/T7-glnA Kan' Ejemplo 23 7107-214 TetR::Anag manXYZ DE3 pET24d(+) T7-glmS KanR Ejemplo 2 7107-308 7107-18, AglgXCA Ejemplo 27 7107-309 ib. ib. 7107-310 7107-18, lacUV5 promotor que reemplaza el promotor lac Ejemplo 28 Cepa No. Descripción Referencia 7107-313 7107-18, lacUV5 que reemplaza Alad (lac) ib. 7107-314 7107-18, lacUV5 que reemplaza Alad (lac) ib. 7 07-315 7107-18, lacUV5 que reemplaza Alad (lac) ib. 7107-321 TetR::Anag manXYZ DE3 T7-glmS*54::Anag Ejemplo 29 7107-325 TetR::Anag manXYZ DE3 T7-glmS*54::Anag T7-ScGNA1::AmanXYZ ib. 7107-326 ib. ib. 7107-327 ib. ¡b. 7107-328 ib. ib. 7107-512 UV mutagenizado 7107-92 (por ejemplo, 7107-18, T7-ScGNA1::AmanXYZ Ejemplo 21 7107-513 UV mutagenizado 7107-92 (por ejemplo, 7107-18, T7-ScGNA1::AmanXYZ ib. 7107-602 7107-18, Apf A T7-ScGNA1::AmanXYZ Ejemplo 22 7107-603 ib. ib. 7107-606 7107-18, T7-ScGNA1::AmanXYZT7-zwf::ArhaBAD Ejemplo 24 7107-18, T7-ScGNA1::AmanXYZ T7-ScGNA1::AfuclK (dos copias de 7107-607 ScGNAl) Ejemplo 16 7107-18, T7-ScGNA1::AmanXYZ T7-ScGNA1::AfuclK T7-ScGNA1::A treE 7107-608 (tres copias de ScGNAl) ib. 7107-18, T7-ScGNA1::AmanXYZ T7-ScGNA1::AfuclK T7- 7107-609 ScGNAl "AamelAB (tres copias de ScGNAl) ib. 7107-610 ib. ib. 7107-611 ib. ib. 7107-18, T7-ScGNA1::AmanXYZ T7-ScGNA1::AfuclK T7-ScGNA1::A treE 7107-612 T7-ScGNA1 "AmelAB (cuatro copias de ScGNAl) ib. 7107-613 ib. ib. 7107-633 7107-18, T7-ScGNA1::AmanXYZT7-ScGNA1::AfuclK zwf::ArhaBAD Ejemplo 25 7107-634 7107-18, T7-ScGNA1 : :AmanXYZ zwf::ArhaBAD ib. 7107-636 7107-18, pET24d(+)/T7-nagB Kan" Ejemplo 14 7107-637 ib. ib. 7107-638 ¡b. ib. 7107-645 Tet^Anag manXYZ DE3 T7-nagB::ApfkB ¡b. 7107-646 TetR::Anag manXYZ DE3 T7-nagB::ApfkB AglmS ib. 7107-660 TetR;.Anag manXYZ DE3 T7-nagB::ApfkB AglmS T7-ScGNA1::AmanXYZ ib. 7107-661 ib. ib. 7107-667 TetR::Anag manXYZ DE3 pET24d(+)/T7-glmU anR Ejemplo 15 7107-668 ib. ib. 7107-669 TetR:.Anag manXYZ DE3 pET24d(+)/T7-glmM KanR ib. 7107-670 ib. ib. 7107-671 TetR::Anag manXYZ DE3 pET24d(+) T7-glmS anR ib. 7107-672 ib. ib. 7107-678 7107-18, T7-glmU::Anag ib. 7107-679 ib. ib. 7107-680 7107-18, T7-glmU::Anag ib. 7107-681 ib. ib. 7107-682 7107-18, T7-glmM::Aglg ib. 7107-683 7107-18, T7-glmM::Aglg (glm orientado en forma opuesta a glg) ib.

Cepa No. Descripción Referencia 7107-18, T7-glmU::Anag T7-glmM::Aglg (glmM orientado en forma opuesta 7107-685 aglg) ib. 7107-18, T7-glmllt::Anag T7-gImM::Aglg (glmM orientado en forma opuesta 7107-687 aglg) ib. 7107-689 7107-18, T7-glmU::Anag T7-glmM::Aglg ib. 7107-692 7107-18, T7-gImUt::inag T7-gtmM::áglg ib. Nota: Todas las cepas descritas en la tabla se derivaron de la misma cepa 1) paterna W31 0. La mayor parte de las cepas descritas en la tabla se desarrollaron a partir 2) de la cepa 7107-18 (TetR AnagmanXYZ DE3T7-glmS*54::galK). Para simplificar, el genotipo de estas cepas se describe tal como 7107- 8 más nuevos cambios. Genes procedentes de otras fuentes a E. coli, se identifican con dos letras. 3) Se: Sacc aromyces cerevisiae, Ca: Dandita albicans, At: Arabidopsis trialiana, Bs: Bacillus subtilis. Para integración de genes, la cinta de expresión insertada se orienta igual 4) que el gen u operon del sitio objetivo, excepto cuando se indica lo contrario.

Ejemplo 1 El ejemplo que se encuentra a continuación describe la clasificación de mutantes para mejores productores de glucosamina. La Patente Norteamericana No. 6,372,457, incorporado en su totalidad a la presente invención como referencia, describe cepas de E. coli recombinante que producen glucosamina en altos niveles. Estas cepas se construyeron utilizando un método de ingeniería metabólica. Este método consistió de tres pasos. Ei primer paso fue introducir mutaciones que restringen el metabolismo e importan glucosamina y su derivado de 6-fosfato. El segundo paso fue sobreexpresar el gen glmS de E. coli que codifica la sintasa de glucosamina (G1mS), la enzima biosintética clave. El tercer paso fue minimizar la inhibición del producto de G1ms mediante mutagónesis in vitro de la enzima. La cepa recombinante 2123-54 contuvo un gen muíante glmS de E. coli recombinante resistente al producto bajo el control del promotor T7 y mostró el titulador del producto más alto en el cultivo en el frasco de agitación en un medio de sal mineral simple suplementado con glucosa. Esta cepa se utilizó como una referencia para evaluar nuevas cepas para mejoras adicionales. También se utilizó en experimentos diseñados para mejorar el crecimiento celular y la producción de glucosamina inducida mediante IPTG. Genotipo de la cepa de producción de glucosamina 2123-54 inducible mediante IPTG 2123-54 se derivó de la cepa E. coli K-12 de laboratorio, designada W3110. El genotipo relevante se describe en la tabla 1.

Genotipo de Cepa de Producción de Glucosamina Cambio Genético Descripción TetR at Anag Reemplazo de la secuencia de regulon nag con un marcador de resistencia a tetraciclina para eliminar genes del metabolismo de glucosamina-6-fosfato y captación de glucosamina mutación manXYZ Mutación que elimina el sistema de transporte de azúcar específico de mañosa, el cual también transporta glucosamina.

Una construcción integrada para sobre expresar el gen glmS que codifica la sintasa GlcN6P. El gen glmS se coloca bajo control a través del promotor T7. La construcción se integra en el cromosoma E. coli en el gen lacZ. El diseño *54 indica la mutación en glmS que da como resultado una enzima resistente a inhibición de retroalimentación a través de su producto. El elemento genético que codifica el gen de polimerasa de ARN T7 conducido mediante el promotor lacUV el cual es inducible mediante IPTG.

Las mutaciones nag y manXYZ se mostraron teniendo una influencia positiva en la producción de glucosamina y continuaron para llevarse a cabo en nuevas cepas de producción. Al utilizar el sistema de expresión T7, el gen glmS tipo natural de E. coli se sobre expresó y se produjo un nivel superior de algunos dobleces de la producción de glucosamina, utilizando inducción IPTG. Ya que GlmS tipo natural de E. coli se inhibe fuertemente a través de su producto, se crearon glucosamina-6-?, conjuntos de mutantes glmS de E. coli mediante PCR propenso a errores, y se clasificó mediante ensayo de alimentación de placa para la producción de glucosamina incrementada. Las construcciones de expresión que expresan mutantes glmS* en los productores de glucosamina mejorados, se integraron dentro del cromosoma en el sitio lacZ para generar cepas de producción estables. Muchas cepas mutantes sintetizaron una sintasa de glucosamina que fue resistente al producto. En experimentos de frascos de agitación, estas cepas mutantes produjeron niveles drásticamente incrementados de glucosamina en comparación con la cepa con la construcción de expresión glmS tipo natural de E. coli. La cepa 2123-54 (con la construcción de expresión T7-glmS*54) produjo alrededor de 11 g de glucosamina por litro. Desarrollo de un método de clasificación de frasco de agitación simplificado: Tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,372,457, se crecieron diferentes cepas de producción de glucosamina en un medio de sal mineral suplementado con glucosa para la producción de glucosamina en un cultivo de frasco de agitación. En experimentos previos, conforme se eliminaron, la glucosa y el sulfato de amonio se alimentaron al cultivo, conduciendo a una producción continua de glucosamina. Sin embargo, esto requiere de un monitoreo y alimentación frecuente (cada 6 a 8 horas) durante un período de tres días. Por consiguiente, es deseable desarrollar un protocolo de cultivo en frasco de agitación que sea más simple, aunque confiable para evaluar diferentes cepas de producción de glucosamina. El medio de sal mineral simple utilizado en la producción de glucosamina fue M9A (Tabla 2). Se desarrolló un protocolo de tres pasos para la evaluación de la cepa. Primero, las células crecidas recientemente en placas LB se utilizaron para iniciar un cultivo en LB 3-ml, la cuales crecieron a una temperatura de 37°C durante aproximadamente 8 horas. Segundo, se utilizó 1.5-ml del cultivo para inocular 50 mi del medio M9A en un frasco de agitación de 250-ml, y el cultivo se incubó a una temperatura de 37°C y se agitó a 225 rpm durante aproximadamente 16 horas (durante la noche). La densidad celular del cultivo se midió a 600 nm. Este paso incluyó que las células se adaptaran al medio mínimo y a los resultados reproducibles de la producción de glucosamina. Tercero, se agregaron alícuotas de células a 50 mi de un medio M9A que contiene IPTG (0.2 mM) en un frasco de agitación de 250-ml. El OD de la célula inicial fue de 0.3. Las células se incubaron a una temperatura de 37°C y se agitaron a 225 rpm durante 72 horas. Las muestras (1 mi) se tomaron en 24, 48 y 72 horas para determinar niveles de glucosamina en el caldo de cultivo. En los puntos de tiempo de 24 y 48, se ajustó el pH a 7.0 a través de la adición de una pequeña cantidad de NaOH y se agregó glucosa a 20 g G1. Bajo estas condiciones experimentales, la cepa de control 2123-54 produjo aproximadamente 6 g 1~1 de glucosamina en 72 horas. Tabla 2. Medio M9A y M9B utilizado para la producción de glucosamida* Macroelementos (g G1) M9A M9B KH2P04 14 6 K2HP04 16 24 Na3Citrato-2H20 1 1 (NH4)2S04 7.5 7.5 MgS04-7H20 0.25 0.25 CaCI2-2H20 0.015 0.015 Glucosa 20 20 pH 7.0 7.0 * Para la fermentación, se suplementa el medio con antiespuma (Mazu 204 y 0.25 mi I Clasificación de mutantes en experimentos de frasco de agitación: Se evaluaron nuevamente aproximadamente 150 cepas de E. coli recombinantes con construcciones mutantes glmS integradas utilizando el protocolo utilizado. Se ensayó la glucosamina después del método colorimétrico utilizando el reactivo de Ehrlich. Las cepas 2123-72 y 2123-103 produjeron glucosamina en niveles ligeramente mayores a 2123-54 (tabla 3).

Tabla 3. Producción de glucosamina inducida mediante IPTG en un cultivo de frasco de agitación.

Cepas Glucosamina (g G1) 24 hr 48 hr 72 hr 2123-54 2.085(100%)* 5.599(100%)* 6.462(100%)* 2123-72 2.141 (103%) 6.699 (120%) 7.791 (120%) 2123-103 2.390(115%) 7.230(129%) 8.712(135%) * El porcentaje de los números mostrados en los paréntesis son relativos con los valores procedentes de 2123-54 en diferentes puntos de tiempo. Evaluación de cepas 2123-72 y 2123-103 que producen glucosamina en forma superior en fermentadores de 1 litro: Se compararon las cepas de producción de glucosamina con mayor potencial, 2123-72 y 2123-103 con 2123-54 en fermentadores de 1 litro. Los fermentadores se prepararon con un volumen inicial de 475 mi de medio 9A suplementado con anti-espuma ( azu 204 a 0.25 mi 1"1) y oligoelementos (tabla 4). Las fermentaciones se corrieron utilizando el 75% de NH4OH para un control de pH a 6.9. La temperatura se mantuvo a 30°C a lo largo de la fermentación. Se ajustaron la aereación y agitación para mantener una concentración de oxígeno disuelto del 20% de saturación de aire. Se alimentó el 65% de glucosa a los cultivos con un rango de alimentación controlado mediante el programa de computadora para lograr un rango de crecimiento de 0.40 hr1 en inoculación y un rango máximo de 5 ml/hr mediante 6 horas. La fermentación permitió el control preciso del pH, oxígeno y concentración de glucosa. Se logró una concentración de glucosamina más alta en los fermentadores en lugar de en los frascos. Se corrieron dos grupos de cada cepa bajo dos diferentes condiciones. Un grupo de fermentadores inició con una concentración baja de glucosa (10 g límite de glucosa), y otro grupo inició con una concentración mayor de glucosa (40 g 1"1, glucosa en exceso). Las condiciones de glucosa en exceso más cercanas se asemejan a las condiciones de crecimiento en el frasco de agitación. Las condiciones de límite de glucosa se utilizaron en forma normal en los experimentos de fermentación y condujeron generalmente a una mayor producción de glucosamina con 2123-54. Los cultivos fueron inducidos con IPTG a partir del inicio de la fermentación. Bajo cualesquiera condiciones de límite o exceso de glucosa, ambas cepas 2123-72 y 2123-103 se desempeñaron mejor que 2123-54, produciendo hasta 14 g 1~1 de glucosamina en 50 horas, en comparación con la producción de hasta 10 g l"1de glucosamina en 50 horas de 2123-54 (datos no mostrados).

Tabla 4. Oligoelementos suplementados al medio de crecimiento utilizado en algunos experimentos.

Microelementos mg G CoCI2-6H20 0.87 CuCI2-2H20 0.60 FeCI3-6H20 10.50 MnCI2-4H20 12.00 ZnCI2 1.50 Na2 o04-2H20 1.50 Ejemplo 2 El ejemplo que se encuentra a continuación describe la sobreexpresión de diferentes genes glmS para la producción de glucosamina. Los genes de sintasa de glucosamina bacterianos (glmS) y los homólogos de levadura (genes GFA) fueron clonados y expresados en E. coli para demostrar su utilidad en la ingeniería de la trayectoria metabólica de glucosamina. Se amplificaron diferentes genes a partir de Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans mediante PCR y se colocaron bajo el control del promotor T7 en el vector de expresión pET24d(+). Las construcciones se transformaron en la cepa E. coli 7101-17 (DE3) y se mantuvieron en la forma de plásmidos de réplica libres. Además, el gen GFA1 C. albicans conducido mediante el promotor T7, se integró en el cromosoma en el sitio lacZ en 7101-17 (DE3). Las cepas que recibieron diferentes genes glmS y GFA se evaluaron con respecto a la expresión genética y producción de glucosamina utilizando inducción IPTG. Clonación del gen glmS B. subtilis: El gen glmS subtilis contiene una estructura de lectura abierta de 1803 pb y codifica una proteína de aproximadamente kDa (599 residuos, excluyendo la metionina iniciadora la cual normalmente se elimina en las células). La secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta de glmS B. subtilis se describe en la SEQ ID NO: 15. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína GlmS de B. subtilis se describe en ia SEQ ID NO:16. El gen glmS se amplificó mediante PCR a partir de las cepas ATCC 23855 y ATCC23857. El cebador de avance contenía el codón de inicio ATG y el sitio Bsa I (SEQ ID NO:21): 5'-GATCGGTCT CGC ATG TGT GGA ATC GTA GGT TAT ATC GGT C-3'. El cebador inverso contenía el codon de detención y un sitio Xho I (SEQ ID No:22): 5'-GAT CCT CGA GTT ACT CCA CAG TAA CAC TCT TCGCAA GGT TAC G-3. Los productos PCR de tamaño esperado se ligaron en pET24d(+) (Novagen Inc, Winconsin). El vector fue digerido previamente con enzimas Neo I y Xho I. Los plásmidos recombinantes pSW 07-15#83 se confirmaron mediante análisis de restricción y se transformaron en 7101-17 (DE3), generando cepas 7107-24 de E. coli (gen glmS procedente de ATCC23856 de B. subtilis) y 7107-25 (gen glmS procedente de ATCC23857 de B. subtilis). Como un control, el vector vacío pET24d(+) también se transformó en 7101-17(DE3) generando la cepa 7107-22. Clonación del gen GFA1 S. cerevisiae La estructura de lectura abierta de GFA1 S. cerevisiae tiene 2154 pb y codifica un péptido de 716 residuos (excluyendo la metionina iniciadora). La secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta GFA1 S. cerevisiae se describe en la SEQ ID NO:17. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína GFA1 S. cerevisiae se describe en la SEQ ID NO:18. El tamaño de proteína anticipado de la secuencia es de aproximadamente 80 kDa. No se encuentran intrones en la secuencia del gen GFA1, por lo cual, el gen se amplificó a partir del ADN genómico preparado de la cepa de S. cerevisiae S288C (ATCC204508).

El cebador de avance, incluyendo el codón de inicio ATG y el sitio Bsa I, tuvo la siguiente secuencia (SEQ ID NO:23): 5'-GAT CGG TCT CGC ATG TGT GGT ATC TTT GGT TAC-3'. El cebador inverso, incluyendo el codon de detención y un sitio EcoR I, tuvieron la siguiente secuencia (SEQ ID NO:24): 5'-GAT CGA ATT CTT ATT CGA CGG TAA CAG ATT TAG-3'. El producto PCR de aproximadamente 2.2 kb se clonó dentro de pPCR-Script Amp SK( + ). Los plásmidos recombinantes se confirmaron mediante digestiones de enzima de restricción. El fragmento GFA1 S. cerevisiae se aisló mediante digestión con Eco I y Bsa I y se ligaron dentro de los sitios EcoR I y Neo I de pET24d( + ). El plásmido recombinante se confirmó mediante análisis de restricción y se transformó en 7101-17(DE3) que genera la cepa E. coli 7107-101. Clonación de GFA1 Candida albicans: El gen GFA1 C. albicans está libre de ¡ntrones y su estructura de lectura abierta de 2142-pb codifica un péptido de aproximadamente 80 kDa (712 residuos, excluyendo la metionina iniciadora). La secuencia de nucleótidos de la secuencia de estructura abierta GFA1 C. albicans se describe en la SEQ ID NO:19. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína GFA1 C. albicans se describe en la SEQ ID NO:20. La secuencia de codificación de GFA1 se amplificó a partir de la cepa ATCC10261 mediante PCR utilizando un cebador de avance y un cebador inverso. El cebador de avance contuvo el codon de inicio ATG y el sitio Bsa I: 5'-GAT CGG TCT CGC ATG TGT GGT ATT TTT GGT TAC GTC-3' (SEQ ID NO:25). El cebador inverso contuvo el codon de detención y un sitio Xho I: 5'-GAT CCT CGA GTT ACT CAA CAG TAA CTG ATT TAG CC-3' (SEQ ID NO:26). El producto PCR fue clonado en el vector pMOSBlue (Amercham Pharmacia Biotech, Nueva Jersey) y los plásmidos recombinantes se confirmaron mediante digestión de enzima de restricción. El fragmento Bsa l-Xho I se aisló y ligó en pET24d(+) mediante digestión con Neo I y Xho I. El plásmido resultante se transformó dentro de 7101-17 (DE3) huésped, generando la cepa E. coli 7107-23. El gen GFA1 C. albicans también se clonó en el vector de expresión pET23b(+) (Novagen Inc). A diferencia de pET24d(+), este vector no contiene una corriente descendente de la secuencia de operador lac procedente del promotor T7. La ausencia del operador lac puede dar como resultado un mayor nivel de expresión de proteína recombinante. La secuencia de codificación GFA1 de C. albicans se amplificó mediante PCR a partir del ADN genómico de levadura. El cebador de avance contuvo el codon de inicio ATG y el sitio Nde I: 5'-GCG GGT ACC CAT ATG TGT GGT ATT TTT GGT TAC GT-3' (SEQ ID N0.27). El cebador inverso contuvo un sitio BamHI: 5'-GCG GGA TCC TTA CTC AAC AGT AAC TGA TTT AGC CA-3' (SEQ ID NO:28). Los productos PCR de tamaño correcto fueron ligados en pET23b en los sitios Nde I y BamH I. El plásmido recombinante se confirmó mediante análisis de restricción y se transformó en 7101-17 (DE3) en huésped de expresión, generando cepas E. coli 7101-58 y 7107-59. Como control, el vector vacío pET23b también se transformó en 7101 -17(DE3), generando la cepa 7107-57. La sobreexpresión de la proteína GFA1 Candida albicans utilizando el sistema de expresión pET E. coli, se describió anteriormente en una publicación (P. Sachadyn y asociados., Protein Expresión and Purification 19, 343-349 2000). Sin embargo, la producción de glucosamina no se demostró o describió en lo absoluto. Además, el gen GFA1 reportado fue clonado a partir de una cepa C. albicans diferente (ATCC13153). Aunque dos proteínas GFA1 tienen las mismas secuencias de aminoácido, el gen GFA1 procedente de ATCC13153 tiene los residuos Leu 29 y Ala 655 codificados por CTA y GCC, respectivamente, en lugar de TTA y GCT tal como en el ATCC101261. Se hizo un intento para probar si el uso de codones diferentes en los residuos Leu 29 y Ala 655 tiene un impacto en la expresión del gen GFA1 en E. coli. Se llevó a cabo una mutagénesis dirigida al sitio utilizando una estrategia basada en Stratagene QuickChange™ Site-Directed Mutagénesis Kit (Stratagena, CA) para convertir el codon Leu 29 a CTA y el codon Ala 655 a GCC en el plásmido pET23b( + )/C. albicans GFA1 creando el plásmido pET23b(+)/C. albicans GFA1-M. La presencia de ambas mutaciones en el plásmido nuevo se confirmó secuenciando y el plásmido se transformó en 7101 -17(DE3), generando cepas E. coli 7107-60 y 7107-61. Sobreexpresión de proteína GImS v GFA: Las cepas transformadas con vectores pET que contienen diferentes genes glmS y GFA1 se crecieron en un medio LB para demostrar la expresión de la proteína GImS y GFA1. Primero, las células fueron crecidas en un medio LB en tubos de prueba a una temperatura de 37°C durante la noche. El medio fue suplementado con kanamicina (25 mg 1" ) para mantener los plásmidos. Posteriormente, se utilizó un inoculo del cultivo de 50-µ? durante la noche, para comenzar un cultivo de 50-ml en un frasco con amortiguación de 250-ml. Los cultivos fueron incubados a una temperatura de 37°C y agitados a 225 rpm durante 3 horas. En este punto, se agregó IPTG a una concentración final de 1mM. Después de un período de inducción de 3 horas, los cultivos fueron recolectados para análisis SDS-PAGE. Como un control negativo, las células con el vector pET24d( + ) vacío también se crecieron y analizaron. Para comparación, las células E. coli con ei gen glmS E. coli tipo natural y el gen glmS*54 muíante llevados por el promotor T7 e integrados en el cromosoma en el sitio lacZ, también se crecieron como se indicó anteriormente, sin selección de antibióticos. Se llevó a cabo SDS-PAGE, siguiendo los métodos estándar. Cuando la cinta de expresión de glmS E. coli T7 se llevó en los plásmidos pET o se integró en el cromosoma, se expresó la proteína GlmS en niveles muy altos (datos no mostrados). Las células que hospedan los plásmidos pET24d(+)/T7-B. subtilis glmS, sobreexpresaron una proteína de aproximadamente 65 kDa, el tamaño esperado de la proteína GlmS (datos no mostrados). El nivel de expresión de la cinta integrada fue comparable con las células que expresan el gen glmS E. coli contenido en plásmidos pET. Las células que hospedan el gen GFA1 S. cerevislae mostraron una banda de proteína claramente sobre expresada del tamaño esperado para la proteína de levadura (80 kDa, datos no mostrados). En la cepa 7107-23 que contiene la cinta de expresión GFA1 C. alb¡cans-T7 (datos no mostrados), la síntesis de la banda de proteína de 80kDa no fue aparente cuando se comparó con la cepa con el vector vacío (datos no mostrados). Sin embargo, la banda GFA1 se sobreexpresó en las cepas 7107-58 y 7107-59 que contienen el gen GFA1 C. albicans llevado por el vector a base de pET23b(+)- (datos no mostrados). El nivel de expresión fue claramente mayor que la cepa 7107-23 con el vector a base de pET24d(+)-. El uso de codones alternativos para Leu 29 y Ala 655 no afectó la expresión de la proteína GFA1 C. albicans en E. coli. Todos los niveles de expresión de los genes GFA1 de levadura en E. coli, fueron bajos comparados con los genes glmS de bacterias. Esto se observa normalmente cuando se intenta observar genes eucarióticos en huéspedes E. coli. Ensayo de actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato: Para medir la actividad enzimática y la producción de glucosamina, se crecieron diferentes cepas en el medio M9A. Se utilizó un protocolo de tres pasos para preparar los cultivos. Primero, se utilizaron las células crecidas recientemente en placas LB para iniciar un cultivo en un medio LB 3-ml el cual fue crecido a una temperatura de 37°C durante aproximadamente 6 horas. Segundo, se utilizaron 1.5-ml del cultivo para inocular 50 mi de M9A en un frasco regulado de 250-ml y se incubó el cultivo a una temperatura de 37°C y se agitó a 224 rpm durante aproximadamente 16 horas (durante la noche). Este paso se incluyó para que las células se adaptaran al medio mínimo y para los resultados reproducibles de la producción de glucosamina. Tercero, se agregaron alícuotas de células de 50 mi de un medio M9A que contienen IPTG (1 mM) en un frasco regulado de 250 mi. Se ajustó la densidad celular inicial a 0.3 OD6oo- Las células se incubaron a una temperatura de 37°C y se agitaron a 225 rpm durante 24 horas. Después de la centrifugación, se utilizó el caldo de cultivo en ensayos de glucosamina y se utilizó el pellet de la célula para determinar la actividad de sintasa de glucosamina. Los datos de los experimentos representativos se muestran en la tabla 5. La actividad enzimática fue detectable fácilmente en células E. coli que expresan los genes glmS B. subti/is (que codifican la SEQ ID NO:16). El nivel de actividad fue comparable con las células con una construcción que contiene los genes mutantes glmS E. coli (que codifican la SEQ ID NO:2) y los genes mutantes glmS*54 E. coli (que codifican la SEQ ID NO:6). Sin embargo, únicamente una cantidad de actividad enzimática pudo ser detectada en células que hospedan los genes GFA1 de levadura (que codifican la SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO.20). Los datos de la actividad de los cultivos en el medio M9A fueron generalmente consistentes con los resultados del análisis SDS-gel de células crecidas en el medio LB. Los bajos niveles de expresión de proteína aparecieron como una de las razones principales de la deficiente actividad enzimática en células que hospedan los genes GFA1 de levadura. Producción de glucosamina mediante la expresión de diferentes genes qlmS y GFA1: Se produjo únicamente un nivel muy bajo de glucosamina y se segregó en el medio de cultivo de células 7101-17 (DE3) transformadas con un vector vacío pET24d(+) (Tabla 5). La expresión de un gen glmS de bacteria (E. coli glmS ó B. subtilis glmS) dio como resultado un incremento mayor a 50 veces en la producción de glucosamina. También se observó un incremento de varias veces en el nivel de glucosamina en los cultivos que expresan genes GFA1 de levadura. Tal como se compara con pET24d(+), el uso de pET23b(+), condujo a un nivel superior de proteína GFA1 C. albicans y a un nivel superior de producción de glucosamina. El cambio de los codones Leu 29 y Ala 655 en el gen GFA1 C. albicans no afectó los niveles de producción de glucosamina. Estas observaciones fueron generalmente consistentes con los resultados del análisis SDS-PAGE. Tal como se observa en los ensayos de actividad enzimática, la integración de la cinta de expresión glmS E. coli T7 en el cromosoma, pareció ser benéfica ya que se produjo un mayor nivel de glucosamina en la cepa 2123-12 que en la cepa 7107-214. Claramente la cepa E. coli con glmS*54 integrado en el cromosoma, fue superior en cuanto a la producción de glucosamina cuando se comparó con las otras cepas probadas. Tabla 5. Actividad de sintasa de glucosamina y producción de glucosamina en cepas E. coli que expresan diferentes homólogos glmS y GFA1. Actividad Enzimática Número de (nmol min1 mg" Glucosamina cepa Descripción de Cepa 1) (mg I"1) 7107-22 pET24d(+) oligo 5 pET24d(+)/T7-R subtilis 7107-24 glmS 23856 637 128 pET24d(+)/T7- 7107-101 S.cerevisea GFA1 oligo 47 pET24d(+)/T7y- 7107-23 C.albicans GFA1 oligo 23 pET23b(+)fT7-C.a/fwcans 7107-58 GFA1 oligo 54 pET23b(+)/T7-C.a/íw'cans 7107-60 GFA1-M oligo 58 pET24d(+)/T7-E. coli 7107-214 glmS 297 37 2123-12 lacZ::T7-E coli glmS 613 75 2123-54 lacZ::T7-E. coli glmS*54 803 2,029 1) Célula huésped: E. coli 7101-17 (DE3). Genotipo: nagA, manXYZDE3. 2) Cultivo celular: 30°C durante 26 horas en frascos de agitación que contienen medio M9A suplementado con 7.5 g (NH)2S04 por litro y 40 g de glucosa por litro. 3) C. albicans GFA1 (M): codones Leu 29 y Ala 655 cambiados de TTA y GCT a CTA y GCC, respectivamente.

Ejemplo 3: El ejemplo que se encuentra a continuación muestra la caracterización de diferentes enzimas GlmS resistentes ai producto: mutantes GlmS E. coli y GlmS B. subtilus tipo natural. Se estudiaron ¡n vitro diferentes enzimas de sintetasa de glucosamina incluyendo GlmS B. subtilus, GlmS E. coli nativo y GlmS E. coli muíante. Las células de diversas cepas E. coli fueron crecidas en el medio M9A, cosechadas y congeladas. Los extractos celulares fueron preparados y las sintetasas de glucosamina se caracterizaron y compararon. Se determinaron las secuencias de ADN para dos mutantes glmS E. coli adicionales que mostraron una fuerte resistencia al producto y condujeron una fuerte resistencia al producto y condujeron a una producción superior de glucosamina en E. coli recombinante. Sensibilidad a inhibición mediante glucosamina-6-?: Se examinaron las sensibilidades enzimáticas de la glucosamina-6-? al producto de reacción. Se examinó la velocidad inicial en niveles de saturación de glutamina y fructosa-6-fosfato en un rango de 0 a 30 mM de glucosamina-6-P. Los resultados del ejemplo se muestran en las figuras 4 y 5. La enzima GlmS nativa E. coli procedente de la cepa 2123-12 perdió aproximadamente el 50% de actividad en un nivel de 1 mM de glucosamina-6-?. La actividad continuó disminuyendo con niveles en incremento de glucosamina-6-?. En la cepa 2123-54, 1 mM de glucosamina-6-? no tuvo esencialmente efecto en la actividad enzimática. Arriba de este nivel, la inhibición es casi lineal, permaneciendo rigurosamente el 50% de actividad en 10 mM de glucosamina-6-P. Las enzimas GlmS mutantes procedentes de otras cepas tales como 2123-4, 2123-59, 2123-64, 2123-72, 2123-103 y 2123-124 también mostraron una sensibilidad reducida a inhibición GlcN-6-?. La figura 5 muestra la actividad en [glucosamina-6-?] relativamente "baja". Esta figura señala la diferencia dramática entre GlmS tipo natural y estas cepas GlmS mutantes. Incluso con niveles muy bajos de glucosamina-6-?, se inhibió significativamente la enzima GlmS nativa. Cuando el gen glmS Bacillus tipo natural se sobreexpresó en E. coli, se condujo a un mayor nivel de producción de glucosamina que la sobreexpresión del gen glmS de E. coli tipo natural. Es interesante, que la enzima Bacillus nativa mostrara una resistencia al producto muy comparable con las enzimas glmS mutantes de E. coli (figura 4). Se midió la actividad de la enzima B. subtillus a 0, 2 y 4 mM de glucosamina-6-?. La enzima tiene un Km (fructosa-e-fosfato) de 0.62 mM, y un Ki (glucosamina-6-?) de 1.25 mM (datos no mostrados). Un segundo trazo de valores de regresión no lineales de Vmaz versus [inhibidor] produjo una constante de inhibición (K¡) de 0.56 mM para la cepa 2123-12. Los mutantes 2123-54 y la enzima B. subtillus tiene mayores valores Ki (tabla 6). Las constantes Ki medidas para diversos de estos mutantes son de 4 a 8 veces el valor de la enzima nativa en la cepa 2123-12. Para estudios de frascos de agitación parece que la sensibilidad disminuida a glucosamlna-6-? permitió que se acumularán mayores niveles de glucosamina. Esto sugiere fuertemente que la [glucosamina-6-?] intracelular es muy alta (multi milimolar) en las cepas E. coli recombinantes, dando como resultado una actividad de sintetasa de glucosamina disminuida. La sensibilidad a la inhibición de glucosamina-6-P drásticamente reducida, ofrece la explicación más simple de la síntesis de glucosamina incrementada en cepas que sobreexpresan las enzimas GlmS E. coli muíante y GlmS Bacillus tipo natural. Afinidad con sustratos de fructosa-6-? y glutamina: Se determinaron las constantes Michaelis-Menten para glutamina y fructosa-6-fosfato utilizando extractos crudos (Tabla 6). Con las enzimas GlmS E. coli tipo natural (cepa 2123-12), la regresión no lineal produjo valores de 0.20 mM (fructosa-6-fosf ato) y 0.17 mM (glutamina). Los experimentos análogos con GlmS*54 mutante (cepa 2123-54) produjeron valores de 0.64 mM (f ructosa-6-fosfato) y 0.73 mM (glutamina). Estos valores son ligeramente mayores a los obtenidos con la enzima nativa. La enzima GlmS Bacillus subtilis expresada en E. coli (cepa 7107-24) mostraron un valor Km (fructosa-6-?) muy similar al GlmS*54 de la enzima E. coli mutante. Tabla 6. Características de diferentes enzimas GlmS.

K¡ (GlcN-6-?) Km (fructosa-6-?) Km (glutamina) Fuentes de enzimas (mM) (mM) (mM) WT E. coli GlmS 0.56 0.20 0.17 E. coli GlmS*54 Mutante 4.00 0.64 0.73 E. coli GlmS*110 Mutante 1.60 0.41 ND* E. coli GimS*124 Mutante 3.50 1.10 ND E. coli GlmS Mutante 1.50 0.35 ND E. coli GlmS*72 1.40 0.95 ND Bacillus GlmS tipo natural 1.25 0.62 ND * ND: No determinada Estabilidad térmica: Se utilizó la desnaturalización a una temperatura de 50°C para medir las posibles diferencias en estabilidad térmica de diferentes enzimas GlmS. Se incubaron extractos crudos a una temperatura de 50°C y se muestrearon durante un período de 90 minutos. Las muestras se ensayaron con respecto a la actividad de sintetasa de glucosamina a una temperatura de 25°C con niveles de saturación de todos los sustratos. No pareció haber ninguna correlación significativa entre la estabilidad térmica a 50°C y la producción de glucosamina (datos no mostrados). La cepa 2123-124 tiene la estabilidad más baja aunque ha demostrado ser una de las mejores cepas de producción de glucosamina. Existe una diferencia poco significativa en estabilidad térmica entre las cepas 12, 54 y 59, aún de otros experimentos, y los inventores conocen que la cepa 54 es mucho mejor cepa para producción de glucosamina. Ejemplo 4 El ejemplo que se encuentra a continuación describe un análisis de secuencia GlmS. Se derivaron las cepas 2123-72 y 2123-103 de la cepa huésped 7101-17(DE3) mediante experimentos de transformación e integración con plásmidos pKIN23-72 y pKLN23-103, respectivamente. Las regiones glmS (glmS*72 y glmS*103) es estos plásmidos fueron secuenciadas. La secuencia del nucleótido del muíante glmS*72 E. coli que codifica la secuencia, se describe en la SEQ ID NO:13. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína GlmS*72 E. coli se describe en la SEQ ID NO:14. Es interesante, que ambos mutantes tengan las mismas mutaciones que resultaron en sustituciones de aminoácidos en las posiciones 15, 387, 450 y 525 (tabla 7). Para comparación, se describen los residuos en las posiciones relevantes en el muíante GlmS tipo natural E. coli (SEQ ID NO:2), GlmS*49 (SEQ ID NO:4), GlmS*54 (SEQ ID NO:6) y GlmS*124 (SEQ ID NO:8). El GlmS*72 no tiene mufaciones comunes con respecío a oíros mutantes GlmS resisteníes al producío, excepto el cambio de una serina a prolina en la prolina en la posición 450 la cual también se encontró tanto en GlmS*49 como GlmS*72. Es interesante, que tres enzimas mutantes GlmS (GlmS*49, 72 y 124) tengan una mutación que de cómo resultado un cambio de un residuo a prolina en la región 450 a 469. GlmS*54 también tiene un cambio de residuos en la posición 472: una glicina reemplazada con una serina. Estos datos sugieren que los cambios en esta región de la proteína pueden jugar un papel importante en la resistencia de la enzima al producto. Tabla 7. Cambios de base en el gen glmS mutante E. coli que codifica una sintasa de glucosamina resistente al producto.

Posición* 15 387 450 525 WR glmS Glu (GAA) Asp (GAT) Ser (TCT) Glu (GAA) glmS*72 Mutante Lys (AAA) Val (GTT) Pro (CCT) Gly (GGA) * Por simplicidad, las posiciones se determinan de acuerdo con la numeración de la secuencia de aminoácidos deducida.

Se analizaron las secuencias de nucleótidos de diferentes glmS bacterianos que codifican las secuencias, utilizando el Programa Megalign, J. Hein Method, Lasergene software (ADN Star, Inc, Madison, Wl) con ajustes estándar. Las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótidos, también se compararon utilizando el programa Magalign, Lipman-Pearson Protein Alignment, Lasergene software (ADN Star) con los ajustes estándar. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Tabla 8. Tamaño de péptido y homología de la enzima de sintasa de glucosamina a partir de diferentes microorganismos Número de Tamaño de GImS Aminoácidos* péptido (kDa) Homología de Secuencia de Péptido (% identidad)** E. coli B. subtilis S. cerivisiae C. albicans E. coli 608 67 41 42 42 (50) (47) (46) B. subtilis 599 65 36 36 (45) (45) S. cerevislae 716 80 72 (72) C. albicans 712 79 * El número de residuos de aminoácidos no incluye la metionina iniciadora, la cual se elimina en forma enzimática después de la traducción ** La homología en el nivel de nucleótidos se muestra en el paréntesis.

El gen glmS Bacillus subtilis codifica una sintasa de glucosamina de 599 residuos de aminoácidos (SEQ ID NO:16) (excluyendo la metionina iniciadora, la cual normalmente se elimina en forma enzimática después de la traducción), 9 residuos más cortos que el homólogo E. coli. Los residuos de aminoácidos de la proteína GImS Bacillus que corresponden a las posiciones en donde se encontraron las mutaciones en diferentes mutantes GImS E. coli resistentes a productos, se describen en la tabla 9 por comparación. Es interesante, que en seis de diez posiciones, la enzima Bacillus tiene diferentes residuos con respecto a GImS tipo natural de E. coli, aunque ninguno de los cambios es el mismo que en las enzimas mutantes E. coli. Tabla 9. Cambios de residuos de aminoácidos en GImS E. coli mutante resistente al producto y GImS* B. subtilis tipo natural.

Posición Peso E. coli GImS mutante E. coli Peso B. subtilis GImS GlmS*49 GlmS*54 GlmS*124 GlmS*72 GImS** 4 lie Thr 15 Glu Lys 39 Ala Thr Gln 250 Arg Cys Pro 272 He Thr Tyr 387 Asp Val 450 Ser Pro Pro Asp 469 Leu Pro Phe 472 Gly Ser 525 Glu Gly His * Únicamente se muestran los residuos que son diferentes a los de la proteína GImS tipo natural E. coli. ** Las posiciones de la secuencia GImS Bacillus se basan en la alineación con la secuencia GImS tipo natural E. coli debido a pequeñas brechas en la alineación.

Ejemplo 5 El ejemplo que se encuentra a continuación demuestra las actividades enzimáticas durante la producción de glucosamina en un cultivo en frasco de agitación. Diversas actividades enzimáticas relevantes para la producción de glucosamina fueron examinadas tanto en frascos de agitación como en fermentadores. La implicación de estas enzimas en el metabolismo de glucosa y la formación de N-glucosamina se señala en la figura 3. La glucosa es tomada por la célula y se convierte en forma simultánea a glucosa-6-?. La glucosa se metaboliza a través de un número de trayectorias incluyendo las que se muestran en la figura. En la trayectoria de síntesis de glucosamina, se isomeriza la glucosa-6-? a fructosa-6-fosfato, seguido de la conversión transmitida por GlmS de fructosa-6-fosfato a glucosamina-6-fosfato. Finalmente, se desfosforila la glucosamina-6-fosfato y se segrega. Una importante ruta de competición alternativa para glucosa-6-fosfato es su entrada en glucólisis a través de la fosfofructocinasa. Otras rutas alternativas importantes para glucosa-6-fosfato es su oxidación a gluconolactona-6-fosfato (la entrada en la trayectoria de fosfato de pentosa). Además, la glucosa-6-fosfato podría convertirse a glucosa-1 -fosfato, a partir de lo cual se elabora el glicógeno y se almacena en la célula. Los resultados del análisis enzimático en un experimento de frasco de agitación utilizando la cepa 2123-54 se muestran en la figura 6. Las células se crecieron en un medio M9A y se indujeron con 0.2 mM de IPTG a partir del inicio del cultivo. La actividad de sintasa de glucosamina (GlmS) fue alta a lo largo de todo el experimento. Existió un alto nivel de actividad GlmS a las 12 horas, el cual incrementó a las 24 horas. Posteriormente, pareció declinar la actividad de GlmS. Sin embargo, esta disminución no fue dramática. La actividad a las 72 horas aún fue alta, y fue básicamente la misma que la que se observó a las 12 horas. Por lo tanto, la actividad GlmS no pareció disminuir significativamente durante el curso del experimento. La actividad de fosfoglucoisomerasa (Pgi) fue alta a las 12 horas, e incrementó en forma significativa a las 24 horas. Después de esto regresó al nivel observado a las 12 horas y permaneció en ese nivel durante el resto del experimento. Claramente, la formación de fructosa-6-fosfato procedente de la glucosa no debe haber sido limitada por la baja actividad Pgi en estas células bajo este grupo de condiciones experimentales. La otra ruta importante para fructosa-6-fosfato es glicolisis. El primer paso aquí, es transmitido por la fosfofrutocinasa (Pfk). Se observó la actividad Pfk más alta a las 12 horas, y aunque disminuyó en las siguientes 48 horas, la actividad permaneció detectabie. Este patrón de actividad es típico de Pfk. La actividad es más alta durante el crecimiento exponencial, y posteriormente disminuye conforme las células entran a una fase estacionaria. Se detectó deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato (Glu6P DH) en los extractos. Esta enzima alimenta carbono de la glucosa en la trayectoria de fosfato de pentosa para la regeneración de NADPH. La actividad de esta enzima fue poco relativa para otras medidas, muy estables y disminuyó ligeramente después de las primeras 24 horas del experimento. La actividad de fosfoglucomutasa (Pgm) se encontró muy baja bajo las condiciones experimentales. Ejemplo 6 El ejemplo que se encuentra a continuación describe el desarrollo de las cepas E. coli recombinantes para la producción de glucosamina inducible por lactosa. Con el objeto de desarrollar un proceso comercialmente viable para la producción de glucosamina, fueron necesarios dos factores. Primero se incrementó el titulador de glucosamina. El segundo fue eliminar el uso de IPTG en el proceso de fermentación, debido a que el costo de IPTG origina que la fabricación de glucosamina sea prohibitivamente costosa. Las cepas de producción de glucosamina que se desarrollaron durante la etapa temprana del programa de investigación, requirió IPTG en el medio de cultivo para inducir la expresión de la sintasa de glucosamina. Estrategia para eliminar IPTG del proceso de fermentación : El requerimiento de IPTG en el proceso de fermentación, viene del modo de sobreexpresión del gen glmS, que codifica sintasa GlcN6P, en la producción de cepas tales como 2123-54. El gen glmS fue aislado de el ADN cromosómico de E. coli y clonado en un vector de expresión detrás de un promotor del bacteriófago T7. Este promotor es muy poderoso y muy específico. No es reconocido por la polimerasa de ARN E. coli; sino más bien, por la polimerasa de ARN T7. Se proporciona la polimerasa de ARN T7 en un elemento genético designado DE3, el cual contiene el gen para la polimerasa de ARN T7 conducida por el promotor lac E. coli y el operador lac. Es el uso de este promotor y operador, que necesita la inducción con IPTG. El promotor lac se somete a control negativo a través del represor lac, codificado por el gen lac I. En la ausencia del inductor, el represor lac enlaza al operador lac y evita la expresión de la corriente descendente de genes del operador, en este caso el gen de polimerasa de ARN T7. En la ausencia de polimerasa de ARN T7, el gen glmS no se expresa. En la presencia de IPTG, el represor lac no se enlaza al operador con el resultado de que el gen de polimerasa de ARN T7 se exprese permitiendo la sobreexpresión de glmS. Otro inductor del promotor lac es alolactosa. Este es un sub producto de la acción de b-galactosidasa en lactosa. Las cepas de producción de glucosamina tales como 2123-54 son negativas para b-galactosidasa debido a la eliminación e interrupción del gen lacZ. Sin embargo, en la presencia de un gen lacZ funcional, la lactosa podría ser convertida a alolactosa, iniciando la cascada de reacciones descritas anteriormente que podrían conducir a la reacción de glmS.

En virtud de lo anterior, existen diversos métodos para eliminar la dependencia de IPTG. Un método ilustrado en el ejemplo de la presente invención es restaurar el gen lacZ. Esto se puede realizar integrando la cinta de expresión T7-glmS*54 en un diferente sitio en el cromosoma. La integración en el sitio galK podría dejar intacto el gen lacZ. Las cepas lac+ son potencialmente ¡nducibles mediante lactosa, lo cual es muchos menos costoso que IPTG. El sitio galK se eligió debido a que las cepas integrantes también pueden ser Gal". Se reportó que dichas cepas de galactosa pueden utilizarse como un inductor para los promotores lac. Además, la galactosa generada a través de la hidrólisis de lactosa podría aumentar la inducción de lactosa. Esto puede aumentar la inducción cuando se utiliza una cantidad sub óptima de lactosa en el proceso de producción de glucosamina. En teoría, cuando la cinta de expresión T7-glmS*54 se inserta en el sito galK en la cepa 7101-17(DE3) la cepa resultante podría ser análoga a la cepa 2123-54, aunque la producción de glucosamina podría ser inducible con cualquier lactosa, galactosa o IPTG. Protocolo general para integración o eliminación del gen en un sitio dirigido en el cromosoma mediante selección de temperatura. Se describen vectores y métodos en la publicación de Hamilton y asociados (1989, J. Bacterial. 171: 4617-4622) para elaborar una eliminación del gen dirigido e integración del gen en cromosoma E. coli mediante cambio de temperatura. El método se adaptó para desarrollar diferentes cepas E. coli de producción de glucosamina. Los protocolos para la integración de gen incluyen los siguientes pasos principales. El primer paso es clonar la secuencia del sitio objetivo y realizar una eliminación y/o inserción interna del gen externo que será integrado en el sitio de eliminación. El segundo paso es subclonar el fragmento que contiene estas secuencias en un vector de integración sensible a la temperatura que contiene un origen de réplica sensible a la temperatura y un marcador de selección de antibióticos. El tercer paso es transformar el vector de integración en la cepa huésped de E. coli y seleccionar los clones con todo el plásmido integrado en el cromosoma a través de un solo caso de recombinación bajo temperatura no permisible (42°C). El cuarto paso es crecer las células de los clones seleccionados en un cultivo líquido a una temperatura permisible (30°C). Las células con el plásmido integrado tienen la tendencia a perder el plásmido. Las células que tienen perdida la parte del origen de réplica y el gen de resistencia a antibióticos o todo el plásmido, crecerán en el cultivo. Normalmente, este paso se logra inoculando un medio LB de 50-ml con células procedentes de un conjunto de dos a diez clones y creciendo el cultivo durante 24 horas. El cultivo se pasó a un medio fresco en una dilución de 1,000 veces y se creció durante otro período de 24 horas. Quinto, las células se plaquearon y se seleccionaron los clones que había perdido la resistencia a antibióticos. Los procedimientos de selección específica de gen pueden ser utilizados, dependiendo de la naturaleza del gen integrado o gen eliminado. Normalmente para clasificar clones, se ileva a cabo PCR utilizando un grupo de cebadores que podrían distinguir los clones con el cambio pretendido en el cromosoma de su forma nativa mediante el tamaño de productos PCR. Los clones se confirmaron mediante análisis de Manchado Southern utilizando sondas específicas para la secuencia de ADN integrada o eliminada. Desarrollo de vectores de integración T7qlmS*54 en el sitio qalK mediante selección de temperatura Se desarrollo un vector que contiene una parte de la secuencia operon gal E. coli, el marcador de selección de resistencia a kanamicina procedente del pUC4K de plásmido (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y el origen de réplica pSC101 sensible a la temperatura procedente de pMAK705 (Hamilton, y asociados, 1989, J. Bacterial. 171: 4617-4622) para la Integración del gen en el sitio galK utilizando un protocolo de selección de temperatura. Se amplificó una parte de la secuencia operon gal E. coli (3.3 kb) mediante PCR procedente de la cepa E. coli W31 0. El producto PCR contenía la secuencia gaIT (comenzando en la corriente ascendente de 14 pb hasta el codon de inicio ATG de la secuencia de codificación gaIT, y terminando en los 68 pb después del codon de detención de la secuencia de codificación galM) y se clonó en el vector pCRScript Amp Sk(+), generando el plásmido recombinante pKLN23-157. Se realizó una eliminación de 0.7-kb en la secuencia galK (entre los sitios de restricción Sfo I y Mlu I) y se agregaron sitios de restricción única (Sal I, Bgl II, y Mes I) en el sitio de eliminación, creando el plásmido pKLN07-1. Se aisló una cinta de resistencia a kanamicina en la forma de un fragmento Pst I a partir de pUC4k (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mediante digestión Pst I y un tratamiento con Polimerasa de ADN T4 para producir extremos atenuados. Se ligó el fragmento en el sitio Not I (atenuados con Polimerasa de ADN T4) del plásmido pKLN07-1 (orientación no determinada). Se eliminó el fragmento kan::galTKM del plásmido como un fragmento BamH l/Sac (extremos atenuados con Polimerasa de ADN T4) y se ligó con el fragmento Pvu ll/Sma I que contiene la réplica sensible a la temperatura pMAK705 (Hamilton, y asociados, 1989, J. Bacterial, 171: 4617-4622), creando el plásmido pSW07-4. La cinta de expresión T7-glmS*54 se digirió a partir del plásmido pKLN23-54 (descrito en la Patente Norteamericana No. 6,372,457) como un fragmento Not I y los extremos se atenuaron con Polimerasa de ADN T4. El fragmento se clonó en pSW07-4 en el sitio Msc I, generando el plásmido pSW07-9. Selección de cepas ¡nducibles por lactosa Después de la transformación de la cepa 7101-17(DE3) E. coli con pSW07-9, se utilizó un protocolo adaptado de Hamilton y asociados (1989) para la selección de mutantes de integración sensibles a la temperatura. Para plásmidos con la réplica sensible a la temperatura de p AK705, la réplica del plásmido puede tener lugar a una temperatura de 30°C, aunque la integración del plásmido se forza a una temperatura no permisible (42°C) bajo selección de antibiótico. Al incubar las células transformadas a una temperatura de 42°C, se seleccionaron de este modo de cepas que tenían integrado el plásmido. Esto se realizó plaqueando células en placas que contienen kanamicina, incubando placas a una temperatura de 42°C y seleccionando colonias. Normalmente, se integra todo el plásmido en el cromosoma mediante recombinación homologa. El único caso de cruce puede tener lugar en las regiones gaIT ó galM. Debido al origen de réplica, las células con el plásmido integrado tienen tendencia a lazar el plásmido fuera del cromosoma. Aunque las células con todo el plásmido integrado crecieron de manera muy deficiente a una temperatura de 30°C las células que habían perdido el plásmido o la parte del origen de la réplica mostraron un crecimiento normal. Por consiguiente, cuando las células seleccionadas a una temperatura de 42°C se crecieron a una temperatura de 30°C, las células que habían perdido el plásmido crecieron las células reteniendo el plásmido. Principalmente, existieron dos diferentes formas para que la célula perdiera el plásmido a través de recombinación homologa. Ya sea que perdieron todo el plásmido, dando como resultado una cepa revertente con el operon gal nativo, o perdieron únicamente la parte del plásmido que contiene el origen de réplica y el marcador de selección, dando como resultado una cepa con la secuencia T7-glmS*54 integrada en el sitio galK. Las células de colonias aisladas de una selección a una temperatura de 42°C, se incubaron en un cultivo líquido a 30°C, se plaquearon en placas que no contienen antibióticos. Ya que la integración dio como resultado la desactivación del gen galK, las cepas integrantes no tuvieron la capacidad de utilizar galactosa como las únicas fuentes de carbono. Las placas de galactosa se utilizaron para clasificar las cepas integrantes, las cuales posteriormente se confirmaron mediante hibridación de Manchado Southern utilizando la secuencia galK como una sonda. Estas cepas de producción de glucosamina inducible por lactosa fueron designadas como 7107-16 y 7107-18. Ejemplo 7 Este ejemplo describe la producción de glucosamina inducible por lactosa. Las cepas con la cinta de expresión T7-glmS*54 integrada en el sitio galK (7107-16 y 7107-18) producen altos niveles de glucosamina después de la inducción ya sea mediante IPTG o lactosa. La cepa de control (2123-54) bajo inducción IPTG produjo 4.2 g/l. Las producciones de glucosamina en cepas inducibles por lactosa fueron comparables con 2123-54 inducida con IPTG. Los niveles de glucosamina en 2123-54 y una cepa inducible por lactosa se muestran en la figura 7. Se ensayó la actividad de sintasa de glucosamina en muestras de cultivos inducidos por lactosa. Las células se crecieron en el medio M9A que contiene diferentes cantidades de glucosa y/o lactosa (números que indican gramos por litro). La actividad enzimática y la glucosamina se ensayaron después de 24 horas de crecimiento. Tal como se muestra en la figura 10, la lactosa induce la actividad GlmS y la síntesis de glucosamina. La inducción de lactosa se vio afectada por la cantidad de glucosa en el medio. Altos niveles de glucosa mostraron una fuerte represión en la inducción mediante lactosa. Se seleccionó la cepa 7107-18 para el desarrollo adicional del protocolo de inducción mediante lactosa. La cepa se evaluó bajo diversos esquemas de inducción mediante lactosa en frascos de agitación y fermentadores de 1 litro.

Tabla 10. Actividad de sintasa de glucosamina y niveles de producción de glucosamina en la cepa 7107-16 inducible por lactosa.

Condiciones de crecimiento ' Actividad GlmS ' GIcN (µ mol min"1 mg'1) (gl'1) 30 glucosa/0.2 mM IPTG 0107 Z386 30 glucosa/20 lactosa 0.046 0.202 5 glucosa/25 lactosa 1.140 2.042 /40 lactosa 0.840 2.810 Nota: 1) Las células se crecieron en el medio M9A que contiene diferentes cantidades de glucosa y/o lactosa (los números indican gramos por litro). 2) Se ensayó la actividad enzimática y la glucosamina después de 24 horas de crecimiento. Inducción mediante lactosa y represión por glucosa: En un experimento de fermentación, se trataron diferentes niveles de lactosa, junto con una alimentación ya sea de lactosa o glucosa después de inducción mediante lactosa. Se monitoreó el nivel de glucosamina durante un período de 72 horas. El primer protocolo para la inducción mediante lactosa fue similar a la inducción mediante IPTG, en cuanto a que la lactosa se agregó antes de la inoculación (sin glucosa, ya que la glucosa reprime el operón lac) seguido de la alimentación de glucosa para suministrar carbono para crecimiento, formación GlcN y mantenimiento de la biomasa. Cuando las células se crecieron en 40 g I'1 de lactosa y se alimentaron continuamente con una alimentación de lactosa, las células continuaron consumiendo la lactosa. Esto originó que se acumularan niveles importantes de galactosa, hasta 40 g 1. El nivel de producción de glucosamina fue similar al de 2123-54 bajo inducción mediante IPTG (aproximadamente 10 g G1). Las células se crecieron en 40 g 1 de lactosa durante 24 horas, y posteriormente se cambiaron a una alimentación de glucosa. Bajo estas condiciones, las células detuvieron la utilización de lactosa y la galactosa permaneció constante en un rango de 10 g G1 durante el resto de la prueba. La producción de glucosamina continuó en un buen rango, alcanzando un nivel comparable con el de la cepa 2123-54. Este resultado indica que la producción de glucosamina puede ser soportada en forma estricta mediante glucosa una vez que se detiene la utilización de lactosa. Esto también implica que la inducción requiere únicamente pequeñas cantidades de lactosa que dan como resultado la acumulación únicamente de bajos niveles de galactosa. Para reducir los costos y recuperar el producto es deseable reducir la necesidad de lactosa y reducir la acumulación de lactosa. Los esquemas de inducción que utilizan lactosa incrementada en un rango de 50 y 60 g/l, seguido de alimentación de glucosa mostraron una utilización continua de la lactosa durante cierto tiempo después de la adición de glucosa. Esto indica que la represión mediante glucosa fue incompleta en niveles mayores de lactosa, o que las enzimas inducidas continuaron funcionando en un nivel adecuado para sostener la producción de glucosamina después de la adición de glucosa. Ya que fue deseable utilizar niveles más bajos de lactosa, y los experimentos mostraron que la represión de glucosa podría minimizarse en el nivel de lactosa más bajo probado, se probaron niveles de lactosa incluso más bajos. El trabajo de desarrollo adicional se enfocó en establecer el nivel mínimo de lactosa requerido para inducción, la sincronización óptima y duración de la inducción y el mérito de una fase de crecimiento inicial con glucosa antes de la inducción mediante lactosa. Esto último debe ser especialmente importante cuando se desean mayores densidades celulares en la fermentación controlada. Se realizó un intento de crecer células en glucosa hasta que las células fueron agotadas por glucosa, seguido de la inducción con lactosa. Se dejó que el crecimiento en glucosa alcanzara una densidad celular de aproximadamente 17 g G1, y posteriormente se inició una alimentación lenta de lactosa. Bajo estas condiciones, la producción de GLcN alcanzó 10 g I" 1. Se utilizó esta estrategia en los últimos experimentos para la producción de GLcN. Efecto de acetato: El acetato es un subproducto común en fermentación E. coli. Se forma incluso bajo condiciones aeróbicas cuando hay un exceso de glucosa, cuando los rangos de crecimiento exceden un nivel crítico, o cuando los rangos de glucólisis de oxidación de metabolitos formados están desequilibrados debido a la saturación de capacidad de respiración. La adición de acetato a los cultivos, mostró un efecto negativo significativo tanto en crecimiento como en acumulación de glucosamina. El acetato también mostró acumularse durante la producción de glucosamina. El nivel de oligoelementos afectó el nivel de formación de acetato (ver más adelante). Las estrategias para reducir la acumulación de acetato a través del desarrollo del proceso, incluyeron el crecimiento limitado a través de una lenta alimentación de glucosa, de modo que la glucosa no se saturó. Esta estrategia se empleó a lo largo del programa. Ciertas condiciones podrían dar como resultado niveles significativos de acetato, tal como oligoelementos superiores y límite de potasio. El pH bajo incrementó el efecto inhibidor del acetato. Efecto de temperatura: Tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,372,457, la temperatura preferida para el crecimiento y producción de glucosamina fue de 30°C. La temperatura de crecimiento más alta (37°C) condujo a rangos superiores de crecimiento, captación incrementada de glucosa y finalmente, a niveles inhibidores de acetato. La temperatura más alta también condujo a la formación de cuerpos de inclusión que contienen proteína GlmS recombinante insoluble/inactiva. Los estudios en frascos mostraron una disminución significativa en los niveles de acetato y un nivel GlcN comparable cuando la temperatura se cambió de 30°C a 25°C después de la inducción. Por consiguiente, se evaluó una baja temperatura (25°C) en los fermentadores para reducir la acumulación de acetato. Los resultados mostraron que a una temperatura más baja se reduce la acumulación de acetato, incluso bajo condiciones de acumulación de glucosamina. Efecto de oligoelementos: Con el objeto de crecer la biomasa a una densidad superior, se requieren ciertos oligoelementos, especialmente hierro, zinc y manganeso. Una titulación inicial de todo el paquete de oligoelementos, mostró que se limitó la producción de biomasa cuando los niveles de oligoelementos fueron demasiado bajos. Posteriormente se determinó que el hierro fue el factor de limitación de crecimiento principal, aunque si está en exceso puede conducir a tituladores GLcN más bajos y niveles de acetato más altos. El manganeso fue similar aunque tuvo efectos débiles en la densidad celular y en los niveles de GLcN en un cultivo en frascos. Los efectos del manganeso parecen ser aditivos a los efectos del hierro. El efecto negativo del manganeso se confirmó en los fermentadores (figura 8). Se descubrió que fue necesario un suministro adecuado de hierro, con el objeto de que las células fueran inducidas en forma adecuada mediante lactosa. Por consiguiente, se tuvo que establecer un rango de concentración crítico para equilibrar los requerimientos de crecimiento, requerimientos de inducción y los efectos en la producción de acetato y GLcN. El límite de hierro, manganeso y zinc para restringir el flujo de carbono procedente de la glucólisis, tuvo precedentes en la mejoría del proceso para una fermentación de ácido cítrico. Después de diversos experimentos, se estableció un esquema final: 3 mg 1 de sulfato de hierro en el medio y se agregó sulfato de hierro a la alimentación de glucosa en una proporción de 5 g de glucosa g"1. En un nivel inicial de 3 mg de sulfato de hierro en el medio, se requirió de la adición de hierro a la solución de alimentación de glucosa para mantener un bajo nivel de crecimiento de biomasa y una producción prolongada de GLcN. Efecto de la concentración de fosfato: El fósforo es un macronutriente necesario para las células, y se utiliza principalmente para la síntesis de ácido nucleico, fosfolípidos y coenzimas. También son necesarios los intermediarios metabólicos fosforilados para el metabolismo celular. Una alta concentración de fosfato en el medio M9A sirve también como una forma para regular el pH en el cultivo, el cual no se puede controlar fácilmente bajo condiciones en frascos. Sin embargo, el incremento de este medio en la escala de fermentación, significa que el fosfato podría tener un exceso más allá de los requerimientos normales de la biomasa. Los altos niveles de sal presentaron un problema para la recuperación del producto. Por consiguiente, fue deseable reducir el nivel de fosfato. Diversas pruebas con niveles de fosfato disminuidos mostraron un mejor crecimiento, aunque una producción de GLcN más deficiente. Por ejemplo, cuando se disminuyó el nivel de fosfato de potasio de 30 g I"1 a 6 g I"1, se mejoró el crecimiento en tanto que se redujo en gran parte la producción de GLcN (figura 9). Ejemplo 8 Este ejemplo describe los efectos del pH en el crecimiento de la cepa 7107-18 de producción de glucosamina inducible mediante lactosa. Tal como se muestra en el ejemplo 11, la glucosamina es inestable en el rango de pH regular utilizado para el crecimiento de E. coli. La glucosamina también originó efectos tóxicos en la cepa 7107-18. Se observó toxicidad incluso cuando la glucosamina en una concentración tan baja como de 20 g 1 se incubó previamente en el medio (pH 7) durante 3.5 horas antes de la inoculación celular. La toxicidad se atribuyó al menos parcialmente a los productos de degradación de GLcN en el medio con un pH de inicio de 7.0. El GLcN es más estable en un pH más bajo, la glucosamina no se degrada en un pH de 4.7 o más bajo. Sin embargo, se sabe que los niveles bajos de pH limitan el crecimiento celular. Por consiguiente, los experimentos se llevaron a cabo en donde 7107-18 creció en un pH de 7.0, 6.0, 5.5, 5.0 y 4.7. Los objetivos principales fueron, estudio de crecimiento celular en estos niveles de pH más bajos (con GLcN) y observar si la muerte celular observada previamente originada por la degradación de GLcN, podría reducirse con pHs más bajos. Se ajustaron los lotes del medio M9A con 40 g I"1 de glucosa y 20 g I'1 de GlcN a cinco diferentes pHs. Se inoculó inmediatamente un grupo de frascos con células 7107-18. Los frascos de réplica del mismo medio fueron incubados sin células durante 10 horas, antes de la inoculación. Se muestrearon siete veces durante 48 horas los frascos para medir el pH, ??ß?? y concentración de GlcN. En cada punto de muestras, se reajustó el pH del cultivo a los ajustes iniciales. Sin una incubación previa de glucosamina, el cultivo celular con un pH de 7.0 mostró un crecimiento incluso con 20 g G1 de glucosamina en el medio (figura 10). Con un pH de 7.0 y 4.7, el rango de crecimiento disminuyó conforme disminuyó el pH. Sin embargo, las células continuaron mostrando un crecimiento significativo en un pH de 4.7. En forma similar a las observaciones anteriores, las células no crecieron bien una vez que el medio se incubó previamente con glucosamina en un pH de 7.0. Se observó crecimiento celular después de la inoculación en un medio incubado previamente. El crecimiento fue muy deficiente en todos los niveles de pH probados. Esto pareció resultar de una combinación de efectos de pH más bajo y de la degradación de glucosamina en el cultivo celular. Con base en estos experimentos, se observó como factible crecer las células 7107-18 en niveles de pH inferiores a 7.0, con el objeto de minimizar la pérdida de producto y los efectos tóxicos originados por el rompimiento de glucosamina. Sin embargo, las condiciones de pH y cultivo óptimas deben ajustarse cuidadosamente. Los niveles de pH más bajos pueden estabilizar la glucosamina pero también afectar en forma negativa el metabolismo celular y el crecimiento de la célula. Un protocolo de producción GlcN en fermentadores corridos en niveles de pH relativamente bajos, podría ayudar ciertamente a conservar cualquier GlcN que se elaborara, protegiendo las células en el proceso reduciendo la concentración de productos de rompimiento. Estos beneficios deben ser equilibrados contra la actividad metabólica reducida de las células crecidas de esta forma. La síntesis de GlcN continua, requiere la generación constante de energía en las células, y el crecimiento lento de las células en estos niveles de pH más bajos, no parece tener la capacidad de generar suficiente de la energía requerida. Ejemplo 9 Este ejemplo describe la fermentación en un pH más bajo para estabilizar la glucosamina. El pH de crecimiento óptimo normal para E. coli, es casi neutral (pH 7.0) e inicialmente se utilizó un pH de 6.7 a 6.9 para las fermentaciones de GLcN. Sin embargo, se descubrió que GLcN está sujeto a degradación en la solución, especialmente en un pH de neutral a alcalino. El organismo es sensible a pH, y no crece bien conforme disminuye el pH. Por consiguiente, se llevaron a cabo pruebas para determinar los efectos del pH bajo en la síntesis de glucosamina y la acumulación después de una fase de crecimiento. También se probó el efecto de un nivel de oxígeno disuelto, ya que se considera oxidativa la degradación de glucosamina. Las células crecieron en un pH de 6.7 para alcanzar una alta densidad celular. Una vez que se indujo el cultivo, el pH se disminuyó de 6.7 a 5.5 y también se disminuyó el nivel de oxígeno disuelto a una saturación del 20% al 5%. En este ejemplo, la mejor acumulación de glucosamina fue en un pH bajo, y también pareció ser benéfico un nivel de oxígeno más bajo (figura 11). Al menos parte de la mejoría, se debió a la degradación más baja, conforme continuó la imposición de las variables de pH y oxígeno que mostraron una degradación más baja en un pH bajo en el cultivo después de la detención de la acumulación de glucosamina en una alimentación de glucosa baja aunque sostenida. Ejemplo 0 Este ejemplo describe un resumen de las condiciones utilizadas para el proceso de fermentación de glucosamina inducida mediante lactosa. El proceso de fermentación se desarrolló utilizando la cepa 7107-18 E. coli recombinante para la producción de glucosamina inducida mediante lactosa. El titulador del producto fue de aproximadamente 20 g I"1 de glucosamina en 72 horas. Para los expertos en la técnica, el proceso puede ser optimizado en forma adicional con base en las observaciones descritas en la presente invención. Los métodos desarrollados para otros procesos de fermentación, también puede aplicar al proceso de fermentación de glucosamina para aumentar el desempeño. Los factores y elementos principales del proceso descrito en la presente invención, se resumen a continuación.

Cepa: E. coli recombinante. Inducción: se agregaron 30 g/l (en la forma de una alimentación al 35% elevada lentamente durante un período de 10 horas), después de que se alcanzó una densidad celular de 10 g/l. Se suspendió la alimentación de glucosa durante este procedimiento para evitar la represión de glucosa. Una vez que se agregó la lactosa, se reinició la alimentación de glucosa.

Alimentación: se alimentó glucosa al 50% con 5 pg de FeS04-7H20 g de glucosa y 0.33 pg de MnSo4-H20/g de glucosa, en concentraciones limitantes.

Tiempo de fermentación: 72 horas. Modo de fermentación: la alimentación por lotes, con adición de glucosa al 50% según se requiera, mantuvo las concentraciones de limitación de glucosa. Inoculo: 5% por volumen. PH: 6.9 durante el crecimiento, posteriormente 6.7 después de la inducción, controlado mediante NH4OH 10 N. Temperatura: 30°C, cambiada a 25°C después de ia inducción. Oxígeno: O2 disuelto al 20% más, controlado mediante agitación. Aireación: 0.5 a 1 wm.

M ed io : Se agregaron todos los componentes antes de la esterilización excepto la glucosa (agregada en incrementos) y los oligoelementos Fe, Zn, Mn, Cu, B, Mo, Co (agregados después de la esterilización). Ejemplo 11 Este ejemplo describe la estabilidad de glucosamina y N-acetilglucosamina y sus efectos en E. coli. Estabilidad de glucosamina: Se probó la estabilidad de glucosamina en un medio M9A libre de células (14 g I"1 K2HP04, 16 g 1 KH2P04, 1 g G1 Na3citrato.2H20, 5 g 1 (NH4)2S04, 10 mM MgS04, 1 mM CaCI2, pH 7.0) suplementado con 40 g I"1 de glucosa. Se preparó la glucosamina en la forma de una solución concentrada de glucosamina al 30%-HCI y se agregó en concentraciones finales de 0, 4, 13, 26 y 42 g I"1 (50 mi totales en un frasco de 250 mi). Se ajustó el pH del medio a pH 6.9. Los frascos se colocaron en un agitador y se agitaron aproximadamente 225 rpm. Los niveles de glucosamina y pH fueron monitoreados a una temperatura de 30°C durante aproximadamente 24 horas. Se descubrió que la glucosamina fue inestable y su degradación dependió de la concentración, siendo mayores los rangos de degradación en concentraciones de glucosamina más altas. Se degradó más de la mitad de la glucosamina en menos de un día en un medio con 42 g I"1 de glucosa. La degradación fue de únicamente 25% cuando la concentración de glucosamina de partida fue de 4 g I"1. La degradación de glucosamina estuvo acompañada por una disminución de pH en el medio. En la muestra de 42 g I"1 de glucosamina, se disminuyó el pH del medio en 0.7 unidades ( de 6.9 a 6.2) después de un período de 24 horas, tal como se comparó con un cambio de pH de únicamente aproximadamente 0.15 unidades en un medio sin glucosamina. El rompimiento de glucosamina (60 g I"1) en cuatro niveles de pH de partida se monitoreó a una temperatura de 30°C en un medio de 9A-glucosa libre de células (40 g G1) durante 52 horas. En cada tiempo de muestreo, se reajustaron las soluciones a su pH original. Cada condición se corrió por triplicado. Tal como se muestra en la figura 12, la degradación dependió en gran medida del pH, ocurriendo con mayor rapidez en un pH mayor. La pérdida de glucosamina fue de 68% en un pH de 7.0, comparado con 18% en un pH de 5.5. La extrapolación de los rangos de degradación versus pH sugiere que no puede ocurrir un rompimiento con un pH debajo de aproximadamente 4.7. Conforme se degrada la glucosamina, la solución desarrolla un color amarillo ámbar. El grado de formación de color puede estimarse mediante absorción a 360-400 nm. Excepto para un período de muestreo temprano durante el cual fueron más rápidos los rangos de degradación, existió una fuerte correlación entre la cantidad de glucosamina degradada y la densidad del color ámbar en el medio. En los dos niveles de pH más bajos, existió un notorio lag entre la desaparición de la glucosamina y la aparición del color, lo que indica que el compuesto con color no es el producto de glucosamina de degradación directa. Una vez que los rangos de degradación se bajaron en todos los niveles de pH probados, fue constante la proporción de glucosamina degradada al color amarillo. Muy poco se sabe con respecto a los casos moleculares implicados en la degradación de glucosamina y la formación de color-. Existen reportes con respecto a la degradación térmica de glucosamina en agua y bajo condiciones secas (Shu, 1998, Journal of Agricultural and Food Chemistry, volumen 46, páginas 1129-1131; Chen y Ho, 1998, Journal of Agricultural and Food Chemistry, volumen 46, páginas 1971-1974, ambas incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia). Sin embargo, no se sabe si los mismos tipos de casos químicos tuvieron lugar bajo condiciones leves utilizadas en los estudios de la presente invención. Aunque los operadores han observado la formación de productos color café procedentes de la glucosamina y las actividades antioxidantes estudiadas de los productos color café (Oyaizu y Mankoto, 1988, Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, volumen 35, páginas 771-775, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia), los productos color café no fueron identificados en forma química en sus estudios. Considerando la estructura molecular de la glucosamina, tanto los grupos de aldehido como de amino podrían estar implicados en la degradación y/o polimerización. El desarrollo de color indica la formación de bandas dobles conjugadas y estructuras complejas. Para probar la implicación del grupo de aldehido, se monitoreó la degradación en un medio M9A que contiene 30 g 1 de glucosamina con y sin 40 g G1 de glucosa. Si se implicó el grupo de aldehido, la presencia de glucosa podría afectar el rango de degradación/polimerización de glucosamina. No se observó una diferencia significativa en el rompimiento de glucosamina. Esta observación sugiere un papel importante del grupo amino en la degradación de glucosamina. Efectos de glucosamina en 7107-18 E. coli: La glucosa es vital para el crecimiento de E. coli ya que es un precursor para la síntesis de componentes importantes de la pared celular. E. coli también tiene la capacidad de utilizar glucosamina y N-acetilglucosamina como la única fuente de carbono. El catabolismo de los aminoazúcares requiere una deaminasa de glucosamina funcional codificada por el gen nagB, el cual se eliminó en la cepa 7107-18. Tal como se espera, 7107-18 podría no crecer en placas que contienen glucosamina como la única fuente de carbono. Se llevaron a cabo experimentos para investigar si la glucosamina afecta el crecimiento celular de 7107-18 E. coli y la supervivencia en un medio que contiene 40 g G1 de glucosa. El crecimiento de cultivos inoculados en forma reciente fue inhibido ligeramente por 10 y 20 g de glucosamina por litro. La glucosamina en 40 g por litro evitó el crecimiento celular y comenzó a exterminar las células después de 16 horas de incubación, tal como se muestra mediante el plaqueo celular. Después de 52 horas, el conteo viable se niveló a aproximadamente un quinto del número original. Se llevaron a cabo más experimentos para investigar el efecto tóxico de glucosamina en 7107-18 E. coli. Las células se inocularon inmediatamente en un medio de M9A-glucosa (40 g G1) que contiene 35 g 1. La glucosamina creció razonablemente bien, aunque las células murieron rápidamente cuando se inocularon en un medio idéntico el cual fue incubado previamente durante un período tan corto como de 3.5 horas. Esto muestra que la exterminación se debe en gran parte a los productos de degradación de glucosamina formados en el medio antes de la inoculación. No se sabe por qué las células pueden sobrevivir y crecer si se inoculan inmediatamente después de que se elabora el medio. Una explicación podría ser que la glucosamina se degrada en secuencias a los productos A, B, C y D. Las células podrían tener la capacidad de tolerar o asimilar productos más tempranos en niveles relativamente bajos, en tanto que los productos posteriores y/o niveles más altos de los productos tempranos podrían ser más tóxicos. Esta hipótesis es consistente con la observación de que las concentraciones más altas de glucosamina y los tiempos más largos de incubación previa dan como resultado niveles más bajos de conteos viables. Con 35 g 1 de glucosamina, los conteos viables se nivelaron a 105 veces menos que los niveles de inoculación. Las células murieron en el medio con 50 g 1 de glucosamina, incluso sin una incubación previa del medio. Estabilidad de N-acetilqlucosamina: Parece que el grupo amino juega un papel importante en la degradación, tal como lo sugieren los efectos del pH. Si esto es real, la N-acetilglucosamina debe ser mucho más estable. Además, los efectos del pH pueden no ser tan dramáticos como lo son con la glucosamina. Se probó la estabilidad de N-acetilglucosamina en un experimento similar a los estudios de degradación de glucosamina. La estabilidad de 80 y 40 g G1 de N-acetilglucosamina en un pH de 5.5 y 7.0, fue monitoreada en el medio 9A sin glucosa durante un período de 2 días. No ocurrió una degradación significativa (figura 13). Esto en contraste con la degradación observada con glucosamina. Cuando se rompe la glucosamina, se desarrolla un color ámbar en el medio. No se observó dicha formación de color en el medio M9A que contiene N-acetilglucosamina durante un período de 48 horas. Además, no existió una disminución significativa en el pH durante la incubación. Los resultados confirman que el grupo libre de amino es el grupo funcional clave implicado en el rompimiento y/o polimerización de glucosamina. Efectos de N-acetilqlucosamina en 7107-18 E. coli: Las células fueron inoculadas en un medio M9A-glucosa (40 g/L) que contiene 62 g/L de N-acetilglucosamina. No se observó una inhibición de crecimiento significativa, incluso cuando el medio fue incubado previamente durante más de 8 horas. En resumen, la N-acetilglucosamina no tiene efectos significativos en la cepa 7107-18 E. coli, y es mucho más estable que la glucosamina. Por consiguiente, existe una ventaja potencial para producir N-acetilglucosamina en lugar de glucosamina. Se sabe que la glucosamina se transporta en las células y fosforila a través del transportador de mañosa, cuyas subunidades son codificadas por los genes manXYZ y a través del transportador de glucosa codificado por el gen ptsG. Aunque se eliminaron los genes manXYZ en la cepa 7107-18, la captación de glucosamina aún puede tener lugar mediante el transportador de glucosa. Con concentraciones más altas en el medio, se podrían obtener cantidades significativas de glucosamina en las células. Debido a la eliminación de los genes que codifican el transportador de mañosa (manXYZ) y el transportador de N-acetilglucosamina (nagE) en 7107-18, N-acetilglucosamina podría acumularse en niveles mayores dentro del medio sin ser transportado nuevamente a la célula. Esto representa otra posible ventaja para producir N-acetilglucosamina con respecto a glucosamina. Ejemplo 12 Este ejemplo describe un método HPLC para la determinación de glucosamina. Es deseable desarrollar un método HPLC simple para cuantificar en forma cromatográfica la glucosamina. Las características del método deseado deben incluir una preparación mínima de la muestra y una determinación razonablemente precisa de la glucosamina. El método aquí presentado se basa en lo descrito por Way y Asociados (J. Liq. Chromatography & Related Technol. 23:2861, 2000). La modificación de la fase sólida en el procedimiento de Way y asociados, permitió la resolución del pico de glucosamina de otros picos observados en las muestras de cultivo celular en el frasco de agitación.

Descripción del método: La inyección del medio de crecimiento estéril M9A, dio como resultado dos picos importantes en un cromatograma. Además, se analizó adicionalmente el cromatograma el cual permaneció esencialmente sin cambio si el medio M9A carece de glucosa, sales de calcio y magnesio. La inyección de glucosamina en el medio M9A dio como resultado un solo pico distinto adicional. Bajo estas condiciones la glucosamina se eluyó en aproximadamente 13 minutos con un pico negativo muy grande inmediatamente después. Además, no tuvo éxito incrementar la resolución variando el pH, resistencia iónica, concentración de metanol (MeOH) o concentración de octanosulfonato. Esta deflexión negativa siempre siguió el pico de glucosamina. La forma normal de remover dicha deflexión negativa, es diluir la muestra en una fase móvil. Sin embargo, incluso diluyendo las muestras 20 veces no se diluyó completamente la deflexión negativa, y dicha dilución alta no es práctica para muestras que proceden de frascos de agitación o fermentadores. Se descubrió que la integración utilizando la altura del pico en lugar del área del pico, permitió una cuantificación muy precisa de la glucosamina en el rango de aproximadamente 500 a 10,000 partes por millón (ppm). Para determinar el rango, fue necesario preparar los estándares en el medio M9A en lugar de en agua o la fase móvil. Por lo tanto, las muestras se prepararon en el medio de crecimiento M9A y se elaboraron cualesquiera diluciones utilizando también el medio M9A. Para cada muestra el tiempo de corrida fue de 20 minutos. Validación del método: Primero, se prepararon varios estándares de glucosamina en el medio M9A. Las inyecciones repetidas produjeron resultados muy precisos (+/- 5%). Segundo, se analizaron las muestras del frasco de agitación tanto mediante ensayo colorimétrico como HPLC. Los valores se obtuvieron generalmente en el 10% del ensayo de colorimetría. No debe esperarse necesariamente una coincidencia cercana entre HPLC y el método colorimétrico, debido a la desviación estándar inherente con el ensayo colorimétrico. Por ejemplo, se ensayaron dos muestras (ambas 10,000 ppm) mediante el método colorimétrico que produjeron valores de 8.9 y 9.3 g G1. Tercero, las muestras del frasco de agitación se hicieron en puntasd con cantidades conocidas de glucosamina y fueron ensayadas. La muestra del frasco de agitación no diluida produjo un valor de 1,479 ppm. Después de la dilución con un volumen igual de 5,000 ppm de glucosamina estándar, la muestra del frasco diluida produjo un valor de 3,440 (esperado 3,240). Parte de la discrepancia del valor esperado tiene la mayor contribución por parte de 9A. De hecho, el medio M9A solo producirá un "valor" de glucosamina falso de alrededor de 100 PPM. Las muestras del cultivo en el frasco de agitación, fueron ensayadas tanto a través del método HPLC como los métodos colorimétricos. Los resultados se muestran en la tabla 11. Se obtuvieron los sobrenadantes de cultivo mediante centrifugación y filtración para eliminar las partículas, y se almacenaron a una temperatura de -20°C hasta el análisis. El HPLC fue calibrado utilizando una solución estándar de 2,500 ppm en un solo punto, preparada en un medio M9A. Después de descongelarse, las muestras se analizaron inmediatamente a través de HPLC. Después de permanecer durante la noche en el automuestreador, las muestras fueron analizadas nuevamente. El acuerdo fue muy bueno entre los dos métodos. Las muestras almacenadas a una temperatura de -20°C durante varias semanas, no mostraron disminución en la concentración de glucosamina. Al mantener las muestras filtradas a temperatura ambiente durante la noche, no se obtuvo como resultado disminución alguna en la concentración de glucosamina. Tabla 11. Comparación del método HPLC y método colorimétrico con respecto a cuantificación de glucosamina*.

* Las muestras del cultivo fueron centrifugadas y filtradas para eliminar las partículas, y almacenadas a una temperatura de -20°C hasta los ensayos. Se corrió el análisis HPLC con las muestras descongeladas (0 horas) y se repitió después de que las muestras se dejaron durante la noche en el automuestreador a temperatura ambiente (24 horas). Se mostraron las concentraciones de glucosamina en PPM. Ejemplo 13 Este ejemplo describe la sobreexpresión de los genes de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato 1 (GNA1) para la producción de N-acetilglucosamina. El ejemplo que se encuentra a continuación describe la clonación y sobreexpresión de diferentes genes de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato 1 (GNA1) en E. coli recombinante para la síntesis incrementada de N-acetilglucosamina. La factibilidad de la estrategia fue demostrada con los vectores de expresión a base de pET que contienen los genes GNA1 procedentes de Saccharomyces cerevisiae de levadura (ScGNAl), Candida albicans de levadura (CaGNAl) y Arabidopsis thaliana de planta superior (AtGNAl). Se llevó a cabo la clonación y expresión de GNA1 clonando la secuencia de codificación del gen GNA1 detrás de un promotor T7lac en un vector pET y transformando los plásmidos pET recombinantes en 71.07-18 de la cepa E. coli de producción de glucosamina inducible por lactosa. La expresión funcional del gen se determinó mediante SDS-PAGE y ensayo de actividad enzimática. Se monitoreó la síntesis de N-acetilglucosamina en los experimentos con frasco de agitación. Clonación del gen GNA1 S. cerevisiae para la sobreexpresión en E. coli: Para clonar y expresar el gen GNA1 S. cerevisiae (ScGNAl), se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada del gen GNA1 (Murakami y Asociados, 1995, Nat. Genet. 10, páginas, 261-268, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia). Los cebadores se utilizaron para amplificar la secuencia que codifica GNA1 procedente del ADN genómico aislado de la cepa S288C S. cerevisiae utilizando reacción de cadena de polimerasa (PCR). Los cebadores utilizados para la amplificación fueron el cebador de avance 07-83 y el cebador inverso 07-84 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-83: 5'-GATCGGTCTCGCATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGGC -3' (SEQ ID NO:35); 07-84: 5'-GATCCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC-3' (SEQ ID NO:36). El cebador 07-83 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:35), seguido de 31 nucleótidos de la secuencia de codificación de GNA1 comenzando desde su codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 13 a 43 de la SEQ ID NO:36). El cebador 07-84 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Xho I (CTCGAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:36) seguido de 30 nucleótidos de la secuencia que codifica GNA1 comenzando en su codón de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 40 de la SEQ ID NO:36). La amplificación PCR se llevó a cabo utilizando un protocolo estándar para generar un fragmento de ADN que contiene toda la secuencia de codificación ScGNAl flanqueada por los sitios Bsa I y Xho I. El producto PCR que contiene la secuencia GNA1, fue clonado en el vector pCR-Script-Amp SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA), generando el plásmido pSW07-60. Se aisló el fragmento ScGNAl del plásmido PSW07-60 a través de la digestión Bsa I y Xho I y se clonaron en los sitios Neo I y Xho I del vector de expresión pET24d( + ) (Novagen, Inc., Madison, Wl), creando el plásmido SW07-60. La clonación en esta forma pone la secuencia ScGNAl detrás del promotor lac-T7 de pET24(+), generando una cinta de expresión T7-lac-ScGNAl. Clonación del gen GNA1 C. albicans para la sobreexpresión en E. coli: Para clonar y expresar GNA1 C. albicans {CaGNAl), se sintetizaron los cebadores con base en la secuencia publicada del GNA1 (Mió y Asociados, 1999, J. Biol. Chem. 274, páginas 424-429, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia). Se utilizaron los cebadores 07-92 y 07-93 para amplificar la secuencia de codificación de GNA1 procedente del ADN genómico ATCC10261 Candida albicans utilizando PCR. El cebador de avance 07-92 y el cebador inverso 07-93 tuvieron las siguientes secuencias: 07-92: 5'- GATCGGTCTCGCATGATGTTACCACAAGGTTATAC-3' (SEQ ID NO:37) y 07-93: 5'-GATCCTCGAGCTAGAATCTACATACCATTTCAAC-3' (SEQ ID NO:38). Los cebadores 07-92 contienen un sitio de endonucleasa de restricción Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:37) seguido de 23 nucleótidos de la secuencia que codifica GNA1 comenzando desde su codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 13 a 35 de la SEQ ID NO:37). El cebador 07-93 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Xho I (CTCGAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:38) seguido de 24 nucleótidos de la secuencia que codifica GNA1 comenzando en su codón de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 34 de la SEQ ID NO:38). Se llevó a cabo la amplificación PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento de ADN que contiene toda la secuencia de codificación CaGNAl flanqueada por los sitios Bsa I y Xho I. El producto PCR que contiene la secuencia CaGNAl fue ligado en el sitio Srñ del vector pCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA), generando el plásmido pKLN07-33. El fragmento CaGNAl fue aislado del plásmido pKLN07-33 con enzimas de restricción Bsa I y Xho I y fueron clonados en los sitios Neo I y Xho I del vector de expresión pET24d(+) (Novagen, Inc., Madison, Wl), creando plásmidos pKLN07-34 y pKLN07-35. La clonación de esta forma coloca la secuencia CaGNAl detrás del promotor T7lac de pET24(+), generando una cinta de expresión de 77lac-CaGNA1. Clonación del gen GNA1 Arabidopsis para la sobreexpresión en E. coli: Para clonar y expresar GNA1 Arabidopsis thaliana (AtGNAl), se sintetizaron los cebadores 07-94 y 07-95 con base en la secuencia publicada del GNA1 (Genebank AL391144). Los cebadores se utilizaron para amplificar la secuencia de codificación de GNA1 procedente del clon BAC F14F8 (Arabidopsis Biological Resource Center DNA Stock Center, Columbus, OH) utilizando PCR. El cebador de avance 07-94 y el cebador inverso 07-95 tuvieron las siguientes secuencias: 07-94: 5'- GATGGTCTCGCATGGCTGAGACATTCAAGATC-3' (SEQ ID NO:39), y 07-95: 5'- GATCCTCGAGTTAATCGAAGTACTTAGACATTTGAATC-3' (SEQ ID NO:40). El cebador 07-94 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 4 a 9 de la SEQ ID NO:39), seguido de 21 nucleótidos de la secuencia de codificación de GNA1 comenzando a partir de su codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 12 a 32 de la SEQ ID NO:39). El cebador 07-95 contiene un sitio Xho I (CTCGAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:40), seguido de 24 nucleótidos de la secuencia de codificación GNA1 que inicia en su codón de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 38 de la SEQ ID NO:40). Se llevó a cabo la amplificación PCR utilizando un protocolo estándar para generar un fragmento de ADN que contiene toda la secuencia de codificación GNA1 flanqueada por los sitios Bsa I y Xho I. Se digirió el fragmento PCR con Bsa I y Xho I de endonucleasas de restricción y se clonaron en los sitios Neo I y Xho I del vector de expresión pET24(+) (Novagen, Inc., Madison, Wl) creando el plásmido pSW07-70. La clonación de esta forma coloca la secuencia AtGNAl detrás del promotor T7/ac de pET24(+), generando una cinta de expresión de J7lac-AtGNA1. Expresión funcional de diferentes genes GNA1 recom binantes y producción de N-acetilglucosamina en E. coli: Los plásmidos recombinantes pSW07-62 (que contiene el gen GNA1 S. cerevlsiae), pKLN07-34 (que contiene el gen GNA1 C. albicans), y pSW07-70 (que contiene el gen GNA1 A. thaliana), se transformaron en la cepa 7107-18 E. coli, generando las cepas 7107-87, 7107-117 y 7107-93, respectivamente. La cepa de control 7107-88 se preparó transformando el vector vacío en el mismo huésped. Después de un protocolo estándar, los cultivos celulares de los transformadores se crecieron en un medio LB y se indujeron con IPTG 1 mM. Las muestras se tomaron de los cultivos inducidos para el análisis SDS-PAGE para confirmar la sobreexpresión de la proteína GNA1. Los tamaños de proteína anticipados de AtGNA 1 , CaGNA 1 y ScGNAl, son 17 kDa, 16.9 kDa, y 18.1 kDa, respectivamente. Las proteínas sobreexpresadas de los tamaños anticipados, se observaron en muestras excedentes de cultivos inducidos que expresan los diversos genes GNA1. En todos los casos, la proteína sobreexpresada pareció ser muy soluble. Tal como se esperó, no se observó una proteína sobreexpresada cercana al tamaño anticipado del gen GNA1, en la cepa de control 7107-88. Se llevó a cabo la clasificación de diferentes cepas E. coli para confirmar la expresión funcional de los genes GNA1 recombinantes. Las cepas que hospedan los vectores de expresión GNA1 de S. cerevisiae, C. albicans, y A. thaliana fueron crecidos en un medio de producción M9B [6 g I"1 KH2P04, 24 g i"1 2HPO4, 1 g I"1 Na3citrato-2H20, 10 g G1 (NH4)2S04 (fosfato ajustado a pH 7.4) además de oligometales (0.2 mg G1 FeS04-7H20, 0.015 mg G1 ZnS0 -7H20, 0.015 mg I"1 nS04-H20, 0.001 mg I"1 CuS04-5H20, 0.001 mg 1 NaMo04-2H20, 0.001 mg I"1 H3BO3, y 0.001 mg 1 CoCI2-6H20) suplementado con 40 g 1 de glucosa, 10 g I"1 de ribosa, 5 g 1 de extracto de levadura, 0.6 g G1 MgS04-7H20, 0.05 g I"1 CaCI2-2H20, 25 mg I"1 de kanamicina, y 0.2 Mm de IPTG]. A las 24 horas, se agregó la glucosa a 30 g I"1 por día en total, con base en los resultados HPLC, y se agregó 5 g G1 (NH4)2S04 a los frascos, en donde los niveles habían disminuido debajo de 1 g 1. Se elaboraron frascos por duplicado de cada cepa, de modo que un frasco podría ser cosechado a las 24 horas y el otro a las 48 horas para el análisis enzimático y determinación de niveles de N-acetilglucosamina y acetato. Se ensayó la actividad de sintasa de glucosamina (GlmS), y todas las cepas exhibieron buenos niveles de actividad. Las muestras también se ensayaron con respecto a la actividad enzimática de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-? (GNA1) después del método descrito por Mió y Asociados (Journal of Biological Chemistry, 1999, 274, páginas 424-429 (tabla 12). Tal como se esperó, la cepa de control no mostró un nivel significativo de actividad GNA1. La expresión de la levadura y los genes GNA1 de plantas superiores condujeron a una mayor actividad de acetiltransferasa. Estos transformadores GNA1 también sintetizaron N-acetilglucosamina en niveles muy altos (tablas 12 y 13). Fueron comparadas las actividades de acetiltransferasa en cepas que expresan genes GNA1 procedentes de S. cerevisiae (7107-87) y C. albicans (7107- 117). Sin embargo, la producción de N-acetilglucosamina fue cuatro veces más alta en cepas que expresan el gen S. cerevisiae. Aunque la actividad enzimática GNA1 en cepas con el gen A. thaliana fue más baja que las cepas con el gen C. albicans, la producción de N-acetilglucosamina fue mayor en el primero que en el último. Claramente, no existe una simple correlación entre los niveles de actividad GNA1 y la producción de N-acetilglucosamina; las enzimas GNA1 procedentes de diversas fuentes pueden tener diferencias en las características enzimáticas. Los datos demuestran la utilidad de diferentes genes GNA1 en ingeniería metabólica para producir N-acetilglucosamina. Entre los tres genes GNA1 probados, el gen GNA1 S. cerevisiae sobresalió de los otros, en términos de producción de N-acetilglucosamina. Por consiguiente, se seleccionó el gen GNA1 S. cerevisiae para la investigación posterior que se describe en la presente invención.

Tabla 12. Actividades de sintasa de glucosamina y acetiltransferasa en cepas que expresan tres diferentes genes GNA1. 1) La actividad enzimática se expresa en pmol de proteína min"1 mg'1. 2) Se determinaron niveles de N-acetilglucosamina y muestras tomadas en un punto de tiempo de 23 horas. 3) Los números en los paréntesis indican diferentes hermanos. La cepa 7107-18 produce altos niveles de glucosamina que pueden ser detectados mediante HPLC. Sin embargo, poca o ninguna de la glucosamina libre (debajo de 0.5 g 1) puede ser detectada en cepas que sobreexpresaron el gen de acetiltransferasa. Esto indica claramente que no existe una acumulación significativa de la glucosamina-6-? intermedia en los transformadores GNA1, lo que confirma que la enzima GNA1 fue la principal fuerza de conducción para un alto nivel de producción de N-acetilglucosamina. La acumulación de acetato es un obstáculo reconocido para lograr altos niveles de proteína recombinante y otros productos de fermentación en E. coli. Con glucosa en exceso en el medio, las células E. coli tienden a sintetizar altos niveles de acetato y otros ácidos orgánicos, resultando normalmente en una inhibición del crecimiento. La producción de acetato ha sido un problema en las cepas E. coli de producción de glucosamina. Sin embargo, las cepas de producción de N-acetilglucosamina acumularon poco o ningún acetato en un punto de tiempo de 23 horas bajo condiciones en las cuales la cepa de control acumuló niveles multi-gram de acetato. La síntesis de N-acetilglucosamina consume acetil-CoA, el precursor de la formación de acetato. Aunque el uso de acetil-CoA será una carga metabólica impuesta en la célula, la redirección de la producción de acetil-CoA a N-acetilglucosamina representa aparentemente un beneficio significativo que evita la acumulación de acetato. Es importante observar que las cepas que producen N-acetilglucosamina mostraron densidades celulares mayores que las cepas de control (tabla 13).

Tabla 13. Crecimiento celular y producción de N-acetilglucosamina en cepas E. col¡ transformadas con diferentes construcciones de expresión GNA1.

Análisis de secuencia de diferentes enzimas GNA1 Se observaron diferencias significativas en términos de actividad específica y producción NAG en cepas E. coli que sobreexpresan los diversos genes GNA1. Sin embargo, ya que todas las enzimas catalizan la misma reacción, podría esperarse una homología entre los diversos GNA en niveles de nucleótido y proteína. La SEQ ID NO:29 contiene la secuencia de codificación del gen GNA1 S. cerevisiae. La SEQ ID NO:29 codifica la secuencia de aminoácidos GNA1 S. cerevisiae representada mediante la SEQ ID NO:30. La SEQ ID NO:33 contiene la secuencia de codificación del gen GNA1 A. thaliana. La SEQ ID NO:33 codifica la secuencia de aminoácidos GNA1 A. thaliana representada aquí por ia SEQ ID NO:34. La SEQ ID NO:31 contiene la secuencia de codificación del gen GNA1 C. albicans. La SEQ ID NO:31 codifica la secuencia de aminoácidos GNA1 C. albicans representada aquí por la SEQ ID NO:32. Cuando se alinean a través del método de alineación de ADN J. Hein (referencia ADNStar), las secuencias de nucleótidos exhibieron una homología significativa. Las secuencias que codifican ScGNAl y At-GNA1 compartieron el 49.7% de identidad, en tanto que las secuencias que codifican ScGNAl y CaGNAl compartieron el 53.1% de identidad. La secuencias que codifican CaGNAl y AtGNAl compartieron el 47.2% de identidad. La traducción de las secuencias de codificación en secuencias de aminoácidos, revelaron una homología significativa entre las diversas proteínas GNA1 cuando se alinearon a través del método de Alineación de Proteína Lipman-Pearson (DNAStar, Inc., Madison, Wl). Tal como se observa en la tabla 14, la secuencia ScGNAl (SEQ ID NO:30) comparte el 44% de identidad con la secuencia CaGNAl (SEQ ID NO:32) y el 38.9% de identidad con la secuencia AtGNAl (SEQ ID NO:34). Algunas regiones parecieron conservarse de mejor forma; por ejemplo, los aminoácidos GHIED se conservaron en todas las secuencias (alineación con los aminoácidos 96-100 de la secuencia ScGNAl (SEQ ID NO:30)). Asimismo, se conservó en gran parte una región de 20 residuos que corresponde a los residuos 129 a 148 ScGNAl de la SEQ ID NO:30. Esta región tuvo un 75% de identidad con la región correspondiente en la secuencia CaGNAl y el 70% de identidad con la región correspondiente en la secuencia AtGNAI. Tabla 14. Tamaño de péptido y homología de ScGNAl, AtGNAI y CaGNAl.

*La homología en el nivel de nucleótidos se muestra en los paréntesis. Ejemplo 14 Este ejemplo describe la construcción de cepas que producen N-acetil-glucosamina a través de la sobreexpresión del gen nagB E. col¡ y GNA1 S. cerevisiae. El gen nagB, parte del reguión nag, que codifica la deaminasa de glucosamina-6-fosfato (NagB), se implica en la trayectoria del catabolismo de N-acetil-glucosamina (GIcNAc) del reguión nag. El reguión nag consiste del operón nagBACD y nagE transcrito en forma divergente (Plumbridge, JA., 1991, Mol. Microbiol. 8:2053-2062). El GIcNAc exógeno se fosforila conforme se transporta dentro de la célula, formando GIcNAc-6-P. El producto del gen nagA, que codifica la desacetilasa de N-acetil-glucosamina-6-fosfato, convierte GlcNAc-6-? a GlcN-6-?. Posteriormente NagB cataliza la conversión de GlcN-6-? a fructosa-6-fosfato (F-6-P). El producto del gen glmS en E. coli, cataliza la síntesis de GlcN-6-?, un intermediario esencial en la trayectoria para la formación de lipopolisacáridos y peptidoglicanos. Por consiguiente, los mutantes con un glmS defectuoso dependen de GlcN ó GIcNAc. Sin embargo, NagB ha mostrado catalizar la reacción llevada a cabo normalmente por GlmS, convirtiendo F-6-P a GlcN-6-?. De hecho, la transformación de los mutantes glmS con un plásmido de copia superior que expresa la deaminasa de glucosamina-6-fosfato (nagB) ha mostrado suprimir la mutación de glmS (J. Bac. 1989 Dec; 171(12):6589-6592). Ya que NagB puede catalizar la conversión de F-6-P a GlcN-6-?, es posible que la sobreexpresión de nagB en lugar de glmS*54 en nuestras cepas de producción, pueda dar como resultado la acumulación de glucosamina. Si la cinta T7 lac-ScGNA1 también estuvo presente en la cepa, GlcN-6-? podría convertirse a GlcNAc-6-? y acumularse como NAG en el medio. Para probar la eficiencia de la producción de glucosamina o N-acetil-glucosamina mediante la sobreexpresión del gen nagB, se adaptaron los métodos y protocolos descritos para la clonación e integración de GNA1 para clonar e integrar una cinta de expresión T7 lac-nagB en el sitio pfkB en el cromosoma de 7107-17 de E. coli (DE3). El gen glmS endógeno también necesitará desactivarse en esta cepa. La secuencia glmS se localiza en la corriente descendente de la secuencia glmU sin una secuencia promotora obvia en la corriente ascendente de glmS. Parece que glmU y glmS forman un glmUS operón. La secuencia glmS y algunas secuencias flanqueadoras se amplificaron mediante PCR a partir de ADN genómico de E. coli, clonado en un vector de plásmido. Se utilizó digestión mediante restricción adecuada para eliminar un fragmento interno de la secuencia glmS. La secuencia glmS con eliminación interna se ligó al origen de réplica sensible a la temperatura y al marcador de selección de kanamicina para crear un vector de integración. Se utilizó el protocolo de selección de temperatura para seleccionar los mutantes con la eliminación glmS. Ya que la glucosamina es vital para la síntesis de la pared celular, la glucosamina necesita suministrarse en el medio de cultivo para el crecimiento de los mutantes. Clonación del gen nactB para la sobreexpresión en E. coli. Al utilizar información con base en la secuencia publicada del gen nagB E. coli (Peri y Asociados, 1990, Biochem. Cell Biol. 68, páginas 123-137, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia), se diseñaron cebadores para amplificar la secuencia de codificación nagB. La secuencia de codificación nagB se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico de E. coli W3110 utilizando el cebador de avance 07-141 y el cebador inverso 07-142, el cual tuvo las siguientes secuencias: 07-141 5'-GATGGTCTCGCATGAGACTGATCCCCCTGAC-3' (SEQ ID NO:43) y 07-142 5'- GATCCTCGAGTTACAGACCTTTGATATTTTCTGCTTCTAATTC-3' (SEQ ID NO:44). El cebador 07-141 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 4 a 9 de la SEQ ID NO:43) seguido de 20 nucleótidos de la secuencia de codificación nagB que comienza a partir de su codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 12 a 31 de la SEQ ID NO:43). El cebador 07-142 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Xho I (CTCGAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:44) seguido de 33 nucleótidos de la secuencia de codificación nagB a partir de su codón de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 43 de la SEQ ID NO:44). La secuencia de codificación nagB E. coli y la secuencia de aminoácidos NagB se representan a través de ia SEQ ID NO:41 y SEQ ID NO:42, respectivamente. El fragmento PCR que contiene la secuencia de codificación nagB, se digirió con los sitios Bsa I y Xho 1 de endonucleasas de restricción y se ligó en los sitios Neo I y Xho I del plásmido pET24d( + ) (Novagen, Inc., Madison, Wl), generando el plásmido pSW07-93. La clonación en esta forma coloca la secuencia nagB detrás del promotor T7-lac de pET24d(+), generando una cinta de expresión de T7-lac-nagB . Sobreexpresión del gen nagB Los plásmidos pSW07-93#3, #8, y #16 se transformaron en la cepa 7101 -17(DE3), generando las cepas 7107-636, 7107-637 y 7107-638, respectivamente. El plásmido pET24d(+) también se transformó en la cepa 7101-17(DE3) para generar la cepa de control negativo 7107-639. Se llevó a cabo un experimento de inducción estándar en el cual los cultivos celulares de los transformadores se crecieron en un medio LB y se indujeron con IPTG 1 mM. Se tomaron muestras de los cultivos inducidos en diversos puntos de tiempo para SDS-PAGE para confirmar la sobreexpresión de proteína NagB. El tamaño anticipado de la proteína NagB sobreproducida es 29.8 kDa. Se sobreprodujo una proteína que corresponde al tamaño esperado de NagB, en la cepa 7107-636 y 7107-637. No se apreció una proteína sobreproducida en este tamaño en la cepa de control 7107-639. Las muestras de proteína después de 2 horas después de inducción, indicaron que la mayor parte de la proteína NagB sobreproducida estuvo en la fracción soluble. Sin embargo, a 4 horas después de la inducción, únicamente aproximadamente el 25% de la proteína apareció en la fracción soluble. Integración de la cinta T7 lac-nagB en el locus pfkB en el cromosoma Habiendo confirmado la sobreproducción exitosa de NagB, el siguiente paso fue integrar la cinta de expresión T7 lac-nagB dentro del cromosoma 71071 -17(DE3) de E. coli. Se decidió dirigir la integración al gen pfkB del cromosoma E. coli. El gen pfkB codifica una fosfofructocinasa menor que suministra el 10% de la actividad de fosfofructocinasa total que se encuentra en E. coli. Por consiguiente, la dirección de integración a este sitio no debe dañar el crecimiento o la producción de N-acetilglucosamina. Se requirieron diversos pasos de clonación para desarrollar un vector para dirigir la integración de la cinta T7 lac-nagB en pfkB del cromosoma en la cepa 710 -17(DE3). El primer paso fue clonar una región a partir del genoma E. coli que contiene la secuencia de codificación pfkB además de las regiones de flanqueo. Los cebadores se diseñaron con base en las secuencias publicadas (Blattner y Asociados, 1997, Science 227(5331 ):1453- 474) para amplificar pfkB además de las regiones genómicas de flanqueo procedentes de ADN genómico de E. coli W3110. Los cebadores 07-16 y 07-17, utilizados para amplificar la región pfkB mediante PCR, tuvieron las siguientes secuencias: 07-16 5'-GATCGCCGGCTTACATGCTGTAGCCCAGC-3' (SEQ ID NO:45) y 07-17 5'-GATCCTGCAGTCATGCTGCTAATAATCTATCC-3' (SEQ ID NO:46). El cebador 07-16 contiene un sitio Nae I (GCCGGC, representado en los nucleótidos 5 a10 de la SEQ ID NO:45) y se amplifica a partir de una corriente ascendente de 1045 nucleótidos del codón de inicio de la secuencia de codificación pfkB (representada en los nucleótidos 11 a 29 de la SEQ ID NO:45). El cebador 07-17 agrega un sitio Pst I (CTGCAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:46) y se amplifica a partir de la corriente descendente de 1357 pares base del codón de detención pdkB (representado en los nucleótidos 11 a 32 de la SEQ ID NO:46). La ligación del producto PCR de 3332 pares base que contiene el pfkB además de las regiones de flanqueo en el sitio Srf I de pPCR-Script Amp SK( + ) (Stratagene, La Jolla, CA), generó el plásmido pKLN-07 4. Se amplificó la cinta T7 -lac-nagB a partir del plásmido pSW07-93#3 (ver anteriormente) bajo condiciones PCR estándar con el cebador de avance 07-145 y el cebador inverso 07-146. Los cebadores tienen las siguientes secuencias: 07-145 5'- GATCTACGTAAGCAACCGCACCTGTGGC-3' (SEQ ID NO:47) y 07-146 5'-GATCCAATTGATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGC- 3' (SEQ ID NO:48). El cebador 07-145 contiene el sitio SnaB I (TACGTA, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:47) y se amplifica a partir de la corriente ascendente de 76 nucleótidos del promotor T7 (representado en los nucleótidos 11 a 28 de la SEQ ID NO:47). El cebador 07-146 contiene un sitio Mfe I (CAATTG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:48) y se amplifica a partir de la corriente descendente de 25 pares base del terminador T7 (representado en los nucleótidos 11 a 36 de la SEQ ID NO:48). El siguiente paso de clonación fue la ligadura de la cinta T7 lac-nagB en el plásmido pKLN07-14. El plásmido pKLN07-14 fue digerido con endonucleasas de restricción SnaB I y Mfe I, eliminando una parte de 523 pares base de la secuencia de codificación pfkB. El fragmento PCR que contiene la cinta T7 lac-nagB con endonucleasas de restricción SnaB I y Mfe I y se ligó en los sitios SnaB 1 y Mfe I de pKLN07-14, generando el plásmido pSW07-97. Por consiguiente, el plásmido pSW07-97 contiene pfkB además de las regiones genómicas de flanqueo con una región de 523 nucleótidos de la secuencia de codificación pfkB reemplazada con la cinta T7 lac-nagB. El fragmento contiene ORFbl 722-DpfkB::T7-lac-nagB-ORFb1725 además de la parte del pPCR-Script MCS se digirió a partir del plásmido pSW07-97 con endonucleasas de restricción Not I y Sal I. Se cortó un fragmento que contiene el replicón sensible a la temperatura además de ia cinta con resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKLN07-21 (descrito previamente) con endonucleasas de restricción Not I y Sal I. Los dos fragmentos se ligaron juntos, generando el plásmido pSW07-98. Se utilizó el plásmido pSW07-98 para generar cepas E. coli con T7 lac-nagB a DpfkB del cromosoma. Después de la transformación de 7107-17(DE3) con pSW07-98, se utilizó el protocolo de selección de temperatura para seleccionar las cepas con el T7-lac-nagB integrado en el sitio pfkB. Las cepas resultantes fueron designadas como 7107-645, y las cepas se confirmaron mediante hibridación Southern estándar altamente estricta, utilizando la secuencia de codificación nagB como sonda. Eliminación del gen glmS en las cepas E. coli con una cinta T7 lac-nagB integrada Para eliminar la cepa 7107-645 de E. coli del gen glmS, se desarrolló un vector de reemplazo de secuencia glmS. Se requirieron diversos pasos para construir el vector. El primer paso fue amplificar la región del genoma que contiene el gen glmS además de la secuencia de flanqueo. Este fragmento podría ligarse posteriormente con el fragmento procedente de pKLN07-21 (descrito previamente) que contiene el replicón sensible a la temperatura y la cinta de resistencia a kanamicina. Finalmente, se podría cortar una parte de la secuencia de codificación glmS del plásmido resultante, generando el vector de integración para dirigir la eliminación glmS al genoma E. coli. Para el primer paso, se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada del gen glmS además de las regiones de flanqueo (referencia). Se utilizaron los cebadores para amplificar un fragmento que contiene los genes glrnil, glmS, y pstS procedentes de ADN genómico E. coli W3110. Los cebadores utilizados para amplificación se designaron como 07-139 y 07-140 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-139 5'- GATGCGGCCGCATGTTGAATAATGCTATGAGCGTAGTGATC-3' (SEQ ID NO:49) y 07-140, 5'- GATCGTCGACTTAGTACAGCGGCTTACCGCTACTGTC-3' (SEQ ID NO:50). El cebador de avance 07-139 que contiene los primeros 30 nucleótidos de la secuencia de codificación glmU procedente de su codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 12 a 41 de la SEQ ID NO:49) estuvo precedido de un sitio de endonucleasa de restricción Not I (GCGGCCGC, representado en los nucleótidos 4 a 11 de la SEQ ID NO:49). El cebador inverso 07-140 que contiene los últimos 27 nucleótidos de la secuencia de codificación pstS comenzando desde su codón de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 37 de la SEQ ID NO:50) estuvo precedido por un sitio de endonucleasa de restricción Sal I (GTCGAC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:50). Se llevó a cabo PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento que contiene las secuencias de codificación glmU-glmS-pstS flanqueadas por los sitios de endonucleasa de restricción Not l y Sal I. Se digirió el fragmento PCR con endonucleasas de restricción Not I y Sal I. El replicón sensible a la temperatura además del fragmento de la cinta de resistencia a kanamicina se cortó a partir del plásmido pKLN07-21 (descrito previamente) con las endonucleasas de restricción Not I y Sal I. Los dos fragmentos se ligaron juntos, generando el plásmido pSW07-94#43. Se dirigió el plásmido pSW07-94#43 con la endonucleasa de restricción Sac II, eliminando 980 nucleótidos de la secuencia de codificación glmS. El resto del plásmido se ligó consigo mismo, generando un vector de integración, pSW07-95. En un intento de mejorar la frecuencia de recombinación para generar la mutación glmS en el cromosoma E. coli, también se construyó el plásmido pSW07-99 agregando 772 nucleótidos de la corriente ascendente de la región de glmU al plásmido pSW07-95. Los cebadores se sintetizaron con base en la secuencia publicada del gen glmU además de la región de flanqueo (referencia). Se utilizaron los cebadores para amplificar un fragmento que contiene la corriente ascendente 772 nucleotidos del codón de inicio glmU y los primeros 246 nucleotidos de la secuencia de codificación glmU procedentes de ADN genómico E. coli W3110. Los cebadores utilizados para amplificación fueron designados como 07-147 y 07-148 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-147, 5'-GATGCGGCCGCATGGCAATGACTTACCACCTGGAC-3' (SEQ ID NO:51) y 07-148, 5'- CGTACCCAGCTGCTCTGCCTGAAGCACCC-3' (SEQ ID NO:52). El cebador directo 07-147 que contiene los primeros 24 nucleotidos de la secuencia de codificación atpC (representado en los nucleotidos 12 a 35 de la SEQ ID NO:51) estuvo precedido por un sitio de endonucleasa de restricción Not I (GCGGCCGC, representado en los nucleotidos 4 a 11 de la SEQ ID NO:51). El cebador inverso 07-148 que contiene 29 nucleotidos de la secuencia de codificación glmU (representada en los nucleotidos 1 a 29 de la SEQ ID NO:52) comenzando a partir de la corriente descendente de 246 pares base de su codón de inicio ATG. Se llevó a cabo PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento que contiene la región de ADN genómico procedente del codón de inicio atpC hasta el nucleótido 246 de la secuencia de codificación glmU. El producto PCR fue digerido con endonucleasas de restricción Not I y SexA I y se ligó en los sitios Not I y SexA I del plásmido pSW07-95#6, generando el plásmido pSW07-99. Se utilizaron los plásmidos pSW07-95 y pSW07-99 para generar la cepas E. coli con la eliminación glmS en el cromosoma. Después de la transformación de las cepas 7107-645(20), 7107-645(30) y 7107-645(43) de E. coli con el plásmido pSW07-95 ó pSW07-99, se utilizó el protocolo de selección de temperatura para seleccionar las cepas con la eliminación glmS. Se agregó glucosamina (2 g I"1) a todos los frascos para el pase y a todas las placas después del pase. Se seleccionaron cepas sensibles a kanamicina y se clasificaron utilizando un protocolo PCR estándar para la presencia de la eliminación glmS. Las cepas de eliminación glmS potenciales identificadas mediante PCR, fueron plaqueadas en placas LB sin glucosamina agregada para buscar el crecimiento reducido. Algunas de estas cepas tuvieron crecimiento limitado en las placas B, en tanto que otras no exhibieron crecimiento. Estas cepas se confirmaron como teniendo la eliminación glmS mediante hibridación Southern, bajo condiciones altamente estrictas utilizando un fragmento de 2.0-kb que contiene la secuencia de codificación glmS. Las cepas resultantes fueron designadas como 7107-646. Expresión funcional de naaB v el efecto en la producción de qlucosamina Se llegó a cabo la clasificación en frasco de agitación 61 para probar las cepas 7107-646 para la producción de glucosamina y actividad enzimática. Las cepas fueron probadas en frascos que contienen medio M9B [6 g G1 KH2P04l 24 g I"1 K2HP04, 1 g G1 Na3 citrato-2H20, 10 g G1 (NH )2S04 (fosfato ajustado a un pH de 7.4) además de oligometales (0.2 mg I"1 FeS0 -7H20, 0.015 mg I"1 ZnS04-7H20, 0.015 mg I"1 MnS04-H20, 0.001 mg I'1 CuS04-5H20, 0.001 mg 1 NaMo04-2H20, 0.001 mg G1 H3B03, y 0.001 mg 1 CoCI2-6H20)] suplementado con 10 g I"1 de glucosa, 0.6 g 1 MgS04-7H20, 0.05 g G1 CaCI2-2H20, y 0.2 mM de IPTG. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C durante 24 horas y posteriormente se colocaron a una temperatura de 25°C. El pH de cada cultivo se ajustó a 7.2 a 24 y 48 horas. En 24 y 48 horas, se agregó la glucosa a los frascos aproximadamente a 30 g 1 por día en total, y se agregaron 5 g 1 de (NH4)2S04 a los frascos en los cuales habían caído los niveles debajo de 1 g G1. Se tomaron muestras a las 24 y 48 horas y se midió la concentración de glucosamina en el sobrenadante de cultivo utilizando el ensayo Elson-Morgan modificado, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,372,457. No se detectó glucosamina en ninguna de las muestras. Se probaron muestras de 48 horas procedentes de las cepas 7107-646#7 y 7107-646#20 con respecto a la actividad de NagB. Estas cepas tuvieron actividades enzimáticas de 58 y 53 mmol min" mg'1, en comparación con la actividad no detectable en la cepa de control 7101 -17(DE3), que indica una sobreexpresion exitosa de nagB. El hecho de que las cepas 7107-646 crecieran tan bien o mejor que a cepa de control 7101-17(DE3) en este experimento, indicó que el nagB sobreexpresado tiene la capacidad de suprimir la mutación glmS. Sin embargo, la sobreexpresion de nagB no dio como resultado la acumulación de glucosamina incrementada. Integración de la cinta T7 lac-ScGNA1 La sobreexpresion de las cepas de eliminación nagB en glmS dio como resultado la no acumulación de glucosamina, debido potencialmente al hecho de que NagB normalmente cataliza la desaminación de GlnC-6-?. La pequeña cantidad de GlcN-6-? producida mediante la enzima NagB, debe convertirse rápidamente nuevamente a fructosa-6-?, evitando cualquier acumulación de GlcN-6-?. Sin embargo, si se introduce la enzima GNA1, GNA1 podría convertir GlcN-6-? a GlcNAc-6-? y conducir en forma continua la formación de glucosamina-6-fosfato a partir de fructosa-6-fosfato. Para probar esta posibilidad, se integró la cinta T7lac-ScGNA1 en manXYZ de las cepas 7107-646(3) y 7107-646(7). Se llevó a cabo la integración GNA1 con el plásmido pSW07-68#25, tal como se detalla en el Ejemplo 16. Se clasificaron cepas sensibles a kanamicina a través de un protocolo PCR estándar para la presencia de T7lac-ScGNA1 en el sitio de eliminación manXYZ. Las cepas positivas mediante PCR, se confirmaron a través de hibridación Southern estándar altamente estricta, utilizando un fragmento que contiene la secuencia de codificación ScGNAl en la forma de la sonda. Las cepas resultantes 7107-660 y 7107-661, derivadas de las cepas 7107-646(3) y 7107-646(7), respectivamente, se probaron con respecto a la acumulación NAG. Expresión funcional de la producción nagB y N -acetilqlucosamina en E. coli Se llevó a cabo una clasificación en frasco de agitación 67 para probar las cepas con la eliminación glmS, la cinta T7 lac-nagB en pfkB, y la cinta T7 lac-ScGNA1 en manXYZ con respecto a la producción de N-acetilglucosamina. Las cepas 7107-660(1), 7107-660(4), 7107-661(1), 7107-661(2), y 7107-661(3), así como las cepas de control 7101-17 y 7107-607(2), se crecieron en frascos de agitación que contienen el medio M9B (descrito previamente) suplementado con g 1 de glucosa, 10 g I"1 de lactosa, 0.6 g I"1 de MgS04-7H20, y 0.05 g !"1 de CaCI2-2H20. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 37°C durante 8 horas y posteriormente se colocaron a una temperatura de 30°C. 8 horas después de la inoculación, se agregó la glucosa a 25 g 1 y se ajustó el pH a 7.2. En 24, 31, 48 y 56 horas se agregó la glucosa con base en los resultados HPLC a 30-40 g 1 por día en total. (NH4)2S04 se agregó a 5 g 1 en frascos con niveles debajo de 1 g I"1, y se ajustó el pH a 7.2. En 27 horas, se agregó la lactosa a 5 g I"1. Se eliminaron las muestras en 8, 24, 48 y 72 horas para el análisis HPLC de los niveles NAG. Se cosecharon cultivos celulares a las 72 horas para ensayar actividades de acetiltransferasa de glucosamina-6-f osfato (GNA1), sintasa de glucosamina (GImS) y deaminasa de glucosamina-6-fosfato (NagB). Los ensayos de enzimas confirmaron que las cepas 7107-660 y 7107-661 carecieron de proteína GImS funcional. Tal como se esperó, se elevó la actividad de NagB en estas cepas. La actividad de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato fue similar a la observada en la cepa de control 7107-607(2) indicando la expresión funcional de la proteína GNA1 en estas cepas. Las cepas de eliminación glmS que sobreexpresan nagB y GNA1 tuvieron la capacidad de producir N-acetilglucosamina (tabla 15). La cepa 7107-661 se desempeñó como la mejor, produciendo el 75% del nivel de NAG logrado con la cepa de producción 7107-607#2. Es interesante, que la cepa 7107-660(1) mostró actividad NagB 20 veces más que otros hermanos y como consecuencia produjo un nivel mucho menor de GIcNAc. Parece que la acetiltransferasa de glucosamina-6-? ayuda a llevar a cabo la reacción catalizada mediante NagB en la dirección de la formación de glucosamina-6-fosfato. Los datos demuestran la funcionalidad de una trayectoria biológica novedosa para la síntesis de N-acetilglucosamina. Además, la sobreexpresión de nagB junto con GNA1, es un método eficiente para producir N-acetilglucosamina en E. coli. Tabla 15. Actividad enzimáticas y producción GIcNAc en cepas mutantes glmS que sobreexpresan nagB. 1 ) Se determinaron las actividades enzimáticas y los niveles de N-acetilglucosamina en muestras tomadas en el tiempo de tiempo de 72 horas. 2) La actividad enzimática se expresa en mol de proteína min"1 mg'1. 3) Los números en los paréntesis indican diferentes hermanos. Ejemplo 15 Este ejemplo describe la clonación y sobreexpresión de los genes glmM y glmU, para la producción de N-acetilglucosamina en la cepa 7107-18. En E. coli, los genes glmM y glmU codifican las enzimas que catalizan los primeros tres pasos mediante los cuales se convierte GlcN-6-? a UDP-GIcNAc. UDP-GIcNAc se requiere para la síntesis de componentes esenciales de envoltura celular. GlmM cataliza la interconversión de GlcN-1,6-difosfato mediante un mecanismo de reacción "ping-pong" de dos pasos en el cual GlcN-1 ,6-difosfato sirve tanto como el primer producto, como el segundo substrato. Se conoce GlmM como activo únicamente en una forma fosforilada, aunque no se conoce la activación enzimática in vivo. En cepas que sobreproducen GlmM en niveles superiores, no se incrementó la cantidad total de enzima fosforilada, indicando que el nivel de fosforilación GlmM puede no ser regulado en forma precisa (Mengin-Lecreulx and van Heifenoort, J. Biol. Chem. 1996 271:32-39). GlmU es una enzima bifuncional con dominios de uridiltransferasa (terminal N) y acetiltransferasa (terminal C) separados. El dominio de acetiltransferasa es responsable de catalizar la conversión de GlcN-1-? a GlcNAc-1-?; el dominio de uridiltransferasa convierte posteriormente GlcNAc-1-? a UDP-GIcNAc. En una publicación reciente, se expresaron versiones truncadas de GImU con etiquetas His6 de terminal-N y se ensayaron con respecto a las actividades de acetiltransferasa y uridiltransferasa (Pompero y Asociados, J. Biol. Chem. 2001 276:3833-3839). Se obtuvo una forma truncada de GImU con actividad uridiltransferasa disminuida mediante un factor de 1320 con relación a GImU de longitud total, eliminando los primeros 78 residuos de aminoácidos de terminal-N de la proteína. Esta proteína GImU truncada retuvo el 66% de la actividad de acetiltransferasa observada en el GImU de longitud total. La figura 14, muestra la trayectoria bacteriana mediante la cual se convierte GlcN-6-? a UDP-GIcNAc a través de la acción de las enzimas GImM y GImU. La sobreexpresion de glmM, glmU, glmU truncado o una combinación de glmM y glmU puede dar como resultado una combinación de N-acetilglucosamina en el medio. Por consiguiente, las cepas se construyeron para la sobreexpresion de estos genes. Clonación del gen glmM con respecto a la sobreexpresion en £. co//: Para la clonación y expresión del gen glmM de E. coli, se sintetizaron los cebadores con base en la secuencia publicada del gen glmM (Mengin-Lecreulx, y van Heijenoort, J. Biol. Chem., 1996, 271:32-39). La secuencia de codificación glmM fue amplificada mediante PCR bajo condiciones estándar a partir de ADN genómico E. col! W3110 utilizando el cebador de avance 07-163 y el cebador inverso 07-164. Los cebadores tienen las siguientes secuencias: 07-163: 5'-GATCGGTCTCGCATGAGTAATCGTAAATATTTC-3' (SEQ ID NO:59) y 07-164 5*-GATCCTCGAGTTAAACGGCTTTTACTGCATC-3' (SEQ ID NO:60). El cebador 07-163 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:59) seguido de 21 nucleótidos de las secuencias de codificación glmM que comienzan a partir de su codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 13 a 33 de la SEQ ID NO:59). El cebador 07-164 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Xho I (CTCGAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:60), seguido de 21 nucleótidos de la secuencia de codificación glmM que comienza en su codón de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 31 de la SEQ ID NO:60). La secuencia de codificación glmM E. colí y la amplificación PCR, se llevó a cabo bajo condiciones estándar para generar un fragmento de ADN que contiene toda la secuencia de codificación glmM flanqueada por los sitios de endonucleasa de restricción de Bsa I y Xho l. Se digirió el producto PCR con las enzimas de restricción Bsa I y Xho I y se ligó en los sitios Neo I y Xho I del plásmido pET24d(+) (Novagen, Inc., Madison, Wl), generando el plásmido pSW07- 109. La clonación en esta forma coloca la secuencia glmM detrás del promotor TTlac de pET24d( + ), generando la cinta de expresión T7lac-glmM. Clonación del gen glmU para la sobreexpresión en E. coli: Para la clonación y expresión del gen glmU E. coli, se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada del gen glmU (Mengin-Lecreulx, and van Heijenoort, J. Bac, 1993, 175:6150-6157). Se amplificó la secuencia de codificación mediante PCR bajo condiciones estándar a partir de ADN genómico E. coli W3110 utilizando el cebador de avance 07-161 y el cebador inverso 07-162. Los cebadores tienen las siguientes secuencias: 07-161 5'-GATCGGTCTCGCATGTTGAATAATGCTATGAGC-3' (SEQ ID NO:61) y 07-162: 5'-GATCCTCGAGTCACTTTTTCTTTACCGGACGAC-3' (SEQ ID NO:62). El cebador 07-161 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:61) seguido de 21 nucleótidos de la secuencia de codificación glmU comenzando en su codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 13 a 33 de la SEQ ID NO:61). El cebador 07-162 contiene un sitio Xho I (CTCGAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:62) seguido de 23 nucleótidos de la secuencia de codificación glmU comenzando en su codón de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 33 de I SEQ ID NO:62). La secuencia de codificación glmil de E. coli y la secuencia de aminoácidos GImU se representan mediante la SEQ ID NO:55 y la SEQ ID NO:56, respectivamente. Se llevó a cabo la amplificación PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento de ADN que contiene toda la secuencia de codificación glmU flanqueada por los sitios de endonucleasa de restricción Bsa I Xho I. El producto PCR se digirió con enzimas de restricción Bsa I y Xho I y se llevó en los sitios Neo I y Xho I del plásmido pET24d( + ) (Novagen, Inc., Madison, Wl), generando el plásmido pSW07-108. La clonación en esta forma colocó la secuencia glmM detrás del promotor T7lac de pET24d(+), generando una cinta de expresión de T7lac-glmU. Clonación v expresión de una enzima GImU truncada por terminal-N (GlmU La secuencia de codificación glmU truncada se amplificó mediante PCR bajo condiciones estándar a partir de ADN genómico E. coli W3110 utilizando el cebador de avance 07-165 y el cebador inverso 07-162. El cebador 07-165 tuvo la siguiente secuencia: 07-165: 5'- GATGGTCTCGCATGGAGCAGCTGGGTACGGGTC-3' (SEQ ID NO:63). El cebador 07-165 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 4 a 9 de la SEQ ID NO:63) y la secuencia CDS glmU comenzando en la corriente descendente de 232 pares base del codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 15 a 33 de la SEQ ID NO:63). Esto da como resultado una eliminación de los primeros 77 aminoácidos de la proteína GlmU. También se incorpora un codón de inicio en el cebador 07-165. El producto PCR generado con los cebadores 07-165 y 07-162 contiene la secuencia de codificación glmU con los primeros 77 residuos de aminoácidos eliminados. La secuencia de codificación glmU truncada mediante terminal-N y la secuencia de aminoácidos GlmU truncada mediante terminal-N de E. coli se representan mediante la SEQ ID NO:57 y la SEQ ID NO:58, respectivamente. El producto PCR fue digerido con Bsa I y Xho I ligado en los sitios Neo I y Xho I del plásmido pET24d( + ) (Novagen, Inc., Madison, Wl), generando el plásmido pSW07-1 0. La clonación en esta forma coloca la secuencia glmU truncada (glmUt) detrás del promotor T7lac de pET24d(+), generando la cinta de expresión de T7lac-glmUt. Sobreexpresión de las proteínas GlmM, GlmU, y GlmUt en E. coli Los plásmidos pSW07-108, pSW07-109, y pSW07-110, que contienen glmU, glmM, ó glmUt, se transformaron en la cepa 7101 -17(DE3), generando las cepas descritas en la tabla 16. El vector vacío pET24d( + ) se transformó en la cepa 7101- 17(DE3), generando la cepa de control 7107-22. Se llevó a cabo un experimento de inducción estándar en el cual los cultivos celulares de los transformadores se crecieron en medio LB y se indujeron con IPTG 1 mM. Se tomaron muestras a partir de cultivos inducidos en diferentes puntos de tiempo de SDS-PAGE para confirmar la sobreexpresión de proteína. El tamaño anticipado de las proteínas GlmU, GlmM, y GlmUt fueron 51 kDa, 50 kDa, y 42 kDa, respectivamente. Las bandas de proteína de los tamaños anticipados en SDS-PAGE se observaron en muestras procedentes de cepas que sobreexpresan glmU, glmM y glmUt. En la cepa de control se observaron proteínas no sobreexpresadas cerca de los tamaños anticipados de GlmU, GlmM, ó GlmUt. Las fracciones totales y solubles de las muestras procedentes de cultivos inducidos, se determinaron mediante SDS-PAGE. Tal como se juzga por una estimación visual, aproximadamente el 20% de la proteína GlmU estuvo en la fracción soluble. Sin embargo, se observó poca proteína soluble con la versión truncada de la proteína GlmM. En forma similar, poca proteína GlmM estuvo en forma soluble.

Tabla 16. Cepas que contienen diferentes plásmidos de proteínas GImU, GImU truncadas con terminal GImM.

Integración de T7 lac-almU y T7lac-almUt en el sitio de eliminación nag Los geles SDS-PAGE indicaron una sobreproducción exitosa de las proteínas GImU y GlmUt en E. coli. Por consiguiente, se desarrolló una estrategia para integrar las cintas de expresión en el cromosoma de la cepa de producción 7107-18. El objetivo elegido para la integración fue el sitio de eliminación nag en el cromosoma de la cepa 7107-18. En las etapas tempranas de construcción de cepas de producción de glucosamina, se eliminó el operón nag y se insertó una cinta de resistencia a tetraciclina en el sitio de la eliminación en el cromosoma que sigue la transducción P1 con un fago preparado a partir de la cepa IBPC590 (Plumbridge, 1989, Mol. Microbio!. 3:506-515; Plumbridge, 1991, Mol. Microbiol. 5:2053-2062, Plumbridge, 1992, J. Gen.

Microbiol. 138: 011-1017). Por consiguiente, la dirección de integración a esta región del cromosoma, no debe afectar el crecimiento o producción de glucosamina en la cepa. Como parte de la estrategia para desarrollar un vector para dirigir la integración de la cinta T7lac-glmU en el sitio de la eliminación nag del cromosoma, se amplificó el fragmento T7lac-glmU mediante PCR a partir del plásmido pSW07-108#1. Se llevó a cabo el PCR bajo condiciones estándar con cebadores GNT7nagA1-5 y 07-120. Los cebadores tienen las siguientes secuencias: GNTnagA1-5: 5'- GCGACGCTCTCCCGGGTGCGACTCCTGCATTA-3' (SEQ ID NO:64) y 07-120: 5'- GATCTGTACAATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAAC CCC-3' (SEQ ID NO:65). El cebador de avance GNT7nagA1-5 incorpora un sitio de endonucleasa de restricción Xma I (CCCGGG, representado en los nucleótidos 11 a 16 de la SEQ ID NO:64), y se amplifica a partir de la corriente ascendente de 296 pares base del promotor 17. El cebador 07-120 contiene un sitio de endonucleasa de restricción BsrG I (TGTACA, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:65) y se amplifica a partir de la corriente descendente de 25 pares base del terminador T7. El plásmido pCALG43 (descrito en el ejemplo 29) contiene la secuencia que flanquea la eliminación nag de las cepas de producción, el replicón sensible a la temperatura procedente de pMAK705 (Hamilton y Asociados, 1989, J. Bac. 171 (9):46 7-4622, incorporado en su totalidad a la presente invención como referencia) y la cinta de resistencia a kanamicina del plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). El producto PCR que contiene la cinta T7lac-glmU fue digerido con las enzimas de restricción Xma I y BsrG I y se ligó en los sitios Age I y BsrG I de pCALG43. Se puede utilizar el plásmido resultante pSW07-112 para dirigir la integración de la cinta T7lac-glmU al sitio de la eliminación nag en el cromosoma de nuestras cepas de producción. Para generar un plásmido para la integración de la cinta T7lac-glmU (truncada) en Dnag, se utilizaron las mismas estrategias y cebadores, excepto que el plásmido pSW07-110#53 sirvió como plantilla para PCR. El plásmido resultante se designó como pSW07-113. Los plásmidos pSW07-112 y pSW07-113 se utilizaron para generar cepas E. col¡, con la cinta glmU o la cinta T7lac-glmUt integrada en el sitio de la eliminación nag en el cromosoma. Después de la transformación de 7107-18 E. coli con los plásmidos, se utilizó el protocolo de selección de temperatura descrito en el ejemplo 13 para seleccionar las cepas que contienen las inserciones. Se clasificaron colonias sensibles a kanamicina mediante PCR con respecto a la presencia de las cintas de expresión glmU en el sitio de la eliminación nag. Las cepas positivas mediante PCR, fueron confirmadas mediante hibridaciones Southern conducidas bajo condiciones altamente estrictas utilizando el producto PCR glmU truncado como una sonda. Se confirmaron las cepas 7107-678 y 7107-679 como teniendo el T7lac-glmU integrado en el sitio de la eliminación nag. Se confirmaron las cepas 7107-681 y 7107-681 como teniendo el T7 lac-glmUt integrado en el sitio de la eliminación nag. Integración de T7 lac-glmM en el sitio de eliminación glg Los geles SDS-PAGE indicaron una sobreexpresión exitosa de la proteína GlmM en e. E. coli. Por consiguiente, se desarrolló una estrategia para integrar la cinta T7lac-glmM en el cromosoma de la cepa de producción 7107-18. El objetivo elegido para integración fue el operón glg. La región glg había sido dirigida previamente para la eliminación en un esfuerzo de incrementar el flujo de carbono a través de las trayectorias de producción de glucosamina y N-acetilglucosamina, bloqueando ia trayectoria de síntesis de glicógeno. Esta mutación no tuvo efecto perjudicial en el crecimiento o producción de NAG. Por consiguiente, la integración de la cinta T7 lac-glmM en este sitio de cromosomas, no debe afectar en forma negativa las cepas de producción. Como parte de la estrategia para desarrollar un vector para dirigir la integración de la cinta T7lac-glmM en el sitio glg, se amplificó el fragmento T7lac-glmM a partir del plásmido pSW07-109#29. Se llevó a cabo PCR bajo condiciones estándar con los cebadores GNT7nagA1-5 y GNT7nagA2-3. Los cebadores tienen las siguientes secuencias: GNT7nagA1-5: 5'- GCGACGCTCTCCCGGGTGCGACTCCTGCATTA-3' (SEQ ID NO:66) y GNT7nagA2-3: 5'- GCGCTAATCAAGTTTTCCCGGGTCGAGGTGCCGTAA-3' (SEQ ID NO:67). El cebador GNT7nagA1-5 incorpora un sitio Xma I (CCCGGG, representado en los nucleótidos 11 a 16 de la SEQ ID NO:66) y se amplifica a partir de la corriente ascendente de 296 pares base del promotor T7. El cebador GNT7nagA2-3 también incorpora un sitio Xma I (CCCGGG, representado en los nucleótidos 17 a 22 de la SEQ ID NO:67) y se amplifica a partir de la corriente descendente de 254 pares bases del terminador T7. El fragmento PCR resultante fue digerido con la endonucleasa de restricción Xma I y se ligó el sitio Age I del plásmido pCALG28-2 (descrito en el ejemplo 29). Esto generó los plásmidos pSW07-111 #3, con la cinta T7lac-glmM ligada en la misma orientación con el operón glg y pSW07-111 #4 con la cinta T7lac-glmM ligada en la orientación opuesta del operón glg. Estos plásmidos pueden utilizarse para dirigir la integración del T7lac-glmM a la región glg de la cepa de producción. Después de la transformación de 7107-18 de E. coli con el plásmido pSW07-111#3 ó pSW07-1 1#4, se utilizó el protocolo de selección de temperatura para seleccionar las cepas que contienen T7-lac-glmM en el sitio glg. Se llevaron a cabo hibridaciones Southern bajo condiciones altamente estrictas utilizando la secuencia de codificación glmM como una sonda. Se confirmó la cepa 7107-682 como teniendo T7-lac-glmM integrada en el sitio glg en el cromosoma (glmM CDS en la misma orientación que los genes glg interrumpidos). Se confirmó la cepa 7107-683 como teniendo T7 -lac-glmM integrado en el sitio glg en el cromosoma (glmM CDS en la orientación opuesta como los genes glg interrumpidos). Ensayos GlmM/GImU Se examinaron varias cepas que contienen GlmM (mutasa), GlmU (acetiltransferasa/uridiltransferasa), y GlmU truncado con terminal-N sobreexpresados. Las actividades de estas enzimas se ensayaron en cepas seleccionadas a partir de esta clasificación. Se ensayó la mutasa de fosfoglicosamina (GlmM) utilizando una reacción acoplada en la dirección de glucosamina-1 -fosfato a glucosamina-6-?. La glucosamina-6-? formada, se convirtió en forma cuantitativa a 6-fosfogluconato utilizando deaminasa de glucosamina-6-? (NagB), fosfoglucoisomerasa y deshidrogenasa de glucosa-6- P. La formación de NADH permitió el monitoreo de la reacción a 340 nm. Se ensayó acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato (GlmU) utilizando glucosamina-1 -fosfato y acetil-CoA. Se midió la formación de CoA libre en un ensayo de punto de extremo utilizando el reactivo ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DNTB). Se monitoreó la formación de CoA libre a 410 nm. Se resumieron en la tabla 17 los niveles de las actividades enzimáticas y niveles de glucosamina y N-acetilglucosamina. Se produjeron cantidades significativas de N-acetilglucosamina en cepas que tienen GlmU sobreexpresada, ya sea la forma nativa o la versión truncada o la terminal-N. Las actividades de esta enzima generalmente fueron de 30 a 50 veces más altas que la cepa de control 7017-18, la cual mostró únicamente un nivel de actividad muy bajo. También se formó en estas cepas una glucosamina libre importante. La sobreexpresión de la proteína GlmM no condujo a una actividad superior. Bajo las condiciones experimentales, la sobreexpresión de GlmM sola no permitió la formación de una cantidad significativa de N-acetilglucosamina. Además, la sobreexpresión de GlmM más GlmU dio como resultado niveles incrementados de N-acetilglucosamina relativa a las cepas GlmU. Tal como lo reporta la literatura, la enzima GlmM está sometida a regulación de fosforilación, a la cual no nos referimos en la presente invención. Se anticipa que la creación y uso de las enzimas mutantes GlmM, la cual deriva la regulación de fosforilación y/o tiene otras características cinéticas mejoradas, puede incrementar la eficacia de la síntesis de N-acetilglucosamina a través de la trayectoria de GlmS-GImM-GImU, ó NagB-GIm -GImU. Tabla 17. Análisis de cepas que sobreexpresan GlmM, GImU y GImUt (GImU truncado por terminal-N).

Todos los genes recombinantes descritos fueron sobreexpresados bajo el control del promotor T7. glmS = sintetasa de glucosamina. glmM = mutasa de fosfoglucosamina. glmU = acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato. glmUt = versión truncada por terminal-N de GlmU. Ejemplo 16 Este ejemplo describe la integración de una o más copias de la cinta T7 lac-ScGNA1 en el cromosoma de las cepas de producción de glucosamina ó N-acetilglucosamina. La sobreexpresión de ScGNAl utilizando el vector pET24d( + ) dio como resultado la producción de N-acetilglucosamina de 24 g I"1 después de 72 horas de cultivo (Tabla 1). Para evitar el uso de antibióticos en cultivos y para maximizar la producción de N-acetilglucosamina, se decidió integrar la cinta de expresión T7lac-ScGNA1 en el cromosoma. Ya que no se conoce cuántas copias de la cinta de expresión T7 lac-ScGNA1 serán óptimas para la producción de NAG, se decidió integrar múltiples copias de la cinta en el cromosoma. Los sitios de inserción para la integración, fueron seleccionados con base en la suposición de que los genes dirigidos no son esenciales para el crecimiento celular de la producción de N-acetilglucosamina. Se seleccionaron cuatro sitios objetivos: manXYZ, fuclK, treB, y melAB. La estrategia general y protocolos de selección de temperatura descritos en el ejemplo 13, se adaptaron a la integración GNA1 dentro del cromosoma. Los diferentes vectores de integración sensibles a la temperatura se desarrollaron, conteniendo cada uno un origen de réplica sensible a la temperatura, un marcador de selección de antibióticos y la cinta de expresión T7 lac-ScGNA1. Por cada vector, se aisló la cinta de expresión T7lac-ScGNA1 del plásmido recombinante pSW07-62#25 y se insertó en un fragmento de la secuencia de ADN de E. coli clonada a partir del sitio de integración proyectado. Los vectores de integración se transformaron en cepas huésped E. coli y se seleccionaron los clones con ScGNAl integrado utilizando procedimientos de cambio de temperatura. Los mismos métodos y protocolos se pueden utilizar para integrar otros homólogos de GNA1 a partir de diferentes orígenes. Se anticipa para los expertos en la técnica, que se puede necesitar modificaciones y cambios para adaptar estos métodos y protocolos para cada gen específico. Dicha modificación y cambios incluyen, pero no se limitan a, el uso de diferentes sitios de restricción para clonar y diferentes localizaciones para integrarse en el cromosoma. Integración GNA1 en el sitio manXYD (una copia de GNA1): Se subclonó la cinta de expresión T7lac-ScGNA1 para integración en el sitio manXYZ dentro del cromosoma 7107-18. manXYD E. coli es un operón que codifica un complejo de tres proteínas implicadas en la captación y fosforilación de mañosa. El operón puede ser eliminado sin afectar el crecimiento de E. coli en un medio que contiene glucosa como la fuente de carbono. Para la integración del gen GNA1 en el sitio manXYZ, se desarrolló un plásmido que contiene la secuencia manXYZ de E. coli. Los cebadores fueron sintetizados con base en la secuencia publicada de manXYZ E. col! (Blattner y Asociados, 1997, Science 277(5331), páginas 1453-1474, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia) para amplificar el operón manXYZ además de las regiones de flanqueo procedentes del ADN genómico E. coli W3110 utilizando el método PCR estándar. Los cebadores utilizados para la amplificación, fueron el cebador de avance 07-87 y el cebador inverso 07-88, el cual tuvo las siguientes secuencias: 5'- GATGCGGCCGCACTGCAGTAATTACCGCATCCAAC-3' (SEQ ID NO:68) y 07-88: 5'- GATGTCGACACCGATTGATGCAGCAAATGCATCC-3' (SEQ ID NO:69). El cebador 07-87 contiene un sitio de endonucleasa de restricción (GCGGCCGC, representado en los nucleótidos 4 a 11 de la SEQ ID NO:68) e inicia en la corriente ascendente de 905 pares base del codón de inicio ATG manX. El cebador 07-88 contiene un sitio Sal I (GTCGAC, representado en los nucleótidos 4 a 9 de la SEQ ID NO:69) e inicia a partir de la corriente descendente de 1010 pares base procedente del codón de detención de traducción manZ. Se llevó a cabo PCR utilizando un protocolo estándar para generar el fragmento que contiene manXYZ además de las regiones de flanqueo, flanqueadas por los sitios de restricción Not I y Sal I. Este fragmento fue clonado en el vector pCRó2.1 -TOPO6 (Invitrogen, Carlsbad, CA), generando el plásmido pSW07- 65#7. Para generar una eliminación en manXYZ, se digirió el plásmido pSW07-65#7 con la enzima de restricción Hpa I. Esto liberó una parte de 2647 pares base del plásmido que contiene la mayor parte de la secuencia de codificación de manXYZ. Además, el fragmento T7lac-ScGNA1 se cortó a partir del plásmido pSW07-62#25 (descrito previamente en el ejemplo 13) utilizando la endonucleasa de restricción Nae I. El plásmido pSW07-62#25 que contiene los sitios Nae I en la corriente ascendente de 46 pares base del promotor T7 y en la corriente descendente de 164 pares base del terminador T7. El fragmento Nae I que contiene la secuencia Tllac-ScGNAl fue ligado en ios sitios Hpa I de pSW07-65#7. Ya que esta ligadura fue una ligadura con extremo romo, el fragmento debe ligarse en el plásmido en cualquier orientación. Por consiguiente, se utilizó la digestión de enzimas de restricción para clasificar los plásmidos con la cinta T7lac-ScGNA1 insertada en la misma orientación que manXYZ. El plásmido resultante fue designado como pSW07-66#25. Para crear un vector de integración sensible a la temperatura, se cortó un fragmento que contiene el replicón sensible a la temperatura de pMAK705 (Hamilton y Asociados, 1989, J. Bac. 171 (9):4617-4622, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia) y la cinta de resistencia a kanamicina del plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a partir del plásmido pKLN07-21 utilizando las enzimas de restricción Not I y Sal I. Se construyó el plásmido pKLN07-21 mediante amplificación PC del replicón sensible a la temperatura a partir del plásmido pSW07-4 (descrito en el ejemplo 6), la ligadura del producto PCR que se encuentra en el vector pPCR-ScriptAMPSK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), y la adición de la cinta de resistencia a kanamicina procedente del plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Se utilizaron las enzimas de restricción Not I y Sal I para cortar el fragmento que contiene T7 lac-ScGNA1 además de la región de flanqueo manXYZ procedente del plásmido pSW07-66#25. Posteriormente este fragmento fue ligado con el fragmento Not \/Sal I que contiene el origen de réplica sensible a la temperatura y el marcador de resistencia a kanamicina procedente de pKLN07-21, generando el plásmido pSW07-68#5. Este plásmido tuvo un origen de réplica sensible a la temperatura, un marcador de selección de kanamicina y una cinta de expresión T7 lac-ScGNA1 que está flanqueada por las secuencias de corriente ascendente 5' y corriente descendente 3' del locus manXYZ. El plásmido pSW07-68#5 fue utilizado para generar las cepas E. coli con T7/ac-ScGN/A ? integrado en el sitio manXYZ. Tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,372,457, el operón manXYZ en la cepa 7107-18 fue mutado mediante transducción de fago P1. Después de la transformación de la cepa 7107-18 E. coli con pSW07-68#5, se utilizó el protocolo de selección de temperatura descrito en el ejemplo 6 para seleccionar las cepas con la secuencia T7-lac-ScGNA1 integrada en el sitio manXYZ. Se clasificaron las cepas sensibles a kanamlcina mediante PCR con respecto a la presencia de la cinta T7lac-ScGNA1 en el reguión fue. Las cepas se confirmaron mediante hibridación Southern utilizando condiciones estándar altamente estrictas, y la secuencia de codificación ScGNAl como una sonda. La cepa resultante con una copia de T7ac-ScGNA1 fue designada como 7107-92. Integración de una segunda copia de GNA1 en el sitio fuclK: Se dirigió la integración de una segunda copia de la cinta T7 lac-ScGNA1 a la región del cromosoma que codifica las enzimas implicadas en la utilización de L-fucosa, como una fuente de carbono alternativa. Los genes fucP (que codifican permeasa L-fucosa), fuel (que codifica isomerasa L-fucosa), fucK (que codifica cinasa L-fuculosa) y fucU (proteína no conocida), forman un operón implicado en la desasimilación de L-fucosa. El gen fucR codifica una proteína reguladora que activa el reguión de desasimilación L-fucosa.

La integración de la cinta T7 lac-ScGNA1 del operón de fucosa, no deben afectar la capacidad de E. col] para crecer en un medio con glucosa como la fuente de carbono, ni deben afectar su capacidad para sintetizar N-acetilglucosamina. Como parte de la estrategia para desarrollar un vector de integración para el objetivo de la región fue, se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada del reguión de fucosa (Chen y Asociados, Mol. Gen. Genet. 1987, 210:331-37). Se amplificaron los genes fuclKU y fucR a partir de ADN genómico E. coli W3110 bajo condiciones PCR estándar utilizando los cebadores 07-113 y 07-114, los cuales tienen las siguientes secuencias: 07-113: 'GATGCGGCCGCGCAAGGCAACAGCAAACTGGC-3' (SEQ ID NO.:70) y 07-114: 5'-GATCGGATCCTCAGGCTGTTACCAAAGAAGTTGCAACCTGGC-3' (SEQ ID NO. :71). El cebador 07-113 que contiene el sitio de endonucleása de restricción Not I (GCGGCCGC, representado en los nucleótidos 4 a 11 de la SEQ ID NO:70) y se amplifica a partir de la corriente descendente 824 pb del codon de inicio ATG fucl (representado en los nucleótidos 12 a 32 de la SEQ ID NO:70). El cebador 07-114 contiene un sitio BamH I (GGATCC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:71) seguido de 32 nucleótidos de la secuencia de codificación fucR que comienza en su codon de detención de traducción (representado en nucleótidos 11 a 42 de la SEQ ID NO 71). El PCR se llevo a cabo bajo condiciones estándar para generar un fragmento que contiene la secuencia fuclKU y fucR mediante los sitios de endonucleasa de restricción BamH I y Not I. Este fragmento fue ligado en pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) generando el plásmido pSW07-75. El plásmido pSW07-75 fue digerido con las endonucleasas de restricción Hpa I y BsrG I , eliminando un fragmento de 1239 pares base que contiene una parte de los genes fucl y fucK. Se amplificó la cinta T7lac-ScGNA1 mediante PCR a partir del plásmido pSW07-62#25 utilizando condiciones estándar. Se llevo a cabo la amplificación PCR con el cebador de avance 07-115 y el cebador inverso 07-112 , los cuales tienen las siguientes secuencias :07-115: 'GATCTGTACAAGCAACCGCACCTGTGGC3' (SEQ ID NO:72) y 07-112: 5'GATCAGCGCTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAA CCCC3'). (SEQ ID NO:73). El cebador 07-115 contiene un sitio BsrG I (TGTACA, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO 72) y se amplifica a partir de la corriente ascendente de 76 pares base de la secuencia promotora T7 de pSW07-62#25 .El cebador 07-112 contiene un sitio Afe I (AGCGCT, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO 73) y se amplifica a partir de la corriente descendente de 25 pares base de la secuencia terminadora T7 de pSW07-62#25. Se digirió el fragmento PCR con BsrG I y Afe I y se ligó en los sitios BsrG I y Hpa I del plásmido pSW07-75, generando el plásmido pSW07-76. El plásmido recombinante contenía la cinta T7lac-ScGNAI ligada en el sitio de la eliminación fuclK.

Para crear un vector de integración sensible a la temperatura, se cortó un fragmento que contiene el replicón sensible a la temperatura de pMAK705 (Hamilton y asociados, 1989, J. Bac. 171(9): 4617-4622, incorporado en su totalidad a la presente invención como referencia) y la cinta de resistencia a kanamicina del plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), a partir del plásmido pKLN07-21 utilizando las enzimas de restricción Not I y Kpn I. Se construyó el plásmido pKLNO.7-21 mediante amplificación PCR del replicón sensible a la temperatura procedente del plásmido pSW07-4 (descrito en el Ejemplo 6), ligadura del producto PCR dentro del vector pPCR-Script™SK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), y la adición de la cinta de resistencia a kanamicina procedente dei plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Se utilizaron las enzimas de restricción Not I y Kpn I para cortar el fragmento que tiene el T7lacScGNAI más la región de flanqueo fue procedente del plásmido Psw07-76. Posteriormente este flanqueo fue ligado con el fragmento Not ?/??? I que contienen el origen de réplica sensible a la temperatura y el marcador de resistencia a kanamicina procedente de pKLN07-21, generando ei plásmido pSW07-77. Este plásmido tuvo un origen de réplica sensible a la temperatura, un marcador de selección de kanamicina y una cinta de expresión T7lac-ScGNAI que está flanqueada por las secuencias de corriente ascendente 5' y corriente descendente 3' del reguión fue. Se puede utilizar el plásmido pSW07-77 para dirigir la integración de la cinta T7-lac-ScGNAl y el reguión fue de E. coli. Se transformó el plásmido pSW07-77 en la cepa 7107-92#1. Se utilizó el protocolo de selección de temperatura para seleccionar las cepas con la secuencia T7-lac GNAI integrada en el sitio AfuclK. Las cepas resultantes fueron designadas como 7107-607(2), 7107-607(3), y 7107-607(4). Integración de una tercera copia de GNAI en el sitio treB: Se dirigió la integración de una tercera copia de la cinta T7-lac-ScGNAI a la región del cromosoma que codifica las enzimas implicadas en la utilización de trealosa como una fuente de carbono alternativa. Los genes treB y treC, que codifican el transportador de trealosa y la hidrolasa de trealosa-6-? respectivamente, forman un operon. El gen treR codifica la proteína represora que controla el operon, el cual es inducible mediante trealosa-6-fosfato (Horlacher, R., y Boos, W., 1997, J. Biol. Chem, 272(20): 13026-13032). Como con los objetivos anteriores, la integración de T7lac-ScGNAI en el reguión de trealosa no debe afectar la capacidad de E. coli para crecer en un medio con glucosa como la fuente de carbono, ni debe afectar su capacidad para sintetizar N-acetilglucosamina. Como parte de la estrategia para desarrollar un vector de la integración para dirigir la región treB, se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada para amplificar los genes treR, treB, y treC procedentes del ADN genómico E. coli W3110 (Blattner y asociados, 1997, Science 227 (5331): 1453-1474). Se llevó a cabo amplificación PCR utilizando los cebadores 07-117 y 07-118, la cual tiene las siguientes secuencias: 5'GAGCGGCCGCATGCAAAATCGGCTGACCATC3' (SEQ ID NO:74) y 07-118: 5'GATCGGGCCCTTACTTCTGTAACCACCAGACAGCCTC3' (SEQ ID NO:75). El cebador 07-117 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Not I (GCGGCCGC, representado en los nucleótidos 3 a 10 de la SEQ ID NO:74) seguido de 21 nucleótidos de la secuencia de codificación treR procedente de su codon de inicio ATG (representado en los nucleótidos 11 a 31 de la SEQ ID NO:74). El cebador 07-118 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Apa I (GGGCCC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:75) seguido de 27 nucleótidos de la secuencia de codificación treC que comienza en su codon de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 37 de la SEQ ID NO:75). Se llevó a cabo amplificación PCR utilizando un protocolo estándar para generar un fragmento de ADN que contiene los genes treR, treB, y treC flanqueados por los sitios de restricción Not I y Apa I. Se ligó el producto PCR de 4.2 kb en el plásmido pPCR-Scr¡pt™SK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), creando el plásmido pSW07-78#20. El plásmido pSW07-78#20 fue digerido con endonucleasa de restricción Bgl II y se trató con polimerasa de ADN T4 bajo condiciones estándar para hacer romos los extremos del fragmento. El fragmento romo se digirió posteriormente con la endonucleasa de restricción BsrG I. Esta doble digestión con Bgl II y BsrG I eliminó una región de 130 pares base de la secuencia de codificación treB procedente del plásmido pSW07-78#20, dejando el fragmento de plásmido con un extremo pegajoso (BsrG I) y un extremoblunt. El siguiente paso fue ligar la cinta T7lac-ScGNA1 en el sitio BsrG I y Bgl II (lleno) de plásmido pSW07-78#20. Para lograr esto, se amplificó la cinta T7lac-ScGNA1 mediante PCR procedente del plásmido pSW07-62#25 bajo condiciones estándar utilizando el cebador de avance 07-115 (SEQ ID NO:72) y el cebador inverso 07-112 (SEQ ID NO:73). El cebador 07-115 contiene un sitio BsrG I (TGTACA, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO: 72) y se amplifica a partir de la corriente ascendente de 76 pares base de la secuencia promotora 11 de pSW07-62#25. El cebador 07-112 contiene un sitio Afe I (AGCGCT, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:73) y se amplifica a partir de la corriente descendente de 25 pares base de la secuencia terminadora T7 de pSW07-62#25. El fragmento PCR fue digerido con BsrG I y Afe I y se ligó en el sitio BsrG I y Bgl II (lleno) del plásmido pSW07-78#20, generando el plásmido pSW07-83. Para crear un vector de integración sensible a la temperatura, se cortó un fragmento que contiene el replicón sensible a temperatura de pMAK705 (Hamilton y asociados, 1989, J. Bac. 171(9): 4617-4622, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia) y la cinta de resistencia a kanamicina del plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a partir del plásmido pKLN07-21 utilizando las enzimas de restricción Not l y Apa I. Se utilizaron las enzimas de restricción Not I y Apa l para cortar el fragmento que contiene el T7lacScGNAI además de la región de franqueo tre procedente del plásmido pSW07-83. Este fragmento se ligó con el fragmento Not I y Apa I procedente del plásmido pKLN07-21 que contiene el origen de réplica sensible a la temperatura y el marcador de resistencia a kanamicina, ciando como resultado el plásmido pSW07-84. El plásmido pSW07-84 puede utilizarse para dirigir la integración de la cinta T7-lac-ScGNAI en el treB de E. col i. El plásmido pSW07-84#1 se transformó en las cepas 7107-607(2), 7107-607(3), y 7107-607(4). Se utilizó el protocolo de selección de temperatura para seleccionar las cepas con la secuencia T7-lac GNAI integrada en el sitio treB. Se clasificaron colonias sensibles a kanamicina mediante PCR para la presencia de la cinta T7lac-ScGNAI en el tre B del cromosoma. Se confirmaron las cepas mediante hibridación Southern utilizando condiciones estándar altamente estrictas y la secuencia de codificación ScGNAl como una sonda, que tiene tres copias de la cinta T7lac-ScGNAl integrada en el cromosoma. Estas cepas se designaron como 7107-608(1) y 7107-608(2). Integración de una cuarta copia de GNA1 en el sitio meIRAB: Se dirigió la integración de una cuarta copia de la cinta T7lac-ScGNAI en las cepas de producción NAG a la región meIR y melAB del cromosoma. En E. coli, esta región codifica proteínas implicadas en la captación e hidrólisis de melibiosa. Los genes melA y melB, que codifican galactosidasa alfa y permeasa de melibiosa II, respectivamente, forman un operon. El gen meIR transcritos en forma divergente codifica el regulador del operon de melibiosa. Como con los objetivos previos para integración, la integración de la cinta T7lac-ScGNA1 en melAB del genoma, no debe afectar la capacidad de E. coli para crecer en un medio con glucosa como la fuente de carbono, ni debe afectar su capacidad para sintetizar N-acetilglucosamina. Como parte de la estrategia para desarrollar un vector de integración para dirigir la región melAB, se sintetizaron los cebadores 07-122 y 07-123 con base en la secuencia publicada de los genes meIR, melA y melB de E. coli (Blattner y asociados, 1997, Science 277(5331), páginas 1453-1474). Se llevó a cabo PCR bajo condiciones estándar para amplificar un fragmento que contiene los genes meIR, melA y melB procedente de ADN genómico E. coli W3110. El cebador de avance 07-122 y el cebador inverso 07-123 tienen las siguientes secuencias: 07-122: 'GATGCGGCCGCTTAGCCGGGAAACGTCTGGCGGC3' (SEQ ID NO:76) y 07-123: 'GATCGTCGACTCAGGCTTTCACATCACTCACTGCACC3' (SEQ ID NO:77). El cebador 07-122 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Not I (GCGGCCGC, representado en los nucleótidos 4 a 11 de la SEQ ID NO:76) seguido de 23 nucleótidos de la secuencia de codificación meIR que comienza a partir del codon de detención de traducción (representado en los nucleótidos 12 a 34 de la SEQ ID NO:76). El cebador 07-123 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Sal I (GTCGAC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:77) seguido de 27 nucleótidos de la secuencia de codificación melB que comienza a partir del codon de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 37 de la SEQ ID NO:77). El fragmento PCR que contiene las secuencias de codificación meIR y melAB flanqueado por los sitios de endonucleasa de restricción Not I y Sal I fue ligado en el vector pPCR-Script Amp SK (+) (Stratagena), generando el plásmido pSW07-81#5. El siguiente paso en la construcción del vector, fue ligar la cinta T7lac-ScGNAI en la región melAB del plásmido pSW07-81#5. El plásmido pSW07-81#5 fue digerido con las endonucleasas de restricción bgl II y AsiSI, eliminando un fragmento de 1676 pares base que contiene toda la secuencia de codificación melA y los primeros 199 nucleótidos de la secuencia de codificación melB. Se amplificó la cinta T7lac-ScGNAI mediante PCR a partir del plásmido pSW07-62#25 bajo condiciones estándar con el cebador de avance 07-124 y el cebador inverso 07-125, los cuales tienen las siguientes secuencias: 07-124: 5'GATGGATCCAGCAACCGCACCTGTGGC3' (SEQ ID NO:78) y 07-125: 5'GATGCGATCGCTATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCC3' (SEQ ID NO:79). El cebador 07-124 contiene un sitio BamH I (GGATCC, representado en los nucleótidos 4 a 19 de la SEQ ID NO:78) y se amplifica a partir de la secuencia de la corriente ascendente de 76 nucleótidos del promotor T7 del plásmido pSW07-62#25. El cebador 07-125 contiene un sitio AsiS I (GCGATCGC, representado en ios nucleótidos 4 a 11 de la SEQ ID NO:79) y se amplifica a partir de la secuencia ascendente de 18 nucleótidos del promotor T7 del plásmido pSW07-62#25. El producto PCR que contiene T7lac-ScGNAI se digirió con las endonucleasas de restricción BamH I y AsiS I y se ligó con el fragmento Bgl II y AsiS I procedente de pSW07-81#5, generando el plásmido pSW07-82. El plásmido pSW07-82 contuvo por lo tanto, los genes mel en el vector pPCR-Script (A pSK(+), con la región melAB de 1676 pares base reemplazada con la cinta T7lac-ScGNAI. Para crear un vector de integración sensible a temperatura, se cortó un fragmento que contiene el replicón sensible a la temperatura de pMAK705 (Hamilton, y asociados, 1989, J. Bac. 171(9): 4617-4622, incorporado en su totalidad a la presente invención como referencia), y la cinta de resistencia a kanamicina del plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), a partir del plásmido pKLN07-21 utilizando las enzimas de restricción Not I y Sal I. Se digirió el plásmido pSW07-82 con endonucleasa de restricción Not I y Sal I que aislan el fragmento que contiene los genes mel interrumpidos con la cinta T7lac-ScGNAI. Este fragmento se ligó posteriormente con el fragmento Not I y Sal I procedente del plásmido pKLN07-21 que contiene el origen de réplica sensible a la temperatura y el marcador de resistencia a kanamicina. El plásmido resultante pSW07-84 se puede utilizar para dirigir la integración de la cinta T7-lac-ScGNAl en melAB de E. co/i. Se transformó el plásmido pSW07-84 en las cepas 7107-608(1) y 7107-608(2). Se utilizó el protocolo de selección de temperatura descrito en el ejemplo 6, para seleccionar cepas con la secuencia T7-iac-GNAI integrado en el sitio melAB. Se clasificaron colonias sensibles a kanamicina mediante PCR con respecto a la presencia de la cinta T7lac-ScGNAI en melAB del cromosoma. Se confirmaron las cepas mediante hibridación Southern utilizando condiciones altamente estrictas estándar con la secuencia de codificación ScGNAl como la sonda que tiene cuatro copias de la cinta T7-lacScGNAl integradas en el cromosoma. Estas cepas resultantes, derivadas de 7107-608(1), y 7107-612(2) fueron designadas como 7107-612 y 7107-613, respectivamente. El plásmido pSW07-84 también fue transformado en ias cepas 7107-607(2), 7107-607(3), y 7107-607(4) para agregar una tercera copia de T7lac-ScGNAI al cromosoma. Las cepas fueron clasificadas tal como se indicó anteriormente y confirmadas mediante hibridación Southern utilizando condiciones estándar altamente estrictas, con la secuencia de codificación ScGNAl como una sonda que tiene tres copias de la cinta T7lac-ScGNAI integradas en el cromosoma. Estas cepas, derivadas de las cepas 7107-607(2), 7107(3), y 7107-607(4), fueron designadas como 7107-609, 7107-610 y 7107-611, respectivamente. Efectos del número de copias del gen GNA1 en los niveles de expresión GNA1 y en la producción de N -acetilglucosamina. Para evaluar el efecto del número de copias del gen en los niveles de expresión GNA1 y en la producción de N-acetilglucosamina, se probaron en frascos de agitación cepas con diversos números de copias de la cinta T7lac-ScGNAI integrada. Se tomaron muestras para analizar la expresión de la proteína GNA1 mediante el ensayo de actividad enzimática y determinación de tituladores NAG. Se llevó a cabo una clasificación en frasco de agitación 53 para evaluar el efecto del número de copias de la cinta 17-lac-ScGNAl integrada en la actividad de sintasa de glucosamina (GlmS), actividad de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato (GNA1) y la producción de N-acetilglucosamina. Las cepas se crecieron en un medio M9B (descrito previamente) suplementado con 0.6 g de MgS04-7H20 r , 0.05 g de CaCI2-2 H20 V 10 g de glucosa V 40 g de lactosa 5 g de ribosa 1"1 y 5 g de extracto de levadura 1~1. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C durante las primeras 24 horas y posteriormente se colocaron a 25°C. En los puntos de tiempos de 24 y 48 horas, se ajustó el pH de los cultivos, a 7.2, se agregó glucosa a cada frasco a 30 g T por día en total, con base en los resultados HPLC y se hicieron adiciones de sulfato de amonio de 5 g 1"1 a los frascos con niveles de amonio debajo de 1 g 1~1. Se eliminaron muestras a las 24, 48 y 72 horas para evaluar la producción NAG y los ensayos enzimáticos. Todas las cepas probadas crecieron a un ??ß?? comparable y tuvieron actividad de sintasa de glucosamina comparable (tabla 18). Existió una correlación notable entre la actividad de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato y el número de copias de T7-lac-ScGNAI , teniendo las cepas que contienen tres copias la mayor actividad específica. Sin embargo, esta actividad específica incrementada no dio como resultado una producción en NAG incrementada en el experimento con el frasco de agitación.

Tabla 18. Comparación de crecimiento, actividad enzimática y producción GIcNAc en cepas con copias múltiples de la cinta T7-lac-ScGNA1.

Cepa Número de Aeoo Actividad de Enzimática GIcNAc copias GNA1 Glms GNA1 <gi-1) 7107-92(1) 1 12.0 0.59 3.0 30.0 7107-607(2) 2 12.0 0.59 5.8 28.8 7107-608(1) 3 12.8 0.55 9.1 29.3 7107-608(2) 3 13.5 0.43 7.9 29.7 7107-609(1) 3 11.3 0.37 8.2 24.7 7107-610(1) 3 12.0 0.40 8.4 26.3 7107-611(1) 3 12.0 0.44 7.4 26.4 1) Se determinaron las actividades enzimáticas y los niveles de N-acetilglucosamina a partir del punto de tiempo de 72 horas. 2) Se expresó la actividad enzimática en µ???? de proteína min"1, mg"1. 3) Los números en los paréntesis indican diferentes hermanos. Evaluación de cepas con diversos números de copias de la cinta T7lac-ScGNA1 integrada en fermentadores de 1 litro Se evaluaron las cepas 7107-92(1), 7107-607(2), y 7107-608(2), y 7102-612(1), que contienen la cinta T7lac-ScGNA integrada en un número de copias que fluctúa de 1 a 4, respectivamente, en fermentadores de 1-L. Los fermentadores 237-240 se prepararon con un volumen inicial de 475 mi. Los componentes del medio de fermentación se describen en la tabla 19. Las fermentaciones se corrieron utilizando 75% de NH4OH para controlar el pH a 6.9. Se mantuvo la temperatura a 37°C durante la fermentación. Se ajustó la aireación y agitación para mantener una concentración de oxígeno disuelto del 20% de saturación de aire. Se alimentó a los cultivos el 65% de glucosa con un rango de alimentación controlado mediante un programa de computadora para lograr un rango de 0.40 hr"1 en inoculación y un rango máximo de 5 mi hr"1 en 6 horas. Se indujeron cultivos con lactosa de grado alimenticio la cual se agregó a 5 g 1~1 en 10 horas, con alimentación de glucosa continua.

Tabla 19. Medio de fermentación utilizado para probar los efectos del número de copias GNA1 en la producción de N-acetilglucosamina.

Componente Cantidad (g G) ?3??4 4.79 KOH 3.15 Ácido Cítrico -H20 3.56 (NH4)2S04 5 Mg SO4-7 H20 2.5 CaCl2-2 H20 0.05 Oligometales * Antiespuma Mazu 204 0.25 * La composición de oligometales es de 5 m FeS04-7H20 1~1, 3.75 mg ZnS04-7H20 V 6 mg de MnS0 -H20 G1 , 0.1002 mg de CuS04-5H20 1"1 y 0.1002 mg de CoCI2-6H20 r1. Los resultados de la fermentación se resumen tal como se indica a continuación. El número de copias de la cinta GNA1 tiene un efecto ligero en los niveles NAG. A través del método de fermentación, la cepa 7107-608(2), que contiene tres copias de la cinta T7lac-ScGNA1 produjo 16% más NAG que la cepa con un copia y 5% más de NAG que la cepa con dos copias de la cinta. En este experimento, la adición de la cuarta copia de T7lac-ScGNA1 no logró una mejoría con respecto a la cepa 7107-608(2). Sin embargo, ha sido validada la utilidad de incrementar el número de copias T7-lac-ScGNA1 en las cepas de producción. Ejemplo 17 El ejemplo que se encuentra a continuación describe los efectos de azúcares fosforilados en sintasa de glucosamina. Se examinó la actividad de sintetasa de glucosamina en la presencia de diversos azúcares fosforilados. Se prepararon extractos de enzimas crudas a partir de las células 7017-18, crecidas en frascos de agitación durante 24 horas con inducción mediante lactosa. Los resultados se resumen en la tabla 20 que se encuentra a continuación. Los datos indican que la glucosamina-6-? observada anteriormente mostró una fuerte inhibición en la sintetasa de glucosamina en una concentración relativamente alta. La glucosamina-1 -P también inhibió la enzima en 10 mM. No se observó inhibición con los fosfatos de N-acetiiglucosamina.

Tabla 20. Efectos de diferentes azúcares fosforilados en la sintasa de glucosamina E. coli GlmS*54 Adición (%) Actividad Control 100 gIucosamina-6-? (10 m ) 70 gIucosamina-6-? (20 mM) 46 glucosamina-1-? (10 mM) 79 N-acetilglucosamina-6-? (10 mM) 100 N-acetilglucosamina-6-? (20 mM) 100 N-acetiIgIucosamina-1-? ( 0 mM) 100 Ejemplo 18 Este ejemplo describe los efectos bioquímicos de los azúcares fosforilados en otras enzimas relevantes para la síntesis de N-acetilglucosamina. Las descripciones previas con respecto a los efectos tóxicos potenciales de los azúcares fosforilados (compuestos tales como glucosamina-6-?) han sido limitadas a las enzimas que están directamente implicadas en el metabolismo de los aminoázucares. Sin embargo, el fenómeno general de la toxicidad de azúcar, ha sido observado ampliamente en diversos mutantes que se dañan en el metabolismo de azúcar. Esto se ha atribuido generalmente a la acumulación de niveles anormalmente altos de intermediaros de azúcar fosforilada que inhiben uno o más objetivos enzimáticos y envenenan metabólicamente la célula. La inhibición del producto de GlmS es un ejemplo de esto. La figura 3 sugiere un número de posibilidades para otros objetivos posibles. Un documento (J. Bacterial. 101: 384, 1970) que trata de los mutantes dañados en el metabolismo de aminoazúcares, describe este fenómeno y muestra que los azúcares de pentosa pueden invertir la inhibición. Por consiguiente, se examinaron los efectos de glucosamina-6-? y N-acetilglucosamina-6-? en diversas de las enzimas. La glucosamina-6-? se reportó como un inhibidor de Pgi en la publicación (Arch. Biochem. Biophys. 64: 489. 1956). La figura 15 muestra Pgi (inhibición de fosfoglucoisomerasa mediante dos aminoázucares). Se observó inhibición con ambos de los compuestos, aunque significativamente menos con N-acetilglucosamina-6-?. La glucosamina-6-? se reportó como un inhibidor de fosfoglucoisomerasa (J. Biol. Chem. 216: 67. 1955). La figura 16 muestra los efectos de aminoázucares fosforilados en la deshidrogenasa de glucosa-6-? (zwf), el punto de entrada de la glucosa-6-? en la trayectoria de fosfato de pentosa. Aquí nuevamente la glucosamina-6-? parece ser un inhibidor más potente de la enzima que N-acetilglucosmaina-6-?. Se observaron tendencias similares con fosfoglucomutasa (Pgm). El efecto inhibidor de glucosamina-6-? en las enzimas antes mencionadas y posiblemente en otras enzimas implicadas en el metabolismo de carbohidratos, pueden ser ciertamente una explicación de la aparente elevación en la productividad de glucosamina observada en 7017-18. Presumiblemente, las altas concentraciones de glucosamina-6-P interfieren con la actividad de diversas enzimas. Además la adición de acetiltranferasa (GNA1) a la trayectoria, conduce presumiblemente a niveles intracelulares muy bajos de glucosamina-6-?. Esto ciertamente podría ser la principal razón de la productividad incrementada junto con la estabilidad mejorada de la N-acetilglucosamina. La N-acetilglucosamina-6-? no inhibe en forma significativa Zwf y Pgi en los ensayos in vito llevados a cabo. Los efectos positivos de ribosa y gluconato en el crecimiento celular y la síntesis de N-acetilglucosamina, sugiere que uno o más pasos en la trayectoria de fosfato de pentosa, se ven afectados por los aminoázucares fosforilados. Por otra parte, la N-acetiltransferasa de glucosamina no mostró inhibición del producto significativa mediante N-acetilglucosamina-6-?. Ejemplo 19 Este ejemplo describe actividades enzimáticas durante la producción de N-acetilglucosamina en fermentadores. Se examinaron diversas actividades enzimáticas relevantes para la producción de N-acetilglucosamina en fermentadores. Las enzimas ensayadas fueron sintasa de glucosamina (GlmS), N-acetiltransferasa de glucosamina (GNA1) y deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, la cual es una enzima clave en la trayectoria de fosfato de pentosa (ver figura 3). Cepas con plásmidos GNA1 (fermentador #102): Se examinó la actividad enzimática relevante en muestras de 7017-87(25) procedentes de las fermentaciones 102. Esta cepa contiene la construcción del gen de acetiltransferasa en plásmidos. Esta corrida produjo 80 g/l de N-acetilglucosamina. Los resultados de las actividades enzimáticas y concentraciones de N-acetilglucosamina se muestran en la figura 17. Se observó una actividad de acetiltransferasa superior inmediatamente después de la inducción y permaneció superior a lo largo de la corrida. Es interesante que la actividad acetiltransferasa, estuvo presente incluso en 90+ horas, en tanto que en este tiempo desapareció la actividad de sintetasa de glucosamina. La producción de N-acetilglucosamina finalizó esencialmente alrededor de 70 horas. La actividad de deshidrogenasa de glucosa-6-? fue constante a lo largo de la corrida. Cepas con construcciones GNA1 integradas (fermentadores #121-128) Esta corridas utilizaron la cepa 7017-92(1) E. coíi que contiene la construcción de acetiltransferasa integrada. Las variables de fermentación examinadas fueron cantidades de hierro agregadas en el medio, alimentación extra de hierro y niveles de regulador de fosfato (1X = 40 g V1). Las actividades enzimáticas se resumen en la tabla 21. Excepto para el nivel de hierro más bajo utilizado en la fermentación 121, las actividades de sintetasa de glucosamina y acetiltranferasa fueron muy altas a lo largo del experimento en los otros siete fermentadores. Tal como se observó anteriormente, la actividad de acetiltransferasa tiende a permanecer en un nivel alto. La actividad de sintetasa de glucosamina fue claramente adecuada en los otros niveles de hierro (5 a 20 PPM), examinados con o sin alimentación de hierro adicional. El hierro inferior produjo una actividad de N-acetilglucosamina más alta aunque una menor actividad de sintetasa de glucosamina. Esta actividad disminuida, aún fue adecuada para una alta producción de N-acetilglucosamina.

Tabla 21. Actividades enzimáticas en fermentación de N-acetilglucosamina (termentadores del 121 al 128).

Muestra Horas GlmS GNA1 [NAG] Hierro Alimentación Fosfato (µp??? de proteína min-1, mg-1) (g G1) (mg I"1) Fe 121-2 24 0.0 0.0 7.1 2.5 + 1X 121-5 46 0.0 0.5 23 121-7 70 0.0 0.6 29 122-2 24 0.0 0.0 6.0 5 + 1X 122-5 46 0.43 5.7 56 122-7 70 0.40 6.3 88 122-8 95 0.18 5.5 88 123-2 24 0.0 0.0 5.7 10 + 1X 123-5 46 0.81 7.5 49 123-7 70 0.99 10 77 124-2 24 0.0 0.0 6.0 20 + 1X 124-5 46 0.81 5.4 50 124-7 70 0.95 6.5 76 125-2 24 0.0 0.0 5.8 5 - 1X 125-5 46 0.43 5.2 57 125-7 70 0.30 5.7 92 126-2 24 0.0 0.0 7.0 10 - 1X 126-5 46 0.57 3.7 68 126-7 70 1.0 5.5 83 127-2 24 0.0 0.0 4.3 20 1X 127-5 46 0.61 5.1 49 127-7 70 0.80 5.7 78 128-2 24 0.0 0.0 7 10 + 0.2X 128-5 46 0.49 7.7 44 128-7 70 0.63 10 69 Notas: 1) Los niveles de hierro en el medio son las cantidades de FeS04-7H20 (mg T1). 2) Se proporcionó alimentación de hierro en la alimentación de glucosa a 5 µg FeS04-7H20 por g de glucosa. 3) Niveles de fosfato: 1X = 40 g 1 fosfato de potasio. Ejemplo 20 Este ejemplo describe la ingeniería metabólica de Saccharomyces cerevisiae para la producción de glucosamina y N-acetilglucosamina. Particularmente, se clonaron los genes que codifican la sintasa de glucosamina resistente al producto, el gen E. Coli glmS*54 y Bacillus subtilis glmS, y S. cerevisiae GNA1 que codifica la N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato en vectores de expresión de levadura y se introdujeron en la levadura para una sobreexpresión. Los elementos importantes descritos en los ejemplos previos para la producción de glucosamina y N-acetilglucosamína y la sobreexpresión de la enzima GlmS resistente al producto y una enzima GNA1. En huéspedes que tienen un gen GNA1 nativo, tal como S. crevisiae y Candida albicans, que sobreexpresan un GlmS resistente al producto podrían conducir a un nivel incrementado de producción de N-acetilglucosamina. Sin embargo, los productos principales de aminoazúcar podrían ser glucosamina ó N-acetilglucosamina. Para producir N-acetilglucosamina como el producto principal, el gen GNA1 necesita ser sobre expresado. La degradación de glucosamina es el cuello de botella en los intentos para producir la glucosamina en un pH de fermentación neutral. Ya que algunas levaduras y bacterias, tales como S. cerevislae se adaptan a un pH relativamente bajo y crecen normalmente en un rango de pH de 4-5 en donde la glucosamina es estable, la sobreexpresión de una enzima GImS resistente al producto en este tipo de huésped, podría conducir al desarrollo de un proceso comercialmente viable para dirigir la producción de glucosamina. Además, ya que S. cerevisiae es un organismo GRAS y no produce endotoxinas, puede ser un huésped de fermentación preferido para producir glucosamina/N-acetilglucosamina para algunas aplicaciones de los productos. Clonación del gen glmS*54 mu tan te E. coli para la expresión en levadura El gen glmS*54 muíante de E. coli se clonó en el vector de expresión yEp352-ADH1. Este veclor se deriva de yEp352 (HUI y asociados, 1986 Yeasí 2: 163-167) ulilizando íécnicas esíándar. Se puede replicar a múlíiples copias por célula de levadura y contiene el promoíor y íerminador de deshidrogenasa de alcohol (ADH). El vecfor fiene un marcador de resislencia a ampicilina para la selección en E. coli y un marcador URA3 para la selección en levadura. Los cebadores de avance Nmd7107-021 y el cebador inverso nMD7107-022 fueron diseñados para amplificación PCR de la secuencia de codificación del gen glmS*54 muíanle E. coli. Los sitios de restricción se incorporaron en los extremos para facilitar la clonación. Se amplificó la secuencia de codificación glmS*54 mediante PCR bajo condiciones estándar, utilizando el cebador de avance nMD7107-021 (Sac I) y el cebador inverso nMD7107-022 (Hind III) que tienen las siguientes secuencias: nMD7107-021 (Sac I): 5'AGCTGAGCTCATGTGTGGAATTGTTGGCGCGA-3' (SEQ ID NO:80) y nMD7107-022 (Hind III): 5'-TACGAAGCTTACTCAACCGTAACCGATTTTGC-3' (SEQ ID NO:81). El cebador nMD7107-021 contiene 22 nucleótidos de la secuencia de codificación glmS*54 representado en los nucleótidos 11 a 32 de la SEQ ID NO:80, y el cebador nMD7107-022 contiene 24 nucleótidos de la secuencia de codificación glmS*54 representado en los nucleótidos 9 a 32 de la SEQ ID NO:81. Los plásmidos pKLN23-54 que contienen el gen glmS*54 E. coli (descrito en la Patente Norteamericana No. 6,372,457), se utilizaron en la forma de las plantillas de ADN en las reacciones PCR. Se generó una sola banda de productos PCR del tamaño esperado, bajo condiciones PCR estándar utilizando polimerasa Taq. Los productos PCR fueron digeridos con enzimas de restricción Sac I y Hind III, purificadas a través de gel de agarosa y clonadas en el vector yEP352-ADH-1 que fue digerido previamente con las mismas enzimas. Los productos de ligadura de ADN se transformaron en células Top 10 E. coli (obtenidas de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en selección de ampicilina.

Primero, se clasificaron 10 grupos de colonias (10 por grupo) mediante PCR, utilizando los cebadores de avance e inversos. Posteriormente, se identificaron clones individuales en grupos positivos mediante PCR, y se confirmaron mediante digestiones de restricción. Los plásmidos recombinantes MD7107-238 y MD7107-239, contenían el gen glmS*54 E. coli en la cinta de expresión de levadura con el promotor y terminador ADH. Los plásmidos recombinantes se transformaron en células de S. cerevisiae SWY5 de acuerdo con el método LiOAc descrito por Geitz y asociados (1995). La cepa de levadura tiene los marcadores de selección auxotrópicos ura e his. Se seleccionaron transformadores de levadura en placas de un medio SCE suplementado con L-histidina en 20 mg 1 (tabla 22). Las líneas celulares de levadura transformadas serán analizadas para determinar las actividades GlmS y GNA1 y los niveles de glucosamina y N-acetilglucosamina.

Tabla 22. Medio Sc-minus para crecimiento de levadura.

Componente Cantidad (g I'1) Base de nitrógeno de levadura sin aminoácido 67 (YNB) glucosa 20 L-arginina 0.02 L-metlonina 0.02 L-tirosina 0.03 L-isoleucina 0.03 L-lisina 0.03 L-fenilalanina 0.05 L-glutamato 0.1 L-asparato 0.1 L-valina 0.15 L-treonina 0.2 L-serina 0.4 Clonación del gen glmS B. subtilis para expresión en levad ura Se clonó el gen glmS tipo natural B. subtilis en el vector de expresión yEp352-ADH1. El cebador de avance nMD7107-023 y el cebador inverso nMD7107.024 se sintetizaron para amplificar la secuencia de codificación del gen glmS tipo natural B. subtilis. Los sitios de restricción se incorporaron en los extremos para facilitar la clonación. Se amplificó la secuencia de codificación glmS mediante PCR bajo condiciones estándar utilizando el cebador de avance nMD7107-023 y el cebador inverso nMD7107-024 que tienen las siguientes secuencias: Nmd7107-023 (Kpn I): 5'-AGCTGGTACCATGTGTGG AATCGTAGGTTATATC-3' (SEQ ID NO:82) y nMD7107-024 (Sph I): 5'- TACGCATGCTTACTCCACAGTAACACTCTTCGCA-3' (SEQ ID NO:83). El cebador nMD8107-023 contiene 24 nucleótidos de la secuencia de codificación glmS representada en los nucleótidos 11 a 34 de la SEQ ID NO:82, y el cebador nMD7107-024 que contiene 25 nucleótidos de la secuencia de codificación glmS representada en los nucleótidos 10 a 34 de la SEQ ID NO:83. El plásmido pSW07-15#83 que contiene el gen glmS Bacillus (plásmido descrito en el Ejemplo 2), se utilizó en la forma de las plantillas de ADN en las reacciones PCR. Se generó una sola banda de productos PCR del tamaño esperado bajo condiciones PCR estándar, utilizando polimerasa Taq. Los productos PCR fueron digeridos con enzimas de restricción adecuadas, purificadas a través de gel-agarosa y, clonadas en el vector yEP352-ADH-1 digerido previamente con las mismas enzimas. Los productos de ligadura de ADN se transformaron en células Top 10 E. coll (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en selección de ampicilina. Primero, se clasificaron 10 grupos de colonia (10 por grupo) mediante PCR utilizando los cebadores delanteros e inversos. Posteriormente, se identificaron clones individuales en grupos positivos mediante PCR y se confirmaron mediante digestiones de restricción. Los plásmidos MD7107-240 y MD7107-241 contenían el gen glmS Bacillus en la cinta de expresión de levadura con el promotor y terminador ADH. Se transformaron los plásmidos recombinantes en células de S. cerevislae SWY5. Se seleccionaron transformadores de levadura en placas de un medio SCE-minus suplementado con L-histidina en 20 mg 1~ . Se analizaron las líneas celulares de levadura transformadas para determinar las actividades GImS y GNA1, y los niveles de glucosamina y N-acetilglucosamina. Clonación de GNA1 S. cerevísiae para sobreexpresión en levadura El fragmento que contiene la secuencia de codificación ScGNAl fue digerido a partir del plásmido pSW07-60#3 (descrito previamente en el ejemplo 13), utilizando las endonucleasas de restricción EcoR I y Sac I. El fragmento resultante fue ligado en los sitios EcoR I y Sac I del vector de conexión pADH313-956. La clonación en esta forma coloca la secuencia de codificación ScGNAl entre el promotor y terminador ADH1. Este vector contiene un marcador de selección de histidina. Los plásmidos resultantes pSW07-114 (#1 y #18) se transformaron en células S. cerevisiae SWY5. Se seleccionaron transformadores de levadura en placas con un medio SCE-minus suplementado con uracil a 20 mg 1. Las líneas celulares de levadura transformadas, serán analizadas para determinar las actividades GImS y GNA1 y los niveles de glucosamina y N-acetilglucosamina.

Los plásmidos con la cinta de expresión ScGNAl también se transformaron en líneas de célula de levadura que ya han sido transformadas con la construcción glmS*54 E. coli o la construcción glmS Bacillus. Ejemplo 21 Este ejemplo describe la mutagénesls aleatoria de la cepa 7107-92 para E. coli para mejorar la producción de N-acetilglucosamina. La cepa 7107-92 (con T7-glmS*54 y T7-ScGNA1 integrado en el cromosoma, descrito en el ejemplo 16), fue mutagenizada con luz UV y se ensayaron 882 colonias aisladas con el bioensayo de auxotropo GlcN, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,372,457 B1. La cepa de auxotropo de glucosamina 2123-15 E. coli, se utilizó como la cepa indicadora. Con base en el tamaño halo, se seleccionaron 19 mutantes y se rayaron para aislamiento y se evaluaron nuevamente 5 colonias de cada uno. Dos cepas mutantes 7107-512 y 7107-513, mostraron los diámetros halo más grandes. Fueron guardados para evaluación en cultivos en frasco. Las cepas 7107-512 E. coli mutantes (ATCC No. ) y 7107-513 (ATCC No. ) se depositaron el 1 de Julio del 2003 con la Recolección de Cultivo Tipo Americano (ATCC), P.O Box 1549, Manassas, Virginia 20108, EUA, bajo los términos de Tratado de Budapest en el reconocimiento Internacional de Depósitos de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patentes. Los mutantes se compararon con la cepa paterna. Todas las cepas crecieron en un medio M9B con 5 g de ribosa 1"1 y 5 g de extracto de levadura 1~ bajo dos diferentes condiciones. Un grupo de cultivo se creció en un medio con 30 g de glucosa 1"1 y 0.2 mM de IPTG (inducción IPTG). El otro grupo de cultivo se creció en el medio con 10 g de glucosa 1"1 y 40 g de lactosa El cultivo se volvió inducido por lactosa una vez que la glucosa se eliminó (inducción mediante lactosa). Bajo inducción IPTG, la producción de N-acetilglucosamina mediante el muíante 7107-512 fue comparado con la cepa paterna. El muíante 7107-513 produjo más glucosamina que la cepa paíerna, 36% más en un punió de íiempo de 71 horas. Tal como se observó anteriormente, la cepa paterna produjo mayores niveles de N-aceíilglucosamina bajo inducción medianíe lacíosa que bajo inducción medíanle IPTG. Dos muíantes produjeron el mismo nivel de glucosamina, el cual fue de aproximadamente el 28% más que la cepa paterna en el punto de tiempo de 71 horas. Los lugares loci de las muíaclones no se delerminaron y los mecanismos de la producción de N-acetilglucosamina mejorada en los muíanles, no se conoce. Ya que únicamenle se clasificaron aproximadamenle 900 clones de muíanles, los dalos demuestran claramente el potencial para mejorar en forma adicional el huésped de producción mediante mutagénesis aleatoria. Tabla 23. Producción de N-acetilglucosamina en mutantes con luz UV N-acetilglucosamina (g I"1) Experimento Cepas 23 horas 47 horas 71 horas Inducción mediante IPTG 7107-92 7.2 11.8 13.8 7107-512 7.0 12.0 13.0 7107-513 7.2 14.6 18.7 Inducción mediante lactosa 7107-92 4.7 13.3 23.3 7107-512 8.0 19.0 29.9 7107-513 7.1 17.4 29.8 Ejemplo 22 El ejemplo que se encuentra a continuación describe la generación de una cepa de producción NAG mutante con una eliminación pfkA, de modo que la producción puede desacoplarse del crecimiento. La fosfofructocinasa es una enzima reguladora principal en la glucólisis que cataliza la formación de fructosa-1 ,6-bifosfato a partir de fructosa 6-fosfato (F-6-P). La fosfotructocinasa importante en E. col!, codificada mediante pfkA proporciona el 90% de la actividad de fosfofructocinasa. El restante 10% de la actividad, es suministrado por la fosfof rutocinasa menor, codificada por pfkB. En cepas de producción NAG, el GlmS*54 sobre expresado cataliza la conversión de F-6-P a glucosamina-6-fosfato (GlcN-6-?), el cual posteriormente se puede convertir a GlcNAc-6-? a través de la acción de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato (GNA1) procedente de Saccharomyces cerevisiae. La racionalidad para los experimentos descritos en el ejemplo 22 es tal como se describe a continuación. El crecimiento de una cepa muíante pfkA en una combinación de fuentes de carbono (por ejemplo glucosa y fructosa) puede permitir que el crecimiento sea desacoplado de la producción NAG. Ya que los mutantes pfkA no crecen bien con glucosa como la fuente de carbono, se puede utilizar fructosa para el crecimiento celular. La fructosa importada podría convertirse en fructosa-1 ,6-bifosfato a través de las acciones de los productos del gen fruA y fruK, permitiendo su entrada en la trayectoria glucolítica. La glucosa podría ser fosforilada al momento de su captación, y la glucosa-6-fosfato resultante a F-6-P mediante el producto de gen pgi, isomerasa de fosfoglucosa. Con la eliminación del gen pfkA, únicamente la isoenzima PfkB menor puede ser la responsable de la conversión de F-6-P a F- ,6-bifosfato. La conversión puede volverse restringida. Como consecuencia, pueden existir cantidades incrementadas de F-6-? disponibles para conversión a gIucosamina-6-fosfato mediante el GlmS*54 sobreexpresado. Por consiguiente, la eliminación de pfkA puede reducir el flujo de F-6-P en la trayectoria glucolítica, permitiendo desviar potencialmente más carbono hacia la producción de glucosamina. En cepas de producción que sobreexpresan el ScGNA , esto puede resultar al final en tituladores NAG superiores. Generación de cepas de eliminación pfkA Se agregó la eliminación pfkA al genoma de la cepa de producción, utilizando el método de selección sensible a la temperatura. Esto requirió la construcción de un vector de integración para dirigir la región pfkA para eliminación. El primer paso en la construcción del vector fue amplificar la secuencia que contiene la secuencia de codificación pfkA además de las regiones de flanqueo procedentes del ADN genómico E. coli W3110. Los cebadores se sintetizaron con base en la secuencia publicada del pfkA además de las regiones de flanqueo procedentes del genoma E. coli (Blattner y asociados, 1997, Science 277 (5331): 1453-1474). Los cebadores que se utilizaron para la amplificación PCR fueron el cebador de avance 07-89 y el cebador inverso 07-90 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-89: 5'GAGCGGCCGCATGAATCAATCTTATGGACGGC3' (SEQ ID NO:86) y 07-90: 'GAGTCGACTCAGCGTTTGCTFATCTFATCGAACGTAC3' (SEQ ID NO:87). El cebador 07-89 contiene un sitio Not I (GCGGCCGC, representado en los nucleótidos 3 a 10 de la SEQ ID NO:86) y amplifica el codon de inicio ATG de la secuencia de codificación yiiP, localizados en la corriente ascendente de 1083 pares base del codon de inicio ATG pfkA (representado en los nucleótidos 11 a 32 de la SEQ ID NO:86). El cebador 07-90 contiene un sitio Sal I (GTCGAC, representado en los nucleótidos 3 a 8 de la SEQ ID NO: 87) y se amplifica a partir del codon de detención de traducción de la secuencia de codificación sbp, localizada en la corriente descendente de 1310 pares base del codón de detención pfkA (representado en los nucleótidos del 9 al 37 de la SEQ ID NO:87). El PCR se llevó a cabo utilizado un protocolo estándar para generar el fragmento que contiene las secuencias de codificación yiiP, pfkA, y sbp flanqueadas por los sitios de endonucleasa de restricción Not I y Sal I. Este fragmento se clonó en el vector pPCR-ScriptAMPSK( + ) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) utilizando materiales e instrucciones suministradas por el fabricante. El plásmido resultante se designó como pSW07-61. Para generar un vector de integración sensible a la temperatura, se cortó un fragmento que contiene el replicón sensible a la temperatura de pMAK705 (Hamilton y asociados, 1989, J. Bac. 171(9): 4617-462) y la cinta de resistencia a kanamicina del plásmido pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a partir del plásmido pKLN07-21 con las endonucleasas de restricción Not I y Sal I. El pfkA además de las regiones de flanqueo, fueron digeridos a partir del plásmido pSW07-61 con enzimas de restricción Not I y Sal I. Los dos fragmentos fueron ligados juntos, generando el piásmido Psw07-63. Para crear una eliminación en la secuencia de codificación de pfkA se digirió el plásmido pSW07-63 para termino con Pvu II, seguido de una digestión parcial con Ahd I. Esto eliminó un fragmento de 781 pares base de la secuencia de codificación pfkA. El fragmento que contiene la eliminación pfkA fue tratado con polimerasa de ADN T4 para llenarse en los extremos y el fragmento con extremo romo resultante se ligó asimismo, dando como resultado el plásmido pSW07-64. Para generar una cepa que contiene la eliminación pfkA, se transformó el plásmido pSW07-64 en 7107-18 E. coli. Después de la selección sensible a la temperatura y el protocolo de pase, se clasificaron colonias sensibles a kanamicina para crecimiento más lento en placas con un medio definido que contiene glucosa como la fuente de carbono. Las cepas se confirmaron mediante hibridación Southern estándar altamente estricta utilizando un fragmento de 1153 pares base que contiene un parte de la secuencia yiiP y pfkA. Estas cepas fueron designadas como 7107-90(1) y 7107-90(2). Se observaron actividades específicas Pfk de 0.054 y 0.035 mmol de proteína min" mg'1 en las cepas 7107-90(1) y 7107-90(2), respectivamente. Se detectó una actividad específica de 0.78 mmol min" mg" en la cepa de control 7107-90(29, la cual tuvo el gen pfkA tipo natural. Por consiguiente, los mutantes pfkA tiene rigurosamente una actividad pfkA de 5 a 6% observada en la cepa de control. Esta actividad Pfk residual tuvo sin duda la contribución de la isoenzima PfkB. Integración de la cinta T7-lac-ScGNA1 en el cromosoma de las cepas 7107-90 (11 y 7107 (2) Las cepas 7107-90 se derivaron a partir de la cepa de producción de glucosamina 7107-18; por consiguiente, no producen un NAG medible. Con el objeto de generar una cepa de producción NAG con la eliminación pfkA, la cinta de expresión T7-lac-ScGNA1 necesita introducirse en la cepa. Siguiendo la estrategia descrita anteriormente, se integró una cinta de expresión de T7-lac-ScGNA1 en el sitio manXYZ del cromosoma en las cepas 7107-90(1) y 7107-90(2), generando las cepas 7107-602 y 7107-603, respectivamente. Estas cepas fueron confirmadas mediante hibridación Southern estándar altamente estricta utilizando un fragmento que contiene la secuencia de codificación ScGNAl como la sonda, como teniendo una T7lac-ScGNA1 integrada en el sitio de la eliminación manXYZ. Análisis en frasco de agitación en la cepa 7107-602 y 7107-603 Se probaron las cepas 7107-602(1) y 7107-603(1) en la clasificación mediante Frasco de Agitación 48 utilizando diversas mezclas de glucosa/fructosa. Los cultivos se indujeron con IPTG 0.2 mM después de 24 horas. Es interesante, que estas cepas produjeron casi nada de acetato bajo cualesquiera de las condiciones probadas, aunque no produjeron más NAG que la cepa de control 7107-92(1) (datos no mostrados). La clasificación mediante Frasco de Agitación 53 probó nuevamente las cepas 7107-602(1) y 7107-603(1) bajo condiciones para la inducción de lactosa. Nuevamente, no se produjo acetato en estas cepas y los niveles de NAG fueron similares a los observados en la cepa de control 7107-92(1). Para evaluar en forma adicional la formación de acetato en la cepa 7107-602(1), se llevó a cabo la clasificación en Frasco de Agitación 56 bajo condiciones que normalmente incrementan la formación de acetato, incluyendo la adición de extracto de levadura, (YE), ribosa y oligo elementos superiores (TE). Los cultivos se crecieron en un medio 9B modificado [6 g/l KH2P04, 24 g/l K2HP04, 1 g/l Na3Citrato.2H20, 10 g/l (NH4)2S04 (el fosfato se ajustó a un pH de 7.4]. Los niveles de oligo metales (0.3 mg/IFeS0 -7H20, 0.375 mg/l ZnS04-7H20, 0.02 mg/l MnS04-H20, 0.001 mg/1 CuS04-5H20, 0.001 mg/1 NaMo04-2H20, 0.001 mg/1 H3BO3, y 0.001 mg/1 CoCI2-6H20) o nivels superiores de oligo metales (12 mg/1 FeS04-7H20, 0.375 mg/1 ZnSo4-7H20, 0.8 mg/1 MnS04-H20, 0.001 mg/1 CuS04-5H20, 0.001 mg/1 NaMo04-2H20, 0.001 mg/1 H3B03, y 0.001 mg/1 CoCI2-6H20) se agregaron tal como se indica en la tabla 24. Se suplementaron los cultivos con 0.6 g/l MgS04-7HO, 0.05 g/l de CaCI2-2H20, 10 g/l de glucosa, y 20 g/l de lactosa. Adicionalmente, se agregaron 5 g/l de ribosa y/o 5 g/l de extracto de levadura a los cultivos tal como se indica en la tabla 24. Los cultivos crecieron a una temperatura de 37°C durante 24 horas y posteriormente se cambiaron a 25°C. A las 12 horas, se agregó 20 g/l de glucosa a los cultivos en los cuales se eliminó y el pH se ajustó a 7.2 a las 24, 30, 48 y 54 horas, se ajustó el pH de los cultivos a 7.2 y se agregó glucosa a 30 g/l por día en total con base en los resultados HPLC 5 g/l (NH4)2S04 se agregó a las 24, 30, 48 y 52 horas a los frascos en los cuales habían caído los niveles debajo de 1 g/l. Tabla 24. Efecto de diversos niveles de oligo elementos, ribosa y extracto de levadura en una formulación de acetato en las cepas 7107-602(1) y 7107-92(1) Cepa Condiciones Tiempo (hr) OD600 Acetato g/l GIcNAc g/l TE Ribosa YE 7107-602(1) Baja 5 g/l 5 g/l 24 4.5 0 8.6 48 9.6 0 18.2 72 1^2 0 4;2 Alta 5 g/l 5 g/l 24 4.75 0 8.7 48 9.0 0 22.8 72 12.9 7.2 22.3 Cepa Condiciones Tiempo (hr) OD600 Acetato g/l GIcNAc g/l TE Ribosa YE Baja Ninguna 5g/l 24 4.5 0 6.8 48 4.8 0 15.6 72 10.8 0 28.2 Alta Ninguna 5g/l 24 4.5 0 6.8 48 9.0 0 16.4 72 12.0 9.8 16.3 Baja 5g/l Ninguna 24 1.75 0 4.15 48 2.4 0 13.0 72 5.4 0 23.0 Alta 5g/l Ninguna 24 1.0 0 4.35 48 4.8 2.2 13.2 72 10.5 0 27.8 7107-92(1) Baja 5g/l 5g/l 24 8.5 0 7.0 (Control) 48 12.6 6.1 18.6 72 13.8 13.6 15.8 Alta 5g/l 5g/l 24 7.5 0 5.2 48 12.6 8.4 13.6 72 12.9 14.4 11.7 Baja Ninguna 5g/l 24 9.0 0 4.9 48 15.0 7.8 9.7 72 15.0 15.0 9.2 Alta Ninguna 5g/l 24 9.5 0 5.4 48 12.6 10.9 7.6 72 13.2 17.1 7.4 Baja 5g/l Ninguna 24 7.0 0 4.2 48 7.2 1.8 16.6 72 7.8 3.7 19.2 Alta 5g/l Ninguna 24 10.0 0 7.17 48 13.2 7.4 13.10 72 13.2 13.0 11.7 Incluso bajo condiciones diseñadas para inducir que la cepa de control 7107-92(1) produzca altos niveles de acetato, la producción de acetato en la cepa 7107-602(1) es ya sea nula o comparativamente baja (Tabla 23). Además, aunque las medidas OD tienden a ser más bajas en la cepa 7107-607(2), generalmente se observó un titulador NAG más alto en estos cultivos. Por consiguiente, la cepa del muíante pfkA pareció adecuada para utilizarse como un huésped de producción NAG. Ejemplo 23 Este ejemplo describe la clonación y sobreexpresión del gen de sintetasa de glutamina (glnA), la integración de una cinta T7lac-glnA en el cromosoma de E. coli y los efectos de la sobreexpresión del gen glnA en la producción GIcN/GIcNAc. La glutamina es un producto principal para la asimilación de amonia que proporciona nitrógeno para aminoázucares, así como para otros compuestos. La sintetasa de glutamina, codificada mediante glnA, cataliza la conversión de L-glutamato a L-glutamina en una reacción que requiere NH3 y ATP. L-glutamina se requiere para la biosíntesis de glucosamina-6-fosfato; GlmS cataliza la reacción mediante la cual L-glutamina y F-6-P se convierten a D-glucosamina-6-? y L-glutamina. Para niveles máximos de producción de GIcN/GIcNAC, es esencial que se encuentren niveles adecuados de glutamina en la célula. La sobreexpresión del gen glnA puede incrementar los niveles de glutamina y finalmente incrementar el titulador GlcN y/o el titulador NAG. Clonación y sobreexpresión del gen E. coli. Para clonar y sobreexpresar glnA E. coli, se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada del gen glnA (Blattner y asociados, 1997, Science 277 (5331): 1453-1474).

La secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de glnA E. coli se describe en el expediente de secuencias identificado como la SEQ ID NO:88. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína E. coli se describe en el expediente de secuencias identificado como SEQ ID NO:89. Se utilizaron los cebadores para amplificar la secuencia de codificación glnA procedentes de ADN genómico 7101-17(DE3) E. coli utilizando PCR. Los cebadores utilizados para amplificación fueron el cebador de avance 07-gln y el cebador inverso 07-15 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-gln: 5'GATCGGTCTCGCATGTCCGCTGAACAGCTACTGAC3' (SEQ ID NO:90) y 07-15: 'GATCCTCGAGTTAGACGCTGTAGTACAGCTC3' (SEQ ID NO:91). El cebador 07-gln que contiene un sitio Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO: 90) y 23 nucleótidos de la secuencias de codificación glnA procedentes de su codon de inicio ATG (representado en los nucleótidos 13 a 35 de la SEQ ID NO:90). El cebador 07-15 contiene un sitio Xho I (CTCGAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:91) y 21 nucleótidos de la secuencia de codificación glnA de su codon de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 31 de la SEQ ID NO:91). Se llevó a cabo PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento que contiene la secuencia de codificación glnA flanqueada por los sitios de endonucleasa de restricción Bsa I y Xho I. El fragmento de PCR que contiene glnA, se digirió con endonucleasas de restricción Bsa I y Xho I y se ligó en los sitios Neo I y Xho I del vector pET24d(+) (Novagen, Inc, Madison, Wl), generando el plásmido pKLN07-28. La clonación en esta forma coloca la secuencia glnA detrás de T7lac del promotor pET24d(+), generando una cinta de expresión de T7lac-gInA. Expresión funcional de glnA recombinante en E. coli Para probar la expresión funcional de glnA, se transformó el plásmido recombinante pKLN07-28 en la cepa 7107-18, generando las cepas 7107-163. La cepa de control 7107-88 se preparó transformando con 7107-18 con el vector vacío Pet24d( + ). Se siguió un protocolo de inducción estándar en el cual se crecieron cultivos celulares en LB y se indujeron con IPTG 1 mM. Se tomaron muestras de los cultivos inducidos para SDS-PAGE para confirmar la sobreexpresión de la proteína GlnA. El tamaño de la proteína anticipada de la proteína GlnA es de aproximadamente 52 kDa. Se observó una proteína sobreexpresada de aproximadamente 52 kDa. La mayor parte de la proteína sobre producida parece ser insoluble, con un poco observado en las fracciones solubles. No se observó la proteína expresada en la cepa de control, lo que indica que la proteína sobre expresada es la enzima GlnA. Construcción de un vector para dirigir la integración de T7lac-glnA en el cromosoma E. coli Habiendo confirmado la sobreexpresión exitosa del gen glnA, el siguiente paso fue integrar la cinta T7lac-glnA en el genoma de cepas de producción. Se construyó un vector de integración para este propósito. El gen pfkB E. coli se eligió como un sitio objetivo para la integración. El pfkB codifica la isoenzima menor de fosfof ructocinasa en E. coli, lo cual cuenta únicamente el 10% de la actividad de fosfofructocinasa total. Por consiguiente, la integración de la cinta en este locus no debe afectar en forma significativa el desempeño de la cepa. Como parte de la estrategia para generar el vector de integración, el pfkB además de las regiones de flanqueo se amplificaron a partir de ADN genómico E. coli W3110 mediante PCR. Se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada de pfkB además de las regiones de flanqueo (Blattner y asociados, 1997, Science 277 (5331): 1453-1474). Los cebadores utilizados para amplificar la región pfkB fueron el cebador de avance 07-16 y el cebador inverso 07-17 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-16: 5'GATCGCCGGCTTACATGCTGTAGCCCAGC3' (SEQ ID NO:92) y 07-17: 5'GATCCTGCAGTCATGCTGCTAATAATCTATCC3' (SEQ ID NO:93). El cebador 07-16 contiene el sitio de endonucleasa de restricción Nae I (GCCGGC, representado en los nucleótidos del 5 a 10 de la SEQ ID NO:92) y 19 pares base de ORF b1722 que comienza en su codon de detención de traducción putativo, localizado en la corriente ascendente de 1042 pares base del codon de inicio pfkB (representado en los nucleótidos de la 11 a 29 de la SEQ ID NO:92). El cebador 07-17 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Pst I (CTGCAG, representado en los nucleótidos del 5 al 10 de la SEQ ID NO:93) y 22 pares base de ORF b1725 que comienza en su codon de detención de traducción putativo, localizado en la corriente descendente de 1357 pares base del codon de detención de traducción de la secuencia de codificación pfkB (representado en los nucleótidos 11 a 32 de la SEQ ID NO:93). Se llevó a cabo el PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento que contiene las secuencias ORFb1722, pfkB, ORFb1724, y ORFb1725 flanqueadas por los sitios de endonucleasa de restricción Nae I y Pst I. El fragmento resultante se ligó en el vector pPCR-Script™SK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), generando el plásmido pKLN07-14. El siguiente paso fue agregar la cinta de resistencia a kanamicina del plásmido Puc4k (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) al plásmido pKLN07-14 La cinta de resistencia de kanamicina se cortó a partir de pUC4K con la endonucleasa de restricción Pst I. Se digirió en igual forma el plásmido pKLN07-14 con la endonucleasa de restricción Pst I, lo cual eliminó un fragmento de 412 pares base del plásmido que incluye 386 pares base de la secuencia de codificación putativa ORFb1725. Se ligó la cinta de resistencia a kanamicina en los sitios Pst I del esqueleto del plásmido pKLN07-14, generando los plásmidos pKLN07-17. El plásmido pKLN07-17 se digirió posteriormente con las endonucleasas de restricción SnaB I y Btr I, eliminando 870 pares base de la secuencia de codificación pfkB del plásmido.

El fragmento que contiene la cinta T7lac-glnA se cortó a partir del plásmido pKLN07-28 con la endonucleasa de restricción Nae I, generando un fragmento que contiene la cinta T7lac-glnA flanqueada por la corriente ascendente de 50 pares base. El promotor 17 y la corriente descendente de 164 pares base del terminador T7 procedente del vector pET24d( + ). Se ligó el fragmento Nae I en los sitios SnaB I y Btr I del plásmido pKLN07-17, generando el plásmido pKLN07-29. El paso final fue agregar el replicón sensible a la temperatura procedente de pMAK705 al fragmento del plásmido pKLN07-29 que contiene la cinta T7lac-gInA en el sitio de la eliminación pfkB y la cinta de resistencia a kanamicina. Se digirió el plásmido pKLN07-29 con las endonucleasas de restricción Not I y Kpn I para liberar el fragmento T7lac-glnA que contiene la cinta de resistencia a kanamicina y pPCR-Script procedente del esqueleto. El plásmido pKLN07-20 (descrito previamente) se digirió con Not I y Kpn I, cortando el fragmento que contiene el replicón sensible a la temperatura. Se ligaron los dos fragmentos juntos, generando un plásmido pKLN07-30, que contiene el replicón sensible a la temperatura, la cinta de resistencia a kanamicina y la secuencia genómica E. coli con la cinta T7Iac-glnA ligada en el sitio de eliminación pfkB. Se puede utilizar el plásmido pKLN07-30 para dirigir la integración de la cinta T7lac-gInA en el pfkB del cromosoma después del protocolo de selección y pase sensible a la temperatura. Se transformó el plásmido pKLN07-30 en la cepa de producción de glucosamina 7107-18. Después de la selección y el pase sensibles a la temperatura, se clasificaron colonias sensibles a kanamicina para la presencia de la cinta T7lac-glnA en el sitio de eliminación pfkB utilizando un protocolo PCR estándar. Se confirmaron diversas cepas identificadas mediante PCR a través de hibridación Southern altamente estricta utilizando un fragmento que contiene la secuencia de codificación glnA como la sonda. Estas cepas se designaron como 7107-118 a 7107-123. Integración de la cinta T7lac-ScGNAI en el cromosoma de las cepas 7107-118. 7107-119 La cepas 7107-118, 7107-119 y 7107-120 se derivaron de la cepa de producción de glucosamina 7107-18; por consiguiente, no producen un NAG medible. Con el objeto de generar una cepa de producción NAG con la cinta de expresión glnA. la cinta de expresión T7lac-ScGNA1 necesita introducirse en la cepa. Tal como se describió anteriormente, se integró una cinta de expresión de T7-lac-ScGNA1 en manXYZ del cromosoma en las cepas 7107-118, 7107-119, y 7107-120, generando las cepas 7107-125 (derivado de 7107-119), 7107-126 (derivado de 7107-120), 7107-132 (derivado de 7107-118), 7107-133 (derivado de 7107-118), y 7107-134 (derivado de 7107-119). Estas cepas se confirmaron mediante hibridación Southern altamente estricta estándar utilizando un fragmento que contiene la secuencia de codificación ScGNAl como una sonda, que tiene un T7 lac-ScGNA1 integrado en el sitio de la eliminación manXY. Clasificación en frasco de agitación 51: elaboración de pruebas de sobreexpresión de T7lac-glnA integrada en el soporte de producción NAG Se llevó a cabo la clasificación en frasco de agitación 51 para evaluar las cepas 7107-125, 7107-126 y 7107-133 que contiene la cinta T7 lac-glnA integrada. Los cultivos se crecieron en un medio M9B suplementado con oligometales y las siguientes substancias: 0.6 g/l MgS04-7H20, 0.05 g/l CaCI2-2H20, 10 g/l glucosa, 40 g/l de lactosa, 5 g/l de ribosa, y 5 g/l de extracto de levadura. Se crecieron los cultivos a una temperatura de 30°C durante 24 horas y posteriormente se cambió la temperatura a 25°C. A las 24 y 48 horas, se ajustó el pH de los cultivos a 7.2 y se agregó la glucosa a 30 g/l, se agregó 5 g/l de (NH4)2S04 a las 24 y 48 horas a los frascos en los cuales los niveles habían caído debajo de 1 g/I. Se tomaron muestras a las 24, 48 y 72 horas para OD y la determinación de los niveles NAG. Se recolectaron los cultivos a las 72 horas para el análisis de actividades enzimáticas. Tal como se aprecia en la tabla 25, las cepas que sobreexpresan glnA, se desempeñan un poco mejor que la cepa de control 7107-92(1), que produce aproximadamente el 8% más de NAG. Ninguno careció de la amonia ya que no se limitó el nitrógeno. Las actividades enzimáticas de GlmS y GNA1 en la cepa de sobreexpresión glnA, son comparados con la cepa de control 7107-92(1). En síntesis, parece que la sobreexpresión de glnA ofrece una ligera mejoría en los tituladores NAG, la cual se puede acentuar bajo condiciones optimizadas.

Tabla 25. Crecimiento celular, actividad enzimática y producción GIcNAc en cepas que sobreexpresan g/nA, 1) OD, las actividades enzimáticas y los niveles GIcNAc en las muestras en los puntos de tiempo de 72 horas. 2) Se reportan las actividades enzimáticas en pmol proteína min"1 mg"1. Experimento de fermentación para probar las cepas de producción NAG con T7lac-alnA integrado Posteriormente se evaluó la cepa 7107-133, que contiene la cinta T7 lac-glnA, en un termentador de 1 litro. El fermentador se preparó con un volumen inicial de 475 mi. Los componentes de medio de fermentación se describen en la tabla 26. Las fermentaciones se corrieron utilizando 75% de NH4OH para controlar el pH a 6.9. Se mantuvo la temperatura a 37°C a lo largo de la fermentación. Se ajustó la aireación y agitación para mantener una concentración de oxígeno disuelto del 20% de aire de saturación. Se alimentó el 65% de glucosa a los cultivos con un rango de alimentación controlado mediante programa de computadora para lograr un rango de crecimiento de 0.40 hr" en inoculación, y un rango máximo de 5 m/hr en 6 horas. Se indujeron los cultivos con lactosa de grado alimenticio agregada en un rango de 5 g/l a las 10 horas, con alimentación de glucosa continua. Se compararon los resultados de la cepa 7107-133 con los de la cepa 7107-92(1), corrida previamente en la fermentación 237 bajo condiciones idénticas. Ambas de estas cepas contienen una copia de una cinta T7lac-ScGNA1 integrada. Los resultados indican que la presencia de la cinta T7lac-glnA en la cepa 7107-133 puede ofrecer una ligera ventaja con respecto a la cepa 7107-92(1). La cepa 7107-133 logró 107.1 g/I de NAG a la 59.6 horas, en comparación con 96.6 g/l de NAG a las 59.8 horas en la cepa 7107-92(1). Tabla 26. Componentes de medio de fermentación.

*La composición de oligometal es de 5 mg/l FeS04-7H20, 3.75 mg/l ZnS04-7H20, 0.6 mg/l MnS04-H20, 0.1002 mg/l CuS04-5H20, 0.1002 mg/l CoCI2-6H20. Ejemplo 24 Este ejemplo describe la clonación, sobreexpresion del gen de deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato (zwf) de una cinta 17 lac-zwf en el cromosoma E. coli y el efecto de la sobreexpresion de zwf bajo el control del promotor T7 en la producción NAG. La trayectoria de fosfato de pentosa proporciona intermedios para la biosíntesis de aminoácidos, nucleótidos y la pared celular. Además, la parte de oxidación de la trayectoria de fosfato de pentosa es una fuente importante de NADPH en la célula. El gen zwf de E. coli, codifica la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato (G6PDH), que cataliza el primer paso en la trayectoria de fosfato de pentosa, convirtiendo la g!ucosa-6-fosfato en glucono-1 ,5-lactona. La expresión del gen zwf se coordina con el rango de crecimiento celular (Rowley, D. y Wolf, R., J. Bac, 1991, 173(3):968-977). La literatura describe aislados de E. coli que no tienen la capacidad de crecer en NAG ó GlcN (J. Bac, 1970, 101:384-391). Los autores especularon que la acumulación de fosfatos de aminoazúcar pueden incluir las reacciones catalizadas mediante isomerasa de fosfohexosa y deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato, dando como resultado la falta de alimentación de pentosa. La adición de pentosa o gluconato, invirtió la inhibición de crecimiento de dichas cepas. Las cepas de E. coli recombinante que producen GIcN/GIcNAc pueden acumular fosfatos de aminoazúcar hasta ciertos niveles. Si este es el caso, la adición de gluconato y pentosas, tal como ribosa, debe dar como resultado un crecimiento y producción incrementada de NAG. Los experimentos en frasco de agitación que se llevaron a cabo con la cepa de producción NAG 7107-87#25, demostraron que la adición de ribosa o gluconato dio como resultado incrementos tanto en crecimiento como en el titulador NAG. Por lo tanto, parece que la cepa de producción NAG experimentó una falta de alimentación de pentosa que podría ser reducida mediante la adición de pentosas o gluconato. Como una estrategia para disminuir la falta de alimentación de pentosas sin agregar pentosas exógenas, se decidió sin expresar el gen zwf en las cepas de producción NAG. Se especuló que la sobreexpresión del gen zwf puede reducir la inhibición de aminoazúcares fosforilados en la trayectoria de fosfato de pentosa. Si es así, esto podría eliminar la necesidad de suministrar pentosas o gluconato adicionales para aumentar el titulador NAG en nuestras cepas. Clonación y expresión de zwf E. coli Para clonar y expresar el gen zwf E. col¡, se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada del gen zwf (Blattner y Asociados, 1997, Science 277(5331 ): 1453-1474). La secuencia de nucleótidos de la secuencia que codifica el gen zwf E. coli, se describe en el expediente de secuencias identificado como la SEQ ID NO:94. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína zwf E. coli, se describe en el expediente de secuencias identificado como la SEQ ID NO:95. Se utilizaron cebadores para amplificar la secuencia de codificación zwf procedentes del ADN genómico E. coli W3110 utilizando PCR. Los cebadores utilizados para amplificación, fueron el cebador de avance 07-101 y el cebador inverso 07-102 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-101: 5'-GATCGGTCTCGCATGGCGGTAACGCAAACAGC 3' (SEQ ID NO:96) y 07-102: 5' GATCCTCGAGTTACTCAAACTCATTCCAGGAACGACC 3' (SEQ ID NO:97). El cebador 07-101 contiene un sitio de endonucíeasa de restricción Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:96) y 20 nucleótidos de la secuencia de codificación zwf procedente de su codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 13 a 32 de la SEQ ID NO:96). Los cebadores 07-102 contienen un sitio de endonucíeasa de restricción Xho I (CTCGAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:97) y 27 nucleótidos de la secuencia de codificación zw" que comienza a partir de su codón de detención de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 37 de la SEQ ID NO:97). Se llevó a cabo PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento que contiene la secuencia de codificación zwf flanqueada por los sitios de endonucleasa de restricción Bsa I y Xho I. Se digirió ei fragmento PCR con endonucleasas de restricción Bsa I y Xho I y se ligó en los sitios Neo I y Xho I del vector pET24d( + ) (Novagen, Inc., Madison, Wl), generando el plásmido pSW07-71. La clonación en esta forma, coloca la secuencia zwf detrás del promotor T7lac de pET24d( + ), generando una cinta de expresión de T7 lac-zwf. Expresión funcional de la proteína ZWF recombínante en E. col i Los plásmidos pSW07-71#17, #20, y #33, que contienen cada uno la cinta de expresión T7 lac-zwf en pET24d( + ), se transformó en la cepa de producción 7107-92(1), generando las cepas 7107-96(1) (transformadas con pSW07-71#17), 7107-96(2) y 7107-96(3) (transformado con pSW07-71#20), y 7107-96(4) (transformado con pSW07-71#33). Se preparó la cepa de control 7107-95 mediante la transformación de la cepa 7107-92(1) con pET24d( + ). Se siguió un protocolo de inducción estándar en el cual los cultivos celulares crecieron en LB y se indujeron con IPTG 1 m . Se tomaron muestras de los cultivos inducidos para SDS-PAGE. Los resultados confirmaron la sobreproducción de una proteína de aproximadamente 56 kDa, que corresponden al tamaño anticipado de la proteína G6PDH. Sin embargo, la mayor parte de la proteína sobreproducida pareció estar en una forma insoluble. Después de 4 horas de inducción IPTG, se recolectaron los cultivos celulares para ensayar la actividad de deshidrogenase de glucosa-6-fosfato. Las cepas 7107-96(2), 7107-96(3), y 7107-96(4) tuvo una actividad G6PDH de 69.7, 78.1, y 90.1 mmol de proteína min"1 mg"1, comparado con 0.04 mmol de proteína min"1 mg"1 de la cepa de control 7107-95. Esto confirmó que el gen zwf se sobreexpreso en forma exitosa en la cepa de producción NAG. Integración de la cinta T7lac-zwf en el cromosoma E. coli Habiendo confirmado la expresión funcional de la proteína ZWF recombinante en 7107-92#1 E. coli, el siguiente paso fue integrar en forma estable la cinta T7lac-zwf en el cromosoma de las cepas de producción NAG. Se diseñó un vector de integración para dirigir la integración de la cinta a la región rha del genoma. Los genes rhaBAD de E. coli, forman un operón que codifica ramnulocinasa, isomerasa L-rhamnosa y aldolasa de ramnuiosa-1 -fosfato. Estos genes están implicados en la utilización de rhamnosa como una fuente de carbono alternativa y se consideran genes no esenciales. Por consiguiente, la interrupción de esta región no debe afectar el crecimiento de la producción NAG. El primer paso en la generación del vector de integración, fue clonar la región rhaBAD del ADN genómico E. coli W3110. Se sintetizaron los cebadores con base en la secuencia publicada del operón rhaBADK además de sus regiones flanqueo (Blattner y Asociados, 1997, Science 277(5331 ):1453-1474). Los cebadores utilizados para amplificar la región rha fueron el cebador de avance 07-107 y el cebador inverso 07-108 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-107: 5' CGAATATCACGCGGTGACCAGTTAAAC3' (SEQ ID NO:98) y 07-108: 5' CACAGTGTGCCGATGATTTTGACC3' (SEQ ID NO:99). El cebador 07-107 se amplifica a partir de la corriente ascendente de 1096 pares base del codón de inicio rhaB. El cebador 07-108 se amplifica a partir de la corriente descendente de 977 pares base del codón de detención rhaD.

Se llevó a cabo PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento que contiene el operón rhaBAD además de las secuencias de flanqueo. Se clonó el fragmento PCR en el vector pPCR-Script™SK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), generando el plásmido pSW07-72. El siguiente paso en la generación del vector de integración fue agregar la cinta T7 lac-zwf en el plásmido pSW07-72. Se amplifica la cinta 17-\ac-zwf mediante PCR a partir del plásmido pSW07-71 utilizando condiciones estándar. Se llevó a cabo la amplificación PCR con el cebador de avance 07-111 y el cebador inverso 07-112, que tuvieron las siguientes secuencias: 07-111: 5'GACCAATGGCCTAATGGAGCAACCGCACCTGTGGC 3' (SEQ ID NO:100) y 07-112: 5' GATCAGCGCTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAAC CCC3' (SEQ ID NO:101). El cebador 07-111 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Xcm I (CCANNNNNNNNNTGG, representado en los nucleótidos 3 a 17 de la SEQ ID NO:100) y se amplifica a partir de la corriente ascendente de 80 pares base de la secuencia de promotor pET24d(+) (representado en los nucleótidos 18 a 35 de la SEQ ID NO:100). El cebador 07-112 contiene un sitio de endonucleasa de restricción Afe I (AGCGCT, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:101) y se amplifica a partir de la corriente descendente de 25 pares base del terminador T7 (representado en los nucleótidos 11 a 46 de la SEQ ID NO:101). El producto PCR de 1.8 kb resultante, se digirió con las endonucleasas de restricción Xcm I y Afe I. Se digirió el plásmido pSW07-72 con las enzimas de restricción Xcm I y Afe I, cortando un fragmento de 3.6 kb del esqueleto pSW07-72. Se ligó el fragmento PCR que contiene la T7lac-zwf con los extremos Xcm I y Afe I en el sitio del corte en el plásmido pSW07-72, generando el plásmido pSW07-73. El plásmido pSW07-73 tiene por lo tanto una eliminación de 3.6 kb de la mayor parte de todo el operón rhaBAD, con el T7-/ac-zwf insertado en el sitio de la eliminación. El paso final en la construcción del plásmido de integración, fue agregar el replicón sensible a la temperatura y la cinta con resistencia a kanamicina procedente del plásmido pKLN07-21. El plásmido pKLN07-21 fue digerido con Not I y Kpn I, cortando el fragmento que contiene el replicón sensible a la temperatura y la cinta con resistencia a kanamicina. Se digirió el plásmido pSW07-73 con las enzimas de restricción Not I y Kpn I, liberando el fragmento que contiene la T7-lac-zwr" con los flanqueos rhaBAD procedentes del esqueleto pPCR-Script. Los dos fragmentos se ligaron juntos, generando el plásmido pSW07-74. El plásmido pSW07-74 se puede utilizar para dirigir la integración de la T7 lac-zwf en la región rha del cromosoma E. coli. Se transformó el plásmido pSW07-74 en la cepa de producción NAG 7107-92(1). Después de la selección sensible a la temperatura y el pase, se clasificaron colonias sensibles a kanamicina con respecto a la presencia de la cinta T7/ac-zwf en el sitio de la eliminación rhaBAD utilizando un protocolo PCR estándar. Se confirmaron diversas cepas identificadas mediante PCR a través de hibridación Southern altamente estricta utilizando un fragmento 1.0-kb de la secuencia de codificación zwf como una sonda. Estas cepas se designaron como 7107-606(1), 7107-606(2), 7107-606(3), y 7107-606(4). Producción NAG en cepas con una cinta T7lac-zwf integrada Se llevó a cabo la clasificación en un frasco de agitación 46 para evaluar el efecto de la sobreexpresión de zwf bajo el control del promotor T7 en la producción NAG en las cepas 7107-606(1) y 7107-606(3). Tal como se describió anteriormente, se especuló que la sobreexpresión de zwf puede liberar la falta de alimentación de pentosa y abolir la inhibición de crecimiento originada por los aminoazúcares fosforilados. Se crecieron cultivos en el medio M9B (descrito anteriormente) suplementado con 0.6 g/l MgS04-7H20, 0.05 g/l CaCI2-2H20, 40 g/l glucosa, y 0.2 mM IPTG (para frascos con inducción tardía, se agregó IPTG a las 24 horas). Se agregaron 10 g/l de ribosa y 5 g/l de extracto de levadura a los cultivos, tal como se indica en la tabla 27. Los cultivos fueron incubados a una temperatura de 30°C durante 24 horas y posteriormente se cambió la temperatura a 25°C. A las 24 y 48 horas, se ajustó el pH de los cultivos a 7.2 y se agregó glucosa en un rango de 30 g/l por día en total. Se agregaron 5 g/l (NH4)2S04 a las 24 y 48 horas a los frascos en los cuales los niveles hayan disminuido a 1 g/l. Se eliminaron muestras a las 24, 48, y 72 horas para la determinación del OD y los niveles NAG. Los cultivos se recolectaron a las 72 horas para análisis de enzimas. Tabla 27. Efecto de la variación del tiempo de inducción, adición de ribosa y adición de extracto de levadura en el crecimiento, actividad enzimatica y producción de GIcNAc en cepas que sobreexpresan zwf.

Se agregó IPTG a las 24 horas para una inducción posterior. 2Se reportaron las actividades enzimáticas en µG???/min/mg de proteína. 3ND: no determinado. Los resultados indican que las cepas que sobreexpresan zwf conducidas por el promotor T7, tuvieron actividades G6PDH de 50 a 100 veces más que en las cepas de control. La sobreexpresion zwf mejoró ligeramente el crecimiento en los cultivos, sin agregar ribosa cuando se compara con el crecimiento de la cepa de control. Sin embargo, la actividad GlmS tendió a disminuir en cepas que sobreexpresan el zwf, y los niveles de producción NAG no alcanzaron los niveles observados en la cepa de control 7107-92(1). Esto indica que se puede pasar demasiado carbono a través de la trayectoria de fosfato de pentosa, aparte de la trayectoria de glucosamina. Ejemplo 25 Este ejemplo describe la clonación de deshidrogenase de glucosa-6-fosfato {zwf), la integración del gen zwf con su promotor nativo en el cromosoma E. coli y los efectos de la sobreexpresion de zwf bajo su control de promotor nativo en el crecimiento celular y producción NAG. Clonación de zwf E. coli con su promotor nativo y regiones de regulación Tal como se describe en el ejemplo 24, las cepas se construyeron con una cinta T7lac-zwf integrada como parte de la estrategia para mejorar el crecimiento y producción NAG. Se especuló que la sobreexpresion de zwf puede reducir la inhibición de aminoazúcares fosforilados en la trayectoria de fosfato de pentosa. Si es así, esto podría eliminar la necesidad de suministrar pentosas o gluconato adicional para mejorar el titulador NAG en nuestras cepas. Las cepas 7107-606 que contienen una cinta J7lac-zwf integrada creció un poco mejor que la cepa de control, lo que indica la disminución parcial de la falta de alimentación de pentosa. Sin embargo, no se desempeñaron tan bien como la cepa de control con respecto a la producción NAG. Esto puede deberse al uso del promotor T7 fuerte, el cual puede conducir a un nivel de expresión de proteína zwf demasiado alto. La actividad en exceso de la deshidrogenase de glucosa-6-fosfato podría pasar en forma indeseable grandes cantidades de carbono a través de la trayectoria de fosfato de pentosa. Por consiguiente, se decidió expresar zwf con su promotor nativo, de modo que la expresión de zwf podría ser regulada por la célula. En E. coli, el gen zwf se somete a una regulación dependiente del rango de crecimiento. Además, el zwf es un elemento del reguión soxRS y del reguión con resistencia a antibióticos múltiples (mar). Por consiguiente, la clonación del zwf nativo debe incluir no únicamente el promotor nativo, sino las regiones reguladoras tales como "Soxbox" (Fawcett, W. y Wolf, R., 1995, J. Bac. 177(7): 1742-1750). La presencia de dos copias del zwf en el cromosoma, podrían dar como resultado el flujo incrementado a través de la trayectoria de fosfato de pentosa sin afectar en gran parte el flujo de carbono a través de otras trayectorias, tal como para la producción de NAG.

Para la clonación y expresión de z f E. coll, se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada del gen zwf (Blattner y Asociados, 1997, Science 277(5331 ):1453-1474). Se utilizaron los cebadores para amplificar la secuencia de codificación zwf además de las regiones reguladoras procedentes del ADN genómico E. coll W3110 utilizando PCR. Los cebadores que se utilizaron para amplificación fueron el cebador inverso 07-129 y el cebador de avance 07-130 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-129: 5'GATGCTAGCTAACCGGAGCTCATAGGGC3' (SEQ ID NO:102) y 07-130: 'GATTTCGAATGATCAGTGTCAGATTTTTACCC3' (SEQ ID NO:103). El cebador de avance 07-130 contiene un sitio BstB I (TTCGAA, representado en los nucleótidos 4 a 9 de la SEQ ID NO:102) y se amplifica a partir de la corriente ascendente de 203 pares base del codón de inicio zwf. El cebador inverso 07-129 contiene un sitio Nhe I (GCTAGC, representado en los nucleótidos 4 a 9 de a SEQ ID NO:103) y se amplifica a partir de la corriente descendente de 154 pares base del codón de detención zwf. Se llevó a cabo el PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento de 1.8-kb flanqueado por los sitios de endonucleasa de restricción Nhe I y BstB I. Integración de zwf recombinante en el cromosoma de E. col i Se diseñó un vector de integración para dirigir la integración de la cinta zwf a la región rha del genoma. Los genes rhaBAD de E. coli forman un operón que codifica rhamnulocinasa, isomerasa de L-rhamnosa, y aldolasa de rhamnulosa-1-fosfato, respectivamente. Estos genes están implicados en la utilización de rhamnosa como una fuente de carbono alternativa, y se consideran genes no esenciales. Por consiguiente, ia interrupción de esta región no debe afectar el crecimiento de la producción NAG en nuestras cepas. El plásmido pSW07-72#45 (descrito en el ejemplo 24) se utilizó en el primer paso para la generación del vector de integración. Este plásmido, que contiene el operón rhaBAD además de la secuencia de flanqueo, se digirió con las endonucleasas de restricción BstB I y Nhe I. Esto eliminó un fragmento de 702 pares base que contiene una parte de las secuencias de codificación rhaB y rhaA procedentes del plásmido. El fragmento PCR que contiene la secuencia de codificación zwf además de las regiones de regulación, se digirió con las endonucleasas de restricción BstB I y Nhe I y se ligó en los sitios BstB 1 y Nhe I de pSW07-72#45, generando el plásmido pSW07-86. Se digirió el plásmido pSW07-86 con las enzimas de restricción Kpn I y Not I para liberar el fragmento de 6.9 kb que contiene el zwf flanqueado mediante los genes rha. Este fragmento se ligó con el fragmento Kpn MNot I de 4.2 kb procedente de pKLN07-21, que contiene el replicón sensible a la temperatura procedente de p AK705 (Hamilton y Asociados, 1989, J. Bac. 171 (9):4617-4622) y la cinta con resistencia a kanamicina procedente de pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). El plásmido resultante, pSW07-87, se puede utilizar para dirigir la integración del zwf a la región rhaBA del cromosoma E. col!. Se transformó el plásmido pSW07-87 en las cepas 7107-92(1) y 7107-607(2), las cuales contienen una o dos copias de la cinta ScGNAl , respectivamente. Después de la selección y del pase sensibles a la temperatura, se clasificaron colonias sensibles a kanamicina para la presencia de la cinta T7 lac-zwf en el sitio de la eliminación rhaBA utilizando un protocolo PCR estándar. Se confirmaron diversas cepas identificadas mediante PCR, mediante hibridación Southern altamente estricta utilizando un fragmento que contiene la secuencia de codificación zwf como una sonda. Las cepas derivadas de 7107-607(2) se designaron como 7107-633 y las cepas derivadas de 7107-92(1) se designaron como 7107-634. Sobreexpresion del zwf baio el control del promotor nativo en las cepas de producción NAG La clasificación incluyó las cepas 7107-633 y 7107-634 para evaluar el efecto de la sobreexpresion de zwf bajo el control del promotor nativo en la producción NAG. Los cultivos se crecieron en el medio 9B (descritos previamente) suplementado con 0.6 g/l gS04-7H20, 0.05 g/I CaCI2-2H20, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l glucosa, y 40 g/l de lactosa. Las cepas se crecieron durante 24 horas a una temperatura de 30°C y posteriormente se cambió la temperatura a 25°C durante el resto del experimento. A las 24 y 48 horas, se ajustó el pH de cada cultivo a 7.2 y se agregó glucosa a un rango de 30 g/l por día con base en los resultados de HPLC. Se agregaron 5 g/l (NH4)2S04 a las 24 y 48 horas a los frascos en los cuales habían caído los niveles debajo de 1 g/l. Se eliminaron las muestras a las 24, 48 y 72 horas para la determinación de OD y ios niveles de NAG. Los resultados se muestran en la tabla 28. Tabla 28. Crecimiento y producción GIcNAG en cepas que sobreexpresan zwf con su promotor nativo.

Los resultados indican que con zwf sobreexpresado ya sea con el promotor nativo ó T7 se incrementó el crecimiento celular, lo que indica la disminución al menos parcial de la falta de alimentación de pentosa. La producción de NAG también se incrementó en diversas de las cepas. Por ejemplo, la cepa 7107-634(2) produjo aproximadamente 25% más de NAG que la cepa de control 7107-92(1). En este experimento, las cepas con dos copias de la cinta T7lac-ScGNA1 con zwf sobreexpresada, no mejoraron con respecto a las que tienen una copia de la cinta y el zwf sobreexpresado. Evaluación de la cepa que sobreexpresa el gen zwf en fermentadores de 1 litro Las cepas que sobreexpresan zwf se evaluaron posteriormente en fermentadores de 1 litro. Estos resultados también se compararon con los procedentes de la cepa 7107-92(1), en forma previa a la corrida en una fermentación separada bajo condiciones idénticas. Los fermentadores se prepararon con un volumen inicial de 475 mi. Los componentes del medio de fermentación se describen en la tabla 26. Las fermentaciones se corrieron utilizando 75% de NH4OH para un control de pH de 6.9. La temperatura se mantuvo a 37°C a lo largo de la fermentación. Se ajustaron la aireación y agitación para mantener la concentración de oxígeno disuelto de 20% de saturación de aire. Se alimentó el 65% de glucosa a los cultivos con un rango de alimentación controlado mediante un programa por computadora para lograr un rango de crecimiento de 0.40 hr'1 en inoculación y un rango máximo de 5 ml/hr en 6 horas. Se indujeron los cultivos con lactosa de grado alimenticio agregado en un rango de 5 g/l en 10 horas, con alimentación de glucosa continua. Los resultados de la fermentación indican que la cepa 7107-606(1), logró un OD6oo mayor que las cepas de control, particularmente en los puntos de tiempo tempranos. Esto puede deberse al suministro de pentosa incrementado en esta cepa. Por otra parte, las cepas que sobreexpresan el zwf con su promotor nativo crecieron hasta aproximadamente el mismo OD6oo que la cepa de control. En este experimento, ninguna de las cepas que sobreexpresan zwf, sobrepasaron la cepa de control 7107-607(2) ó 7107-92(1) en la producción de GIcNAc. Sin embargo, se optimizaron las condiciones para la fermentación de las cepas de producción 7107-92(1) y 7107-607(2). Es posible que las cepas que sobreexpresan zwf puedan requerir de condiciones de fermentación ligeramente diferentes para mostrar sus potenciales totales en la mejora de crecimiento y producción NAG. Ejemplo 26 Este ejemplo describe la clonación del gen de isomerasa de fosfoglucosa (pgi), la integración de la cinta T7lac-pgi en el cromosoma E. coli y los efectos de la sobreexpresión del gen pg¡ en la producción NAG.

El gen pgi E. coli codifica la isomerasa de fosfoglucosa, una enzima que cataliza la interconversión de glucosa-e-fosfato a fructosa-6-fosfato. La sobreexpresión de pgi puede incrementar el conjunto de F-6-P en las cepas, y conducir por lo tanto a una mayor producción de GIcN/GIcNAc. Para probar esta posibilidad, se clonó el gen pgi y se sobreexpresó en un soporte de producción NAG E. coli. Clonación v sobreexpresión de oai E. coli Para clonar y sobreexpresar pgi E. coli, se sintetizaron cebadores con base en la secuencia publicada del gen pgi (Blattner y Asociados, 1997, Science 277(5331 ): 1453-1474). La secuencia de nucleótidos de la secuencia que codifica el gen pgi E. coli, se describe en la secuencia identificada como la SEQ ID NO.104. La secuencia de aminoácidos deducida de ia enzima PGI E. coli, se describe en la secuencia identificada como SEQ ID NO:105. Se utilizaron los cebadores para amplificar la secuencia de codificación pgi procedente de ADN genómico E. coli W3110 mediante PCR. Se utilizaron el cebador de avance 07-103 y el cebador inverso 07-104 para la amplificación y tuvieron las siguientes secuencias. 07-103: 5'GATCGGTCTCGCATGAAAAACATCAATCCAACGCAGAC3' (SEQ ID NO:106) y 07-104: 'GATCCTCGAGTTAACCGCGCCACGCTTTATAGC3' (SEQ ID NO:107).

El cebador 07-103 contiene un sitio Bsa I (GGTCTC, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:106) y 26 nucleótidos de la secuencia de codificación pgi procedente de su codón de inicio ATG (representado en los nucleótidos 13 a 38 de la SEQ ID NO:106). El cebador 07-104 contiene un sitio Xho I (CTCGAG, representado en los nucleótidos 5 a 10 de la SEQ ID NO:107) y 23 nucleótidos de la secuencia de codificación pgi procedente de su codón de traducción (representado en los nucleótidos 11 a 33 de la SEQ ID NO:107). Se llevó a cabo la amplificación PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento que contiene la secuencia de codificación pgi flanqueada por los sitios de endonucleasa de restricción Bsa I y Xho I. Se digirió el fragmento PCR con endonucleasas de restricción Bsa I y Xho I y se ligó con los sitios Neo I y Xho I del vector pET24d( + ) (Novagen, Inc., Madison, Wl), generando los plásmidos pKLN0736 y PKLN07-37. La clonación en esta forma provoca la secuencia pgi detrás del promotor T7Iac de pET24d( + ), generando una cinta de expresión de T7 lac-pgi . Expresión funcional de pgi recombinante en E. cotí Se transformó el plásmido pKLN07-36 en la cepa de producción NAG 7107-92(1), generando la cepa 7107-124. Se generó una cepa de control 7107-95 transformando 7107-92(1) con el vector vacío pET24d(+). Se siguió el protocolo de inducción estándar en el cual los cultivos se crecieron en un medio LB y se indujeron con IPTG 1 mM. Se tomaron muestras de los cultivos inducidos y no inducidos para SDS-PAGE. Los resultados confirmaron la sobreproducción de una proteína de aproximadamente 62 kDa que corresponden al tamaño anticipado de la proteína PGI. Se determinaron cantidades de proteína total y soluble mediante SDS-PAGE 4 horas después de la inducción IPTG. Las muestras procedentes de las cepas 7107-124(1) y 7107-124(2), mostraron la sobreproducción de la proteína de 62 kDa, que indica la sobreexpresión exitosa de la proteína PGI recombinante. La presencia de la proteína sobreproducida en cultivos tanto inducidos como no inducidos, indica una expresión débil del gen PGI en ausencia del inductor. No se observó dicha banda de proteína en las muestras procedentes de la cepa de control 7107-95. Al menos la mitad de la proteína PGI total, pareció estar en la forma soluble. Después de 4 horas de inducción, se recolectaron los cultivos para determinar la actividad de isomerasa de fosfoglucosa. Se descubrió que las cepas 7107-124(1), 7107-124(2), y 7107-124(3) tienen actividades específicas Pgi de 242, 158 y 215 mmol de proteína min" mg"1, respectivamente, comparados con 0.94 mmol de proteína min"1 mg"1 en la cepa de control 7107-95. Esto confirma la sobreexpresión exitosa de la proteína Pgi, alcanzando niveles de 100 a 200 veces más comparados con el control. Construcción de un vector para dirigir la integración de T7 lac-pgiA en el cromosoma E. coli Habiendo confirmado la expresión funcional de pgi, el siguiente paso fue construir un vector para dirigir la integración de la cinta T7 lac-pgi en el cromosoma de E. col!. El objetivo elegido para la integración fue la región araBAD del genoma E. col!. El operón araBAD, que codifica las proteínas de L-ribuIocinasa, isomerasa de L-arabinosa y L-ribuIosa-5~P-4-epimerasa, está implicado en la utilización de L-arabinosa como una fuente de carbono. Estas proteínas catalizan la conversión de L-arabinosa a D-xilulosa-5-fosfato, un intermedio en la derivación de fosfato de pentosa. Ya que L-arabinosa no se utiliza como una fuente de carbono en el proceso de fermentación NAG, la integración del gen en este sitio no debe afectar el crecimiento celular o la producción NAG. El primer paso en la generación del vector de integración, fue clonar la región del genoma que comprende al operón araBAD. Los cebadores se sintetizaron con base en la secuencia publicada del operón araBAD (Blattner y Asociados, 1997, Science 277(5331 ): 1453-1474). Los cebadores utilizados para amplificar la región araBAD fueron el cebador de avance 07-105 y el cebador inverso 07-106 y tuvieron las siguientes secuencias: 07-105: 5'GGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTC3' (SEQ ID NO:108) y 07-106: 5'CGGACGCACATCGGCCTCGTAGAC3' (SEQ ID NO:109). El cebador 07-105 se amplifica a partir de la corriente descendente de 74 pares base del codón de inicio ATG de araB y el cebador 07-106 se amplifica a partir de la corriente descendente de 404 pares base del codón de detención de traducción araD. El fragmento PCR de 4.7 kb resultante que contiene el operón araBAD se ligó en el vector pPCR-Script™SK(+) (Stratagene Cioning Systems, La Jolla, CA), generando el plásmido pKLN07-38. El siguiente paso fue agregar la cinta T7lac-pgi por el plásmido pKLN07-37 al plásmido pKLN07-38. La cinta T7lac-pgi se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pKLN07-37 con el cebador de avance 07-109 y el cebador inverso 07-110 que tuvieron las siguientes secuencias: 07-109: 5'GATTCCGGAAGCAACCGCACCTGTGGC3' (SEQ ID NO:110) y 07-110: 5'GATCACCTGGTTATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCC3' (SEQ ID NO:111). El cebador 07-109 que contiene el sitio de endonucleasa de restricción BspE I (TCCGGA, representado en los nucleótidos 4 a 9 de a SEQ ID NO:110) y se amplifica a partir de la corriente ascendente de 80 pares base del promotor T7 de pET24d( + ). El cebador 07-110 contiene un sitio de endonucleasa de restricción SexA I (ACCTGGT, representado en los nucleótidos 5 a 11 de la SEQ ID NO:111) y se amplifica a partir de la corriente descendente de 18 pares base del promotor T7 de pET24d( + ). Se llevó a cabo PCR bajo condiciones estándar para generar un fragmento que contiene una cinta T7lac-pgi flanqueada por los sitios de endonucleasa de restricción BspE I y SexA I. El fragmento PCR se digirió subsecuentemente con endonucleasa de restricción BspE I y SexA I. Se digirió el plásmido pKLN07-38 con las endonucleasas de restricción BspE I y SexA I, cortando un fragmento de 2477 pares base que contienen los últimos 621 pares base de la secuencia de codificación araB, toda la secuencia de codificación araA y los primeros 59 pares base de la secuencia de codificación araD. El fragmento T7lac-pgi PCR digerido (descrito anteriormente), se ligó en BspE I y SexA I, sitios de pKLN07-38, generando el plásmido pKLN07-41. Por consiguiente, el plásmido pKLN07-41 tiene una eliminación de 2.4 kb de una parte del operón araBAD, con la T7 -lac-pgi insertada en el sitio de la eliminación. Para el paso de clonación final, se digirió el fragmento que contiene la secuencia araBAD con la inserción 17lac-pgi a partir del plásmido pKLN07-41 con las endonucleasas de restricción Not I y Sal I. Este fragmento se ligó con el fragmento Sal \/Not I de 4.2 kb procedente de pKLN07-21, que contiene el replicón sensible a la temperatura de pMAK705 (Hamilton y Asociados, 1989, J. Bac. 171(9):4617-4622), y la cinta con resistencia a kanamicina procedente de pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). El plásmido resultante, pKLN07-47, se puede utilizar para dirigir la integración del pgi a la región araBAD del cromosoma E. coli. Se transformó la cepa 7107-92(1) con el plásmido pKLN07-47. Se llevó a cabo el protocolo de selección de temperatura. Se clasificaron colonias sensibles a kanamicina mediante PCR bajo condiciones estándar para la presencia de Jllac-pgi en el sitio de la eliminación araBAD en el cromosoma. Se confirmaron diferentes cepas identificadas mediante PCR, mediante hibridación Southern altamente estricta utilizando un fragmento que contiene la secuencia de codificación pgi como sonda. Estas cepas se designaron como de la 7107-136 a la 7107-141. Evaluación en frasco de agitación de la cepa 7107-136 y 7107-141 La clasificación de cepas, incluyó las cepas 7107-136 y 7107-141 para evaluar los efectos de la sobreexpresión del pgi en la producción NAG. Se crecieron cultivos en el medio M9B (descrito anteriormente), suplementado con 0.6 g/l MgS04-7H20, 0.05 g/l CaCI2-2H20, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de ribosa, 10 g/l glucosa, y 40 g/l de lactosa.

Se crecieron las cepas durante 24 horas a una temperatura de 30°C y posteriormente se cambiaron a una temperatura de 25°C para el resto del experimento. A las 24 y 48 horas, se ajustó el pH de cada cultivo a 7.2 y se agregó glucosa en un rango de 30 g/l por día con base en los resultados HPLC. Se agregaron 5 g/l (NH4)2S04 a las 24 y 48 horas a frascos en los cuales había disminuido los niveles a 1 g/l. Las muestras se eliminaron a las 24, 48 y 72 horas para la determinación de niveles OD y NAG. Los cultivos se recolectaron a las 72 horas para el análisis de enzimas. Los resultados se muestran en la tabla 29. Tabla 29. Crecimiento y producción de GIcNAc en cepas que sobreexpresan el pgi.

En este experimento, no se observó una mejoría significativa en las cepas con el pgi sobreexpresado. Sin embargo, bajo condiciones de frasco de agitación o de fermentación optimizadas, el pgi sobreexpresado puede influenciar en forma positiva el crecimiento y/o producción NAG.

Evaluación de la cepa 7107-141 en fermentación de 1 litro Posteriormente se evaluó la cepa 7107-141, que sobreexpresa el pgi en un fermentador de 1 litro. Los resultados se compararon con los de la cepa 7107-92(1), corrida previamente en una fermentación por separado bajo condiciones idénticas. Los fermentadores se prepararon con un volumen inicial de 475 mi. Los componentes del medio de fermentación se describen en la tabla 3. Las fermentaciones se corrieron utilizando 75% de NH4OH para un control de pH a 6.9. La temperatura se mantuvo a 37°C a lo largo de la fermentación. Se ajustó la aireación y agitación para mantener una concentración de oxígeno disuelto de 20% de saturación de aire. Se alimentó el 65% de glucosa al cultivo con un rango de alimentación controlado mediante programa de computadora para lograr un rango de crecimiento de 0.40 hr"1 en inoculación y un rango máximo de 5 ml/hr en 6 horas. Los cultivos se indujeron con lactosa de grado alimenticio agregada a 5 g/I en 10 horas, con alimentación de glucosa continua. En forma similar a los experimentos con frasco de agitación, no se observó una mejoría significativa en la producción de glucosamina en cepas que sobreexpresan el gen pgi. Sin embargo, como se describió anteriormente, bajo condiciones optimizadas para estas cepas, la sobreexpresión de pgi puede influenciar en forma positiva el crecimiento y/o producción NAG. Ejemplo 27 El ejemplo que se encuentra a continuación describe el desarrollo de las cepas de producción de glucosamina/N-acetilgiucosamina en donde la síntesis de glicógeno se bloquea mediante la eliminación de los genes glgXCA. También se demuestran los efectos de bloquear la síntesis de glicógeno en la producción de glucosamina/N-acetilglucosamina. Las células bacterianas acumulan el glicógeno como la principal forma de reserva de carbono almacenado. La síntesis de glicógeno implica tres enzimas: pirofosforilasa ADP-glucosa, sintasa de glicógeno y una enzima de ramificación. Estas enzimas ramifican, respectivamente, la síntesis del donante de monosacáridos (ADP-glucosa) procedente de glucosa-1 -fosfato, la polimerización de estas unidades de monosacáridos para formar un polímero (1,4) de glucosa, y el reajuste de este polímero para generar una ramificación (1-6) en la cadena. La pirofosforilasa de ADP-glucosa es una enzima pivotal en la síntesis de glicógeno y se modula fuertemente mediante efectores alostéricos. Los genes implicados en la síntesis de glicógeno y en la degradación se organizan como un operón glg (glgBXCAP), que incluye glgB (enzima de ramificación de 1,4-alfa-glucano), glgX (hidrolasa de glucosil, enzima de desramificación), glgC (pirofosforilasa de ADP-glucosa), glgA (sintasa de glicógeno), y glgP (fosforilasa de glucogén-maltotetraosa). En un esfuerzo para incrementar el flujo de carbono a las trayectorias de producción de glucosamina y N-acetilglucosamina, se bloqueó la trayectoria de síntesis de glicógeno mediante la eliminación genética en las cepas que producen glucosamina y N-acetilglucosamina. Los cebadores PCR de las siguientes secuencias, fueron sintetizados para clonar secuencias procedentes del operón glg. GNglgBXCAP1-5: 5'-GAGTCATCCGGATACAGTACGCGA-3' (SEQ ID NO:112) y GNglgBXCAP2-3: 5'-ATAAACCAGCCGGGCAAATGG-3' (SEQ ID NO:113). La amplificación PCR con los cebadores utilizando condiciones estándar, dio como resultado la generación de un fragmento de 5737 pares base del operón glg procedente de la cepa E. coli W3110. La secuencia amplificada abarca de glgB a glgP. El producto PCR fue ligado en pCR®2.1 -TOPO® (Invitrogen TOPO TA Cloning Kit, Catalog #4500-01), generando el plásmido recombinante pCALG18.1. Se digirió pCALG18-1 con Age I para eliminar una parte 3' de glgX, todo el glgC y la parte 5' de glgP del plásmido. La parte restante del plásmido se circuló nuevamente para generar pCALG21-1. Este plásmido recombinante contiene el operón glg (glgXCAD). Para generar el plásmido necesario para integrar glgXCAD en los genomas de las cepas que producen glucosamina y/o N-acetilglucosamina, se requirieron dos procedimientos adicionales. Primero, el gen Kanr de pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Catalog #27-4958-01, Acceso GenBank #X06404) se agregó a pCALG21-1 para generar pCALG23.1. Segundo, el origen de réplica sensible a la temperatura procedente de pMAK705 (Hamilton, C, y Asociados, 1989, Journal of Bacteriology, 171:9, páginas 4617-4622) se agregó a pCALG23-1 para generar pCALG28-1. Para lograr el primer procedimiento, se digirieron tanto pCALG21-1 como pUC4K con fiamHI. La digestión de SamHI lineariza la corriente descendente de pCALG21-1 del sitio de eliminación glgXCA y libera el fragmento Kanr de pUC4K. Los fragmentos pCALG21-1 y Kanr linearizados se ligaron para generar pCALG23-1. Para generar pCALG28-1, se amplificó el fragmento KanT-glgXCAD de pCALG23-1 mediante PCR utilizando los oligonucleótidos GNTOP02-5 (SEQ ID NO:114) y GNTOP03-4 (SEQ ID NO:115). La secuencia de GNTOP02-5: 5'CGCCAAGCTTGGTACCG-3' (SEQ ID NO:114). La secuencia del cebador es idéntica a los nucleotidos 230 a 246 de pCR®2.1-TOPO®. La secuencia de GNTOP03-4: 5*-CCCTCTAGATGCATGCTCGAG-3' (SEQ ID NO:115). La secuencia es complementariamente inversa en los nucleotidos 334 a 354 de pCR®2. -TOPO®. Los productos PCR fueron ligados al fragmento Sma I que contiene ei origen de réplica sensible a la temperatura aislado de pMAK705. El plásmido recombinante pCALG28-1 resultante que contiene Kanr, las secuencias glgXCAD y el origen de réplica sensible a la temperatura. La generación de las cepas deficientes en síntesis de glicógeno, se logró mediante el reemplazo de las secuencias endógenas glgBXCAP con las secuencias glgXCAD recombinante. Se transformó pCALG28-1 en la cepa E. coll 7107-18 y los clones, en los cuales glgBXCAP endógeno se reemplazó con la secuencia glgXCAD recombinante procedente de pCALG28-1 se generaron utilizando el procedimiento de selección de temperatura. Los clones deseados se identificaron en forma adicional mediante clasificación PCR y se confirmaron mediante una prueba de vapor de yodo. La selección PCR se llevó a cabo utilizando los nucleótidos GNglgBXCAP3-5 (SEQ ID NO:136) y GNglgBXCAP4-3 (SEQ ID NO:137). La secuencia de GNgIgBXCAP3-5 es tal como se indica: 5'-GGCGGCTTAAAATGTCCTGAATG-3' (SEQ ID NO:136). El cebador se localiza en forma adicional en la corriente ascendente del extremo 5' del fragmento glgBXCAP PCR generado a partir de los oligonucleótidos GNglgBXCAP1-5 (SEQ ID NO:112) y GNglgBXCAP2-3 (SEQ ID NO:113). La secuencia de GNglgBXCAP4-3 es: 5'-CGAAATCATCGTTGCCAGTAACTTTACG-3' (SEQ ID NO:137).

El cebador se localiza adicionalmente en la corriente descendente del extremo 3' del fragmento glgBXCAP PCR generado a partir de los oligonucleótidos GNglgBXCAPI -5 (SEQ ID NO.H2) y GNglgBXCAP2-3 (SEQ ID NO:113). En la clasificación PCR dos cepas produjeron productos PCR del tamaño esperado (2295 pares base) para las secuencias gígXCAD. Estas dos cepas fueron denominadas 7107-307 y 7107-309. Las cepas se sometieron posteriormente a una prueba de vapor de yodo para demostrar que ninguna de estas cepas tuvo la capacidad de acumular glicógeno. Para llevar a cabo la prueba, se expusieron placas con 7107-18, 7107-308 y 7107-309 a vapores procedentes de cristales de yodo. Únicamente la cepa 7107-18 se volvió de un color café obscuro, que indica la presencia de glicógeno. Experimentos en frascos de agitación para probar la producción NAG en cepas con deficiencia de glicógeno Una clasificación de frasco de agitación evaluó cepas con la síntesis de glicógeno bloqueada mediante la eliminación glg. Las cepas se crecieron en un medio 9B suplementado con 40 g I"1 de glucosa, 10 g I"1 de ribosa y 5 g G1 de extracto de levadura. Parecieron haber algunas diferencias interesantes entre las cepas con la eliminación glg. Algunas cepas con eliminación glg (por ejemplo 7107-604) crecieron mejor que el control, aunque produjeron un nivel disminuido de NAG. La cepa 7107-605-1 mostró un crecimiento comparable con el control, aunque con una mejoría del 12% en el titulador NAG. Tabla 30. Crecimiento y producción NAG en cepas con eliminación de glg en experimentos en frascos de agitación Ejemplo 28 El ejemplo que se encuentra a continuación demuestra los efectos de la eliminación de uno de los dos genes /acl y el reemplazo del promotor lac con el promotor lacUV5 en la disminución de la represión de glucosa y la producción de glucosamina/N-acetilglucosamina. Se sabe que la presencia de glucosa en el medio, reprime la expresión del promotor lac en E. coli. El operón lac codifica tres proteínas: LacZ, LacY, y LacA. El gen /acZ, codifica la enzima ß-galactosidasa, la cual disocia la lactosa en glucosa y la galactosa y también convierte la lactosa en alolactosa, un inductor real del operón. La alolactosa induce el operón lac interactuando con el represor (codificado por el gen /acl) y evita que se enlace al operador lac. El gen /acY codifica la permeasa de lactosa que controla el influjo de lactosa en la célula. El gen lacA codifica la transacetilasa de tiogalactosida (acetiltransferasa de galactosidasa), una enzima que puede ayudar a la destoxificación celular de piranosidas no metabolizables. La transcripción del operón lac requiere el enlace de la secuencia promotora lac a través del complejo CRP:cA P, un complejo formado entre cAMP y su proteína receptora (CRP). Se considera que la glucosa reprime el operón lac reduciendo los niveles cAMP en las células. El promotor lacilV5 es una versión mutante del promotor lac que contiene cambios de nucleótidos específicos. Debido a estos cambios, el promotor lac ya no requiere el enlace mediante el compiejo CRP:cAMP para activar la transcripción. Esto sugiere que el operón lac bajo el control lacUV5 podría no ser susceptible a represión de glucosa. Por consiguiente, se reemplazo el promotor lac a través del promotor lacUV5 (representado en la presente invención mediante la SEQ ID NO:135) en cepas E. coll que producen N-acetilglucosamina y/o glucosamina para minimizar la represión de glucosa. Algunas cepas de producción de N-acetilglucosamina y/o glucosamina contienen dos copias del gen represor lac\. Uno es un componente del operón lac nativo y el otro se encuentra en el elemento DE3. La cantidad de proteína represora lacl celular puede afectar la fuerza de represión. Por consiguiente, la eliminación de uno de los genes /acl puede afectar la inducción mediante lactosa de la producción de glucosamina/N-acetilglucosamina. Reemplazo del promotor lac con el promotor lacUV5 Se generaron diversos plásmidos promotores antes de la construcción del plásmido utilizado para integrar el promotor lacUV5 en cepas que producen N-acetilglucosamina y/o glucosamina. Se llevó a cabo la generación del primer plásmido precursor que incluyó amplificación PCR del fragmento mphRIacllacZ de la cepa E. col! W3110, utilizando los cebadores de oligonucleótidos GNmphRIacllacZI -5 (SEQ ID NO:116) y GNmphRlacllacZ2-3 (SEQ ID NO:117). La secuencia de GNmphRIacllacZI -5 fue tal como se indica: 5'-ATTGTGCGCTCAGTATAGGAAGG-3' (SEQ ID NO:116), y la de GNmphRlacllacZ2-3: 5'-CGATACTGACGGGCTCCAG-3' (SEQ ID NO:117). El producto PCR con tamaño corregido que contiene la secuencia mphRIacllacZ, se clonó en pCR®2.1-TOPO® para generar pCALG3-1. El siguiente plásmido precursor resultó de una mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene® QuikChange® XL Site-Directed Mutagénesis Kit, Catalog #200517) de pCALG3-1 utilizando los oligonucleótidos GNacdel2-5 (SEQ ID NO:118) y GNIacdel3-5 (SEQ ID NO:119). La secuencia de GNIacdel2-5 fue: 5'-(fosforilado) GCAAAACCTTTCGCGGTCACCCATGATAGCGCCCG-3' (SEQ ID NO:118). La secuencia del cebador es idéntica a la secuencia lacl W3110 excepto por los cambios de ATGG a CACC que se hicieron para agregar el sitio BstE II (representado a partir de los nucieotidos 15 a 21 de la SEQ ID NO:118) 5' del codón de inicio lacl. La secuencia de GNIacdel3-5: 5'-(fosforilado) CGGGCGCTATCATGGGTGACCGCGAAA-GGTTTTGC-3' (SEQ ID NO:119). La secuencia de oligonucleótidos es complementaria en forma inversa a la secuencia lacl W3110 excepto por lo cambios de CCAT a GGTG elaborados para agregar el sitio BstE II (representado de los nucieotidos 15 a 21 de la SEQ ID NO:119) 5' del codón de inicio lacl. La mutagénesis dirigida al sitio de pCALG3-1 utilizando los oligonucleótidos GNIacdel2-5 (SEQ ID NO:118) y GNIacdel3-5 (SEQ ID NO:119) agregaron un sitio BstE II 5' del codón de inicio lacl para generar pCALG5-1. Este plásmido recombinante consiste de la secuencia mphRlacllacZ con un sitio BstE II 5' del codón de inicio lacl en el esqueleto de pCR®2.1 -TOPO®. Posteriormente, se digirió pCALG5-1 con BstE II y el fragmento que contiene las secuencias 3' de lacl, una parte del gen lacZ con el promotor lac, pCR®2.1 -TOPO®, y se aislaron las secuencias procedentes de mphR. El fragmento aislado de pCALG5-1 se ligó así mismo para generar pCALG10-1. El plásmido pCALG10-1 recombinante que contiene las secuencias mphR, lacID, el promotor lac, las secuencias lacZ en el esqueleto de pCR®2.1 -TOPO®. Posteriormente, se digirió pCALG10-1 con BstE II y Nde I y el fragmento que contiene pCR®2.1 -TOPO® y se aislaron las secuencias mphR. El fragmento pCALG10-1 aislado se ligó posteriormente a los dos productos PCR. El primer producto PCR, generado a partir de pCALG10-1, contenía la secuencia lacZ con el sitio Nde I agregado inmediatamente 5' de codón de inicio lacZ. Utilizando PCR bajo condiciones estándar y los cebadores de oligonucleótidos GNLacZ1-5 (SEQ ID NO.-120) y GNLacZ2-3 (SEQ ID NO:121), se amplifica la parte de pCALG10-1 que contiene la secuencia lacZ. La secuencia de GNLacZ1-5 es tal como se indica a continuación: 5'-CACAGGAAACACATATGACCATGATTACGG-3' (SEQ ID NO:120). La secuencia del cebador es idéntica a los nucleótidos 1921 a 1950 de pCALG10-1 (el promotor /ac/unión lacZ) excepto por los cambios en los nucleótidos G1932C y C1933A para agregar un sitio Nde I (representado por los nucleótidos 12-17 de la SEQ ID NO:120). La secuencia de GNLacZ2-3 es: 5'- CCACCATGATATTCGGCAAGCAG-3' (SEQ ID NO:121). La secuencia es complementaria en forma inversa a los nucleotidos 6523 a 6545 de pCALG10-1. Utilizando PCR bajo condiciones estándar y los cebadores de oligonucleótido GNLacuv53-5 (SEQ ID NO:122) y GNLacuv54-3 (SEQ ID NO:123), se amplificó el segundo producto PCR, el promotor lacUV5 de la cepa 7101 -17(DE3). La secuencia de GNLacuv53-5 es: 5'- CCTTTCGCGGTCACCAGCAAA-3' (SEQ ID NO:122). La secuencia es idéntica a los nucleotidos del 1253 al 1273 de pCALG10-1 y comprende el sitio BstE II endógeno (representado por las secuencias de nucleotidos 9 a 15 de la SEQ ID NO:122) dentro de lacl. La secuencia de GNLacuv54-3 es: 5'-CCGTAATCATGGTCATATGTGTTTCCTGTG-3' (SEQ ID NO:123). La secuencia es complementaria en forma inversa a los nucleotidos 1921 a 1950 de pCALG10-1 (el promotor /ac/unión lacZ) excepto por los cambios en los nucleotidos C1923G y G1933T para agregar un sitio Nde I (representado por los nucleotidos 14 a 19 de la SEQ ID NO:123). El fragmento del promotor lacUV5 generado mediante PCR se digirió con BstK II además de Nde I, y se purificó. En forma similar, se digirió el producto PCR que contiene la secuencia lacZ con Nde I y se purificó. Para generar el siguiente plásmido precursor, se ligó el fragmento mphR (Nde l-SsíE II) procedente de pCALG10-1, el fragmento del promotor lacUV5 (BstE W-Nde I), y el fragmento lacZ (Nde I- Nde I) juntos. El plásmido recombinante resultante, pCALG16-3, contiene las secuencias mphR, lacID, el promotor lacilV5, las secuencias lacZ (en orden opuesto a la forma nativa de las secuencias) en el vector pCR®2.1 -TOPO®. Las secuencias promotoras lacUV5 corregidas de pCALG16-3, se confirmaron mediante secuenciación. Posteriormente, se amplificó mediante PCR el fragmento lacZ en pCALG10-1, utilizando condiciones estándar y los cebadores de oligonucleótidos GNLacZ1-5 (SEQ ID NO:120) y GNLacZ3-3 (SEQ ID NO:124). La secuencia de nucleótidos de GNIacZ3-3 es: 5'-GACGAAGCGGCCGCGTAAACG-3' (SEQ ID NO:124). La secuencia es complementaria en forma inversa a los nucleótidos 3618 a 3638 de pCALG10-1 excepto por los cambios en los nucleótidos T3625C, C3626G, y C3630G para agregar un sitio Not I (representado por los nucleótidos 7 a 14 de SEQ ID NO:124). El fragmento PCR lacZ se digirió con Nde I y Not I y se aisló. Además, se digirió pCALG16-3 con Nde I a Not I y se aisló el fragmento que contiene pCR®2.1 -TOPO®, las secuencias de mphR, lacID, y el promotor lacUV5. El fragmento PCR lacZ y el fragmento pCALG16-3 que contiene pCR®2. -TOPO®, las secuencias mphR, lacID, y el promotor lacUV5 se ligaron juntos para producir pCALG20-1. El plásmido pCALG20-1 recombinante que contiene pCR®2.1- TOPO®, las secuencias de mphR, lacID, el promotor lacUV5 (con un sitio Nde I inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ) y la región de codificación lacZ en la orientación 5' a 3'. Se utilizó pCALG3-1 construida previamente junto con pCALG20-1 para generar el siguiente plásmido precursor. Tanto pCALG3-1 y pCALG20-1 se digirieron con Apa I. El fragmento pCALG20-1 que contiene el promotor lacUV5 y las secuencias lacZ y el fragmento pCALG3-1 que contiene pCR®2.1-TOPO®, las secuencias mphR y lacl de longitud completa se aislaron y ligaron juntas para producir pCALG22-1. El pCALG22-1 recombinante que contiene las secuencias mphR, lacl de longitud total, el promotor lacUV5 (con el sitio Nde I inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ) las secuencias lacZ y pCR®2.1 -TOPO®. pCALG22-1 y pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Catalog #27-4958-01, Acceso GenBank #X06404), se utilizaron para generar el siguiente plásmido precursor. pCALG22-1 y pUC4K, ambos se digirieron con BamHI. El fragmento pCALG22-1 que contiene las secuencias mphR, lacl de longitud completa, el promotor lacUV5, las secuencias lacZ, y pCR®2.1 -TOPO®, y el fragmento pUC4K que contiene Kanr se aislaron y ligaron juntas para generar pCALG25-1. El pCALG25-1 recombinante que consiste de Kanr, secuencias mphR, lacl de longitud completa, el promotor lacilV5 (con el sitio Nde I inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ) secuencias lacZ, y pCR®2.1 -TOPO®. Para generar el siguiente plásmido precursor, pCAI_G25-1 y pKLN07-20 (que se describen en cualquier parte) se digirieron con Kpn I y Not I. El fragmento pCALG25-1 que contiene Kanr, las secuencias mphR, lacl de longitud completa, el promotor lacUV5 y las secuencias lacZ y el fragmento pKLN07-20 que contiene el origen de réplica sensible a la temperatura procedente de pMAK705 (descrito anteriormente), se aislaron y ligaron juntos para generar pCALG29-1. El plásmido pCALG29-1 recombinante que contiene Kanr, las secuencias mphR, lacl de longitud completa, el promotor lacUV5 (con el sitio Nde I inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ), las secuencias lacZ, y la región sensible a la temperatura procedente de pMAK705. Después de construir pCALG29-1, se consideró que esto podría ser el vector de integración final. Sin embargo, se determinó subsecuentemente que la adición del sitio Nde I inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ inhibió la expresión adecuada de lacZ. Por consiguiente, se sometió pCALG29-1 a mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene® QuikChange® XL Site-Directed Mutagénesis Kit, Catalog #200517) para destruir el sitio Nde I y reemplazar los cambios del nucleótido Nde I con los nucleótidos lacUV5 endógenos. Para hacer los cambios necesarios a pCALG29-1, se sometió pCALG29-1 a mutagénesis dirigida al sitio utilizando los oligonucleotidos GNIacZ-Nde1 (SEQ ID NO:125) y GNIacZ-Nde2 (SEQ ID NO:126) para producir pCALG31-1. La secuencia de nucleótidos de GNIacZ-Nde1 es como sigue: 5'-CACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTC-ACTGG-3' (SEQ ID NO:125). La secuencia es idéntica a los nucleótidos 1919 a 1959 de pCALG10-1. La secuencia de nucleótidos de GNIacZ-Nde2 es como se Indica: 5'-CCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTG-TGTG-3' (SEQ ID NO:126). La secuencia es complementaria en forma inversa a los nucleótidos 1919 a 1959 de pCALG10-1. El plásmido pCALG31-1 recombinante resultante contiene Kanr, secuencias mphR, lacl de longitud completa, el promotor lacUV5 (con nucleótidos endógenos inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ), secuencias lacZ, y el origen de réplica sensible a la temperatura de pMAK705. Se transformó pCALG31-1 recombinante en 7107-18 y se generaron clones con el reemplazo del promotor lacUV5 utilizando el procedimiento de selección de temperatura. Para identificar los clones correctos, se preparó ADN genómico y la región del promotor lacUV5 se amplificó mediante PCR. Posteriormente los productos PCR se secuenciaron para confirmar la presencia del promotor lacUV5. Una cepa genera un producto PCR del tamaño esperado y tuvo la secuencia de ADN correcta. Esta cepa se denominó 7107-310.

Eliminación lacl y reemplazo del promotor lac con el promotor lacUV5 Para generar el plásmido necesario para eliminar lacl del operón lac y reemplazar el promotor lac con el promotor lacUV5 en cepas de producción de N-acetilglucosamina y/o glucosamina, se desarrollaron dos plásmidos precursores. Para generar el primer plásmido precursor, pCALG20-1 (ver anteriormente) y pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Catalog #27-4958-01, Acceso GenBank #X06404), se digirieron con SamHI. El fragmento pCALG20-1 que contiene las secuencias mphR, lacID, el promotor lacUV5 (con el sitio Nde I inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ), las secuencias lacZ, y pCR®2.1 -TOPO® y el fragmento pUC4K que contiene Kanr, se aislaron y ligaron juntos para generar pCALG26-1. El pCALG26-1 recombinante consiste de Kanr, secuencias mphR, ¡acID, el promotor lacUV5 (con el sitio Nde I inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ), las secuencias lacZ, y pCR®2.1-TOPO®. Para generar el siguiente plásmido precursor, pCALG26-1 y pKLN07-20 (descritos en cualquier parte) se digirieron con Kpn I y Not I. El fragmento pCALG26-1 que contiene Kanr, secuencias mphR, lacID, el promotor lacUV5 (con un sitio Nde i inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ), y las secuencias lacZ y el fragmento pKLN07-20 que contiene el origen de réplica sensible a la temperatura procedente de pMAK705 (descrito anteriormente), se aislaron y ligaron juntos para generar pCALG30-1. El plásmido pCALG30-1 contiene Kanr, las secuencias mphR, laclD, el promotor lacUV5 (con un sitio Nde I inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ), secuencias lacZ, y el origen de réplica sensible a la temperatura procedente de p AK705. Después de construir pCALG30-1, se consideró que esto podría ser un vector de integración final. Sin embargo, se determinó subsecuentemente que la adición del sitio Nde I después de 5' del codón de inicio lacZ inhibió la expresión adecuada de lacZ. Por consiguiente, pCALG30-1 se sometió a mutagénesis dirigida al sitio Stratagene® QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit, Catalog #200517) para destruir el sitio Nde I y reemplazar los cambios del nucleótido Nde I con los nucleótidos lacUV5 endógenos. Para hacer los cambios necesarios a pCALG30-1, se sometió pCALG30-1 a mutagénesis dirigida al sitio utilizando los oligonucleótidos GNIacZ-Nde1 (SEQ ID NO:125) y GNIacZ-Nde2 (SEQ ID NO:126) para producir pCALG332-2. El plásmido pCALG32-2 recombinante resultante contiene Kanr, las secuencias mphR, laclD, el promotor lacUV5 (con nucleótidos endógenos inmediatamente 5' del codón de inicio lacZ), secuencias lacZ, y la región sensible a la temperatura procedente de pMAK705. Se transformó pCALG32-2 recombinante en 7107-18 y los clones con el reemplazo del promotor lacUV5 se generaron utilizando el procedimiento de selección de temperatura. Para identificar los clones correctos, se preparó ADN genómico y se amplificó mediante PCR la región del promotor lacUV5. Posteriormente se secuenciaron los productos PCR para confirmar la presencia del promotor lacUV5. Se generaron tres cepas del producto PCR del tamaño esperado y tuvieron la secuencia de ADN correcta. Estas cepas fueron denominadas 7107-313, 7107-314, y 7107-315. Eliminación lacl procedente del elemento DE3 Para eliminar el gen lacl del elemento DE3 en el genoma de las cepas de producción, se utilizó el método de selección sensible a la temperatura descrito en el ejemplo 13. Esta estrategia implicó la construcción de un vector de integración al objetivo del elemento DE3 para la eliminación lacl. Para el primer paso de construcción, se amplificó la región que contiene lacl del elemento DE3 mediante PCR a partir de ADN genómico 7107-73 de E. coli. Los cebadores se sintetizaron con base en la secuencia publicada del RNAP T7 y la región attB del genoma E. coli (Blattner y Asociados, 1997, Science 277(5331):1453-1474). El cebador de avance 07-74 y el cebador inverso 07-48 fueron utilizados para la amplificación y tuvieron las siguientes secuencias: 'GATCCCGGGAACGGACGATTAGAGATCACC3' (SEQ ID NO:127) y 07-48: 5'-GTCAGAGAAGTCGTTCTTAGCGATG3' (SEQ ID NO:128). El cebador de avance 07-74 agregó a un sitio Sam I (CCCGGG, representado en los nucleótidos 4 a 9 de la SEQ ID NO:127) y se amplificó a partir de la corriente ascendente de 1194 pares base en el sitio attB del genoma E. col¡. El cebador inverso 07-48 se amplificó a partir de la corriente ascendente de 36 pares base del codón de inicio ATG 1 del gen T7. Se ligó el fragmento PCR de ~3.2 kb resultante en el vector pPCR™SK( + ) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), generando los plásmidos pSW07-53#7 y #17. La secuenciación del ADN reveló que el producto PCR contenía la región de la corriente ascendente del genoma del sitio attB además del fragmento lacl lacZ' del elemento DE3. Para generar la eliminación de lacl, se digirió el plásmido pSW07-53#17 con endonucleasas de restricción Mlu I y Sfo I para eliminar fragmentos de 640 pares base de la secuencia de codificación lacl. El resto del plásmido pSW07-53 se trató con DNAP T4 para producir extremos romo y posteriormente ligarlos así mismos, generando el plásmido pSW07-55#13. El fragmento que contiene la secuencia DE3 con la eliminación lacl se digirió a partir del plásmido pSW07-55#13 con las endonucleasas de restricción Not I y Sal I. Este fragmento se ligó con el fragmento Sal I y Not I de 4.2 kb procedente de pKLN07-21, que contiene la réplica sensible a temperatura de p AK705 (Hamilton y Asociados, 1989, J. Bac. 171(9):4617-4622) y la cinta de resistencia a kanamicina procedente de pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). El plásmido resultante, pKLN07-56#13, se utilizó para generar la eliminación de lacl del elemento DE3 en el cromosoma E. coli. Para generar una cepa con la eliminación lacl del elemento DE3, se transformó 7107-18 E. coli con el plásmido pSW07-56# 3. Después del protocolo de selección sensible a la temperatura y al pase, se clasificaron cepas utilizando un protocolo PCR estándar para la presencia de la eliminación. Se confirmaron diversas cepas identificadas mediante PCR a través de hibridación Southern altamente estricta utilizando un fragmento que contiene una parte del fragmento lacl y lacZ del elemento DE3 como sonda. Estas cepas se designaron de la 7107-84(1) a la 7107-94(4). Producción de qlucosamina en cepas con reemplazo del promotor lacID y/o lacUV5 en frascos de agitación La cepa 7107-84(1) contiene únicamente un gen lacl, en forma opuesta a la cepa 7107-18 con dos genes funcionales lacl. Se llevó a cabo la clasificación en frasco de agitación 42 para determinar el efecto de la eliminación lacl de la cepa 7107-84(1) en inducción mediante lactosa. En la presencia de glucosa y lactosa en exceso, la inducción mediante lactosa debe inhibirse en la cepa 7107-18 debido a la proteína represora LacI que enlaza al operador lac, evitando la transcripción. Esta inhibición mediante glucosa debe reducirse en la cepa 7107-84(1), por lo menos la proteína represora LacI debe estar presente para enlazar al operador lac, permitiendo la transcripción incrementada de los promotores lac. Esto debe incrementar los conjuntos de T7 RNAP en las células, dando como resultado una transcripción incrementada de la cinta T7lac-glmS*54. Al final, los mayores niveles de glucosamina deben dar como resultado la cepa 7107-84(1). De igual forma, las cepas que contienen la eliminación lacl es el operón lac (por ejemplo, 7107-313, 7107-314 y 7107-315) debe tener mayores niveles de producción de GlcN al momento de las inducciones mediante lactosa. Las cepas E. coli con el gen lacl eliminado del operón lac (7107-310), con el gen lacl eliminado del elemento DE3 (7107-84#1), y con la eliminación lacl procedente del operón lac en el cual se reemplaza el promotor lac con el promotor lacUV5 (7107-313, 7107-314, y 7107-315) se compararon con la cepa 7107-18 en los experimentos en frascos de agitación. Todas las cepas se crecieron en frascos que contienen medio M9B: 6 g/l KH2P04, 24 g/l K2HP04, 1 g/l Na3citrato-2H20, 10 g/l (NH4)2S04 (pH ajustado a 7.4 mediante fosfato), y oligometales (0.2 mg/l FeS04-7H20, 0.015 mg/l ZnS04-7H20, 0.015 mg/l MnS04-H20, 0.001 mg/l CuS04-5H20, 0.001 mg/l NaMo04-2H20, 0.001 mg/l H3B03, y 0.001 mg/l CoCI2-6H20), suplementado con 0.6 g/l MgS04-7H20 y 0.05 g/l CaCI2-2H20. Para probar la represión de glucosa, los frascos contenían diversas cantidades de glucosa y lactosa. Las cantidades de glucosa y lactosa utilizadas en los frascos se muestran en la tabla 4 y en la tabla 5. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C, con agitación a 225 rpm, durante 24 horas y posteriormente se ajustó la temperatura a 25°C, con agitación a 225 rpm, durante el resto del experimento. A las 24 y 48 horas, cada cultivo se ajustó a un pH de 7.0, se agregó glucosa a los frascos a aproximadamente 30 g/l, y 5 g/l (NH4)2S04 se agregó a los cultivos en los cuales el nivel de amonia había caído a 1 g/l. Las muestras se recolectaron a las 24 y 48 horas. Cada punto de tiempo la concentración de glucosamina en el sobrenadante de cultivo, fue medida utilizando el ensayo Elson- organ modificado tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,372,457 B1. Los niveles de glucosamina se muestran en la tabla 31. Tal como se espera, las cepas 7107-18, 7107-84(1), 7107-310 y 7107-313 se desempeñaron en forma similar en la presencia de glucosa sola o lactosa sola. Se observó poca producción GlcN en cualquier cepa cuando se creció en glucosa, ya que no estuvo presente el inductor. Cuando las cepas se crecieron con lactosa en la forma del inductor, ocurrieron acumulaciones de glucosamina significativas con ambas cepas. Sin embargo, cuando las cepas se crecieron en la presencia tanto de glucosa como de lactosa, la eliminación de una copia del gen lacl del cromosoma, impactó en forma significativa la inducción mediante lactosa, y por lo tanto, los tituladores de glucosamina. La cepa 7107-313 y 7107-84(1) logró aproximadamente de 6 a 8 veces el nivel de glucosamina observada en la cepa 7107-18 en el punto de tiempo de 48 horas. Esto confirma el concepto de que la proteína represora Lacl disminuida permite una transcripción incrementada de los promotores lac, dando como resultado niveles incrementados de producción de glucosamina.

Tabla 31. Concentración de glucosamina en diferentes muestras procedentes de la Clasificación en Frasco de Agitación 42 Integración de la cinta T7 ¡ac-ScGNA1 en cepas con reemplazo del promotor lacID y/o lacUV5 Para evaluar el efecto de la eliminación lacl en la desrepresión de glucosa en las cepas de producción NAG, fue necesario agregar la cinta TJ lac-ScGNA1 al cromosoma de la cepa 7107-84(1) y 7107-84(2). Se emplearon tal como se explica en forma detallada en cualquier parte de la presente invención los métodos y protocolos descritos para la clonación de GNA1 y la integración mediante selección sensible a la temperatura con el piásmido pSW07-68#5. Las cepas resultantes 7107-97 y 7107-98 se confirmaron mediante hibridación Southern altamente estricta utilizando la secuencia de codificación ScGNAl como una sonda que tiene la cinta T7 lac-ScGNA1 integrada en el sitio de eliminación manXYZ del cromosoma. En forma similar, se construyeron otras versiones de las cepas de glucosa desreprimidas potencialmente. Se construyó la cepa 7107-310 alterando el promotor del operón lac a la versión lacUV5. Las cepas 7107-313, 7107-314, y 7107-315 se construyeron eliminando la copia cromosomica del gen lacl además de alterar el promotor del operón lac a la versión lacUV5 del promotor. Para evaluar el efecto de estas mutaciones en la desrepresión de glucosa en un soporte de producción NAG, se agregó la cinta T7 lac-ScGNA1 al cromosoma de las cepas. Se emplearon los métodos y protocolos descritos para la clonación e integración de GNA1 mediante selección sensible a la temperatura con el piásmido pSW07-68#25 para las cepas 7107-310 y 7107-313. Las cepas resultantes 7107-129 y 7107-130 (procedentes de la cepa 7107-310) y 7107-131 (procedente de la cepa 7107-313) se confirmaron como teniendo la cinta T7 lac-ScGNA1 integrada mediante el sitio de la eliminación manXYZ del cromosoma utilizando hibridación Southern altamente estricta con la secuencia de codificación ScGNAl como la sonda. Producción de N-acetilglucosamina en cepas con reemplazo del promotor lacID v/o lacUV5 en frascos de agitación Se llevó a cabo la clasificación para evaluar el efecto de la eliminación lacl del elemento DE3 en desrepresión de glucosa en una cepa de producción NAG. Se probaron las cepas 7107-97 y 7107-98(2) con diversos niveles de glucosa y lactosa, con y sin adición de ribosa. Se incluyó la cepa de producción NAG 7107-92(1), con dos copias de lacl como un control. Los cultivos se crecieron en un medio M9B (descrito previamente) suplementado con 0.6 g/l gS04-7H20, 0.05 g/l CaCl2-2H20, diversas concentraciones de glucosa y lactosa y 5 g/l de extracto de levadura. Las cepas se crecieron inicialmente en 10 g/l de glucosa con un cambio a utilización de lactosa una vez que se agotó la glucosa. Las condiciones de glucosa en exceso (en la presencia de lactosa) también se utilizaron para determinar la sensibilidad a represión de glucosa. Cada variable se desempeñó con o sin adición de ribosa. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C durante 24 horas y posteriormente se cambió la temperatura a 25°C durante el resto del experimento. En los puntos de tiempo de 24 a 48 horas, se ajustó el pH a 7.2 y se agregó glucosa hasta un total de 30 g/l. Se agregó 5 g/l (NH4)2S04 a las 24 y 48 horas a los frascos en los cuales los niveles habían disminuido debajo de 1 g/l. Las muestras se analizaron para la producción de NAG a las 24, 48 y 72 horas.

La cepa de control se desempeñó bien en condiciones sin represión, produciendo alrededor de 20 g/l NAG, aunque produjo únicamente aproximadamente 5 g/l con glucosa en exceso (tabla 32). Una cepa mutante (7107-98) se desempeñó en forma similar al control, aunque la otra, (7107-97), mostró resistencia a glucosa, produciendo alrededor de 20 g/i de NAG incluso cuando estuvo presente un exceso de glucosa. De hecho, esta también pareció desempeñarse mejor que el control bajo condiciones sin represión en términos de producción NAG y acumulación de acetato. La adición de ribosa a los cultivos no incrementó en forma significativa el crecimiento o los tituladores NAG en este experimento. Los resultados generales indican que la eliminación del elemento lacl de DE3 no disminuyó al menos parcialmente la represión de glucosa, dando como resultado tituladores NAG mejorados en la cepa de producción.

Tabla 32. Efecto de la eliminación lacl y del elemento DE3 en desrepresión de glucosa en la presencia de diversas cantidades de glucosa y lactosa. 1)Cepas: Control 7107-92(1): dos genes lacl. 7107-97 y 7107-98(2): únicamente un gen lacl (el DE3 se eliminó). 2) Los niveles OD6oo> acetato y NAG son del punto de tiempo de 72 horas. Se llevó a cabo otra clasificación para evaluar las cepas 7107-129, 7107-130 y 7107-131 para la desrepresión de glucosa. La cepa de producción NAG 7107-92(1), con dos copias de lacl, se incluyó como un control. Se crecieron cultivos en un medio M9B (descrito previamente) suplementado con 0.6 g/l MgS04-7H20, 0.05 g/l CaCI2-2H20, concentración variada de glucosa y lactosa, 5 g/l de ribosa y 5 g/l de extracto de levadura. Las cepas se crecieron inicialmente en 10 g/l de glucosa con un cambio a lactosa una vez que la glucosa se agotó para la confirmación de inducción mediante lactosa. Las condiciones de glucosa en exceso (en la presencia de latosa) en la cual la lactosa siempre estuvo presente, se utilizaron para probar la cepa 7107-131 para determinar la sensibilidad a glucosa con respecto a la inducción. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C durante 24 horas y posteriormente se cambió la temperatura a 24°C para el resto el experimento. El pH se ajustó a 7.2 y se agregó glucosa hasta un total de 30 g/l por día en los puntos de tiempo de 24 y 48 horas. Se agregó 5 g/l de (NH4)2S04 a las 24 y 48 horas a los frascos en los cuales los niveles habían bajado a 1 g/l. Las muestras se analizaron para la producción NAG a las 24, 48 y 72 horas. Tal como se observa en la tabla 33, una de las cepas mutantes lacilV5 (7107-130) y la cepa muíante lac(JV5 con la eliminación lacl (7107-131), se desempeñó mejor que la cepa de control 7107-92(1) cuando creció inicialmente en glucosa con un cambio a lactosa después de que se agotó la glucosa. En condiciones de glucosa en exceso, la cepa 7107-131 se desempeñó mejor que la cepa de control 7107-92(1), produciendo aproximadamente 30% más de NAG. Esto confirma que la eliminación de cualquier copia de lacl ayudará a disminuir la represión de glucosa, permitiendo que ocurra la inducción en la presencia de glucosa en exceso y mejorando los tituladores NAG. Tabla 33. Efecto de eliminación lacl y/o del promotor lacUV5 en la producción NAG bajo condiciones de glucosa limitada o en exceso. Cepa Azúcares iniciales (g ) ODsoo Acetato NAG Glucosa Lactosa (gi-1) (g r1) Condiciones de límite de glucosa: 7107-92(1) 10 40 9.75 2.4 24.3 7107-129 10 40 9.75 2.0 23.3 7107-130 10 40 11.25 3.0 30.4 7107-131 10 40 11.25 2.2 31.6 Condiciones de exceso de glucosa: 7107-92(1) 40 10 12.75 6.4 5.3 40 20 13.5 6.5 5.8 7107-131 40 10 15.0 5.7 15.4 40 10 13.87 6.0 14.2 40 20 15.75 4.0 21.0 40 20 14.25 5.0 18.6 1) Cepas: Cepa de control 7107-92(1): lacl(lac), lacl(DE3). 7107-129, 7107-130: lacUV5, lacl(lac), lacl(DE3). 7107-131: ¡acUV5, laclA(lac), lacl(DE3). 2) Los niveles de OD60o, acetato, y NAG son del punto de tiempo de 72 horas. Ejemplo 29 El ejemplo que se encuentra a continuación demuestra los efectos de la restauración de la utilización de galactosa en la acumulación de N-acetilglucosamina y/o glucosamina. Las cepas que producen N-acetilglucosamina y/o glucosamina inducidas mediante lactosa que contienen la construcción galKA::T7-lac-glmS*54, no tiene la capacidad de utilizar la galactosa como una fuente de carbono debido a galKA. Estas cepas acumulan galactosa debido a la disociación de la lactosa en glucosa y galactosa mediante ß-galactosidasa. En un esfuerzo de disminuir la acumulación de galactosa en estas cepas, se necesita integrar la cinta de expresión T7-lac-glmS*54 en un lugar diferente en el cromosoma. Las cepas que producen N-acetilglucosamina y/o glucosamina construidas previamente contienen nagA::Tetr. La parte nagA::Tetr del genoma se transfirió de la cepa paterna IBPC590 (Plumbridge (1991) Mol. Microbiol. 5, 2053-2062) mediante la transducción de fago P1 tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,372,457 B1. La presencia de Tetr en las cepas de producción no es recomendable. Por consiguiente, el reemplazo de Tetr con T7-lac-glmS*54 podría no servir como un sitio de integración para T7-lac-glmS*54, podría también eliminar Tetr en el mismo proceso. La integración de la construcción Aaga\kT7-lac-glmS*54 en 7101 -17(DE3), para producir la cepa 7107-18 (descrita previamente en el ejemplo 7), ha conducido a un incremento significativo en la producción de glucosamina. Además, la integración de la construcción manXYZA T7-lac-ScGNA1 en 7107-18, ha conducido a la producción de N-acetilglucosamina, descrita previamente en el ejemplo 16. Para desarrollar las cepas de producción de N-acetilglucosamina con la capacidad de metabolizar la lactosa, se integró la cinta de expresión T7-lac-glmS*54 integrada en el sitio nagDwleW seguido de la inserción de la cinta de expresión T7-lac-ScGNA1 en el sitio manXYZ. Los pasos implicados en la construcción de cepas que contienen nagA::T7-lac-g/mS*54 y manXYZA::T7-lac-ScGNA1 incluyó la generación de tres plásmidos precursores. Para generar el primer plásmido precursor, el fragmento T7-lac-glmS*54 procedente de pKLN23-54 (descrito en la Patente Norteamericana No. 6,372,457 B1) se amplificó mediante PCR utilizando condiciones estándar con cebadores de oligonucleótidos GNgimSnagE3-5 (SEQ ID NO:129) y GNglmSnagE4-3 (SEQ ID NO:130).

GNgImSnagE3-5: 5'-GGATCTAAACCTCAGTAGCGACCGGTCTAGAACTA-GTG-3' (SEQ ID NO:129). El cebador es idéntico a los nucleótidos 1109 a 1146 de pKLN23-54 con la siguientes excepciones: C1115A, C1116A, G1120T, G1122A, G1125A, G1129A, y C1133G. Los cambios en los nucleótidos 1115 a 1125 de pKLN23-54 (que corresponde a los nucleótidos 8, 12, 14, 17, 21, y 25 de la SEQ ID NO:129), se realizaron para incrementar la actividad del cebador PCR y los cambios en 1129 y 1133 de pKLN23-54 agregan un sitio Age I a la SEQ ID NO:129 (representado a partir de la posición 21 a la posición 26 de la SEQ ID NO:129). GNglmSnagE4-3 5'-CCCTCGCCCCTCTAGAGCATTTAAATTCAGTCAATT-AC-3' (SEQ ID NO:130). El cebador es complementario en forma inversa a los nucleótidos 3237 a 3274 de pKLN23-54 con las siguientes excepciones: T3251A, G3253T, G3256A, A3270C, y T3273C (representado mediante las posiciones 24, 22, 19, 5 y 2, respectivamente, de la SEQ ID NO:130). Se realizaron los cambios del 3251 al 3256 para agregar un sitio Swa I (representado por las posiciones 19 a 26 de la SEQ ID NO:130) y se realizaron los cambios en 3270 y 3273 para incrementar la estabilidad del cebador en el PCR. El producto PCR resultante se ligó en pCR®-Blunt II-TOPO® (Invitrogen Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit, Catalog #K2800-20). El plásmido recombinante pCALG38-2, contiene la cinta de expresión T7-lac-glmS*54 flanqueada 5' por un sitio Age I y 3' por un sitio Swa I. Para generar el segundo plásmido precursor, se amplificó el fragmento nagA::Tetr::asn a partir de la cepa 7107-18 E. coli mediante PCR utilizando GNnagEteR1-5 (SEQ ID NO:131) y GNnagEtetR2-3 (SEQ ID NO:132). La secuencia de nucleótidos de GNnagEtetRI -5 es como se indica a continuación: 5'-CACGCAGGCAGGCTTTACCTTCTTC-3' (SEQ ID NO:131) y la de GNnagEtetR2-3 es como se indica: 5'-CGGAAGAACAAGCGACGGAAGGAC-3' (SEQ ID NO:132). El producto PCR se ligó en pCR®-Blunt ll-TOPO® para generar el plásmido recombinante pCALG35-1. Para generar el tercer plásmido precursor, se digirió pCALG38-2 con Age I y Swa I y se purificó el fragmento 77-lac-glmS*54. Además, se digirió pCALG35-1 con Age I y Nru I y se purificó el fragmento asn-pCR®-Blunt I l-TOPO®-rjagD. Los fragmentos purificados procedentes de pCALG38-2 y pCALG35-1 se ligaron para generar pCALG40. El plásmido pCALG40 recombinante contiene el fragmento nagD::T7-lac-glmS*54::asn en pCR®-Blunt ll-TOPO®. Para generar el plásmido final necesario para integrar el fragmento nagD: :T7-lac-glmS*54::asn recombinante en los genomas, se llevó a cabo la siguiente operación. Se digirió pCALG40 con Kpn I y Not I y se aisló el fragmento que contiene nagD::T7-lac-glmS*54::asn. Además, se digirió pKLN07-21 (descrito previamente) con Kpn I y Not I para aislar el fragmento que contiene Kanr (procedente de pUC4K, descrito previamente) y el origen de réplica sensible a la temperatura (procedente de pMAK705). El fragmento nagD::T7-lac-glmS*54: :asn procedente de pCALG40 y el fragmento de Kan1" y el origen de réplica sensible a la temperatura pKLN07-21, se ligaron para generar pCALG43-2. El plásmido pCALG43-2 se transformó en 7107-17(DE3) y se generaron clones con nagD::T7-lac-glmS*54 en el genoma. Los clones correctos se identificaron mediante PCR y se confirmaron mediante análisis de manchado Southern. Los clones también se confirmaron a través de la pérdida de resistencia a tetraciclina. Para clasificación mediante PCR de las cepas que contienen nagD::T7-lac-glmS*54::asn , se sintetizó un par de cebadores de oligonucleótidos. El cebador de avance GNnagET7glmS1 -5 tiene la secuencia de 5'-CAC GAT AAA CGG TGA AGC CAT GTC G-3' (SEQ ID NO:133). El cebador inverso GNnagET7glmS2-3 tiene la secuencia de 5'-CGT CCA TTT TCT TGA ACG CTT CAT CCC-3' (SEQ ID NO:134). El cebador de avance y el cebador inverso se localizan en 5' y 3', respectivamente, del fragmento PCR nagD::Tetr::asn generado a partir de los nucleótidos GNnagEtetRI -5 (SEQ ID NO:133) y GNnagEtetR2-3 (SEQ ID NO:134). Se identificaron cuatro cepas mediante PCR y se denominaron 7107-321#1, #2, #3, y #4. Para confirmar la integración de nagú::T7-lac-glmS*54 en las cepas 7107-321, se aisló el ADN genómico y se analizó mediante manchado Southern utilizando una sonda específica de nagE bajo condiciones estándar. Las cepas 7107-321 se encontraron como correctas mediante análisis Southern. Además, se confirmó la ausencia de nag ::Tetr::asn debido a la incapacidad de las cepas 7107-321 para crecer en un medio que contiene tetraciclina. Para agregar la construcción manXYZA::T7-lac-ScGNA1 , se transformó el plásmido pSW07-68 recombinante (descrito previamente) en cada una de las cepas 7107-321. Los clones con manXYZA::T7-lac-ScGNA1 integrado en el genoma, se generaron utilizando el procedimiento de selección de temperatura. Los clones se identificaron mediante PCR y se confirmaron mediante análisis de manchado Southern. Doce cepas generaron los productos PCR del tamaño esperado. Estas cepas fueron denominadas 7107-325#1, #2, #3 (derivado de 7107-321#1); 7107-326#1, #2, y #3 (derivado de 7107-321#2); 7107-327#1, #2, y #3 (derivado de 7107-321#3); y 7107-328#1, #2, y #3 (derivado de 7107-321#4). Todas estas cepas se confirmaron para corregirse mediante análisis de manchado Southern utilizando la sonda específica GNA1. Evaluación de las cepas de producción de N- acetilglucosamina con la capacidad de metabolizar galactosa en experimentos en frasco de agitación Las cepas de producción de N-acetilglucosamina con la capacidad de metabolizar galactosa (7107-325#1, 7107-326#1, 7107-327#1, y 7107-328#1), se probaron en experimentos en frasco de agitación (tabla 34). Las cepas se probaron en frascos que contienen el medio M9B con suplemento de 0.6 g G1 MgS04-7H20, y 0.05 g G CaCl2-2H20. El suplemento de oligometales de las clasificaciones 54 y 55, incluyó 0.2 mg I"1 FeS04-7H20, 0.015 mg I"1 ZnS04-7H20, 0.015 mg G1 MnS04-H20, 0.001 mg G1 CuS04-5H20, 0.001 mg G1 NaMo04-2H20, 0.001 mg G1 H3B03, y 0.001 mg I"1 CoCI2-6H20, en tanto que el suplemento con oligometales de las clasificaciones 59 y 66 incluyó 0.5 mg 1 FeS04-7H20, 0.38 mg I"1 ZnS0 -7H20, 0.033 mg I"1 MnS04-H20, 0.01 mg I"1 CuS04-5H20, y 0.01 mg I"1 CoCI2-6H20. Tal como se muestra en la tabla 34, se utilizaron en los frascos diversas cantidades de glucosa (Glu), lactosa (Lac), extracto de levadura (YE), y Permeato de Suero (WP, Formost Whey, Wisconsin). Para las clasificaciones 54 y 55, los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C, con agitación a 225 rpm durante 24 horas y posteriormente se ajustó la temperatura a 25°C, con agitación a 225 rpm para el resto del experimento. Para las clasificaciones 59 y 66, los cultivos se crecieron a una temperatura de 37°C con agitación a 225 rpm, durante 8 a 10 horas y posteriormente se ajustó la temperatura a 30°C, con agitación a 225 rpm para el resto del experimento. En las clasificaciones 59 y 66, se ajustó el pH a 7.2 a las 10 horas y si los cultivos tenían glucosa agotada, se agregaba 20 a 25 g G1 de glucosa. Para las cuatro clasificaciones, a las 24 y 48 horas, se ajustó el pH del cultivo a 7.2, se agregó glucosa a los frascos a un rango de aproximadamente 30 g G1, y se agregó 5 g 1 de (NH4)2S04 a los cultivos en los cuales el nivel de amonia había caído debajo de 1 g I"1. En la clasificación 66, a las 30 y 54 horas se agregó glucosa si era necesario, se ajustó el pH a 7.2, y si los niveles de amonia habían caído debajo de 1 g G1, se agregó 2.5 g G1 de (NH4)2S04. Para las cuatro clasificaciones, se recolectaron muestras a las 24 y 48 horas y se midieron las concentraciones de N-acetilglucosamina y galactosa en el sobrenadante del cultivo utilizando una corona de carbohidrato HPLC. En la tabla 34 se muestran las concentraciones de N-acetilglucosamina en diferentes muestras. Se puede concluir a partir de estos experimentos, que bajo condiciones de integración de T7Iac-glmS*54 en el sitio nagA en lugar de en el sitio galK, se mejora la producción de N-acetilglucosamina. La tabla 34 también muestra concentraciones de galactosa en diferentes cultivos. Tal como se espera, la integración de T7-lac-glmS*54 en el sitio nagA en lugar de en el sitio galK, abolió la acumulación de galactosa. Tabla 34. Niveles de N-acetilglucosamina y galactosa bajo diferentes condiciones de crecimiento.

Clasificación Número de Adición al medio GIcNAc Galactosa (g G1) en frasco de cepa* (g i'1) (gr1 agitación # (7107-) Glu Lac YE WP 24 48 72 24 48 72 hrs hrs hrs hrs hrs hrs 54 Control 10 40 5 0 2.0 7.0 13.0 2.6 3.4 4.0 325#1 3.6 9.9 14.6 0 0 0 55 Control 2.4 9.6 16.0 2.9 3.3 3.5 325#1 4.1 12.3 17.0 0 0 0 326#1 4.1 11.9 16.6 0 0 0 327#1 10 40 5 0 4.1 11.4 15.2 0 0 0 328#1 4.1 14.6 21.5 0 0 0 59 Control 8 20 0 0 11.3 20.5 26.3 1.6 2.7 3.6 10 0 10.9 21.3 24.3 1.6 2.3 2.9 5 0 11.8 21.3 26.2 1.6 2.2 2.0 2.5 0 9.6 18.4 21.0 1.0 1.1 0.8 1.25 0 10.6 18.7 22.5 0.8 0 0 0 10 12.3 21.7 26.3 1.8 3.1 3.5 0 5 10.7 21.4 27.4 1.6 2.4 2.4 0 2.5 12.6 21.7 28.3 1.5 1.4 1.2 325#1 20 0 10.8 18.6 21.2 0 0 0 10 0 11.6 20.6 23.6 0 0 0 5 0 11.7 20.7 24.2 0 0 0 2.5 0 7.4 14.0 16.1 0 0 0 1.25 0 9.7 16.1 18.8 0 0 0 0 10 11.2 19.2 22.2 0 0 0 0 5 11.2 19.6 22.5 0 0 0 0 2.5 11.8 18.9 21.3 0 0 0 66 Control 8 10 0 0 10.1 23.9 26.2 1.2 1.6 1.9 328#1 12.1 26.7 28.8 0 0 0 *Control: cepa de usuario en galactosa 7107-92. Todas las otras cepas son siblings de usuario de galactosa. Glu = Glucosa, Lac=Lactosa, YE = extracto de levadura, WP = Permeato de suero. Evaluación de cepas de producción N-acetilqlucosamina con la capacidad de metabolizar galactosa en termentadores de 1 litro Las cepas con la capacidad de utilizar (7107-325#1 y 7107-328#1), se compararon con galactosa-usuario (7107-92#1) en fermentadores de 1 litro. Los fermentadores se ajustaron con un volumen inicial de 475 mi con el medio de fermentación: 4.79 g I"1 H3P04, 3.15 g I"1 KOH , 3.56 g I"1 ácido cítrico-H20, 5 g I"1 (NH4)2S04, 2.5 g I'1 MgS04-7H20, 0.05 g I"1 CaCl2-2H20, oligometales (5 mg I"1 FeS04-7H20, 3.75 mg I ZnS04-7H20, 0.6 mg P1 MnS04-H20, 0.1002 mg I"1 CuS02-5H20, y 0.1002 mg I"1 CoCI2-6H20), y 0.25 g G1 de antiespuma Mazu 204. Se ajustó el pH a 7.0 utilizando 45% de KOH. El pH (6.9) del medio se mantuvo utilizando 75% de NH4OH, se mantuvo la temperatura a 37°C, y se utilizaron rangos de aireación y agitación para mantener el oxígeno disuelto a una concentración de 20% de saturación. Se alimentó una solución de glucosa al 65% a los cultivos con un rango de alimentación controlada mediante programa de computadora para lograr un rango de crecimiento de 0.4 hr"1 en inoculación y un rango máximo de 5 mi h"1 a las 6 horas.

Se indujeron los cultivos con lactosa de grado alimenticio agregada en una concentración de 5 g 1 alrededor de 10 horas, con alimentación de glucosa continua. Se recolectaron siete muestras aproximadamente 10, 21, 28, 35, 45, 52 y 60 horas durante la corrida de la fermentación. Para cada muestra, se determinaron las concentraciones de N-acetilglucosamina y galactosa, además de las concentraciones de otros diversos componentes para el monitoreo de la salud del cultivo, utilizando una columna de carbohidrato HPLC. Tal como se esperó, aunque la lactosa se detectó en el medio procedente de la cepa de control 7107-92#1 (0.6 g I"1 en la muestra 7), la galactosa no se acumuló en cepas harboring del medio 7107-325#1 y 7107-325#1. Al expresar GImS*54 bajo estas condiciones, en una cepa que tiene la capacidad de consumir la galactosa, no se mejora la producción de N-acetilglucosamina. Sin embargo, el medio utilizado para esta fermentación se optimizó para 7107-92#1. Las cepas con uso de galactosa pueden requerir condiciones de fermentación ligeramente diferentes para un desempeño óptimo. Es probable que se pueda generar un medio que pueda permitir que las cepas 7107-325#1 y 7107-328#1 produzcan una mayor cantidad de N-acetilglucosamina que 7107-92#1. Por consiguiente, se considera que la integración de la cinta de expresión T7-lac-glmS*54 en el sitio nagD en lugar de en el sitio galK puede probar ser benéfica para la producción de N-acetilglucosamina y/o glucosamina. Desarrollo del proceso de fermentación para la producción de N-Acetilglucosamina Ejemplo 30 Este ejemplo describe los experimentos en el frasco de agitación para optimizar la producción NAG con cepas que contienen plásmidos ScGNAl. Habiendo determinado que la sobreexpresión de ScGNAl dio como resultado mayores niveles de NAG en cepas de producción de glucosamina E. coi), el siguiente paso fue optimizar las condiciones para la producción de NAG. El método elegido fue incrementar la densidad celular y por siguiente los tituladotes NAG sin producir acetato en exceso en el frasco de agitación. La cepa 7107-87#25, que expresa ScGNAl procedente del promotor T7 del plásmido pET24d(+), se utilizó para experimentos de optimización iniciales. Adición de extracto de levadura e inducción posterior La clasificación en frascos de agitación probó el efecto de la adición del extracto de levadura en el crecimiento, la acumulación de acetato y la producción de NAG en la cepa 7107-87#25. Esto también probó el efecto de una inducción más temprana versus más tardía con 0.2 mM IPTG. Las cepas se crecieron en un medio M9B (descrito previamente) pero con (NH4)2SC>4 disminuido a 7.5 g Se suplemento el medio M9B con 30 g 1"1 de glucosa, 0.6 g 1"1 MgS04-7H20, 0.05 g 1"1 CaCI2-2H20, y 25 mg/ml de kanamicina. Se agregaron 0.2 mM IPTG a todos los frascos excepto aquellos para inducción posterior, a los cuales se les agregó 24 horas después de la inoculación. Para el frasco de control no se agregó extracto de levadura. Para los frascos de prueba, se agregó extracto de levadura (que fluctúa de 0.5 a 4.0 g 1"1) al inicio o a las 24 horas después de la inoculación. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C hasta 24 horas, y posteriormente se ajustó la temperatura a 25°C. A las 24 y 48 horas, se agregaron 5 g 1"1 (NH4)2S04 y 20 g 1~1 de glucosa a cada frasco y se ajustó el pH a 7.2. Tal como se observa en la tabla 35, la adición de extracto de levadura dio como resultado el crecimiento incrementado y producción de NAG. De hecho, el frasco con 4 g1"1 de extracto de levadura agregada al inicio se desempeñó mejor, logrando 8.9 gV1 de NAG, comparado con 2.9 gV1 de NAG producido en el frasco de control. Sin embargo, también se acumularon 3.0 g1"1 en estos frascos. Los frascos con el extracto de levadura agregado después de 24 horas, crecieron casi también como los que tuvieron extracto de levadura agregado al inicio y acumularon menos acetato. Sin embargo, bajo estas condiciones, la producción NAG alcanzó únicamente 4.9 g1"1 a las 48 horas en el frasco, con 4 g1"1 de extracto de levadura. Además, los frascos con la inducción posterior crecieron mejor que los que se indujeron inicialmente con 0.2 mM IPTG, aunque se eliminó la producción de NAG. Esto sugiere que la inducción de la síntesis de N-acetilglucosamina tiene algunos efectos negativos en el crecimiento celular. Tabla 35. Efecto de la adición de extracto de levadura y la inducción posterior en el crecimiento, acumulación de acetato y producción NAG en la cepa 7107-87#25.

Condiciones Tiempo de Extracto de adición ODÜOO Acetato GIcNAc del extracto de Levadura (g G1) levadura (gr) (gr1) IPTG agregado al inicio: Ninguno (control) 2.7 0 2.9 0.5 Inicio (0 hr) 3.2 0. 2.1 1.0 Inicio (0 hr) 4.0 0 2.9 2.0 Inicio (0 hr) 5.7 1.9 5.0 4.0 Inicio (0 hr) 8.4 3.0 8.9 0.5 24 hr 2.3 0 2.4 1.0 24 hr 2.7 0 2.8 2.0 24 hr 4.2 0 3.5 4.0 24 hr 6.3 0 4.9 IPTG agregado a las 24 horas: Ninguno 6.6 2.8 0 2.0 Inicio (0 hr) 6.9 4.0 3.1 1) Resultados tomados en el punto de tiempo de 48 horas Adición de varios azúcares y extracto de levadura Se llevó a cabo la clasificación en frascos de agitación para evaluar el efecto de diversos azúcares con el extracto de levadura en el crecimiento, acumulación de acetato y producción NAG en la cepa 7107-87#25. Las cepas se crecieron en un medio M9B (descrito previamente), pero con el (NH4)2S04 disminuido a 7.5 g1"1. El medio M9B se suplemento con 0.6 g1~1 MgS04-7H20, 0.05 g1~1 CaCI2-2H20, y 25 mg/ml de kanamicina. Debido a los efectos positivos del extracto de levadura observados en el experimento anterior, se incluyeron 5 g1"1 de extracto de levadura en todos los frascos. Se agregaron 0.2 mM IPTG y diversas mezclas y concentraciones de la lactosa, glucosa, fructosa, y ribosa de azúcares a los frascos, tal como se indica en la tabla 36. Es importante observar que la cepa 7107-87#25 crecida en la presencia de lactosa no requiere IPTG para inducción, ya que es inducible mediante lactosa. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C durante 24 horas y posteriormente se cambió la temperatura a 25°C. Aproximadamente a las 24 horas, se ajustó el pH de cada cultivo a 7.2. Se agregó 5 g1"1 (NH4)2S04 a cada frasco de glucosa y se agregó glucosa a un rango de aproximadamente 30 g1~1 por día en total con base en los resultados HPLC. A las 32.5 horas, se agregaron 15 g1"1 de glucosa, 2.5 g1"1 de ribosa, y 2.5 g1"1 (NH4)2S04 al frasco 7. A las 48 horas, se agregaron 10 g1"1 de glucosa a cada frasco. Se agregaron 2.5 g1~1 de ribosa y 5.0 g1~1 de (NH )2S04 adicionales al frasco 7 a las 49.5 horas. Las muestras se eliminaron de los frascos aproximadamente a las 24, 48 y 72 horas para monitorear los niveles de OD60o, y N-acetilglucosamina y los niveles de acetato.

Tabla 36. Efecto de diversos aminoázucares en el crecimiento, acumulación de acetato y producción NAG en la cepa 7107-87#25.

Frasco Condiciones IPTG ODeoo Acetato GIcNAc Glucosa Otros Azúcares (m ) (g i"1) (gr1) (g i"1) (g 1 0 lactosa (40) 0 10.0 2.5 9.0 2 10 lactosa (30) 0 13.5 0 13.7 3 0 Ninguna 0.2 11.0 4.7 12.3 4 0 fructosa (30) 0.2 5.0 0 9.1 5 0 Abosa (20) 0.2 11.0 4.8 10.6 6 15 fructosa (15) 0.2 11.0 4.4 14.8 7 20 ribosa (10) 0.2 13.5 3.1 27.0 1) Los resultados se tomaron en el punto de tiempo de 72 horas. 2) Se incluyó extracto de levadura (5.0 g 1"1) en todos los frascos.

Los resultados mostrados en la tabla 36 indican que los tres azúcares (lactosa, glucosa y ribosa) soportaron bien el crecimiento y se obtuvo como resultado una acumulación significativa de NAG. Los frascos que contienen fructosa no lograron un OD6oo alto, aunque el titulador NAG alcanzó 9.1 g G1. La inclusión inicial de glucosa en los frascos que contienen fructosa o lactosa mejoró el crecimiento así como el titulador NAG. Sin embargo, se logró el mejor resultado en el frasco que contenía inicialmente tanto glucosa como ribosa. La literatura describe aislados E. col! sin la necesidad de crecer en NAG o GlcN (J. Bac, 1970, 101: 384-391). Los autores especularon que la acumulación de fosfato de amino azúcar puede inhibir las. reacciones catalizadas mediante isomerasa de fosfohexosa y deshidrogenase de glucosa-6-fosfato, dando como resultado una falta de alimentación de pentosa. Además la adición de pentosas y gluconato, invirtió la inhibición de crecimiento de los mutantes. La cepa de producción-NAG 7107-87#25 también puede acumular datos de amino azúcar (GlcN-6-? y/o GlcNAc-6-?), dando como resultado la falta de alimentación de pentosa. SI este es el caso, la adición de ribosa o gluconato debe dar como resultado el crecimiento y producción NAG mejorados. De hecho, el crecimiento y la N-acetilglucosamina se mejoraron mediante la adición de ribosa. En este experimento, el frasco que contiene 20 g1"1 de glucosa más 10 g1~1 de ribosa, produjo el mayor nivel de NAG, logrando 27 g1"1. Esta es dos veces la cantidad producida en el frasco que contiene 30 g1"1 de glucosa. El crecimiento también se mejoró en el frasco que contiene tanto ribosa como glucosa. Niveles de glucosa y ribosa Los experimentos previos indicaron que la adición de ribosa a los frascos que contienen glucosa, tiene un efecto positivo significativo en la producción NAG en la cepa 7107-87#25. La Clasificación en Frascos de Agitación #35 se llevó a cabo para probar el efecto de diferentes mezclas de glucosa/ribosa en el crecimiento y producción NAG. La cepa 7107#87-25 se creció en el medio M9B (descrito previamente), suplementado con 0.6 g1"1 de MgS04- 7H20, 0.05 g1~1 de CaCI2-2 H20, 25 mg/ml de kanamicina, 0.2 mM ÍPTG, y 5.0 gV1 de extracto de levadura. Se agregaron diversas mezclas de glucosa y ribosa a cada frasco, tal como se describe en la tabla 37. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C durante 24 horas y posteriormente se cambió la temperatura a 25°C. Aproximadamente a 24 y 48 horas, se ajustó el pH de los frascos a 7.2. Se realizó una adición de 5 gT de ( H4)2S04 a todos los frascos a las 24 horas. Se agregaron 2.5 g1"1 de (NH4)2S04 adicionales a los frascos del 4 al 9 y 5.0 g1"1 (NH4)2S04 adicionales se agregaron a los frascos del 10 al 15 a las 29 horas. Aproximadamente a las 48 horas se agregaron 5 g1"1 (NH4)2S04 a los frascos 7 al 9, y se agregaron 2.5 g1~1 de (NH4)2S04 a los frascos 10 a 15. Se agregó glucosa para ajustar el nivel de glucosa a aproximadamente 30 g1~1 a las 24 y 48 horas. Se eliminaron muestras de los frascos a aproximadamente a las 24, 29, 48 y 72 horas para monitorear los niveles OD60o, N-acetilglucosamina y los niveles de acetato. Los frascos seleccionados fueron recolectados a las 72 horas para el análisis de enzimas. Tal como se observa en la tabla 37, la concentración de glucosa no afecta en forma significativa la producción NAG, siempre que existiera glucosa residual. Por otra parte, tampoco como 5 g1"1 de ribosa dio como resultado un gran incremento en los niveles NAG, alcanzando aproximadamente 30 g1 1 a las 72 horas en los frascos 4, 5 y 6 y en comparación con aproximadamente 14 g1" en frascos sin ribosa. Se observaron los mejores resultados con 10 g1"1 de ribosa. En estos frascos, los niveles NAG alcanzaron aproximadamente 36 g1"1 a las 72 horas. El crecimiento también se vio afectado en forma positiva en cultivos que contienen ribosa. El análisis enzimático de los frascos seleccionados reveló que la adición de ribosa no afecta directamente la actividad GImS ó GNA1, ya que los niveles de actividad para ambas enzimas fueron los mismos con o sin ribosa en el medio. Esto sugiere que el efecto de adición de ribosa probablemente fue más bien un resultado de la liberación del agotamiento en los intermediarios de la trayectoria de fosfato de pentosa.

Tabla 37. Efecto de glucosa y ribosa en el crecimiento, acumulación de acetato y producción de NAG en la cepa 7107-87#25.

Frasco Condiciones OD600 Acetato GIcNAc Actividad Enzimática (g 1) (g r1) (µp??? min'1 mg"1 proteína) Glucosa Ribosa GlmS GNA1 (gi-1) (g r1) 1 20 Ninguna 12.5 5.4 14.0 2 30 Ninguna 13.0 5.4 14.7 3 40 Ninguna 12.8 5.5 14.5 0.114 7.8 4 20 5 15.6 0 28.1 5 30 5 14.5 2.9 30.6 6 40 5 14.5 3.1 29.0 0.140 7.9 7 20 10 16.0 2.8 35.2 8 30 10 14.5 0 37.1 9 40 10 15.0 0 36.4 0.105 8.0 10 20 15 15.5 4.3 31.3 11 30 15 16.5 0 33.4 12 40 15 16.0 0 34.0 0.101 8.2 13 20 20 15.0 4.4 30.0 14 30 20 15.0 4.7 26.3 15 40 20 16.0 4.5 28.4 0.121 7.7 1) Resultados obtenidos en el punto de tiempo de 72 horas. 2) El extracto de levadura (5.0 g I"1) se incluyó en todos los frascos.

Ribosa v otros intermediarios de la trayectoria de fosfato de pentosa En virtud de los resultados positivos observados con los cultivos crecidos en glucosa y ribosa, se llevó a cabo la Clasificación en Frascos de Agitación #36 para determinar el efecto de otros diversos azúcares de carbono-5 y gluconato en el crecimiento y producción NAG. Se creció la cepa 7107-87#25 en el medio M9B (descrito previamente) suplementado con 0.6 g 1'1 de MgS04-7H20, 0.05 g 1"1 d CaCI2-2 H20, 5.0 g 1"1 de extracto de levadura, 25 mg/ml de kanamicina, y 0.2 mM IPTG. Se agregaron glucosa, ribosa, xilosa, arabinosa y ácido glucónico (sal de potasio) a los frascos tal como se indica en. la tabla 38. Los cultivos se crecieron a una temperatura de 30°C durante 24 horas y posteriormente se cambió la temperatura a 25°C. A las 24 y 48 horas se ajustó el pH a 7.2. Aproximadamente a las 24 horas se agregó glucosa en un rango de aproximadamente 30 g V1 por día en total con base en los resultados HPLC procedentes de la muestra de 24 horas. También se agregaron a todos los frascos 5 g 1~1 de (NH4)2S04. Se agregaron 10 g 1"1 de ribosa adicional a los frascos 11 y 12 tanto a las 24 como 48 horas y se agregaron 5 g 1"1 de ribosa a los frascos 3 y 4 a las 48 horas. Se agregaron 10 g 1"1 de ácido glucónico adicionales al frasco 10 a las 28.5 horas. Aproximadamente a las 48 horas se agregó glucosa para ajustar los niveles de glucosa aproximadamente a 30 g Adicionatmente se agregaron 5 g 1"1 de (NH4)2S04 a los frascos 11 y 12. Se eliminaron las muestras de cada frasco aproximadamente a las 24, 30, 48, 54 y 72 horas para monitorear los niveles OD60o, N-acetilglucosamina y los niveles de acetato. Se recolectaron los frascos seleccionados a las 72 horas para el análisis de enzimas.

Tabla 38. Efectos de los compuestos de carbono-5 y ácido glucurónico en el crecimiento y producción de N-acetilglucosamina.

Frasco Condiciones OD603 Acetato GIcNAc Actividad Enzimática (9 (9 l") (µ???? min'1 mg"1 proteína) Glucosa Otros Azúcares GlmS GNA1 (g i-1) (10 g I"1) 1 30 Ninguna 11.0 4.5 14.6 .230 11.4 2 40 Ninguna 12.5 4.8 15.0 3 30 Ribosa 14.0 1.6 29.1 .215 12.5 4 40 Ribosa 14.0 1.2 30.8 5 30 Xilosa 12.0 4.1 17.1 .211 12.5 6 40 Xilosa 11.5 4.1 17.0 7 30 Arabinosa 12.5 3.2 20.3 .180 11.4 8 40 Arabinosa 12.5 3.3 20.4 9 30 Ácido glucónico 12.0 4.0 24.3 .190 9.0 10 40 Ácido glucónico 13.0 3.8 22.1 11 30 Ribosa + ribosa 13.0 2.8 25.0 12 40 Ribosa + ribosa 13.0 3.0 24.9 1) Resultados obtenidos en el punto de tiempo de 72 horas. 2) Se agregó ribosa adicional ( 0 g T ) a los frascos 11 y 12 a las 24 y 48 horas 3) Se incluyó extracto de levadura (5.0 g 1"1) en todos los frascos.

La adición de pentosas de ácido glucónico dio como resultado el titulador NAG incrementado y el crecimiento mejorado cuando se comparar con el control (figura 18). Estos cultivos también contienen niveles más bajos que los del control. Sin embargo, la reacción de ribosa dio como resultado la producción NAG más alta. El ácido glucónico es menos costoso que los otros azúcares, y por consiguiente es atractivo para usarse en escala industrial. Debido a que la adición de ácido glucónico resultó en una producción NAG incrementada en comparación con la cepa de control, este experimento confirma su valor potencial en la liberación de falta de alimentación de pentosa en fermentaciones industriales. Los niveles de actividad enzimática de los frascos seleccionados indican que el efecto dramático de ribosa y gluconato en la producción de N-acetilglucosamina no se puede atribuir a una influencia en la actividad de GImS ó GNA1. Tal como se observa en la clasificación en frascos de agitación en comparación con los efectos de diferentes niveles de glucosa/ribosa en el crecimiento y la producción, los niveles de actividad son similares con y sin ribosa en el medio de cultivo. Ejemplo 31 Este ejemplo describe experimentos llevados a cabo en fermentadores de 1 litro para optimizar la producción NAG utilizando la cepa 7107-87#25 la cual contenía plásmidos ScGNAI. Sincronización de inducción IPTG: Se llevó a cabo un experimento de fermentación para evaluar la inducción con IPTG desde el comienzo y después de 24 horas de crecimiento (masa celular en aproximadamente 13 g 1"1). El crecimiento fue inhibido en gran medida por una inducción temprana, lo cual también condujo a tituladotes NAG muy bajos (<5 g/l) en comparación con una inducción posterior (50 g 1~ en 70 horas) tal como se muestra en la figura 19. Se considera que el crecimiento se inhibió debido a los fosfatos de aminoazúcar acumulados en las enzimas específicas inhibidas por las células de la trayectoria de fosfato de pentosa. Esta hipótesis está soportada por los descubrimientos de los efectos positivos de los intermediarios de fosfato de pentosa en el crecimiento celular y producción NAG. Efecto de los Intermediarios de la Trayectoria de Fosfato de Pentosa (PPP): Se inocularon fermentadores con células en tres diferentes densidades: baja (OD = 20), intermedia (OD = 30) y alta (OD=40). Se utilizó el último esquema de inducción (inducción aproximadamente a 24 horas después de la inoculación). La inoculación de la mayor densidad celular condujo a la mayor producción NAG. Sin importar la densidad celular de la inoculación, la adición de ribosa mostró una producción NAG mejorada, incluso con un esquema de inducción posterior. Ejemplo 32 Este ejemplo describe diferentes experimentos de fermentación para optimizar la producción NAG utilizando cepas que contienen construcciones ScGNAl integradas. En experimentos previos con cepas que contienen plásmidos ScGNAl, IPTG se utilizó para inducir la producción NAG ya que la lactosa fue muy ineficiente. Con las construcciones ScGNAl integradas, se puede inducir en forma efectiva la producción NAG mediante adición de lactosa.

Inducción de lactosas: El desarrollo de la cepa 7107-92#1 que contuvo una copia de la construcción ScGNAl integrada en el cromosoma, permitió el desarrollo del proceso de inducción de lactosa para la producción NAG. En virtud de los resultados en los frascos de agitación que mostraron una inhibición del crecimiento mediante la inducción IPTG temprana, se probó un esquema de inducción posterior en los fermentadores. Las células se inocularon primero y crecieron aproximadamente 15 y 20 g 1"1 de células. Posteriormente se alimentó lactosa a 10, 20 ó 30 g 1~1 durante 7 horas durante el período en el cual se detuvo la alimentación de glucosa. Posteriormente, se reinicio la alimentación de glucosa para el crecimiento y producción NAG continua. Se descubrió que los niveles de lactosa tan bajos como 10 g 1~ fueron efectivos, alcanzando hasta 50 g 1"1 en 78 horas. Debido a que el método de alimentación de lactosa por separado introduce complejidad al proceso, se llevó a cabo un experimento para evaluar diferentes opciones: alimentación de lactosa de 10 g 1"1 con alimentación de glucosa discontinua, inducción IPTG con alimentación de glucosa continua y un solo punto de adición de 10 g 1~1 de lactosa con y sin discontinuación de la alimentación de glucosa. Otra variable probada fue una alimentación de lactosa prolongada hasta 40 g 1"1 seguido de alimentación de glucosa. La adición de lactosa en un solo punto fue tan efectiva como cualquier otra estrategia de inducción. Todo logró un nivel de producción NAG entre 45 y 55 g Incluso cuando la alimentación de glucosa fue continua, su concentración aún estuvo limitada a las células (se consumió tan rápido conforme se agregó). Debido a que el operon lac normalmente es reprimido por la presencia de glucosa, el rango de alimentación de límite de la glucosa permite aparentemente condiciones no represivas para la inducción de lactosa. El uso de la adición de lactosa en un solo punto simplificó en gran parte el proceso. Un experimento evaluó el nivel de la inducción de lactosa en un solo punto (1.25 a 10 g 1"1) después de un período de crecimiento inicial. También se trató una inducción en dos puntos (5 g 1~ cada vez). La lactosa tan poco como de 1.25 g 1"1 fue muy efectiva, alcanzando tituladotes casi de 100 g 1"1 de NAG. Sin embargo, la inducción de lactosa a 5 g 1"1 alcanzó niveles NAG alrededor de 100 g Por consiguiente se aplicó la inducción de lactosa a 5 g 1~ en pruebas adicionales en la forma de un nivel seguro. La inducción de dos puntos también fue efectiva, dando como resultado incluso rangos de producción NAG iniciales más rápidos, aunque el titulador final no excedió el de la inducción de un solo punto con 5 ó 10 g 1"1 de lactosa.

Efecto de una operación con pH y temperatura superiores: El uso de una temperatura y pH inferiores fueron factores clave en la estabilización de la fermentación GLcN, principalmente debido a la naturaleza lábil de GLcN en un pH y temperaturas mayores. Sin embargo, se demostró que el NAG fue estable en un pH neutral. La fermentación de la producción NAG se operó en el rango de pH de 6.7 a 7.0 a lo largo de todo el programa. Los datos experimentales mostraron que NAG fue estable durante al menos 50 horas después del término de la alimentación de glucosa a una temperatura de 37°C y a un pH de 7.0. La temperaturas relativamente bajas (30°C y 25°C) utilizadas en el proceso GLcN son costosas y difíciles de mantener a escala industrial. Además, el rango de crecimiento celular es mucho más bajo a una temperatura de 30°C que a 37°C. El uso de una temperatura de 30°C requiere un período relativamente largo para lograr la biomasa requerida para una alta producción de NAG. Por consiguiente, se llevó a cabo una prueba a una temperatura de 37°C para evaluar cuatro diferentes rangos de crecimiento antes de la inducción. En esta forma, se puede lograr la biomasa requerida en forma más temprana, dando como resultado un proceso general más productivo. Todos los fermentadores fueron inducidos a las 10 horas, en forma opuesta de las 22 a las 24 horas requeridas a una temperatura de 30°C, y todos se desempeñaron bien, logrando alrededor de 100 g 1"1 de NAG a las 50 horas, y algunos logrando casi 120 g 1"1 a las 70 horas. A partir de este punto, se utilizó una temperatura de 37°C como la temperatura de crecimiento y producción. Efecto del rango de alimentación de glucosa: Se utilizó un rango nominal de 6 g 1"1 hr"1 (con base en el volumen después de la inoculación) en la mayor parte de las pruebas. Para ver si el rango de producción NAG estuvo limitado por la restricción de glucosa, se probaron rangos de alimentación de glucosa más altos. Al incrementar el rango de alimentación a 7.5 g 1"1 hr"1, se condujo a rangos iniciales más rápidos de producción NAG, aunque los tituladotes finales no fueron más altos o se alcanzaron en forma más rápida. Al incrementar en forma adicional el rango de alimentación a 9.5 g 1"1 hr"1 se mostraron rangos de producción NAG iniciales incluso más rápidos. Sin embargo, estos cultivos parecieron detener la producción en forma mucho más temprana y realmente tuvieron un titulador final disminuido (85 a 65 g 1"1 NAG). En el mismo experimento, el rango de alimentación lenta (g 1"1 hr"1) permitió niveles NAG de 100 g 1"1. A partir de este punto de tiempo, el rango de alimentación de glucosa se mantuvo a 6.5 g 1"1 hr"1 en fermentación NAG. Efecto de nivel de fosfato: El medio de fermentación contiene tanto como 30 g 1 de sales de fosfato de potasio totales. Un nivel de sal de fosfato alto presentó un problema significativo para la recuperación, ya que la mayor parte de la sal no es utilizada por las células, y tiene que ser eliminada durante la purificación del producto. En el proceso NAG, el nivel de fosfato alto mostró no ser importante. Los fosfatos totales se redujeron cuatro veces a 7.5 g V1 con un pequeño efecto en la producción de NAG. Este nivel de fosfato se utilizó en experimentos subsecuentes. Importancia de magnesio y hierro: El magnesio y hierro son dos nutrientes requeridos para lograr una biomasa superior y estabilizar el cultivo. En el proceso GLcN, se observó el nivel de hierro como un factor importante. Se necesitó un cierto nivel para lograr una mayor biomasa e inducción de lactosa, aunque demasiado hierro dio como resultado niveles superiores de acetato y niveles inferiores de GLcN. El nivel de hierro determinado para el proceso GLcN fue de 3 g 1"1 de FeS04-7H20 en el medio con alimentación de hierro adicional incluyendo FeS04-7H20 en la alimentación de glucosa (5 µg g"1 de glucosa). Se seleccionó el mismo nivel de hierro para los experimentos de producción NAG iniciales. La adición de hierro a la alimentación de glucosa, complica el proceso. Por consiguiente, se hizo un esfuerzo para evaluar los efectos de las concentraciones de hierro y alimentación de hierro iniciales. También se estudiaron los efectos de la alimentación de magnesio. Los resultados del primer experimento mostraron que los niveles de 5 a 10 m g V1 FeS04-7H20 condujeron a niveles de producción NAG comparables, y que el nivel de hierro puede no ser tan importante como el proceso GLcN. Un estudio de seguimiento con hierro y magnesio mostró que el hierro no fue absolutamente necesario en la alimentación. El magnesio en la alimentación puede tener efectos de estabilización. Esta prueba se llevó a cabo en un rango de alimentación superior de 7.5 g 1"1 hr"1, y otra prueba de seguimiento a 6.5 g 1"1 hr"1 mostró que ambos se podían eliminar de la alimentación sin una reducción de productividad significativa. Aunque se reconoció la importancia tanto del hierro como del magnesio, fue recomendable la eliminación de éstos de la alimentación desde el punto de vista de simplificar el proceso de producción. Por consiguiente, se eliminaron el hierro y magnesio de la alimentación de glucosa y se mantuvo el hierro en una concentración inicial de 5 mg 1"1 de FeS04-7 H20. El magnesio se agregó en un rango inicial de 0.6 g 1~1 de MgS04-7H20 , y si fue utilizado en la alimentación de glucosa, fue en un rango de 5 a 10 mg También se reconoció el magnesio como importante para el cultivo y no debe limitarse. El magnesio se puede secuestrar mediante fosfato bajo ciertas condiciones de esterilización (calor, tiempo de exposición y pH excesivo), volviendo no disponible para el organismo en la forma de precipitados de sal de fosfato de magnesio insoluble. Un estudio en frasco utilizando magnesio en exceso o magnesio limitado mostró que el nivel de hecho fue importante para la producción NAG, y que la adición de magnesio después de la esterilización fue recomendable para reducir los efectos de de precipitación, si el nivel de magnesio fue mayor. Se llevó a cabo un experimento de fermentación para comparar la adición de magnesio antes y después de la esterilización. Los resultados mostraron que los cultivos con magnesio agregado antes de la esterilización, se desempeñaron en forma deficiente. El nivel de magnesio inicial se duplicó posteriormente casi a 1 g 1"1 MgS04-7H20, y los estudios mostraron que este nivel podría utilizarse si se agregaban después de la esterilización o si se agregaban niveles incrementados de ácido cítrico y el medio acidificado antes de la esterilización. Esto tuvo implicaciones muy positivas para la simplificación del protocolo. La acidificación también permitió que todos los oligoelementos fueran agregados antes de la esterilización. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo de preparación del medio, en el cual todos los componentes excepto glucosa pueden agregarse antes de la esterilización. La acidificación del medio se logró inicialmente utilizando ácido fosfórico en lugar de sales de fosfato de potasio para suministrar fósforo. El pH se ajustó al pH de operación requerido (7.0) después de la esterilización con hidróxido de potasio, lo cual también suministra potasio al medio. Sin embargo, este método introdujo una cantidad innecesariamente alta de potasio. El protocolo se modificó en forma adicional utilizando fosfato de potasio monobásico para acidificar el medio y ajustar el pH con hidróxido de amonio después de la esterilización. Esto simplificó incluso el protocolo, permitiendo la eliminación de sulfato de amonio del medio. Eliminación de oligoelementos e importancia del zinc: El paquete de oligoelementos consistió originalmente de sales de los elementos que se encuentran a continuación, agregados en cantidades de µg a mg/l: hierro, zinc, manganeso, cobre, cobalto, molibdeno, y boro. El molibdeno y boro presentaron aspectos de toxicidad, si se encontraban en el producto final y no se conocieron los efectos de algunos otros elementos. Por consiguiente, se llevaron a cabo los experimentos de eliminación simple para determinar si se podía eliminar cualquiera de ellos. La primera prueba mostró que la eliminación tanto de molibdeno como de boro no tuvo un efecto negativo importante en la producción NAG, por lo que se eliminaron de los experimentos adicionales. La eliminación de cobalto también tuvo un efecto positivo, pero no se eliminó debido a que se reconoció como necesario para la función completa de la vitamina B12, y un estudio de seguimiento mostró que no existe efecto en la eliminación. Los resultados mostraron un efecto positivo de la eliminación de zinc en la producción NAG. Los estudios adicionales confirmaron que la restricción total de zinc dio como resultado niveles de biomasa más bajos, y niveles NAG significativamente mayores, hasta 118 g 1~1 de 1 NAG en 60 horas (figura 20). Esto fue especialmente interesante debido a que se pueden utilizar niveles de hierro iniciales mayores, hasta 10 mg 1"1 FeS04-7H20. Ejemplo 33 Este ejemplo describe protocolos de fermentación preferidos para la producción NAG. El protocolo de fermentación se muestra más adelante.

Cepas: E. con recombinante. Inducción: Se agregaron 5 a 10 g 1"1de lactosa en adición de un solo punto después que se alcanzón una densidad celular de 15 a 20g 1"1' La alimentación de glucosa no se suspendió durante este procedimiento, sino que permaneció constante a 6.5 g 1" hr" 1(con base en el volumen inicial). Alimentación: 65% de glucosa sin enmiendas adicionales, la alimentación de glucosa en concentración de límite. Tiempo de Fermentación 60 a 72 horas. Modo de Fermentación: Alimentación por lotes, con el 65% de glucosa agregada según se requiere, manteniendo la concentraciones del límite de glucosa. . Ino.cu.lo: 2.5% a 5% por volumen. pH: 6.9 a lo largo del ensayo, controlado con 12 N NH4OH Temperatura: 37°C a lo largo del ensayo. Oxígeno: 02 disuelto al 20% más, controlado mediante agitación. Aereación: 0.5 a 1 vvm. Medio: Componente Contentación (Cantidad por litro) KH2P04 6.67 g Ácido Cítrico 3.25 g CaCI2-H20 0.05 g MgS04-7H20 2.5 g FeS0-7H20 5 mg ZnS04-7H20 3.8 mg MnS04-H20 0.33 mg CuS04-5H20 0.1 mg CoCI2-6H20 0.1 mg Glucosa >200 g, según se necesite Eliminador de espuma Mazu 204 0.25 g Todos los componentes se agregaron antes de la estabilización excepto la glucosa (agregada en incrementos). El pH inicial es casi de 3.0 después de la esterilización y se ajusta a 6.9 con NH4OH antes de la inoculación. Ejemplo 34 Este ejemplo describe la purificación de N-acetilglucosamina mediante cristalización doble. El caldo de fermentación se sometió a eliminación de células mediante filtración y microfiltración. Dependiendo de las condiciones de fermentación, el porcentaje de N-acetilglucosamina en el sólido disuelto fluctúo de 70 a 87% (p, en una base de sólidos secos). Por consiguiente, el producto N-acetilglucosamina debe ser purificado. Esto se puede realizar a través de una combinación de pasos de desionización de cationes y aniones para incrementar la pureza de N-acetilglucosamina en el caldo crudo. Se pueden utilizar diferentes protocolos de cristalización. Los ejemplos que se encuentran a continuación describen experimentos diferentes para establecer protocolos y condiciones para la purificación de N-acetilglucosamina. Tal como se demostró, la N-acetilglucosamina con =98% de pureza se obtuvo utilizando los métodos descritos en los ejemplos 34, 35, 40 y 41. La pureza se incrementó en forma adicional a través del método descrito en el ejemplo 37. Se determinó la N-acetilglucosamina mediante cromatografía líquida utilizando una columna Supelcosil LC-18-DB (250 x 4.6 mm, 5 µ?t?) (obtenido de Supelco, Bellefonte, PA) y una fase móvil de 10% (v) de acetonitrilo 1 mi min" . Se midió la N-acetilglucosamina a 210 nm utilizando N-acetilglucosamina comercial (Sigma, >99%) como un estándar externo. El detector mostró una respuesta lineal de hasta 5g 1"1 de N-acetilglucosamina, cuando el volumen de inyección fue de 4µ?. Las muestras y estándares se mostraron en forma rutinaria a aproximadamente 3g 1"1 y se inyectaron al menos dos veces. La desviación en el área pico fue menor al 2% de los valores promedio. Se agregó carbono activado (malla 100 G-60, disponible en Norit Americas, Atlanta, GA) a una muestra de fermentación (30 g/L) que contiene 70% (p) N-acetilglucosamina en el sólido disuelto, y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante una hora seguido de filtración utilizando un papel de filtro del medio. El filtrado mostró un color reducido y fue café amarillento pálido. La cantidad de sólido se midió y el porcentaje de N-acetilglucosamina en el sólido fue de 75% (p). La muestra tratada con carbono obtenida anteriormente que contiene 77.5 g de sólidos disueltos (58.1 g de los cuales está en la forma de N-acetilglucosamina) se concentró a una temperatura de 45°C a 50°C bajo vacío a 51% (p) de sólidos (calculado a partir del peso de la muestra, suponiendo que no existe pérdida de sólido durante la concentración). Se dejó a temperatura ambiente con un mezclado ocasional de 2 horas. El precipitado fue recolectado mediante filtración en un papel de filtro de medio y se disolvió nuevamente a 100-ml agua. Posteriormente el contenido de sólidos se determinó para ser de 19.7% (p) de sólidos (sólidos totales 26.2 g). Se concentró la muestra redisuelta nuevamente a 44% (p) del sólido disuelto. Se agregaron aproximadamente 2 mg de polvo de N-acetilglucosamina puro y la muestra se mezcló en un mezclador a temperatura ambiente durante 2 horas. El precipitado fue recolectado mediante filtración y lavado con etanol (2 veces sin suspender el sólido y dos veces suspendiéndolo). El sólido blanco se secó a temperatura ambiente bajo vacío, hasta que el peso permaneció constante para producir 5.32 g de producto (98% de N-acetilglucosamina, 9% de recuperación total).

Ejemplo 35 Este ejemplo describe la purificación de N-acetilglucosamina mediante cristalización simple a una temperatura de 50°C. Se trató otro lote de muestras de fermentación que contienen 87% (p) de N-acetilglucosamina en el sólido disuelto, con carbono activado tal como se describe en el Ejemplo 34. La cantidad de sólido disuelto se midió y el porcentaje de N-acetilglucosamina fue de 88% (p). La muestra tratada con carbono que contiene 80.5 g de sólidos (71 g de los cuales está en la forma de N-acetilglucosamina) se concentró a una temperatura de 45 a 50°C bajo vacío hasta 45% (p) de sólidos (calculado a partir del peso, suponiendo que no existió perdida del sólido durante la concentración) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El precipitado se recolectó mediante filtración en el papel de filtro del medio y se lavó con etanol (dos veces sin suspender el sólido y dos veces suspendiéndolo). Después del secado bajo vacío, se obtuvieron 33.2 gms de un sólido blanco (N-acetilglucosamina 100% pura, 47% de recuperación). Ejemplo 36 Este experimento describe la purificación de N-acetilglucosamina mediante cristalización simple a una temperatura de 70°C.

La N-acetilglucosam'ina parcialmente purificado puede obtenerse mediante una cristalización de una muestra de fermentación tratada con carbono (ver ejemplo 34). La pureza de N-acetilglucosamina fluctúo de 86% a 90% dependiendo del grado de concentración antes de la cristalización y el porcentaje inicial de N-acetilglucosamina en el sólido disuelto. Se mezcló una muestra sólida que contiene 86% ó 90% de N-acetilglucosamina con agua para obtener 44% (p) del sólido. La mezcla se calentó a 70°C con un mezclado ocasional para la disolución. Posteriormente se dejó a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. Los cristales se recolectaron mediante filtración y se lavaron con etanol (dos veces sin suspender el sólido y dos veces suspendiéndolos). Después del secado a temperatura ambiente bajo vacío, el producto contenía 99% de N-acetilglucosamina (24-30% de recuperación). Ejemplo 37 Este ejemplo describe la purificación de N-acetilglucosannina mediante el tratamiento de intercambio de cationes. Se utilizó el caldo de fermentación decolorado como la alimentación de entada para una columna de intercambio de cationes. La columna fue de 1.6 x 15 cm, y contenía 20 g de resina DOWEX™ onosfhere 88 (disponible en DowCorp., Midland, MI) en la forma de hidrógeno. Los experimentos se realizaron utilizando una preparación de Pharmacia FPLC™ (disponible en Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a una temperatura de 4°C. La alimentación de entrada fue de aproximadamente 76% de N-acetilglucosamina en una base de sólidos, una conductividad de 10.5 mS/cm y el pH fue de aproximadamente 6.5. El material se bombeó en un rango de 1 ml/minuto. El pH de salida inicial fue de aproximadamente 2.3. A partir de que la capacidad de la columna alcanzó pH rosa, fue eventualmente el mismo al de la alimentación de entrada. La conductividad disminuyó desde alrededor de 10.5 mS/cm hasta alrededor de 2.5 mS/cm, en aproximadamente 125 mi. Posteriormente se incrementó la conductividad con la elevación en el pH. La pureza de N-acetilglucosamina, medida en una base de sólidos, también incrementó rápidamente mientras que el pH permaneció alrededor de 2.5. La pureza incrementó aproximadamente el 85% de N-acetilglucosamina. La pureza disminuyó conforme se exhausto la capacidad de la columna, y fue esencialmente la misma que la corriente de entrada a 200 mi. La pureza de N-acetilglucosamina se incrementó mediante el tratamiento con cationes. Ejemplo 38 Este ejemplo describe la purificación de N-acetilglucosamina mediante tratamiento de intercambio de aniones. El caldo de N-acetilglucosamina el cual había sido decolorado y tratado con la resina de intercambio de cationes, se utilizó como un material de entrada para la resina de intercambio de aniones Dow Monosphere 77. Las condiciones del experimento fueron tal como se describió anteriormente para los experimentos de resina de intercambio de cationes. La alimentación de entrada fue de aproximadamente el 81% de N-acetilglucosamina en una base de sólidos, conductividad de 3.8 mS/cm, y el pH fue de aproximadamente el 3.0. El pH de salida alcanzó rápidamente alrededor de 8.0, y posteriormente cayó aproximadamente 3.8 a 250 mi. La conductividad disminuyó rápidamente a menos de 1 mS/cm, y permaneció en dicho nivel a lo largo de la corrida. Incrementó la pureza de N-acetllglucosamina y permaneció también significativamente más alta. La pureza de N-acetilglucosamina incrementó aproximadamente 87% de N-acetilglucosamina a partir de una pureza de corriente de entrada de aproximadamente 81%. Los tratamientos de cationes y aniones combinados, proporcionan un método simple para incrementar en forma significativa la pureza de N-acetilglucosamina en el caldo crudo basados en una base de sólidos secos totales. Ejemplo 39 Este ejemplo describe el tratamiento de caldo de fermentación con carbono activado e intercambio de iones en cama mezclada. Las muestras de fermentación se trataron primero con carbono activado, tal como se describe en el ejemplo 34, y posteriormente mediante resina de intercambio de iones de cama mezclada AG501-X8(D) (procedente de Bio-Rad, Hercules, CA) en una columna con base en las recomendaciones del fabricante. Las muestras se cargaron lentamente y el flujo fue conducido mediante gravedad. La cantidad de la carga de la muestra se exhausto dos tercios de la cama, tal como se indica a través del indicador azul que cambia a dorado. Las muestras que contienen inicialmente 70% (p) y 80% (p) de N-acetilglucosamina en el sólido disuelto, mostraron una pureza final de N-acetilglucosamina de 89% (p) y 93% (p), respectivamente, en el sólido disuelto. Ejemplo 40 Este ejemplo describe la estabilización de N-acetilglucosamlna purificada. Una muestra de N-acetilglucosamina (98% de pureza) generada mediante cristalización descrita anteriormente, se volvió a café clara a las 2 horas a una temperatura de 105°C y perdió 4.7% de peso. Este cambio de color y perdida de peso al momento del calentamiento, se pueden eliminar utilizando uno de los siguientes tratamientos (descritos más adelante) que comprende alcohol isopropílico (IPA). Se ha demostrado que IPA (alcohol isopropílico) es un reactivo útil en la precipitación de N-acetilglucosamina y en la eliminación del oscurecimiento de la muestra a una temperatura de 105°C. Sin embargo, es muy probable que los expertos en la técnica puedan elegir otros solventes orgánicos que se puedan mezclar con agua, tales como acetonitrilo o etanol para reemplazar el IPA y lograr el mismo efecto. Precalentamiento seguido de precipitación de aqua/IPA Se calentó una muestra (0.30 g) a una temperatura de 105°C durante 2.5 horas. Después del enfriamiento a temperatura ambiente, se agregó 0.7 mi de agua para formar una suspensión amarilla. Se agregó IPA (2.8 mi) y la mezcla se agitó durante 2 horas. La precipitación se recolectó mediante filtración y se lavó dos veces con IPA mediante la suspensión del sólido. El licor madre fue amarillo pálido. El sólido se secó bajo vacío hasta que el peso fue constante (0.18 g, 60% de recuperación). Tratamiento con jabón en 80:20 ó 85:15 IPA/aqua (v/v) Se agitó una muestra a una proporción de 80:20 o 85:15 (v/v) de IPA/agua en 5 o 12 mi de mezcla de solvente/sólido gram durante 3 horas o durante la noche. La recuperación (mismo procedimiento anterior) fluctúo de 56 a 67%. Disolución v precipitación con IPA Se disolvió una muestra (0.50 g) en 2.27 mi de agua. Se agregó IPA (12.86 mi, IPA/agua = 85: 15 v/v) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El procedimiento de recuperación (56%) fue el mismo al anterior.

Disolución en agua seguida de concentración y precipitación con IPA Se disolvió una muestra (89.6 g) en agua hasta obtener el 20% de sólidos (p/p). Se concentró a una temperatura de 45 a 50°C bajo vacío. La precipitación se inició para formarse cuando la concentración de sólidos alcanzó aproximadamente 42% (p/p). Se concentró en forma adicional hasta 55% de sólidos (calculado con base en el peso de la muestra total suponiendo que no existe pérdida de sólido durante la concentración). Se agregó IPA (IPA/agua = 85:15 v/v) y se agitó durante la noche. Se recolectó el sólido mediante filtración y se lavó dos veces con IPA suspendiendo el sólido. El licor madre se concentró hasta concentrarse para producir 13g de un sólido húmedo que se suspendió subsecuentemente en 20ml 85:15 IPA/agua (v/v). Se filtró y lavó dos veces con IPA. El sólido húmedo se combinó con el sólido obtenido después de la primera filtración y se secó bajo vacío hasta que se obtuvo un peso constante (82.1 g, 98% N-acetilglucosamina, 92% de recuperación). Ejemplo 41 Este ejemplo describe la purificación de N-acetilglucosamina con IPA. Se utilizó IPA para purificar N-acetilglucosamina con el objeto de obtener una mayor recuperación. Se utilizó una mezcla de IPA y agua (probablemente en una proporción de 70:30 a 85:15 v/v) para precipitar N-acetilglucosamina mientras se mantienen las impurezas en la solución. La N-acetilglucosamina purificada obtenida de este modo no muestra oscurecimiento a una temperatura de 105°C. La cantidad requerida de esta mezcla de solvente depende de la cantidad de impurezas en la muestra inicial y de su solubilidad. Ejemplo 42 Este ejemplo describe la purificación de N-acetilglucosamina con etanol. Se disolvió una muestra de NAG puro al 95% (40g) en 160 mi de agua. Se agregó lentamente etanol (640 mi) en tanto que se agitaba la muestra. Se agitó la suspensión a temperatura ambiente durante la noche. El sólido se recolectó mediante filtración y se lavó dos veces mediante suspensión en etanol. El secado bajo vacío produjo 16.12 g de un sólido blanco (98% NAG con 42% de recuperación de NAG). Este material no mostró oscurecimiento a una temperatura de 105°C en dos horas. Cualquier experto en la técnica puede utilizar otros solventes mezclables en agua tal como IPA, acetonitrilo, o metanol para reemplazar el metanol y lograr el mismo resultado. Ejemplo 43 Este ejemplo demuestra procesos para la hidrólisis química de N-acetilglucosamina a glucosamina.

Se anticipa que la N-acetilglucosamina producida mediante fermentación, puede ser recuperada y purificada en la forma de N-acetilglucosamina como el producto final. La N-acetilglucosamina producida mediante fermentación también se puede convertir químicamente a glucosamina antes o después de aislarse y purificarse. Se llevaron a cabo experimentos piloto simples para demostrar la conversión química de N-acetilglucosamina a glucosamina. En el primer experimento, se hidrolizó N-acetilglucosamina (10 g/l en un medio M9A sin glucosa) a una temperatura de 100°C con diversos niveles de ácido clorhídrico. En un experimento paralelo se sometió a glucosamina a los mismos tratamientos para determinar su estabilidad bajo condiciones de hidrólisis. Los resultados se muestran en las figuras 21 y 22. Se determinó la conversión de N-acetilglucosamina a glucosamina monitoreando la cantidad de glucosamina generada mediante la reacción de hidrólisis. Se determinó la glucosamina mediante un método HPLC con base en el descrito por Way y asociados (Journal of Liquid Chromatography and elated Technologies, 23: 2861, 2000). A continuación se proporcionan algunos detalles específicos del método HPLC: columna: Phenomenex Prodigy ODS(3) C18-5 µ?t? (disponibles en Phenomenex, Torrance, CA), 150 x 4.6 mm; fase móvil: metanol: regulador acuoso (4:1, v:v) que contiene 10 mM de acetato de sodio, 10 mM de octanosulfonato de sodio, pH 5.1; rango de flujo: 0.7 mi por minuto; detector: detector de índice de refracción a una temperatura de 30°C. La figura 21 demuestra la conversión cuantitativa de N-acetilglucosamina a glucosamina cuando se calienta a un pH lo suficientemente bajo (<1). En un pH superior, no ocurrió hidrólisis o se degrado la glucosamina formada. La figura 22, muestra que la glucosamina fue estable con el calentamiento a un pH de 1.0 o menos. En un pH mayor, se perdió una cantidad significativa de glucosamina. La hidrólisis de ácido de N-acetilglucosamina utilizando ácido clorhídrico 1.0 N (pH<), se examinó a diferentes temperaturas. Tanto la cantidad de N-acetilglucosamina restante como la cantidad de glucosamina formada fueron monitoreadas. Se midió la N-acetilglucosamina mediante HPLC utilizando un sistema de carbohidratos estándar. A continuación se presentan algunos detalles específicos: columna: Bio-RadH PX-87H , 7.8 mm x 300 mm; fase móvil: 0.1% HN03 en H20: rango de flujo: 0.8 mi por minuto; detector: detector de índice de refracción a una temperatura de 30°C. Se midió la glucosamina utilizando la columna HPLC de par de iones tal como se describió anteriormente. La N-acetilglucosamina (20 g/l) en un medio M9A (que se describió previamente en la presente invención), acidificado con ácido clorhídrico 1N para un pH <1.0, se incubó a una temperatura de 35°C, 60°C, ó 100°C. Los resultados se muestran en la figura 23. A una temperatura de 100°C, se completó la conversión en 2.5 horas. No se observó degradación significativa de la glucosamina formada a temperaturas inferiores. En un experimento paralelo, se incubó glucosamina (20 g/l) con ácido clorhídrico 1N en diferentes temperaturas, como se indicó anteriormente. No se observó degradación después de 24 horas incubación, tal como se mide mediante HPLC (datos no mostrados). En síntesis, queda claro que la N-acetilglucosamina puede convertirse fácilmente en forma química a glucosamina y que la glucosamina, el producto de la hidrólisis, es muy estable bajo condiciones de hidrólisis utilizadas en estos experimentos. La hidrólisis de ácido de la N-acetilglucosamina a glucosamina es un paso clave en el proceso completo de la producción de glucosamina. Por consiguiente, se llevaron a cabo experimentos de hidrólisis utilizando material de N-acetilglucosamina cristalizada procedente de fermentación o N-acetilglucosamina o purificado. Ejemplo 44 Este ejemplo describe la desacetilación de N-acetilglucosamina en concentraciones superiores de ácido clorhídrico y en tiempos cortos.

Se llevó a cabo la hidrólisis de ácido de N-acetilglucosamina a una temperatura de 90°C. Se utilizaron N-acetilglucosamina (10% y 20% p/v) en soluciones de ácido clorhídrico (12% y 16%-diluido por volumen a partir de 37%). Se empleó una serie de doce tubos de vidrio de 12 mi con tapa de tornillo con tapas revestidas con teflón. Cada tubo representó un punto de tiempo separado (0, 15, 30, 45, 60, 90 minutos) y contenía 2 mi de la solución de N-acetilglucosamina/ácido clorhídrico. Los tubos se calentaron en un bloque de calentamiento equilibrado a una temperatura de 90°C. Los tubos se eliminaron en tiempos adecuados y se enfriaron rápidamente en agua con hielo. Se realizaron diluciones adecuadas y las muestras fueron analizadas mediante HPLC con respecto a la glucosamina y N-acetilglucosamina. La figura 24 muestra, la desaparición de N-acetilglucosamina y la formación de glucosamina. Las cinéticas de la desaparición de N-acetilglucosamina fueron esencialmente las mismas para las cuatro soluciones. La hidrólisis es muy rápida a una temperatura de 90°C. A los 30 minutos, se habían hidrolizado aproximadamente 95% de la N-acetilglucosamina en los cuatro casos. Después de 45 minutos, permaneció menos del 1% de la concentración inicial de N-acetilglucosamina. No se detectó N-acetilglucosamina a los 60 ó 90 minutos. Después de 1 hora a 90°C, ya no se detectó N-acetilglucosamina incluso con 20% de N- acetilglucosamina. La figura 24 también muestra la formación de glucosamina en los tubos que contienen 10% de glucosamina. No se observó una gran perdida de glucosamina después de 90 minutos. Ejemplo 45 Este ejemplo describe la desacetilación de N-acetilglucosamina en concentraciones altas de ácido clorhídrico durante un período largo (24 horas). Se examinó la degradación de glucosamina a una temperatura de 90°C y 100°C utilizando 5% y 10% de clorhidrato de glucosamina (p/p) con 12% y 20% de ácido clorhídrico en peso. Las muestras se incubaron de 1 a 24 horas y se ensayaron enzimáticamente para amonio utilizando deshidrogenasa de glutamato. La glucosamina se refiere a clorhidrato de glucosamina. Todos los porcentajes son p/p. La degradación de glucosamina se basa en la formación de amonia. La degradación del porcentaje fue esencialmente la misma para soluciones al 5% y al 10%. La degradación fue significativamente superior con una mayor concentración de ácido. Se observaron tendencias similares para el experimento a una temperatura de 100°C. El incremento en temperatura de 10° incrementó claramente en gran parte la degradación de glucosamina. Ejemplo 46 Este ejemplo describe la desacetilación química de N- acetilglucosamina en altas concentraciones de ácido clorhídrico (30%). Se hidrolizó ia N-acetilglucosamina a glucosamina a una temperatura de 90°C, utilizando el horno de hibridación. La reacción se llevó a cabo dentro de un tubo de vidrio con tapa de tornillo. Se incubó previamente a una temperatura de 90°C durante 1 hora el ácido clorhídrico al 30% (30 g). Después de esto, se agregaron 10 g de N-acetilglucosamina sólida, se disolvió rápidamente, y se tomó una muestra T0. Se tomaron muestras en intervalos de 30 minutos en las siguientes tres horas. La solución cambió rápidamente a naranja/café oscuro a los 30 minutos. Este oscurecimiento fue notablemente más rápido que el que se observó previamente con concentraciones más bajas de ácido. A los 45 o 60 minutos se observó una glucosamina sólida significativa, convirtiendo la mezcla en una pasta de clorhidrato de glucosamina en ácido clorhídrico. Las muestras fueron analizadas enzimáticamente con respecto a la amonia. Los resultados se muestran en la figura 25. La figura 25, también muestra datos procedentes de los experimentos de degradación de glucosamina realizados a una temperatura de 90°C, utilizando concentraciones más bajas de ácido clorhídrico. Es significativa la degradación de N-acetilglucosamina, y se basa en los niveles de amonia que son alrededor de 3.5% a las 3 horas. Esto es claramente más alto que lo que se observó utilizando glucosamina en ácido clorhídrico al 12 ó 20%. Ejemplo 47 Este ejemplo describe la desacetilación enzimática de N-acetilglucosamina. A continuación se describen procesos de enzimas para hidrolizar N-acetilglucosamina en el caldo de fermentación o después de su recuperación. Tres tipos de enzimas son candidatas: desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-? (EC3.5.1.25,NagA), desacetilasa de quitina y transferasas de acilo. Desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-? y desacetilasa de N-acetilglucosamina Existen enzimas que han demostrado desacetilar la N-acetilglucosamina. Roseman reportó la actividad enzimática que catalizó la desacetilación de N-acetilglucosamina (EC 3.5.1.33) en E. coli, BacHlus cadaveris y Streptococcus (Roseman S. 1957. J. Biol. Chem. 226: 5-124). Un grupo japonés (Yamano, Fujishima y asociados, Osaka Nacional Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology) estudió las desacetilasas de N-acetilglucosamina procedentes de una bacteria que produce quitinasa Vibrio choleraenon-O y una bacteria marina Alteromonas. En las patentes y publicaciones que se encuentran a continuación, se describió la preparación, propiedades y uso tanto de la desacetiiasa de N-acetilgIucosamina-6-? como las desacetilasas de N-actilglucosamina procedentes de organismos nativos específicos: Fujishima S. y asociados, 1996, titulada desacetiiasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato JP9234064A2, Fujishima S. y asociados, 1997, titulada Procesos para producir desacetiiasa de N-acetilglucosamina-6-fosfato, US5744325; y Fujishima y asociados, 1996, titulada Proceso para producir desacetiiasa de N-acetil-D-glucosamina, EP 0 732 400 B1, las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Las desacetilasas descritas por Fujishima y asociados, fueron identificadas como desacetilasas de N-acetilglucosamina-6-? (EC 3.5.1.25, NagA). Su afinidad y eficacia con N-acetilglucosamina 6-P fueron mucho mayores que con N-acetilglucosamina. Sin embargo, la desacetiiasa de N-acetilglucosamina-6-? purificada a partir de E. coli, no actúa en N-acetilglucosamina. La enzima de desacetiiasa N-acetilglucosamina (EC 3.5.1.25, NagA) es bien conocida por su papel de convertir N-acetilglucosamina-6-? a glucosamina-6-?, un paso necesario en el metabolismo celular de N-acetilglucosamina, N-acetilmanosamina y ácido neuramínico. Normalmente, esta enzima, la proteína NagA E. coli recombinante, no es activa en N-acetilglucosamina no fosforilada. Las secuencias de ADN que codifican la desacetiiasa de N-acetilglucosamina 6-P (gen nagA), se determinaron en muchos organismos diferentes. No se sabe si existe una desatilasa que únicamente se active en N-acetilglucosamina (diferenciable de este modo de NagA). Desacetilasa de quitina La desacetilasa de quitina (EC 3.5.1.41) cataliza la desacetiiación de las unidades de N-acetilglucosamina en quitina, dando como resultado quitosán. La actividad de desacetilasa de quitina normalmente se determina utilizando como sustrato quitina de glicol (quitina parcialmente O-hidroxietilada) radioetiquetada en grupos N-acetilo. La enzima también actúa en quitina microcristalina y carboximetilquitina (derivado soluble). Sin embargo, se reportó que la desacetilasa de quitina procedente de Mucor rouxxi no desacetila el monómero de N-acetilglucosamina o 2-3 oligómeros (Araki e Ito, 1975. Eur. J. Biochem. 55:71-78, la cual esta incorporada a la presente invención como referencia). Aunque no existen indicaciones de que la desacetilasa de quitina normal desacetila el monómero de glucosamina, las variantes de desacetilasa de quitina con dicha actividad podrían aislarse de la naturaleza o crearse in vitro. La desacetiiación de N-acetilglucosamina podría llevarse a cabo mediante una desacetilasa contenida en, o aislada en organismos con desacetilasa nativa u organismo con una desacetilasa recombinante. Las desacetilasas recombinantes podrían mejorarse mediante mutagénesis aleatoria dirigida. A continuación se describen experimentos de hidrólisis de N-acetilglucosamina utilizando desacetilasa . de N-acetilglucosamina y/o desacetilasa de N-acetilglucosamina-6-P. Acil transferasas Un número de aciltransferasas puede eliminar el grupo acetilo de un sustrato y transferirlo a otro sustrato (Money y asociados). Aunque no existen indicaciones de que dichas enzimas puedan desacetilar la N-acetilglucosam¡na, las variantes de acil transferasa con dicha actividad pueden aislarse de la naturaleza o generarse in vitro. Se puede llevar a cabo la desacetilación de N-acetilglucosamina, a través de una aciltransferasa contenida en, o aislada de organismos con una aciltransferasa nativa u organismos con una acil transferasa recombinante. La acil transferasa recombinante puede mejorarse mediante mutagénesis aleatoria dirigida y/o mediante ingeniería de proteínas. Definición de condiciones de hidrólisis enzimática Las células nativas o recombinantes que expresan una desacetilasa, crecen bajo condiciones estándar o condiciones optimizadas. Se lleva a cabo la hidrólisis de N-acetilglucosamina utilizando células completas, extractos de enzimas crudas o enzimas purificadas como catalizadores. Primero, se agregan 0.3 mi de una solución al 109% de N-acetilglucosamina como el sustrato a 0.1 mi de solución reguladora de fosfato 200 mM (pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.0). En segundo lugar, se agregan 0.1 mi de una solución de enzimas. La mezcla de reacción se incuba a 25, 30, 35, 40, 45 y 50°C durante 30, 60 y 120 minutos. Se determina la formación del producto de hidrólisis, glucosamina, a través de un método HPLC. El sustrato restante, N-acetilglucosamina se monitorea mediante un método HPLC diferente. Ambos métodos se describirán en ejemplos previos. Hidrólisis de N-acetilglucosamina producida en fermentación La N-acetilglucosamina en el caldo de fermentación o después de su recuperación se hidroliza utilizando extractos de enzimas crudas o desacetilasa purificada como catalizadores bajo condiciones que se describen anteriormente. La glucosamina se recupera mediante cristalización en una solución de ácido clorhídrico y se lava mediante etanol, metanol, o alcohol isopropílico. Ejemplo 48 Este ejemplo describe la hidrólisis de N-acetilglucosamina de alta pureza. El aparato de esta prueba consistió de un envase de fondo redondo de un litro calentado con un mantel de calentamiento. Los ingredientes, 150 gms de agua, 21 g de acetilglucosamina al 98% y 238 gms de ácido clorhídrico al 36.7%, se mezclaron juntos y se agregaron al envase de reacción. Se calentó la mezcla de reacción agitada a una temperatura de 70°C y se mezcló durante 3 horas, tiempo en el cual la mezcla fue transferida a un recipiente y se enfrió a 20°C. Estuvieron presentes algunos cristales. La mezcla se transfirió de regreso al envase de reacción y se agregaron 10 gms de N-acetilglucosamina. El reactor se calentó nuevamente a 70°C y se reaccionó durante 3 horas, se enfrió a una temperatura de 4°C durante la noche. Los cristales presentes se filtraron y lavaron con etanol, se secaron al vacío y se ensayaron (20 g de clorhidrato de glucosamina al 99.9%). El filtrado se transfirió de regreso en el envase de reacción y se agregaron 10 g de N-acetilglucosamina. El reactor se calentó nuevamente a 70°C, se hizo reaccionar durante 3 horas, se, enfrió durante la noche a 4°C, se filtró, se lavó con etanol, se secó al vacío y se ensayó (16.1 g de clorhidrato de glucosamina al 99.6%). El filtrado se regresó nuevamente al reactor, se agregaron 41.5 gms y se repitió el ciclo de reacción. 33 gms de clorhidrato de glucosamina resultaron del cuarto ciclo con un ensayo de 99.5%. La producción total fue de 86%, con todo el clorhidrato de glucosamina producido en 99%+ en el ensayo y con un color blanco. Este material no necesito recristalización. Ejemplo 49 Este ejemplo describe la hidrólisis de N-acetilglucosamina de baja pureza. Esta prueba repitió las condiciones del ejemplo 47 utilizando N-acetilglucosamina concentrado y secado a partir del caldo de fermentación. Los sólidos contenían 52% de N-acetilglucosamina. Se llevaron a cabo tres ciclos. El clorhidrato de glucosamina se volvió más oscuro con cada ciclo. Las primeras dos muestras tuvieron ensayos de 99.7% y 99.4% y podrían no requerir recristalización. La tercera muestra tuvo un ensayo de 97.7% y fue más oscura en color y podría requerir recristalización. La producción general fue de 71%. El filtrado final fue de color negro inclinándose a café, en forma opuesta al color café claro traslucido del filtrado final del ejemplo 48. Ejemplo 50 Este ejemplo describe la hidrólisis del caldo de fermentación concentrado a 21.8% de N-acetilglucosamina. El aparato de esta prueba consistió de un envase de vidrio con chaqueta de 4 litros. Se utilizó agua para calentar el envase de reacción a la temperatura requerida. Se agregaron al envase de reacción dos mil mi del caldo de fermentación concentrado que contiene 218 g/l de N-acetilglucosamina. Se agregaron mil quinientos mi de 36.7% de ácido clorhídrico. El envase de reacción se agitó bajo vacío y se calentó a una temperatura de 70°C. La reacción procedió durante 90 minutos con 310 mi de condensado recolectado. La mezcla de reacción se enfrió a una temperatura de 4°C y se filtró. Los sólidos se lavaron con 265 mi de etanol y se secaron. La conversión se basó en el análisis de N-acetilglucosamina en el caldo, y el filtrado fue de 89.5%. El clorhidrato de glucosamina lavado fue disuelto en agua, para producir 1550 mi de solución. Se agregaron a la solución 15 gms de carbono activado Darco G-60. Después de mezclar durante 30 minutos, se filtró la solución; dando como resultado un filtrado sin color. El filtrado fue evaporado al vacío a una temperatura de 50°C con un vacío de 55-cm Hg. Los sólidos fueron etanol lavado y secado. La producción general fue de 82%. Ejemplo 51 Este ejemplo describe la hidrólisis de N-acetilglucosamina de baja pureza N-acetilglucosamina con pasos de enjuague extra. Ei propósito de esta prueba fue determinar si los pasos del lavado extra después de la hidrólisis pueden producir un producto de alta pureza que pudiera no requerir recristalización. Se utilizó el aparato utilizado en el ejemplo 49 sin la recuperación de concentrado. El caldo de fermentación seco que contiene 54% de N-acetilglucosamina fue agregado a 20% de ácido clorhídrico. La proporción de ácido a N-acetilglucosamina fue de 2.5:1. Las condiciones de reacción para esta serie fueron una temperatura de 80°C durante 103 minutos. La pasta húmeda después de la filtración fue lavada con 500 g de agua, 529 g de 37% de ácido y 407 g de etanol. La meta fue determinar si el lavado extra puede producir un producto que no requiera re-cristalización. Los cristales de clorhidrato de glucosamina fueron aún ligeramente cobrizos y requirieron todavía de re-cristalización. La producción general fue de 70%, con el 7% de pérdida de producción debido al primer lavado de agua. El lavado de ácido dio como resultado una pérdida de producción del 1% en tanto que al lavado con etanol se le atribuyó el 1.6% de pérdida. Ejemplo 52 Este ejemplo describe el tratamiento de carbono durante la hidrólisis de N-acetilglucosamina. Se utilizó carbono activado después de la hidrólisis y antes de la re-cristalización para eliminar impurezas. Esta prueba implicó la adición de carbono activado a la solución de hidrólisis antes de la reacción. Se agregó un total de 34 g de carbono activado Darco G-60 a la mezcla de reacción de N-acetilglucosamina y ácido clorhídrico y se mezcló durante 30 minutos, posteriormente se filtró y agregó al reactor. Se agregó al reactor un enjuague con agua de 1000 g del carbono activado. El clorhidrato de glucosamina resultante fue más claro, aunque aún requirió de re-cristalización. Las condiciones de reacción fueron a una temperatura de 80°C durante 60 minutos. La producción general de 29%, fue baja debido a la dilución del medio de reacción mediante agua adicional, lo cual redujo la concentración inicial de ácido clorhídrico al 14%. Ejemplo 53 Este ejemplo describe la hidrólisis de N-acetilglucosamina de baja pureza. Las condiciones de reacción utilizadas para este ejemplo fueron una temperatura de 90°C durante 30 minutos. Se utilizó una proporción de 3:1 de ácido clorhídrico al 30% a N-acetilglucosamina. El aparato utilizado en el ejemplo 49, fue el que se utilizó en este ejemplo. La producción de hidrólisis fue del 86%. El clorhidrato de glucosamina sin procesar se disolvió nuevamente en agua; se trató con carbono activado, se filtró y cristalizó al vacío a una temperatura de 50°C y 60 cm HG. El ensayo final fue de 99.7% con una producción total del 58%. Ejemplo 54 Este ejemplo describe el tratamiento de carbono durante la hidrólisis de N-acetilglucosamina. Se intentó una segunda prueba utilizando el tratamiento de carbono activado de la solución de hidrólisis. Las condiciones de reacción fueron las que se utilizaron en el ejemplo 52, excepto que se agregaron 50 g de carbono activado a la mezcla de hidrólisis, se filtraron y el carbono activado fue enjuagado con 1,000 g de agua. La reacción se llevó a cabo a una temperatura de 90°C durante 30 minutos, con una proporción de 3:1 de ácido clorhídrico al 20% a N-acetilglucosamina. No se apreció mejoría en color con respecto a los resultados descritos en el ejemplo 52. Como con la prueba anterior con carbono activado antes de la hidrólisis, se agregó ácido durante la filtración y se enfrió para disminuir la solubilidad y mejorar la producción. La producción final fue del 36% con un ensayo del 98.4%. Ejemplo 55 Este ejemplo describe la hidrólisis de N-acetilglucosamina con alta pureza. El propósito de este ejemplo fue determinar si la glucosamina de alta calidad puede ser producida sin requerir re-cristalización a partir de N-acetilglucosamina de alta calidad a una temperatura de 90°C. Utilizando el aparato del ejemplo 49, se mezclaron 320 gms de N-acetilglucosamina con 941 gms de 30% p/p de ácido clorhídrico. La mezcla se agregó al recipiente enchaquetado y posteriormente se calentó a una temperatura de 90°C. La reacción se dejó surgir durante el tiempo de calentamiento y durante un tiempo adicional de 47 minutos, en tanto se mantenía a una temperatura de 90°C. Después de enfriar a 20°C, se filtró la pasta húmeda, se lavó con etanol y se secó al vacío a una temperatura de 50°C. La producción total fue de 71%, lo cual es consistente con un solo uso de licor de hidrólisis. El clorhidrato de glucosamina producido fue blanco con una tinta negra y requirió re-cristalización. Ejemplo 56 Este ejemplo describe la hidrólisis de N-acetilglucosamina impura. Los mismos procedimientos descritos en el ejemplo 54 se llevaron a cabo, utilizando N-acetilglucosamina sólida aislada del caldo de fermentación. La pureza de los sólidos de N-acetilglucosamina fue del 48%. Se hizo reaccionar una mezcla que contiene 1,411 gms de N-acetilglucosamina con 4,236 gms de 30% p/p de ácido clorhídrico a una temperatura de 70°C durante 3 horas y posteriormente se enfrió a una temperatura de 20°C. Después de la filtración, se lavó la pasta húmeda con etanol y se secó al vacío a una temperatura de 50°C. La producción total fue del 90%. Ejemplo 57 Este ejemplo describe la hidrólisis de N-acetilglucosamina de alta pureza. Se llevó a cabo la hidrólisis utilizando una proporción de 2:1 de 36.7% de ácido clorhídrico a N-acetilglucosamina pura.

Utilizando el aparato del ejemplo 49, se hicieron reaccionar 2,004 gms de N-acetilglucosamina con 4,009 gms de 36.7% p/p de ácido clorhídrico a una temperatura de 80°C durante 58 minutos, y posteriormente se enfrió a 20°C. Después de la filtración no se lavó la pasta húmeda, pero se dejó secar durante la noche a temperatura ambiente. La pasta final contenía 6% de ácido clorhídrico y 75.2% de clorhidrato de glucosamina. La mezcla de reacción fue bastante viscosa con sólidos blancos en los lados del reactor. La producción total fue de 70%. Ejemplo 58 Este ejemplo describe la hidrólisis de N-acetilglucosamina de alta pureza utilizando ácido clorhídrico reciclado. Una de las formas para incrementar la producción de clorhidrato de glucosamina recuperada total, es reciclar el licor madre de la hidrólisis. Después de la reacción de hidrólisis, se enfrió la mezcla y se filtró. El filtrado se pesó y recicló nuevamente en el reactor. Se agregó ácido clorhídrico fresco al 36.7% para cubrir la diferencia en peso entre el peso del ácido inicial y el filtrado regresado. Esta serie implicó hacer reaccionar una proporción de 2.5:1 de 36.7% de ácido clorhídrico a N-acetilglucosamina a una temperatura de 80°C durante 60 minutos. Se agregó ácido clorhídrico a un reactor a una temperatura de 74°C que contiene N-acetilglucosamina pura, sólida. La mezcla de reacción se calentó y se hizo reaccionar durante 60 minutos, posteriormente se enfrió a una temperatura de 20°C y se filtró. Se recuperaron los sólidos de clorhidrato de glucosamina mediante filtración después de este primer uso del ácido clorhídrico, y se midió la producción en 88%. Se pesó el filtrado y se regresó al reactor. Se agregó una segunda e igual cantidad de N-acetilglucosamina sólida junto con suficiente ácido clorhídrico al 36.7% para regresar el peso del ácido al nivel del primer ciclo de reacción. Se repitió la reacción durante el mismo tiempo y temperatura para este segundo uso del ácido, y después del enfriamiento y la filtración, la producción recuperada fue de 105%, indicando que parte de clorhidrato de glucosamina que se dejó en la solución del primer ciclo de ácido se recuperó durante la segunda filtración del ciclo. Se llevó a cabo un tercer ciclo en la misma forma que el segundo, con una producción recuperada del 60%. La producción general recuperada de los tres ciclos fue del 87%. El filtrado del tercer ciclo se guardó para futuros ciclos. Ejemplo 59 Este ejemplo describe la purificación cromatográfica de N-acetilglucosamina. Para purificar N-acetilglucosamina se llevó a cabo cromatografía utilizando la resina DOWEX™ Monosphere 99/K. La resina se utilizó para empacar una columna de 2.6 x 23 cm. El volumen de la cama de la columna fue de aproximadamente 120 mi, con un volumen vacío estimado en 35 mi (medido drenando el líquido de la columna utilizando una jeringa). Para estos experimentos, se utilizó el caldo desionizado mediante el tratamiento con resinas de cationes y aniones. Este material de ingreso tuvo una concentración de N-acetilglucosamina de aproximadamente 75.7 g/l, sólidos totales de aproximadamente 83.4 g/l, dando una pureza de alrededor del 91%. La conductividad fue de alrededor de 0.1 mS/cm. En el primer experimento, se bombeó una muestra de 30 mi a través de la columna a 2 ml/min. Quedó claro que la N-acetilglucosamina interactúo en la misma forma con la resina. No se detectó N-acetilglucosamina hasta aproximadamente 60 mi, y se eluyó en un pico muy amplio centrado en 90 mi, pasando por mucho el volumen hueco. La pureza de N-acetilglucosamina también varió en gran parte, con el valor más alto de 94.5% de N-acetilglucosamina a 90 mi. La pureza medida en esta región angosta, fue mayor que la del material de entrada. La variabilidad de los valores de pureza obtenidos fue de aproximadamente 2 a 3%. En fracciones que contienen concentraciones más bajas de N-acetilglucosamina, la pureza cayó rápidamente alrededor de 125 mi y debajo de 75 mi. Se llevó a cabo un segundo experimento utilizando la misma columna. Aquí se aplicó una muestra de 5-mI más pequeña en un rango de flujo más lento de 1 ml/min. Los resultados son similares a los observados con la muestra más grande y el rango de flujo más rápido. La única diferencia es que el pico de N-acetilglucosamina se centra alrededor de 80 mi en lugar de 90 mi. La pureza de N-acetilglucosamina medida como el porcentaje de sólidos totales, varió significativamente durante la corrida. Esto sugirió alguna separación cromatográfica o diferencias en interacción a partir de N-acetilglucosamina entre la resina y los otros compuestos, presumiblemente no iónicos, que estuvieron presentes. Si los otros compuestos, interactuaron con la resina en una forma idéntica a N-acetilglucosamina, debía haber estado presente en el mismo nivel de pureza en todas las fracciones que contienen N-acetllglucosamina, lo cual, no fue el caso. La resina utilizada en el ejemplo, se convirtió posteriormente a la forma de calcio utilizando métodos conocidos en la técnica y se utilizó el mismo procedimiento, tal como el que se describió anteriormente. Ejemplo 60 Este ejemplo describe la hidrólisis simultánea de N-acetilglucosamina de alta pureza y la eliminación de ácido acético. El co-producto mayor procedente de la hidrólisis de ácido clorhídrico acuoso de N-acetilglucosamina, fue ácido acético, el cual tiene un punto de ebullición relativamente alto y no se eliminó fácilmente durante el paso de hidrólisis. Al proporcionar un alcohol, tal como etanol o metanol, durante el paso de hidrólisis, se obtuvo como resultado la esterificación del ácido acético, formando un acetato de etilo o metilo respectivamente, en la forma de un co-producto que se eliminó más fácilmente debido al punto de ebullición reducido. Al eliminar el co-producto, la impureza mayor presente en el hidrolizado gastado, permitió que se prolongara el número de nuevos usos del ácido clorhídrico en la solución de hidrólisis. Se agregó una mezcla de 173 gms de metanol, 189.4 gms de 36.7% por peso de ácido clorhídrico acuoso y 201 gms de N-acetilglucosamina a un envase de vidrio agitado, calentado, y se mezcló bajo reflujo a una temperatura de 65°C. Se tomó una muestra en 1 hora. El análisis mostró el 8.3% de clorhidrato de glucosamina, 11.6% de ácido clorhídrico y ninguna cantidad significativa de ácido acético mediante la titulación. La reacción se detuvo después de 24 horas y se enfrió a 20°C. Los sólidos se enjuagaron con metanol y se secaron. La producción inicial de clorhidrato de glucosamina fue de 25.6%. Posteriormente el hidrolisado se enfrió durante la noche a una temperatura de 4°C y se filtró. Se obtuvo otra producción de clorhidrato de glucosamina al 10%. La pureza de los sólidos iniciales fue del 85%. No estuvo presente ácido acético en el filtrado. Aunque se han descrito con detalle diversas modalidades de la presente invención, se apreciará que los expertos en la técnica puedrán realizar modificaciones y adaptaciones a dichas modalidades. Sin embargo, queda expresamente entendido, que dichas modificaciones y adaptaciones estarán dentro del alcance de la presente invención, tal como se establece a través de las reivindicaciones que se encuentran a continuación.

Claims

REIVINDICACIONES 1. - Un método para producir glucosamina o N-acetilglucosamina mediante fermentación, en donde el método comprende: a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de acetiltransferasa de gIucosamina-6-fosfato; y b) recolectar un producto producido a partir del paso de cultivo, el cual se selecciona del grupo que consiste gIucosamina-6-fosfato, glucosamina, gIucosamina-1 -fosfato, N-aceti Iglucosa mi na- 1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina.
2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la modificación genética para incrementar la actividad de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato proporciona un resultado seleccionado del grupo que consiste de: actividad enzimática incrementada de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato, sobreexpresión de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato mediante el microorganismo; inhibición reducida del producto de N-acet¡IgIucosamina-6-fosfato de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; y afinidad incrementada de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato para glucosamina-6-fosfato.
3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato.
4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato.
5. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:34, en donde la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
6. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 50% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:34, en donde la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
7.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:34, en donde la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
8.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:34.
9.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la expresión de la molécula de ácido nucleico recombinante es inducible.
10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la expresión de la molécula de ácido nucleico recombinante es inducible mediante lactosa.
11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para reducir la inducción de transcripción mediante lactosa.
12.- El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la modificación genética comprende una eliminación o desactivación parcial o total del gen que codifica una proteína represora Lac I.
13. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que incrementa la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la sintasa de glucosamina-6-fosfato .
15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos que es de al menos de aproximadamente el 35% idéntica con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, y SEQ ID NO.20, en donde la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
16. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 50% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, y SEQ ID NO:20, en donde la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
17.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos que es de al menos de aproximadamente el 70% idéntica con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, y SEQ ID NO:20, en donde la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
18.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, y SEQ ID NO:20.
19.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene una modificación para reducir la inhibición del producto de sintasa de glucosamina-6-fosfato en comparación con la sintasa de glucosamina-6-fosfato tipo natural.
20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14.
21. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que disminuye la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato.
22. - El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la modificación genética para disminuir la actividad de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato comprende una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la deaminasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo.
23. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que disminuye la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato.
24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la modificación genética para disminuir la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato, comprende una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la deaminasa de glucosamina- 6-fosfato en el microorganismo.
25. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo incluye el paso de mantener la fuente de carbono a una concentración de aproximadamente 0.5% a 5% en el medio de fermentación.
26. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo se lleva a cabo en un medio de fermentación que comprende extracto de levadura.
27. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo se lleva a cabo en un medio de fermentación que comprende una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste de glucosa, fructosa, un azúcar de pentosa y ácido glucónico.
28. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el azúcar de pentosa se selecciona del grupo que consiste de ribosa, xilosa y arabinosa.
29. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo se lleva a cabo en el medio de fermentación que comprende glucosa y ribosa.
30.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo se lleva a cabo en un medio de fermentación que comprende glucosa y ácido glucónico.
31.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo se lleva a cabo a una temperatura desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 45°C.
32. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 37°C.
33. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo se lleva a cabo a un pH desde aproximadamente 4 hasta un pH de aproximadamente 7.5.
34.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo se lleva a cabo a un pH desde aproximadamente 6.7 hasta un pH de aproximadamente 7.5.
35. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo se lleva a cabo a un pH desde aproximadamente 4.5 hasta un pH de aproximadamente 5.
36. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de bacterias y hongos.
37. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo se selecciona del grupo que consiste de bacterias y levaduras.
38. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo es una bacteria del género seleccionado del grupo que consiste de: Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas y Streptomyces.
39. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo es una bacteria procedente de una especie seleccionada del grupo que consiste de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus brevls, Pseudomonas aeruginosa y Streptomyces livldans.
40. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo es una levadura de un género seleccionado del grupo que consiste de: Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluveromyces, y Phaffia.
41. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo es una levadura de una especie seleccionada del grupo que consiste de: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, P. canadensis, Kluveromyces marxianus y Phaffia rhodozyma.
42.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo es un hongo procedente de un género seleccionado del grupo que consiste de\Aspergillus, Absidia, Rhizopus, Chrysosporium, Neurospora y Trichoderma.
43.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo es un hongo procedente de una especie seleccionada del grupo que consiste de:Asperg¡llus niger, A. nidulans, Absidia coerulea, Rhizopus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, N. intermedia y Trichoderm reesei.
44.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de fosfoglucoisomerasa en el microorganismo.
45.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el microorganismo se transforma con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la fosfoglucoisomerasa.
46.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la fosfoglucoisomerasa comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105.
47. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo comprende además una eliminación o desactivación parcial o total de la fosfofructocinasa en el microorganismo.
48. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de la sintetasa de glutamina.
49. - El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el microorganismo ha sido transformado con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la sintetasa de glutamina.
50. - El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la sintetasa de glutamina comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89.
51. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato.
52. - El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el microorganismo ha sido transformado con una molécula de ácido nucleico recombínate que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la deshidrogenasa de g!ucosa-6-fosfato.
53. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:95.
54. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo comprende además una eliminación o desactivación parcial o total de genes que codifican las enzimas responsables de la síntesis de glicógeno en el microorganismo.
55. - El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque los genes que codifican las enzimas responsables de la síntesis de glicógeno comprende pirofosforiiasa de glucosa ADP, sintasa de glicógeno y una enzima de ramificación.
56. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las modificaciones genéticas no inhiben la capacidad del microorganismo para metabolizar galactosa.
57.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de recolección comprende recuperar un producto intracelular del microorganismo seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina-6-fosfato,, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y glucosamina intracelular, o recuperar un producto extracelular del medio de fermentación seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina y N-acetilglucosamina.
58.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un paso seleccionado del grupo que consiste de: a) purificar un producto seleccionado del grupo que consiste de glucosamina N-acetilglucosamina del medio de fermentación ; b) recuperar un producto seleccionado del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1 -fosfato del microorganismo. c) desfosforilar un producto seleccionado del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato y glucosamina-1-fosfato; y d) desfosforilar un producto seleccionado del grupo que consiste de N-acetiIglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1 -fosfato para producir N-acetilglucosamina. e) tratar un producto seleccionado del grupo que consiste de N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato y N-acetilglucosamina-1 -fosfato para producir un producto de glucosamina seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina, glucosamina-6-fosfato y glucosamina-1 -fosfato.
59. - El método de conformidad con la reivindicación 54, en donde el paso (e) comprende hidrolizar el producto seleccionado del grupo que consiste de N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina-1 -fosfato, bajo condiciones de ácido y calor o mediante desacetilación enzimática.
60. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la N-acetilglucosamina producida mediante el método de fermentación se recupera precipitando los sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación.
61. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la N-acetilglucosamina se recupera re-cristalizando los sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación.
62. - Un método para producir glucosamina o N-acetilglucosamina mediante fermentación, en donde el método comprende: a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato; y b) recolectar un producto producido del paso de cultivo el cual es seleccionado del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilgIucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina.
63. - El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la modificación genética proporciona un resultado seleccionado del grupo que consiste de: la sobreexpresión de deaminasa de gIucosamina-6-fosfato, mediante el microorganismo, actividad enzimática incrementada de deaminasa de glucosamina-6-fosfato, reacción inversa incrementada de deaminasa de glucosamina- 6-fosfato para formar glucosamina-6-fosfato incrementada, reacción directa reducida de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato para formar fructosa-6-fosfato reducida, afinidad incrementada de deaminasa de glucosamina-6-fosfato para fructosa-6-fosfato, afinidad reducida de deaminasa de glucosamina-6-fosfato e inhibición reducida del producto de glucosamina-6-fosfato de la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato.
64. - El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el microorganismo se transforma con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la deaminasa de glucosamina-6-fosfato.
65. - El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica la deaminasa de glucosamina-6-fosfato tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad enzimática de la deaminasa de glucosamina-6-fosfato.
66.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la deaminasa de glucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:42, en donde la deaminasa gIucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
67. - El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la deaminasa de gIucosamina-6-fosfato tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:42.
68. - El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
69. - El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato es una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la sintasa de glucosamina-6-fosfato.
70. - El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato.
71. - El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la modificación genética proporciona un resultado seleccionado del grupo que consiste de: actividad enzimática incrementada de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; sobreexpresión de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato mediante el microorganismo, inhibición reducida del producto de N-acetiIglucosamina-6-fosfato de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato; y afinidad incrementada de la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato para glucosamina-6-fosfato.
72. - El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el microorganismo se transforma con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la N-acetiitransferasa de glucosam¡na-6-fosfato.
73. - El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos que es de al menos aproximadamente el 35% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:34, en donde la acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
74.- El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la N-acetiltranferasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32 y SEQ ID NO:34.
75.- El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
76.- El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato es una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la sintasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo.
77.- El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato.
78. - El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la modificación genética proporciona un resultado seleccionado del grupo que consiste de actividad enzimática de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato, actividad enzimática reducida de uridiltransferasa de N-acetiltransferasa-1 -fosfato; sobreexpresión de una enzima que tiene una actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato mediante el microorganismo; afinidad incrementada de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato para glucosamina-1 -fosfato; afinidad reducida de una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de N-acetilglucosamina-1 -fosfato; y inhibición reducida del producto de una N-acetilglucosamina-1 -fosfato para producir N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato.
79. - El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el microorganismo comprende una uridiltransferasa N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 - fosfato de glucosamina-1 -fosfato bifuncional en donde se incrementa la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato.
80. - El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el microorganismo se transforma con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato o una secuencia de ácido nucleico que codifica una N-acetiltransferasa de glucosamina- -fosfato.
81. - El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico codifica una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato o una N-acetiltransferasa de glucosamina- -fosfato que tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato o N-acetiltransferasa de glucosamina- -fosfato, respectivamente.
82. - El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato tiene una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente el 35% idéntica a una secuencia de aminoácidos de de la SEQ ID NO:56, en donde la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato tiene una actividad enzimática de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato.
83. - El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la uridiltransferasa de N-acetiltra nsferasa/N-acetilglucosam i na- 1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56.
84. - El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico codifica una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato que tiene una actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina- -fosfato, y una actividad o ninguna actividad de uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina- -fosfato de glucosamina-1 -fosfato.
85. - El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetllglucosamina- -fosfato de glucosamina-1 -fosfato truncada tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica como una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:58, en donde la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N- acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato truncada tiene una actividad enzimática de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato.
86. - El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilgIucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato truncada tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:58.
87. - El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
88. - El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque la modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato es una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la sintasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo.
89. - El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el paso de recolección comprende recuperar un producto intracelular del microorganismo seleccionado del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetiIglucosamina-6-fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y glucosamina intracelular o recuperar un producto extracelular del medio de fermentación seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina y N-acetilglucosamina.
90. - Un método para producir glucosamina o N-acetilglucosamina mediante fermentación, en donde el método comprende: a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que comprende al menos una modificación genética que disminuye la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato y al menos una modificación genética que incrementa la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato; y b) recolectar un producto producido del paso de cultivo el cual es seleccionado del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilg lucosa mi na- 1 -fosfato, N-aceti Iglú cosa mina-6-fosf ato, y N-acetilglucosamina.
91. - El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque la modificación genética para disminuir la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato comprende una eliminación o desactivación parcial o total de un gen endógeno que codifica la deaminasa de glucosamina-6-fosfato en el microorganismo.
92. - El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque la modificación genética para incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato proporciona un resultado seleccionado del grupo que consiste de actividad enzimática de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato, actividad enzimática reducida de uridiltransferasa de N-acetiltransferasa-1 -fosfato; sobreexpresión de una enzima que tiene una actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato mediante el microorganismo; afinidad incrementada de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato para glucosamina-1 -fosfato; afinidad reducida de una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de N-acetilglucosamina-1 -fosfato; y inhibición reducida del producto de una N-acetilglucosamina-1 -fosfato para producir N-acetiltransferasa de glucosamina-1-fosfato.
93.- El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el microorganismo comprende una uridiltransferasa N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina- -fosfato bifuncional, en donde se incrementa la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato.
94.- El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el microorganismo se transforma con una molécula de ácido nucleico recombínate que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato o una secuencia de ácido nucleico que codifica una N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato.
95. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato o una N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato tiene al menos una modificación genética que incrementa la actividad de la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato o la N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato, respectivamente.
96. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la uridiltransferasa de N-acetiltra nsferasa/N-acetilglucosam i na- 1 -fosfato de glucosamina- -fosfato tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:56, en donde la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1-fosfato de glucosamina-1 -fosfato tiene una actividad enzimática de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato.
97. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:56.
98. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica una uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetiIgiucosamina-1 -fosfato de giucosamina-1 -fosfato truncada que tiene una actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1-fosfato, y una actividad reducida o ninguna actividad de uridiltransferasa de N-acetilglucosamina-1-fosfato.
99. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato truncada tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:58, en donde la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetilglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato truncada tiene actividad enzimática de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato.
100. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la uridiltransferasa de N-acetiltransferasa/N-acetiiglucosamina-1 -fosfato de glucosamina-1 -fosfato truncada tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:58.
101. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que incrementa la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
102. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la modificación genética para incrementar la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende la transformación del microorganismo con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la sintasa de glucosamina-6-fosfato.
103. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:20, en donde la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
104. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:20.
105. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene una modificación para reducir la inhibición del producto de la glucosamina-6-fosfato, en comparación con una sintasa de giucosamina-6-fosfato tipo natural.
106. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, y SEQ ID NO:14.
107. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el paso de recolección comprende recuperar un producto intracelular del microorganismo seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina-6-fosfato, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, N-acetilg!ucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina y glucosamina intracelular o recuperar un producto extracelular del medio de fermentación seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina y N-acetilglucosamina.
108. Un método para producir glucosamina o N-acetilglucosamina mediante fermentación, en donde el método comprende: a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que comprende una acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato endógena de al menos una modificación genética para incrementar la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato; y b) recolectar un producto producido del paso de cultivar, el cual se selecciona del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato, glucosamina, glucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-1 -fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina.
109. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el microorganismo se transforma con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la sintasa de gIucosamina-6-fosfato.
110. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la sintasa de gIucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 35% idéntica con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, y SEQ ID NO:20, en donde la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene actividad enzimática.
111. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:18, y SEQ ID NO:20.
112. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato tiene una modificación para reducir la inhibición del producto de la sintasa de glucosamina-6-fosfato, en comparación con la sintasa de glucosamina-6-fosfato tipo natural.
113. El método de conformidad con la reivindicación 112, caracterizado porque la sintasa de glucosamina-6-fosfato comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, y SEQ ID NO:14.
114. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el microorganismo comprende además al menos una modificación genética para disminuir la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato.
115. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el método es un método para producir N-acetilglucosamina mediante fermentación, y en donde el paso de recolección comprende recolectar un producto producido del paso de cultivo, el cual es seleccionado del grupo que consiste de N-acetilglucosamina-1-fosfato, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina.
116. Un microorganismo modificado en forma genética que comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato.
117. El microorganismo modificado en forma genética de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que incrementa la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
118. El microorganismo modificado en forma genética de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que disminuye la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato.
119. El microorganismo modificado en forma genética de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque el microorganismo comprende además al menos una modificación genética que incrementa la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
120. Un microorganismo modificado en forma genética que comprende al menos una modificación genética que incrementa la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato.
121. El microorganismo modificado en forma genética de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
122. El microorganismo modificado en forma genética de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato.
123. El microorganismo modificado en forma genética de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
124. El microorganismo modificado en forma genética de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-6-fosfato.
125. El microorganismo modificado en forma genética de conformidad con la reivindicación 124, caracterizado porque el microorganismo comprende además una modificación genética para disminuir la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
126. Un microorganismo modificado en forma genética que comprende a! menos una modificación genética que disminuye la actividad de deaminasa de glucosamina-6-fosfato y al menos una modificación genética que incrementa la actividad de N-acetiltransferasa de glucosamina-1 -fosfato.
127. El microorganismo modificado en forma genética de conformidad con la reivindicación 124, caracterizado porque el microorganismo comprende además al menos una modificación genética para incrementar la actividad de sintasa de glucosamina-6-fosfato.
128. Un método para producir N-acetilglucosamina, en donde el método comprende: a) obtener un caldo de fermentación que contiene N-acetiiglucosamina solubillzada que es un producto de un proceso de fermentación; b) recuperar los sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación.
129. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque comprende además eliminar el material celular del caldo de fermentación.
130. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque comprende además decolorar el caldo de fermentación.
131. El método de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque el paso de decoloración se selecciona del grupo que consiste de cristalizaciones múltiples de N-acetilglucosamina, tratamiento con carbón activado y decoloración cromatográfica.
132. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque comprende además el paso de contactar el caldo de fermentación con una resina de intercambio de iones.
133. El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado porque el paso de contactar el caldo de fermentación con una resina de intercambio de iones, comprende contactar el caldo de fermentación con una resina de intercambio de aniones y una resina de intercambio de cationes.
134. El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque el paso de contactar el caldo de fermentación con una resina de intercambio de aniones y una resina de intercambio de cationes, comprende contactar el caldo de fermentación con una cama mezclada de resinas de intercambio de aniones y cationes.
135. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el paso de recuperación comprende precipitar sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación.
136. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el paso de recuperación comprende cristalizar sólidos que contienen N-acetilglucosamina del caldo de fermentación.
137. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el paso de recuperación comprende concentrar el caldo de fermentación que contiene N-acetilglucosamina solubilizada.
138. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el paso de concentración se lleva a cabo a menos de presión atmosférica.
139. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el paso de concentración se lleva a cabo mediante separación de membrana.
140. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el paso de concentración se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 75°C.
141. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el paso de concentración se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 55°C.
142. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el paso de concentración se lleva a cabo para lograr un contenido de sólidos en el caldo de fermentación de al menos aproximadamente el 30% de sólidos.
143. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el paso de concentración se lleva a cabo para lograr un contenido de sólidos de en el caldo de fermentación de al menos aproximadamente el 40% de sólidos.
144. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el paso de concentración se lleva a cabo para lograr un contenido de sólidos de en el caldo de fermentación de al menos aproximadamente el 45% de sólidos.
145. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque comprende además enfriar el caldo de fermentación después del paso de concentración.
146. El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque el caldo de fermentación se enfría a una temperatura de entre aproximadamente -5°C y aproximadamente 45°C.
147. El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque el caldo de fermentación se enfría a una temperatura de entre aproximadamente -5°C y aproximadamente a temperatura ambiente.
148. El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque el caldo de fermentación se enfría aproximadamente a temperatura ambiente.
149. El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque comprende además sembrar el caldo de fermentación con cristales de N-acetilglucosamina.
150. El método de conformidad con la reivindicación 149, caracterizado porque los cristales sembrados de N- acetilglucosamina se seleccionan del grupo que consiste de N-acetilglucosamina formados mediante nucleación en el caldo de fermentación y cristales de N-acetilglucosamina proporcionados en forma externa.
151. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el paso de recuperación comprende contactar N-acetilglucosamina con un solvente mezclable en agua.
152. El método de conformidad con la reivindicación 151, caracterizado porque el solvente mezclable en agua seleccionado del grupo que consiste de alcohol isopropílico (IPA), etanol metanol, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, dioxano y acetonitrilo.
153. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque comprende además secar los sólidos que contienen N-acetilglucosamina recuperados.
154. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque comprende además lavar los sólidos que contienen N-acetilglucosamina seco con un solvente mezclable en agua.
155. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque comprende además disolver los sólidos que contienen N-acetilglucosamina recuperados para formar una solución de N-acetilglucosamina y recuperar los sólidos que contienen N-acetilglucosamina de la solución.
156. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque se filtra en forma adicional el caldo de fermentación para eliminar las endotoxinas bacterianas.
157. Un método para producir glucosamina a partir de una fuente de N-acetilglucosamina, en donde el método comprende: a) obtener una fuente de N-acetilglucosamina seleccionada del grupo que consiste de: N-acetilglucosamina, N-acetilglucosamina-6-fosfato, y N-acetilglucosamina-1 -fosfato; y b) tratar la fuente de N-acetilglucosamina de (a) para producir un producto de glucosamina seleccionado del grupo que consiste de: glucosamina, glucosamina-6-fosfato y glucosamina-1 -fosfato a partir de una fuente de N-acetilglucosamina.
158. El método de conformidad con la reivindicación 157, caracterizado porque la fuente de N-acetilglucosamina es al menos de aproximadamente el 40% de N-acetilglucosamina como un porcentaje de los sólidos secos en la fuente.
159. El método de conformidad con la reivindicación 157, caracterizado porque la fuente de N-acetilglucosamina es N-acetilglucosamina que ha sido producida mediante un proceso de fermentación.
160. El método de conformidad con la reivindicación 157, caracterizado porque la fuente de N-acetilglucosamina es un caldo de fermentación que contiene N-acetilglucosamina que fue producido mediante un proceso de fermentación, en donde el caldo de fermentación ha sido tratado para eliminar substancialmente el material celular.
161. El método de conformidad con la reivindicación 157, caracterizado porque se proporciona la fuente de N-acetilglucosamina como un sólido o como una solución.
162. El método de conformidad con la reivindicación 161, caracterizado porque la fuente de N-acetilglucosamina se suspende en un alcohol primario o secundario acuoso de baja ebullición.
163. El método de conformidad con la reivindicación 157, caracterizado porque el paso (b) de tratamiento comprende hidrolizar la fuente de N-acetilglucosamina bajo condiciones de ácido y calor.
164. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque el paso de hidrolización se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 60°C hasta aproximadamente 100°C.
165. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque el paso de hidrolización se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 90°C.
166. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque el paso de hidrolizar se lleva a cabo utilizando una solución clorhídrica a una concentración desde aproximadamente 10% en peso hasta aproximadamente 40% en peso.
167. El método de conformidad con la reivindicación 166, caracterizado porque la proporción de peso de la solución de ácido clorhídrico a la fuente de N-acetilglucosamina en la forma de un peso seco puro, es desde aproximadamente 1:1 en peso hasta aproximadamente 5:1 en peso.
168. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque el paso de hidrolizar, se lleva a cabo durante desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 24 horas.
169. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque los pasos de: a) hidrolizar la fuente de N-acetilglucosamina combinando la fuente de N-acetilglucosamina con una solución de ácido clorhídrico o un licor madre de hidrólisis reciclado bajo condiciones de calor para producir una solución que contiene clorhidrato de glucosamina; b) enfriar la solución de (a) para precipitar el clorhidrato de glucosamina; y c) recuperar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina precipitada de (b).
170. El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado porque el paso de (a) hidrolización, se lleva a cabo mediante combinación continua de la fuente de N-acetilglucosamina con una solución de ácido clorhídrico o un licor madre de hidrólisis reciclado para mantener la fuente de N-acetilglucosamina como una solución disuelta, seguido de la adición de ácido clorhídrico anhidro bajo condiciones de calor para que la solución de (a) inicie la hidrólisis y convierta la N-acetilglucosamina en clorhidrato de glucosamina.
171. El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado porque el licor madre de hidrólisis es una solución de hidrólisis que permanece después de la recuperación del clorhidrato de glucosamina precipitado en el paso (c), en donde se agrega un alcohol primario o secundario a la solución de hidrólisis antes, durante o después de que se lleva a cabo el paso de hidrólisis.
172. El método de conformidad con la reivindicación 171, caracterizado porque el alcohol primario o secundario se selecciona del grupo que consiste de: metanol, ¡sopropanol, etanol, n-propanol, n-butanol, y sec-butanol.
173. El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado porque el paso de enfriamiento se lleva a cabo hasta que la solución tiene una temperatura de aproximadamente -5°C hasta aproximadamente 40°C.
174. El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado porque el paso de recuperación comprende: i) recuperar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina precipitada; ii) lavar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina con un solvente mezclable en agua; y iii) secar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina.
175. El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado porque el paso de recuperación comprende: i) recolectar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina precipitada; ii) disolver los sólidos del (i) en agua para formar una solución; iii) ajustar el pH de la solución de (ii) de entre aproximadamente 2.5 y 4; iv) contactar la solución de (iii) con carbono activado para decolorar los sólidos que contienen clorhidrato de glucosamina; v) eliminar el carbón activado de la solución de (iv); vi) cristalizar el clorhidrato de glucosamina de la solución de (v).
176. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque el paso de cristalización comprende concentrar el clorhidrato de glucosamina a una temperatura menor a aproximadamente 70°C.
177. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque el paso de cristalización comprende concentrar el clorhidrato de glucosamina a una temperatura menor a aproximadamente 50°C.
178. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque el paso de cristalización comprende concentrar el clorhidrato de glucosamina a menos que la presión atmosférica.
179. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque comprende además reciclar la solución que permanece después del paso de cristalización (vi) para el paso (i) de un proceso de recuperación subsecuente.
180. El método de conformidad con la reivindicación 180, caracterizado porque comprende además reciclar la solución que permanece después del paso de cristalización (vi) para un paso subsecuente de cristalización.
181. El método de conformidad con la reivindicación 175, caracterizado porque comprende además lavar el clorhidrato de glucosamina cristalizado del paso (vi) con un solvente mezclable en agua.
182. El método de conformidad con la reivindicación 181, caracterizado porque el solvente mezclable en agua se selecciona del grupo que consiste de metanol, isopropanol, etanol, acetonitrilo, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, y dioxano.
183. El método de conformidad con la reivindicación 181, caracterizado porque comprende además secar el clorhidrato de glucosamina cristalizado después del lavado a una temperatura menor a aproximadamente 70°C durante menos de aproximadamente 6 horas.
184. El método de conformidad con la reivindicación 183, caracterizado porque el paso de secado se lleva a cabo a menos que la presión atmosférica.
185. El método de conformidad con la reivindicación 183, caracterizado porque el paso de secado se lleva a cabo con un barrido de aire.
186. El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado porque la fuente de N-acetilglucosamina se suspende en un alcohol primario o secundario acuoso de baja ebullición, y en donde el método comprende un paso adicional, entre los pasos (a) y (b) de eliminar el éster de ácido acético formado con el alcohol después de la hidrólisis o antes de reciclar la solución de hidrólisis para nuevo uso.
187. El método de conformidad con la reivindicación 186, caracterizado porque el éster de ácido acético se elimina mediante un proceso seleccionado del grupo que consiste de: destilación, centelleo y concentración a menos que la presión atmosférica.
188. El método de conformidad con la reivindicación 186, caracterizado porque el paso de hidrolizar se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 60°C y aproximadamente 100°C.
189. El método de conformidad con la reivindicación 186, caracterizado porque el paso de hidrolizar se lleva a cabo en el punto de ebullición a una atmósfera.
190. El método de conformidad con la reivindicación 169, caracterizado porque el paso de hidrólisis se lleva a cabo a una proporción de solución de ácido clorhídrico a la fuente de N-acetilglucosamina en la forma de un peso seco de desde aproximadamente 3:1 en peso hasta aproximadamente 5:1 en peso, y la temperatura es menor a aproximadamente 80°C.
191. El método de conformidad con la reivindicación 190, caracterizado porque comprende lavar el clorhidrato de glucosamina recuperado en el paso (c) con un solvente mezclable en agua.
192. El método de conformidad con la reivindicación 191, caracterizado porque el solvente mezclable en agua se selecciona del grupo que consiste de: metanol, isopropanol, etanol, acetonitrilo, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, y dioxano.
193. El método de conformidad con la reivindicación 191, caracterizado porque comprende además secar el clorhidrato de glucosamina cristalizado después del lavado a una temperatura menor a aproximadamente 70°C durante menos de aproximadamente 6 horas.
194. El método de conformidad con la reivindicación 193, caracterizado porque el paso de secado se lleva a cabo a menos que la presión atmosférica.
195. El método de conformidad con la reivindicación 193, caracterizado porque el paso de secado se lleva a cabo con un barrido de aire.
196. El método de conformidad con la reivindicación 157, caracterizado porque el paso (b) de tratamiento comprende contactar la fuente de N-acetilglucosamina con una enzima de desacetilacion para producir el producto de glucosamina.
197. El método de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque la enzima de desacetilacion se selecciona del grupo que consiste de: desacetilasa de: N-acetilglucosamina-6-? y desacetilasa de N-acetilglucosamina.
198. El método de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque la enzima de desacetilacion es una desacetilasa de quitina que ha sido modificada para, o seleccionada por su capacidad de desacetilar un monómero de N-acetilglucosamina para producir glucosamina.
199. El método de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque comprende además recuperar el producto de glucosamina mediante cristalización.
200. El método de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque comprende además recuperar el producto de glucosamina mediante precipitación.
201. El método de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque la enzima de desacetilación se inmoviliza en un substrato.
202. El método de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque el paso de contactar comprende contactar la fuente de N-acetilglucosamina con la enzima de desacetilación en la presencia de una solución acuosa de cloruro de sodio o de calcio.
203. El método de conformidad con la reivindicación 202, caracterizado porque comprende además recuperar el producto de glucosamina mediante cristalización o precipitación .
204. El método de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque el paso de contactar comprende contactar la fuente de N-acetilglucosamina con la enzima de desacetilación en la presencia de un alcohol para esterificar el alcohol.
205. El método de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque comprende además mezclar una sal con el producto de glucosamina y contactar la mezcla con un medio de intercambio de iones.
206. El método de conformidad con la reivindicación 205, caracterizado porque la sal se selecciona del grupo que consiste de sal de cloruro, un fosfato, un sulfato, un yoduro y un disulfato.
207. Un método para producir glucosamina mediante fermentación, en donde el método comprende: a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que ha sido transformado con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica sintasa de glucosamina-6-fosfato, en donde la expresión de la molécula de ácido nucleico recombinante se controla mediante una inducción de lactosa, y en donde el paso de cultivo comprende: i) crecer el microorganismo en el medio de fermentación, que comprende glucosa como una fuente de carbono en un pH de desde aproximadamente pH 4.5 hasta aproximadamente pH 7 y a una temperatura desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 37°C; ii) inducir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico mediante la adición de lactosa al medio de fermentación en ausencia de la adición en forma adicional de glucosa al medio; iii) fermentar el microorganismo después del paso (¡i) en la presencia de glucosa a un pH desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 6.7 y a una temperatura desde aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 37°C; y b) recolectar un producto producido del paso de cultivo, el cual se selecciona del grupo que consiste de glucosamina-6-fosfato y glucosamina.
208. El método de conformidad con la reivindicación 207, caracterizado porque la fuente de oligoelementos se agrega al paso (¡ii) de fermentación.
209. El método de conformidad con la reivindicación 208, caracterizado porque los oligoelementos incluyen hierro.
210. El método de conformidad con la reivindicación 207, caracterizado porque el paso (ii) comprende crecer el microorganismo en el medio de fermentación que comprende glucosa como una fuente de carbono a un pH de aproximadamente 6.9.
211. El método de conformidad con la reivindicación 207, caracterizado porque el paso (iii) comprende fermentar el microorganismo después del paso (¡i) en la presencia de glucosa a un pH desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 5.
212. El método de conformidad con la reivindicación 207, caracterizado porque el paso (iii) comprende fermentar el microorganismo después del paso (ii) en la presencia de glucosa a un pH de aproximadamente 6.7.