JP2013009690A - グルコサミンおよびｎ−アセチルグルコサミン製造のためのプロセスおよび材料 - Google Patents

グルコサミンおよびｎ−アセチルグルコサミン製造のためのプロセスおよび材料 Download PDF

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Abstract

【課題】グルコサミンを製造する方法を提供すること。
【解決手段】グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生合成法が開示される。この様な方法には、遺伝子修飾された微生物による発酵でグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産する工程が含まれる。グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生産に有用な遺伝子修飾微生物も開示される。さらに、高純度のＮ−アセチルグルコサミンが得られる方法を含む、発酵プロセスで製造されたＮ−アセチルグルコサミンの回収法も説明する。Ｎ−アセチルグルコサミンからグルコサミンの製造法も開示される。
【選択図】なし

Description

本発明は醗酵によるグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの製造法に関する。本発明はまた、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの製造に有用な遺伝子操作微生物株に関する。本発明はまた、醗酵工程からグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを回収する方法に関する。本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミン源からグルコサミンを製造する方法に関する。
アミノ糖は通常、複雑なオリゴ糖および多糖中の単量体残基として見出される。グルコサミンは単純な糖であるグルコースのアミノ誘導体である。Ｎ−アセチルグルコサミンはグルコサミンのアセチル化誘導体である。グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび他のアミノ糖は多くの天然型多糖の重要な構成要素である。例えば、アミノ糖を含む多糖は、構造タンパク質と同様に細胞の構造材料を形成し得る。
グルコサミンはとりわけ、動物およびヒトにおける骨関節炎の治療における栄養補給剤として製造されている。グルコサミンの市場は急速に成長しつつある。さらに、グルコサミンの世界市場における価格の低下は期待できない。Ｎ−アセチルグルコサミンも、多様な慢性疾患の治療で価値のある薬品である。Ｎ−アセチルグルコサミンの副作用は確認されていない。Ｎ−アセチルグルコサミンは動物体内におけるタンパク質合成の貴重で重要な成分であるので、組織再生に有用である。Ｎ−アセチルグルコサミンは胃炎、食物アレルギー、炎症性腸炎（ＩＢＤ）、憩室炎、リュウマチ性関節炎および骨関節炎の急性および／または慢性症状の他、骨関節組織の代謝不全から生じる病的状態等、様々な疾患の予防および／または治療に用いられる可能性がある。
現在、グルコサミンはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから誘導される複雑な炭水化物であるキチンの酸加水分解により得られる。また、グルコサミンは様々なアセチル化キトサンの酸加水分解でも得られる。Ｎ−アセチルグルコサミンとグルコサミンの共重合体であるキチンは、節足動物および菌類に見出される共通の天然型物質である。キチンは例えば甲殻類（ロブスター、エビ、オキアミ、カニおよびクルマエビの外骨格）、ハエ幼虫等のブタ内蔵の生物分解に用いられる昆虫等の節足動物廃棄物、および最近ではクエン酸生産に用いられた菌類バイオマス廃棄物等の安価な資源から得られる。廃棄物資源中のキチン含有量が相対的に低いため、比較的少量の製品を得るために大量の廃棄物を処理しなければならず、処理自体の収率が低く、多くの薬剤とエネルギーを要するため、最終生産物であるグルコサミン塩は比較的高価である。
キチンを精製する一般的な工業プロセスでは、酸と塩基の組み合わせでキチンを処理して廃棄される出発原料に付随する無機質、タンパク質その他の不純物を除去し、高温で濃塩酸を使用してキチンを１工程で脱重合、脱アセチル化してグルコサミンを精製するが、この方法は時間がかかり収率が低い。遊離塩基としてのグルコサミンは極めて不安定で分解され易い。従って、塩酸塩等の安定な塩が製造される。臨床試験で効能が試験された形態を模倣するため、通常、ＶｉａｒｔｒｉｌおよびＤＯＮＡ（登録商標）２００−Ｓ等、塩酸塩を基本として用いる他の塩のブレンドが提供されている。これらの組成物は分子式（グルコサミン）２硫酸−（ＮａＣｌ）２および（グルコサミン）２硫酸−（ＫＣｌ）２を有する混合塩の形をとる。最近、低いナトリウムおよびカリウム投与量でグルコサミン塩を提供する手段として、（グルコサミン）２亜硫酸ナトリウム−（ＨＣｌ）２および（グルコサミン）２亜硫酸カリウム−（ＨＣｌ）２が研究されている。
Ｎ−アセチルグルコサミンは市場で広く得られるものではない。現在では、無水酢酸等の有機アセチル化剤を用いるグルコサミンのアセチル化でＮ−アセチルグルコサミンが生産されているが、これは高価で困難な工程である。これらの工程の生産収率も低い（基質からグルコサミンへの転換率は５０％台）。
甲殻類由来の一般的な形のグルコサミンは、甲殻類に過敏な人にアレルギー反応を引き起こすという消費者への警告が付けられている。そのため、動物由来の副産物のない材料を求めている消費者が増加している。さらに、原材料（即ちカニの甲羅等のキチン源）の入手がますます制約されつつある。従って、商品として販売し消費するために、高収率でグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンを生産するコスト効率の良い方法が産業界で必要とされている。
ＰＣＴ公報ＷＯ０２／６６６６７には微生物バイオマスからグルコサミンを製造する方法が開示されている。この製造法は甲殻類アレルギーに伴う問題を克服しているが、収率が低い点が主な問題である。具体的には、その方法はクエン酸等の他の製品生産の目的の醗酵で生じるバイオマス廃棄物に依存しているため、グルコサミン製品の市場の増加に合致する量のグルコサミンを生産するには十分でない。本明細書に参照され援用される米国特許第６、３７２、４５７号には、微生物醗酵によるグルコサミン生産のためのプロセスと材料が開示されている。しかしながら、米国特許第６、３７２、４５７号はＮ−アセチルグルコサミンの生産法は開示していない。
（発明の開示）
本発明の実施態様の一つは醗酵によるＮ−アセチルグルコサミンの製造法に関する。この方法は（ａ）グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの活性を増加する遺伝子修飾の少なくとも一つを有する微生物を醗酵培地中で培養する工程、および（ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、培養工程で製造された生成物を回収する工程が含まれる。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの活性を増加するための遺伝子修飾により、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加、微生物によるグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少、およびグルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加からなる群より選択される結果が得られる。他の態様では、微生物がグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む組み換え核酸分子の少なくとも一つにより形質転換される。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。他の態様では、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼは、配列番号３０、３２および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一、または少なくとも約５０％同一、または少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ酵素活性を有する。他の態様では、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼは配列番号３０、３２および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ）グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を含む微生物を発酵培地中で培養する工程；および
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、およびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれる、該培養工程から製造された生成物を採集する工程
を包含する、発酵によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目２）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する前記遺伝子修飾が、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加；微生物によるグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現；グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少；およびグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのグルコサミン−６−燐酸に対する親和性の増加でなる群から選ばれる結果を提供する、項目１に記載の方法
。
（項目３）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも一つの組み換え核酸分子で、前記微生物が形質転換される、項目１に記載の方法。
（項目４）
グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする前記核酸配列が、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが酵素活性を有する、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが酵素活性を有する、項目３に記載の方法。
（項目７）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが酵素活性を有する、項目３に記載の方法。
（項目８）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４でなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、項目３に記載の方法。
（項目９）
前記組み換え核酸分子の発現が誘導可能である、項目３に記載の方法。
（項目１０）
前記組み換え核酸分子の発現がラクトースで誘導可能である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記微生物がラクトースによる転写誘導の阻害を減少する遺伝子修飾をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
（項目１２）
前記遺伝子修飾がＬａｃＩレプレッサータンパク質をコードする遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記微生物が、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記微生物がグルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする核酸配列を含む少なくとも一つの組み換え核酸分子で形質転換される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４配列番号、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４配列番号、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４配列番号、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有する、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼと比較して前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害を減少する修飾を、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有する、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４でなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記微生物がグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する前記遺伝子修飾が、前記微生物中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記微生物がグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目２４）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する前記遺伝子修飾が、前記微生物中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記発酵培地中で炭素源を約０．５％〜約５％の濃度に保つ工程を前記培養工程が含む、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記培養工程が酵母抽出物を含む発酵培地中で行われる、項目１に記載の方法。
（項目２７）
グルコース、フラクトース、ペントース糖、ラクトースおよびグルコン酸でなる群から選ばれる炭素源を含む発酵培地中で前記培養工程が行われる、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記ペントース糖がリボース、キシロースおよびアラビノースでなる群より選ばれる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記培養工程がグルコースおよびリボースを含む発酵培地中で行われる、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記培養工程がグルコースおよびグルコン酸を含む発酵培地中で行われる、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記培養工程が約２５℃〜約４５℃の温度で行われる、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記培養工程が約３７℃で行われる、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記培養工程が約ｐＨ４〜約ｐＨ７．５のｐＨで行われる、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記培養工程が約ｐＨ６．７〜約ｐＨ７．５のｐＨで行われる、項目１に記載の方法
。
（項目３５）
前記培養工程が約ｐＨ４．５〜約ｐＨ５のｐＨで行われる、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記微生物がバクテリアおよび菌類でなる群より選ばれる、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記微生物がバクテリアおよび酵母でなる群より選ばれる、項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓでなる群から選ばれた属由来のバクテリアである、項目１に記載の方法。
（項目３９）
前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓでなる群から選ばれた種由来のバクテリアである、項目１に記
載の方法。
（項目４０）
微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＰｈａｆｆｉａでなる群から選ばれた属由来の酵母である、項目１に記載の方法。
（項目４１）
微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓおよびＰｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａでなる群から選ばれた種由来の酵母である、項目１に記載の方法。
（項目４２）
前記微生物がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａでなる群から選ばれた属由来の菌類である、項目１に記載の方法。
（項目４３）
前記微生物がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｎ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍ ｒｅｅｓｅｉでなる群から選ばれた種由来の菌類である、項目１に記載の方法。
（項目４４）
前記微生物中でホスフォグルコイソメラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を、該微生物がさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４５）
前記微生物が前記ホスフォグルコイソメラーゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子で形質転換される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ホスフォグルコイソメラーゼが配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記微生物中でホスフォフラクトキナーゼの部分的または完全な欠失または不活性化を該微生物がさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４８）
前記微生物がグルタミンシンテターゼ活性を増加する遺伝子修飾をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４９）
グルタミンシンテターゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子で前記微生物が形質転換されている、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記グルタミンシンテターゼが配列番号８９のアミノ酸配列を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ活性を増加する遺伝子修飾を、前記微生物がさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５２）
グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子で、前記微生物が形質転換されている、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼが配列番号９５のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
（項目５４）
前記微生物中でグリコーゲン合成に関与する酵素をコードする遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を、該微生物がさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５５）
グリコーゲン合成に関与する酵素をコードする前記遺伝子は、ＡＤＰ−グルコースピロホスフォリラーゼ、グリコーゲンシンターゼおよび分枝酵素を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記遺伝子修飾が前記微生物のガラクトース代謝能を阻害しない、項目１に記載の方法。
（項目５７）
前記採集工程が、細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンでなる群から選ばれる細胞内生成物を前記微生物から回収する工程、またはグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれる細胞外生成物を前記発酵培地から回収する工程を有する、項目１に記載の方法。
（項目５８）
ａ）グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれた生成物を前記発酵培地から精製する工程；
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を前記微生物から回収する工程；
ｃ）グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を脱燐酸し、グルコサミンを製造する工程；
ｄ） Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を脱燐酸し、Ｎ−アセチルグルコサミンを製造する工程；
ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を処理し、グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれたグルコサミン製品を製造する工程、
でなる群から選ばれた工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目５９）
Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた前記生成物を、酸および加熱条件下または酵素的脱アセチル化で加水分解する工程を工程（ｅ）が含む、項目５４に記載の方法。
（項目６０）
Ｎ−アセチルグルコサミンを含む固体を発酵ブロスから沈殿させて、前記発酵法で製造されたＮ−アセチルグルコサミンを回収する、項目１に記載の方法。
（項目６１）
Ｎ−アセチルグルコサミンを含む固体を発酵ブロスから結晶化させて、前記発酵法で製造されたＮ−アセチルグルコサミンを回収する、項目１に記載の方法。
（項目６２）
ａ）グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を含む微生物を、発酵培地中で培養する工程；ならびに
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれた、培養工程で製造された生成物を採集する工程、
を包含する、発酵によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目６３）
前記微生物によるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの過剰発現；グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの酵素活性の増加；グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆反応の増加によるグルコサミン−６−燐酸生成の増加；グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの正反応の減少によるフラクトース−６−燐酸生成の減少；グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼのフラクトース−６−燐酸に対する親和性の増加；グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼのグルコサミン−６−燐酸に対する親和性の減少；およびグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼのグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少でなる群より選ばれた結果を、前記遺伝子修飾が提供する、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子で、微生物が形質転換されることを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目６５）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする核酸配列が有することを特徴とする項目６４に記載の方法。
（項目６６）
配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼが有し、ここでグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼが酵素活性を有することを特徴とする項目６４に記載の方法。
（項目６７）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼが配列番号４２のアミノ酸配列を有することを特徴とする項目６４に記載の方法。
（項目６８）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目６９）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾が、微生物中でグルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化であることを特徴とする項目６８に記載の方法。
（項目７０）
グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目７１）
グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加；微生物によるグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現；グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少；およびグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのグルコサミン−６−燐酸に対する親和性の増加でなる群から選ばれる結果を遺伝子修飾が提供することを特徴とする項目７０に記載の方法。
（項目７２）
グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子で微生物が形質転換されることを特徴とする項目７０に記載の方法。
（項目７３）
配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４でなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが有し、グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが酵素活性を有することを特徴とする項目７０に記載の方法。
（項目７４）
配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４でなる群より選ばれたアミノ酸配列を、グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが有することを特徴とする請求項７０に記載の方法。
（項目７５）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目７０に記載の方法。
（項目７６）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾が、微生物中のグルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化であることを特徴とする項目７５に記載の方法。
（項目７７）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を微生物がさらに有することを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目７８）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ酵素活性の減少；グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の微生物による過剰発現；グルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの親和性の減少；およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少でなる群より選ばれる結果を遺伝子修飾が提供することを特徴とする項目７７に記載の方法。
（項目７９）
微生物が二元活性グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを有し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性が増加することを特徴とする項目７７に記載の
方法。
（項目８０）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子で、微生物が形質転換されることを特徴とする項目７７に記載の方法。
（項目８１）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ、またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列が、それぞれグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有することを特徴とする項目８０に記載の方法。
（項目８２）
配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが有し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼがグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することを特徴とする項目８０に記載の方法。
（項目８３）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが、配列番号５６のアミノ酸配列を有することを特徴とする項目８０に記載の方法。
（項目８４）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性が減少された、またはその活性を持たない短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを核酸配列がコードすることを特徴とする項目８０に記載の方法。
（項目８５）
短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を有し、短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼがグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することを特徴とする項目８４に記載の方法。
（項目８６）
短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが配列番号５８のアミノ酸配列を有することを特徴とする項目８４に記載の方法。
（項目８７）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少させる遺伝子修飾を微生物がさらに有することを特徴とする項目７７に記載の方法。
（項目８８）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少させる遺伝子修飾が、微生物中のグルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化であることを特徴とする項目８７に記載の方法。
（項目８９）
細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンでなる群から選ばれた細胞内生成物を微生物から回収するか、またはグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群から選ばれた細胞外生成物を発酵培地から回収する工程を、採集工程が有することを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目９０）
ａ）グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾、およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する微生物を発酵培地中で培養する工程；および
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれた生成物の、培養工程から生成された生成物を採集する工程 を有することを特徴とするグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目９１）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する遺伝子修飾が、微生物中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化であることを特徴とする項目９０に記載の方法。
（項目９２）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ酵素活性の減少；グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の微生物による過剰発現；グルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの親和性の減少；およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少でなる群より選ばれた結果を、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾が提供することを特徴とする項目９０に記載の方法。
（項目９３）
微生物が二元活性グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを有し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性が増加することを特徴とする項目９０に記載の
方法。
（項目９４）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子で、微生物が形質転換されることを特徴とする項目９０に記載の方法。

（項目９５）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列が、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性、またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性をそれぞれ増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有することを特徴とする項目９４に記載の方法。
（項目９６）
配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが有し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼがグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することを特徴とする請求項９４に記載の方法。
（項目９７）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが、配列番号５６のアミノ酸配列を有することを特徴とする項目９４に記載の方法。
（項目９８）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性が減少、またはその活性がない短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを核酸配列がコードすることを特徴とする請求項９４に記載の方法。
（項目９９）
配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を、短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが有し、短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼがグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することを特徴とする項目９８に記載の方法。
（項目１００）
短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが配列番号５８のアミノ酸配列を有することを特徴とする項目９８に記載の方法。
（項目１０１）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目９０に記載の方法。
（項目１０２）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する遺伝子修飾が、グルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子での微生物の形質転換を含むことを特徴とする項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列をグルコサミン−６−燐酸シンターゼが有し、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有することを特徴とする請求項１０１に記載の方法。
（項目１０４）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群から選ばれるアミノ酸配列をグルコサミン−６−燐酸シンターゼが有することを特徴とする項目１０１に記載の方法。
（項目１０５）
野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼと比較してグルコサミン−６−燐酸の生成物阻害が減少する修飾を、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有することを特徴とする請求項１０１に記載の方法。
（項目１０６）
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４でなる群から選ばれるアミノ酸配列をグルコサミン−６−燐酸シンターゼが有することを特徴とする項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンでなる群からから選ばれた細胞内生成物を微生物から回収する工程、またはグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれた細胞外生成物を発酵培地から回収する工程を、採集工程が含むことを特徴とする項目９０に記載の方法。
（項目１０８）
ａ）内因性グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼとグルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも１種の遺伝子修飾とを有する微生物を発酵培地中で培養する工程；および
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選ばれる、培養工程から生産された生成物を採集する工程、
を有することを特徴とするグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目１０９）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする核酸配列を有する少なくとも一つの組み換え核酸分子で、微生物が形質転換されることを特徴とする項目１０８に記載の方法
。
（項目１１０）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれたアミノ酸配列に少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有し、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有することを特徴とする項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれたアミノ酸配列を、グルタミン−６−燐酸シンターゼが有することを特徴とする項目１０９に記載の方法。
（項目１１２）
野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼと比較してグルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害が減少する修飾を、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有することを特徴とする項目１０９に記載の方法。
（項目１１３）
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４でなる群より選ばれたアミノ酸配列を、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有することを特徴とする項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性が減少する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１０８に記載の方法。
（項目１１５）
その方法がＮ−アセチルグルコサミンの発酵による製造法であり、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれた、培養工程から製造された生成物を採集する工程を採集工程が有することを特徴とする項目１０８に記載の方法。
（項目１１６）
グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する遺伝子修飾微生物。
（項目１１７）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１１６に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１１８）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１１６に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１１９）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１１６に記載の遺伝子修飾微生物。

（項目１２０）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有することを特徴とする遺伝子修飾微生物。
（項目１２１）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１２０に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２２）
グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１２０に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２３）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１２２に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２４）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１２０に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２５）
グルコサミン−１−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１２４に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２６）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾と、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有することを特徴とする遺伝子修飾微生物。
（項目１２７）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微生物がさらに有することを特徴とする項目１２６に記載の修飾微生物。
（項目１２８）
ａ）発酵プロセスの生成物である可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンを含む発酵ブロスを得る工程；および
ｂ）発酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を回収する工程、
を有することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目１２９）
発酵ブロスから細胞物質を除去する工程をさらに有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
発酵ブロスを脱色する工程をさらに有することを特徴とする項目１２８に記載の方法
。
（項目１３１）
Ｎ−アセチルグルコサミンの繰り返し再結晶、活性炭処理およびクロマトグラフィー脱色でなる群から、脱色工程が選ばれることを特徴とする項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
発酵ブロスをイオン交換樹脂と接触させる工程をさらに有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１３３）
発酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂と接触させる工程を、発酵ブロスをイオン交換樹脂と接触させる工程が有することを特徴とする項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
発酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂の混合ベッドと接触させる工程を、発酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂と接触させる工程が有することを特徴とする項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
発酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を沈殿させる工程を、回収工程が有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１３６）
発酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を結晶化する工程を、回収工程が有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１３７）
可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンを含む発酵ブロスを濃縮する工程を、回収工程が有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１３８）
濃縮工程が大気圧以下で行われることを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
濃縮工程が膜分離で行われることを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４０）
濃縮工程が約４０℃〜約７５℃の間の温度で行われることを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４１）
濃縮工程が約４５℃〜約５５℃の間の温度で行われることを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４２）
発酵ブロス中の固形分が少なくとも約３０％固形になる様に濃縮工程が行われることを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４３）
発酵ブロス中の固形分が少なくとも約４０％固形になる様に濃縮工程が行われることを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４４）
発酵ブロス中の固形分が少なくとも約４５％になる様に濃縮工程が行われることを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４５）
濃縮工程の後に発酵ブロスを冷却する工程をさらに有することを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４６）
発酵ブロスを約−５℃〜約４５℃の間の温度に冷却することを特徴とする項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
発酵ブロスを約−５℃〜約室温の間の温度に冷却することを特徴とする項目１４５に記載の方法。
（項目１４８）
発酵ブロスを室温に冷却することを特徴とする項目１４５に記載の方法。
（項目１４９）
発酵ブロスにＮ−アセチルグルコサミン結晶を接種する工程をさらに有することを特徴とする項目１４５に記載の方法。
（項目１５０）
発酵ブロス中の核生成で形成したＮ−アセチルグルコサミン結晶、および外部から提供されたＮ−アセチルグルコサミン結晶でなる群からＮ−アセチルグルコサミンの種結晶が選ばれることを特徴とする項目１４９に記載の方法。
（項目１５１）
回収工程がＮ−アセチルグルコサミンを水混和性溶剤と接触させる工程を有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１５２）
イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、エタノール、メタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびアセトニトリルでなる群より水混和性溶剤が選ばれることを特徴とする項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
回収されたＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を乾燥する工程をさらに有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１５４）
Ｎ−アセチルグルコサミンを含む乾燥固体を水混和性溶剤で洗浄する工程をさらに有することを特徴とする項目１５３に記載の方法。
（項目１５５）
回収されたＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を溶解してＮ−アセチルグルコサミン溶液を形成する工程と、この溶液からＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を回収する工程をさらに有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１５６）
発酵ブロスを濾過してバクテリア内毒素を除去する工程をさらに有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１５７）
ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群から選ばれたＮ−アセチルグルコサミン源を得る工程；および
ｂ）工程ａ）のＮ−アセチルグルコサミン源を処理して、Ｎ−アセチルグルコサミン源からグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸でなる群から選ばれるグルコサミン製品を製造する工程、
を有するＮ−アセチルグルコサミン源からグルコサミンの製造方法。
（項目１５８）
原料中の乾燥固体の比率としてＮ−アセチルグルコサミン源が少なくとも約４０％のＮ−アセチルグルコサミンであることを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
Ｎ−アセチルグルコサミン源が発酵プロセスで製造されたＮ−アセチルグルコサミンであることを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１６０）
Ｎ−アセチルグルコサミン源が、発酵プロセスで製造されたＮ−アセチルグルコサミンを含む発酵ブロスであり、発酵ブロスが処理されて実質的に細胞物質が除去されていることを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１６１）
Ｎ−アセチルグルコサミン源が固体として、または溶液中に提供されることを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１６２）
Ｎ−アセチルグルコサミン源を水性で低沸点の一級または二級アルコール中に懸濁することを特徴とする項目１６１に記載の方法。
（項目１６３）
処理工程ｂ）が酸および加熱条件下にＮ−アセチルグルコサミン源を加水分解する工程を有することを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１６４）
加水分解工程が約６０℃〜約１００℃の温度で行われることを特徴とする項目１６３に記載の方法。
（項目１６５）
加水分解工程が約７０℃〜約９０℃の温度で行われることを特徴とする項目１６３に記載の方法。
（項目１６６）
加水分解工程が約１０重量％〜約４０重量％の濃度の塩酸を用いて行われることを特徴とする項目１６３に記載の方法。
（項目１６７）
塩酸溶液の重量と純乾燥重量としてのＮ−アセチルグルコサミン源との比率が約１：１重量比〜約５：１重量比であることを特徴とする項目１６６に記載の方法。
（項目１６８）
加水分解工程が約１０分〜約２４時間行われることを特徴とする項目１６３に記載の方法。
（項目１６９）
ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン源を加熱条件下で塩酸溶液または循環加水分解母液と組み合わせて加水分解し、グルコサミン塩酸塩を含む溶液を製造する工程；
ｂ）工程ａ）の溶液を冷却してグルコサミン塩酸塩を沈殿させる工程；および
ｃ）工程ｂ）から沈殿したグルコサミン塩酸塩を含む固体を取り出す工程、
を有することを特徴とする項目１６３に記載の方法。
（項目１７０）
Ｎ−アセチルグルコサミン源を塩酸塩溶液または循環加水分解母液と連続的にブレンドし、Ｎ−アセチルグルコサミン源を溶解溶液として維持し、次いで加熱条件下に無水塩酸水溶液を工程ａ）の溶液に加えて加水分解を開始し、Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミン塩酸塩に変換することで加水分解工程ａ）が行われることを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１７１）
加水分解母液が工程ｃ）で沈殿したグルコサミン塩酸塩を回収した後に残る加水分解溶液であり、加水分解工程が行われる前、工程中、または工程後に一級または二級アルコールが加水分解溶液に添加されることを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１７２）
一級または二級アルコールがメタノール、イソプロパノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノールおよびｓｅｃ−ブタノールでなる群より選ばれることを特徴とする項目１７１に記載の方法。
（項目１７３）
溶液が約−５℃〜約４０℃になるまで冷却工程が行われることを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１７４）
回収工程が：
ｉ）沈殿したグルコサミン塩酸塩を含む固体を採集する工程；
ｉｉ）グルコサミン塩酸塩を含む固体を水混和性溶剤で洗浄する工程；および
ｉｉｉ）グルコサミン塩酸塩を含む固体を乾燥する工程、
を有することを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１７５）
回収工程が：
ｉ）沈殿したグルコサミン塩酸塩を含む固体を採集する工程；
ｉｉ）工程（ｉ）からの固体を水に溶解して溶液とする工程；
ｉｉ）工程（ｉｉ）の溶液のｐＨを約２．５〜４の間に調整する工程；
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の溶液を活性炭と接触させ、グルコサミン塩酸塩を含む固体を脱色する工程；
ｖ）工程（ｉｖ）の溶液から活性炭を除去する工程；および
ｖｉ）グルコサミン塩酸塩を工程（ｖ）の溶液から結晶化する工程、
を有することを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１７６）
結晶化工程が約７０℃以下の温度でグルコサミン塩酸塩を濃縮する工程を有することを特徴とする項目１７５に記載の方法。

（項目１７７）
結晶化工程が約５０℃以下の温度でグルコサミン塩酸塩を濃縮する工程を有することを特徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１７８）
結晶化工程がグルコサミン塩酸塩を大気圧以下で濃縮する工程をさらに有することを特徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１７９）
結晶化工程（ｖｉ）〜（ｉ）後に残留する溶液を循環する工程をさらに有することを特徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１８０）
結晶化工程（ｖｉ）から次の結晶化工程後に残留する溶液を循環する工程をさらに有することを特徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１８１）
工程（ｖｉ）後の結晶化グルコサミン塩酸塩を水混和性溶剤で洗浄する工程をさらに有することを特徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１８２）
水混和性溶剤がメタノール、イソプロパノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびジオキサンでなる群より選ばれることを特徴とする項目１８１に記載の方法。
（項目１８３）
洗浄後の結晶化グルコサミン塩酸塩を約７０℃以下の温度で約６時間以下乾燥する工程をさらに有することを特徴とする項目１８１に記載の方法。
（項目１８４）
乾燥工程が大気圧以下で行われることを特徴とする項目１８３に記載の方法。
（項目１８５）
乾燥工程が空気吹き付けで行われることを特徴とする項目１８３に記載の方法。
（項目１８６）
Ｎ−アセチルグルコサミン源を水性で低沸点の一級または二級アルコール中に懸濁され、その方法が、加水分解後、または再使用のために加水分解溶液を循環する前にアルコールで生成したエステルを除去する工程（ａ）〜（ｂ）の間に追加工程を有することを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１８７）
蒸留、フラッシングおよび濃縮でなる群から選ばれたプロセスで、大気圧以下で酢酸エステルが除去されることを特徴とする項目１８６に記載の方法。
（項目１８８）
加水分解工程が約６０℃〜約１００℃の間の温度で行われることを特徴とする項目１８６に記載の方法。
（項目１８９）
加水分解工程が１気圧で溶液の沸点で行われることを特徴とする項目１８６に記載の方法。
（項目１９０）
塩酸と乾燥重量としてのＮ−アセチルグルコサミン源との比率が約３：１〜約５：１で、約８０℃以下の温度で加水分解工程が行われることを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１９１）
工程（ｃ）で回収されたグルコサミン塩酸塩を水混和性溶剤で洗浄する工程を有することを特徴とする項目１９０に記載の方法。
（項目１９２）
水混和性溶剤がメタノール、イソプロパノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびジオキサンでなる群より選ばれることを特徴とする項目１９１に記載の方法。
（項目１９３）
洗浄後の結晶化グルコサミン塩酸塩を約７０℃以下の温度で約６時間以下乾燥する工程をさらに有することを特徴とする項目１９１に記載の方法。
（項目１９４）
乾燥工程が大気圧以下で行われることを特徴とする項目１９３に記載の方法。
（項目１９５）
乾燥工程が空気吹き付けで行われることを特徴とする項目１９３に記載の方法。
（項目１９６）
処理工程（ｂ）がＮ−アセチルグルコサミン源を脱アセチル化酵素と接触させ、グルコサミン製品を製造する工程を有することを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１９７）
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼでなる群より脱アセチル化酵素が選ばれることを特徴とする項目１９６に記載の方法。
（項目１９８）
脱アセチル化酵素が、Ｎ−アセチルグルコサミンモノマーを脱アセチル化しグルコサミンを製造する様に修飾されたか、またはそのような能力についてキチンデアシラーゼであることを特徴とする項目１９６に記載の方法。
（項目１９９）
結晶化で製造したグルコサミン製品を回収する工程をさらに有することを特徴とする請求項１９６に記載の方法。
（項目２００）
沈殿で製造したグルコサミン製品を回収する工程をさらに含むことを特徴とする項目１９６に記載の方法。
（項目２０１）
脱アセチル化酵素が基質に固定化されていることを特徴とする項目１９６に記載の方法。
（項目２０２）
塩化ナトリウムまたは塩化カルシウム水溶液の存在でＮ−アセチルグルコサミン源を脱アセチル化酵素と接触させる工程を、接触工程が有することを特徴とする項目１９６に記載の方法。
（項目２０３）
結晶化または沈殿でグルコサミン製品を回収する工程をさらに有することを特徴とする項目２０２に記載の方法。
（項目２０４）
アルコールの存在下、Ｎ−アセチルグルコサミン源を脱アセチル化酵素と接触させ、アルコールをエステル化する工程を接触工程が有することを特徴とする項目１９６に記載の方法。
（項目２０５）
塩をグルコサミン製品と混合し、その混合物をイオン交換媒体と接触させる工程をさらに有することを特徴とする項目１９６に記載の方法。
（項目２０６）
塩が塩化物、燐酸塩、硫酸塩、沃素塩および亜硫酸塩でなる群より選ばれることを特徴とする項目２０５に記載の方法。
（項目２０７）
ａ）グルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子で形質転換された微生物を、発酵培地中で培養する工程であって、組み換え核酸分子の発現がラクトース誘導で制御され、発酵工程が
ｉ）グルコースを炭素源として含む培地中、約ｐＨ４．５〜約７のｐＨ、約２５℃〜約３７℃の温度で微生物を生育させる工程と；
ｉｉ）それ以上のグルコースを添加せず、発酵培地にラクトースを添加して核酸配列の転写を誘導する工程と；
ｉｉｉ）グルコースの存在で、約４．５〜６．７のｐＨ、約２５℃〜３７℃の温度で工程（ｉｉ）の後に微生物発酵を行う工程と
を有する工程；および
ｂ）グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミンでなる群より選ばれた、培養工程で製造された生成物を採集する工程、
を有する発酵によるグルコサミンの製造方法。
（項目２０８）
微量元素源を発酵工程（ｉｉｉ）に添加することを特徴とする項目２０７に記載の方法。
（項目２０９）
微量元素が鉄を含むことを特徴とする項目２０８に記載の方法。
（項目２１０）
グルコースを炭素源として含む発酵培地中、約ｐＨ６．９で微生物を生育させる工程を、工程（ｉｉ）が有することを特徴とする項目２０７に記載の方法。
（項目２１１）
工程（ｉｉ）の後にグルコースの存在下で、約４．５〜５のｐＨで微生物発酵を行う工程を、工程（ｉｉｉ）が有することを特徴とする項目２０７に記載の方法。
（項目２１２）
工程（ｉｉ）の後にグルコースの存在で、ｐＨ約６．７で微生物発酵を行う工程を、工程（ｉｉｉ）が有することを特徴とする項目２０７に記載の方法。
本発明の実施態様の他の態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する、少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する遺伝子修飾には、微生物中のグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全欠失または不活性化を含み得るが、それらに限定されない。
本発明の実施態様のある態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸シンターゼの活性を増加する、少なくとも一つの遺伝子修飾を含む。ある態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼをコードする核酸配列を有する少なくとも一つの組み換え核酸で形質転換される。この様なグルコサミン−６−燐酸シンターゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一、または少なくとも約５０％同一、または少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ酵素活性を有するグルコサミン−６−燐酸シンターゼを含み得る。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸シンターゼは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸シンターゼは野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼと比較してグルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害を減少する修飾を有する。この様なグルコサミン−６−燐酸シンターゼには配列番号４、６、８、１０、１２および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含み得るが、それに限定されない。また別な態様では、この微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾をさらに有する。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する遺伝子修飾は、微生物中のグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含み得るが、これらに限定されない。
本発明の他の実施態様は、（ａ）グルコース−６−燐酸デアミナーゼの活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する微生物を醗酵培地中で培養する工程、および（ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される培養工程で生産された生成物を回収する工程を有する醗酵により、グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを製造する方法に関する。本態様では、遺伝子修飾により微生物によるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの過剰発現、グルコサミン−６−燐酸の酵素活性の増加、グルコサミン−６−燐酸の生成量を増加させるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆反応の増加、グルコサミン−６−燐酸の生成量を減少させるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの正反応の減少、グルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの親和性の減少、およびグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼのグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少からなる群より選択される結果が得られることが好ましい。ある態様では、微生物がグルコーサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする配列を有する組み換え核酸分子で形質転換される。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードするアミノ酸配列は、グルコーサミン−６−燐酸デアミナーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼは配列番号４２と、少なくとも約３５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有し、そのグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼは酵素活性を有する。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼはアミノ酸配列番号４２を有する。
本実施態様のある態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸シンテターゼの活性を減少する遺伝子修飾を有する。例えば、グルコサミン−６−燐酸シンテターゼの活性を減少する遺伝子修飾は微生物中でグルコサミン−６−燐酸シンテターゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含み得るが、それに限定されない。
本実施態様の他の態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの活性を増加する遺伝子修飾を有する。遺伝子修飾によりグルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加、微生物によるグルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの過剰発現、グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少、およびグルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加からなる群より選択される結果が得られる。ある態様では、先の本明細書の実施態様で説明した様に、微生物がグルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む組み換え核酸分子で形質転換される。グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの様々な態様が先行する実施態様に記載され、本明細書に組み込まれる。ある態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸シンテターゼの活性を減少する遺伝子修飾を有する。この様な修飾は微生物中でグルコサミン−６−燐酸シンテターゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含み得るが、それに限定されない。
本実施態様のさらに別な態様では、微生物はグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの活性を増加する遺伝子修飾をさらに有する。この遺伝子修飾はグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの高活性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性の減少、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性の微生物による過剰発現、グルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミンに対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの親和性の減少、およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少からなる群より選択される結果を与え得る。ある態様では、微生物は２元活性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチル−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを有し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性が増加する。他の態様では、微生物がグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸分子、またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする組み換え核酸分子で形質転換される。ある態様では、グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ、またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼそれぞれの活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。他の態様では、グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼはアミノ酸配列番号５６と約３５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ酵素活性を有する。他の態様では、グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼはアミノ酸配列番号５６を有する。他の態様では、切断グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列番号５８と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を有する短縮型グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを含むがそれに限定されないＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性が減少しているか、その活性がない。ある態様では、切断グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼはアミノ酸配列番号５８を有する。本態様では、上記の様に微生物はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼの活性を減少する遺伝子修飾をさらに有する。
本発明のさらに別な実施態様は、（ａ）グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾と、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する微生物を醗酵培地中で培養する工程、および（ｂ）培養工程で生産される、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、およびＮ−アセチルグルコサミンでからなる群より選択される生成物を採集する工程を有する醗酵によるＮ−アセチルグルコサミン製造法に関する。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する遺伝子修飾は、微生物中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含む。他の態様では、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの活性を増加する遺伝子修飾により、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性の減少、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の微生物による過剰発現、グルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの親和性の減少、およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少からなる群より選択される結果が得られる。この様な２元活性グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼは上記先行実施態様に記載され、本明細書にも採用される。
本実施態様のある態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼを増加する少なくとも一つの遺伝子修飾をさらに有する。この様な修飾の様々な態様は先行実施態様に記載され、本明細書に採用される。
本発明のさらに別な実施態様は（ａ）内在性グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼと、グルコサミン−６−燐酸シンテターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する微生物を醗酵培地中で培養する工程、および（ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、培養工程で製造される生成物を回収する工程を有するＮ−アセチルグルコサミンの製造法に関する。ある態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼをコードする核酸配列を有する少なくとも一つの組み換え核酸分子で形質転換される。この修飾の様々な態様が上記に記載され、本明細書に包含される。ある態様では、微生物は上記に記載された様なグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する遺伝子修飾をさらに有する。ある態様では、その方法は醗酵でＮ−アセチルグルコサミンを製造する方法であって、回収する工程はＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、培養工程で生産される生成物を回収する工程を含む。
上記実施態様の何れか一つの態様では、上記組み換え核酸分子の何れか一つの発現は、ラクトース等により誘導可能であるが、それに限定されない。ある態様では、微生物はラクトースによる転写誘導阻害を減少する遺伝子修飾をさらに有する。この様な遺伝子修飾にはＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含み得るが、それに限定されない。
醗酵によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造法に関連する本発明の上記実施態様の何れかで、以下の議論が当てはめられる。ある態様では、培養工程には醗酵培地中の炭素源を約０．５％〜約５％の濃度に保つ工程が含まれる。他の態様では、培養工程は酵母抽出物を含む醗酵培地中で行われる。また別な態様では、培養工程はグルコース、フラクトース、ペントース糖、ラクトースおよびグルコン酸からなる群より選択される炭素源を含む醗酵培地中で行われる。ペントース糖にはリボース、キシロースおよびアラビノースが含まれるがそれに限定されない。他の態様では、培養工程はグルコースおよびリボースを含む醗酵培地中で行われ、他の態様では培養工程はグルコースおよびグルコン酸を含む醗酵培地中で行われる。ある態様では、培養工程は約２５℃〜４５℃の温度で、他の態様では約３７℃で行われる。ある態様では、培養工程は約ｐＨ４〜約ｐＨ７．５で、他の態様では約ｐＨ６．７〜７．５で、さらに別な態様では約ｐＨ４．５〜５で行われる。
醗酵法によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造法の任意の上記実施態様で、微生物には以下の少なくとも１種の修飾を含み得る。ある態様では、微生物には微生物中でホスホグルコイソメラーゼ活性を増加する遺伝子修飾がさらに含まれる。例えば、アミノ酸配列番号１０５を有するホスホグルコイソメラーゼをコードする核酸配列を有するホスホグルコイソメラーゼを含む組み換え核酸で、微生物を形質転換することができる。他の態様では、微生物中でさらにホスホフラクトキナーゼが部分的に欠失または完全に不活性化されている。他の態様では、微生物はさらにグルタミンシンテターゼ活性が増加する遺伝子修飾を有する。例えば、アミノ酸配列番号８９を有するグルタミンシンテターゼを含むグルタミンシンテターゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子で、微生物を形質転換することができる。他の態様では、微生物はグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ活性を増加する遺伝子修飾をさらに含むことができる。例えば、アミノ酸配列番号９５を有する、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子で、微生物を形質転換することができる。他の態様では、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、グリコーゲンシンターゼまたは分枝酵素を含むがそれに限定されない、微生物中でグリコーゲン合成を担う酵素をコードする遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を微生物はさらに含み得る。上記修飾の何れも微生物のガラクトース代謝を阻害しないことが好ましい。
醗酵によるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン製造法の上記実施態様の何れにおいても、採集工程には微生物から細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはグルコサミンからなる群より選択される細胞内生成物を回収する工程、または醗酵培地からグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される細胞外生成物を回収する工程が含まれる。ある態様では、この工程には（ａ）グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される生成物を精製する工程、（ｂ）微生物から、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択される生成物を回収する工程、（ｃ）グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択される生成物を脱燐酸化し、グルコサミンを生産する工程、（ｄ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択される生成物を脱燐酸化し、Ｎ−アセチルグルコサミンを生産する工程、（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択される生成物を処理し、グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択されるグルコサミン製品を製造する工程する工程から選ばれる工程が含まれる。ある態様では、工程（ｅ）はＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択される生成物を、酸および加熱条件または酵素的脱アセチル化により加水分解工程が含まれる。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン含有固体を醗酵ブロスから沈殿させて、醗酵法で生産されたＮ−アセチルグルコサミンを回収する。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン含有固体を醗酵ブロスから結晶化して、醗酵法で生産されたＮ−アセチルグルコサミンを回収する。
本発明の他の実施態様は、遺伝子修飾された上記微生物の任意の何れかに関連する。
上記の実施態様の何れか一つにおける遺伝子修飾した微生物にはバクテリアと菌類より選ばれる。適当なバクテリアにはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからなる属より選択される種由来のバクテリアが含まれるが、それに限定されない。適当なバクテリアにはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔｒｅｐｒｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓからなる種より選択される種由来のバクテリアがさらに含まれるが、それに限定されない。適当な酵母にはＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｈａｆｆｉａからなる群より選択される属由来の酵母が含まれるが、それに限定されない。適当な酵母にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ． ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｕｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓおよびＰｈａｆｆｉａｒｈｏｄｏｚｙｍａからなる群より選択される種由来の酵母が含まれるが、それに限定されない。適当な真菌類にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａからなる群より選択される属由来の真菌類が含まれるが、それに限定されない。適当な真菌類にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｂｓｉｄｉａｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｒｈｉｚｐｐｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ、Ｎ． ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍｒｅｅｓｅｉからなる群より選択される種由来の真菌類が含まれるが、それに限定されない。
本発明のさらに別な実施態様は、（ａ）醗酵生産物である可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンを含む醗酵ブロスを得る工程、および（ｂ）醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミン含有固体を回収する工程を含む、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造法に関する。ある態様では、その方法には醗酵ブロスから細胞物質を除去する工程がさらに含まれる。ある態様では、その方法には醗酵ブロスを脱色する工程がさらに含まれる。この様な脱色工程にはＮ−アセチルグルコサミンの繰り返し結晶化、活性炭処理、およびクロマトグラフィーによる脱色が含まれるが、それに限定されない。ある態様では、その方法には醗酵ブロスをイオン交換樹脂に接触させる工程が含まれる。例えば、醗酵ブロスをイオン交換樹脂に接触させる工程には、醗酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂に接触させる工程が含まれるが、それに限定されない。醗酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂に接触させる工程には、醗酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂の混合床に接触させる工程が含まれる。
本発明のある実施態様では、回収工程はＮ−アセチルグルコサミン含有固体を醗酵ブロスから沈殿する工程が含まれる。
本実施態様のある態様では、回収工程には醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンを結晶化する工程が含まれる。
本実施態様のある態様では、回収工程は可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンを含む醗酵ブロスの濃縮工程が含まれる。ある態様では、濃縮工程は大気圧以下で行われる。他の態様では、濃縮工程は膜分離で行われる。他の態様では、濃縮工程は約４０℃〜約７５℃の間の温度で行われる。他の態様では、濃縮工程は約４５℃〜約５５℃の間の温度で行われる。他の態様では、濃縮工程は醗酵ブロス中の固体含有量が少なくとも約３０％になる様に行われる。他の態様では、濃縮工程は醗酵ブロス中の固体含有量が少なくとも約４０％になる様に行われる。他の態様では、濃縮工程は醗酵ブロス中の固体含有量が少なくとも約４５％になる様に行われる。他の態様では、濃縮工程は濃縮後の醗酵ブロスを冷却する工程が含まれる。例えば、醗酵ブロスを約−５℃〜約４５℃の間の温度に冷却し、他の態様では約−５℃からほぼ室温の間の温度に、または他の態様ではほぼ室温に冷却する。
濃縮工程の他の態様には、冷却工程後にＮ−アセチルグルコサミンの結晶を醗酵ブロスの種結晶とする工程がさらに含まれる。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミンの種結晶は醗酵ブロス中の核生成で形成されたＮ−アセチルグルコサミン結晶、または外部から提供したＮ−アセチルグルコサミン結晶でなる群から選ばれる。
本実施態様の様々な態様の任意の態様で、回収工程にはＮ−アセチルグルコサミンを水混和性溶剤に接触させる工程が含まれる。水混和性溶剤にはイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびアセトニトリルが含まれるが、それに限定されない。
本実施態様の様々な態様の任意の態様で、回収法には回収されたＮ−アセチルグルコサミン含有固体を乾燥する工程が含まれる。この工程には乾燥されたＮ−アセチルグルコサミン含有固体を水混和性溶剤で洗浄する工程が含まれる。
本実施態様の様々な態様の任意の態様で、回収法には回収されたＮ−アセチルグルコサミン含有固体を溶解してＮ−アセチルグルコサミン溶液を作成し、その溶液からＮ−アセチルグルコサミン含有固体を回収する工程が含まれる。
本実施態様の様々な態様の任意の態様で、回収法にはさらに醗酵ブロスを濾過してバクテリア外毒素を除去する工程が含まれる。
本発明のさらに別な実施態様は、（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択されるＮ−グルコサミン源を得る工程、および（ｂ）（ａ）のＮ−アセチルグルコサミン源を処理して、グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択されるグルコサミン製品をＮ−アセチルグルコサミン源から生産する工程を含む、Ｎ−アセチルグルコサミン源からグルコサミンを製造する別な方法に関する。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源はその中の乾燥固体の割合として少なくとも約４０％のＮ−アセチルグルコサミンを含む。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源は醗酵法で生産されたＮ−アセチルグルコサミンである。また別な実施態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源は醗酵法で生産されたＮ−アセチルグルコサミンを含む醗酵ブロスであって、その醗酵ブロスは細胞物質を実質的に除去する様に処理されている。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源は固体または溶液中に存在する。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源は水性、低沸点第一級または第二級アルコール中に懸濁される。
本実施態様のある態様では、処理工程（ｂ）はＮ−アセチルグルコサミン源を酸および加熱条件で加水分解する工程を含む。ある態様では、加水分解工程は約６０℃〜約１００℃の温度で行われる。他の態様では、加水分解工程は約７０℃〜約９０℃の温度で行われる。他の態様では、加水分解工程は約１０重量％〜約４０重量％の濃度の塩酸を使用して行われる。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミンの純粋な乾燥重量に対する塩酸の重量の比は約１：１〜５：１である。他の態様では、加水分解工程は約１０分〜約２４時間行われる。
ある態様では、加水分解工程は（ａ）加熱条件下でＮ−アセチルグルコサミン源と塩酸溶液を組み合わせて、または加水分解母液を循環して、グルコサミン塩酸塩を含む溶液を製造する工程、（ｂ）溶液（ａ）を冷却してグルコサミン塩酸塩を沈殿させる工程、および（ｃ）工程（ｂ）から沈殿したグルコサミン塩酸塩を含む固体を回収する工程を含む。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源を塩酸溶液と連続的に混合して、または加水分解母液を循環させてＮ−アセチルグルコサミン源を溶液に保ち、次いで加熱条件下で無水塩酸を溶液（ａ）に加えて加水分解を開始し、Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミン塩酸塩に転換することで加水分解工程（ａ）が行われる。他の態様では、加水分解母液は工程（ｃ）で沈殿したグルコサミン塩酸塩を回収後に残留する加水分解溶液であって、加水分解工程が行われる前、加水分解工程中、または加水分解工程後に第一級または第二級アルコールが添加される。この様な第一または第二アルコールにはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノールおよびｓｅｃ−ブタノールが含まれるが、それに限定されない。ある態様では、冷却工程は溶液が約−５℃〜約４０℃になるまで行われる。
他の態様では、回収工程は（ｉ）グルコサミン塩酸塩含有固体を回収する工程、（ｉｉ）グルコサミン塩酸塩含有固体を水混和性溶剤で洗浄する工程、および（ｉｉｉ）グルコサミン塩酸塩含有固体を乾燥する工程を含む。
また別な態様では、回収工程は（ｉ）グルコサミン塩酸塩含有固体を回収する工程、（ｉｉ）工程（ｉ）由来の固体を水に溶解して溶液を形成する工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶液のｐＨを２．５〜４の間に調節する工程、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の溶液を活性炭に接触させてグルコサミン塩酸塩含有固体を脱色する工程、（ｖ）工程（ｉｖ）の溶液から活性炭を除去する工程、および（ｖｉ）工程（ｖ）の溶液からグルコサミン塩酸塩を結晶化する工程を含む。この態様では、結晶化工程はグルコサミン塩酸塩を約７０℃以下の温度で濃縮する工程を含む。ある態様では、結晶化工程はグルコサミン塩酸塩を約５０℃以下の温度で濃縮する工程を含む。他の態様では、結晶化工程はグルコサミン塩酸塩を大気圧以下で濃縮する工程を含む。他の態様では、その方法は結晶化工程（ｖｉ）からその後の回収工程（ｉ）後に残留する溶液を循環する工程をさらに含む。他の態様では、その方法は結晶化工程（ｖｉ）からその後の結晶化工程後に残留する溶液を循環する工程をさらに含む。この態様では、その方法は、メタノール、イソプロパノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびジオキサンを含むがそれに限定されない、水混和性溶剤で、工程（ｖｉ）由来の結晶化グルコサミン塩酸塩を洗浄する工程を含み得る。ある態様では、その方法は洗浄後の結晶化グルコサミン塩酸塩を約７０℃以下の温度で約６時間乾燥する工程をさらに含む。乾燥工程は大気圧以下で行い得る。ある態様では、乾燥工程は空気吹き付けで行われる。
本実施態様の他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源を水性低沸点第一級または第二級アルコールに懸濁するが、その方法は加水分解後にアルコールで生成した酢酸エステルを除去する工程（ａ）および（ｂ）の間、または加水分解溶液を再利用のため循環する前に別な工程を有する。ある態様では、酢酸エステルは大気圧以下で蒸留、フラッシュおよび濃縮からなる群より選択される方法で除去される。他の態様では、加水分解工程は約６０℃〜約１００℃の間の温度で行われる。他の態様では、加水分解工程は１気圧における溶剤沸点で行われる。他の態様では、加水分解工程はＮ−アセチルグルコサミン乾燥重量に対して塩酸溶液の比率が重量比約３：１〜約５：１、および約８０℃以下の温度で行われる。ある態様では、その方法は工程（ｃ）で回収されたグルコサミン塩酸塩を水混和性溶剤で洗浄する、および／または結晶化グルコサミン塩酸塩を上記の様に乾燥する工程をさらに含む。
本発明の本実施態様のまた別な態様では、処理工程（ｂ）はＮ−アセチルグルコサミン源を脱アセチルグルコサミン化酵素と接触させてグルコサミン製品を製造する工程を含む。この様な脱アセチルグルコサミン化酵素にはＮ−アセチルグルコサミンモノマーを脱アセチル化してグルコサミンを製造する様に修飾されているかまたはその能力について選択されたＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼ、および／またはキチンデアセチラーゼが含まれるが、それに限定されない。ある態様では、グルコサミン製品は結晶化で製造される。ある態様では、その方法には沈殿でグルコサミン製品を回収する工程が含まれる。ある態様では、脱アセチル化酵素は基質に固定化される。ある態様では、接触工程はＮ−アセチル源を塩化ナトリウムまたはカルシウム水溶液中で脱アセチル化酵素に接触させる工程を有する。この態様では、その方法にはさらに結晶化または沈殿によりグルコサミン製品を回収する工程が含まれる。ある態様では、接触工程にはＮ−アセチルグルコサミン源をアルコール中で脱アセチル化酵素に接触させ、アルコールをエステル化する工程が含まれる。他の態様では、その方法には塩化物、燐酸塩、硫酸塩、沃化物および亜硫酸塩捕含むが、それに限定されない塩をグルコサミンと混合し、混合物をイオン交換媒体と接触させる工程がさらに含まれる。
本発明のさらに別な実施態様は、（ａ）グルコサミン−６−燐酸シンテターゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子で形質転換体された微生物を、醗酵培地中で培養する工程を有する醗酵によるグルコサミンの製造法であって、培養工程は（ｉ）グルコースを炭素源として含み、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ７、約２５℃〜約３７℃の温度で醗酵培地中で微生物を生育させる工程、（ｉｉ）培地にそれ以上のグルコースを添加せず、ラクトースを醗酵培地に添加することにより、核酸配列の転写を誘導する工程、（ｉｉｉ）約４．５〜６．７のｐＨ、約２５℃〜３７℃の温度で工程（ｉｉ）後にグルコースを加えて微生物を培養する工程、および（ｂ）グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミンでなる群より選ばれた、培養工程で生産された生成物を回収する工程を有する製造法に関する。ある態様では、鉄を含むがそれに限定されない微量元素源を醗酵工程（ｉｉｉ）で添加する。ある態様では、工程（ｉｉ）はｐＨ約６．９でグルコースを炭素源として含む醗酵培地中で微生物を生育させる工程を含む。ある態様では、工程（ｉｉｉ）は約ｐＨ４．５〜５でグルコースを加えて工程（ｉｉ）後に微生物を培養する工程を有する。ある態様では、工程（ｉｉｉ）は約ｐＨ６．７でグルコースを加えて工程（ｉｉ）後に微生物を培養する工程を有する。
図１は組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるグルコサミンの生合成と代謝経路の模式図である。 図２は組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるグルコサミンとＮ−アセチルグルコサミンの過剰生産経路の新規修飾の模式図である。 図３はグルコースからグルコサミンへの経路および他の競合経路の概要である（Ｐｇｉ＝ホスホグルコイソメラーゼ；Ｐｇｍ＝ホスホグルコムターゼ；Ｐｆｋ＝ホスホフラクトキナーゼ；Ｚｗｆ＝グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ；ＧｌｍＳ＝グルコサミン−６−Ｐシンテターゼ；ホスファターゼ＝グルコサミン−６−燐酸の加水分解に拘わるホスファターゼ活性） 図４は組み換えＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＧｌｍＳ酵素活性に対するグルコサミン−６−燐酸の影響を示すグラフである。 図５は低レベルグルコサミン−６−燐酸における様々なＣｌｍＳタンパク質のグルコサミンシンテターゼ活性を示すグラフである。 図６は振盪フラスコ培養における酵素活性の経時変化を示すグラフである。 図７は振盪フラスコ中の異なった条件でラクトースにより誘導されたグルコサミン生産レベルを示す棒グラフである（ラクトース誘導株は７１０７−１６、および対照株は２１２３−５４）。 図８は初期生育期後にラクトースにより誘導された細胞培養におけるグルコサミン生産への微量元素の効果を示す線グラフである。 図９は培養器中のグルコサミン生産に対する燐酸レベルおよび鉄供給の効果を示す線グラフである。 図１０は異なったｐＨにおける２０ｇ／リッター濃度のグルコサミンの生育曲線を示す線グラフである。 図１１は異なった環境条件下の１リッター培養器中の２１２３−５４株によるグルコサミン生産を示す線グラフである。 図１２は異なったｐＨにおけるグルコサミン分解を示す線グラフである。 図１３はＭ９Ａ培地中（グルコースなし）のＮ−アセチルグルコサミンの安定性を示す線グラフである。安定性は二つのＮ−アセチルグルコサミン濃度（４０および８０ｇ／リッター）と二つのｐＨ（５．５および７．０）で試験された。 図１４はＮ−アセチルグルコサミン生産の別な経路の概要である。 図１５はホスホグルコイソメラーゼ活性（Ｐｇｉ）に対する燐酸化アミノ糖の効果を示す線グラフである。 図１６はグルコース−６−デヒドロゲナーゼに対する燐酸化アミノ糖の効果を示す線グラフである。 図１７はＮ−アセチルグルコサミン醗酵中の酵素活性レベルを示す線グラフである。 図１８は振盪フラスコ実験におけるＮ−アセチルグルコサミン生産に対するペントースおよびグルコネートの効果を示す線グラフである。 図１９は培養器中の初期および後期ＩＰＴＧ誘導を伴う＃７１０７−８７＃２５によるＮ−アセチルグルコサミン生産を示す線グラフである。 図２０はＮ−アセチルグルコサミン生産に対する亜鉛および鉄濃度の効果、特に亜鉛除去の有益な効果を示す線グラフである。 図２１はＮ−アセチルグルコサミン（Ｍ９Ａ培地中１０ｇ／リッター）の酸／熱加水分解を示す線グラフである。 図２２は酸／熱加水分解でのグルコサミン（Ｍ９Ａ培地中１０ｇ／リッター）の安定性を示す線グラフである。 図２３は０．１Ｎ塩酸を用いる、異なった温度におけるＮ−アセチルグルコサミン（Ｍ９Ａ培地中１０ｇ／リッター）の加水分解を示す線グラフである。 図２４は９０℃におけるＮ−アセチルグルコサミン／グルコサミンの加水分解を示す線グラフである。 図２５は９０℃におけるＮ−アセチルグルコサミン／グルコサミンからのアンモニア生成を示す線グラフである。
（発明の詳細な説明）
本発明はグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン生産のための生合成法に関する。この様な方法にはグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを製造するための遺伝子修飾した微生物の醗酵工程が含まれる。本発明はまた、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン生産に有用な遺伝子修飾した微生物に関する。さらに、本発明は高純度でＮ−アセチルグルコサミンを得る方法を含む、醗酵法で製造したＮ−アセチルグルコサミンの回収法に関する。本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミンからグルコサミンを製造する方法に関する。本発明以前に、Ｎ−アセチルグルコサミンはグルコサミンのアセチル化により製造されており、従ってＮ−アセチルグルコサミンから市場で有用なグルコサミンを製造する方法が報告されているとも、その方法が商業的に実施可能であるとも考えられていなかった。本発明は全く天然の生物学的方法によるＮ−アセチルグルコサミンの直接生産を最初に示すものである。
具体的には、本発明は全体として微生物醗酵によるグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの製造法に関するものである。その方法にはアミノ糖代謝経路に遺伝子修飾を有する微生物を醗酵培地中で培養する第一工程を含み、その代謝経路にはグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を他の化合物に変換する経路；グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を合成する経路；グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を微生物の外へ輸送する経路；グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを微生物内へ輸送する経路；およびグルコサミン−６−燐酸の生産に関与する基質と競合し、細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミン、および／または細胞外グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを含む生成物を微生物から生産する経路が含まれる。その方法には細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンを微生物から回収、および／または細胞グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを醗酵培地から回収して生成物を採集する第二工程が含まれ、その工程には回収と精製工程が含まれる（以下に詳細に定義され議論される）。本発明の醗酵プロセスから回収されるＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸は、本明細書記載の方法を用いて脱アセチルグルコサミン化され、グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸が製造される。
本発明の醗酵によるグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの新規製造法は安価であり、現在の方法で製造されるグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの収率を越える収率でグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンを製造し得る。さらに、本明細書に記載の遺伝子修飾された微生物を使用することにより、本発明の方法を特定の問題に適応し、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生産比率を変える必要性に容易に変更することができる。さらに、本発明に記載の方法と材料を当業者が使用および／または変更し、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ポリグルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびその誘導体等の他のアミノ糖を製造することができる。
アミノ糖であるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびグルコサミン（ＧｌｃＮ）は、主要な高分子、特に糖結合体（すなわち共有結合で結合したオリゴ糖鎖を含む高分子）の生合成の前駆体であるため、微生物で基本的に重要な分子である。例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉではＮ−アセチルグルコサミンとグルコサミンは細胞外被の二つの高分子、ペプチドグリカンとリポ多糖の前駆体である。ペプチドグリカンまたはリポ多糖の生合成を妨害する突然変異は致命的であり、細胞外被の一体性を喪失し、最終的には溶菌を生じる。
本明細書で用いられるグルコサミン、Ｄ−ガラクトサミンおよびＮ−グルコサミンという用語は相互に交換して用いることができる。同様に、グルコサミン−６−燐酸とＮ−グルコサミン−６−燐酸という用語は互換的に用いられ、グルコサミン−１−燐酸とＮ−グルコサミン−１−燐酸という用語も互換的に用いられる。グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸はそれぞれＣｌｃＮ、ＧｌｃＮ−６−ＰおよびＧｌｃＮ−１−Ｐと略記することができる。Ｎ−アセチルグルコサミンは２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコースとも呼ばれる。Ｎ−アセチルグルコサミンはＮ−アセチルグルコサミドと書くこともできる。グルコサミンとその誘導体と同様に、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸という用語は、それぞれＧｌｃＮＡｃ（またはＤ−ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｉｃＮ−６−ＰおよびＧｌｉｃＮ−１−Ｐと略記することができる。Ｎ−アセチルグルコサミンはＮＡＧとも略記できる。
本明細書で上記で同定したグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン製品の製造に関連するアミノ糖の代謝経路における酵素を参照する。アミノ糖はサッカライドのアミノ誘導体（例えばヒドロキシル基の代わりにアミノ基を有するサッカライド）である。本発明によれば、アミノ糖代謝経路とは、アミノ糖の生合成、同化作用または異化作用に関与する、または含まれる任意の生化学経路である。本明細書で用いる場合、アミノ糖代謝経路には、アミノ糖とその前駆体の細胞内へ、および細胞外からの輸送に関与する経路が含まれ、またアミノ糖の生合成または異化作用に関与する物質と競合する生化学経路も含まれ得る。例えば、最初に形成されたアミノ糖の一つに対する直接前駆体は、フルクトース−６−燐酸（Ｆ−６−Ｐ）であり、生化学反応（グルコサミンシンターゼで触媒される）またはアンモニウムとの生化学反応（グルコサミンデアミナーゼで触媒される）でグルコサミン−６−燐酸を生成する。フルクトース−６−燐酸も解糖経路の中間体である。従って、解糖経路は、基質であるフルクトース−６−燐酸について競合することにより、グルコサミン−６−燐酸生合成経路と競合する。さらに、グルコサミン−６−燐酸を他のアミノ糖に変換し、一連の生化学反応により様々な高分子中の構成要素を形成することができる。この様にして、解糖経路であるフルクトース−６−燐酸／グルコサミン−６−燐酸経路はグルコサミン−６−燐酸の生合成が影響を与える程度まで、グルコサミン−６−燐酸／高分子生合成経路はすべて、本発明ではアミノ糖代謝経路であると考えられる。
グルタミン合成の経路および代謝がグルタミンの利用可能性（グルコサミン−６−燐酸合成のアミノ供与体）を決定し、従ってグルコサミン−６−燐酸の生合成に影響する。従って、これら全ての経路は本発明ではアミノ糖代謝経路と考えられる。グルコサミン−６−燐酸からのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸の合成、およびグルコサミン−１−燐酸からのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸の合成には、クレブスサイクルの基質でもあるアセチルＣｏＡの供給が必要である。従って、クレブスサイクルはＮ−アセチルグルコサミン合成経路と、基質であるアセチルＣｏＡについて競合する。この様にして、アセチルＣｏＡの合成および代謝の経路はＮ−アセチルグルコサミン生合成に影響し、本発明ではアミノ糖代謝経路であると考えられる。
様々な微生物では、アミノ糖代謝経路の多くが明らかになっている。特に、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生合成および異化作用、ならびにその燐酸化誘導体に対する経路がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで明らかになっている。これらの経路にはこれらのアミノ糖を炭素源として利用するための複数の輸送系が含まれる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるアミノ糖の輸送、異化作用および生合成に直接関連する酵素およびタンパク質をコードする遺伝子がクローン化され配列決定されている。さらに、アミノ糖代謝の実質的に全ての工程が妨害されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの変異株が単離されている。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのアミノ糖代謝の既知の経路が図１に示される。米国特許第６，３７２，４５７号は、あらゆる既知の野生型および変異体の微生物のグルコサミン生産能をはるかに越えるグルコサミン生産能を有する、グルコサミン生産微生物を初めて記載した。米国特許第６，３７２，４５７号に開示される様に、異化作用経路のいくつかの工程は遺伝子不活性化により妨害され（十字により示す）、ＧｌｃＮ−６−Ｐの合成を触媒する酵素ＧｌｃＮ−６−Ｐシンターゼが組み替え宿主細胞中で過剰発現された（太線で示す）。本発明は米国特許第６，３７２，４５７号に記載されないグルコサミンの生産に対する新規醗酵プロセスを提供するが、それには生産微生物の遺伝子修飾、ならびにグルコサミン生産に対し米国特許第６，３７２，４５７号に記載されない遺伝子修飾の組み合わせも記載される。本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミンの生産に対する微生物の遺伝子修飾および醗酵プロセスの最初の記載であると確信する。
以下に詳細に議論する様に、アミノ糖代謝経路に関与する経路および遺伝子の多くが解明されているが、多くの可能な遺伝子修飾のどれが、商業的に有意な量のＮ−アセチルグルコサミンを生産し得る微生物を作製するのに必要であるかは本発明の前には知られていなかった。その上、本明細書に記載される様なグルコサミンの生産に対する新規の遺伝子修飾およびその組み合わせは以前には分かっていなかった。実際、本明細書に記載するグルコサミンの生産に対する遺伝子修飾のあるものは、グルコサミン生産の醗酵法の以前の開示である、前出の米国特許第６，３７２，４５７号に記載された内容と相反している。
微生物Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのアミノ糖代謝経路を、本発明の特定の実施態様とする。グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの過剰生産に対して、本発明で開示されたアミノ糖代謝経路の遺伝子修飾の主な態様が図２に示される。図２では、本発明で検討される遺伝子工学による代謝フラックスの発生および／または増加が太線で示される。ＧＮＡｌおよび／またはＮａｇＢへの修飾を含むがそれに限定されず、ＧｌｍＳとＧＮＡｌ、ＧｌｍＳとＧｌｍＵ、ＮａｇＢとＧＮＡ１、ＮａｇＢとＧｌｍＵの組み合わせそれ自体、さらに他の遺伝子修飾との組み合わせをさらに含むＮ−アセチルグルコサミンの合成に対するいくつかの異なったアプローチが開示されている。一例として、本発明はグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生産を最適にするための別な遺伝子の過剰発現または欠失を検討する。図３および以下の表を説明すると、この図にはグルコースの代謝およびＮ−グルコサミンの生成における様々な他の酵素の関与が示され、この表にはグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を最適化するために本発明の微生物宿主に対し付加的に行われ得る様々な修飾が示される。これらの実施態様の全ては以下に詳細に述べられる。他の微生物も同様なアミノ糖代謝経路を有すると共に、この様な経路内に類似の構造および機能を有する遺伝子およびタンパク質を有することが理解される。この様にして、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに関して以下に議論する原理は他の微生物にも適用可能で、本発明に含まれているのは明らかである。
Figure 2013009690
同じ生物活性を有する酵素が、どの生物にその酵素が由来するかによって異なった名前を有し得ることは当該分野で公知である。以下は、本明細書に参照される酵素の多くの別名、およびいくつかの生物由来のこの様な酵素をコードする遺伝子の特定の名前の一般的なリストである。本発明は任意の生物由来の所定の機能の酵素を包含することを意図するが、酵素名が互換的に用いられ得るか、ある配列または生物で適切に用いられ得る。
例えば、本明細書で一般的に「グルコサミン−６−燐酸シンターゼ」と呼ばれる酵素はフルクトース−６−燐酸およびグルタミンからグルコサミン−６−燐酸およびグルタメートの形成を触媒する。その酵素はグルコサミン−フルクトース−６−燐酸アミノトランスフェラーゼ（異性化）、ヘキソセホスフェートアミノトランスフェラーゼ、Ｄ−フルクトース−６−燐酸アミドトランスフェラーゼ、グルコサミン−６−燐酸イソメラーゼ（グルタミン生成）、Ｌ−グルタミン−フルクトース−６−燐酸アミドトランスフェラーゼ、およびＧｌｃＮ６Ｐシンターゼとしても知られている。Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼは一般にＧｌｍＳと呼ばれる。酵母および他の供給源由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼは一般的にＧＦＡまたはＧＦＡＴと呼ばれる。
様々な生物由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼは当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼが本明細書に記載されている。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼは、本明細書で配列番号１で表される核酸配列でコードされる本明細書で配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼも本明細書に記載されているが、この酵素は本明細書で配列番号１５で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有する。また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼが本明細書に記載されているが、この酵素はその微生物ではグルコサミン−フルクトース−６−燐酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＦＡ１）として知られ、本明細書に配列番号１７で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有する。また本明細書にＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼが記載されるが、この酵素はその微生物でグルコサミン−フルクトース−６−燐酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＦＡ１）としても知られ、本明細書で配列番号１９で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有する。また本発明にグルコサミン−６−燐酸シンターゼが含まれるが、この酵素はグルコサミン−６−燐酸シンターゼの酵素活性の増加、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害の減少、およびグルコサミン−６−燐酸シンテターゼのその基質に対する親和性の増加から選ばれる結果をもたらす、一以上の遺伝子修飾を有する。一般的に、本発明によれば、変異酵素または修飾酵素の所定の特性の増加または減少は、同じかまたは同等な条件で測定または確立された、同じ生物由来の野生型（即ち正常な、修飾されていない）酵素の同じ特性を参照して行われる（以下により詳細に議論する）。
酵素活性の生成物阻害が減少する結果となる遺伝子修飾を有するグルコサミン−６−燐酸シンターゼのいくつかも本明細書に記載される。グルコサミン−６−燐酸シンターゼに対するこの様な修飾は、米国特許第６，３７２，４５７号にも詳細に記載されたが、生成物阻害が減少した別な明白なＧｌｍＳ突然変異体の少なくとも一つが本明細書に記載されている（配列番号１４）。生成物阻害が減少したＥ．ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼ酵素は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４（それぞれ配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３でコードされる）で表されるアミノ酸配列を含むがそれに限定されないアミノ酸配列を有する。さらに、生成物阻害が減少した酵素を生じる、野生型配列（配列番号２）と比較した配列番号１４中のアミノ酸位置を記載する表が、表７として提供される。配列番号４は配列番号２と比較して以下の変異を有する：位置４におけるＩｌｅ→Ｔｈｒ、位置２７２におけるＩｌｅ→Ｔｈｒ、および位置４５０におけるＳｅｒ→Ｐｒｏ。配列番号６は配列番号２と比較して以下の変異を有する：位置３９におけるＡｌａ→Ｔｈｒ、位置２５０におけるＡｒｇ→Ｃｙｓ、および位置４７２におけるＧｌｙ→Ｓｅｒ。配列番号８は配列番号２と比較して以下の変異を有する：位置４６９におけるＬｅｕ→Ｐｒｏ。配列番号１０および１２はそれぞれ、配列番号２と比較して少なくとも以下の変異を有する：位置４７２におけるＧｌｙ→Ｓｅｒ。表７に列記した、その中に示す変異の任意の組み合わせを含む任意の少なくとも一以上の位置において変異を有するグルコサミン−６−燐酸シンターゼ、または任意の組み合わせを含む配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の何れかで表される別の変異のいずれかを有するグルコサミン−６−燐酸シンターゼが本発明により意図される。さらに、他の微生物由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼで相同修飾を行うことができる。最後に、天然に存在するいくつかのグルコサミン−６−燐酸シンターゼでは、他の微生物由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼより生成物阻害が少ない。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼはＥ．ｃｏｌｉ変異ＧｌｍＳ酵素にほとんど匹敵する生成物耐性を示すことが本発明者らにより示されている（実施例のセクションを参照）。
本明細書で一般的にグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素は、グルコサミン−６−燐酸およびアセチルＣｏＡをＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸に変換し、ＣｏＡを放出する。この酵素はグルコサミン−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミントランスアセチラーゼおよびホスホグルコサミンアセチラーゼとしても知られている。その酵母酵素は一般的にＧＮＡ１と呼ばれる。様々な生物由来のグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略での使用が意図される。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが本明細書に記載される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼは、本明細書で配列番号２９で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号３０で表されるアミノ酸配列を有する。また、本明細書で配列番号３１で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号３２で表されるアミノ酸配列を有するＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ由来のグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼも本明細書に記載される。また本明細書で配列番号３３で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号３４で表されるアミノ酸配列を有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼも本明細書に記載される。グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ酵素活性の増加、微生物によるグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少、およびグルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加から選ばれる結果をもたらす遺伝子修飾を有するグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼも本発明に含まれる。
本明細書で一般的にグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼと呼ばれる酵素は、グルコサミン−６−燐酸および水の可逆反応を触媒し、フルクトース−６−燐酸およびアンモニアを形成する。この酵素はグルコサミン−６−燐酸イソメラーゼ、ＧｌｃＮ６Ｐデアミナーゼ、ホスホグルコサミンイソメラーゼ、ホスホグルコサミン−イソメラーゼ、グルコサミン燐酸デアミナーゼ、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸ケトールイソメラーゼ（脱アミノ化）としても知られている。Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌では、この酵素は一般にＮａｇＢとして知られている。様々な生物由来のグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼが本明細書に記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼは、本明細書で配列番号４１で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号４２で表されるアミノ酸配列を有する。また、グルコサミン−６−燐酸酵素活性の増加、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆反応の増加により増加した（より多くの）グルコサミン−６−燐酸の形成、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの正反応の減少により増加した（より少量の）フルクトース−６−燐酸の生成、フルクトース−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの親和性の増加、グルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの親和性の減少、およびグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼのグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少から選ばれる結果をもたらす遺伝子修飾を有するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼも本発明に含まれる。
本明細書で一般的にグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素は、グルコサミン−１−燐酸およびアセチルＣｏＡをＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に変換し、ＣｏＡを放出する。この酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中ではＧｌｍＵとして知られている。細菌ＧｌｍＵ酵素は２機能性酵素である（すなわち、この酵素は二つの酵素機能を有する；この酵素は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンジホスホリラーゼとしても知られるＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの機能も有する）。様々な生物由来のグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、実際には二機能性グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼであるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが本明細書に記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼは、本明細書で配列番号５５で表される核酸配列でコードされる、本明細書に配列番号５６で表されるアミノ酸配列を有する。また本明細書にはＥ．ｃｏｌｉグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの切断型変異体も記載され、ここでは、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸Ｎ−ウリジルトランスフェラーゼをコードする部分が欠失し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性のみを有する酵素のみが有効に残される。この切断型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼは、本発明で配列番号５７で表される核酸配列でコードされる、本発明で配列番号５８で表されるアミノ酸配列を有する。また、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ酵素活性の減少（酵素が二機能性酵素である場合）、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのグルコサミン−１−燐酸に対する親和性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの親和性の減少（酵素が二機能性酵素である場合）、およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少から選ばれる結果をもたらす遺伝子修飾グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼも本発明に含まれる。
本明細書で一般的にＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼと呼ばれる酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸をグルコサミン−６−燐酸およびアセテートに加水分解する。その酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中でＮａｇＡとして知られている。様々な生物由来のＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略での使用が意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼが本明細書に記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼは本明細書で配列番号８５で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号８４で表されるアミノ酸配列を有する。グルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ活性の増加、グルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの逆反応のＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸の形成の増加、グルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの正反応の減少によるグルコサミン−６−燐酸形成の減少、グルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの親和性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの親和性の減少、グルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少から選ばれる結果をもたらす遺伝子修飾を有するＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼも本発明に含まれる。
本明細書で一般的にホスホグルコサミンムターゼと呼ばれる酵素は、グルコサミン−６−燐酸とグルコサミン−１−燐酸との間の変換を触媒する。この酵素は一般にＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中でＧｌｍＭとして知られている。様々な生物由来のホスホグルタミンムターゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のホスホグルコサミンムターゼが本明細書に記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホスホグルコサミンムターゼは、本明細書で配列番号５３で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号５４で表されるアミノ酸配列を有する。ホスホグルコサミンムターゼ活性の増加、ホスホグルコサミンムターゼの正反応の増加によるグルコサミン−１−燐酸生成の増加、ホスホグルコサミンムターゼの逆反応減少によるグルコサミン−６−燐酸生成の減少、グルコサミン−６−燐酸に対するホスホグルコサミンムターゼの親和性の増加、グルコサミン−１−燐酸に対するホスホグルコサミンムターゼの親和性の減少、およびホスホグルコサミンムターゼのグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少から選ばれた結果をもたらす遺伝子修飾を有するホスホグルコサミンムターゼも本発明に含まれる。
本明細書でホスホグルコイソメラーゼと一般的に呼ばれる酵素は、グルコース−６−燐酸のフルクトース−６−燐酸への相互変換を触媒する。この酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌でホスホグルコイソメラーゼまたはＰｇｉとして知られている。様々な生物由来のホスホグルコイソメラーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のホスホグルコイソメラーゼが本明細書に記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホスホグルコイソメラーゼは、本明細書で配列番号１０４で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号１０５で表されるアミノ酸配列を有する。
本明細書で一般的にホスホフルクトキナーゼと呼ばれる酵素は、フルクトース−６−燐酸（Ｆ−６−Ｐ）からフルクトース１，６−二燐酸の生成を触媒する。ｐｆｋＡでコードされるＥ．ｃｏｌｉの主要ホスホフルクトキナーゼはホスホフルクトキナーゼ活性の９０％を提供する。残りの１０％の活性はｐｆｋＢでコードされる小数のホスホフルクトキナーゼで供給される。ホスホフルクトキナーゼ酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌でホスホフルクトキナーゼまたはＰｆｋとして一般的に知られている。様々な生物由来のホスホフルクトキナーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＰｆｋＡが本明細書に記載される。
本明細書でグルタミンシンテターゼと一般的に呼ばれる酵素は、ＮＨ３およびＡＴＰを必要とする反応でＬ−グルタミン酸のＬ−グルタミンへの変換を触媒する。この酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中でグルタミンシンテターゼまたはＧｌｎＡとして一般的に知られている。様々な生物由来のグルタミンシンテターゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のグルタミンシンテターゼが本明細書に記載されている。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のグルタミンシンテターゼは本明細書で配列番号８８で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号８９で表されるアミノ酸配列を有する。
本明細書で一般的にグルコース−６−燐酸デヒドロロゲナーゼと呼ばれる酵素は、ペントース燐酸経路の第一段階を触媒し、グルコース−６−燐酸をグルコノ−１，５−ラクトンへ変換する。この酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中でｚｗｆでコードされるグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼとして一般的に知られている。様々な生物由来のグルコース−６−燐酸デヒドロロゲナーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼは、本明細書で記載される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼは本明細書中で配列番号９４で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号９５で表されるアミノ酸配列を有する。
多数の酵素が微生物中のグリコーゲン合成に関与している。この様な酵素にはＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、グリコーゲンシンターゼおよび分枝酵素が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書に参照される他の遺伝子にはＮ−アセチルグルコサミントランスポーター（ＩＩＮａｇ）、マンノーストランスポーター（ＥＩＩＭ，Ｐ／ＩＩＩｍａｎ）、グルコーストランスポーター（ＩＩＧｌｃ）および／またはホスファターゼが含まれるが、それに限定されない。Ｅ．ｃｏｌｉ中の遺伝子はそれぞれｎａｇＣ、ｎａｇＤ、ｎａｇＥ（Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター（ＩＩＮａｇ））ｍａｎＸＹＺ（マンノーストランスポーター（ＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩｍａｎ））、ｐｔｓＧ（グルコーストランスポーター（ＩＩＧｌｃ））またはホスファターゼ遺伝子に対応する。ｎａｇＣ遺伝子はｎａｇ領域のリプレッサーおよびｇｌｍＵオペロンのアクチベーターおよびリプレッサー両方として作用する制御タンパク質をコードする。ｎａｇＤ遺伝子の機能は知られていないが、それがｎａｇレギュロン内に存在するのでアミノ糖代謝に関係していると考えられている。グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの分解に関与しているｎａｇ遺伝子（ｎａｇＡ、ｎａｇＢ、ｎａｇＣ、ｎａｇＤ、ｎａｇＥ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体上の１５ｍｉｎに位置するレギュロン（すなわち、ｎａｇレギュロン）として存在する。マンノーストランスポーター（ＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩｍａｎ）（ｍａｎＸＹＺ）は細胞内へのグルコサミンの輸送を担う。グルコーストランスポーター（ＩＩＧｌｃ）（ｐｔｓＧ）はグルコースを細胞内に輸送するが、グルコサミンに対しては第二トランスポーターとして作用し得る。ホスファターゼが糖燐酸エステルおよびタンパク質の脱燐酸化を触媒することは周知である。
本発明のある実施態様はグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの醗酵生産法に関する。この様な方法には一般的に（ａ）微生物中でグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を増加するに有用であると本明細書中に開示される、少なくとも一つの特異的遺伝子修飾を有する微生物を醗酵培地中で培養する工程、ならびに（ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンでなる群から選ばれる生成物を培養工程から採集する工程が含まれる。より具体的には、生成物には微生物から採集される細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミン、ならびに／または醗酵培地から採集される細胞外グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンが含まれ得る。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸は加水分解生成物（グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１燐酸）が安定である酸／加熱条件下で加水分解される。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸が脱アセチル化酵素を用いて脱アセチル化される。回収および精製法は以下に詳細に述べられる。
一般的に、本発明の方法に有用な遺伝子修飾された微生物は、代表的には少なくとも一つのアミノ糖代謝経路に関与する少なくとも１個の修飾された遺伝子を有し、その結果（ａ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を他の化合物へ変換する能力の減少（すなわちグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸の同化作用または異化作用経路の阻害）、（ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を生産（即ち合成）する能力の増大、（ｃ）グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを細胞内へ輸送する能力の減少、（ｄ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを細胞外へ輸送する能力の増大、および／または（ｅ）生化学反応と競合する、グルコサミン−６−Ｐ生産に関与する基質を使用する能力の減少、および／または（ｆ）生化学反応と競合する、アセチルＣｏＡ（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸の生産に関与）を使用する能力の減少をもたらす。
一般的に、遺伝子修飾されたアミノ糖代謝経路を有する微生物は、以下に詳細に議論される様に少なくとも一つの遺伝子修飾を有し、その結果、同じ条件下で培養された野生型微生物と比較して上記の様な一つ以上のアミノ糖代謝経路の変化をもたらす。アミノ糖代謝経路におけるこの様な修飾は、微生物のアミノ糖生産能を変化させる。以下に詳細に議論する様に、本発明によれば遺伝子修飾された微生物では、同じまたは同等の条件下で培養された同じ種（および好ましくは同じ株）の野生型微生物と比較して、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産能が増大していることが好ましい。同等の条件とは、類似しているが必ずしも同じでなく（例えば培地組成、温度、ｐＨおよび他の条件の若干の変化は許容され得る）、および微生物の増殖、または微生物によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの生産に対する効果が実質的に変化しない培養条件である。
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産に影響するするアミノ糖代謝経路は、以下の種類の経路のうちの少なくとも１つに分類することができる：（ａ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を他の化合物に変換する経路、（ｂ）グルコサミン−６−燐酸合成経路、（ｃ）グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの細胞内への輸送経路、（ｄ）グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミンの細胞外への輸送経路、ならびに（ｅ）グルコサミン−６−燐酸生産における基質競合経路。
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産能の増大した微生物の遺伝子修飾による開発は、古典的株開発および分子遺伝学的技術の両方を用いて達成され得る。一般的に、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産の増大した微生物を作製する戦略は（１）グルコサミン−６−燐酸生産の影響が負（例えば阻害する）である、少なくとも一つ、好ましくは一つより多くのアミノ糖代謝経路の不活性化または欠失、および（２）グルコサミン−６−燐酸生産が増大する、少なくとも一つの、好ましくは一つより多くのアミノ糖代謝経路の増幅である。
本発明のある実施態様では、微生物がグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を合成する能力の増大を、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｍＳ）の発現の増幅（例えば過剰発現）、および／またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉではｎａｇＢ遺伝子であり、その生成物がグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼであるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ遺伝子の発現の増幅で達成することができる。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼはグルコサミン−６−燐酸が脱アミノ化されてフルクトース−６−燐酸およびアンモニウムを形成する正反応を触媒する。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼはまた、フルクトース−６−燐酸およびアンモニウムがグルコサミン−６−燐酸を形成する逆反応を触媒する。シンターゼ反応ではフルクトース−６−燐酸およびグルタミンがグルコサミン−６−燐酸およびグルタミン酸を生成するので、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆反応はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼの作用とは異なっている。グルタミンの適切な細胞内供給がグルコサミン−６−燐酸シンターゼ反応に重要である。グルコサミン−６−燐酸の合成経路および分解経路を調べると、潜在的に無駄なサイクルの存在が明らかとなり、それによりフルクトース−６−燐酸およびグルコサミン−６−燐酸の連続的な相互変換がグルタミンの無駄な枯渇を引き起こしている。従って、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆作用の使用は、デアミナーゼがアミノ酸（グルタミン）よりもアンモニウムをアミノ供与体として使用するため、グルコサミン−６−燐酸シンターゼより有利である。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼは、グルコサミン−６−燐酸のフルクトース−６−燐酸およびアンモニウムへの分解を利用する速度論的平衡で逆反応を触媒する。従って、本発明の他の実施態様にある様に、逆反応の活性が増加し正反応の活性が減少した、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの変異誘発形態、または過剰発現グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼが、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産に使用される。本発明の他の実施態様は、Ｖｍａｘが増加し、比活性が増加し、安定性が増加し、基質であるフルクトース−６−燐酸およびアンモニウムに対する親和性が増加し、グルコサミン−６−燐酸による生成物阻害が減少したグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼを有する微生物を提供することである。この様に改良されたグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼを天然から単離してもよく、または遺伝子修飾もしくはタンパク質工学の任意の適切な方法で生産してもよい。例えば、コンピューターベースタンパク質操作工学をこの目的に使用することができる。例えばその全体が本明細書で参照され援用されるＭａｕｌｉｋら、１９９７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．を参照。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの発現の増幅を、例えばｎａｇＢ遺伝子をコードする組み替え核酸分子を導入することにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで達成することができる。宿主株中でのグルコサミン−６−燐酸シンターゼがグルコサミン−６−燐酸の合成を触媒することができるので、不活性化ｇｌｍＳ遺伝子を有する変異Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの発現の増幅を分析しなければならない。この生物中のグルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性の除去は必要ないが、それも本発明の実施態様の一つである。
本明細書に記載した他の酵素および他のタンパク質の例では、修飾したグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼは例えば変異（すなわち、遺伝子修飾）グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ遺伝子であり、遺伝子修飾の任意の適切な方法で製造することができる。例えば、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする組み替え核酸分子を、エラープローンＰＣＲによりヌクレオチドを挿入、欠失および／または置換する任意の方法で修飾することができる。この方法では、遺伝子が増幅に用いたＤＮＡポリメラーゼによる高頻度の誤取り込み誤差を生じる条件下で増幅される。その結果、ＰＣＲ生成物に高頻度の変異を生じる。得られたグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ遺伝子変異体は、変異体遺伝子を、非変異組み替えグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ核酸分子を有する微生物と比較して、試験微生物にグルコサミン生産増加を与える能力について試験することによりスクリーニングされ得る。従って、変異体またはホモロググルコサミン−６−燐酸デアミナーゼタンパク質をコードする核酸配列を有する、遺伝子修飾された組み替え核酸分子で形質転換された微生物を提供することが本発明の実施態様の一つである。この様なグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼタンパク質を、本明細書ではグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼホモログと言われ得る（以下に詳細に記載される）。
細胞中のグルコサミン−６−燐酸シンターゼまたはグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼのレベルが、解糖からグルコサミン−６−燐酸合成への炭素の流れの逆流を制御するので、本発明のある態様では、ｇｌｍＳまたはｎａｇＢのいずれかの過剰発現はグルコサミン−６−燐酸の細胞間蓄積、最終的にはグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産に重要である。
Ｎ−アセチルグルコサミンの生産では、グルコサミン−６−燐酸をＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に変換し、それを次に脱燐酸化および／または培養ブロス中へ分泌しなければならない。本発明のある実施態様では、微生物がＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンを合成する能力の増大はグルコース−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現の増幅で行われ、一例を挙げれば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中ではその遺伝子はＧＮＡ１遺伝子であり、その生成物はグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼである。本発明の他の実施態様では、微生物がＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンを合成する能力の増大は、Ｎ−アセチルグルコース−６−燐酸デアセチラーゼ遺伝子の増幅で達成され、その遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中ではｎａｇＡ遺伝子であり、その生成物はＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼである。デアセチラーゼは正反応におけるＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸のグルコサミン−６−燐酸への変換を触媒する。このデアセチラーゼはまた、逆反応を触媒して、グルコサミン−６−燐酸からＮ−アセチルグルコサミンへと変換する。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸のグルコサミン−６−燐酸への脱アセチル化に好都合な動力学的平衡で可逆反応を触媒する。従って、本発明の他の実施態様として、逆反応の活性が増加し正反応の活性が減少したＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの変異誘発形態はグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産に用いられる。
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）は生成物であるグルコサミン−６−燐酸に強く阻害されるので、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＧＮＡ１）および／またはＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ遺伝子（ｎａｇＡ）の発現増幅は、グルコサミン−６−燐酸の細胞内レベルを減少させ得、ＧｌｍＳ酵素の生成物阻害を減少させ得、従ってグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を増加し得る。
本発明の他の実施態様では、微生物がグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンを合成する能力を増大することは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉではｇｌｍＭ遺伝子であり、その生成物がホスホグルコサミンムターゼであるホスホグルコサミンムターゼ遺伝子の発現の増幅で達成される。ホスホグルコサミンムターゼはグルコサミン−６−燐酸のグルコサミン−１−燐酸への転換を触媒する。グルコサミン−６−燐酸シンテターゼ（ＧｌｍＳ）は生成物であるグルコサミン−６−燐酸で強く阻害されるので、ホスホグルコサミンムターゼ遺伝子の発現増幅によりグルコサミン−６−燐酸の細胞内レベルが減少し得、ＧｌｍＳ酵素の生成物阻害が減少し得、従ってグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を増加させ得る。
本発明の他の実施態様では、微生物によるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン合成能の増大は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉではｇｌｍＵ遺伝子であり、その生成物がグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼである二機能性グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ遺伝子の発現の増幅で達成される。本発明にはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の発現の増幅または活性の増加も含まれる。二機能性酵素は（グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼとして）グルコサミン−１−燐酸のＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸への変換を触媒し、（Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼとして）生成物をさらにＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンへ変換する。従って、本発明の他の実施態様としては、アセチルトランスフェラーゼ作用の活性が増加し、ウリジルトランスフェラーゼ作用の活性が減少したグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの変異誘発形態が、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産に用いられる。グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが一連の生化学反応によりグルコサミン−６−燐酸が高分子に取り込まれるアミノ糖代謝経路内で機能するので、ｇｌｍＵ遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの増殖に必須の遺伝子である。アセチルトランスフェラーゼ作用の活性が増加し、ウリジルトランスフェラーゼ作用の活性が減少したＧｌｍＵ酵素の変異誘発形態を、グルコサミン由来の高分子を合成して細胞増殖を支える様に、野生型ｇｌｍＵ遺伝子を有する宿主株中で使用する必要がある。
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン合成は、図３に概観する様にグルコース代謝の多くの異なった経路と密接に関連している。グルコースが細胞に取り込まれ、同時にグルコース−６−Ｐに変換される。グルコースは図に示される経路を含む多くの経路で代謝される。グルコサミン合成経路では、グルコース−６−Ｐがフルクトース−６−Ｐに異性化され、次いでＧｌｍＳが媒介してフルクトース−６−Ｐがグルコサミン−６−Ｐに変換される。最後に、グルコサミン−６−Ｐが脱燐酸化され、分泌される。グルコース−６−Ｐの主要な競合別ルートは、ホスホフルクトキナーゼにより解糖に入ることである。グルコース−６−燐酸の別な重要なルートはグルコノラクトン−６−燐酸への酸化である（ペントース燐酸経路へ入る）。さらに、グルコース−６−燐酸がグルコース−１−燐酸に変換され得、その後グリコーゲンが生成し細胞に蓄えられる。以下に詳細に述べる様に、他の競合経路を調節してグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を最大にすることも、本発明の範囲内である。
細菌細胞は貯蔵炭素保存の主な形としてグリコーゲンを蓄積する。グリコーゲン合成には３種の酵素が関係する：ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（グルコース−１−燐酸アデニルトランスフェラーゼとしても知られる）、グリコーゲンシンターゼ、および分枝酵素。これらの酵素はそれぞれ、グルコース−１−燐酸から単糖供与体（ＡＤＰ−グルコース）の合成、これらの単糖ユニットの重合によるグルコース（１，４）ポリマーの形成、およびこのポリマーの再配列による鎖内に（１−６）分枝の形成を触媒する。ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼはグリコーゲン合成の中枢酵素であり、アロステリックエフェクターにより強く調節される。例えば、３−ホスホグリセレートが酵素活性を刺激し、オルト燐酸はその活性を阻害する。これらのエフェクターはグリコーゲン合成の制御においてインビボで重要な役割を果たし得る。増殖条件によっては、細胞内のグリコーゲンの量はその乾燥重量の１０〜６０％を占める。一般に、炭素およびエネルギーの供給が豊富で、窒素が制限栄養素である条件下でグリコーゲンが蓄積する。増殖培地中で燐酸が欠乏するとまた、細胞内のグリコーゲン量がより高くなる。細菌におけるＡＤＰ−グルコースの唯一の機能は、グリコーゲン合成の前駆体として作用することである。グリコーゲン合成が妨害されたＥ．ｃｏｌｉ変異体では、細胞の増殖は、悪影響を受けない。グリコーゲン合成の妨害により、グルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生産により多くの炭素源が利用できる様になる。
グルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミンの生産を最大にするため、ホスホグルコイソメラーゼ（ｐｇｉ遺伝子でコードされる）を操作することができる。ｐｇｉ遺伝子の過剰発現により、グルコサミン−６−Ｐ合成の直接の基質であるフルクトース−６−Ｐへのグルコース−６−Ｐの変換を増加することができる。
グルコースは細胞増殖およびグルコサミン合成を支えるために必要である。ホスホフルクトキナーゼ（ＰｆｋＡおよびＰｆｋＢ、前者が主なイソ酵素）はフルクトース−６−Ｐからフルクトース−１，６−二燐酸への変換を触媒する。その反応はグルコサミン−６−Ｐ合成と競合して作動する。炭素フラックスの制御では、ＰｆｋＡおよび／またはＰｆｋＢの発現を調節してより多くのグルコース−６−Ｐをグルコサミン経路へ向かわせることが望ましい。グルコサミン合成を最大にするためには、グルコースの供給を制限すべきであるが、過剰のグルコースは通常酢酸が合成される結果となる。酢酸の蓄積は細胞増殖を阻害し、全般的な細胞の代謝を低下する信号となるので、避けるべきである。炭素の供給を管理する一つのアプローチは、グルコサミン合成への炭素フラックスと細胞増殖および酢酸生成への炭素フラックスの結合を断つことである。これは、ｐｆｋＡ遺伝子を欠失させ、増殖のために細胞にフルクトースを供給することで達成され得る。ｐｆｋＡノックアウト変異体では、フルクトース−６−燐酸の解糖へのフラックスが大きく制限される。従って、実質的に全てのグルコースがグルコサミン合成に使用され得、一方、細胞増殖およびエネルギー生産はフルクトースを供給して行われ、これは細胞内に輸送され、燐酸化されてフルクトース−１−燐酸になる。後者はさらに燐酸化されてフルクトース−１，６−二燐酸になる。
文献には燐酸化アミノ糖がペントース燐酸経路を阻害したことが示唆されている。実際、Ｎ−アセチルグルコサミン生産により細胞増殖が阻害されたが、グルコネートおよびリボースというこの経路の中間体を供給すると阻害がなくなり得る。グルコネートおよびペントース化合物の補充がＮ−アセチルグルコサミンの生産を増加することも見出された。アミノ糖による阻害を克服するため、グルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ遺伝子でコードされる）等のペントース燐酸経路の酵素を過剰発現することもできる。
グルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン合成はアミノ供与体であるグルタミンを消費する。グルタミン合成にはｇｌｎＡ遺伝子でコードされるグルタミンシンターゼが関与する。ｇｌｎＡ遺伝子の過剰発現により、グルタミンプールが増加し得、従ってグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミンが増加し得る。
従って、本発明による好ましい改変のいくつかを一般的に説明してきたが、ある実施態様では、微生物は微生物中でグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加させる少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾により、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ酵素活性の増加；微生物によるグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現：グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少；および／またはグルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加から選ばれる結果が提供されることが好ましい。ある実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１個の組み替え核酸分子で形質転換される。この様な核酸分子には、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性を増加する、または任意の上記結果をもたらす、少なくとも一つの遺伝子修飾を有するグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列が含まれ得る。グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの機能および代表的な配列は、上記に記載されている。
他の実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンターゼの活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。グルコサミン−６−燐酸シンターゼの活性を増加するためのその遺伝子修飾は、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの酵素活性の増加；グルコサミン−６−燐酸シンターゼの過剰発現；グルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害の減少；およびその基質に対するグルコサミン−６−燐酸シンターゼの親和性の増加；から選ばれる結果をもたらすことが好ましい。ある態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする核酸配列を含む少なくとも１個の組み替え核酸分子で形質転換される。この様な核酸分子には、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの酵素活性を増加するか、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害を減少するか、または上記結果の任意の一つをもたらす、少なくとも一つの遺伝子修飾を有する、グルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする核酸配列が含まれ得る。グルコサミン−６−燐酸シンターゼの機能とそれぞれの配列は、上記に記載されている。
他の実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンターゼの活性を減少する遺伝子修飾を有する。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの活性を減少する遺伝子修飾は、微生物中でグルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化である。
また別な実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を増加するための遺伝子修飾は、微生物によるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの過剰発現、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ酵素活性の増加、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆反応の増加により増加した（より多くの）グルコサミン−６−燐酸の形成、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの正反応の減少により減少した（より少ない）フルクトース−６−燐酸の形成、フルクトース−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの親和性の増加、グルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの親和瀬の減少、およびグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼのグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少から選ばれる結果をもたらすことが好ましい。ある態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも１個の組み替え核酸分子で形質転換される。この様な核酸分子には、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの酵素活性を増加する、または上記結果の任意の一つをもたらす、少なくとも一つの遺伝子修飾を有するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする核酸配列が含まれ得る。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの機能および代表的な配列は、上記に記載されている。
別の実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する遺伝子修飾は微生物中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化である。
また別な実施態様では、微生物はグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも１つの遺伝子修飾を有する。好ましくは、その遺伝子修飾はグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ酵素活性の減少；グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の微生物による過剰発現；グルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの親和性の減少；および／またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少から選ばれた結果を提供する。ある態様では、微生物はグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列を含む、少なくとも１個の組換え核酸分子で形質転換される。この様な核酸分子は、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの酵素活性を増加する、または任意の上記結果をもたらす少なくとも１つの遺伝子修飾を有するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含み得る。グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの機能と代表的な配列は、上記に記載されている。
他の実施態様では、遺伝子修飾された微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を含む。好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ活性を増加する遺伝子修飾は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ活性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの過剰発現；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの逆反応の増加によるＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸の生成；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの正反応の減少されて、またはより好ましくは消失されてグルコサミン−６−燐酸の生成から選ばれた結果をもたらす。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼをコードする核酸配列を有する、少なくとも１個の組換え核酸分子で微生物が形質転換される。この様な核酸分子には、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの酵素活性を増加する、または任意の上記結果をもたらす、少なくとも一つの遺伝子修飾を有するＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼをコードする核酸配列が含まれ得る。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの機能と代表的な配列は上記に記載されている。
他の実施態様では、遺伝子修飾された微生物はホスフォグルコサミンムターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。好ましくは、ホスフォグルコサミンムターゼ活性を増加する遺伝子修飾は、ホスフォグルコサミンムターゼ活性の増加；ホスフォグルコサミンムターゼの過剰発現；ホスフォグルコサミンムターゼ活性の増加によるグルコサミン−１−燐酸の生成；および／またはホスフォグルコサミンムターゼ活性の減少、または好ましくは消失によるグルコサミン−６−燐酸の生成から選ばれる結果をもたらす。ある態様では、微生物はホスフォグルコサミンムターゼをコードする核酸配列を有する、少なくとも１個の組換え核酸分子で形質転換される。この様な核酸分子にはホスフォグルコサミンムターゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有するホスフォグルコサミンムターゼをコードする、または上記結果をもたらす核酸配列が含まれ得る。ホスフォグルコサミンムターゼの機能と代表的な配列は上記に記載されている。
本明細書中に記載した任意の実施態様で、遺伝子修飾された微生物は、ホスフォグルコイソメラーゼ活性を微生物内で増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を有し得る。好ましくは、ホスフォグルコイソメラーゼを増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を有し得る遺伝子修飾された微生物はホスフォグルコイソメラーゼ活性の増加；ホスフォグルコイソメラーゼの過剰発現；基質に対するホスフォグルコイソメラーゼの親和性の増加から選ばれた結果をもたらす。ある実施態様では、微生物はホスフォグルコイソメラーゼをコードする核酸配列を有する組換え核酸分子の少なくとも１個で形質転換される。この様な核酸分子は、ホスフォグルコイソメラーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有するホスフォグルコイソメラーゼをコードする、または任意の上記結果をもたらす核酸配列を含み得る。ホスフォグルコイソメラーゼの機能と代表的な配列は上記に記載されている。
本明細書に記載された任意の実施態様で、遺伝子修飾された微生物はホスフォフルクトキナーゼ活性を減少する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を微生物中に有し得る。ある局面では、ホスフォフルクトキナーゼ活性を減少する遺伝子修飾は、微生物中でホスフォフルクトキナーゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失もしくは不活性化である。ホスフォフルクトキナーゼの機能と代表的な配列は、上記に記載されている。
本明細書に記載された任意の実施態様で、遺伝子修飾された微生物はグルタミンシンテターゼ活性を増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を微生物中に有し得る。好ましくは、グルタミンシンテターゼを増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を有し得る遺伝子修飾された微生物はグルタミンシンテターゼ活性の増加；グルタミンシンテターゼの過剰発現；基質に対するグルタミンシンテターゼの親和性の増加から選ばれた結果をもたらす。ある実施態様では、グルタミンシンテターゼをコードする核酸配列を有する少なくとも１個の組換え核酸分子で微生物が形質転換される。この様な核酸分子には、グルタミンシンテターゼの酵素活性を増加する、または上記の任意の結果をもたらす、少なくとも一つの遺伝子修飾を有するグルタミンシンテターゼをコードする核酸配列が含まれ得る。グルタミンシンテターゼの機能と代表的な配列は上記に記載されている。
本明細書に記載の任意の実施態様では、遺伝子修飾した微生物は、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ活性を微生物中で増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を有し得る。好ましくは、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼを増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を有し得る遺伝子修飾した微生物はグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ活性の増加、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの過剰発現、基質に対するグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの親和性の増加から選ばれた結果をもたらすことが好ましい。ある態様では、微生物はグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を有する、少なくとも１個の組換え核酸分子で形質転換される。この様な核酸分子には、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有するグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼをコードする、または任意の上記結果をもたらす核酸配列が含まれ得る。グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの機能と代表的な配列は上記に記載されている。
本明細書に記載の任意の実施態様では、遺伝子修飾した微生物は、グリコーゲン合成に関与する一つ以上の酵素の活性を減少する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を微生物中に有し得る。この様な酵素にはＡＤＰグルコースピロホスフォリラーゼ、グリコーゲン合成および分枝酵素を有するグリコーゲン合成が含まれるがそれに限定されない。ある局面では、グリコーゲン合成に関与する酵素の活性を減少する遺伝子修飾は、微生物中でグリコーゲン合成に関与する酵素をコードする、１個以上の内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化である。
本明細書に記載の任意の実施態様において、遺伝子修飾された微生物はホスファターゼ活性を増加する少なくとも一つのさらなる遺伝子修飾を有し得る。本明細書に記載された、遺伝子修飾された微生物の最初の細胞内生成物はグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉを含む多くの微生物で、アンモニウムの適切な細胞内への供給が、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの反応に重要である。グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸は、代表的に細胞外へ輸送する前にグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンに脱燐酸化される。それにも拘わらず、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸の脱燐酸化のための適当なホスファターゼ活性を有する様に遺伝子修飾された微生物を提供することが本発明のなお他の実施態様である。この様なホスファターゼには例えばアルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ホスフォ糖ホスファターゼおよびホスフォアミノ糖ホスファターゼが含まれ得るが、それに限定されない。好ましい実施態様では、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉはホスファターゼ活性（すなわちホスファターゼ作用）のレベルが増大（すなわち、増加）している。
上記の任意の一つの実施態様で、微生物はＮ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター（ＩＩＮａｇ）、グルコサミンシンターゼ、ホスフォグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ、マンノーストランスポーター（ＥＩＩＭ／ＩＩＩｍａｎ）、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコーストランスポーター（ＩＩＧｌｃ）、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼおよび／またはホスファターゼでなる群から選択される酵素の活性を増加または減少する、少なくとも一つのさらなる遺伝子修飾を有し得る。Ｅ．ｃｏｌｉ中の遺伝子はＮａｇＡ、ｎａｇＢ、ｎａｇＣ、ｎａｇＤ、ｎａｇＥ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭ、ｇｌｍＵ、ｍａｎＸＹＺ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｐｔｓＧ、ＧＮＡＩまたはホスファターゼ遺伝子にそれぞれ対応する。
上記に定義した様々な遺伝子修飾を組み合わせて、一つ以上の修飾を有する所望の微生物を形成し、微生物によるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を増大することができる。例えば、ある実施態様では、微生物は以下の遺伝子修飾を有する：（１）グルコサミン燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾；および（２）グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する遺伝子修飾。より好ましい実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する遺伝子修飾も有する。
他の実施態様では、微生物は以下の遺伝子修飾を有する：（１）グルコサミン燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾；および（２）グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を増加する遺伝子修飾。より好ましい実施態様では、微生物はまた、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾も有する。
他の実施態様では、微生物は以下の遺伝子修飾を有する：（１）グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を増加する遺伝子修飾；および（２）グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾、および好ましくはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性を減少する遺伝子修飾。より好ましい実施態様では、微生物はまた、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾も有する。
他の実施態様では、微生物は以下の遺伝子修飾を有する：（１）グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する遺伝子修飾；および（２）グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾、および好ましくはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加し、そして／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性を減少する遺伝子修飾。より好ましい実施態様では、微生物はまた、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する遺伝子修飾も有する。
他の実施態様では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾した微生物は、内因性グルコース−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ（例えば酵母は内因性グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼを有する）および、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。より好ましい実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する遺伝子修飾を有し得る。
他の実施態様では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾した微生物は、転写制御配列と結合して作動するグルコサミン−６−燐酸シンターゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ、ホスフォグルコサミンムターゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸分子で形質転換される。組換え核酸分子は、酵素作用に影響する遺伝子修飾を有することができる。組換え核酸分子の発現により、グルタミン−６−燐酸シンターゼ、グルタミン−６−燐酸デアミナーゼ、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ、ホスフォグルコサミンムターゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの微生物による発現および／または生物活性が、組換え核酸分子がない場合の発現レベルまたはタンパク質の生物活性と比較して増加する。好ましい実施態様では、組換え核酸分子が微生物のゲノムに組み込まれる。さらなる実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン特異的酵素ＩＩＮａｇ、ホスフォグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、ＰＥＰ、グルコースＰＴＳ、ＥＩＩＭの酵素ＩＩＧｌｃ、ＰＥＰ、マンノースＰＴＳのＰＩＩＩＭａｎ、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ、および／またはホスファターゼの群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも一つのさらなる遺伝子修飾を有する。遺伝子修飾は、ホスファターゼの作用が増加することが好ましいホスファターゼの場合を除いて、タンパク質の作用を増加または減少する。別な好ましい実施態様では、微生物はＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼおよびＮ−アセチルグルコサミン特異的酵素ＩＩＮａｇをコードする遺伝子が修飾され、その遺伝子修飾はタンパク質の作用を減少または増加する。ある実施態様では、遺伝子修飾は遺伝子の少なくとも一部の欠失である。
他の実施態様では、本発明の遺伝子修飾された微生物は転写制御配列と作動可能に連結して作動するグルコサミン−６−燐酸シンターゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ、ホスフォグルコサミンムターゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸分子；およびＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン特異的酵素ＩＩＮａｇ，ホスフォグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ、ＰＥＰ：グルコースＰＴＳおよび／またはＥＩＩＭの酵素ＩＩＧｌｃ，および／またはＰＥＰ：マンノースＰＴＳのＩＩＩＭａｎの群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子中の少なくとも一つの遺伝子修飾的修飾を有する。遺伝子修飾により、タンパク質の作用が増加または減少し、組換え核酸分子の発現が、微生物による酵素の発現を増加する。他の実施態様では、微生物はホスファターゼ遺伝子中に少なくとも一つの遺伝子修飾を有し、そのためにこの様な遺伝子でコードされたホスファターゼの作用が増加する。好ましい実施態様では、組換え核酸分子が微生物のゲノム中に組み込まれる。
本明細書に記載の変異の種々の他の組み合わせが本発明に含まれ、その多くが実施例の項に記載される。
さらに、本発明に開示されたプロセスおよび材料を当業者が使用し得そして／または変更し得、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ポリグルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびそれらの誘導体等の他のアミノ糖を製造することができる。
上記の様に、本発明の醗酵法でグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンをかなりの高い収率で製造するためには、微生物を遺伝子修飾してグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を増大する。本明細書で用いられるように、遺伝子修飾された微生物は、その正常な形（すなわち野生型または天然起原）から修飾された（すなわち変異または変化した）ゲノムを有する。ある態様では、この様な生物は目的のタンパク質をコードする遺伝子を内在的に含有し発現することが可能で、遺伝子修飾は遺伝子の遺伝子修飾であり得、それにより、修飾は遺伝子の発現および／または活性にある影響（例えば、増加、減少、欠失）を及ぼす。他の態様では、この様な生物は目的のタンパク質を内在的に含有し発現することが可能で、遺伝子修飾は少なくとも１個の外来核酸配列（例えば組換え核酸分子）の導入であり得、外来核酸配列は目的のタンパク質および／またはタンパク質の活性またはそのタンパク質をコードする遺伝子の活性に影響するタンパク質をコードする。微生物に導入される外来核酸分子は野生型タンパク質をコードすることが可能であるか、または野生型タンパク質または正常なタンパク質と比較してコードされたタンパク質の発現および／または活性に影響する、一つ以上の修飾を受けることができる。また別な態様では、その生物が目的のタンパク質をコードする遺伝子を必ずしも内在的に（自然に）含有する必要はなく、遺伝子修飾されて目的のタンパク質の生物活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個の組換え核酸分子を誘導する。再び、組換え核酸分子は野生型タンパク質をコードすることができるか、または組換え核酸配列を修飾して、野生型タンパク質と比較してコードされたタンパク質の発現および／または活性に影響することができる。他の実施態様では、様々な発現制御配列（例えばプロモーター）を微生物に導入して、微生物中で内在性遺伝子を発現させることができる。これらの態様のそれぞれに関連する様々な実施態様を、以下により詳細に議論する。
本明細書で使用されるように、遺伝子修飾された微生物には、バクテリア、原生生物、微細藻類、菌類その他の微生物を含む任意の遺伝子修飾された微生物が含まれ得る。この様な遺伝子修飾された微生物は、所定の結果（例えば酵素の発現および／または活性が増加、減少その他の修飾、および／または修飾によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン生産の修飾）が得られる様に、その正常な形（すなわち野生型または天然起原）が修飾された（すなわち変異または変化した）、および／または染色体外遺伝物質（例えば組換え核酸分子）を発現するように修飾されたゲノムを有する。より具体的には、微生物に対する修飾は、微生物のゲノム（例えば内在性ゲノム）の修飾で行われ得るか、および／または遺伝物質（例えば組換え核酸分子）を微生物中に導入して行われ、その遺伝子は染色体外に存在するか、または宿主微生物遺伝子中に組み込まれ得る。この結果、遺伝子修飾には微生物中の内在性核酸配列、または組換えで導入された核酸配列の発現を調節する調節配列の導入または修飾、野生型または修飾された組換え核酸分子（例えば野生型または修飾タンパク質をコードする）の導入、微生物中の内在性遺伝子の修飾、または酵素の発現および／または生物活性に関して特定の特徴を有する微生物が得られる任意の他の修飾が含まれ得る。微生物の遺伝子修飾は古典的な株の開発、および／または分子遺伝子技術を用いて行われ得る。この様な技術は公知であり、微生物でも一般的に開示されている（例えばＳａｍｂｒｏｏｏｋら、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｂｓ Ｐｒｅｓｓ）。Ｓａｍｂｒｏｏｋらの参考文献はその全体が参考として本明細書に援用される。遺伝子修飾された微生物には、核酸分子が挿入、欠失および／または修飾された（すなわち、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、置換および／または反転により変異された）微生物が含まれ、この様な修飾により微生物内に所望の効果を生じる。本発明によれば、遺伝子修飾された微生物には、組換え技術を用いて修飾された微生物が含まれる。
本発明のある実施態様では、微生物の遺伝子修飾により本発明によるアミノ糖代謝経路に含まれるタンパク質の活性が増加または減少する。この様な遺伝子修飾には任意の型の修飾が含まれ、特に組換え技術および／または古典的突然変異誘発で行われた修飾が含まれる。本発明で使用されるように、遺伝子発現、遺伝子の機能または遺伝子生成物（すなわち遺伝子でコードされるタンパク質）の機能の減少をもたらす遺伝子修飾とは、遺伝子の不活性化（完全または部分的）、欠失、妨害、遮断、抑制または下方調節を言い得る。例えば、この様な遺伝子でコードされるタンパク質の機能が減少する結果となる遺伝子の遺伝子修飾により、遺伝子の完全な欠失（すなわち遺伝子が存在せず、従ってタンパク質も存在しない）、タンパク質が不完全に翻訳または翻訳されない遺伝子の変異（例えばタンパク質が発現しない）、またはタンパク質の本来の機能が減少または失われた遺伝子の変異（例えば酵素活性または作用が減少または失われたタンパク質が発現する）がもたらされる。具体的には、本明細書で議論される酵素の作用または活性の減少とは、一般的に問題とする微生物の任意の遺伝子修飾のことであり、酵素の発現および／または機能（生物活性）が減少する結果となり、それには酵素活性（例えば比活性）の減少、酵素の阻害または分解の増加ならびに、酵素の発現の減少または喪失が含まれる。例えば、本発明の酵素の作用または活性が、酵素の生産を妨害または減少、酵素活性の減少、または酵素活性の阻害により減少し得る。この様な修飾のいくつかの組み合わせもまた可能である。酵素生産の妨害または減少には、生育培地中に誘導化合物の存在が必要であるプロモーターの制御下にある酵素をコードする遺伝子を導入することが含まれる。培地に誘導因子が欠乏する様な条件を与えることにより、その酵素をコードする遺伝子の発現（従って酵素合成）を切り離すことができる。酵素活性の妨害または減少には、本明細書に参考として組み込まれる米国特許第４、７４３、５４６号に記載の技術と類似の切除技術アプローチの使用も含まれる。このアプローチを使用するためには、目的の酵素をコードする遺伝子が、ゲノムから遺伝子の特異的かつ制御された切除が可能である特定の遺伝子配列間にクローニングされる。例えば米国特許第４、７４３、５４６号に記される様に培養における培養温度の変更を、または他の物理的または栄養信号を変えることにより、切除が促され得る。
遺伝子の発現または機能を増加させる遺伝子修飾とは、遺伝子の増幅、過剰生産、過剰発現、活性化、増大、付加または上方制御のことであり得る。具体的には、本明細書で議論する酵素または他のタンパク質の作用（または活性）の増加とは、一般的に問題とする微生物で酵素またはタンパク質の発現および／または機能（生物活性）の増加をもたらす任意の遺伝子修飾のことであり、酵素活性（例えば比活性またはインビボでの酵素活性）の増加、酵素阻害または分解の減少、および酵素の過剰発現を含む。例えば、遺伝子コピー数が増加するか、天然型プロモーターの発現レベルより高い発現レベルを与えるプロモーターの使用により発現レベルが増加され得、または遺伝子工学もしくは古典的突然変異誘発により遺伝子を変化させ、酵素の生物活性を増加することができる。この様な修飾のいくつかの組み合わせも可能である。
一般に、本発明によれば、変異体または修飾酵素のある特性（例えば酵素活性）の増加または減少は、同じまたは同等の条件で測定または確立された、同じ生物由来（同じ起原または親配列）の野生型（すなわち正常で修飾されていない）酵素の同じ特性を参照して行われる。同様に、遺伝子修飾された微生物の特性（例えばタンパク質の発現および／もしくは生物活性、または生成物の生産）の増加または減少は、同じ種の野生型微生物、好ましくは同じ株の同じ特性を同じまたは等価の条件で参照して行われる。この様な条件には、タンパク質の活性（例えば発現または生物活性）または微生物の他の特性が測定されるアッセイまたは培養条件（例えば培地成分、温度、ｐＨ等）と共に、使用したアッセイのタイプ、評価される宿主微生物等が含まれる。上記に議論した様に、等価な条件とは、類似しているが必ずしも同じ（例えば条件の保存性変化は許容され得る）でない条件（例えば培養条件）、および同じ条件で行われた対照と比較して微生物生育、酵素発現または生物活性に対する効果を実質的に変えない条件である。
好ましくは、あるタンパク質（例えば酵素）の活性を増加または減少する遺伝子修飾を有する遺伝子修飾された微生物は、タンパク質の活性（例えば発現、生産および／または生物活性）が、野生型微生物中の野生型タンパク質の活性と比較して好ましくは少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約５５％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、または任意の割合、すなわち５％〜１００％の間の任意の整数（たとえば６％、７％、８％等）の間でそれぞれ増加または減少している。単離された修飾核酸分子またはタンパク質を単離された野生型核酸分子またはタンパク質と直接比較する場合（例えばインビボと対照して比較をインビトロで行う場合）、同じ差であることが好ましい。
本発明の他の態様では、あるタンパク質（例えば酵素）の活性を増加または減少する遺伝子修飾を有する遺伝子修飾された微生物は、野生型微生物中の野生型タンパク質の活性と比較して、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約３０倍、より好ましくは少なくとも約４０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約７５倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１２５倍、より好ましくは少なくとも約１５０倍、または少なくとも約２倍から出発する任意の全整数倍増加（例えば３倍、４倍、５倍、６倍等）で、それぞれタンパク質の活性（例えば発現、生産および／または生物活性）が増加または減少している。
活性（発現、比活性、インビボ活性などを含む）を増加または減少する微生物の遺伝子修飾は、微生物中のグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生合成経路またはアミノ糖代謝経路の活性に影響することが好ましく、その経路は内在性で遺伝子修飾された経路、生物内に一つ以上の組換え核酸分子を導入した内在性の経路、または完全に組換え技術で作製された経路である。本発明によれば、「グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生合成経路の活性への影響」には、遺伝子修飾がない場合と比較して微生物により発現する、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生合成経路に任意の検出可能なまたは測定可能な変化または修飾を生じる任意の遺伝子修飾が含まれる。グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生合成経路中の任意の検出可能な変化または修飾には、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生合成経路中の少なくとも一つの生成物生産の検出可能な変化、または微生物による細胞内および／または細胞外グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン生産の検出可能な変化が含まれるが、それに限定されない。
本発明のある実施態様では、遺伝子修飾には本明細書に記載の特定の酵素または他のタンパク質をコードする核酸配列の修飾が含まれる。この様な修飾を内在性酵素またはタンパク質に行うことができ、その結果この様なタンパク質を自然に含む微生物が例えば古典的突然変異誘発、および遺伝子工学技術を含む選択技術および／または分子遺伝学技術により遺伝子修飾される。遺伝子工学技術には例えば、内在性遺伝子のある部分を欠失するため、または改良された酵素または他のタンパク質をコードする配列、または内在性酵素または他のタンパク質の発現を増加する種々のプロモーターをコードする配列のような相同配列で、内在性遺伝子の一部を交換するための標的組換えベクターの使用が含まれ得る。遺伝子工学技術にはまた、組換え技術を用いる遺伝子の過剰発現も含まれ得る。
例えば、非天然型プロモーターを、本明細書に記載されるアミノ糖代謝経路中の目的の酵素または他のタンパク質をコードする少なくとも１個の遺伝子の上流に導入できる。好ましくは、内在性遺伝子の５’側の上流配列が誘導プロモーターである構成プロモーター、または使用する生育条件下で最適発現されるプロモーターで置換される。この方法は、内在性遺伝子が使用する生育条件下で活性でない、または十分に活性でない場合にとくに有用である。
本発明の本実施態様の別のある態様では、遺伝子修飾には目的の酵素またはタンパク質をコードする組換え核酸分子を、宿主中へ導入することが含まれ得る。宿主には（１）特定の酵素またはタンパク質を発現しない宿主細胞、または（２）特定の酵素またはタンパク質を発現せず、導入された組換え核酸分子が微生物中の酵素または他のタンパク質の活性を変化または増大する宿主細胞が含まれ得る。本発明は任意の遺伝子修飾された微生物を包含するよう意図され、その微生物は本発明によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを生産するための醗酵プロセスに適した少なくとも一つの修飾を有する。
遺伝子修飾された微生物を、単離された核酸分子の微生物中への導入等により、組換え技術で修飾することができる。例えば、遺伝子修飾された微生物を、発現の増加が望まれるタンパク質等の目的のタンパク質をコードする組換え核酸分子に感染させることができる。感染した核酸分子は、染色体外に存在し得るか、またはこの様式で１個以上の部位が感染（すなわち組換え）宿主細胞の染色体内に組み込まれ得、発現される能力が維持される。好ましくは、本発明の宿主細胞が核酸分子に一度感染すると、核酸分子が宿主細胞ゲノム中に組み込まれる。組み込みの重要な利点は、核酸分子が細胞内に安定に維持されることである。好ましい実施態様では、組み込まれた核酸分子は、転写制御配列（下記）に作動可能に結合し、核酸分子の発現を制御する様に誘導され得る。
核酸分子を無秩序または標的組み込みによって宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。この様な組み込み法は当該分野で公知である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ４７００２はその上に複製のＣｏｌＥ１開始点を含むプラスミドの維持を不可能にする変異を含む。この様なプラスミドがこの株中に導入される場合、プラスミド上に含まれる遺伝子マーカーの選択により、プラスミドが染色体中へ組み込まれる。例えばこの株を目的の遺伝子と、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃＺ遺伝子の５’−末端および３’−末端で挟まれた選択可能なマーカーを含むプラスミドで形質転換することができる。ｌａｃＺ配列は導入されるＤＮＡを染色体に含まれるｌａｃＺ遺伝子に向かわせる。ｌａｃＺ座に組み込むことにより、酵素β−ガラクトシダーゼをコードする本来のｌａｃＺ遺伝子が、目的の遺伝子を間に挟む部分ｌａｃＺ遺伝子で置換される。成功した組み込み体を、β−ガラクトシダーゼが無いことで選択することができる。導入バクテリオファージ等を用いるような方法により、受容体細胞ゲノム中へ核酸配列を導入して、遺伝子修飾された微生物を作製することもできる。組換え技術および導入バクテリオファージ技術を使用して本発明のいくつかの種々の遺伝子修飾された微生物を作製することは公知であり、実施例の項に詳細に述べられる。
温度シフトによりＥ．ｃｏｌｉ染色体中に標的遺伝子を欠失させ、そして組み込むベクターおよび方法が、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７−４６２２）により記載された。その方法は異なったグルコサミン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株を開発するために採用された。遺伝子組み込みのプロトコールには以下の主な工程が含まれる。第一の工程では、標的部位の配列をクローニングし、内部欠失を作製し、そして／または欠失部位に組み込まれる外来遺伝子を挿入することでる。第二工程は、これらの配列を含むフラグメントを、温度感受性複製開始点および抗生物質選択マーカーを含む温度感受性組み込みベクター中へサブクローニングすることである。第三工程は、組み込みベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、染色体中に組み込まれた全プラスミドを有するクローンを、非許容温度（４２℃）で単一交差組換え法により選択することである。第四工程は、選択したクローンの細胞を液体培養物中で許容温度（３０℃）で培養することである。組み込みプラスミドを有する細胞は、プラスミドを失い易い。複製開始点および抗生物質耐性遺伝子の部分または全プラスミドを喪失した細胞は、培養物中で発芽後成長する。具体的には、この工程は５０ｍｌＬＢ培地に１０個の内の２個のクローンのプールからの細胞を接種し、培養細胞を２４時間生育させて行われた。培養細胞を１０００倍希釈の新鮮な培地に移し、さらに２４時間生育した。第五工程では、細胞をプレートに接種し、抗生物質耐性を失ったクローンを選択した。組み込み遺伝子または欠失遺伝子の性質に応じて、特定の遺伝子選択法を用いることができる。クローン選択の具体的方法では、染色体内に意図された変化を有するクローンを、その本来の形からＰＣＲ生成物の大きさで区別できるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。クローンを組み込まれた、または欠失したＤＮＡ配列に特異的なプローブを用いるサザンブロット分析を用いて確認した。
本発明は醗酵プロセスで商業的に有用な量のグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産する能力（すなわち、好ましくは同じ条件で培養された野生型微生物と比較して、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産能が増大した）のある、微生物の使用を含む方法を開示することを理解される。本明細書中で用いるように、醗酵プロセスとは、微生物等の細胞を、容器、バイオリアクター、培養器またはその他の適当な培養チャンバー中で、生成物を細胞から生産するために培養する（すなわち、培養プロセスの間に細胞が生成物を生産する）プロセスである。生成物は代表的には、実験または商業目的で有用な生成物である。本発明の醗酵法は、アミノ糖代謝経路に含まれるタンパク質をコードし、対応する野生型タンパク質と比較して異なった機能（例えば増加または減少）を有するタンパク質の生産（発現）をもたらす一つ以上の遺伝子の遺伝子修飾で行われる。この様な異なった機能により、遺伝子修飾された微生物がグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産する能力が増大する。実施例に記載される特異的選択技術等、本明細書の何れかに記載された様な、特定の異なった機能（例えばグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を生産する増大された能力）を有する遺伝子修飾された微生物の生産により、与えられた機能的必要性に合致する多くの生物を作製し得ることは、様々な異なった遺伝子修飾によっても当業者が理解する。例えば、ある核酸配列中の異なった無秩序ヌクレオチド欠失および／または置換は、同じ遺伝子型の結果を生じ得る（例えばその配列でコードされるタンパク質の作用の減少）。本発明は、本明細書に示す特性を有する微生物の作製をもたらす、この様な多くの遺伝子修飾を企図する。
本発明のある実施態様によれば、遺伝子修飾された微生物にはグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸の合成能が増大した微生物が含まれる。本発明によれば、生成物の「合成能の増大」とは、同じ条件下で培養された野生型微生物と比較して、微生物がより多くの生成物を生産する様な、生成物の合成に関係するアミノ糖代謝経路における任意の増大または上方制御のことである。
本発明のある態様では、醗酵法で有用な遺伝子修飾された微生物は、任意の適当な培養条件、特に本明細書に記載の任意の培養条件で、少なくとも約１ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも約５ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも約１０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約２０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約４０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約５０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約６０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約７０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約８０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約９０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約１００ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約１１０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約１２０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約１５０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約１８０ｇ／ｌ、またはさらに多い任意の量、または全整数で少なくとも約１ｇ／ｌ〜少なくとも約５００ｇ／ｌの範囲の任意の量（例えば２ｇ／ｌ、３ｇ／ｌ等）のグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を生産する。他の局面では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾された微生物は少なくとも約２倍以上のグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２５倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、さらに好ましくは少なくとも約１００倍、さらに好ましくは少なくとも約２００倍（全整数倍の、少なくとも約２倍〜少なくとも約２００倍の間の任意の倍数（すなわち少なくとも３倍、少なくとも４倍等）を含む）を生産し、遺伝子修飾された微生物と同じまたは等価の条件下で培養された同じ種（好ましくは同じ株）の野生型（すなわち、非修飾、天然起原）微生物より多くのグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を生産する。この様な特性を有する多くの微生物が実施例の項で同定されている。
他の態様では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾された微生物は、乾燥細胞重量で少なくとも約８ｇ／ｌの細胞濃度に、３７℃で約２４時間、１４Ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１６ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ３、２０ｇ／ｌのグルコース、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２、および１ｍＭのＩＰＴＧを含むｐＨ７．０の発酵培地中で培養した場合、少なくとも約１ｇ／ｌのグルコサミンを生産する。他の態様では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾された微生物は、乾燥細胞重量で少なくとも約８ｇ／ｌの細胞濃度に、約２８℃〜約３７℃で約１０から６０時間、１４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１６ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｇ／ｌのグルコース、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２、および約０．２ｍＭ〜約１ｍＭのＩＰＴＧを含むｐＨ７．０発酵培地中で培養した場合、少なくとも約１ｇ／ｌのグルコサミンを生産する。好ましい実施形態では、ＩＰＴＧの量は、約０．２ｍＭである。
本発明の醗酵法で使用される微生物（例えば宿主細胞または生産生物）は任意の微生物（例えばバクテリア、原生生物、藻類、菌類、または他の微生物）であり、最も好ましくはバクテリア、酵母または菌類である。適当なバクテリア属にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれるが、それに限定されない。適当なバクテリア種には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓが含まれるが、それに限定されない。酵母の適当な属にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｈａｆｆｉａが含まれるが、それに限定されない。酵母の適当な種にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓおよびＰｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａが含まれるが、それらに限定されない。適当な菌類属にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａが含まれるが、それに限定されない。適当な菌類の種にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｂｓｉｄａｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ、Ｎ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍｒｅｅｓｅｉが含まれるが、それに限定されない。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの特に有用な株はＫ−１２、ＢおよびＷ、最も好ましくはＫ−１２が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉが好ましいバクテリアの一つであり、本発明の様々な実施態様の例に使用されているが、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産し、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を増加を増大する様に遺伝子修飾し得る任意の微生物も本発明の方法で使用し得ることを理解する必要がある。本発明の醗酵法に使用される微生物はまた、生産生物と呼ばれ得る。
好ましい実施態様では、遺伝子修飾された微生物はバクテリアまたは酵母であり、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のバクテリアであり、さらに好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉである。遺伝子修飾されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉはｎａｇＡ、ｎａｇＢ、ｎａｇＣ、ｎａｇＤ、ｎａｇＥ、ｍａｎＸＹＺ、ｇｌｍＭ、ｐｆｋＢ、ｐｆｋＡ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＳ、ＧＮＡ１、ｐｔｓＧまたはホスファターゼ遺伝子を含むが、それに限定されない遺伝子が修飾されている。他の実施態様では、この様な遺伝子修飾されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉはｎａｇレギュロン遺伝子が欠失し、また別な実施態様ではｎａｇレギュロン遺伝子の欠失およびｍａｎＸＹＺ遺伝子の遺伝子修飾によりｍａｎＸＹＺ遺伝子でコードされるタンパク質の作用が減少した。
本発明によれば、本明細書の特定の酵素または他のタンパク質の対照とは、野生型参照タンパク質の少なくとも一つの生物活性を有する任意のタンパク質をいい、全長タンパク質、融合タンパク質、または天然起原のタンパク質の任意のホモログ（天然型対立遺伝子変異体、フラグメント、異なった生物由来の関連タンパク質、および合成または人工由来の変異体（ホモログ）を含む）である。対照タンパク質のホモログ（突然変異体、変異体、修飾型）には天然起原の対照タンパク質と少なくとも１個または数個−必ずしも１個または数個に限られない−のアミノ酸の欠失した（例えば、ペプチドまたはフラグメントのようなタンパク質の切断型）、挿入された、反転した、置換されたそして／または誘導体化された（例えばグリコシル化、燐酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加による）点で異なるタンパク質が含まれる。好ましいホモログの一つは天然起原のタンパク質の生物活性フラグメントである。本発明で有用な天然起原タンパク質の他の好ましいホモログが以下に詳細に記載される。従って、本発明の単離された核酸分子は、任意の特定のタンパク質のオープンリーディングフレーム、ドメイン、その生物活性フラグメント、または生物活性を有する天然起原タンパク質またはドメインの任意のホモログの翻訳産物をコードすることができる。
本発明による単離されたタンパク質は、天然型環境から除去されたタンパク質（すなわち人間による加工が行われた）であり、例えば精製タンパク質、部分精製タンパク質、組換えで製造したタンパク質、および合成で製造したタンパク質を含み得る。組換えで製造したタンパク質のいくつかが実施例の項に記載されている。ここで「単離された」とはタンパク質が精製された程度を反映していない。さらに、「タンパク質Ｘ」と呼ばれる仮定タンパク質の参照例（すなわち本発明で使用された任意の酵素またはタンパク質をこの用語で置き換えることができる）では、「Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質Ｘ」とは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のタンパク質Ｘ（天然起原のタンパク質Ｘのホモログも含む）または構造（例えば配列）の知識から別法で製造されたタンパク質Ｘのことであり、時々Ｅ．ｃｏｌｉ由来の天然起原タンパク質Ｘの機能のことである。言い換えれば、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質ＸにはＥ．ｃｏｌｉ由来の天然起原タンパク質Ｘと類似の構造と機能を実質的に有するか、本明細書に詳細に記載されたＥ．ｃｏｌｉ由来の天然起原タンパク質Ｘの生物活性（すなわち生物活性を有する）ホモログである任意のタンパク質Ｘが含まれる。従って、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質Ｘには精製された、部分的に精製された、組換え、突然変異／修飾および合成タンパク質が含まれ得る。この議論は本明細書に開示される他の微生物由来のタンパク質Ｘにも同様に当てはめられる。
ホモログは、天然型対立遺伝子変異または天然型突然変異の結果であり得る。タンパク質をコードする核酸の天然起原の対立遺伝子変異体は、この様なタンパク質をコードする遺伝子のようなゲノムと基本的に同じ遺伝子座（単数または複数）に生じる遺伝子であるが、例えば突然変異または組換えで生じた天然型変異のため、類似ではあるが同一ではない配列である。対立遺伝子変異体は代表的には、それと比較される遺伝子でコードされるタンパク質の活性と類似の活性を有するタンパク質をコードする。あるクラスの対立遺伝子変異体は同じタンパク質をコードし得るが、遺伝子コードの縮重のために異なった核酸配列を有し得る。対立遺伝子変異体は遺伝子の５’非翻訳領域または３’非翻訳領域での変化を含み得る（例えば調節制御領域中に）。対立遺伝子変異体は、当業者に周知である。
ホモログは、単離された、天然起原のタンパク質の直接修飾、直接タンパク質合成、または例えば無秩序または標的を定めた突然変異誘発を行うための古典的または組換えＤＮＡ技術を用いる、そのタンパク質をコードする核酸配列の修飾を含むがそれに制限されないタンパク質産生のための公知の技術を用いて製造し得る。
野生型タンパク質と比較して、ホモログの修飾は、天然起原のタンパク質と比較してのホモログの基本的な生物活性に作用するか、拮抗するか、またはこれを実質的に変化させる。一般的に、タンパク質の生物活性または生物作用は、インビボ（すなわちタンパク質の天然型生理的環境中の）またはインビトロ（すなわち実験室条件下）で測定または観察される、タンパク質の天然起原型に帰せられる、タンパク質により示されまたは実施される任意の機能（単数または複数）のことである。本明細書で用いられる酵素およびタンパク質の生物活性は、上記に詳細に記されている。例えば、本明細書で一般的に「グルコサミン−６−燐酸シンターゼ」と呼ばれる酵素は、フルクトース−６−燐酸およびグルタミンからグルコサミン−６−燐酸とグルタミン酸の生成を触媒する。ホモログ中等のタンパク質の修飾は、天然起原タンパク質と同じレベルの生物活性を有するタンパク質を与え得るか、または天然起原のタンパク質と比較して減少または増加した生物活性を有するタンパク質を与え得る。タンパク質の発現の減少、または活性の減少をもたらす修飾は、タンパク質の不活性化（完全もしくは部分的）、下方調節、または作用低下と呼ばれ得る。同様に、タンパク質の発現の増加またはタンパク質の活性の増加をもたらす修飾は、増幅、過剰生産、活性化、増大、上方調節、またはタンパク質作用の増加と呼ばれ得る。機能性サブユニット、ホモログまたは与えられたタンパク質のフラグメントは、天然型タンパク質（即ち生物活性を有する）と実質的に同じ（例えば少なくとも定性的に同じ）生物機能を果たし得ることが好ましい。あるタンパク質の機能性サブユニット、フラグメントまたは他のホモログは、参照または野生型タンパク質の生物活性を有すると見なされるために参照または野生型タンパク質と必ずしも同じレベルの生物活性を有することが要求されない（即ち定性的類似性で充分である）ことが注目される。ある実施態様では、野生型タンパク質と比較したホモログ中の修飾が、天然起原タンパク質と比較してタンパク質の基本的な生物活性を実質的に減少しないことが好ましい。ホモログ中で生物活性が増加する（例えば酵素活性を増加させる）ことが望ましくあり得る。ホモログはまた、天然起原タンパク質と比較してある化合物による阻害に対する感受性の減少等、タンパク質の機能的、または酵素活性以外の特性で、天然起原型と比較して異なり得る。
本発明によれば、生物活性ホモログおよびそのフラグメントを含む単離タンパク質は野生型、または天然起原タンパク質の生物活性の少なくとも一つの特性を有する。タンパク質の発現と生物活性を検出および測定する方法にはタンパク質転写の測定、タンパク質翻訳の測定、タンパク質の細胞局在の測定、タンパク質と他のタンパク質との結合または会合の測定、タンパク質調節配列をコードする遺伝子とタンパク質または他の核酸との結合または会合の測定、タンパク質を発現する細胞内のタンパク質の生物活性の増加、減少または誘導の測定が含まれるが、それに限定されない。
本発明によるタンパク質の発現レベルの測定法にはウエスターンブロット、免疫細胞化学、フローサイトメトリーまたは他の免疫系分析；リガンド結合、酵素活性または他のタンパク質パートナーとの相互作用を含むがそれに限定されないタンパク質の性質に基づく分析が含まれるがそれに限定されない。結合分析も周知である。２つのタンパク質間の複合体の結合乗数を測定するため、例えば、ＢＩＡコア装置を使用することができる。複合体の解離定数は、緩衝液がチップ上を通り過ぎる時間の屈折率の変化をモニターして求めることができる（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：４５７−４６８（１９９３）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：３４３−３４７（１９９３））。あるタンパク質と他のタンパク質との結合を測定する他の適当な分析法は、例えば免疫分析（酵素結合免疫吸収体分析（ＥＬＩＳＡ）および放射線免疫分析（ＲＩＡ）、またはタンパク質の分光学または光学的特性の変化を、蛍光、ＵＶ吸収、円二色性または核磁気共鳴（ＮＭＲ））でモニターする結合測定である。本発明で用いられるタンパク質の酵素活性を測定する分析法は当該分野で周知であり、多くが実施例の項に記載される。
アミノ糖代謝経路に関与し、修飾のための望ましい標的を示し、本明細書に記載の醗酵プロセスに用いられる酵素およびタンパク質の多くは、代表的な野生型または突然変異タンパク質の機能とアミノ酸配列（およびそれをコードする核酸配列）に関して上記に記載されている。本発明のある実施態様では、与えられたタンパク質のホモログ（他の生物由来の関連タンパク質または与えられたタンパク質の修飾型も含み得る）が、本発明の遺伝子修飾された生物で使用するために含まれる。本発明に含まれるタンパク質のホモログは、本発明により修飾または過剰発現し得る酵素またはタンパク質のアミノ酸配列を表す、本明細書に開示のアミノ酸配列に対し、少なくとも約３５％の同一、より好ましくは少なくと約も４０％同一、より好ましくは少なくとも約４５％同一、より好ましくは少なくと約も５０％同一、より好ましくは少なくとも約５５％同一、より好ましくは少なくとも約６０％同一、より好ましくは少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約７５％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約８５％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、より好ましくは少なくとも約９５％同一、より好ましくは少なくとも約９６％同一、より好ましくは少なくとも約９７％同一、より好ましくは少なくとも約９８％同一、より好ましくは少なくとも約９９％同一、または全整数（すなわち３６％、３７％等）で３５％〜９９％の間の任意％同一であるアミノ酸を含み得る。ホモログのアミノ酸配列が野生型または参照タンパク質の生物活性を有することが好ましい。
本明細書で用いられる同一性（％）とは、特に指定しない限りホモロジーの評価を意味し、以下を用いて行われる：（１）標準デフォルトパラメーターを有するアミノ酸配列の対しｂｌａｓｔｐを、核酸配列に対しｂｌａｓｔｎを用いるＢＬＡＳＴ２．０Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴホモロジー検索；低複雑度領域に対して質問配列がデフォルトにより篩い分けられる（Ａｌｔｓｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、Ｍａｄｄｅｎ、Ｔ．Ｌ．、Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ａ．Ａ．、Ｚｈａｎｇ、Ｊ．、Ｚｈａｎｇ、Ｚ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．Ｊ．（１９９７）、“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、その全文を本明細書に参考として援用する）；（２）ＢＬＡＳＴ２整列（以下に記載のパラメーターを使用）；および／または（３）標準デフォルトパラメーターを有するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（位置特異性繰り返しＢＬＡＳＴ）。ＢＬＡＳＴ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ２の間の標準的なパラメーターにおける若干の差により、ＢＬＡＳＴ２プログラムを用いると２個の特定の配列が有意のホモロジーを有すると認識されるのに対し、配列の一つを質問配列として用いるＢＬＡＳＴ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴで行われる検索では、最高一致で第二の配列を同定しない場合があることに注意されたい。さらに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴでは“プロフィル”検索の自動化された使い易いバージョンが提供され、配列のホモロジーを求める感度の高い方法となる。そのプログラムはギャップ付きＢＬＡＳＴデータベース検索を最初に行う。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、データーベース検索の次のラウンドのために質問配列を置き換える位置特異性スコアマトリックスを構築するために戻される、任意の有意な整列由来の情報を使用する。従って、％同一性はこれらのプログラムの何れを使用しても決定可能であることを理解する必要がある。
ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ、（１９９９）、“Ｂｌａｓｔ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１７４：２４７−２５０（その全文は本明細書に参考として援用される）に記載される。ＢＬＡＳＴ２配列を用いて、２個の特定配列を相互に整列させることができる。ＢＬＡＳＴ２配列の整列は、二つの配列間でギャップ付きＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ２．０）を行い、得られた整列中にギャップ（欠失および挿入）を導入し得る、ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて、ｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎにおいて行われる。本明細書では分かりやすくするため、以下の標準デフォルトパラメーターを用いてＢＬＡＳＴ２配列の整列が行われる：
以下の０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いるｂｌａｓｔｎでは：
マッチングの報酬＝１
ミスマッチの罰則＝−２
開放ギャップ（５）および延長ギャップ（２）罰則
ギャップ× ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（１１）フィルター（オン）
以下の０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いるｂｌａｓｔｐでは：
開放ギャップ（１１）および延長ギャップ（１）罰則
ギャップ× ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（３）フィルター（オン）
本発明で参照および／または使用されたタンパク質には、参照タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも３０個の隣接アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質もまた含まれ得る（すなわち、上で同定した配列の３０個の隣接アミノ酸と１００％同一を有する３０個の隣接アミノ酸残基）。好ましい実施態様では、本発明で参照または使用されたタンパク質には、少なくとも５０個、より好ましくは少なくとも７５個、より好ましくは少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１１５個、より好ましくは少なくとも１３０個、より好ましくは少なくとも１５０個、より好ましくは少なくとも２００個、より好ましくは少なくとも２５０個、より好ましくは少なくとも３００個、より好ましくは少なくとも３５０個の参照タンパク質のアミノ酸配列の隣接アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。ある実施態様では、この様なタンパク質は参照タンパク質の生物活性を有する。
本発明によれば、本発明に記載の核酸またはアミノ酸配列に関する“隣接”または“連続”と言う用語は、破壊されていない配列中で連結されていることを意味する。例えば、第二の配列の３０個の隣接（または連続）アミノ酸を有する第一配列では、第一配列に第二配列中の３０個のアミノ酸残基の破壊されていない配列に対し同一性が１００％である３０個のアミノ酸残基の破壊されない配列が含まれることを意味する。同様に、第二配列と同一性１００％を有する第一配列では、ヌクレオチドまたはアミノ酸間にギャップがなく、第一配列が第二配列と正確に一致することを意味する。
他の実施態様では、ホモログを含む本発明で参照された、または使用されたタンパク質には、ホモログをコードする核酸配列が中程度の、高度のまたは極めて高度のストリンジェント条件（以下に記載）下で、天然起原のタンパク質をコードする核酸分子に（即ち核酸分子と）ハイブリダイゼーション可能な（即ち天然起原のタンパク質をコードする核酸分子鎖の相補体とハイブリダイゼーション可能な）、天然起原のタンパク質のアミノ酸配列と十分に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。与えられたホモログは、中程度の、高度のまたは極めて高度のストリンジェント条件下で、野生型または参照タンパク質をコードする核酸分子配列の相補体とハイブリダイゼーションする核酸配列でコードされることが好ましい。
参照核酸配列の核酸配列相補体とは、タンパク質をコードする鎖と相補的である核酸の核酸配列を意味する。あるアミノ酸配列をコードする二重鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡおよび、その一本鎖ＤＮＡと相補性である配列を有する相補鎖を有することが理解される。従って、本発明の核酸分子は二重鎖または一本鎖の何れかであり、ストリンジェント条件下でタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列、および／またはこの様なタンパク質をコードする核酸配列の相補体と安定なハイブリッドを形成する核酸分子を含む。相補的配列を推論する方法は当業者に公知である。アミノ酸配列決定と核酸配列決定の技術は全く誤りがないことはないので、本明細書に提示される配列は、たかだか本発明の参照タンパク質の見掛けの配列を表すことに注意しなければならない。
本明細書で用いるハイブリダイゼーション条件とは、核酸分子が類似の核酸分子を同定するために用いられる標準ハイブリダイゼーション条件を言う。この様な標準条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ、１９８９に開示されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（同書）はその全文を本明細書に参考として援用する（特にｐ９．３１−９．６２参照）。さらに、ヌクレオチドのミスマッチ度を様々に変え得るためのハイブリダイゼーションを達成する適当なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を計算する式は、例えばＭｅｉｎｋｏｔｈら、１９８４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８、２６７−２８４；Ｍｅｉｎｋｏｔｈら（同書）に開示され、その全文を本明細書に参考として援用される。
具体的には、本明細書で言う中程度のストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応を検出するために用いられる核酸分子で、少なくとも約７０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を行うことができる条件のことである（すなわちヌクレオチドの約３０％以下のミスマッチを許容する条件）。本明細書で言う高いストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応を検出するために用いられる核酸分子で、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を行うことができる条件のことである（すなわちヌクレオチドの約２０％以下のミスマッチを許容する条件）。本明細書で言うきわめて高いストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応を検出するために用いられる核酸分子で、少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を行うことができる条件のことである（すなわちヌクレオチドの約１０％以下のミスマッチを許容する条件）。上記で議論した様に、この様な特定のレベルのヌクレオチドのミスマッチを行うための適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を計算するために、当業者はＭｅｉｎｋｏｔｈらの式（上記）を使用することができる。この様な条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが形成されるか否かにより変化する。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融点の計算温度は、ＤＢＡ：ＲＮＡハイブリッドのそれより１０℃低い。ある特定の実施態様では、ＤＮＡ：ＤＮＡのストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、約２０℃〜約３５℃（より低いストリンジェント）、より好ましくは約２８℃〜約４０℃（よりストリンジェント）、さらに好ましくは、約３５℃〜約４５℃（さらによりストリンジェント）の間の温度で、適当な洗浄条件でイオン強度６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）におけるハイブリダイゼーションが含まれる。特定の実施態様では、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、約３０℃〜約４５℃、より好ましくは約３８℃〜約５０℃、さらにより好ましくは、約４５℃〜約５５℃の間の温度で、同様なストリンジェント洗浄条件でイオン強度６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）におけるハイブリダイゼーションが含まれる。これらの値は、約１００個のヌクレオチドより大きい分子に対する、０％ホルムアミドおよびＧ＋Ｃ含有量約４０％における融点の計算に基づいている。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上記文献ｐ９．３１〜９．６２に記載された様にＴｍを経験的に計算することができる。一般に、洗浄条件はできるだけストリンジェントであり、選択したハイブリダイゼーション条件に適している必要がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件には塩条件および特定のハイブリッドのＴｍの計算値より約２０〜２５℃低い温度条件の組み合わせが含まれ、洗浄条件には代表的には塩条件および特定のハイブリッドのＴｍの計算値より約１２〜２０℃低い温度条件の組み合わせが含まれる。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに使用するに適したハイブリダイゼーション条件の一例には、約４２℃における６×ＳＳＣ（５０％ホルムアミド）中の２〜２４時間のハイブリダイゼーション、次いで約２×ＳＳＣ中の室温での１回以上の洗浄を含む洗浄工程、次いでさらに高温で低イオン強度（例えば約０．１〜０．５×ＳＳＣ中で約３７℃での少なくとも１回の洗浄、次いで約６８℃、約０．１〜０．５×ＳＳＣでの洗浄）の洗浄が含まれる。
ある実施態様では、ホモログは自然対立遺伝子変異または自然突然変異の結果であり得る。あるタンパク質のホモログはまた、本明細書記載の核酸またはアミノ酸レベルで相互に少なくともある構造的類似性を有する（例えば少なくとも約３５％同一）、異なる生物由来の実質的に同じ機能を有する天然起原のタンパク質であり得る。本発明のホモログはまた、例えば古典的または組換えＤＮＡ技術を用いて無秩序または標的を定めた突然変異誘発を行う、タンパク質の直接修飾またはそのタンパク質をコードする遺伝子の直接修飾を含むがそれに限定されない公知の技術を用いて作成され得る。あるタンパク質をコードする核酸の天然起原対立遺伝子変異体は、その所定のタンパク質をコードするが、例えば突然変異または組換えにより生じた自然変異体のために、類似ではあるが同一でない配列を有する遺伝子と、基本的に同じゲノム内の遺伝子座（単数または複数）で生じる遺伝子である。自然対立遺伝子突然変異体は代表的に、比較される遺伝子でコードされるタンパク質の活性と類似の活性を有するタンパク質をコードする。あるクラスの対立遺伝子変異体は同じタンパク質をコードし得るが、遺伝子コードの縮重のため異なった核酸配列を有する。対立遺伝子変異体は、遺伝子の５’または３’未翻訳領域（例えば調節制御領域）の変化を含み得る。対立遺伝子変異体は当業者に周知である。
ある態様では、本発明のタンパク質および／またはホモログの最少サイズはタンパク質の所望の生物活性を有するために十分なサイズである。他の実施態様では、本発明のあるタンパク質は少なくともアミノ酸長３０、より好ましくは少なくともアミノ酸長約５０、より好ましくは少なくともアミノ酸長７５、より好ましくは少なくともアミノ酸長１００、より好ましくは少なくともアミノ酸長１１５、より好ましくは少なくともアミノ酸長１３０、より好ましくは少なくともアミノ酸長１５０、より好ましくは少なくともアミノ酸長２００、より好ましくは少なくともアミノ酸長２５０、より好ましくは少なくともアミノ酸長３００、より好ましくは少なくともアミノ酸長３５０である。タンパク質があるタンパク質の一部または全長タンパク質プラス必要あれば追加配列（例えば融合タンパク質配列）を含み得る点で、実用的な制限以外にこの様なタンパク質の最大サイズに制限はない。本発明で用いられる適当な融合セグメントにはタンパク質の安定性を増進し得る、他の所望の生物活性を提供する（例えば第二酵素の融合）、および／またはタンパク質精製を補助する（例えば親和性クロマトグラフィーによる）セグメントが含まれるがそれに制限されない。
本発明のある実施態様では、本明細書に記載の任意のアミノ酸配列を、少なくとも１個、約２０個までの、特定のアミノ酸配列のＣ−および／またはＮ−末端にそれぞれ隣接する別な異種アミノ酸を用いて製造できる。得られたタンパク質またはポリペプチドは特定のアミノ酸が「から本質的なる」と言うことができる。本発明によれば、相同アミノ酸は特定のアミノ酸配列ではさまれた、天然に見出されない（即ちインビボで自然に見出されない）か、特定のアミノ酸配列の機能と関連しないか、またはあるアミノ酸配列を誘導する生物が利用する標準コドンを用いて天然起源配列におけるこのようなヌクレオチドが翻訳される場合、遺伝子内で生じる様な特定のアミノ酸配列をコードする天然起原核酸配列に隣接するヌクレオチドによってコードされないアミノ酸の配列である。同様に、本明細書の核酸配列に参照して用いられる場合「から本質的なる」という句は、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列の５’および／または３’末端それぞれで少なくとも１個、多くても約６０個までの別な異種核酸配列に隣接し得る特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列をいう。天然型遺伝子内で生じる様に、特定アミノ酸配列をコードする核酸配列に隣接する異種ヌクレオチドは天然に見出されない（すなわち生体内で自然に見出されない）か、任意の別な機能を与えるタンパク質をコードせず、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能も変化させないタンパク質をコードしない。
本発明の実施態様には、本明細書に記載のアミノ糖代謝経路中の酵素または他のタンパク質をコードする核酸分子の使用および／または操作が含まれる。本発明の核酸分子には、本明細書に記載の任意の酵素または他のタンパク質をコードする核酸配列を含む、その核酸配列から本質的になる、またはその核酸配列からなる核酸分子が含まれる。
本発明によれば、単離された核酸分子はその天然の環境から除去された（すなわち人に操作された）核酸分子であり、その天然の環境はその核酸分子が天然に見出されるゲノムまたは染色体である。従って、“単離された”とはその核酸分子が精製された程度を必ずしも反映せず、その核酸分子が天然に見出される全ゲノムまたは全染色体をその分子が含まないことを示すものである。単離された核酸分子には、本明細書に記載のグルコサミン−６−燐酸シンテターゼ遺伝子等の遺伝子が含まれ得る。ある遺伝子を含む単離された核酸分子はこの遺伝子を含む染色体のフラグメントではなく、むしろこの様な遺伝子に関連するコード領域および調節領域を含むが、同じ染色体上に天然で見出される別な遺伝子を含まないフラグメントである。単離された核酸分子は、通常は天然で特定の核酸配列に側面しない別な核酸（すなわち配列の５’および／または３’末端）、隣接する特定の核酸配列（すなわち異種配列）も含む。単離された核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）またはＤＮＡまたはＲＮＡ（例えばｃＲＮＡ）の誘導体を含み得る。“核酸分子”と言う用語は一次的には体の核酸分子のことであり、「核酸配列」という用語は一次的には核酸分子上のヌクレオチドの配列を言うが、二つの用語は交換可能に使用され得、特にタンパク質をコードし得る核酸分子または核酸配列に関して交換可能に使用される。
本発明の単離された核酸分子は組換えＤＮＡ技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を使用して製造されることが好ましい。単離された核酸分子には、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換および／または反転され、その様な修飾がタンパク質の生物活性に所定の影響を与える様式において、天然型対立遺伝子変異体および修飾された核酸分子が含まれるが、それに限定されない天然型核酸分子およびそのホモログが含まれる。対立遺伝子変異体およびタンパク質ホモログ（例えば核酸ホモログでコードされたタンパク質）は上記に詳細に議論されている。
核酸分子ホモログを当業者に公知のいくつかの方法を使用して製造できる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）参照）。例えば、部位指向突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の薬品処理、核酸フラグメントの制限酵素切除、核酸フラグメントのライゲーション、ＰＣＲ増幅および／または核酸配列の選択領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成ならびに、核酸分子の混合物およびその組み合わせを“構築”するための混合物群のライゲーション等、古典的突然変異誘発技術および組換えＤＮＡ技術を含むがそれに限定されない、様々な技術を用いて核酸分子を修飾することができる。核酸および／または野生型遺伝子とのハイブリダイゼーションによりコードされるタンパク質の機能をスクリーニングして、核酸分子ホモログを修飾核酸の混合物から選択することができる。
本発明の核酸分子の最少サイズは、所望の生物活性を有するタンパク質をコードするに十分な、または天然型タンパク質をコードする核酸分子の相補配列と（例えば中程度、高度または極めて高度なストリンジェント条件下、および好ましくは極めて高度のストリンジェント条件下で）安定なハイブリッドを生成し得るプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを形成するに十分なサイズである。従って、本発明の核酸分子のサイズは、核酸の組成、および核酸分子と相補配列間の相同性または同一性の割合ならびに、ハイブリダイゼーション条件そのもの（例えば温度、塩濃度、およびホルムアミド濃度）に依存し得る。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして使用される核酸分子の最少サイズは、代表的には核酸分子がＧＧに富んでいる場合は少なくとも約１２〜約１５ヌクレオチド長、ＡＴに富んでいる場合は少なくとも約１５〜約１８塩基長である。本発明の核酸分子の最大サイズには、核酸分子がタンパク質コード配列の一部、全長タンパク質をコードする核酸配列（完全な遺伝子を含み）を含み得る点で、実用的な限度以外は制限がない。
本発明のある核酸分子の核酸配列、特に本明細書に詳細に記載された任意の核酸配列の知見により、当業者は例えば（ａ）これらの核酸分子のコピーを作成する、および／または（ｂ）この様な核酸分子の少なくとも一部を含む核酸分子（例えば全長遺伝子、全長コード領域、調節制御配列、切断コード領域を含む核酸分子）を得ることができる。この様な核酸分子は、適当なライブラリーまたはＤＮＡをスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプローブを用いる伝統的なクローニング技術、およびオリゴヌクレオチドプライマーを用いる適当なライブラリーまたはＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む様々な方法で得ることができる。スクリーニングまたは核酸分子の増幅からの好ましいライブラリーには、バクテリアまたは酵母ゲノムＤＮＡライブラリー、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉゲノムＤＮＡライブラリーが含まれる。遺伝子をクローニングし増幅する技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（上記）に開示されている。
本発明の他の実施態様には、組換えベクターを有する組換え核酸分子、および本明細書に記載のアミノ糖代謝経路中の任意の酵素または他のタンパク質の生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する核酸分子が含まれる。本発明によれば、組換えベクターは、このような核酸配列を宿主細胞中に導入するため、および最適な核酸配列を操作するための道具として用いられる、遺伝子工学による（即ち人工的に製造された）核酸分子である。従って、組換えベクターは、最適な核酸配列を発現および／または宿主細胞中に配送し組換え細胞を作成するための、最適な核酸配列をクローニング、配列決定および／または他の操作をするために用いるのに適している。代表的にはこの様なベクターは異種核酸配列を含む。すなわち、その核酸配列はクローニングまたは配送される核酸配列に隣接して天然では見出されない核酸配列であるが、そのベクターは本発明の核酸分子に隣接して天然で見出されるか、あるいは本発明の核酸分子の発現に有用である（以下に詳細に議論される）調節核酸配列（例えばプロモーター、未翻訳領域等）も含み得る。ベクターは原核または真核細胞のＲＮＡまたはＤＮＡ、代表的にはプラスミドであり得る。ベクターは染色体外要素（例えばプラスミド）として維持され得るか、または組換え生物（例えば微生物または植物）の染色体中に組み込まれる。ベクター全体が宿主細胞内の正規の位置に残留し得るか、またはある条件下ではプラスミドＤＮＡが欠失し、本発明の核酸分子が残され得る。組み込まれた核酸分子は染色体プロモーター制御下、天然またはプラスミドプロモーターの制御下に置かれるか、あるいはいくつかのプロモーターの組み合わせの制御下に置かれ得る。核酸分子の１個または複数個のコピーを染色体に組み込むこともできる。本発明の組換えベクターは少なくとも１個の選択マーカーを含み得る。
ある実施態様では、本発明の組換え核酸分子に用いられる組換えベクターは発現ベクターである。本明細書で用いられる“発現ベクター”と言う用語は、コードされた生成物（例えば関心のあるタンパク質）の製造に適したベクターを言う。本実施態様では、製造される生成物をコードする核酸配列が組換えベクター中に挿入され、組換え核酸分子を生成する。製造されるタンパク質をコードする核酸配列が核酸配列がベクター中の制御配列に作動可能に結合する様式でベクター中に挿入され、組換え宿主細胞中で核酸配列の転写および翻訳を可能にする。
他の実施態様では、本発明の組換え核酸分子に用いられた組換えベクターは標的化ベクターである。本明細書で用いられる“標的化ベクター”と言う用語は、特定の核酸分子を組換え宿主細胞中に配送するために用いられるベクターのことであり、その核酸分子は宿主細胞または微生物内の内因性遺伝子を欠失または不活性化するために用いられる（すなわち、標的遺伝子の破壊またはノックアウト技術に用いられる）。この様なベクターは当該分野で“ノックアウト”ベクターとしても知られている。本実施態様のある態様では、ベクターの一部であるが、より代表的にはベクター中に挿入された核酸分子（すなわちインサート）は宿主細胞中で標的遺伝子（すなわち欠失または不活性化の標的となる遺伝子）の核酸配列と相同である核酸配列を有する。ベクターインサートの核酸配列は、標的遺伝子に結合する様に設計され、標的遺伝子とインサートが相同組換えを行い、その結果（即ち突然変異または欠失した内因性標的遺伝子の少なくとも一部により）内因性標的遺伝子が欠失、不活性化または減衰する。
代表的には、組換え核酸分子には、転写制御配列および翻訳制御配列を含む、１個以上の発現制御配列と作動可能に結合する本発明の少なくとも一つの核酸分子が含まれる。本明細書で用いる“組換え分子”または“組換え核酸分子”と言う用語は、主に発現制御配列と作動可能に結合する核酸分子または核酸配列を言うが、この様な核酸分子が本明細書で議論するような組換え分子である場合、“核酸分子”と言う用語と互換的に用いられ得る。本発明によれば、“作動可能に結合”と言う用語は、核酸分子を、宿主細胞中にトランスフェクションさせた（すなわち、形質転換、導入、トランスフェクション、複合化または誘導された）場合、その分子が発現可能な様式で発現制御配列（例えば転写制御配列および／または翻訳制御配列）に結合させることを言う。転写制御配列は転写の開始、伸長または停止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびレプレッサー配列等の転写開始を制御する配列である。適当な転写制御配列には、組換え核酸分子が導入される宿主細胞または生物中で機能し得る任意の転写制御配列が含まれる。
本発明の組換え核酸分子は翻訳調節配列、複製起点、および組換え細胞に適応し得る他の調節配列等の別な調節配列も含むことができる。ある実施態様では、宿主染色体中へ組み込まれる分子を含む本発明の組換え分子は、分泌シグナル（すなわちシグナルセグメント核酸配列）も含み、発現タンパク質をそのタンパク質を生産する細胞から分泌することができる。適当なシグナルセグメントには発現されるタンパク質と天然で結合するシグナルセグメント、または本発明によるタンパク質の分泌を目的とし得る任意の異種シグナルセグメントが含まれる。他の実施態様では、本発明の組換え分子は、発現タンパク質を宿主細胞の膜に配送し挿入し得るリーダー配列を有する。適当なリーダー配列には天然でタンパク質と結合するリーダー配列、またはタンパク質の細胞膜への配送および挿入を目的とし得る任意の異種リーダー配列が含まれる。
本発明によると、“トランスフェクション”と言う用語は異種核酸分子（即ち組換え核酸分子）を細胞へ挿入する任意の方法を言う。“形質転換”と言う用語は、この様な用語が核酸分子を藻類、バクテリアおよび酵母等の微生物細胞中、または植物細胞中へ導入する意味で使用されている場合、“トランスフェクション”と言う用語と互換的に用いることができる。微生物および植物系では、用語“形質転換”は微生物または植物が異種核酸を取得したことによる遺伝的変化を説明するために用いられ、“トランスフェクション”と言う用語と本質的に同義語である。従って、トランスフェクション技術には形質転換、細胞の薬品処理、粒子爆撃、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染およびプロトプラスト融合が含まれるがそれに限定されない。
組換え細胞をバクテリアまたは酵母（すなわち宿主細胞）を１個以上の組換え分子で形質転換して生成することが好ましく、その組換え分子は１個以上の転写制御配列を含む発現ベクターと作動可能に連結する、それぞれ１個以上の核酸分子を有する。“作動可能に連結”と言う用語は、その分子が宿主細胞中に形質転換された場合、発現可能である様式において、核酸分子を発現ベクター中に挿入することを意味する。本明細書で用いる発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、特定の核酸分子を発現し得るＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。発現ベクターが宿主細胞内で複製可能であることも好ましい。本発明では、発現ベクターは代表的にはプラスミドである。本発明の発現ベクターには、酵母宿主細胞またはバクテリア宿主細胞、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞中で機能（すなわち直接遺伝子発現）する任意のベクターが含まれる。本発明の好ましい組換え細胞は実施態様例の項に記載される。
本発明の核酸分子は、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および組換え細胞と適合し、本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列等の調節配列を含む発現ベクターと作動可能に連結することができる。特に、本発明の組換え分子は転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長および停止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列はプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびレプレッサー配列等、転写開始を制御する配列である。適当な転写制御配列には酵母またはバクテリア細胞、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で機能し得る任意の転写制御配列が含まれる。様々なこの様な転写制御配列が当業者に公知である。
本明細書に記載の様々な酵素およびタンパク質をコードする核酸配列を有する組換え核酸分子（それらのホモログを含む）を人工プロモーターの制御下にクローニングすることが好ましい。そのプロモーターは生産生物中に十分なレベルのコードされたタンパク質を維持するに必要なレベルの遺伝子発現を行う任意の適当なプロモーターであり得る。適当なプロモーターは、様々な薬品（例えば、ラクトース、ガラクトース、マルトースまたは塩）、または生育条件の変化（温度等）で誘導可能なプロモーターであり得る。誘導可能なプロモーターを使用することにより、遺伝子発現と醗酵プロセスの最適性能を得ることができる。高価な誘導因子を添加する必要がないので、好ましいプロモーターは構成プロモーターであっても良い。この様なプロモーターにはより弱い突然変異体レプレッサー遺伝子等による遺伝子修飾により機能的に構造性または“漏出”性となった、通常誘導し得るプロモーター系が含まれる。使用される特に好ましいプロモーターはｌａｃ、ＰＬおよにＴ７である。遺伝子投与量（コピー数）は必要とする最大生成生産量により変化し得る。ある実施態様では、組換え遺伝子が宿主染色体中に組み込まれる。
組換えＤＮＡ技術を使用することで、例えば宿主細胞中の核酸分子のコピー数、これらの核酸分子の転写効率、得られた転写体の翻訳効率、および翻訳後修飾効率を操作することにより形質転換核酸分子の発現を改善し得ることは、当業者が理解し得る。本発明の核酸分子の発現を増加させるために有用な組換え技術には核酸分子の高コピー数プラスミドへの動作可能な連結、宿主細胞染色体への核酸分子の統合、プラスミドへのベクター安定化配列の付加、転写制御シグナル（例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、宿主細胞のコドン利用に対応する本発明の核酸分子の修飾、転写制御シグナルの置換または修飾、転写体を不安定化する配列の欠失、および醗酵中に組換え細胞の生育を組換え酵素の生産から一時的に切り離す制御シグナルの使用が含まれるがそれに限定されない。本発明の発現組換えタンパク質の活性を、この様なタンパク質をコードする核酸分子を断片化、修飾または誘導体化することにより改善し得る。この様な修飾は実施態様例の項に詳細に記されている。
本発明の一つ以上の組換え分子を使用して本発明のコードされた生成物を製造することができる。ある実施態様では、コードされた生成物は本明細書に記載の核酸分子の発現で、タンパク質を生産するに有効な条件下で製造される。コードされたタンパク質を製造するための好ましい方法は、宿主細胞を一つ以上の組換え分子でトランスフェクトし、組換え細胞を作成することである。適当な細胞（例えば宿主細胞または生産細胞）は任意の微生物（例えばバクテリア、原生生物、藻類、菌類、その他の微生物）であり最も好ましくは、バクテリア、酵母または菌類である。適当なバクテリア属にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれるがそれに限定されない。適当なバクテリア種にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓが含まれるがそれに限定されない。酵母の適当な属にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＰｈａｆｆｉａが含まれるがそれに限定されない。適当な酵母の種にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓおよびＰｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａが含まれるがそれに限定されない。適当な菌類の属にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａが含まれるがそれに限定されない。適当な菌類の種にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｎ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍ ｒｅｅｓｅｉが含まれるがそれに限定されない。宿主細胞は未トランスフェクト細胞または少なくとも一つの他の組換え核酸分子で既にトランスフェクトされた細胞であり得る。
本発明の別な実施態様には本明細書に記載の任意の遺伝子修飾微生物、および実施例で具体的に同定された微生物の同定特性を有する微生物が含まれる。この様な同定特性には、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産能を含む実施例の微生物の任意の、または全ての遺伝子型および／または表現型特性が含まれる。
上記の様に、本発明のグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの製造法では、遺伝子修飾されたアミノ糖代謝経路を有する微生物をグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産用の醗酵培地中で培養する。適当な、または有効な醗酵培地とは、培養により本発明の遺伝子修飾された微生物がグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産し得る任意の培地をいう。この様な培地は代表的に同化可能な炭素、窒素およびホスフェート原料を含む水性培地である。この様な培地には適当な塩、無機物およびその他の栄養素も含まれ得る。本明細書に記載の微生物に対する遺伝子修飾の一つの利点は、この様な遺伝子修飾がアミノ糖の代謝をかなり変化させるが、生産生物に何らの栄養要求を生じないことである。従って、グルコース、フラクトース、ラクトース、グリセロールまたは二種以上の異なった化合物の混合物を唯一の炭素源として含む最小塩培地が、醗酵培地として使用されることが好ましい。最小塩グルコース培地がグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン醗酵用の最も好ましい培地であり、これはまた、生成物の回収と精製が促進される。ある態様では、酵母抽出液が培地の成分である。
本発明の微生物を通常の醗酵バイオリアクター中で培養することができる。微生物をバッチ、栄養補給バッチ、細胞循環および連続醗酵を含むがそれに限定されない任意の醗酵プロセスで培養することができる。本発明の微生物をバッチまたは栄養補給醗酵プロセスで生育することが好ましい。
本発明のある実施態様では、インキュベーション前に醗酵培地を所望の温度、代表的には約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約４５℃、または約２５〜約４０℃に、約２５〜約３７℃の温度に加温するが、ある実施態様では約３０〜約３７℃がより好ましい。醗酵条件には本発明の微生物を、約２０〜４０℃の間の全ての温度上昇（すなわち２１℃、２２℃等）の任意の温度で培養することが含まれ得る。生育と本発明の微生物によるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産のための最適温度は、様々な因子で変化し得ることに注意する必要がある。例えば、微生物中の組換え核酸分子の発現のための特定のプロモーターの選択は、最適培養温度に影響し得る。当業者は標準技術を用いる本発明の任意の微生物に対する最適生育およびグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産温度を、本発明のある微生物に対して実施例の項に記載した様に、容易に決定し得る。
活発に生育している遺伝子修飾微生物の培養物を、妥当な生育時間後に高い細胞密度で生成するに十分な量で培地に播種する。少なくとも約１０ｇ／ｌ、好ましくは約１０〜約４０ｇ／ｌ、より好ましくは約４０ｇ／ｌの細胞密度で細胞が生育する。このプロセスは代表的には約１０〜６０時間を要する。
初期の細胞生育中、および代謝の維持、およびグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産中の細胞の増殖を維持するために、醗酵工程中に十分な酸素を培地に加えなければならない。培地の攪拌と曝気が酸素供給に便利である。攪拌と振盪等の通常の方法も培地の攪拌と曝気に使用し得る。培地中の酸素濃度は飽和値（すなわち大気圧で約３０〜４０℃における酸素の培地中への溶解度）の約１５％以上であることが好ましく、飽和値の約２０％以上であることがより好ましいが、醗酵に悪影響を与えない場合はより低い濃度へずれること（ｅｘｃｕｒｉｓｉｏｎ）も起こり得る。さらに、生産プロセス中にグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの安定性および生成が助長される場合、醗酵中に任意の適当な時間、酸素レベルを極めて低いレベルにすることが可能であることも理解される。培地の酸素濃度を酸素電極等の通常の方法でモニターすることができる。未希釈酸素ガスおよび窒素以外の不活性ガスで希釈された酸素ガス等の他の酸素源も用いることができる。
醗酵によるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産は唯一の炭素源としてグルコースの使用に基づくことが好ましいので、好ましい実施態様ではＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中にＰＥＰ：グルコースＰＴＳが誘導される。従って、機能性ＥＩＩＭ、ＰＥＰ：マンノースＰＴＳのＰ／ＩＩＩＭａｎ（例えばｍａｎＸＹＺ突然変異を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中に）がない場合でも、生成物であるグルコサミンが誘導されたグルコース輸送系を通して細胞に取り込まれると考えられる。しかしながら、過剰発現のグルコースが存在すると、グルコサミンの取り込みは厳しく抑制される。従って、醗酵バイオリアクター中の過剰のグルコースを維持することにより生成グルコサミンの取り込みを阻止することが、本発明の実施態様の一つである。本明細書で用いる“過剰”のグルコースとは、上記の培養条件等の正常な条件下で微生物の生育を維持するに必要な量以上のグルコース量を言う。
グルコース濃度が重量／体積比で醗酵容積の約０．０５〜１５％の濃度に保たれることが好ましい。他の実施態様では、グルコース濃度が醗酵培地の約０．５ｇ／ｌ〜約１５０ｇ／ｌに、より好ましくは醗酵培地の約０．５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌに、さらに好ましくは約５ｇ／ｌ〜約２０ｇ／ｌの濃度に保たれる。ある実施態様では、醗酵培地のグルコース濃度は任意の的様な方法で（例えばグルコース試験ストリップで）モニターされ、グルコース濃度が欠乏またはほとんど欠乏している場合、さらなるグルコースを培地に追加することができる。他の実施態様では、醗酵培地の半連続または連続補充でグルコース濃度が維持される。グルコースについて本発明で開示されたパラメーターは、本発明の醗酵培地において使用される任意の炭素源にも適用することができる。グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの製造プロセスを助長するならば、醗酵時間中に任意の適切な時間で炭素源を検出不能のレベルに到達させ得ることがさらに理解される。本発明の醗酵法で使用できる他の炭素源にはフラクトース、五糖、ラクトースおよびグルコン酸が含まれるがそれに限定されない。五糖にはリボース、キシロースおよびアラビノースが含まれるがそれに限定されない。ある態様では、培養工程はグルコースとリボースを含む醗酵培地中で行われる。
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産と安定性を維持および／または増大するために必要な、醗酵培地の他の成分およびパラメーターを補充および／または制御することが、本発明のまた別な実施態様である。例えば、ある実施態様では、醗酵培地には硫酸アンモニウムが含まれ、醗酵培地中の硫酸アンモニウム濃度は過剰の硫酸アンモニウムの添加で補充される。好ましくは、醗酵培地中の硫酸アンモニウムの量は約０．１％〜約１％（重量／体積）、好ましくは約０．５％のレベルに保たれる。また別な実施態様では、醗酵培地のｐＨの変動がモニターされる。本発明の醗酵法では、好ましくは、ｐＨは約ｐＨ４．０〜約ｐＨ８．０に保たれ、ある態様では約ｐＨ４〜約ｐＨ７．５、他の態様では約ｐＨ６．７〜約ｐＨ７．５、他の実施態様では約ｐＨ４．５〜約ｐＨ５に保たれる。好ましい実施態様が先に記載されているが、醗酵プロセスは０．１の増加（すなわちｐＨ４．１、ｐＨ４．２、ｐＨ４．３等）でｐＨ４〜ｐＨ８の間の任意のｐＨで行うことができる。本発明の方法では、例えば醗酵培地の出発ｐＨがｐＨ７．０である場合、醗酵培地のｐＨをｐＨ７．０からの有意の変化がモニターされ、それにより例えば水酸化ナトリウムを添加して調整される。グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの安定と生成のための最適ｐＨは細胞生育のための最適ｐＨと異なる場合もあるので、二相（または二相以上）のプロトコールを用いることができる。この様なプロトコールでは、細胞は最初はバイオマスの迅速な生産に最適のｐＨで生育し、次いでグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの合成を最大にするが、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの分解を最小にする異なるｐＨが使用される。
本発明のまた別な実施態様は、炭素フラックスを酢酸生産からより毒性の少ない副製品へ反転することである。この様な方法により、醗酵培地中の過剰グルコースに関連する毒性問題を回避することができる。炭素フラックスを酢酸製造から反転する方法は公知である。
本発明のバッチ、補充バッチ、および／または連続醗酵プロセスでは、細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの蓄積で明らかになる様に、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生成が基本的に停止するまで醗酵を継続する。全醗酵時間は代表的には約４０〜約６０時間であり、より好ましくは約４８時間である。連続醗酵プロセスでは、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを、それが培地に蓄積した場合、バイオリアクターから除去することができる。本発明の方法により、細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミン、または細胞外グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを含み得る生成物が生産される。
グルコースおよびＮ−アセチルグルコサミンの合成では、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＴ発現系を用いて異なった遺伝子が過剰発現した。遺伝子発現はＩＰＴＧおよびラクトースで誘導される。ＩＰＴＧのコストにより、グルコサミン生産が法外に高価になる。従って、ＩＰＴＧの使用を醗酵プロセスから除外することが理想的である。ラクトースは相対的に安価であり、大量生産プロセスに使用し得る。ラクトース誘導では、ラクトースを、細胞内のβ−ガラクトシダーゼで真の誘導因子であるアラビノースに最初に変換する必要がある。２１２３−５４等のグルコサミン生産株では、この株がβ−ガラクトシダーゼ陰性であるためにラクトースを誘導因子として使用することができない。これはその遺伝子座へのＴ７−ｇｌｍＳ＊５４発現カセットの挿入によるｌａｃＺの欠失および分解のためである。
原理的には、ＩＰＴＧ依存性を除外するためにいくつかの異なった方法を使用し得る。本発明で説明するあるアプローチは、ｌａｃＺ遺伝子を修復することである。これはＴ７−ｇｌｍＳ＊５４発現カセットを染色体内のｌａｃＺ以外の異なった部位へ組み込むことで行われた。
ｇａｌＫ部位への組み込みにより、ｌａｃＺ遺伝子が無傷で残される。Ｌａｃ＋株はＩＰＴＧよりはるかに安価なラクトースにより潜在的に誘導可能である。組み込み株もＧａｌ−であるため、ｇａｌＫ部位がＴ７−ｇｌｍＳ＊５４発現カセットの組み込みのために選ばれた。この様な株ではガラクトースがｌａｃプロモーターのための誘導因子として使用され得ることが報告されている。従って、アロラクトースによる誘導に加えて、ラクトースの加水分解で生成したガラクトースがさらに誘導を増強し得る。準最適量のラクトースがグルコサミン生産プロセスで使用された場合、この事は有益であると思われる。組み込みはまた、挿入が細胞の生育、およびグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産に何らの負の効果を与えない任意の他の場所のおいて行われ得る。
ラクトース誘導はグルコース抑制で生じる。培養系に高レベルのグルコースが存在する場合、グルコサミンの生産は行われなかった。しかしながら、一度グルコースが消費されると、ラクトースが利用され、グルコサミン生産が誘導された。グルコースとラクトースの比率が酵素の発現とグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生産に影響することが示された。天然型ｌａｃオペロンを抑制することにより、グルコース抑制が行われる。グルコースが存在する場合、ラクトーストランスポーター（ＬａｃＹ）およびβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）の合成が抑制され、従ってＴ７ＲＮＡポリメラーゼ誘導のための少量の誘導因子分子（アロラクトースおよびガラクトース）しか生産されなかった。グルコース抑制の詳細な機構は現在研究中である。グルコース抑制は二つのレベルで作用すると思われる。一つの抑制レベルはｌａｃプロモーター配列に対するｃＡＭＰ媒介作用で行われる。他の抑制レベルはラクトース取り込みの阻害で行われ、グルコーストランスポータータンパク質、すなわち酵素ＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ遺伝子でコードされる）およびＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ遺伝子でコードされる）により生じる。ｌａｃＵＶ５プロモーターはグルコース抑制に敏感ではないが、ラクトースが細胞に入ることを排除すると誘導を阻止し得る（誘導因子）。
グルコース抑制を最適生育および誘導プロトコールを用いて最小にすることができた。また、異なった遺伝子修飾を導入してグルコース抑制を最小にすることができた。一つのアプローチは、ｌａｃオペロン中の天然型ｌａｃプロモーターを、グルコースで抑制されないと考えれているｌａｃＵＶ５プロモーターで置換することであった。グルコース抑制はまた、ｃｒｒ遺伝子の遺伝子修飾で最小にすることができた。他のアプローチは、ｌａｃＩレプレッサー遺伝子の１つを欠失することであった。あるＥ．ｃｏｌｉのグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン生産株では、ｌａｃＩレプレッサー遺伝子の二つのコピーがあるが、その一つは天然型ｌａｃオペロン中にあり、もう一つはＤＥ３要素中にある。何れかのｌａｃＩ遺伝子を欠失すると、グルコース抑制とグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生産に対する抵抗性が増加した。ラクトースはｌａｃＹでコードされるラクトースパーミアーゼで細胞内に輸送されるので、ラクトース誘導はｌａｃＹの過剰発現に影響された。
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンレベルは合成速度で決められるばかりでなく、培養条件下で生成物が安定でない場合、細胞の代謝と分解によって決められる。本発明で開示する様に、グルコサミンはＥ．ｃｏｌｉの生育に用いられた典型的なｐＨ範囲で極めて不安定であることが見出された。また、グルコサミンおよび／またはその分解生成物は７１０７−１８株に毒性を与えた。細胞接種前に培地（ｐＨ７．０）中でグルコサミンを２０ｇ／ｌの低い濃度で３．５時間、プレインキュベーションした場合でも毒性が観察された。毒性は少なくとも部分的には出発ｐＨ７．０の培地中のＧｌｃＮ分解生成物に帰せられた。ＧｌｃＮはより低いｐＨでより安定であり、グルコサミンはｐＨ４．７以下では分解されない。
経済的なプロセスを開発するためには、グルコサミン生産を最大にする一方、生成物の分解を最小にしなければならない。さらに、比較的低いｐＨの醗酵槽中で行われるＧｌｃＮ生産プロトコールは合成されたＧｌｃＮを保存するばかりでなく、毒性の分解生成物を減少させることにより、このプロセスは細胞も保護する。これらの恩恵は、成長速度およびこの方法で生育した細胞の代謝活性の減少と釣り合わなければならない。ＧｌｃＮを連続的に合成するためには細胞内でエネルギーが定常的に発生することが必要であり、この様な低いｐＨで生育する細胞は、必要なエネルギーを発生できないと思われる。
一般的に、Ｅ．ｃｏｌｉは６〜７より低いｐＨで極めて遅く成長する。低いｐＨで成長特性が改良されたＥ．ｃｏｌｉ突然変異体を単離することは有用であると思われる。また、低いｐＨ条件下で正常に生育する他のバクテリアおよび酵母種中で、グルコサミン合成増強経路を遺伝子操作することも可能である。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅも生育はｐＨ４〜５の間で最適である。
生成物の分解の問題を解決するための新規の戦略が開発された。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグルコサミン合成経路は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐの合成に導くグルコサミン−６−ＰＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）の過剰発現で拡張された。この株では、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐが合成され、Ｎ−アセチルグルコサミンとして効率的に培地に分泌されることが示された。Ｎ−アセチルグルコサミンは広い範囲のｐＨと温度範囲で極めて安定である。温和な条件を用いて生成物をグルコサミンに変換して戻すことができる。この戦略を用いることにより、Ｎ−アセチルグルコサミンの力価がグルコサミン生産株中で７倍高く上昇した。Ｎ−アセチルグルコサミンも最終生成物として回収された。
いくつかの因子が単純無機塩培地中でのＮ−アセチルグルコサミン生産の高い力価に寄与していると思われる。第一の因子はＮ−アセチルグルコサミンの安定性である。これにより生成物が保存されるばかりでなく、グルコサミン分解生成物の毒性効果も避けられる。第二に、Ｎ−アセチル化工程が合成経路フラックスをこの目的へ引き寄せる強い力となる。ＮａｇＢ酵素がＧｌｍＳおよびＧＮＡ１酵素の不在で過剰発現された場合、それは細胞の生存と生育にアミノ糖を提供するに十分な程度機能することは興味のあることである。ＧＮＡ１酵素がＮａｇＢと共発現した場合、Ｎ−アセチルグルコサミンがグラムレベルで生産される結果となり、合成経路におけるアセチル化反応の牽引力であることを示している。第三に、Ｎ−アセチルグルコサミンの合成はアセチル基の供与体としてアセチルＣｏＡを利用する。これは細胞に一種の代謝負荷を与えると見なされるが、実際には酢酸の生成を回避し、細胞培養物に酢酸が蓄積することで生じる負の効果を阻止する。酢酸の生成は、酢酸合成に関与する酵素の遺伝子修飾により最小にすることができた。
ＮａｇＢとＧＮＡ１の組み合わせは、フラクトース−６−ＰからＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐへの興味ある経路を提供する。グルタミンとフラクトース−６−Ｐを使用するＧｌｍＳと異なり、ＮａｇＢ酵素はアンモニウムのＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐ中への直接の同化を触媒する。その上、ＮａｇＢタンパク質は約３０ｋＤａであり、ＧｌｍＳタンパク質（約７０ｋＤａ）よりはるかに小さい。ＧｌｍＳタンパク質と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉ中で過剰発現した場合、ＮａｇＢのより大きい部分が可溶性タンパク質部分にあることが見出された。
ＧｌｍＳタンパク質は一般に強い生成物阻害を受ける。生成物耐性ＧｌｍＳ酵素の使用は、グルコサミン力価の上昇、および多分Ｎ−アセチルグルコサミン力価の上昇にも重要な役割を果たした。生成物耐性ＧｌｍＳ突然変異体はインビトロ突然変異誘発で作成された。この様な突然変異体も天然から単離することができた。この方法は、天然型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＧｌｍＳの生成物耐性を示すことで説明された。
以下はグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの差異的生産に対するプロトコールの例である。これらは本発明の作動可能で好ましい実施態様の例にすぎず、本発明の唯一の実施態様であると解釈してはならない。共にフラスコ培養および培養装置培養用である好ましいいくつかの醗酵プロトコールと醗酵プロセスのパラメーターが実施例の項に詳細に述べられている。
以下は本発明によるラクトース誘導グルコサミン醗酵プロセスの典型的なプロトコールである。
Figure 2013009690
上記培地で、グルコース（徐々に増やして添加）およびＦｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｂ、Ｍｏ、Ｃｏ、微量元素（滅菌後添加）以外は滅菌前に添加した。
以下は本発明によるＮ−アセチルグルコサミン醗酵プロセスの典型的なプロトコールの例である。
Figure 2013009690
上記培地で、全ての成分をグルコース（徐々に増やして添加）以外は滅菌以前に添加した。滅菌後の初期ｐＨは３．０であり、接種前にＮＨ４ＯＨで６．９に調節した。
本発明の方法には、細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミン、および／または細胞外グルコサミンおよび／または細胞外Ｎ−アセチルグルコサミンであり得る生成物を採集する工程がさらに含まれる。採集の一般的な工程には、生成物（以下に定義）を回収し、必要があれば生成物を精製する工程が含まれる。回収と精製法の詳細な議論は以下に提供される。グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン等に生成物を「採集」することは、単に醗酵バイオリアクターから生成物を採集することを言い、分離、回収または精製を意味する必要はない。例えば、採集工程はバイオリアクターから培養物全体（すなわち微生物および醗酵培地）を取り出し、細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを含む醗酵培地をバイオリアクターから取り出し、および／または細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンをバイオリアクターから取り出すことを言う。本明細書で用いる「回収する」または「回収」と言う用語は、グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンがそれぞれ不溶性になり、溶液から沈殿するか結晶化する点へグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン溶液の溶解度条件を減少させることを言う。これらの工程の後に精製工程が続く。グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンが実質的に純粋な形で回収されることが好ましい。本明細書で用いる「実質的に純粋」であるとは、市販するための栄養補助化合物としてグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを有効に使用し得る純度を言う。ある実施態様では、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン製品は生産生物および／または他の醗酵培地成分から分離されることが好ましい。この様な分離を行う方法は以下に記載される。
本発明の方法により、少なくとも約１ｇ／ｌの生成物（即ち、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸）が微生物および／または醗酵培地採集されるか回収されることが好ましい。本発明の方法により、少なくとも約５ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１０ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも２０ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５０ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも７５ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも１００ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも１２０ｇ／ｌの生成物が回収され、少なくとも約１ｇ／ｌ〜約１２０ｇ／ｌの間の全増分（即ち２ｇ／ｌ、３ｇ／ｌ等）で回収されることがより好ましい。ある実施態様では、生成物は約１ｇ／ｌ〜少なくとも１２０ｇ／ｌの量で回収される。
代表的には、本発明のプロセスで生産されるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンのほとんどは細胞外である。微生物を醗酵培地から濾過または遠心分離等の通常の方法で除去できる。ある実施態様では、生成物を採集または回収する工程には、醗酵培地からグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの精製が含まれる。グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを細胞を除去した醗酵培地から、クロマトグラフィー、抽出、結晶化（例えば蒸発結晶化）、膜分離、逆浸透圧および蒸留等の通常の方法で回収できる。好ましい実施態様では、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを細胞を除去した醗酵培地から結晶化で回収する。他の実施態様では、生成物回収工程には細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを濃縮する工程が含まれる。
ある実施態様では、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンは細胞内に蓄積し、生成物の回収工程には微生物からグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンを単離する工程が含まれる。例えば、生成物（グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸）を分解しない方法で微生物細胞を溶菌し、溶菌物を遠心分離して不溶性の細胞断片を除去し、次いで生成物であるグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を上記の様な通常の方法で回収することにより、生成物を採集することができる。
本明細書に記載の遺伝子修飾微生物中の最初の細胞内生成物はグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンである。燐酸化中間生成物が多分、微生物の細胞周辺空間内のアルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、糖ホスファターゼ、またはアミノ糖ホスファターゼのために微生物から排出する間に脱燐酸化されることは一般的に受け入れられている。本発明のある実施態様では、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸は天然起原ホスファターゼにより細胞から排出前、または排出中に脱燐酸化され、所望の生成物であるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産が促進される。この実施態様では、細胞内での組み換えで提供されるホスファターゼ活性の増幅、または醗酵培地のホスファターゼ処理の必要性がなくなる。他の実施態様では、生産生物中のホスファターゼレベルが内在性ホスファターゼ遺伝子の遺伝子修飾、または微生物の組み換え修飾によるホスファターゼ遺伝子の発現を含むがそれに限定されない方法によって増加する。また別な実施態様では、上記の様に細胞を溶解した場合、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸が、溶解培地中に放出された後、採集した醗酵培地をホスファターゼで処理する。
上記の様に、本発明のプロセスは相当量の細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産する。特に、このプロセスは約５０％以上の全グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンが細胞外であり、より好ましくは約７５％以上の全グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンが細胞外であり、最も好ましくは約９０％以上の全グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンが細胞外である様に細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産する。本発明の方法により、約１ｇ／ｌ以上、より好ましくは約５ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約１０ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約２０ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約５０ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約７５ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約１００ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約１２０ｇ／ｌ以上の細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産が達成される。
本発明の他の実施態様はＮ−アセチルグルコサミン製造の新規方法に関する。その方法には上記の様な醗酵プロセスで生産した可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンを含む醗酵ブロスを得る工程と、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む固体を醗酵ブロスから回収する工程が含まれる。本発明によれば、醗酵プロセスで生産されるＮ−アセチルグルコサミンは、醗酵プロセスの生成物であるＮ−アセチルグルコサミンである。言い換えれば、細胞を培養する醗酵プロセスが、細胞によるＮ−アセチルグルコサミンの生産をもたらす。回収するまたは回収という用語は、Ｎ−アセチルグルコサミンがそれぞれ不溶性になり、溶液から沈殿するか結晶化する点へＮ−アセチルグルコサミン溶液の溶解度条件を減少させることを言う。Ｎ−アセチルグルコサミンを含む醗酵ブロス、残存培地および細胞性物質を、まず最初に細胞性物質およびバクテリア内毒素を除去して処理する。細胞性物質の除去前に、醗酵ブロス中の細胞を超音波処理、浸透圧破壊、摩砕／ビーズ処理、フレンチプレス、爆発性脱圧縮、溶媒処理、臨界点抽出および凍結／溶融を含むがそれに限定されない異なった方法を用いて溶菌することができる。細胞性物質と内毒素の除去は、ミクロまたは超濾過またはその組み合わせで行うことができる。公知の他の技術には遠心分離およびダイアフォルトレーションが含まれる。細胞性物質の除去後、溶液を内毒素の除去が適切であったかどうか試験できる。
醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミン含有固体を回収する工程の前に、醗酵ブロスを脱色および／または脱塩することができる。これらのプロセスのブロスの双方を行う場合、何れかの一つを最初に行うことができる。しかしながら、イオン交換樹脂を用いる脱塩プロセスによる脱色のため、脱塩工程を最初に行うことにより脱色の必要性が減少する。脱色工程は繰り返し結晶化、活性炭処理、およびクロマトグラフィーによる脱色で行うこともできる。クロマトグラフィーによる脱色にはイオン交換樹脂（イオン交換のためでなく、色の吸着のためだけで）、ＤｏｗＯｐｔｉｐｏｒｅＳＤ２および古典的なシリカ
系クロマトグラフィー媒体が含まれる。
醗酵ブロスをイオン交換樹脂と接触させて脱塩工程を行うことができるが、その工程には醗酵ブロスを陰イオン交換樹脂および／または陽イオン交換樹脂と接触させる工程が含まれる。ある実施態様では、陰イオンおよび陽イオン交換樹脂の混合ベッドが使用される。陽イオンの除去は強酸または弱酸イオン交換樹脂上で行われ、一方、弱塩基樹脂は醗酵で生成した有機酸の除去能があるので好ましい。陽イオン交換体からの流出液のｐＨは減少し、一方、陰イオン交換体空の流出液のｐＨは上昇するので、具体的には陽イオン除去が陰イオン除去に先行する様に選ばれる。Ｎ−アセチルグルコサミンは高いｐＨでエピマー化する傾向を示し、測定可能なレベルのＮ−アセチルマンノサミンを生成する。陰イオン除去は強塩基または弱塩基樹脂の何れを用いても行うことができる。得られた精製溶液にはわずかなイオン性物質しか含まれず、水、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび醗酵中に消費されなかった醗酵槽のフィード由来の炭水化物が主成分である。この中間性品のＮ−アセチルグルコサミン純度は、典型的にはには工程の全乾燥固体含有量の約９０％以上である。脱塩を完結するためにさらに精製が必要な場合、混合ベッドイオン交換工程が適用される。この場合、陽イオンおよび陰イオン樹脂が同じイオン交換体を占有し、高度に脱塩されたこのベッドを通過する。混合ベッドイオン交換はそれぞれ別個の陽イオンおよび陰イオン交換体を置き換えるものであり、ブロスｐＨの変化が最小になる利点があるが、樹脂の損失の高い危険性を同時に伴う再生前のイオン交換樹脂の分離のために、別個のベッドを使用する方がより便利である。
醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミン含有固体を回収する工程には、醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミン含有固体を沈殿および／または結晶化する工程が含まれる。具体的には、回収工程前に醗酵ブロスを濃縮して、沈殿または結晶化を可能にするためにより高い濃度の可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンとする。濃縮工程を真空下（即ち少なくとも大気圧以下）または膜分離で行うことができる。好ましい実施態様では、濃縮工程は約４０〜７０℃、より好ましくは約４５〜５５℃の温度で行われる。濃縮工程は具体的には醗酵ブロス中の固体含有量が少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約４５％で行われる。
濃縮後に、醗酵ブロスを冷却する。この様な冷却は受動的、すなわち単にブロスを放置して室温にするか、または凍結乾燥器、スプレー冷却器、噴射造粒器、フレーカー、および冷却ジャケットを備えたブレンダーまたはエクストルーダーの使用等、積極的であっても良い。濃縮ブロスの冷却工程のみで、Ｎ−アセチルグルコサミン含有固体の回収には充分である。例えば、醗酵ブロスを約−５〜４５℃、約−５℃〜室温、または室温に冷却することができる。
醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミン含有固体の回収には、醗酵ブロスにＮ−アセチルグルコサミンの結晶を接種し、添加した結晶の清澄で回収を促進することができる。結晶は醗酵ブロス中の核形成、または外部からＮ−アセチルグルコサミン結晶を添加することで提供される。最初に過飽和溶液を活性状態にさせて核が形成するまで醗酵ブロスを濃縮および／または冷却するが、その後はそれ以上の核形成を避け既存の結晶の成長を促進するため徐々に冷却する。または、任意の方法で生成したＮ−アセチルグルコサミン結晶を種結晶として醗酵ブロス中に導入する。
醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンの回収は、ブロス中のＮ−アセチルグルコサミンを水混和性溶剤と接触させることで促進される。Ｎ−アセチルグルコサミンはイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、エタノール、メタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびアセトニトリル等の水混和性溶剤に極めて溶けにくいことが見出されている。従って、この様な水混和性溶剤をブロス中に導入することにより、Ｎ−アセチルグルコサミンがより溶け難くなり、さらに回収される。
本発明の回収プロセスを醗酵ブロスのバッチまたは連続結晶化として行うことができる。濃縮プロセス中に生成した結晶をフィルターまたは遠心機で連続的に収穫し、母液をさらに濃縮するため再循環するか、または固体レベルが結晶の除去を要求するまで結晶を母液中に蓄積することができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン固体の回収後、固体を遠心分離または濾過等により醗酵ブロスから分離する。得られた固体ケーキを、真空乾燥等の公知の任意の様々な技術で乾燥するが、分解と着色を防止するためこの様な工程を低温で行うことが好ましい。最終乾燥製品は典型的には乾燥固体の少なくとも５０％、より好ましくは乾燥固体の少なくとも７０％、より好ましくは乾燥固体の少なくとも８５％である。乾燥前に、回収した固体を上記の様な水混和性溶剤で洗浄することもできる。この様な洗浄工程により、製品が安定化する、例えば着色を防止する。
別な実施態様では、固体を溶解し、第二回収工程で回収することにより、回収されたＮ−アセチルグルコサミン含有固体がさらに精製される。第二回収工程には任意の上記回収工程が含まれる。回収の第二サイクルの必要性は、最終製品の所定の純度と出発純度で決められる。
上記の様々な回収プロセスを用いて、高純度のＮ−アセチルグルコサミンが得られる。特に、本発明のプロセスは少なくとも約７０％純度、より好ましくは少なくとも約９０％純度、より好ましくは少なくとも約９９％純度のＮ−アセチルグルコサミンを生産し得る。
様々な回収プロセスの実施態様が好ましい。例えば、細胞を含まないブロスをそれ以上イオン除去せずに、活性炭による脱色、エネルギー効率のために多段である真空蒸留器中で乾燥固体約４５％以上へ濃縮（例えば好ましい条件は約６００ｍｍＨｇで液体温度４５〜５５℃）、暖めた濃縮液にＮ−アセチルグルコサミンの接種および攪拌しながら冷却により、固体Ｎ−アセチルグルコサミンを製造するために用いることができる。冷却したブロスを濾過または遠心分離し、固体ケーキを取り出す。回収された固体を真空乾燥し、純Ｎ−アセチルグルコサミンまたはグルコサミン塩製造の中間体として使用する。Ｎ−アセチルグルコサミン純度が８７％以上である場合、一回の結晶化のみで純粋なＮ−アセチルグルコサミンを製造することができる。母液から接種、冷却および固体回収の代わりに、過飽和ストリームを冷却で強制的に固化することもできる。適当な冷却装置には凍結乾燥器、スプレー冷却器、噴射造粒器、フレーカー、および冷却ジャケットを備えたブレンダーまたはエクストルーダーが含まれる。得られた固体はさらに乾燥される。
他の好ましい回収の実施態様では、回収されたＮ−アセチルグルコサミンを前もって乾燥することなく水に溶解し、第二サイクル、すなわち濃縮、接種、冷却および固体採集が行われる。採集した固体を水混和性溶剤で洗浄し、真空で乾燥する。２回の結晶化の必要性は、Ｎ−アセチルグルコサミンの最初の純度で決められる。乾燥固体の割合としての純度が８７％以上である場合、１回の結晶化が必要である。純度が７０％である場合、２回の結晶化が必要である。
他の好ましい回収の実施態様は、脱色および７０℃に達する温度で濃縮された材料を用いる、または部分的に精製された材料を７０℃で溶解し室温に冷却することによる一回の結晶化で純Ｎ−アセチルグルコサミンの生成である。回収された固体を水混和性溶剤で洗浄し乾燥する。
他の好ましい回収の実施態様では、脱塩した細胞除去ブロスを、陽イオン交換樹脂を含むクロマトグラフィー媒体を用いる擬似移動床クロマトグラフィーシステム上の分離でさらに精製する。９８％純度ストリームが一度得られると、真空濃縮により以下に記載の安定化処理のための材料が調製される。
他の好ましい回収の実施態様では、１０５℃での乾燥による分解による重量減少が１％以下である、高純度と色安定性を有するＮ−アセチルグルコサミンの高度回収を行うため、水混和性溶剤が使用される。例えば脱色と脱塩で達成した比較的高純度のＮ−アセチルグルコサミンから出発して、水を真空濃縮で除去し、次いで水可溶性溶剤を添加してさらに純粋な製品を沈殿させることが可能である。沈殿製品を含水水混和性溶剤で処理するプロセスにより次の乾燥工程を促進し、残存する水による分解反応促進を防止する。
本発明の他の実施態様はＮ−アセチルグルコサミンからグルコサミンの製造法に関する。Ｎ−アセチルグルコサミンを加水分解して、最終製品としてのグルコサミンを製造することができる。醗酵槽から最初に単離せず、醗酵ブロス中に生成したＮ−アセチルグルコサミンを用いて加水分解を行うことができる。または、上記の任意の方法を用いて回収されたＮ−アセチルグルコサミン等、醗酵ブロスから単離された後のＮ−アセチルグルコサミンで加水分解を行うこともできる。さらに、本発明の方法において任意に入手できるＮ−アセチルグルコサミン原料を使用することもできる。本発明の前は、有機アセチル化剤を用いるか、またはグルコサミンをキチンから製造するために伝統的に用いられた酸加水分解と平行し、キチンから直接Ｎ−アセチルグルコサミンを酵素により加水分解してＮ−アセチルグルコサミンはグルコサミンのアセチル化で製造されていた。従って、Ｎ−アセチルグルコサミンから最終製品としてのグルコサミンを製造するための逆反応の必要はなかった。
従って、本明細書に記載のＮ−アセチルグルコサミン原料とは純粋なＮ−アセチルグルコサミン原料である必要はなく、グルコサミンへ変換するための一定量のＮ−アセチルグルコサミンを含む任意の原料（固体または溶液）である。上記の醗酵プロセスで製造され、上記に詳細に述べた様に醗酵ブロスから回収されたＮ−アセチルグルコサミンからグルコサミン塩酸塩を製造するか、細胞物質が除去されているが、残留する色またはイオン性成分は除去されていない醗酵槽濃縮物として、醗酵で直接製造されたＮ−アセチルグルコサミンをプロセスに使用することができる。また、キチンの酵素化水分解等他の方法で製造したＮ−アセチルグルコサミンを含む他の任意の適当Ｎ−アセチルグルコサミン原料も本発明の方法に使用できる。好ましい実施態様では、グルコサミン塩酸塩が、原料内の全固体の割合として少なくとも３０％のＮ−アセチルグルコサミンを含むＮ−アセチルグルコサミン原料から製造され、原料内の全固体の割合としてその原料はより好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のＮ−アセチルグルコサミンを含む。一般に、約１％〜１００％の全整数の範囲（即ち１％、２％、３％、．．．９８％、９９％、１００％）の任意の割合のＮ−アセチルグルコサミンを含む原料からグルコサミン塩酸塩が生産される。Ｎ−アセチルグルコサミンは固体または水溶液として、またはエタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールまたはｓｅｃ−ブタノールを含むがそれに限定されない水性低沸点第一または第二アルコール溶液として反応に使用される。好ましい実施態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン原料は原料内の全乾燥固体の割合として少なくとも約４０％のＮ−アセチルグルコサミンを含む。
ある実施態様では、グルコサミン塩酸塩を酸と加熱条件下の加水分解を用いてＮ−アセチルグルコサミンから製造できる。酸加水分解は、当該分野で公知である。本発明では、この化学反応がＮ−アセチルグルコサミンからグルコサミン塩酸塩への変換に特に適用される。加水分解反応により１モルの酢酸が放出され、グルコサミン塩酸塩に変換されるＮ−アセチルグルコサミン１モル毎に１モルの塩酸と水が消費される。水、塩酸およびＮ−アセチルグルコサミンの多くの組み合わせで反応が良好に行われ、従って無水塩酸、乾燥Ｎ−アセチルグルコサミンおよび水を反応試薬として用いるか、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび塩酸の一方または双方で水を持ち込むことも可能である。反応は過剰の水と塩酸で行われる。重要なパラメーターは反応時間と温度、および残留塩酸濃度である。変換が完了後に反応液が冷却され、過剰塩酸の残留濃度と終了温度によりグルコサミン塩酸塩生成物の溶解度が決められる。溶解度が大きすぎるとグルコサミン塩酸塩の１サイクル当たりの回収と収率が減少する。グルコサミンが分解し、分解に伴う反応が生じる。反応速度は温度、溶液中のＮ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンの濃度、および溶液中の塩酸濃度と関連する。有利な条件には６０〜１００℃の温度が含まれ、７０〜９０℃の温度がより好ましい。塩酸溶液とＮ−アセチルグルコサミン固体の許容範囲は重量比で１：１〜５：１であり、３：１が好ましく２．５：１がより好ましい。塩酸溶液の許容濃度範囲は１０〜４０％ｗ／ｗであり、より好ましくは約１０〜３７％ｗ／ｗである。希釈熱を制御し、Ｎ−アセチルグルコサミンを完全に溶解する適切な溶液となるならば、塩酸水溶液を無水塩酸で置換することが可能である。添加の順番と添加の温度は、組み合わせが適切ならばあまり重要でない。反応を行う時間は反応温度と酸濃度で変わり、高温の濃い酸で１０分、低温で希釈濃度で３時間以上（例えば２４時間まで）の範囲である。グルコサミン塩酸塩を沈殿させるため、溶液を４℃に冷却する。より高い温度またはより低い温度（例えば約−５〜４０℃の間の任意の温度）も可能であるが、商業的に便利な条件での加水分解で残存グルコサミンを最小にするために、４℃が便利な温度として選ばれた。より不純な、すなわちグルコサミン塩酸塩の相対的乾燥固体組成がより低い加水分解溶液では、加水分解溶液を飽和に戻すためにはより低い冷却温度と、最終温度により長時間保持することが必要である。溶液の攪拌を和らげても、結晶化プロセスに加えられた障害は克服できない。
加水分解反応は過剰の塩酸で行われるので、冷却とグルコサミン塩酸塩除去プロセス後の加水分解溶液は加水分解に再度使用し得る。各加水分解サイクルで酢酸副生物の濃度が増加し反応物である塩酸が消費されるので、加水分解溶液の活性が低下し、反応が完結するのにより長い時間が必要になる。この反応物を再構成するためには塩化水素を供給して補給することが可能であるが、各反応サイクルからの生成物である酢酸の増加のため、単純な加水分解物リサイクルの障害が増加する。これは加水分解工程の前、工程中または工程後に第一または第二アルコールを添加して酢酸をエステル化することにより克服できる。酢酸はアルコールとエステルを形成し、Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解前、加水分解中または加水分解後に蒸留、フラッシングまたは真空蒸発で除去できる。
Ｎ−アセチルグルコサミンを、それが溶解する、または溶解されたままであることを保証するため、再循環加水分解母液と連続的に混合することができる。次いで、交換用無水塩酸を添加し、それにより溶液温度を上昇させて加水分解反応を開始し、グルコサミン塩酸塩の溶解度を最小にする妥当な残硫酸濃度を維持する。圧力を大気圧以上に維持し、反応器滞在時間が最小となる高温が選ばれる。Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミン塩酸塩に完全に転換後、反応溶液を冷却し、グルコサミン塩酸塩が濾過または遠心分離で回収される。目的の温度である約４℃に達するまで濾液または濃縮液を冷却器を通して再循環し、グルコサミン塩酸塩の大部分を回収する。遠心分離液または濾液を再使用のため再循環する。反応ロスとなる適量の水がＮ−アセチルグルコサミンで生じる。母液の連続パージ、残留塩酸をパージストリームから分離し次に再使用のために戻すこと、および酢酸を第一または第二アルコールでエステル化しエステルとして蒸発させることにより、酢酸等の反応副生物の蓄積が除去される。
本明細書に記載の加水分解プロセスからのグルコサミン回収の詳細は、Ｎ−アセチルグルコサミンに対する上記内容と類似しており、グルコサミンの回収に対しても本明細書で採用される。グルコサミン回収の好ましい態様は以下の実施例の項で議論される。
次いで濾過または遠心分離によりグルコサミン塩の固体が回収できる。回収されたモル収率はＮ−アセチルグルコサミンに対して５０〜９０％である。アルコール洗浄および乾燥後のグルコサミン純度は９６〜１００％の範囲である。遠心機またはフィルターから回収された湿潤ケーキをアルコールで洗浄して、生成物が乾燥中に塊を形成する傾向を最小にする。次いで乾燥原料が製品使用に合致するまで、生成物を真空乾燥機またはＷｙｓｓｍｏｎｔ型乾燥機中で真空で乾燥する。
洗浄または未洗浄の回収Ｎ−アセチルグルコサミン加水分解濾過または遠心分離ケーキで解することも可能である。攪拌しながら室温で約２５％（ｗ）濃度にケーキを水に溶解する。水酸化ナトリウムまたはカリウム等の塩基を加えてｐＨ２．５〜４の間にする。ｐＨ調整後、完全に溶解した溶液を活性炭で処理する。例えばバッチ法では、グルコサミン１ｇ当たり０．０２ｇのＤａｒｃｏＧ−６０またはその等価活性炭を加え、最低３０分間混合する。混合物を濾過して活性炭を除く。活性炭を再結晶するグルコサミン塩酸塩と等量の水で濯ぎ粗いし、活性炭と濾過装置に吸収されたグルコサミン塩酸塩を溶出する。または、溶液を活性炭顆粒の充填ベッドに通し、次いで使用済み活性炭の再生または廃棄の前に吸収されたグルコサミン塩酸塩を回収する溶離工程を行う。
透明な溶液を真空下で攪拌して５０℃に加熱する。５０〜６０ｃｍＨｇの真空が使用される。蒸発で約半分の容積を除去し、濾過、遠心分離または他の適当な手段で固体を取り出し、結晶化したグルコサミン塩酸塩を回収する。残りの溶液がさらに回収するため戻される。固体を集め、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドまたはジオキサンを含むがそれに限定されない水混和性溶剤で洗浄し、乾燥する。
一回使用した加水分解液から結晶化する場合、固体が目に見え、体積が出発体積の２０〜３０％程度と見積もられる点へ液体をさらに蒸発させる。液体沈殿剤として等容積の水混和性溶剤を加え、残った溶液から固体を濾過、遠心分離または他の適当な手段で除去し結晶化したグルコサミン塩酸塩を回収する。次いで残りの溶液を例えば４℃に冷却し、濾過して残りのグルコサミン塩酸塩を回収する。
複数回使用した加水分解液から結晶化する場合、次のサイクルの活性炭処理加水分解液を現在のサイクルの回収溶液に加え、蒸発と固体回収で除かれた体積を再現する。次いで約半分の体積を蒸留で除去し、このサイクルを繰り返す。
再結晶グルコサミン塩酸塩の純度は過剰の酸の中和による塩の量と、第一の加水分解、結晶化工程から送られた他の不純物の量に依存する。回収されたグルコサミン塩酸塩が純度仕様に合致しなくなった場合、不純物の量は一回使用した加水分解液再結晶化工程を複数回使用した加水分解液の再結晶化に置き換えることで制御される。混和性溶剤沈殿中に回収された、得られたグルコサミン塩酸塩沈殿を再溶解し、その後の一連の再結晶化の一部に加えられる。
回収されたグルコサミン塩酸塩湿潤ケーキは、生成物が塊を形成し乾燥中に黒ずむ傾向を最小にするため、アルコールを含んでいる必要がある。湿潤ケーキは次に真空乾燥機またはＷｙｓｓｍｏｎｔ乾燥機中で乾燥減量が製品仕様に合致するまで乾燥される。
ある実施態様では、加水分解工程は（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン原料を塩酸溶液または再循環加水分解母液と加熱条件下に組み合わせて、グルコサミン塩酸塩を含む溶液を製造する工程；（ｂ）溶液（ａ）を冷却してグルコサミン塩酸塩を沈殿する工程；および（ｃ）溶液（ｂ）から沈殿したグルコサミン塩酸塩含有固体を回収する工程を含む。ある態様では、加水分解工程を、Ｎ−アセチルグルコサミン原料を塩酸溶液または再循環加水分解母液と連続的に混合し、Ｎ−アセチルグルコサミン原料を溶解液に保ち、次いで加熱条件下に無水塩酸を溶液（ａ）に添加し加水分解を開始し、Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミン塩酸塩に転換することにより加水分解工程が行われる。他の態様では、再循環加水分解母液は、工程（ｃ）の沈殿したグルコサミン塩酸塩を回収後に残る加水分解溶液であり、第一または第二アルコールが加水分解工程が行われる前、工程中または工程後に添加される。この態様では、冷却工程を約−５℃〜４０℃になるまで行うことができる。
回収工程は（ｉ）沈殿したグルコサミン塩酸塩含有固体を採集する工程；（ｉｉ）グルコサミン塩酸塩含有固体を水混和性溶剤で洗浄する工程（メタノール、イソプロパノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびジオキサンを含むがそれに限定されない）；および（ｉｉｉ）グルコサミン塩酸塩含有固体を乾燥する工程を有する。
他の態様では、回収工程は（ｉ）沈殿したグルコサミン塩酸塩含有固体を採集する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）由来の固体を水に溶解し、溶液とする工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶液のｐＨを（例えば「塩基を加える、洗浄して酸を除く、イオン交換媒体を通過させる、またはその他の適当な方法により）２．５〜４の間に調節する工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の溶液を活性炭と接触させてグルコサミン塩酸塩含有固体を脱色する工程；（ｖ）活性炭を工程（ｉｖ）の溶液から除去する工程；および（ｖｉ）工程（ｖ）由来の溶液よりグルコサミン塩酸塩を結晶化する工程を含み得る。この態様では、結晶化工程にはグルコサミン塩酸塩を約７０℃以下の温度、より好ましくは約５０℃以下の温度で濃縮する工程が含まれる。ある態様では、結晶化工程には大気圧以下でグルコサミン塩酸塩を濃縮する工程が含まれる。他の態様では、そのプロセスはさらに結晶化工程（ｖｉ）後に残る溶液を次の回収プロセスの工程（ｉ）、または結晶化の次の工程（すなわち再結晶）へ再循環する工程を含む。
他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン原料を水性低沸点第一または第二アルコール中に懸濁した場合、加水分解法には溶液を冷却する前に、加水分解後に、または加水分解溶液を再使用のため再循環する前に、アルコールで生成した酢酸エステルを除去する別な工程が含まれる。酢酸エステルは蒸留、フラッシング、および大気圧以下で濃縮を含むがそれに限定されないプロセスで除去される。この実施態様では、加水分解工程は約６０〜１００℃の温度、好ましくは１気圧での溶液の沸点で行われる。
他の態様では、加水分解が比較的高い酸対Ｎ−アセチルグルコサミン比（例えば約３：１〜５：１）および比較的低温（例えば約８０℃以下）で行われる場合、製造されたグルコサミンの結晶の品質は十分に高く、グルコサミンの再結晶の必要はない。この実施態様では、一回の結晶化工程の後に先に述べた様な水混和性溶剤中での洗浄、および上記の様な乾燥工程が行われる。
実際、本明細書に記載の任意の加水分解および回収法には、先に述べた様に工程（ｖｉ）由来の再結晶グルコサミン塩酸塩を水混和性溶剤で洗浄し、その後乾燥する工程がさらに含まれる。ある態様では、結晶化グルコサミン塩酸塩が７０℃以下の温度で６時間以下乾燥され、他の実施態様では、５０℃以下の温度で３時間以下乾燥される。乾燥工程を真空の有無、および空気または不活性ガス吹き付けの有無で行われる。
Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミンへ転換する他の方法は、酵素加水分解法を用いることである。醗酵ブロス中のＮ−アセチルグルコサミン、またはその回収後の酵素プロセスが実施例の項に記載される。３つのタイプの酵素が候補である：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミンデアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．３３）およびキチンデアシラーゼ。
Ｆｕｊｉｓｈｉｍａらが報告したデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼであると同定された（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）。それらの酵素のＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐとの親和性と効力はＮ−アセチルグルコサミンよりはるかに高かった。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたＮ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミンには作用しなかった。
酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）の、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンマンノサミンおよびノイラミン酸の細胞代謝における必要な過程である、酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）の、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐへ変換する役割は公知である。組み換えＥ．ｃｏｌｉＮａｇＡタンパク質等のこの酵素は通常、非燐酸化Ｎ−アセチルグルコサミンでは活性でない。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼをコードするＤＮＡ配列（ＮａｇＡ遺伝子）が多くの異なった生物で決定された。Ｎ−アセチルグルコサミンにのみ活性である（従ってＮａｇＡとは異なる）デアセチラーゼが存在するかどうかは知られていない。
キチンデアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．４１）はキチン内のＮ−アセチルグルコサミンユニットの脱アセチル化を触媒し、キトサンとする。キチンデアセチラーゼ活性は、基質としてＮ−アセチルグルコサミン基に放射線標識したグリコールキチン（部分Ｏ−ヒドロキシエチル化キチン）を用いて測定される。この酵素は微結晶キチンおよびカルボキシメチルキチン（可溶性誘導体）にも作用する。しかしながら、Ｍｕｃｏｒｒｏｕｘｉｉ由来のキチンデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミンモノマーまたは２〜３個のオリゴマーを脱アセチル化しないことが報告された（ＡｒａｋｉおよびＩｔｏ、１９７５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：７１−７８、その全文を本明細書に参考として援用する）。通常のキチンデアセチラーゼがグルコサミンモノマーを脱アセチル化するという事実はないが、この様な活性を有するキチンデアセチラーゼの変異体が自然から単離されるか、インビトロで創出し得ると思われる。
いくつかのアセチルトランスフェラーゼはアセチル基を基質から除去し、別な基質へ転移させる（Ｋｏｎｅｃｎｙら）。この様な酵素がＮ−アセチルグルコサミンを脱アセチルグルコサミン化し得ることは示されていないが、この様な活性を有するキチンデアセチラーゼの変異体が自然から単離されるか、インビトロで創出し得ると思われる。
Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を、天然型アシルトランスフェラーゼを有する生物、または組み換えアシルトランスフェラーゼを有する生物中に含まれるか、そこから単離されたからアシルトランスフェラーゼで行うことができた。組み換えアシルトランスフェラーゼを無秩序または指向性突然変異誘発および／またはタンパク質遺伝子工学で改良することができた。
アシルトランスフェラーゼまたはデアセチラーゼ技術をＮ−アセチルグルコサミンのグルコサミンへの変換に応用する場合、特に外部が窒素原子をプロトン化する低いｐＨ環境である場合、グルコサミンの溶液中における周知の不安定性のため、様々な機構により生成物が分解する可能性がある。
単にｐＨを下げることは酸加水分解には適当であるが、酵素触媒には問題である。無緩衝または非中性ｐＨに晒された場合、酵素はより変性し易くなる。その上、高い塩負荷が酵素変性と関連することが多い。
従って、酵素の立体配座を固定し、高いイオン濃度に晒される機会を減少し、高価な酵素の消耗を減らす公知の酵素固定化技術（下記）を採用することが提案される。さらに、酢酸ナトリウム、酢酸カルシウム、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウム等の他の塩に比べて、グルコサミン塩酸塩の比較的低い溶解度を利用することが提案されている。
適当な酵素を塩化ナトリウムまたはカルシウム水溶液とＮ−アセチルグルコサミンに接触させることにより、平衡反応が進行し、酵素に対してｐＨ緩衝剤となる溶解度の高い酢酸ナトリウムまたはカルシウムが生成する。その反応はまた、比較的不溶性であるが安定なグルコサミン塩酸塩を生成し、蒸発濃縮または液体沈殿剤の使用により溶液から結晶化または沈殿する。グルコサミンが溶液から分離すると平衡反応が進み、さらにＮ−アセチルグルコサミンが消費される。残りの母液は残留するグルコサミン塩酸塩、酢酸ナトリウムまたはカルシウム、塩化ナトリウムまたはカルシウム、および少量の未反応Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。この母液を液体沈殿剤としてのアルコールで処理すると、可溶性の酢酸ナトリウムまたはカルシウムとより不溶性のグルコサミン塩酸塩、塩化ナトリウムまたはカルシウム、およびＮ−アセチルグルコサミンが分離され、Ｎ−アセチルグルコサミンは酵素変換プロセスの最初に再循環される。
Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミン塩酸塩へ変換するまた別なアプローチは、アセチル基をＮ−アセチルグルコサミンから添加したアルコールへ転移してアルコールをエステル化するために酵素触媒を使用することである。加水分解中に生成したエステルを除去すると、反応が先に進んでＮ−アセチルグルコサミンを消費し、グルコサミン遊離塩基を生成する。
酵素加水分解で生成したグルコサミン遊離塩基を、塩化物溶液、例えば塩化ナトリウムとの混合物として水素型の陽イオン交換樹脂を通過させることにより安定化することができる。塩の陽イオンが水素イオンと交換され、安定なグルコサミン塩酸塩が形成され、イオン交換樹脂は塩の陽イオンを保持する。この方法では、燐酸塩、硫酸塩、沃素塩および亜硫酸塩を含むがそれに制限されない様々な選択された塩がグルコサミン遊離塩基と混合され、陽イオン交換樹脂カラムを通過させると、（グルコサミン）２硫酸塩−（ＮａＣｌ）２、（グルコサミン）２硫酸塩−（ＫＣｌ）２、（グルコサミン）２硫酸塩、グルコサミン塩酸塩、グルコサミンヨウ素酸塩、グルコサミン燐酸塩、（グルコサミン）２亜硫酸カリウム−（ＨＣｌ）２、および（グルコサミン）２亜硫酸ナトリウム−（ＨＣｌ）２を含む公知の安定な酸の塩に変換される。
従って、ある実施態様では、上記の組み替え脱アセチルグルコサミン化酵素が固体支持体に結合し、固定化酵素となる。本明細書で用いる固体支持体に結合した酵素（すなわちデアシラーゼ）には固定化単離酵素、組み替え酵素等の酵素を含む固定化細胞（固定化バクテリア、菌類（例えば酵母）、藻類、昆虫、植物または哺乳動物細胞を含む）、安定化完全細胞および安定化細胞／細胞ホモジェネートが含まれる。安定化非損傷細胞および安定化細胞／細胞ホモジェネートには、その酵素を発現する天然起原微生物、または遺伝子修飾微生物由来の細胞とホモジェネート、遺伝子修飾によりその酵素を発現する、本明細書で開示された昆虫または哺乳動物細胞が含まれる。従って、酵素を固定化する方法は下記に議論されるが、この様な方法はバクテリアおよびその他の細胞、および細胞を溶菌する実施態様でも応用できる。
酵素を固定化する様々な方法は、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第二版、Ｇｏｄｆｒｅｙ、Ｔ．およびＷｅｓｔ、Ｓ．編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈ．Ｙ．、１９６６、ｐ２６７−２７２；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ、Ｃｈｉｂａｔａ、Ｉ．編、ｈａｌｓｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９７８；Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｓｋｉｎ、Ａ．編、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｉｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９８５；およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏ．４、Ｃｈｉｂａｔａ、Ｉ．およびＷｉｎｇａｒｄ、Ｊｒ．Ｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８３に開示され、その全文を本明細書に引用して援用する。
簡単に言えば、固体支持体とは、単離された酵素の活性に影響せず、酵素と結合を形成し得る任意の有機支持体、人工膜、バイオポリマー支持体または無機支持体を言う。有機固体支持体の例にはポリエステル、ナイロン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、アクリル共重合体（例えばポリアクリルアミド）、安定化完全全細胞および安定化粗全細胞／膜ホモジェネートが含まれる。バイオポリマーの例にはセルロース、ポリデキストラン（例えばセファデックス（登録商標））、アガロース、コラーゲンおよびキチンが含まれる。無機支持体の例にはガラスビーズ（多孔性および非多孔性）、ステンレススチール、金属酸化物（例えばＺｒＯ２、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３およびＮｉＯ等の多孔性セラミック）、および砂が含まれる。固体支持体は安定化完全細胞および／または粗細胞ホモジェネートから選ばれることが好ましい。この様な支持体の調製には最小の手間と費用しか必要でない。さらに、この様な支持体は酵素の安定化に優れる。
吸着、架橋（共有結合を含む）および包含を含む様々な方法で酵素を固体支持体に結合できる。吸着はファンデルワールス力、水素結合、イオン結合または疎水性結合で行われる。吸着固定化のための固体支持体の例にはポリマー吸着体およびイオン交換樹脂が含まれる。ベッド型の固体支持体が特に適している。吸着固体支持体の粒径を、固定化酵素がメッシュフィルター中に保持され、基質（例えばオイル）が所望の速度でリアクターを通って流れる様に選ぶことができる。多孔性粒子支持体では、酵素またはバクテリア細胞が粒子の空洞中に包含され、活性を失うことなく保護できる様に吸着プロセスを制御することができる。
本明細書に引用された各文献および参考資料は、その全文が援用される。
以下の実験結果は説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
以下は本明細書で参照および／または記載した様々な遺伝子修飾微生物のリストである。これらの株のいくつかは米国特許第６，３７２，４５７号（前出）に記載され、本明細書に具体的に記載した遺伝子修飾のための親株として用いられた。
（Ｅ．ｃｏｌｉ株）
Figure 2013009690
Figure 2013009690
注：
１）表に列記した全ての株は同じ親株Ｗ３１１０由来である。
２）表に列記した株の大部分は７１０７―１８株から開発され（ＴｅｔＲ：：ｎａｇ ｍａｎＸＹＺ ＤＥ３ Ｔ７−ｇｌｍＳ＊５４：：ｇａｌｋ）、簡単にするため、これらの株の遺伝子型が７１０７−１８＋新規変化として列記される。
３）Ｅ．ｃｏｌｉ以外の種由来の遺伝子は２個の文字で同定される。Ｓｃ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｃａ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｔ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｂｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ。
４）遺伝子組み込みのため、他に指示されていなければ挿入された発現カセットは標的部位の遺伝子またはオペロンと同じ配向である。
（実施例１）
以下の実施例はより良いグルコサミン生産菌のための突然変異体スクリーニングを説明する。
その全文を本明細書に引用して援用される米国特許第６，３７２，４５７号は、グルコサミンを生産する組み替えＥ．ｃｏｌｉ株を記載している。これらの株は代謝遺伝子工学アプローチを用いて構成された。このアプローチは３つの工程で構成される。第一工程はグルコサミンとその６−燐酸誘導体の代謝と取り込みを制限する突然変異を導入することであった。第二工程は、生合成酵素の鍵である、グルコサミンシンターゼ（ＧｌｍＳ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ遺伝子を過剰発現することであった。第三工程は、ＧｌｍＳの生成物阻害を、酵素の試験管内突然変異誘発により最小にすることであった。組み替え株２１２３−５４は、Ｔ７プロモーターの制御下にある生成物耐性組み替えＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ突然変異遺伝子を含み、グルコースを補充した単純塩培地中の振盪フラスコ培養で高い生成物力価を示した。この株は、さらに改良するための新規株を評価する参照として用いられた。その株は、細胞生育とＩＰＴＧ誘起グルコサミン生産を改善するために設計された実験でも用いられた。
（ＩＰＴＧ誘導性グルコサミン生産株２１２３−５４の遺伝子型）
２１２３―５４はＷ３１１０で指定される実験室Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株から誘導された。関係する遺伝子型を表１に記す。
（表１．グルコサミン生産株２１２３−５４の遺伝子型）
Figure 2013009690
ｎａｇおよびｍａｎＸＹＺ突然変異はグルコサミン生産に正の効果を有し、新規生産株中に維持されることが示された。Ｔ７発現系を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ｇｌｍＳ遺伝子が過剰発現され、ＩＰＴＧ誘導を用いて数倍高いレベルのグルコサミン生産が得られた。Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ＧｌｍＳはその生成物であるグルコサミン−６−Ｐで強く阻害されるので、Ｅ．ｃｏｌｉｇｌｍＳ突然変異体のプールが易誤謬性ＰＣＲで作成され、プレートフィード分析でグルコサミン生産の増加がスクリーニングされた。改良されたグルコサミン生産株中のｇｌｍＳ＊突然変異体を発現する発現コンストラクトが、染色体中でｌａｃＺ部位に組み込まれ、安定な生産株を生成した。多くの突然変異株が、生成物耐性であるグルコサミンシンターゼを合成した。振盪フラスコ実験では、Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ｇｌｍＳ発現コンストラクトを有する株に比べて、これらの突然変異株は飛躍的に増加したレベルのグルコサミンを生産した。２１２３−５４株（Ｔ７−ｇｌｍＳ＊５４発現コンストラクトを有する）は１１ｇ／ｌ以上のグルコサミンを生産した。
（簡略化振盪フラスコスクリーニング法の開発）
米国特許第６，３７２，４５７号に記載される様に、異なったグルコサミン生産株を、振盪フラスコ培養によるグルコサミン生産のためにグルコース補充無機塩培地中で生育した。以前の実験では、グルコースと硫酸アンモニウムが欠乏するとそれらを培地に供給し、連続グルコサミン生産を行っていた。しかしながら、これは３日間の頻繁なモニタリングと供給（６〜８時間毎）が必要である。従って、より簡単であるが、異なったグルコサミン生産株の評価に信頼できる振盪フラスコ培養プロトコールを開発することが望まれた。
グルコサミン生産に使用された単純無機塩培地はＭ９Ａであった（表２）。株の評価のために３工程プロトコールが開発された。第一に、ＬＢプレート上に生育した新鮮な細胞を使用して３ｍｌのＬＢ中で培養を開始し、細胞を３７℃で約８時間生育させた。第二に、１．５ｍｌの培養液を用いて、２５０ｍｌの振盪フラスコ中の５０ｍｌのＭ９Ａ培地に接種し、培養液を３７℃でインキュベーションし、約１６時間（終夜）、２２５ｒｐｍで振盪した。培養液中の細胞濃度を６００ｎｍで測定した。この工程には細胞を最小培地に適応させることと、グルコサミン生産の再現性のある結果を得ることが含まれる。第三に、細胞の一部をＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）を含む振盪フラスコ中の５０ｍｌのＭ９Ａ培地に加えた。初期の細胞ＯＤは０．３であった。細胞を３７℃でインキュベーションし、２２５ｒｐｍで７２時間振盪した。試料（１ｍｌ）を２４、４８および／または７２時間に取り出し、培養ブロス中のグルコサミンレベルを測定した。２４時間および４８時間の時点で、少量のＮａＯＨを加えてｐＨを７．０に調節し、グルコースを２０ｇ／ｌで加えた。これらの条件下で、対照株２１２３−５４は約６ｇ／ｌのグルコサミンを７２時間の時点で生産した。
（表２．グルコサミン製造で使用したＭ９ＡおよびＭ９Ｂ＊）
Figure 2013009690
＊醗酵のために培地に消泡剤（Ｍａｚｕ２０４、０．２５ｍｌ／Ｌ）を添加する。
（振盪フラスコ実験における突然変異体スクリーニング：）
組み込みｇｌｍＳ突然変異コンストラクトを有する約１５０の組み替えＥ．ｃｏｌｉ株を最適化プロトコールを用いて再評価した。Ｅｈｒｌｉｃｈ試薬を用いる比色法によりグルコサミンを分析した。２１２３−７２および２１２３−１０３株はグルコサミンを２１２３−５４株より若干高いレベルでグルコサミンを生産した（表３）。
（表３．振盪フラスコ培養におけるＩＰＴＧ誘導グルコサミン生産）
Figure 2013009690
＊括弧内に示した割合は、異なった時点における２１２３−５４株に対する相対値である。
（１リッター醗酵槽中の高グルコサミン生産２１２３−７２および２１２３−１０３株の評価）
潜在的に優れたグルコサミン生産株２１２３−７２および２１２３−１０３を１リッター醗酵槽中で２１２３−５４株と比較した。消泡剤（０．２５ｍｌ／ＬのＭａｚｕ２０４）と微量元素（表４）を添加した初期容積４７５ｍｌのＭ９Ａ培地を醗酵槽に入れた。ｐＨを６．９に制御するため、７５％ＮＨ４ＯＨを用いて醗酵槽を運転した。醗酵中、温度を３０℃に保った。晒気と攪拌を調節した溶存酸素濃度を２０％飽和とした。コンピュータープログラムで制御して６５％グルコースを培地へ供給し、接種時に生育速度０．４０／時間、６時間で最高速度５ｍｌ／時間とした。醗酵はｐＨ、酸素およびグルコース濃度を正確に制御して行った。フラスコ中より醗酵槽でより高いグルコサミン濃度が得られた。
各株の２セットを二つの異なった条件下で培養した。1セットの醗酵槽を低濃度グルコ
ース濃度で（１０ｇ／ｌ、グルコース制限）、他のセットをより高いグルコース濃度（４０ｇ／ｌ、過剰発現グルコース）で開始した。過剰グルコース条件は振盪フラスコ生育条件により似ている。通常はグルコース制限条件を醗酵実験に使用し、２１２３−５４株では一般により高いグルコサミンの生産が得られた。醗酵の開始から、培養は全てＩＰＴＧで誘導された。グルコース制限および過剰条件の何れでも、２１２３−７２および２１２３−１０３株の双方とも２１２３−５４株より成績が良く、２１２３−５４株での１０ｇ／ｌまでのグルコサミン生産（データは示されない）と比較して５０時間で１４ｇ／ｌまでのグルコサミンを生産した。
（表４．いくつかの実験で使用された、生育培地に添加された微量元素）
Figure 2013009690
（実施例２）
以下の実施例は、グルコサミン生産のための過剰発現された異なったｇｌｍＳ遺伝子を説明する。
バクテリアグルコサミンシンターゼ遺伝子（ｇｌｍＳ）および酵母ホモログ（ＧＦＡ遺伝子）をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させてグルコサミン代謝経路の遺伝子工学におけるその有用性を示した。異なった遺伝子をＰＣＲでＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓから増幅し、発現ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）中のＴ７プロモーターの制御下に置いた。コンストラクトをＥ．ｃｏｌｉ株７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換し、自由に複製するプラスミドとして維持した。さらに、Ｔ７プロモーターで駆動するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１遺伝子を７１０１−１７（ＤＥ３）株中の染色体中のｌａｃＺ部位に組み込んだ。異なったｇｌｍＳおよびＧＦＡ遺伝子の宿主である株の遺伝子発現と、ＩＰＴＧ誘導を用いるグルコサミン生産を評価した。
（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子のクローニング）
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子は１８０３ｂｐのオペロン読み取り枠を含み、約６５ｋＤａのタンパク質（５９９残基、細胞内で通常除去されるイニシエーターメチオニンを除く）をコードする。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ開放読み取り枠のヌクレオチド配列は配列番号１５に列記されている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＧｌｍＳタンパク質の推定アミノ酸配列は配列番号１６に列記されている。ｇｌｍＳ遺伝子はＡＴＣＣ２３８５６およびＡＴＣＣ２３８５７株よりＰＣＲで増幅された。前方プライマーはＡＴＧ開始コドンとＢｓａＩ部位（配列番号２１）：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＧＡ ＡＴＣ ＧＴＡ ＧＧＴ ＴＡＴ ＡＴＣ ＧＧＴ Ｃ−３’を含んでいた。逆方向プライマーは停止コドンとＸｈｏＩ部位（配列番号２２）：５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＣＡ ＣＡＧ ＴＡＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＴＣＧ ＣＡＡ ＧＧＴ ＴＡＣ Ｇ−３を含んでいた。
期待するサイズのＰＣＲ生成物をｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中にライゲートした。そのベクターを酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化した。組み換えプラスミドｐＳＷ０７−１５＃８３を制限酵素分析で確認し、７１０７−１７（ＤＥ３）中に形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７−２４（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ２３８５６由来のｇｌｍＳ遺伝子）と７１０７−２５（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ２３８５７由来のｇｌｍＳ遺伝子）を作成した。対照として、空のベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）も７１０７−１７（ＤＥ３）中に形質転換し、７１０２−２２株を作成した。
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＦＡ１遺伝子のクローニング：）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＦＡ１読み取り開放枠は２１５４ｂｐを有し、７１６残基のペプチドをコードする（イニシエーターであるメチオニンを除く）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＦＡ１読み取り開放枠は配列番号１７に列記されている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＦＡ１タンパク質の推定アミノ酸配列は配列番号１８に列記されている。配列から予想されるタンパク質のサイズは約８０ｋＤａである。ＧＦＡ１遺伝子配列にはイントロンが存在しないので、遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２０４５０８）から調製したゲノムＤＮＡから増幅した。
ＡＴＧ開始コドンおよびＢｓａＩ部位を含む前方プライマーは以下の配列（配列番号２３）を有した：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＧＴ ＴＡＣ−３’。停止コドンとＥｃｏＲＩ部位を含む逆方向プライマーは以下の配列（配列番号２４）を有した：５’−ＧＡＴ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＴＴ ＡＴＴ ＣＧＡ ＣＧＧ ＴＡＡ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＡＧ−３’。
約２．２ｋｂのＰＣＲ生成物をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）中へクローニングした。組み替えプラスミドを制限酵素消化で確認した。ＥｃｏＲ１およびＢｓａＩで消化してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＧＡ１フラグメントを単離し、ｐＥＴ２４ｄ（＋）のＥｃｏＲおよびＮｃｏＩ部位へライゲートした。この組み替えプラスミドを制限酵素解析で確認し、７１０１−１７（ＤＥ３）中へ形質転換してＥ．ｃｏｌｉ株７１０７−１０１を作成した。
（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１のクローニング）
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１遺伝子にはイントロンがなく、その２１４２ｂｐの読み取り開放枠は約８０ｋＤａ（７１２残基、イニシエーターであるメチオニンを除く）のペプチドをコードする。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１読み取り開放枠のヌクレオチド配列は配列番号１９中に列記される。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１タンパク質の推定アミノ酸配列は配列番号２０に列記される。ＧＦＡ１コード配列をＡＴＣＣ１０２６１株から、前方プライマーおよび逆方向プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。前方プライマーはＡＴＧ開始コドンとＢｓａＩ部位：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＴＡＣ ＧＴＣ−３’（配列番号２５）を含んでいた。逆方向プライマーは停止コドンとＸｈｏＩ部位：５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＴＡＡ ＣＴＧ ＡＴＴ ＴＡＧ ＣＣ−３’（配列番号２６）を含んでいた。
ＰＣＲ生成物をベクターｐＭＯＳＢｌｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）中にクローニングし、組み替えプラスミドを制限酵素消化で確認した。ＢｓａＩ−Ｘｈｏフラグメントを単離し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化して調製したｐＥＴ２４ｄ（＋）中にライゲートした。得られたプラスミドを宿主７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７−２３を作成した。
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１遺伝子も発現ベクターｐＥＴ２３（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）中へクローニングした。ｐＥＴ２４（＋）と異なり、このベクターはｌａｃオペレーター配列をＴ７プロモーターの下流に含んでいなかった。ｌａｃオペレーターがないため、組み替え遺伝子レベルが高くなった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１コード配列を酵母ゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。前方プライマーはＡＴＧ開始コドンとＮｄｅＩ部位：５’−ＧＣＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＴＡＣ ＧＴ−３’（配列番号２７）を含んでいた。逆方向プライマーはＢａｍＨＩ部位：５’−ＧＣＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＣＴＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＡＡＣ ＴＧＡ ＴＴＴ ＡＧＣ ＣＡ−３’（配列番号２８）を含んでいた。正しいサイズのＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位のｐＥＴ２３ｂ中にライゲートした。組み替えプラスミドを制限酵素分析で確認し、発現宿主７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換してＥ．ｃｏｌｉ株７１０７−５８と７１０７−５９を作成した。対照として空のベクターｐＥＴ２３ｂを７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換して株７１０７−５７を作成した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＴ発現系を用いるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓタンパク質の過剰発現は、先の文献に記載されている（Ｐ．Ｓａｃｈａｄｙｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１９、３４３−３４９、２０００）。しかしながら、グルコサミンの生産は全く示されず、議論されてもいない。さらに、報告されたＦＧＡ１遺伝子はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株（ＡＴＣＣ１３１５３）からクローニングされた。２つのＦＧＡ１タンパク質は同じアミノ酸配列を有するが、ＡＴＣＣ１３１５３由来のＦＧＡ１遺伝子はＡＴＣＣ１０２６１株中の様なＴＡＡおよびＧＴＣの代わりにＣＴＡおよびＧＣＣでそれぞれコードされるＬｅｕ２９およびＡｌａ６５５残基を有する。残基Ｌｅｕ２９およびＡｌａ６５５の異なったコドンを用いることが、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＧＦＡ１遺伝子発現に影響するかどうかの試験が試みられた。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）に基づく戦略を用いる部位指向突然変異誘発を行ってプラスミドｐＥＴ２３ｂ（＋）／Ｃ．ａｌａｂｉｃａｎｓＦＧＡ１中のＬｅｕ２９コドンをＣＴＡに、Ａｌａ６５５コドンをＧＣＣに変換し、プラスミドｐＥＴ２３ｂ（＋）／Ｃ．ａｌａｂｉｃａｎｓＦＧＡ１−Ｍを作成した。新規プラスミド中の双方の突然変異の存在を配列決定で確認し、そのプラスミドを７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換してＥ．ｃｏｌｉ株７１０７−６０および７１０７−６１を作成した。
（ＧｌｍＳおよびＧＦＡタンパク質の過剰発現）
異なったｇｌｍＳおよびＣＦＡ１遺伝子を含むｐＥＴベクターで形質転換した株をＬＢ培地中で生育させ、ＧｌｍＳおよびＦＧＡ１タンパク質の発現を示した。最初に、細胞を試験管中、ＬＢ培地中３７℃で終夜生育させた。培地にはカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加しプラスミドを維持した。次に５０μｌの終夜培養接種液を用いて２５０ｍｌバッフル付きフラスコ中で５０ｍｌ培養を開始した。培養液を３７℃でインキュベーションし、２２５ｒｐｍで３時間振盪した。その時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで添加した。３時間のインキュベーション時間後、培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために収穫した。負対照として空のｐＥＴ２４ｄ（＋）ベクターも生育させ、分析した。比較のため、Ｔ７プロモーターで駆動し、ｌａｃＺ部位で染色体中に組み込んだ野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ遺伝子と突然変異ｇｌｍＳ＊５４遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ細胞も、抗生物質選択なしで上記のように生育させた。
標準法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。Ｔ７−Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ発現カセットがｐＥＴプラスミドにあるか、染色体中に組み込まれた場合、ＧｌｍＳタンパク質が極めて高いレベルで発現した（データは示さず）。プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）／Ｔ７−Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳの宿主である細胞は、ＧｌｍＳタンパク質の予想サイズである約６５ｋＤａのタンパク質を過剰発現した（データを示さず）。組み込みカセット由来の発現レベルは、ｐＥＴプラスミドに含まれるＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ遺伝子を発現する細胞と同程度であった。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＦＡ１遺伝子の宿主である細胞は、酵母タンパク質の予想サイズ（８０ｋＤａ、データは示されない）の過剰発現タンパク質バンドを明らかに示した。Ｔ７−Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１発現カセットを含む（データは示されない）７１０７−２３株では、８０ｋＤａバンドタンパク質の合成は空のベクターを有する株と比較して明らかでなかった（データは示されない）。しかしながら、ＧＦＡ１バンドは、ｐＥＴ２３ｂ（＋）系ベクター上のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＦＧＡ１遺伝子を含む７１０７−５８株および７１０７−５９株中で過剰発現された（データは示されない）。発現レベルはｐＥＴ２３ｂ（＋）系ベクターを有する７１０７−２３株より明らかに高かった。Ｌｅｕ２９およびＡｌａ６５５に対する別なコドンを使用しても、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１タンパク質発現に影響しなかった。
まとめると、Ｅ．ｃｏｌｉ中の酵母ＧＦＡ１遺伝子の発現レベルはバクテリアｇｌｍＳ遺伝子と比較して低かった。このことは真核遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ宿主中で発現することを試みた場合、共通に観察された。
（グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性分析）
酵素活性とグルコサミン生産を測定するため、Ｍ９Ａ培地中で異なった株を生育させた。培養液を調製するため、３工程プロトコールを使用した。最初にＬＢプレート上で生育した新鮮な細胞を３ｍｌのＬＢ中で培養を開始するために使用し、３７℃で約６時間生育させた。次に１．５ｍｌの培養液を使用して２５０ｍｌのバッフル付きフラスコ中の５０ｍｌのＭ９Ａに接種し、培養液を３７℃でインキュベーションし２２５ｒｐｍで約１６時間（終夜）振盪した。この工程は細胞を最小培地に適応させること、およびグルコサミン生産の再現性のある結果を得るために行われた。三番目に、一定量の細胞を２５０ｍｌのバッフル付きフラスコ中のＩＰＴＧ（１ｍＭ）を含む５０ｍｌのＭ９Ａ培地に添加した。最初の細胞密度を０．３ＯＤ６００に調節した。細胞を３７℃でインキュベーションし、２２５ｒｐｍで２４時間振盪した。遠心分離後、培養ブロスをグルコサミン分析に使用し、細胞ペレットをグルコサミンシンターゼ活性の測定に使用した。それぞれの実験からのデータを表５に示す。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子（配列番号１６をコード）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞中では酵素活性が容易に検出できた。活性レベルはＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ（配列番号２をコード）を有する細胞、およびＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ＊５４突然変異遺伝子（配列番号６をコード）を有する細胞と同程度であった。しかしながら、酵母ＦＧＡ１遺伝子（配列番号１８および配列番号２０をコード）の宿主である細胞中では微量量の酵素活性しか検出できなかった。Ｍ９Ａ培地中の培養由来の活性データは、一般にＬＢ培地中で生育した細胞のＳＤＳ−ゲル分析の結果と一致した。低いタンパク質発現レベルは、酵母ＦＧＡ１遺伝子の宿主である細胞中の僅かな酵素活性を説明する主な理由の一つであると思われる。
（異なったｇｌｍＳおよびＧＦＡ１遺伝子の発現によるグルコサミンの生産）
空のベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）で形質転換した７１０１−１７（ＤＥ３）株の培養培地中では、きわめて低いレベルのグルコサミンしか生産されず、分泌されなかった（表５）。バクテリアｇｌｍＳ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ）の発現により、グルコサミン生産は５０倍以上増加した。グルコサミンレベルの数倍の増加も、酵母ＧＦＡ１遺伝子を発現する培養物中で観察された。ｐＥＴ２４ｄ（＋）と比較して、ｐＥｔ２３ｂ（＋）を使用するとＣ．ａｌｂｉｃａｎｓタンパク質のレベルおよびグルコサミン生産レベルが高くなった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１遺伝子中のＬｅｕ２９およびＡｌａ６５５コドンの変化はグルコサミン生産レベルに影響しなかった。これらの観察は、一般的にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果と一致した。酵素活性分析で観察された様に、２１２３−１２株で７１０７―２１４株より高いレベルでグルコサミンが生産されたので、染色体中のＴ７−Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ発現カセットの組み込みは有益である様に思われる。染色体中に組み込まれたＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ＊５４を有するＥ．ｃｏｌｉ株は、他の試験された株と比較して明らかにグルコサミン生産に優れていた。
（表５．異なったｇｌｍＳおよびＧＦＡ１ホモログを発現するＥ．ｃｏｌｉ中におけるグルコサミンシンターゼ活性およびグルコサミン生産）
Figure 2013009690
注：１）宿主細胞：Ｅ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）、遺伝子型：ｎａｇΔ、ｍａｎＸＹＺ ＤＥ３
２）細胞培養：リッター当たり７．５ｇ（ＭＨ４）２ＳＯ４および４０ｇグルコースを添加したＭ９Ａ培地を含む振盪フラスコ中３０℃、２６時間
３）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１（Ｍ）：ＴＡＡおよびＧＣＴからそれぞれＣＴＡおよびＧＣＣに換えたＬｕｅ２９およびＡｌａ６５５コドン
（実施例３）
以下の実施例は異なった生成物耐性ＧｌｍＳ酵素：Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異体および野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＨｌｍＳの特徴付けを示す。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧｌｍＳ、天然型Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ、および突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉＧｌｍＳを含む、異なるグルコサミンシンターゼ酵素を、試験管内で研究した。様々なＥ．ｃｏｌｉ株の細胞をＭ９Ａ培地中で生育させ、収穫し凍結した。細胞抽出物を調製し、グルコサミンシンターゼを特徴付けし比較した。強い生成物耐性を示し、組み替えＥ．ｃｏｌｉ内で高いグルコサミン生産が得られた二つの別なＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ突然変異体に付き、ＤＮＡ配列を決定した。
（グルコサミン−６−Ｐによる阻害に対する感受性）
反応生成物であるグルコサミン−６−Ｐに対する酵素の感受性を調べた。０〜３０ｍＭのグルコサミン−６−Ｐの範囲で、グルタミンおよびフルクトース−６−Ｐの飽和レベルにおける初期速度を測定した。結果の例を図４および５に示す。２１２３−１２株由来のＥ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ酵素は１ｍＭレベルのグルコサミン−６−Ｐで約５０％の活性を失った。グルコサミン−６−Ｐのレベルを増加すると、活性は減少し続けた。２１２３−５４株では、１ｍＭのグルコサミン−６−Ｐは酵素活性に本質的に効果がなかった。このレベル以上では阻害はほぼ直線的であり、１０ｍＭのグルコサミン−６−Ｐでは約５０％の活性が残った。２１２３−４、２１２３−５９、２１２３−６４、２１２３−７２、２１２３−１０３および２１２３―１４等の他の株由来の突然変異ＧｌｍＳ酵素も、ＧｌｃＮ−６−Ｐ阻害に対し感受性が減少することが示された。図５は比較的「低い」［グルコサミン−６−Ｐ］で活性を示す。この図は野生型ＧｌｍＳとこれらの突然変異ＧｌｍＳ株の間の顕著な差を浮き彫りにするものである。かなり低いレベルのグルコサミン−６−Ｐでも天然型ＧｌｍＳ酵素を有意に阻害する。
野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｍＳ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで過剰発現された場合、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ遺伝子の過剰発現より高いレベルのグルコサミンが生産される。興味のあることに、天然型Ｂａｃｉｌｌｕｓ酵素はＥ．ｃｏｌｉ突然変異ＧｌｍＳ酵素に極めて匹敵する生成物耐性を示した（図４）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素の活性を０．２および４ｍＭグルコサミン−６−Ｐで測定した。その酵素は０．６２ｍＭのＫｍ（フルクトース−６−燐酸）と、１．２５ｍＭのＫｉ（グルコサミン−６−Ｐ）を有する（データは示さず）。
Ｖｍａｘ対［阻害剤］に対する非線形回帰値の２次プロットから、２１２３−１２株に対し０．５６ｍＭの阻害定数（Ｋｉ）が得られた。突然変異２１２３−５４株とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素はより高いＫｉ値を有する（表６）。これらの突然変異体のいくつかに対する測定Ｋｉ値は、２１２３−１２株の値の４〜８倍である。振盪フラスコ実験から、グルコサミン−６−Ｐに対する感受性の減少により、高いグルコサミンレベルの蓄積が可能であることが明らかである。これは、細胞内［グルコサミン−６−Ｐ］が組み替えＥ．ｃｏｌｉ株中でかなり高く（複数ミリモル）、グルコサミンシンターゼ活性が減少する結果となることを示唆する。グルコサミン−６−Ｐに対する感受性の急激な変化は、突然変異Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ、および野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＧｌｍＳ酵素を過剰発現するこれらの株中のグルコサミン合成の増加に対する最も単純な説明を与える。
（基質であるフルクトース−６−Ｐおよびグルタミンに対する親和性）
グルタミンおよびフルクトース−６−Ｐに対するＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数を粗抽出物を用いて測定した（表６）。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ酵素（２１２３−１２株）では、非線型回帰により０．２０ｍＭ（フルクトース−６−Ｐ）および０．１７ｍＭ（グルタミン）の値が得られた。突然変異ＧｌｍＳ＊５４（２１２３−５４）での同様な実験から、０．６４ｍＭ（フルクトース−６−燐酸）および０．７３ｍＭ（グルタミン）の値が得られた。これらの値は天然型酵素で得られた値より若干高かった。Ｅ．ｃｏｌｉ（７１０７−２４株）中で発現したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧｌｍＳ酵素は、突然変異Ｅ．ｃｏｌｉ酵素ＧｌｍＳ＊５４に極めて類似したＫｍ（フルクトース−６−Ｐ）を示した。
（表６．異なったＧｌｍＳ酵素の特性）
Figure 2013009690
＊ＮＤ：検出されず
（熱安定性）
５０℃における変性を、異なったＧｌｍＳ酵素の熱安定性の有り得る差を測定するために用いた。粗抽出物を５０℃でインキュベーションし、９０分間にわたってサンプリングした。サンプルのグルコサミンシンターゼ活性を、全ての基質の飽和レベルで２５℃で分析した。
５０℃における熱安定性とグルコサミン生産の間には何らの有為の関連がないように思われる（データを示さず）。２１２３−１２４株の熱安定性は最低であるが、最良のグルコサミン生産株の一つであることが示されている。株１２、５４および５９の間の熱安定性に有為の差はほとんどないが、本発明の発明者らは株５４がより優れたグルコサミン生産株であることを知っている。
（実施例４）
以下の実施例はＧｌｍＳ配列解析を説明する。
プラスミドｐＫＩＮ２３−７２およびｐＫ１Ｎ２３−１０３による形質転換および組み込み実験で、宿主株７１０１−１７（ＤＥ３）から２１２３−７２および２１２３−１０３株がそれぞれ誘導された。これらのプラスミド中のｇｌｍＳ領域（ｇｌｍＳ＊７２およびｇｌｍＳ＊１０３）の配列決定を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ＊７２突然変異体コード配列のヌクレオチド配列は配列番号１３として列記される。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ＊７２タンパク質の推定アミノ酸配列は配列番号１４として列記される。
興味のあることに、両方の突然変異体は１５、３８７、４５０および５２５位でアミノ酸置換される同じ突然変異を有することが分かった（表７）。Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ＧｌｍＳ（配列番号２）、突然変異ＧｌｍＳ＊４９（配列番号４）、ＧｌｍＳ＊５４（配列番号６）およびＧｌｍＳ＊１２４（配列番号８）中の関連する位置における残基が比較のため列記される。ＧｌｍＳ＊４９およびＧｌｍＳ＊７２でも見出される、４５０位におけるセリンからプロリンへの変化以外は、ＧｌｍＳ＊７２は他の生成物耐性ＧｌｍＳ突然変異体と共通の突然変異を持たない。興味のあることに、３種のＧｌｍＳ突然変異酵素（ＧｌｍＳ＊４９、７２および１２４）は、４５０〜４６９領域内で１個の残基がプロリンへ変化する突然変異を有する。ＧｌｍＳ＊５４も４７２位で残基が変化する、すなわちグリシンがセリンで置換される。これらのデータは、タンパク質のこの領域のおける変化が酵素の生成物耐性に重要な役割を果たし得ることを示唆する。
（表７．生成物耐性グルコサミンシンターゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ突然変異体ｇｌｍＳ遺伝子における塩基の変化）
Figure 2013009690
＊ 簡単にするため、位置は推定アミノ酸配列の番号付けに従って与えられる。
異なったバクテリアｇｌｍＳコード配列のヌクレオチド配列を、標準設定のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム、Ｊ．Ｈｅｉｎ法、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウエア（ＤＮＡ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて解析した。標準設定のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ配列、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウエア（ＤＮＡ Ｓｔａｒ）を用いて、核酸配列から推定したアミノ酸配列も比較された。結果を表８に示す。
（表８．異なった微生物由来のグルコサミンシンターゼ酵素のペプチドサイズとホモロジー）
Figure 2013009690
＊アミノ酸残基数には翻訳後に酵素除去されるイニシエーターであるメチオニンは含まれない。
＊＊ヌクレオチドレベルのホモロジーは括弧で示される。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉホモログより９残基短いグルコサミンシンターゼの５９９個のアミノ酸残基（通常、翻訳後に酵素除去されるイニシエーターであるメチオニンを除く）をコードする（配列番号１６）。異なった生成物耐性Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ突然変異体中に突然変異が見出される位置に対応する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＧｌｍＳタンパク質のアミノ酸残基が表９に列記される。興味のあることに、１０個の位置のうち６個で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ酵素はＥ．ｃｏｌｉ野生型ＧｌｍＳとは異なった残基を有するが、どの変化もＥ．ｃｏｌｉ突然変異酵素中と同じでない。
（表９．生成物耐性突然変異Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳと野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧｌｍＳ＊におけるアミノ酸残基の変化）
Figure 2013009690
＊ Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ＧｌｍＳタンパク質の残基と異なる残基のみを示す。
＊＊配列中の小さいギャップのため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＧｌｍＳ配列の位置は、Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ＧｌｍＳ配列との整列に基づく。
（実施例５）
以下の実施例は、振盪フラスコ培養内のグルコサミン生産中の酵素活性を示す。
グルコサミン生産に関連する様々な酵素活性を振盪フラスコおよび醗酵槽中で調べた。これらの酵素のグルコース代謝およびＮ−グルコサミン生成への関与の概要を図３に示す。グルコースが細胞に取り込まれ、同時にグルコース−６−Ｐに変換される。グルコースは図に示される経路を含むいくつかの経路で代謝される。グルコサミン合成経路で、グルコース−６−Ｐはフラクトース−６−Ｐに異性化され、次いでＧｌｍＳが媒介してフラクトース−６−リン酸がグルコサミン−６−リン酸へ変換される。最後に、グルコサミン−６−リン酸が脱リン酸化され、分泌される。グルコース−６−リン酸に対する主要な別ルートは、ホスフォフラクトキナーゼによりグリコリシスへ入ることである。グルコース−６−リン酸に対する重要な別ルートは、グルクノラクトン−６−リン酸への酸化である（ペントースリン酸経路へ入る）。また、グルコース−６−リン酸はグルコース−１−リン酸へ変換され、それからグリコーゲンが生成し細胞内に貯蔵される。
２１２３−５４株を用いる振盪フラスコ実験における酵素分析の結果が図６に示される。細胞をＭ９Ａ培地中で生育し、培養の開始から０．２ｍＭＩＰＴＧで誘導された。全実験を通してグルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）活性は高かった。１２時間で高いレベルのＧｌｍＳ活性があり、２４時間で活性はさらに増加した。その後、ＧｌｍＳ活性は減少する様に思われた。しかしながら、この減少は急激ではなかった。７２時間における活性はまだ高く、１２時間で観測された活性と基本的に同じであった。従って、ＧｌｍＳ活性は実験期間中に有意に減少するとは思われなかった。
ホスフォグルコイソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性は１２時間で高く、２４時間で有意に増加した。その後、活性は１２時間におけるレベルに戻り、残りの実験中そのレベルのままであった。明らかに、この実験条件のセットではグルコースからフラクトース−６−リン酸の生成はこれらの細胞中の低いＰｇｉ活性で制約されない。
フラクトース−６−リン酸についての他の主要なルートはグリコリシスである。これに関連する最初の工程はホスフォフラクトキナーゼ（Ｐｆｋ）で媒介される。最大Ｐｆｋ活性が１２時間で観測され、次の４８時間にわたって減少したが、この活性は検出可能のままであった。この活性パターンはＰｆｋに典型的である。対数増殖中は活性は最高であり、次いで細胞が定常期に入ると減少する。
抽出物中でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕ６Ｐ ＤＨ）が検出された。この酵素はＮＡＤＰＨを再生するためにグルコースからペントースリン酸経路へ炭素を供給する。この酵素の活性は測定された他の酵素と比べて非常に低いが、十分に安定であり、実験の最初の２４時間後は若干減少した。ホスフォグルコムターゼ（Ｐｇｍ）の活性は実験条件下で極めて低いことが見出された。
（実施例６）
以下の実施例は、ラクトース誘導グルコサミン生産のための組み換えＥ．ｃｏｌｉ開発を記載する。
グルコサミン生産の商業的に利用できるプロセスを開発するためには、二つの因子が必要であった。第一はグルコサミン力価を増加させることである。第二は醗酵プロセスでＩＰＴＧを使用しないことである。なぜならＩＰＴＧのコストがグルコサミン生産を阻害するほど高価になるからである。研究計画の初期に開発されたグルコサミン生産用の株は、グルコサミンシンテターゼの発現を誘導するために培養培地中にＩＰＴＧを必要とした。
（醗酵プロセスからＩＰＴＧを除外するための戦略）
生産株（例えば、２１２３−５４株）において、醗酵プロセス中におけるＩＰＴＧ要求は、ＧｌｃＮ６ＰシンセターゼをコードするｇｌｍＳ遺伝子の過剰発現モードから生じる。ｇｌｍＳ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡから単離され、そしてバクテリオファージＴ７由来のプロモーターの後、発現ベクター中にクローニングされた。このプロモーターは極めて強力で特異的である。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼはこれを認識せず、むしろＴ７ＲＮＡポリメラーゼがこれを認識する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーターとｌａｃオペレーターで作動するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む、ＤＥ３と指定される遺伝子要素中に提供される。ＩＰＴＧによる誘導を必要とするのはこれらのプロモーターおよびオペレーターである。ｌａｃプロモーターはｌａｃＩ遺伝子でコードされるｌａｃレプレッサーにより負の制御を受ける。誘導因子がない場合は、ｌａｃレプレッサーがｌａｃオペレーターに結合し、オペレーターの下流の遺伝子、この場合はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を妨害する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがない場合は、組み換えｇｌｍＳ遺伝子は発現されない。ＩＰＴＧが存在すると、ｌａｃレプレッサーがオペレーターに結合せず、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が発現しｇｌｍＳが過剰発現する結果となる。
ｌａｃプロモーターの他の誘導因子はアロラクトンである。これはｂ−ガラクトシダーゼのラクトースにたいする作用の副生物である。ｌａｃＺ遺伝子の欠失および破壊のために、２１２３−５４株等のグルコサミン生産株はｂ−ガラクトシダーゼに対し陰性である。しかしながら、機能性ｌａｃＺ遺伝子が存在すると、ラクトースはアロラクトンに変換され、ｇｌｍＳを発現させる上記の連続反応を開始する。
上記を参照すると、ＩＰＴＧ依存性を解消する方法がいくつかある。本実施例で記載する一つのアプローチはｌａｃＺ遺伝子を除去することである。これはＴ７−ｇｌｍＳ＊５４発現カセットを染色体中の異なった部位へ組み込むことで行われる。ｇａｌＫ部位に組み込むとｌａｃＺ遺伝子は無傷のままである。Ｌａｃ＋株はＩＰＴＧより安価であるラクトースで潜在的に誘導可能である。組み込み株はＧａｌ−であるので、ｇａｌＫ部位が選ばれた。この様な株ではガラクトースをｌａｃプロモーターに対する誘導因子として使用し得ると報告された。さらに、ラクトースの加水分解で生じたガラクトースがラクトース誘導を促進し得る。準最適量のラクトースをグルコサミン生産プロセスで使用した場合、ラクトースは誘導を促進する。理論的には、Ｔ７−ｇｌｍＳ＊発現カセットを７１０７−１７（ＤＥ３）株中のｇａｌＫ部位に挿入した場合、得られた株は２１２３−５４株と類似しているが、グルコサミン生産は、ラクトース、ガラクトースまたはＩＰＴＧの何れかで誘導可能である。
（温度選択による染色体上の標的部位へ遺伝子組み込みまたは欠失のための一般的プロトコール）
温度変化でＥ．ｃｏｌｉ染色体中に標的遺伝子の欠失と遺伝子組み込みを行うためのベクターと方法がＨａｍｉｌｔｏｎら（１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７−４６２２）によって報告された。この方法を異なったグルコサミン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株を開発するために採用した。遺伝子組み込みのためのプロトコールには以下の主な工程が含まれる。第一工程では標的部位の配列をクローニングし、内部欠失を行い、および／またはこの欠失部位に組み込まれるべき外来遺伝子を挿入する。第二工程では、これらの配列を含むフラグメントを、温度感受性複製開始点および抗生物質選択マーカーを含む温度感受性組み込みベクター中にサブクローニングする。第三工程では、組み込みベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、非許容温度（４２℃）で単一交差組み換えにより染色体中に組み込まれた全プラスミドにつき、クローンを選択する。第四工程では、選択したクローンの細胞を液体培地中に許容温度（３０℃）で生育させる。選択したプラスミドを有する細胞はプラスミドを失い易い。複製開始点および抗生物質耐性遺伝子、または全プラスミドを失った細胞は培養液中で速く生育する。具体的には、この工程は５０ｍｌのＬＢ培地に２個〜１０個のクローン由来の細胞を接種し、培養細胞を２４時間生育させることで行われた。培養細胞を１０００倍希釈で新鮮な培地に移し、さらに２４時間生育させた。第五工程では、細胞をプレート上に蒔き、抗生物質耐性を失ったクローンを選択した。組み込まれた遺伝子または欠失した遺伝子の性質によって、遺伝子特異性手順が使用された。具体的には、クローンを選択するために、染色体中の意図する変化を有するクローンを、その天然型からＰＣＲ生成物のサイズによって区別し得るプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。組み込まれた、または欠失したＤＮＡ配列に特異的なプローブを用い、クローンをサザンブロットで確認した。
（Ｔ７ｇｌｍＳ*５４のｇａｌＫ部位への組み込み用ベクターの温度選択による開発）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌオペロン配列の一部を含むベクター、ｐＵＣ４Ｋプラスミド由来のカナマイシン耐性選択マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、およびｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性ｐＳＣ１０１複製開始点（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７−４６２２）を含むベクターを、温度選択プロトコールを用いるｇａｌＫ部位への遺伝子組み込みのために開発した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌオペロン配列の一部（３．３ｋｂ）をＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株からＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ生成物はｇａｌＴＫＭ配列（ｇａｌＴコード配列のＡＴＧ開始コドンの１４ｂｐ上流から開始し、ｇａｌＭコード配列の停止コドンに続く６８ｂｐで終了）を含み、ベクターｐＣＲＳｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）中にクローニングして組み換えプラスミドｐＫＬＮ２３−１５７を作成した。０．７ｋｂの欠失をｇａｌＫ配列に作成し（制限部位ＳｆｏＩとＭｌｕＩの間）、ユニーク制限部位（ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩおよびＭｃｓＩ）を欠失部位に加え、プラスミドｐＫＬＮ０７−１を作成した。ＰｓｔＩ消化と平滑末端を生成するためのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により、カナマイシン耐性カセットをＰｓｔＩフラグメントとしてｐＵＣ４Ｋから単離した。このフラグメントをプラスミドｐＫＬＮ０７−１（配位は未決定）のＮｏｔＩ部位（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化）にライゲートした。ｋａｎ：：ｇａｌＴＫＭフラグメントからプラスミドのＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化）フラグメントとして除去し、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７1：４６１７−４６２２）を含むＰｖｕＩＩ／ＳｍａＩフラグメントとライゲートしプラスミドｐＳＷ０７−４を作成した。発現カセットＴ７−ｇｌｍＳ＊５４をプラスミドｐＫＬＮ２３−５４（米国特許第６．３７２．４５７号に開示）からＮｏｔＩフラグメントとして消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端した。このフラグメントをＭｓｃＩ部位のｐＳＷ０７−４中にクローニングし、プラスミドｐＳＷ０７−９を作成した。
（ラクトース誘導株の選択）
Ｅ．ｃｏｌｉ７１０１―１７（ＤＥ３）株をｐＳＷ０７−９で形質転換後、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９８９）から採用したプロトコールを組み込み突然変異体の温度感受性選択のために使用した。ｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レプリコンを有するプラスミドではプラスミドの複製が３０℃で行われるが、抗生物質選択条件下でプラスミドの組み込みが非許容温度で強制的に行われる。この結果、形質転換細胞を４２℃でインキュベーションして組み込みプラスミドを有する株が選択された。これは細胞をカナマイシンを含むプレート上に播種し、プレートを４２℃でインキュベーションしコロニーを選択することで行われた。通常、全プラスミドが相同組み換えにより染色体中に組み込まれた。ｇａｌＴまたはｇａｌＭ領域では単一交差が行われた。
複製開始点のため、組み込まれたプラスミドを有する細胞は染色体からプラスミドがループとなってはみ出す傾向がある。全プラスミドが組み込まれた細胞は３０℃での生育が極めて悪いが、プラスミドまたは複製開始点部分を失った細胞は正常な生育を示す。従って、４２℃で選択した細胞を３２℃で生育させた場合、プラスミドを失った細胞はプラスミドが残る細胞より速く成長する。原理的に、相同組み換えにより細胞がプラスミドを失うには、二つの異なった方法がある。細胞が全プラスミドを失って天然型ｇａｌオペロンを有する復帰株となるか、または複製開始点と選択マーカーを含むプラスミド部分のみを失ってｇａｌＫ部位に組み込まれたＴ７−ｇｌｍＳ＊５４配列を有する株となるかである。４２℃選択から単離された細胞を液体培地中に３０℃でインキュベーションし、抗生物質を含まないプレート上に播種した。組み込みによりｇａｌＫ遺伝子が不活性化したので、組み込み株は単独の炭素源としてガラクトースを利用することができなかった。ガラクトースプレートをこの様な組み込み株のスクリーニングに使用し、その株をｇａｌＫ配列をプローブとして用いるサザンブロットハイブリダイゼーションで確認した。これらのラクトース誘導グルコサミン生産株は７１０７−１６および７１０７−１８を表わす。
（実施例７）
本実施例はラクトース誘導グルコサミン生産を記載する。
ｇａｌＫ部位に組み込まれたＴ７−ｇｌｍＳ＊５４発現カセットを有する株（７１０７−１６および７１０７−１８株）は、ＩＰＴＧまたはラクトースのいずれかによる誘導後に高レベルのグルコサミンを生産する。ＩＰＴＧ誘導下のコントロール株（２１２３−５４）は４．２ｇ／ｌを生産した。ラクトース誘導株におけるグルコサミン収量はＩＰＴＧ誘導２１２３−５４株と同等であった。２１２３−５４株およびラクトース誘導株におけるグルコサミンレベルを図７に示す。
グルコサミンシンテターゼ活性をラクトース誘導培養サンプルで分析した。細胞を異なった量のグルコースおよび／またはラクトース（数字はリッター当たりのグラム数を示す）を含むＭ９Ａ培地中で生育させた。２４時間の生育後、酵素活性とグルコサミンを分析した。表１０に示すように、ラクトースはＧｌｍＳ活性とグルコサミン合成を誘導する。ラクトース誘導は培地中のグルコース量に影響された。高レベルのグルコースはラクトース誘導の強い抑制を示した。７１０７−１８株をラクトース誘導プロトコールのさらなる開発のために選択した。この株を、振盪フラスコおよび１リッター醗酵槽中での様々なラクトース誘導スキームで評価した。
表１０．ラクトース誘導株７１０７−１６におけるグルコサミンシンテターゼ活性およびグルコサミン生産レベル
Figure 2013009690
注：
１）細胞を異なった量のグルコースおよび／またはラクトースを含むＭ９Ａ培地中で生育させた（数字はリッター当たりのグラム数を示す）。
２）酵素活性とグルコサミンを２４時間の生育後に分析した。
（ラクトース誘導およびグルコース抑制）
醗酵実験では、ラクトース誘導後にラクトースまたはグルコースの供給と共に異なったラクトースレベルが試された。を試みた。グルコサミンレベルを７２時間にわたりモニターした。ラクトース誘導の最初のプロトコールは、接種前にラクトースを添加し（グルコースはｌａｃオペロンを抑制するのでグルコースなしで）、その後生育、ＧｌｃＮ生成およびバイオマス維持のために炭素を供給した点でＩＰＴＧ誘導と類似していた。細胞を４０ｇ／ｌのラクトースで生育させ、ラクトースを連続的に供給した場合、細胞はラクトースを消費し続けた。これにより４０ｇ／ｌまでの有意レベルのガラクトースが蓄積された。グルコサミン生産レベルは、ＩＰＴＧ誘導下の２１２３−５４レベルと同等であった（約１０ｇ／ｌ）。
細胞を４０ｇ／ｌのラクトースで２４時間生育し、次いでグルコース供給へ切り替えた。この様な条件下で、残りの試行中、細胞はラクトースの消費を停止し、ガラクトースは１０ｇ／ｌで一定であった。グルコサミン生産は良好な速度で続き、２１２３−５４株に匹敵する速度レベルに達した。この結果は、ラクトースの利用が停止した後もガラクトース生産を厳密にグルコースで維持し得ることを示す。このことはまた、誘導には低いレベルのガラクトースのみが蓄積する少量のラクトースのみが、必要であることを意味する。ラクトース要求が少なく、ガラクトース蓄積が少ないことは、双方ともコスト削減および生成物回収に望ましいことである。
５０ｇ／ｌおよび６０ｇ／ｌに増加させたラクトースを使用した後、グルコースを供給する誘導スキームは、グルコース添加後しばらくの間ラクトースの利用が継続したことを示す。このことは、より高レベルのラクトースでグルコースによる抑制が不完全であるか、または誘導された酵素が適当なレベルで機能し続け、グルコース添加後のグルコサミン生産を維持することを示している。
低いレベルのラクトースを使用することが望ましく、この実験は、より少ないレベルのラクトースを試験したが、試験される最低レベルのラクトースでグルコース抑制が最小になり得ることを示した。以後の開発作業は誘導に必要な最小レベルのラクトース、最適タイミングおよび誘導期間、およびラクトース誘導前のグルコースを含む初期生育期の利点を確立することに集中された。制御醗酵で取り他界細胞密度が望ましい場合、後者は特に重要であり得る。
細胞がグルコース欠乏になるまで細胞をグルコースで生育させ、その後ラクトースで誘導することが試みられた。グルコースによる生育で約１７ｇ／ｌの細胞密度に到達させ、次いでラクトース供給をゆっくり開始した。この様な条件下でＧｌｃＮ生産は１０ｇ／ｌに達した。この戦略をＧｌｃＮ生産のその後の実験に使用した。
（酢酸の効果）
酢酸はＥ．ｃｏｌｉ醗酵の共通の副生物である。グルコースが過剰である場合、生育速度が臨界レベルを超える場合、またはグリコリシス速度と生成した代謝物の酸化が呼吸容量の飽和のために不均衡である場合、酢酸は好気条件でも生成する。培養液に酢酸を加えると、生育およびグルコサミン蓄積の両方に有意の負の効果を示す。酢酸はグルコサミン生産中も蓄積することが示された。微量元素レベルも酢酸生成レベルに影響した。
プロセス開発による酢酸の蓄積を減らす戦略には、グルコースが飽和しない様にグルコース供給を遅くすることによる生育制限が含まれる。この戦略は全実験計画中に採用された。微量元素またはカリウム制限等のある条件で、酢酸レベルは有意なレベルとなった。低いｐＨは酢酸の粗が憩うかを増加させた。
（温度の効果）
米国特許第６，３７２，４５７号に開示される様に、生育とグルコサミン生産に好ましい温度は３０℃たった。高い生育温度（３７℃）は生育速度を高くして、グルコース取り込みを増加し、最終的に酢酸阻害レベルをもたらした。高い温度はまた、不溶性／不活性組み換えＧｌｍＳタンパク質を含む封入体を生成し得る。誘導後に温度を３０℃から２５℃に変化した場合、フラスコ内実験で酢酸レベルの有意の減少と相対的なＧｌｃＮレベルを示した。従って、酢酸の蓄積を減少させるための低い温度（２５℃）を醗酵槽で評価した。その結果、グルコース蓄積の条件下でも低温で酢酸の蓄積が減少することが示された。
（微量元素の効果）
バイオマスをより高い密度に生育するためにある種の微量元素、特に鉄、亜鉛およびマンガンが必要である。全微量元素パッケージの最初の滴定で、微量元素のレベルが低すぎる場合はバイオマス生産が限定されることが示された。鉄が主要な制限成長因子であることが分かったが、過剰にあると鉄はＧｌｃＮ力価を減少し酢酸レベルを高くする。フラスコ培養ではマンガンは細胞密度とＧｌｃＮレベルに同様ではあるがより弱い効果を与える。マンガンの効果は鉄の効果に加算的であるように思われる。マンガンの負の効果は、醗酵槽で確認された（図８）。細胞がラクトースで適切に誘導される様になるためには、適切な鉄の供給が必要であることが見出された。従って、生育要求、誘導要求と、酢酸およびＧｌｃＮ生産への効果とがり合うために、臨界濃度範囲を確立しなければならなかった。グリコリシスからの炭素フローを制限するための鉄、マンガンおよび亜鉛の制限は、クエン酸醗酵の開発に先例がある。
数回の実験後、最終スキームが確立された：培地中の３ｍｇ／ｌの硫酸鉄、および５μｇ／ｇの比率でグルコース供給に添加される硫酸鉄。培地中３ｍｇの硫酸鉄の最初のレベルで、グルコース供給溶液に鉄を添加することが、定レベルのバイオマス生育およびＧｌｃＮ生産の増加を維持するために必要であった。
（リン酸濃度の効果）
細胞にとって、核酸合成、燐脂質およびコエンザイムに主に用いられる燐は必要な主要栄養要素である。リン酸化代謝中間体も細胞代謝に必要である。Ｍ９Ａ培地中の高いリン酸濃度は、振盪フラスコ条件下では容易に制御できない培養中のｐＨを緩衝する一つの方法となる。しかしながら、この培地を醗酵スケールへスケールアップすることは、リン酸が正常なバイオマスの要求を超えた大過剰となることを意味する。高い塩レベルは、生成物回収に問題を提示する。従って、リン酸レベルを下げることが望まれた。リン酸レベルを下げるいくつかの試みはより良い生育を示したが、ＧｌｃＮ生産ははるかに悪くなった。例えば、リン酸カリウムレベルを３０ｇ／ｌから６ｇ／ｌへ下げた場合、恣意行くは改善されたがＧｌｃＮの生産は大きく減少した（図９）。
（実施例８）
この実施例は、ラクトース誘導グルコサミン生産株７１０７−１８の生育に対するｐＨの効果を記載する。
実施例１１に示すように、グルコサミンはＥ．ｃｏｌｉ生育に用いられる正規のｐＨ範囲では不安定である。グルコサミンはまた、７１０７−１８に毒性効果をもたらした。細胞を接種する前にグルコサミンを２０ｇ／ｌの低い濃度で培地（ｐＨ７）中にプレインキュベーションした場合でも、毒性が観察された。出発ｐＨが７．０である培地中で、毒性は少なくとも部分的にＧｌｃＮ分解生成物に帰せられた。ＧｌｃＮは低いｐＨでより安定であり、ｐＨ４．７以下でグルコサミンは分解しない。しかしながら、低いｐＨレベルが細胞生育を制限することが公知である。従って、７１０７−１８株がｐＨ７．０、６．０、５．５、５．０および４．７で生育する実験が行われた。主な目的はこれらの低いｐＨ（ＧｌｃＮ含有）での細胞生育の実験、および以前に観察されたＧｌｃＮ分解で生じた細胞死が低いｐＨで減少し得るかどうかを調べることである。
４０ｇ／ｌのグルコースおよび２０ｇ／ｌのＧｌｃＮを有するＭ９Ａのバッチを５種の異なったｐＨに調節した。フラスコの一つのセットは即時に７１０７−１８細胞を接種した。同じ培地の複製フラスコは、接種前に細胞なしで１０時間インキュベーションした。４８時間で７回、フラスコをサンプリングしてｐＨ、ＯＤ６００およびＧｌｃＮ濃度を測定した。各サンプリングポイントで、培地のｐＨを再調整して最初の設定に戻した。
グルコサミンをプレインキュベーションしない場合は、ｐＨ７．０出の細胞培養は、培地中のグルコサミンが２０ｇ／ｌの場合でも生育は良好であった（図１０）。ｐＨ７．０と４．７の間では、ｐＨが減少すると生育速度が減少した。しかしながら、ｐＨ４．７で細胞は有意の生育を続けた。
先の観察と同様に、ｐＨ７．０で培地をグルコサミンと共にプレインキュベーションした後は細胞の生育は良くなかった。プレインキュベーションされた培地中に接種した後の細胞生育を観察した。試験したｐＨレベルを通じて生育は極めて悪かった。これは低いｐＨとグルコサミン分解の細胞培養に対する影響の組み合わせの結果であると思われる。
これらの実験に基づき、生成物の損失とグルコサミンの分解で生じる毒性効果を最小にするためには、７１０７−１８細胞を７．０より低いｐＨレベルで生育することが実行可能である様に思われた。しかしながら、最適ｐＨと培養条件を注意深く調整しなければならない：低いｐＨはグルコサミンを安定化し得るが、細胞代謝と細胞生育に負の効果がある。比較的低いｐＨレベルで実行する醗酵槽中のＧｌｃＮ生産プロトコールは、生成する任意のＧｌｃＮを保存するのに確かに有利であり、分解生成物の濃度を下げてプロセス中の細胞を保護する。これらの利点は、この方法で生育した細胞の代謝活性の減少と釣り合わなければならない。連続ＧｌｃＮ合成には細胞内で定常的なエネルギー発生が必要であり、これらの低いｐＨレベルでゆっくり生育する細胞は要求される十分なエネルギーを発生し得るとは思われない。
（実施例９）
本実施例では、グルコサミンを安定化するためのより低いｐＨにおける醗酵を記載する。
Ｅ．ｃｏｌｉに対する地位上の最適ｐＨは中性（ｐＨ７．０）付近であり、最初は６．７〜６．９のｐＨがＧＬｃＮ醗酵に用いられる。しかしながら、ＧＬｃＮは特に中性〜アルカリ性ｐＨで溶液中に分解される。微生物はｐＨに敏感であり、ｐＨが減少すると生育が悪くなる。従って、グルコサミン合成と生育期後の蓄積に対するｐＨの効果を調べる試験を行った。グルコサミン分解は酸化的であるとされているので、溶存酸素レベルの効果も試験した。細胞をｐＨ６．７で生育させ、高い細胞密度に到達させた。培養を誘導後、ｐＨを６．７から５．５に下げ、溶存酸素のレベルも２０％から５％飽和に下げた。この実施例において、最高のグルコサミンの蓄積は低いｐＨであり、低い酸素レベルも有益であったと思われる（図１１）。ｐＨと酸素負荷を変えていくと、低いが一定のグルコース供給でグルコサミン蓄積の停止後、培養液中の低いｐＨにおける分解はより少なくなったので、少なくとも改良の幾分かは低い分解のためであった。
（実施例１０）
本実施例はラクトース誘導グルコサミン醗酵プロセスで用いられた条件を集約する。
グルコサミンのラクトース誘導生産のため、組み換えＥ．ｃｏｌｉを用いて醗酵プロセスを開発した。７２時間で生成物力価は約２０ｇ／ｌであった。当業者にとっては、本発明に開示された観察に基づいてプロセスをさらに最適にし得る。また他の醗酵プロセスのために開発された方法をグルコサミン醗酵プロセスに応用し、効率を向上させ得る。本発明に開示された主要な因子と要素が以下にまとめられる。
株： 組み換えＥ．ｃｏｌｉ
誘導： 細胞密度が３０ｇ／ｌに達した後、ラクトースを添加した（１０時間に
わたり徐々に３５％フィードとして）。グルコース抑制を阻止するため、
この手順中はグルコースフィードを停止。
フィード： ５μｇＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ／ｇグルコースおよび０．３３μｇＭｎＳＯ４・
Ｈ２Ｏ／ｇグルコースを含む５０％グルコース；グルコースフィードは制
限濃度。
醗酵時間： ７２時間
醗酵モード： フィードバッチ、必要あれば５０％グルコースを添加し、グルコースの
制限濃度を維持。
接種： ５容積％
ｐＨ： 生育中は６．９、誘導後は６．７、１０ＮＮＨ４ＯＨで制御
温度： ３０℃、誘導後は２５℃に切り替え
酸素： 溶存酸素２０％以上、攪拌で制御
曝気： ０．５〜１ｖｖｍ
培地
Figure 2013009690
Figure 2013009690
グルコース（徐々に増加して添加）、およびＦｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｂ、Ｃｏ微量元素（滅菌後添加）以外の全成分を滅菌前に添加した。
（実施例１１）
本実施例はグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの安定性と、そのＥ．ｃｏｌｉに対する効果を記載する。
（グルコサミンの安定性）
グルコサミンの安定性を、４０ｇ／ｌグルコースを添加した無細胞Ｍ９Ａ培地（Ｋ２ＨＰＯ４ １４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １６ｇ／ｌ、クエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ、（ＮＨ４）ＳＯ４ ５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、ＣａＣｌ２ １ｍＭ、ｐＨ７．０）中で試験した。グルコサミンを３０％グルコサミンＨＣｌ濃縮液として調製し、最終濃度０、４、１３、２６および４２ｇ／ｌ（２５０ｍｌフラスコ中全量５０ｍｌ）で添加した。培地のｐＨを６．９に調節した。フラスコをシェーカー上に置き、約２２５ｒｐｍに調節した。グルコサミンレベルを３０℃で約２４時間モニターした。グルコサミンは不安定であり、グルコサミン濃度が高いほど分解速度が速く、その分解は濃度に依存した。グルコサミン４２ｇ／ｌの培地中では、グルコサミンの半分以上が１日以内に分解した。出発グルコサミン濃度が４ｇ／ｌの場合、分解はわずか約２５％であった。培地のｐＨの減少に伴ってグルコサミンが分解した。４２ｇ／ｌグルコサミンサンプルでは、培地のｐＨは２４時間後に０．７単位（６．９から６．２に）減少したが、グルコサミンのない培地ではｐＨ変化は僅か約０．１５単位であった。
４種の開始ｐＨレベルにおけるグルコサミン（６０ｇ／ｌ）の分解を無細胞Ｍ９Ａ−グルコース（４０ｇ／ｌ）培地中、３０℃でモニターした。各サンプリング時間で溶液のｐＨを再調整した。各条件を三重で行った。図１２に示すように、分解は強くｐＨに依存し、高いｐＨでより速かった。グルコサミンの損失はｐＨ７．０で６８％であったが、ｐＨ５．５では１８％であった。分解速度に対するｐＨの外插により、ｐＨ約４．７以下では分解を生じないと示唆される。
グルコサミンが分解すると溶液は黄琥珀色になった。発色の程度は３６０−４００ｎｍの吸収で見積もることができる。分解速度がより速い初期のサンプリング期間を除いて、分解したグルコサミンの量と培地中の琥珀色濃度の間には強い相関があった。２種の最低ｐＨレベルで、グルコサミンの消失と発色の間にかなりの遅れがあり、着色成分がグルコサミンの直接分解生成物でないことを示している。試験した全てのｐＨレベルで分解速度が遅くなった後、分解したグルコサミンと黄色い色の比率は一定であった。
グルコサミンの分解と発色の分子機構はほとんど知られていない。水中および乾燥条件下でのグルコサミンの熱分解について報告されている（Ｓｈｕ、１９８８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．４６、ｐ１１２９−１１３１）；ＣｈｅｎおよびＨｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．４６、ｐ１９７１−１９７４；双方ともその全文は本明細書中に援用される）。しかしながら、本実験で用いられた温和な条件下で、同じタイプの化学反応が生じるかどうかは公知でない。研究者らはグルコサミンから褐色生成物の生成を観測し、褐色生成物の抗酸化活性を研究したが（ＯｙａｉｚｕおよびＭａｎｋｏｔｏ、１９８８、ＮｉｐｐｏｎＳｈｏｋｕｈｉｎＫｏｇｙｏＧａｋｋａｉｓｈｉ、ｖｏｌ．３５、ｐ７７１−７７５、その全文は本明細書中に援用される）、その研究では褐色生成物が化学的に同定されなかった。グルコサミンの分子構造を考えると、アルデヒドとアミノ基の双方が分解および／または重合に関与していると思われる。発色は共役二重結合と複合構造の形成を示唆する。
アルデヒド基の関与を試験するため、３０ｇ／ｌのグルコサミンを含み、４０ｇ／ｌのグルコースを含む、または含まないＭ９Ａ培地中で分解をモニターした。アルデヒド基が関与している場合、グルコースの存在はグルコサミンの分解／重合速度に影響すると考えられる。グルコサミン分解に有意な差は見られなかった。この観察はアミノ基のグルコサミン分解への役割を示唆する。
（Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−１８に対するグルコサミンの効果）
グルコサミンは重要な細胞壁成分の合成の前駆体であるので、Ｅ．ｃｏｌｉ生育に極めて重要である。Ｅ．ｃｏｌｉはグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンを唯一の炭素源として使用することも可能である。ミノ糖の異化作用には、７１０７−１８株では欠失しているｎａｇＢ遺伝子でコードされる機能性グルコサミンデアミナーゼを必要とする。予想通り、７１０７−１８株はグルコサミンを唯一の炭素源として含むプレート上で生育できなかった。４０ｇ／ｌのグルコースを含む培地中でグルコサミンがＥ．ｃｏｌｉ７１０７−１８細胞の生育と生存に影響するかどうかを研究する実験を行った。新規に接種した培養物の生育はリッター当たり１０および２０ｇのグルコサミンでわずかに阻害された。細胞プレート培養で示される様に、リッター当たり４０ｇのグルコサミンは細胞生育を阻止し、約１６時間のインキュベーションで細胞を死滅させはじめた。５２時間後、生存菌数は最初の数の約１／５に低下した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ７１０７−１８についてのグルコサミンの毒性効果を調べるためにさらに実験を行った。３５ｇ／ｌのグルコサミンを含むＭ９Ａ−グルコース（４０ｇ／ｌ）中に直ちに接種した細胞はかなり良く生育したが、３．５時間の短い時間プレインキュベーションした同じ培地中に接種した場合、細胞は急速に死滅した。このことは、殺菌は接種前に培地中で生成したグルコサミン分解生成物（複数）によることが多いことを示している。培地調製後直ちに接種した場合、何故細胞が生存し生育し得るかは分かっていない。一つの記載は、グルコサミンが生成物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに順番に分解され得る。細胞は比較的低濃度の初期生成物を許容または同化する能力を有するが、その後の生成物および／または高レベルの初期生成物はより毒性が高くなり得る。この仮説は、より高いグルコサミン濃度とより長いプレインキュベーション時間が生存菌数のより低いレベルをもたらすという観察と一致している。３５ｇ／ｌのグルコサミンでは、生存菌数は接種レベルより１０５倍低下した。
（Ｎ−アセチルグルコサミンの安定性）
ｐＨの効果で示唆される様に、アミノ基が分解に重要な役割を果たす様に思われる。これが真実である場合、Ｎ−アセチルグルコサミンははるかに安定でなければならない。さらに、ｐＨ効果もグルコサミンほど顕著になり得ない。Ｎ−アセチルグルコサミンの安定性をグルコサミン分解の実験と類似の実験で試験した。ｐＨ５．５および７における８０および４０ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンの安定性を無グルコースＭ９Ａ培地中で２日間にわたってモニターしたが、有意な分解を生じなかった（図１３）。これはグルコサミンで見られた分解と明瞭に対照的である。グルコサミンが分解すると、培地は琥珀色に発色した。Ｎ−アセチルグルコサミンを含むＭ９Ａ培地で４８時間に渡ってこの様な発色は見られなかった。さらに、インキュベーション中に有意なｐＨ低下がなかった。この結果より、遊離アミノ基がグルコサミンの分解および／または重合に関与する鍵となる官能基であることが確認される。
（Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−１８に対するＮ−アセチルグルコサミンの効果）
６２ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンを含むＭ９Ａ−グルコース（４０ｇ／ｌ）中に細胞を接種した。培地を８時間以上プレインキュベーションした場合でも、有意の生育阻害は観察されなかった。
まとめると、Ｎ−アセチルグルコサミンはＥ．ｃｏｌｉ７１０７−１８株に対し負の効果を持たず、グルコサミンよりはるかに安定であった。従って、グルコサミンの代わりにＮ−アセチルグルコサミンを生産することは潜在的に有利である。グルコサミンは細胞内に輸送され、サブユニットがｍａｎＸＹＺ遺伝子でコードされるマンノーストランスポーター、およびｐｔｓＧ遺伝子でコードされるグルコーストランスポーターでリン酸化されることが知られている。ｍａｎＸＹＺ遺伝子は７１０７−１８株で欠失しているが、グルコーストランスポーターでグルコサミン取り込みが行われる。培地中の濃度が高い場合、相当量のグルコサミンが細胞内に入り得る。７１０７−１８株中のマンノーストランスポーター（ｍａｎＸＹＺ）およびＮ−アセチルグルコサミントランスポーター（ｎａｇＥ）の欠失のため、細胞内輸送で戻ることなく、Ｎ−アセチルグルコサミンを培地内に高いレベルで蓄積し得る。これはＮ−アセチルグルコサミンのグルコサミンに対するまた別な利点である。
（実施例１２）
本実施例はグルコサミン測定のＨＰＬＣ法を記載する。
グルコサミンをクロマトグラフィーで定量する簡単な方法を開発することが望ましい。所望の方法の特性には、最小のサンプル調製と十分に正確なグルコサミン測定が必要である。本明細書に示す方法は、Ｗａｙらの報告に基づいている（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｔａｐｈｙ＆Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｎｏｌ．２３：２８６１、２０００）。Ｗａｙらの方法の移動相を変更することにより、グルコサミンのピークと振盪フラスコ細胞培養サンプル中に観測される他のピークとの分離が可能になった。
（方法の記載）
カラム： Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ（３）Ｃ１８−５μ、１５ ０×４．６ｍｍ（ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）
移動相： ＭｅＯＨ:水性緩衝液（１:４ｖ／ｖ）１０ｍＭ酢酸ナトリウムと１０ｍＭ
オクタンスルホン酸ナトリウム（ｐＨ５．１）。全移動相を以下のように
調製した。１リッターの脱イオン水に０．８ｇの酢酸ナトリウムと２．１
６ｇのオクタンスルホン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ特級）を加えた。塩を
溶解後、氷酢酸を用いてｐＨを５．１±０．１に調節した。この１リッタ
ー溶液に２５０ｍｌのメタノールを加え、溶液を脱気した。容器とカラム
を室温に保った。
流速： ０．７ｍｌ／分
検出器： 屈折率検出器、３０℃
サンプル： Ｍ９Ａ培地中１０μｌ
滅菌Ｍ９Ａ生育培地を注入すると、クロマトグラム上に２本の主なピークが得られた。さらに、そのクロマトグラムはＭ９Ａにグルコース、カルシウムおよびマグネシウム塩がない場合でも基本的に変化しなかった。グルコサミンをＭ９Ａに注入すると、さらに別な１本のピークが得られた。この様な条件下でグルコサミンは約１３分に溶出し、その直後に極めて大きい負ピークを伴った。さらに、ｐＨ、イオン強度、メタノール（ＭｅＯＨ）濃度またはオクタンスルホン酸濃度を変えてピーク分離を増加することは成功しなかった。この負のピークはグルコサミンピークに常に続いている。この様な負のピークを除去する通常の方法は、移動相でサンプルを希釈することである。しかしながら、サンプルを２０倍希釈しても負のピークを完全に除去せず、この様な高度希釈は振盪フラスコまたは醗酵槽由来のサンプルでは実用的でない。
ピーク面積の代わりにピーク高さを用いて積分することで、約５００〜１０、０００ｐｐｍの範囲で非常に正確なグルコサミンの定量が可能であることが見出された。その範囲を決めるためには、標準サンプルを水または移動相でなくＭ９Ａ中で調製することが必要であった。従って、サンプルをＭ９Ａ生育培地中で調製し、希釈もＭ９Ａを用いて行った。各サンプルで分析時間は２０分であった。
（方法の有効性検証）
まず、Ｍ９Ａ中のグルコサミンのいくつかの標準サンプルを調製した。繰り返し注入により、極めて正確な結果が得られた（±５％）。
次に、振盪フラスコサンプルを比色分析およびＨＰＬＣで分析した。得られた値は比色分析で一般に１０％以内であった。比色法に固有の標準偏差のために、ＨＰＬＣと比色法の間の密接な一致は必ずしも期待すべきでない。例えば、比色法で分析した二つのサンプル（双方とも１０、０００ｐｐｍ）は８．９および９．３ｇ／ｌの値であった。
第三に、振盪フラスコサンプルに既知の量のグルコサミンを添加し分析した。未希釈振盪フラスコサンプルでは１４９７ｐｐｍの値が得られた。等容積の５０００ｐｐｍグルコサミン標準サンプルで希釈後、希釈振盪フラスコサンプルは３４４０（期待値３２４０）の値を示した。期待値との不一致の一部はＭ９Ａの寄与である可能性が高い。事実、Ｍ９Ａ単独でも見掛けのグルコサミン「値」約１００ｐｐｍを与える。
振盪フラスコ培養サンプルをＨＰＬＣ法と比色法の両方で分析した。この結果を表１１に示す。培養上澄液を遠心分離と粒子を除去する濾過で得て、分析まで−２０℃で保存した。Ｍ９Ａ培地中で調製した２５００ｐｐｍの１点標準溶液を用いてＨＰＬＣを補正した。解凍後、サンプルを即座にＨＰＬＣで分析した。オートサンプラー中に終夜置いた後、サンプルを再度分析した。二つの方法間で一致は極めて良好であった。数週間−２０℃で保存したサンプルでもグルコサミン濃度の減少は見られなかった。濾過サンプルを室温で終夜放置しても、グルコサミン濃度は減少しなかった。
表１１．グルコサミン定量のためのＨＰＬＣ法と比色法の比較＊
Figure 2013009690
＊培養サンプルを遠心分離し、濾過して粒子を除き、分析まで−２０℃で保存した。ＨＰＬＣ分析を解凍サンプル（０時間）で行い、サンプルをオートサンプラー中に室温で終夜置いた後に分析を繰り返した（２４時間）。グルコサミン濃度はｐｐｍで示される。
（実施例１３）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミン生産のためのグルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ１遺伝子（ＧＮＡ１）の過剰発現を記載する。
以下の実施例はＮ−アセチルグルコサミン生産を増加するための、異なったグルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ１遺伝子（ＧＮＡ１）の組み換えＥ．ｃｏｌｉ中の過剰発現を記載する。この戦略の実用可能性を、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳｃＧＮＡ１）、酵母Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ（ＣａＧＮＡ１）および高騰植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＧＮＡ１）由来のＧＮＡ１遺伝子を含むｐＥＴ系発現ベクターで示した。
ＧＮＡ１のクローニングと発現を、ＧＮＡ１遺伝子コード配列をｐＥＴベクター中のＴ７ｌａｃプロモーターの後ろにクローニングし、ｐＥＴプラスミドをラクトース誘導グルコサミン生産株Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７―１８株中に形質転換して行った。遺伝子の機能性発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性分析で測定した。Ｎ−アセチルグルコサミンの合成を振盪フラスコ実験でモニターした。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧＮＡ１遺伝子のクローニング）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１遺伝子（ＳｃＧＮＡ１）をクローニングするため、ＧＮＡ１遺伝子の公開された配列（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９９５、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０、ｐ２６１−１６８、その全文は本明細書中に援用される）に基づいてプライマーを合成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２８８Ｃから単離されたゲノムＤＮＡ由来のＧＮＡ１コード配列を増幅するため、プライマーを使用した。増幅に用いたプライマーは前方プライマー０７−８３および反転プライーマー０７−８４であり、以下の配列を有した：０７−８３；５’−ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＡＧＣＴＴＡＣＣＣＧＡＴＧＧＡＴＴＴＴＡＴＡＴＡＡＧＧＣ−３’（配列番号３５）；０７−８４：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＴＧＣ−３’（配列番号３６）。プライマー０７−８３はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＧＴＣＴＣ、配列番号３５のヌクレオチド５〜１０に示される）と、その後のＡＴＧ開始コドンから始まるＧＮＡ１コード配列の３１個のヌクレオチド（配列番号３６のヌクレオチド１３〜４３に示される）を含む。プライマー０７−８４はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号３６のヌクレオチド５〜１０に示される）と、その後の翻訳停止コドンで始まるＧＮＡ１コード領域の３０個のヌクレオチド（配列番号３６のヌクレオチド１１〜４０に示される）を含む。標準プロトコールを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ部位に側面する全ＳｃＧＮＡ１コード配列を含むＤＮＡフラグメントを生成した。
ＧＮＡ１配列を含むＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）中にクローニングし、プラスミドｐＳＷ０７−６０を生成した。ＳｃＧＮＡ１フラグメントをＢｓａＩおよびＸｈｏＩ消化でプラスミドＰＳＷ０７−６０から単離し、発現ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングし、プラスミドＳＷ０７−６０を生成した。この方法のクローニングはＳｃＧＮＡ１並列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７−ｌａｃプロモーターの後ろに置き、発現カセットＴ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を作成する。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのＣ．ａｌａｂｉｃａｎｓ ＧＮＡ１遺伝子のクローニング）
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＮＡ１（ＣａＧＮＡ１）のクローニングと発現のために、ＧＮＡ１の公開された配列（Ｍｉｏら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、ｐ４２４−４２９、その全文は本明細書中に援用される）に基づいてプライマーを合成した。ＰＣＲを用いてＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓゲノムＤＮＡ由来のＧＮＡ１コード配列を増幅するため、プライマー０７−９２および０７−９３を使用した。前方プライマー０７−９２および逆方向プライマー０７−９３は以下の配列を有した：０７−９２：５’−ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＡＴＧＴＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＴＴＡＴＡＣ−３’（配列番号３７）および０７−９３：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＴＡＣＡＴＡＣＣＡＴＴＴＣＡＡＣ−３’（配列番号３８）。プライマー０７−９２はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＴＴＣＴＣ、配列番号３７のヌクレオチド５〜１０に示される）と、その後のＡＴＧ開始コドンから開始するＧＮＡ１コード配列の２３個のヌクレオチド（配列番号３７のヌクレオチド１３〜３５で表される）を含む。プライマー０７−９３はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号３８のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンで開始するＧＮＡ１コード配列の２４ヌクレオチド（配列番号３８のヌクレオチド１１〜３４で表される）を含む。ＰＣＲ増幅を標準条件下で行い、ＢｓａＩとＸｈｏＩ部位に側面する全ＣａＧＮＡ１コード領域を含むＤＮＡフラグメントを生成した。
ＣａＧＮＡ１配列を含むＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）のＳｒｆＩ部位中へライゲートし、プラスミドｐＫＬＮ０７−３３を生成した。ＣａＧＮＡ１フラグメントを制限酵素ＢｓａＩおよびＸｈｏＩでプラスミドｐＫＬＮ０７−３３から単離し、発現ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位へクローニングしてプラスミドｐＫＬＮ０７−３４およびｐＫＬＮ０７−３５を生成した。この方法のクローニングはＣａＧＮＡ１配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモーターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ＣａＧＮＡ１の発現カセットを作製する。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＧＮＡ１遺伝子のクローニング）
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＧＮＡ１（ＡｔＧＮＡ１）のクローニングと発現のため、プライマー０７−９４および０７−９５をＧＮＡ１の公開された配列（ＧｅｎｅｂａｎｋＡＬ３９１１４４）に基づいて合成した。プライマーをＰＣＲを用いるＢＡＣクローンＦ１４Ｆ８（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ＤＮＡ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）由来のＧＮＡ１コード配列を増幅するために使用した。前方プライマー０７−９４および逆方向プライマー０７−９５は以下の配列を有した：０７−９４：５’−ＧＡＴＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号３９）；および０７−９５：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＴＴＡＧＡＣＡＴＴＴＧＡＡＴＣ−３’（配列番号４０）。プライマー０７−９４はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＧＴＣＴＣ、配列番号３９のヌクレオチド４〜９で示される）と、その後のＡＴＧ開始コドンから開始するＧＮＡ１コード配列の２１個のヌクレオチド（配列番号３９のヌクレオチド１２〜３２で示される）を含む。プライマー０７−９５はＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号４０のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンで始まるＧＮＡコード配列の２４ヌクレオチド（配列番号４０のヌクレオチド１１〜３８で表される）を含む。標準プロトコールを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ部位に側面する全ＧＮＡ１コード配列を含むＤＮＡフラグメントを作成した。ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、発現ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＳＷ０７−７０を作成した。この方法のクローニングはＡｔＧＮＡ１配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモーターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ＡｔＧＮＡ１の発現カセットを作成する。
（別な組換えＧＮＡ１遺伝子の発現とＥ．ｃｏｌｉ中のＮ−アセチルグルコサミン生産）
組換えプラスミドｐＳＷ０７−６２（Ｓ，ｃｅｒｖｉｓｉａｅＧＮＡ１遺伝子を含む）、ｐＫＬＮ０７−３４（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子を含む）およびｐＳＷ０７−７０（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子を含む）をＥ．ｃｏｌｉ株７１０７−１８中に形質転換し、７１０７−８７株、７１０７−１１７株および７１０７−９３株をそれぞれ作成した。空のベクターを同じ宿主に形質転換して対照株７１０７−８８を調製した。標準プロトコールに従い、形質転換体の細胞培養物をＬＢ培地中で生育させ、１ｍＭＩＰＴＧで誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため誘導培養物から試料を取り、ＧＮＡ１タンパク質の過剰発現を確認した。ＡｔＧＮＡ１、ＣａＧＮＡ１およびＳｃＧＮＡ１の予想タンパク質サイズはそれぞれ１７ｋＤａ、１６．９ｋＤａおよび１８．１ｋＤａであった。予想されたサイズの過剰発現タンパク質が様々なＧＮＡ１遺伝子を発現する誘導培養物由来の試料で見られた。全ての場合で、過剰発現タンパク質は極めて可溶性である様に思われた。予想通り、対照株７１０７−８８中にはＧＮＡ１遺伝子の予想されたサイズの過剰発現タンパク質は見られなかった。
異なったＥ．ｃｏｌｉ株のスクリーニングを行って組換えＧＮＡ１遺伝子の機能性発現を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびａ．ｔｈａｌｉａｎａ発現ベクターの宿主である株をＭ９Ｂ生産培地中で生育させた［６ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、２４ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／ｌクエン酸Ｎａ３、１０ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４（リン酸塩でｐＨ７．４に調整）＋微量金属（０．２ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌ ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌ Ｈ３ＢＯ３および０．００１ｍｇ／ｌＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、４０ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ リボース、５ｇ／ｌ 酵母抽出液、０．６ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２５ｍｇ／ｌカナマイシンおよび０．２ｍＭ ＩＰＴＧを補充］。２４時間目にＨＰＬＣの結果に基づいてグルコースを１日当たり３０ｇ／ｌ添加し、レベルが１ｇ／ｌ以下に下降している場合は５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコに添加した。一つのフラスコは２４時間に収穫し、もう一方のフラスコは４８時間で酵素分析とＮ−アセチルグルコサミンおよび酢酸レベルを行える様に、二重のフラスコを作成した。
グルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）活性を分析したところ、全ての株は良好な活性レベルであった。Ｍｉｏら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９、２７４、ｐ４２４−４２９）が報告した方法に従い、試料のグルコサミン−６−Ｐ Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）酵素活性も測定した（表１２）。予想通り、対照株は有意なレベルのＧＮＡ１活性を示さなかった。酵母および高等植物ＧＮＡ１遺伝子の発現により、高いアセチルトランスフェラーゼ活性が得られた。これらのＧＮＡ１形質転換体も非常に高いレベルでＮ−アセチルグルコサミンを合成した（表１２および１３）。Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ（７１７０−８７）およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ（７１７０−１１７）由来のＧＮＡ１遺伝子発現株におけるアセチルトランスフェラーゼ活性は同程度であった。しかしながら、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子を発現する株中でＮ−アセチルグルコサミン生産は４倍高かった。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子を有する株中のＧＮＡ１酵素活性はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子を有する株より低いが、Ｎ−アセチルグルコサミン生産は前者中の方が後者中より高かった。明らかに、ＧＮＡ１活性とＮ−アセチルグルコサミン生産の間に単純な相関はない。様々な起原由来のＧＮＡ１酵素は酵素特性が異なっていると思われる。データは、Ｎ−アセチルグルコサミンを生産するための代謝遺伝子工学に異なったＧＮＡ１遺伝子の有用性を示している。試験した３種のＧＮＡ１遺伝子間で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１がＮ−アセチルグルコサミン生産に関して優れていた。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１遺伝子を本発明に開示した以後の研究用に選択した。
（表１２．３種の異なったＧＮＡ１遺伝子を発現する株におけるグルコサミンシンテターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ活性）
Figure 2013009690
１）酵素活性はμｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１で表される。
２）Ｎ−アセチルグルコサミンレベルは２３時間の時点で採集した試料で測定された。
３）括弧内の数は異なった同胞種を示す。
７１０７−１８株はＨＰＬＣで検出し得る高レベルのグルコサミンを生産する。しかしながら、アセチルトランスフェラーゼを過剰発現する株では僅かな（０．５ｇ／ｌ以下）遊離グルコサミンしか検出されないか、全く検出されなかった。これは中間体であるグルコサミン−６−ＰがＧＮＡ１形質転換体で有意に精製されなかったことを示し、酵素ＧＮＡ１が高レベルのＮ−アセチルグルコサミンに対する主な駆動力であることを確認した。
酢酸の蓄積が、高レベルの組換えタンパク質およびその他の発酵生成物をＥ．ｃｏｌｉ中で達成する障害であることが認められている。培地中に過剰のグルコースがあると、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は高レベルの酢酸およびその他の有機酸を合成する傾向があり、通常、生育阻害を生じる。酢酸の生成はグルコサミン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株でも問題である。しかしながら、Ｎ−アセチルグルコサミン生産株は、対照株が数グラムレベルの酢酸を蓄積する条件下でも、２３時間の時点でも僅かな酢酸を蓄積するか、全く蓄積しなかった。Ｎ−アセチルグルコサミンの合成は酢酸生成の前駆体であるアセチルＣｏＡを消費する。アセチルＣｏＡの使用は細胞に課せられる代謝負担であるが、アセチルＣｏＡをＮ−アセチルグルコサミン生産へ向けることは、酢酸の蓄積を避ける点で明らかに有利である。Ｎ−アセチルグルコサミン生産株が対照株より高い細胞密度を示したことに注目することが重要である（表１３）。
（表１３．異なったＧＮＡ１発現コンストラクトで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株における細胞生育とＮ−アセチルグルコサミン生産）
Figure 2013009690
（異なったＧＮＡ１酵素の配列解析）
様々なＧＮＡ１遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株における比活性とＮＡＧ生産に関してかなりの差が観察された。しかしながら、全ての酵素は同じ反応を触媒するので、核酸およびタンパク質レベルで様々なＧＮＡ１間に相同性が予想される。配列番号２９はＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１遺伝子のコード配列を含む。配列番号２９は本明細書において配列番号３０で表されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１アミノ酸配列をコードする。配列番号３３はＡ．ｔｈａｌｉａｎａＧＮＡ１遺伝子のコード配列を含む。配列番号３３は本明細書において配列番号３４で表されるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＧＮＡ１アミノ酸配列をコードする。配列番号３１はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＮＡ１遺伝子のコード配列を含む。配列番号３１は本明細書において配列番号３２で表されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓアミノ酸配列をコードする。Ｊ．Ｈｅｉｎ ＤＮＡ整列法（ＤＮＡ Ｓｔａｒ参照）で整列した場合、核酸配列は有為の相同性を示した。ＳｃＧＮＡ１とＡｔＧＮＡ１コード配列は４９．７％同一を共有し、ＳｃＧＮＡ１とＣａＧＮＡ１コード配列は５３．１％同一を共有する。ＣａＧＮＡ１とＡｔＧＮＡ１コード配列は４７．２％同一を共有する。
コード配列をアミノ酸配列に翻訳すると、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎタンパク質整列法（ＤＮＡ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で整列した場合、様々なＧＮＡ１タンパク質間に有為の相同性があることが分かった。表１４で分かる様に、ＳｃＧＮＡ１配列（配列番号３０）はＧａＧＮＡ１配列（配列番号３２）と４４％同一を共有し、ＡｔＧＮＡ１（配列番号３４）と３８．９％同一を共有する。ある領域はより高度に保存されていると思われる；例えばアミノ酸ＣＨＩＥＤは全ての配列で保存されていた（ＳｃＧＢＡ１配列（配列番号３０）の９６〜１００アミノ酸と整列）。また、配列番号３０のＳｃＧＮＡ１残基１２９〜１４８に対応する２０残基領域は高度に保存された。この領域はＣａＧＮＡ１配列中の対応する領域と７５％同一を、ＡｔＧＮＡ１配列中の対応する領域と７０％同一を有していた。
（表１４．ＳｃＧＮＡ１、ＡｔＧＮＡ１およびＣａＧＮＡ１のペプチドサイズと相同性）
Figure 2013009690
＊ヌクレオチドレベルの相同性が括弧内に示される。
（実施例１４）
本実施例はＥ．ｃｏｌｉ ｎａｇＢおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１の過剰発現によりＮ−アセチルグルコサミンを生産する株の構築を説明する。
グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ（ＮａｇＢ）をコードするｇａｎレギュロンの一部であるｎｇＢ遺伝子は、ｎａｇレギュロンの一部としてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の異化作用経路に含まれる。ｎａｇレギュロンはオペロンｎａｇＢＡＣＤおよび別に転写され他ｎａｇＥで構成される（Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ、ＪＡ．、１９９１、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：２０５３−２０６２）。外来性ＧｌｃＮＡＣは細胞内に輸送されてリン酸化され、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐを生成する。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼをコードするｎａｇＡ遺伝子生成物はＧｌｃＮＡｃ−６−ＰをＧｌｃＮ−６−Ｐへ変換する。次いでＮａｇＢがＧｌｃＮ−６−Ｐのフラクトース−６−リン酸（Ｆ−６−Ｐ）への変換を触媒する。
Ｅ．ｃｏｌｉ中のｇｌｍＳ遺伝子生成物は、リポ多糖とペプチドグリカン生成経路中の必須中間体であるのＧｌｃＮ−６−Ｐの合成を触媒する。従って、ｇｌｍＳ欠損変異体は外来性ＧｌｃＮまたはＧｌｃＮＡｃ依存性である。しかしながら、ＮａｇＢが通常はＧｌｍＳで行われる反応を触媒し、Ｆ−６−ＰをＧｌｃＮ−６−Ｐに変換することが知られている。事実、グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ（ｎａｇＢ）を発現する高コピープラスミドでｇｌｍＳ変異体を形質転換すると、ｇｌｍＳ変異を抑制することが示されている（Ｊ．Ｂａｃ．、１９８９年１２月；１７１（１２）：６５８９−６５９２）。ＮａｇＢはＦ−６−ＰからＧｌｃＮ−６−Ｐへの変換を触媒し得るので、我々の生産株でｇｌｍＳ＊５４の代わりにｎａｇＢを過剰発現することでグルコサミンを蓄積することが可能である。Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットもその株中に存在する場合、ＧｌｃＮ−６−ＰをＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐに変換しＮＡＧとして培地中に蓄積することが可能であると思われる。
ｎａｇＢ遺伝子の過剰発現によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン生産効率を試験するため、ＮＧＡ１のクローニングと組み込みのために報告された方法とプロトコールを、Ｅ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）の染色体中のｐｆｋＢ部位にＴ７ｌａｃ−ｎａｇＢ発現カセットをクローニング死組み込むために採用した。外来性ｇｌｍＳ遺伝子もこの株で不活性化する必要がある。ｇｌｍＳ配列はｇｌｍＳの上流に明白なプロモーター配列を持たず、ｇｌｍＵ配列から下流に位置している。ｇｌｍＵおよびｇｌｍＳはオペロンｇｌｍＳを形成していると思われる。ｇｌｍＳ配列と側面配列のいくつかがＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅され、プラスミドベクター中へクローニングされた。ｇｌｍＳ配列由来の内部フラグメントを除去するため、適当な制限消化を用いた。内部欠失を有するｇｌｍＳ配列を温度感受性複製開始点とカナマイシン選択マーカーにライゲートし、組み込みベクターを作成した。ｇｌｍＳ欠失を有する変異体を選択するため、温度選択プロトコールを使用した。グルコサミンは細胞壁合成に必要であるので、変異体の生育のためにグルコサミンを培養培地に補給する必要がある。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのｎａｇＢのクローニング）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｎａｇＢ遺伝子の公開された配列に基づく情報（Ｐｅｒｉら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６８、ｐ１２３−１３７）を用いて、ｎａｇＢコード配列を増幅するためにプライマーを設計した。異化の配列を有する前方プライマー０７−１４１および逆方向プライマー０７−１４２を使用し、ｎｇＢコード配列をＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した：０７−１４１；５’−ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＴＣ ＧＣＡ ＴＧＡ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＧＡ ｃ−３’（配列番号４３）、および０７−１４２；５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＣＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＡＴＴ ｃ−３’（配列番号４４）。
プライマー０７−１４１はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＧｔＣＴＣ、配列番号４３中のヌクレオチド４〜９で表される）と、その後のＡＴＧ開始コドンから始まるｎａｇＢコード配列の２０個のヌクレオチド（配列番号４３中のヌクレオチド１２〜３１で表される）を含む。プライマー０７−１４２はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号４４のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンからのｎａｇＢコード配列の３３ヌクレオチド（配列番号４４のヌクレオチド１１〜４４で表される）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ｎａｇＢコード配列とＮａｇＢアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４１と配列番号４２で表される。
ｎａｇＢコード配列を含むＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−９３を作成した。この方法によるクローニングにより、ｎａｇＢ配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７−ｌａｃプロモーターの後ろに置き、Ｔ７−ｌａｃ−ｎａｇＢの発現カセットを作成した。
（ｎａｇＢ遺伝子の過剰発現）
プラスミドｐＳＷ０７−９３＃３、＃８および＃１６を７１０１−１７株（ＤＥ３）中に形質転換し、株７１０７−６３６、７１０７−６３７および７１０７−６３８をそれぞれ作成した。ｐＥＴ２４ｄ（＋）プラスミドも７１０１−１７株中に形質転換し、陰性対照株７１０７−６３９を作成した。形質転換体の培養細胞をＬＢ培地中で生育させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する標準誘導実験を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために様々な時点で誘導培養物から試料を採取し、ＮａｇＢタンパク質過剰発現を確認した。過剰発現ＮａｇＢタンパク質の予想サイズは２９．８ｋＤａである。予想されたサイズのＮａｇＢタンパク質に相当するタンパク質が７１０７−６３６および７１０７−６３７株で過剰生産された。対照株７１０１−６３９ではこのサイズの過剰生産タンパク質は明瞭でなかった。誘導２時間後のタンパク質試料は、過剰生産ＮａＢタンパク質のほとんどが可溶性分画中にあることを示した。しかしながら、誘導後４時間では、可溶性分画中に約２５％のタンパク質しか現れなかった。
（Ｔ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットの染色体中のｐｆｂＫ部位への組み込み）
ＮａｇＢの過剰発現に成功したことを確認後、次の工程はＴ７ｌａｃ−ｎａｇＢ発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）の染色体中に組み込むことであった。Ｅ．ｃｏｌｉ染色体のｐｆｋＢ遺伝子へ組み込みを目標にすることが決定された。ｐｆｋＢ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中に存在する全ホスフォフラクトキナーゼの１０％を供給する主要ホスフォフラクトキナーゼをコードする。従って、この部位に組み込むことを標的とすることは、生育またはＮ−アセチルグルコサミン生産を損なわないと考えられる。
Ｔ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットを７１０１−１７（ＤＥ３）株中の染色体のｐｆｋＢに組み込むことを指向するベクターの開発には、数回のクローニング工程が必要であった。第一工程は、ｐｆｋコード配列＋側面領域を含むＥ．ｃｏｌｉゲノム由来の領域をクローニングすることである。プライマーを公開された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７（５３３１）：１４５３−１４７４）に基づいて設計し、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡからｐｆｋＢ＋側面ゲノム領域を増幅した。ＰＣＲでｐｆｋＢ領域を増幅するために用いられたプライマー０７−１６および０７−１７は異化の配列を有した：０７−１６；５’−ＧＡＴ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＴＴ ＡＣＡ ＴＧＣ ＴＧＴ ＡＧＣ ＣＣＡＧＣ―３’（配列番号４５）および５’−ＣＡＴ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＴＡ ＡＴＡ ＡＴＣ ＴＡＴＣＣ−３’（配列番号４６）。
プライマー０７−１６はＮａｅＩ部位（ＧＣＣＧＧＣ、配列番号４５のヌクレオチド５〜１０で表される）を含み、ｐｆｋＢコード配列開始コドンの上流の１０４５ヌクレオチド（配列番号４５のヌクレオチド１１〜２９で表される）から増幅する。プライマー０７−１７はＰｓｔＩ部位（ＣＴＧＣＡＧ、配列番号４６のヌクレオチド５〜１０で表される）を加え、ｐｆｋＢ停止コドンの下流の１３５７塩基対（配列番号４６のヌクレオチド１１〜３２で表される）から増幅する。ｐｆｋＢ＋側面領域を含む３３３２塩基対ＰＣＲ生成物のｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）中へのライゲーションにより、プラスミドｐＫＬＮ０７−１６を作成した。
Ｔ７−ｌａｃ−ｎａｇＢカセットを標準ＰＣＲ条件で、前方プライマー０７−１４５および逆方向プライマー０７−１４６を用いてプラスミドｐＳＷ０７−９３＃３（上記参照）から増幅した。プライマーは以下の配列を有する：０７―１４５；５’−ＧＡＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＧ ＣＡＡ ＣＣＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＧＣ―３’（配列番号４７）および０７−１４６；５’−ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＡＴ ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＧＣ−３’（配列番号４８）。
プライマー０７−１４５はＳｎａＢＩ部位（ＴＡＣＧＴＡ、配列番号４７のヌクレオチド５−１０で表される）を有し、Ｔ７プロモーターの上流の７６ヌクレオチド（配列番号４７のヌクレオチド１１〜２８で表される）から増幅する。プライマー０７−１４６はＭｆｅＩ部位（ＣＡＡＴＴＧ、配列番号４８のヌクレオチド５〜１０で表される）を有し、Ｔ７ターミネーターの下流の２５塩基対（配列番号４８のヌクレオチド１１〜３６で表される）から増幅する。
次のクローニング工程は、Ｔ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットをプラスミドｐＫＬＮ０７−１４中へライゲートすることである。プラスミドｐＫＬＮ０７−１４を制限エンドヌクレアーゼＳｎａＢＩおよびＭｆｅＩで消化し、ｐｆｋＢコード配列の５２３ｂｐ部分を除去した。Ｔ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットを含むＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＳｎａＢおよびＭｆｅＩで消化し、ｐＫＬＮ０７−１４のＳｎａＢおよびＭｆｅＩ部位へライゲートしてプラスミドｐＳＷ０７−９７を作成した。従って、プラスミドｐＳＷ０７−９７はＴ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットで置換されたｐｆｋＢコード配列の５２３ヌクレオチド領域を有するｐｆｋＢ＋側面ゲノム領域を含む。
ＯＲＦｂ１７２２−ＤｐｆｋＢ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｎａｇＢ−ＯＲＦｂ１７２５プラスｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＭＣＳを含むフラグメントを、プラスミドｐＳＷ０７−９７から制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。温度感受性レプリコン＋カナマイシン耐性カセットを含むフラグメントをプラスミドｐＫＬＮ０７−２１から、制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで切り出した。この二つのフラグメントを共にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−９８を作成した。
プラスミドｐＳＷ０７−９８を用いて染色体のＤｐｋｆＢにＴ７ｌａｄ−ｎａｇＢを有するＥ．ｃｏｌｉ株を作成した。Ｅ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）株をｐＳＷ０７−９８で形質転換後、温度選択プロトコールを用いてｐｆｋＢ部位に組み込まれたＴ５−ｌａｃ−ｎａｇＢを有する株を選択した。得られた株は７１０７−６４５と呼ばれ、その株を、ｎａｇＢコード領域をプローブとして用いて標準高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで確認した。
（組み込みＴ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットを有するＥ．ｃｏｌｉ株中のｇｌｍＳ遺伝子の欠失）
Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７−６４５のｇｌｍＳ遺伝子を欠失するため、ｇｌｍＳ配列置換ベクターを開発した。このベクターを構築するためには数工程を要した。第一工程はｈｌｍＳ遺伝子＋側面配列を含むゲノム領域の増幅である。このフラグメントは次に、温度感受性レプリコンとカナマイシン耐性カセットを含むｐＫＬＮ０７−２１由来のフラグメント（上記）とライゲートされる。最後に、ｇｌｍＳコード配列の一部を得られたプラスミドから切除し、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムのｇｌｍＳ欠失を標的とする組み込み可能ベクターを作成する。
最初の工程では、ｇｌｍＳ遺伝子プラス側面領域の公開された配列（参考文献）に基づいてプライマーが合成された。このプライマーはＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡ由来のｇｌｍＵ、ｇｌｍＳおよびｐｓｔＳ遺伝子を含むフラグメントを増幅するために使用された。増幅に使用されたプライマーは０７−１３９および０７−１４０と呼ばれ、以下の配列を有する：０７−１３９；５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＴＧＴ ＴＧＡ ＡＴＡ ＡＴＧ ＣＴＡ ＴＧＡ ＧＣＧ ＴＡＧ ＴＧＡ ＴＣ−３’（配列番号４９）および０７−１４０；５’−ＧＡＴ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＡＧＴ ＡＣＡ ＧＣＧ ＧＣＴ ＴＡＣ ＣＧＣ ＴＡＣ ＴＧＴＣ―３’（配列番号５０）。
前方プライマー０７−１３９はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号４９のヌクレオチド４〜１１で表される）が先行する、そのＡＴＧ開始コドン由来のｇｌｍＵコード配列の最初の３０ヌクレオチド（配列番号４９のヌクレオチド１２〜４１で表される）を含む。逆方向プライマー０７−１４０はＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＴＧＡＣ、配列番号５０の５〜１１ヌクレオチドで表される）が先行する、その翻訳停止コドンから開始するｐｓｔＳコード配列の２７ヌクレオチド（配列番号５０のヌクレオチド１１〜３７で表される）を含む。標準条件下でＰＣＲを行って、ＢｏｔＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に側面するｇｌｍＵ−ｇｌｍＳ−ｐｓｔＳコード配列を作成した。
ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。温度感受性レプリコン＋カナマイシン耐性カセットフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩで、プラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切り出した。二つのフラグメントを互いにライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−９４＃４３を作成した。
プラスミドｐＳＷ０７−９４＃４３を制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩＩで消化し、ｇｌｍＳコード配列の９８０ヌクレオチドを除去した。プラスミドの残りをそれ自体にライゲートし、組み込みベクターｐＳ０７−９５を作成した。
Ｅ．ｃｏｌｉ染色体上にｇｌｍＳ変異を生じるための組換え頻度を改善するため、ｇｌｍＵの上流の領域の７７２ヌクレオチドをプラスミドｐＳＷ０７−９５に加えてプラスミドｐＳＷ０７−９９も構築した。ｇｌｍＵ＋側面領域の公開された配列（参考文献）に基づいてプライマーを合成した。ｇｌｍＵ開始コドンの上流の７２２ヌクレオチドを含むフラグメント、およびＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡ由来のｇｌｍＵコード領域の最初の２４６ヌクレオチドを含むフラグメントを増幅するためにこのプライマーを使用した。増幅に使用したプライマーは０７−１４７および０７−１４８と呼ばれ、以下の配列を有した：０７−１４７；５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＴＧＧ ＣＡＡ ＴＧＡ ＣＴＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＡＣ−３’（配列番号５１）および０７−１４８；５’−ＣＧＴ ＡＣＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＣ−３’（配列番号５２）。
前方プライマー０４−１４７は、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号５１のヌクレオチド１２〜１１で表される）が先行する、ａｔｐＣコード配列の最初の２４ヌクレオチド（配列番号５１のヌクレオチド１２〜３５で表される）を含む。逆方向プライマー０７−１４８は、ＡＴＧ開始コドンの下流の２４６塩基対から始まるｇｌｍＵコード領域の２９ヌクレオチド（配列番号５２のヌクレオチド１〜２９で表される）を含む。標準条件下でＰＣＲを行い、ａｐｔＣ開始コドンからｇｌｍＵコード配列のヌクレオチド２４６までのゲノムＤＮＡを含むフラグメントを作成した。ＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳｅｘＡＩで消化し、プラスミドｐＳＷ０７−９５＃６のＮｏｔＩおよびＳｅｘＡＩ部位中にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−９９を作成した。
プラスミドｐＳＷ０７−９５およびプラスミドｐＳＷ０７−９９を用いて、染色体上にｇｌｍＳ欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ株を作成した。Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７―６４５（２０）、７１０７−６４５（３０）および７１０７―６４５（４３）のプラスミドｐＳＷ０７−９５またはｐＳＷ０７−９９による形質転換後、温度選択プロトコールを用いてｇｌｍＳ欠失を有する株を選択した。グルコサミン（２ｇ／ｌ）を継代培養用の全てのフラスコおよび継代培養後の全てのプレートに加えた。標準ＰＣＲプロトコールを用いて、カナマイシン感受性株をｇｌｍＳ欠失の存在で選択／スクリーニングした。ＰＣＲで同定した潜在的ｇｌｍＳ欠失株を、グルコサミンを添加せずにＬＢプレートに播種し、生育減少を探した。株の一部はＬＢプレート上で生育が制限されたが、その他の株では生育しなかった。これらの株はｇｌｍＳコード領域を有する２．０ｋｂフラグメントを用い、高ストリンジェント条件下のサザンハイブリダイゼーションでｇｌｍＳ欠失を有すると確認された。得られた株は７１０７−６４６と呼ばれた。
（ｎａｇＢの機能的発現およびグルコサミン生産に対する効果）
グルコサミン生産および酵素活性につき試験株７１０７−６４６を試験するため、振盪フラスコスクリーン６１を行った。Ｍ９Ｂ培地を含むフラスコ中で株を試験した［ＫＨ２ＰＯ４ ６ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２４ｇ／ｌ、クエンサン３Ｎａ・Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／ｌ＋微量金属（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１５ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２０ ０．０１５ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０ ０．００１ｍｇ／ｌ、ＮａＭＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．００１ｍｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ０．００１ｍｇ／ｌおよびＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．００１ｍｇ／ｌ）］、グルコース １０ｇ／ｌ 、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ０．６ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ／ｌ、およびＩＰＴＧ ０．２ｍＭ補充。培養細胞を３０℃で２４時間生育させ、２５℃に置いた。画培養液のｐＨを２４時間および４８時間に７．２に調節した。２４および４８時間目にグルコースを一日当たり３０ｇ／ｌでフラスコに加え、レベルが１ｇ／ｌ以下に低下した場合、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコに加えた。試料を２４および４８時間に採取し、米国特許第６、３７２、４５７号に記載の修正Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ分析を用いて培養液上澄中のグルコサミン濃度を測定した。どの試料にもグルコサミンは検出されなかった。７１０７−６４６＃７および７１０７−６４６＃２０株由来の４８時間試料をＮａｇＢ活性について分析した。検出可能な活性がなかった対照株７１０７―１７（Ｄ３）と比較して、これらの株は５８および５３ｍｍｏｌ・ｍｉｎ−１・ｍｇ−１の活性を有し、ｎａｇＢの過剰発現が成功したことを示した。この実験で７１０７−６４６株が対照株７１０１−１７（ＤＥ３）と同様またはそれ以上に良い生育を示した事実は、過剰発現ｎａｇＢがｇｌｍＳ変異を抑制し得ることを示した。しかしながら、ｎａｇＢの過剰発現がグルコサミン蓄積を増加させる結果とはならなかった。
（Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込み）
ｇｌｍＳ欠失株中のｎａｇＢの過剰発現によりグルコサミンが蓄積しなかったが、これは多分、ＮａｇＢが通常はＧｌｃＮ−６−Ｐの脱アミノ化を触媒すると言う事実のためと思われる。ＮａｇＢ酵素で製造される少量のＧｌｃＮ−６−Ｐは速やかにフラクトース−６−Ｐに変換して戻り、ＧｌｃＮ−６−Ｐの蓄積を阻止している。しかしながら、ＧＮＡ１酵素が誘導された場合、ＧＮＡ１はＧｌｃＭ−６−ＰをＧｌｃＡｃ−６−Ｐに変換し、フラクトース−６−Ｐからグルコサミン−６−Ｐの生成を連続的に駆動する。この可能性を試験するため、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットを７１０７−６４６（３）および７１０７−６４６（７）株のｍａｎＸＹＺに組み込んだ。ＧＮＡ１の組み込みはプラスミドｐＳＷ０７−６＃２５により実施例１６で行われた。ｍａｎＸＹＺ欠失部位におけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１の存在について、カナマイシン感受性株を標準ＰＣＲプロトコールでスクリーニングした。ＰＣＲ陽性の株を、ＳｃＧＮＡ１コード配列をプローブとして含むフラグメントを用いる標準高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで確認した。７１０７−６４６（３）および７１０７−６４６（７）株由来の得られた７１０７−６６０および７１０７−６６１株それぞれにつき、ＮＡＧ蓄積を試験した。
（ｎａｇＢの機能性発現およびＥ．ｃｏｌｉ中のＮ−アセチルグルコサミン生産）
ｇｌｍＳ欠失、ｐｆｋＢにおけるＴｌａｃ−ｎａｇＢカセット、およびＮ−アセチルグルコサミン生産のためのｍａｎＸＹＺにおけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＢＮＡ１カセットを有する株を試験するため、振盪フラスコスクリーニング試験を行った。７１０７−６６０（１）、７１０７−６６０（４）、７１０７−６６１（１）、７１０７−６６０（４）、７１０７−６６１（２）および７１０７−６６１（３）株、および対照７１０１−１７および７１０１−６０７（２）株を、グルコース １０ｇ／ｌ、ラクトース １０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ０．６ｇ／ｌ、およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ／ｌを補充したＭ９Ｂ培地（上記）を含む振盪フラスコ中で生育させた。培養細胞を３７℃で８時間生育させ、その後３０℃に置いた。接種後８時間でグルコースを２５ｇ／ｌで加え、ｐＨを７．２に調節した。２４、３１、４８および５６時間で、ＨＰＬＣの結果に基づいてグルコースを１日当たり３０〜４０ｇ／ｌで加え、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコ中に１ｇ／ｌ以下のレベルで加え、ｐＨを７．２に再調節した。２７時間でラクトースを５ｇ／ｌで加えた。ＮＡＧレベルのＨＰＬＣ分析のため試料を８、２４、４８および７２時間で取り出した。培養細胞を７２時間で収穫し、グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）、グルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）およびグルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ（ＮａｇＢ）活性を分析した。
酵素分析により、７１０７−６６０および７１０７−６６１株は機能性ＧｌｍＳタンパク質が欠けていることが確認された。予想通り、ＮａｇＢ活性はこれらの株中で上昇した。グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性は対照株７１０７−６０７（２）中で見出された活性と同様であり、これらの株中でＧＮＡ１タンパク質の機能的発現を示していた。
ｎａｇＢおよびＧＮＡ１を過剰発現するｇｌｍＳ株はＮ−アセチルグルコサミンの生産が可能であった（表１５）。７１０７−６６１株は最良であり、生産株７１０７−６０７＃２株で達成したＮＡＧレベルの７５％を生産した。興味のあることに、７１０７−６６０（１）株は他の同胞株より２０倍低いＮａｇＢ活性を示し、その結果はるかに低いレベルのＧｌｃＮＡｃを生産した。グルコサミン−６−ＰアセチルトランスフェラーゼがＮａｇＢで触媒される反応をグルコサミン−６−リン酸生成の方向への駆動を助長する様に思われる。データはＮ−アセチルグルコサミン合成に対する新規生物学的経路の機能性を示している。さらに、ＧＮＡ１と組み合わせたｎａｇＢの過剰発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＮ−アセチルグルコサミンを生産するための効率的な方法である。
（表１５．ｎａｇＢを過剰発現するｇｌｍＳ変異株中の酵素活性およびＧｌｃＮＡｃ生産）
Figure 2013009690
１）酵素活性とＮ−アセチルグルコサミンレベルは７２時間の時点で採取した試料で測定した。
２）酵素活性はμｍｏｌ ｍｉｎ−１ ｍｇ−１タンパク質で表される。
３）括弧内の数字は異なった同胞株を示す。
（実施例１５）
本実施例は７１０７−１８株中のＮ−アセチルグルコサミン生産に対するｇｌｍＭおよびｇｌｍＵのクローニングと過剰発現を説明する。
Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵ遺伝子はＧｌｃＮ−６−ＰをＵＤＰ−ＧｌａｃＮＡｃに変換する最初の３工程を触媒する。ＵＤＰ−ＧｌａｃＮＡｃは必須細胞外被化合物の豪勢に必要である。ＧｌｍＭはＧｌｃＮ−１，６−二リン酸が第一および第二基質の双方として働くＧｌｃＮ−６−ＰとＧｌｃＮ−１−Ｐの相互変換を、２工程ピンポン反応機構で触媒する。生体内の酵素活性化は知られていないが、ＧｌｍＭはリン酸化型としてのみ活性であることが知られている。ＧｌｍＭを高いレベルで過剰生産する株では、リン酸化酵素の全量は増加せず、ＧｌｍＭのリン酸化が厳しく制限されていることを示している（Ｍｅｎｇｎｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕｌｘおよびｖａｎ Ｈｅｉｆｅｎｏｏｒｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６６、２７１：３２−３９）。ＧｌｍＵはウリジルトランスフェラーゼとアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ−末端）ドメインが分離している２機能酵素である。アセチルトランスフェラーゼドメインはＧｌｃＮ−１−ＰのＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐへの転換を触媒する役割があり、ウリジルトランスフェラーゼドメインはＧｌｃＮＡｃ−１−ＰをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する。最近の報告では、ＧｌｍＵの切断型バージョンがＮ−末端Ｈｉｓ６タグで発現し、アセチルトランスフェラーゼおよびウリジルトランスフェラーゼ活性が分析された（Ｐｏｍｐｅｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１、２７６：３８３３−３８３９）。全長ＧｌｍＵに対し１３２０分の１に減少したウリジルトランスフェラーゼ活性を有するＧｌｍＵの切断型が、タンパク質から最初の７８個のＮ−末端残基を欠失することで得られた。この切断ＧｌｍＵタンパク質は全長ＧｌｍＵに見られるアセチルトランスフェラーゼ活性の６６％を維持していた。
図１４はＧｌｍＭとＧｌｍＵの作用により、ＧｌｃＮ−６−ＰがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換されるバクテリア経路を示す。ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵの過剰発現、またはｇｌｍＭとｇｌｍＵの組み合わせの結果、培地中にＮ−アセチルグルコサミンが蓄積すると考えられる。従って、これらの遺伝子の過剰発現のために株が構築された。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのｇｌｍＭ遺伝子のクローニング）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＭ遺伝子のクローニングと発現のため、ｇｌｍＭ遺伝子の公開された配列（Ｍｅｎｇｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕｌｘおよびｖａｎ Ｈｅｉｊｅｎｏｏｒｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１：３２−３９）に基づいてプライマーを合成した。前方プライマー０７−１６３および逆方向プライマー０７−１６４を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから、ｇｌｍＭコード配列を標準条件下で、ＰＣＲで増幅した。プライマーは以下の配列を有する：０７−１６３；５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＴＧ ＡＧＴ ＡＡＴ ＣＧＴ ＡＡＡ ＴＡＴＴＴＣ−３’（配列番号５９）、および０７−１６４：５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＣＧＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＡＴＣ−３’（配列番号６０）。
プライマー０７−１６３はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＧＴＣＴＣ、配列番号５９のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後のＡＴＧ開始コドンから始まるｇｌｍＭコード配列の２１ヌクレオチド（配列番号５９のヌクレオチド１３〜３３で表される）を含む。プライマー０７−１６４はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号６０のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンで開始するｇｌｍＭコード配列の２１ヌクレオチド（配列番号６０のヌクレオチド１１〜３１で表される）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＭコード配列とＧｌｍＭアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５３および配列番号５４で表される。標準条件でＰＣＲ増幅を行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に側面する全ｇｌｍＭコード配列を含むＤＮＡフラグメントを作成した。ＰＣＲ生成物を制限酵素ＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲートしプラスミドｐＳＷ０７−１０９を作成した。この方法のクローニングはｇｌｍＭ配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモーターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭ発現ベクターを生成する。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのｇｌｍＵ遺伝子のクローニング）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＵ遺伝子のクローニングと発現のため、ｇｌｍＵ遺伝子の公開された配列（Ｍｅｎｇｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕｌｘおよびｖａｎ Ｈｅｉｊｅｎｏｏｒｔ、Ｊ．Ｂａ．、１９９３、１７５：６１５０−６１５７）に基づいてプライマーを合成した。前方プライマー０７−１６１および逆方向プライマー０７−１６２を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから、ｇｌｍＵコード配列を標準条件下で、ＰＣＲで増幅した。プライマーは以下の配列を有する：０７−１６１；５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＣＴＣ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＧＣ−３’（配列番号６１）、および０７−１６２：５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＣＣＧ ＧＡＣ ＧＡＣ−３’（配列番号６２）。
プライマー０７−１６１はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＧＴＣＴＣ、配列番号６１のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後のＡＴＧ開始コドンで始まるｇｌｍＵコード配列の２１ヌクレオチド（配列番号６１のヌクレオチド１３〜３３で表される）を含む。プライマー０７−１６２はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号６２のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンで開始するｇｌｍＵコード配列の２３ヌクレオチド（配列番号６２のヌクレオチド１１〜３１で表される）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＵコード配列とＧｌｍＵアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５５および配列番号５６で表される。標準条件でＰＣＲ増幅を行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に側面する全ｇｌｍＵコード配列を含むＤＮＡフラグメントを作成した。ＰＣＲ生成物を制限酵素ＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲートしプラスミドｐＳＷ０７−１０８を作成した。この方法のクローニングはｇｌｍＵ配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモーターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＵ発現ベクターを生成する。
（Ｎ−末端切断ＧｌｍＵ酵素（ＧｌｍＵｔ）のクローニングと発現）
前方プライマー０７−１６５および反転プラーマー０７−１６２を用い、標準条件下でＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから切断ｇｌｍＵコード配列をＰＣＲで増幅した。プライマー０７−１６５は以下の配列を有した：０７−１６５：５’−ＧＡＴ ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＣＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＴＡ ＣＧＧ ＧＴＣ−３’（配列番号６３）。
プライマー０７−１６５はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＧＴＣＴＣ、配列番号６３のヌクレオチド４〜９で表される）と、ＡＴＧ開始コドンの下流の２３２ｂｐで始まるｇｌｍＵ ＣＤＳ配列（配列番号６３のヌクレオチド１５〜３３で表される）を含む。この結果、ＧｌｍＵタンパク質の最初の７７個のアミノ酸が欠失する。開始コドンもプライマー０７−１６５中に含まれる。プライマー０７−１６５および０７−１６２で生成したＰＣＲ生成物は、最初の７７個のアミノ酸が欠失したｇｌｍＵコード配列を含む。Ｅ．ｃｏｌｉのＮ−末端切断ｇｌｍＵコード配列とＮ−末端切断ＧｌｍＵアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５７および配列番号５８で表される。ＰＣＲ生成物をＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲートしプラスミドｐＳＷ０７−１１０を作成した。この方法のクローニングにより、切断ｇｌｍＵ（ｇｌｍＵｔ）配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモーターの後ろに置き、発現カセットＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵｔを生成する。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中のＧｌｍＭ、ＧｌｍＵおよびＧｌｍＵｔタンパク質の過剰発現）
ｇｌｍＵ、ｇｌｍＭまたはｇｌｍＵｔを含むプラスミドｐＳＷ０７−１０８、ｐＳＷ０７−１０９およびｐＳＷ０７−１１０を７１０１−１７（ＤＥ３）株中に形質転換し、表６に挙げる株を作成した。空のベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）を７１０１−１７（ＤＥ３）株中に形質転換し、標準株７１０７−２２を作成した。標準誘導実験を行い、形質転換体の培養細胞をＬＢ培地中で生育させ１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために誘導培養細胞から試料を様々な時点で採取し、タンパク質の過剰発現を確認した。ＧｌｍＵ、ＧｌｍＭおよびＧｌｍＵｔタンパク質の予想サイズはそれぞれ５１ｋＤａ、５０ｋＤａおよび４２ｋＤａであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の予想されたサイズのバンドはｇｌｍＵ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵｔを過剰発現する株由来の試料で見られた。対照株ではＧｌｍＵ、ＧｌｍＭおよびＧｌｍＵｔの予想サイズ付近に過剰発現タンパク質は見られなかった。誘導培養液からの試料の全体および可溶性分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。目視評価で判断すると、約２０％のＧｌｍＵタンパク質は可溶性分画にあった。しかしながら、ＧｌｍＵタンパク質の切断型バージョンでは可溶性タンパク質はほとんど見られなかった。同様に、ほとんどのＧｌｍＭタンパク質は可溶型でなかった。
（表１６．ＧｌｍＵ、Ｎ−末端切断ＧｌｍＵおよびＧｌｍＭタンパク質用の異なったプラスミドを含む株）
Figure 2013009690
（ｎａｇ欠失部位におけるＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵおよびＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵｔの組み込み）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧｌｍＵおよびＧｌｍＵｔタンパク質の過剰発現に成功したことが示された。従って、発現カセットを生産株７１０７−１８中の染色体中に組み込む戦略が開発された。組み込みのために選ばれた標的は、７１０７−１８株の染色体上のｎａｇ欠失部位であった。グルコサミン生産株を構築する初期で、オペロンを欠失させ、ＩＢＰＣ５９０株（Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ、１９８９、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３：５０６−５１５；Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ、１９９１、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５：２０５３−２０６２；Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３８：１０１１−１０１７）から調整したファージで形質導入の後にＰ１テトラサイクリン耐性カセットを染色体の欠失部位に挿入した。従って、染色体のこの領域を標的とする組み込みは生育または株中のグルコサミン生産に影響するものではない。
Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＵカセットを染色体のｎａｇ欠失部位への組み込みを標的とするベクター開発戦略の一部として、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＵフラグメントをプラスミドｐＳＷ０７―１０８＃１からＰＣＲで増幅した。ＰＣＲをＧＮＴ７ｎａｇＡ１−５および０７−１２０プライマーを用いて標準条件下で行った。プライマーは以下の配列を有する：ＧＮＴ７ｎａｇＡ１−５；５’−ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＴＧ ＣＧＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＡ−３’（配列番号６４）、および０７−１０７；５’−ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＡＴ ＣＣＧ ＧＡＴ ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＣＣ Ｃ−３’（配列番号６５）。
前方プライマーＧＮＴ７ｎａｇＡ１−５はＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＣＣＧＧＧ、配列番号６４のヌクレオチド１１〜１６で表される）を含み、Ｔ７プロモーターの上流の２９６塩基対から増幅する。プライマー０７−１２０はＢｓｒＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＴＧＴＡＣＡ、配列番号６５のヌクレオチド５〜１０で表される）を含み、Ｔ７ターミネーターの下流の２５塩基対から増幅する。
プラスミドｐＣＡＬＧ４３（実施例２９に記載）はｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７−４６２２、その全文を本明細書に引用して援用する）である生産株のｎａｇ欠失と、プラスミドｐＵＶ４Ｋのカナマイシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に側面する配列を有する。Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＵカセットを含むＰＣＲ生成物を制限酵素ＸｍａＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、ｐＣＡＬＧ４３のＡｇｅＩおよびＢｓｒＨＩ部位へライゲートした。得られたプラスミドｐＳＷ０７−１１２をＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵカセットを、我々の生産株の染色体上のｎａｇ欠失部位へ直接組み込むために使用することができる。
Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＵ（切断）カセットをＤｎａｇへ組み込むためのプラスミドを作成するため、プラスミドｐＳＷ０７−１１０＃５３がＰＣＲの鋳型となることを除いて、同じ戦略とＰＣＲプライマーを使用した。得られたプラスミドをｐＳＷ０７−１１３と呼ぶ。
プラスミドｐＳＷ０７−１１２およびｐＳＷ０７−１１３を、染色体上のｎａｇ欠失部位へ組み込まれたＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵまたはＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵｔを有するＥ．ｃｏｌｉ株を作成するために使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−１８をプラスミドで形質転換後、実施例１３に記載の温度選択プロトコールを用いて挿入部を含む株を選択した。ｎａｇ欠失部位のｇｌｍＵ発現の存在につき、カナマイシン感受性コロニーをＰＣＲでスクリーニングした。切断ｇｌｍＵ ＰＣＲ生成物をプローブとして用い、高ストリンジェント条件下で行ったサザンハイブリダイゼーションでＰＣＲ陽性株を確認した。７１０７−６７８および７１０７−６７９株がｎａｇ欠失部位に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵを有することが確認された。７１０７−６８０および７１０７−６８１株がｎａｇ欠失部位に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵｔを有することが確認された。
（Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭのｇｌｇ欠失部位への組み込み）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより、ＧｌｍＭタンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での過剰発現に成功したことが示された。従って、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭカセットを生産株７１０７−１８の染色体中へ組み込む戦略が開発された。組み込みのための選ばれた標的はｇｌｇオペロンである。グリコーゲン合成経路を妨害してグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン生産経路を通る炭素フローを増加させる試みの中で、ｇｌｇ領域は以前に欠失の標的とされていた。この変異は生育またはＮＡＧ生産に重大な影響を及ぼさなかった。従って、この染色体部位へのＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＭカセットの組み込みは、生産株に負の影響を与えないと考えられる。
Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭカセットの組み込みの標的をｇｌｇ部位とするベクターを開発する戦略の一部として、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭフラグメントをプラスミドｐＳＷ０７―１０９＃２９からＰＣＲで増幅した。プライマーＧＮＴ７ｎａｇＡ１−５およびＧＮＴ７ｎａｇＡ２−３を用いてＰＣＲを標準条件下で行った。プライマーは以下の配列を有した：ＧＴＮ７ｎａｇＡ１−５：５’−ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＡ−３’（配列番号６６）およびＧＮＴ７ｎａｇＡ２−３：５’−ＧＣＧ ＣＴＡ ＡＴＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＴＣ ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＣＧ ＴＡＡ−３’（配列番号６７）。
プライマーＧＮＴ７ｎａｇＡ１−５はＸｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ、配列番号６６のヌクレオチド１１〜１６で表される）を含み、Ｔ７プロモーターの上流の２９６塩基対から増幅する。プライマーＧＮＴ７ｎａｇ２−３もＸｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ、配列番号６７のヌクレオチド１１〜１６で表される）を含み、Ｔ７プロモーターの下流の２５４塩基対から増幅する。得られたＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＸｍａで消化し、プラスミドｐＣＡＬＧ２８−２のＡｇｅＩ部位（実施例２９に記載）へライゲートされた。この生成したプラスミドｐＳＷ０７−１１１＃３はｇｌｇオペロンと同じ配位でライゲートされたＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＭカセットと、ｇｌｇオペロンの反対配位でライゲートされたｐＳＷ０７−１１１＃４とを有する。これらのプラスミドを使用して、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭの生産株へｇｌｇオペロンを直接組み込むことができる。
Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−１８をプラスミドｐＳＷ０７−１１１＃３またはｐＳＷ０７−１１１＃４で形質転換後、ｇｌｇ部位にＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＭを含む株を選択するために温度選択プロトコールを用いた。ｇｌｍＭコード配列をプローブとして用い、高ストリンジェント条件下でサザンハイブリダイゼーションを行った。７１０７−６８２株が染色体中のｇｌｇ部位に組み込まれたＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＭを有することが確認された（介在ｇｌｇ遺伝子と同じ配位のｇｌｍ ＭＣＤＳ）。７１０７−６８３株が染色体中のｇｌｇ部位に組み込まれたＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＭを有することが確認された（介在ｇｌｇ遺伝子と反対配位のｇｌｍＭＣＤＳ）。
（ＧｌｍＭ／ＧｌｍＵの分析）
過剰発現ＧｌｍＭ（変異体）、ＧｌｍＵ（アセチルトランスフェラーゼ／ウリジルトランスフェラーゼ）およびＮ−末端切断ＧｌｍＵを含む様々な株を試験した。これらの酵素の活性を本スクリーニングから選択した株で分析した。ホスフォグルコサミンムターゼ（ＧｌｍＭ）をグルコサミン−１−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への連結反応を用いて分析した。生成したグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐデアミナーゼ（ＮａｇＢ）、ホスフォグルコイソメラーゼおよびグルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼを用いて定量的に６−リン酸に変換した。ＮＡＤＨの生成により、反応を３４０ｎｍでモニターした。グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＧｌｍＵ）をグルコサミン−１−ｒｉｎｓａｎおよびアセチルＣｏＡを用いて分析した。遊離ＣｏＡの生成を、試薬ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）を用いる終了点分析で測定した。遊離ＣｏＡの生成を４１０ｎｍでモニターした。
酵素活性のレベルと、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンのレベルを表１７にまとめる。天然型またはＮ−末端切断バージョンの何れでも、過剰発現ＧｌｍＵを有する株でかなりの量のＮ−アセチルグルコサミンが生産された。この酵素の活性は、極めて低いレベルの活性しか示さない対照株７０１７−１８より３０〜５０倍高かった。有為の量の遊離グルコサミンもこれらの株で生成した。ＧｌｍＭタンパク質が過剰発現してもより高い活性は得られなかった。実験条件下では、ＧｌｍＭの過剰発現により有意な量のＮ−アセチルグルコサミンが生成しなかった。さらに、ＧｌｍＭ＋ＧｌｍＵの過剰発現でも、ＧｌｍＵ株に比べてＮ−アセチルグルコサミンレベルが増加しなかった。文献に報告される様に、ＧｌｍＭ酵素はリン酸化で制御されるが、これは本明細書では言及されない。リン酸化制御を迂回する、または他の改善された動力学的特徴を有するＧｌｍＭ変異酵素を作成し使用することは、ＧｌｍＳ−ＧｌｍＭ−ＧｌｍＵまたはＮａｇＢ−ＧｌｍＭ−ＧｌｍＵ経路によるＮ−アセチルグルコサミン合成の効率を増加させえることが予想される。
（表１７．ＧｌｍＭ、ＧｌｍＵおよびＧｌｍＵｔ（Ｎ−末端切断型ＧｌｍＵ）を過剰発現する株の分析）
Figure 2013009690
＊列記した組換え遺伝子はすべてＴ７プロモーターの制御下で過剰発現された。
ｇｌｍＳ＝グルコサミンシンテターゼ
ｇｌｍＭ＝ホスフォグルコサミンムターゼ
ｇｌｍＵ＝グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ
ｇｌｍＵｔ＝ＧｌｍＵのＮ−末端切断型バージョン。
（実施例１６）
本実施例は、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの少なくとも１個のコピーの、グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン生産株の染色体への組み込みを説明する。
ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）を用いるＳｃＧＮＡ１の過剰発現により、７２時間の培養後にＮ−アセチルグルコサミンの生産が２４ｇ／ｌとなった（表１）。倍溶液中の抗生物質の使用を避け、Ｎ−アセチルグルコサミン生産を最大にするために、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを染色体中に組み込むことが決定された。ＮＡＧ生産にＴ７ｌａｃ―ＳｃＧＮＡ１発現カセットのどれだけのコピー数が最適であるかが未知であるので、カセットの複数のコピーを染色体中に組み込むことが決定された。標的遺伝子が細胞生育またはＮ−アセチルグルコサミン生産に必須でないという仮定に基づいて、組み込みのための挿入部位が選択された。４個の標的部位が選ばれた；ｍａｎＸＹＺ、ｆｕｃＩＫ、ｔｒｅＢおよびｍｅｌＡＢ。
実施例１３に記載した温度選択の一般的なストラテジーとプロトコールを、染色体中へのＧＮＡ１の組み込みに採用した。異なった温度感受性組み込みベクターを開発したが、それぞれ温度感受性複製起点、抗菌性マーカーおよびＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを含んでいた。各ベクターで、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを組換えプラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５から単離し、所定の組み込み部位からクローニングされたＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ配列のフラグメント中に挿入した。組み込みベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、組み込みＳｃＧＮＡ１を有するクローンを温度変化法を用いて選択した。
異なった起原由来の他のＧＮＡ１を組み込むために、同じ方法とプロトコールを使用することができる。当業者は、これらの方法とプロトコールを特定遺伝子それぞれに採用するためには若干の修正と変更が必要であることを予想できる。この様な修正と変更にはクローニングのための異なった制限部位と、染色体への組み込みのための異なった位置の使用が含まれるが、それに限定されない。
（ｍａｎＸＹＺ部位（ＧＮＡ１の一つのコピー）へのＧＮＡ１の組み込み）
Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを７１０７−１８中のその染色体のｍａｎＸＹＺ部位にサブクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ ｍａｎＸＹＤはマンノースの取り込みおよび燐酸化に関与する３個のタンパク質の複合体をコードするオペロンである。グルコースを炭素源として含む培地中でＥ．ｃｏｌｉの生育に影響せず、このオペロンを欠失することができる。ｍａｎＸＹＺ部位でのＧＮＡ１遺伝子の組み込みのために、Ｅ．ｃｏｌｉ ｍａｎＸＹＺ配列を含むプラスミドを開発した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｍａｎＸＹＺの公開された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）、ｐ１４５３−１４７４、その全体を本明細書中で参考として援用する）に基づき、プラーマーを合成し、標準ＰＣＲ法を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡからｍａｎＸＹＺ＋隣接領域を増幅した。増幅に使用したプライマーは順方向プライマー０７−８７および逆方向プライマー０７−８８であり、以下の配列を有した：０７−８７；５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＡＡ ＴＴＡ ＣＣＧ ＣＡＴ ＣＣＡ ＡＣ−３’（配列番号６８）および０７−８８；５’−ＧＡＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＣＣ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＴＧＣ ＡＴＣＣ−３’（配列番号６９）。
プライマー０７−８７はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（配列番号６８のヌクレオチド４〜１１として表される、ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を含み、ｍａｎＸ ＡＴＧ開始コドンの下流の９０５塩基対で開始する。プライマー０７−８８はＳａｌＩ部位（ＧＴＣＧＡＣ、配列番号６９の塩基対４〜９で表される）を含み、ｍａｎＺ翻訳停止コドンの下流の１０１０塩基対から始まる。標準プロトコールを用いてＰＣＲを行い、（ｍａｎＸＹＺ）＋（ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限部位が隣接する隣接領域）を含むフラグメントを生成する。このフラグメントをベクターｐＣＲσ２．１−ＴＯＰＯσ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローニングし、プラスミドｐｓＷ０７−６５＃７を作製した。
ｍａｎＸＹＺに欠失を作製するため、プラスミドｐｓＷ０７−６５＃７を制限酵素ＨｐａＩで消化した。これにより、ｍａｎＸＹＺのコード配列のほとんどを含むプラスミドの２６４７ｂｐ部分が放出された。さらに、制限エンドヌクレアーゼＮａｅＩを用いてＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１フラグメントをプラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５（先に実施例１３に記載）から切除した。プラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５はＴ７プロモーターの上流の４６塩基対、およびＴ７ターミネーターの下流に１４６塩基対にＮａｅＩ部位を含む。Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１配列を含むＮａｏＩフラグメントをｐＳＷ０７−６５＃７のＨｐａＩ部位中にライゲートした。このライゲーションは平滑末端ライゲーションであるので、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１フラグメントを何れの方向でもプラスミド中にライゲートし得る。従って、制限酵素消化をｍａｎＸＹＺと同じ配位で挿入されたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットを有するプラスミドをスクリーニングするために用いた。得られたプラスミドはｐＳＷ０７−６６＃２５と呼ばれる。
温度感受性組み込みベクターを作製するために、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７−４６２２、その全体を本明細書中で参考として援用する）を含むフラグメントとプラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いてＰＫＬＮ０７−２１から切除した。プラスミドｐＫＬＮ０７−２１をプラスミドｐＳＷ０７―４（実施例６に記載）から温度感受性レプリコンのＰＣＲ増幅、ＰＣＲ生成物のベクターｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡＭＰＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）へのライゲーション、およびプラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）由来のカナマイシン耐性カセットの付加で構築した。
Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１＋ｍａｎＸＹＺ隣接領域をプラスミドｐＳＷ０７−６６＃２５から切除するため、制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを使用した。次にこのフラグメントをｐＫＬＮ０７−２１由来の温度感受性レプリコン領域起点とカナマイシン耐性マーカーを含むＮｏｔＩ／ＳａｌＩフラグメントとライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−６８＃５を作製した。このプラスミドは温度感受性複製起点、カナマイシン選択マーカー、およびｍａｎＸＹＺ遺伝子座由来の５’上流および３’下流配列に隣接するＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを有していた。
プラスミドｐＳＷ０７−６８＃５を使用してｍａｎＸＹＺ部位に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を有するＥ．ｃｏｌｉ株を作製した。米国特許第６、３７２、４５７号に記載のように、７１０７−１８株中のｍａｎＸＹＺオペロンはＰ１ファージ導入で突然変異していた。ｐＳＷ０７−６８＃５でＥ．ｃｏｌｉ ７１０７−１８株を形質転換した後、実施例６記載の温度選択プロトコールを用いてｍａｎＸＹＺ部位に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１配列を有する株を選択した。カナマイシン感受性株をｆｕｃレギュロンでのＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの存在についてＰＣＲでスクリーニングした。標準的な高ストリンジェントな条件を使用し、ＳｃＧＮＡ１コード配列をプローブとして用い、株をサザンハイブリダイゼーションで確認した。１つのＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を伴って得られた株を、７１０７−９２と示す。
（ｆｕｃＩＫ部位におけるＧＮＡ１の第二コピーの組み込み）
Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの第二コピーの組み込みの標的は、別な炭素源としてＬ−フコースの利用に関連する酵素をコードする染色体領域であった。ｆｕｃＰ（Ｌ−フコースパーミアーゼをコードする）、ｆｕｃＩ（Ｌ−フコースイソメラーゼをコードする）、ｆｕｃＫ（Ｌ−フコースキナーゼをコードする）およびｆｕｃＵ（未知のタンパク質）遺伝子は、Ｌ−フコース異化作用に関連するオペロンを形成する。このｆｕｃＲ遺伝子は、Ｌ−フコース異化レギュロンを活性化する調節タンパク質をコードする。フコースオペロンでのＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込みは、グルコースを炭素源として含む培地中でのＥ．ｃｏｌｉの生育能、およびそのＮ−アセチルグルコサミン合成能の何れにも影響しないことが必要である。
ｆｕｃ領域を標的とする組み込みベクターを開発するストラテジーの一部として、フラクトースレギュロンの公開された配列（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．、１９８７、２１０：３３１−３３７）に基づいてプライマーを合成した。標準ＰＣＲ条件下にプライマー０７−１１３および０７−１１４を用いて、ｆｕｃＩＫＵおよびｆｕｃＲ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから増幅した。これらのプライマーは以下の配列を有する：０７―１１３；５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＣＴＧ ＧＣ−３’（配列番号７０）および０７−１１４：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＴＴＡ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＡＡ ＣＣＴ ＧＧＣ−３’（配列番号７１）。
プライマー０７−１１３はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（配列番号７０のヌクレオチド４〜１１として表される、ＣＧＣＧＣＣＧＣ）を含み、ｆｕｃＩ ＡＴＧ開始コドンの下流の８２４ｂｐ（配列番号７０のヌクレオチド１２〜３２で表される）から増幅する。プライマー０７−１１４はＢａｍＩＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ、配列番号７１のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンで開始するｆｕｃＲコード配列の３２ヌクレオチド（配列番号７１のヌクレオチド１１〜４２）を含む。標準条件下でＰＣＲを行い、ＢａｂＨおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接するｆｕｃＩＫＵ配列およびｆｕｃＲ配列を含むフラグメントを作製した。このフラグメントをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７５を作製した。プラスミドｐＳＷ０７−７５を制限エンドヌクレアーゼＨｐａおよびＢｒｓＧＩで消化し、ｆｕｃＩ遺伝子およびｆｕｃＫ遺伝子を含む１２３９塩基対フラグメントを除去した。
標準条件を用い、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５からＰＣＲで増幅した。以下の配列を有する順方向プライマー０７−１１５および逆方向プライマー０７−１２２を用いてＰＣＲを行った：０７−１１５：５’−ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＡＧ ＣＡＡ ＣＣＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＧ Ｃ−３’（配列番号７２）および０７−１１２：５’−ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＧＣ ＴＡＴ ＣＣＧ ＧＡＴ ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＣＣ Ｃ−３’（配列番号７３）。
プライマー０７−１１５はＢｓｒＧＩ部位（配列番号７２のヌクレオチド５〜１０で表される、ＴＧＴＡＣＡ）を含み、ｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７プロモーター配列の上流の７６塩基対から増幅する。プライマー０７−１１２はＡｆｅＩ部位（ＡＧＣＧＣＴ、配列番号７３のヌクレオチド５〜１０で表される）を含み、ｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７ターミネーターの下流から２５塩基対から増幅する。ＰＣＲフラグメントをＢｓｒＧＩおよびＡｆｅＩで増幅し、プラスミドｐＳＷ０７−７５のＢｓｒＧＩおよびＨｐａＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７６を作製した。組換えプラスミドはｆｕｃＩＫ欠失部位中にライゲートされたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットを含んでいた。
温度感受性組み込みベクターを作製するため、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７−４６２２、その全体を本明細書中で参考として援用する）、およびプラスミドｐＵＣ４Ｋのカナマイシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むフラグメントを制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｐｎＩを用いてプラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切除した。プラスミドｐＫＬＮ０７−２１をプラスミドｐＳＷ０７−４（実施例６に記載）から温度感受性レプリコンのＰＣＲ増幅、ＰＣＲ生成物のベクターｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌｌａ、ＣＡ）中へのライゲーション、およびプラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）由来のカナマイシン耐性カセットの付加で構築した。
プラスミドｐＳＷ０７−７６からＴ７ｌａｃＳｃＧＮＡ１＋ｆｕｃ隣接領域を含むフラグメントを切除するため、制限酵素ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩを使用した。次いでこのフラグメントをｐＫＬＮ０７−２１由来の温度感受性複製起点とカナマイシン耐性マーカーを含むＮｏｔＩ／ＫｐｎＩフラグメントとライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７７を生成した。このプラスミドは温度感受性複製起点、カナマイシン選択マーカー、およびｆｕｃレギュロン由来の５’上流および３’下流配列に隣接するＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを含んでいた。プラスミドｐＳＷ０７−７７をＴ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込みをＥ．ｃｏｌｉのｆｕｃレギュロンへ組み込むために使用できる。
プラスミドｐＳＷ０７−７７を７１０７−９２＃１中へ形質転換した。ΔｆｕｃＩＫ部位に組み込まれたＴ７−ｌａｃＧＮＡ１を有する株を選択するため、温度選択プロトコールを用いた。得られた株を、７１０７−６０７（２）、７１０７−６０７（３）および７１０７−６０７（４）と称する。
（ＧＮＡ１の第三コピーのｔｒｅＢ部位への組み込み）
Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの第三コピーを、別な炭素源としてトレハロースの利用に関与する酵素をコードする染色体領域に組み込んだ。トレハローストランスポーターおよびトレハロース６−ＰハイドロレースをコードするｔｒｅＢ遺伝子およびｔｒｅＣ遺伝子それぞれはオペロンを形成する。ｔｒｅＲ遺伝子はトレハロース−６−Ｐで誘導し得るオペロンを制御するレプレッサータンパク質をコードする（Ｈｏｒｌａｃｈｅｒ、Ｒ．およびＢｏｏｓ、Ｗ．、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２（２０）：１３０２６−１３０３２）。先の標的と同じ様に、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１のトレハロースレギュロンへの組み込みは、グルコースを炭素源として含む培地中のＥ．ｃｏｌｉ生育能、およびそのＮ−アセチルグルコサミン生産能の何れにも影響してはならない。
ｔｒｅＢを標的とする組み込みベクターを開発するストラテジーとして、公開された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２（５３３１）：１４５３−１４７４）に基づきプライマーを合成し、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡからｔｒｅＲ遺伝子、ｔｒｅＢ遺伝子およびｔｒｅＣ遺伝子を増幅した。以下の配列を有するプライマー０７−１１７および０７−１１８を使用してＰＣＲ増幅を行った：０７―１１７：５’−ＧＡＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＡＴ ＧＣＡ ＡＡＡ ＴＣＧ ＧＣＴ ＧＡＣ ＣＡＴ Ｃ−３’（配列番号７４）および０７−１１８：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＡＣＴ ＴＣＴ ＧＴＡ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＣＴ Ｃ−３’（配列番号７５）。
プライマー０７−１１７はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（配列番号７４のヌクレオチド３〜１０として表される、ＧＣＧＧＣＣＧＣ）と、その後のＡＴＧ開始コドンからｔｒｅＲコード領域の２１ヌクレオチド（配列番号７４のヌクレオチド１１〜３１で表される）を含む。プライマー０７−１１８はＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＧＧＣＣＣ、配列番号７５のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンで開始するｔｒｅＣコード配列の２７ヌクレオチド（配列番号７５のヌクレオチド１１〜３７で表される）を含む。標準プロトコールを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩ制限部位が隣接するｔｒｅＲ、ｔｒｅＢおよびｔｒＣを含むＤＮＡフラグメントを作製した。４．２ｋｂのＰＣＲ生成物をプラスミドｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７８＃２０を作製した。
プラスミドｐＳＷ０７−７８＃２０を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩで消化し、標準条件下でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理してフラグメントの末端を鈍化した。平滑末端化フラグメントを次に制限エンドヌクレアーゼＢｓｒＧＩで消化した。このＢｇｌＩおよびＢｓｒＧＩによる二重消化によりｔｒｅＢコード配列の１３０塩基対領域をプラスミドｐＳＷ０７−７８＃２０から除去し、プラスミドフラグメントに１個の粘着末端（ＢｓｒＧＩ）と１個の平滑末端を残した。
次の工程はＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐＳＷ０７−７８＃２０のＢｓｒＧＩおよびＧｇｌＩ（充填）部位へライゲートすることである。これを行うため、順方向プライマー０７−１１５（配列番号７２）および逆方向プライマー０７−１１２（配列番号７３）を用い、標準条件下でＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５からＰＣＲで増幅した。プライマー０７−１１５はＢｓｒＧＩ部位（ＴＧＴＡＣＡ、配列番号７２のヌクレオチド５〜１０で表される）を含み、ｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７プロモーター配列の上流の７６塩基対から増幅する。プライマー０７−１１２はＡｆｅＩ部位（ＡＧＣＧＣＴ、配列番号７３のヌクレオチド５〜１０で表される）を含み、ｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７ターミネーター配列の下流の２５塩基対から増幅する。ＰＣＲフラグメントをＢｓｒＧＩおよびＡｆｅＩで消化し、プラスミドＰＳＷ０７−７８＃２０のＢｓｒＧＩおよびＮｇｌＩＩ（充填）部位中にライゲートされ、プラスミドｐＳＷ０７−８３を生成する。
温度感受性組み込みベクターを作製するため、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコンを含むフラグメント（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７−４６２２、その全体を本明細書中で参考として援用する）およびプラスミドｐＵＫＣ４Ｋのカナマイシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒａｍｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むフラグメントを、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＩを用いてプラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切除した。
Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１＋ｔｒｅ隣接領域をプラスミドｐＳＷ０７−８３から切除するため、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＩを使用した。このフラグメントを、温度感受性複製起点とカナマイシン耐性マーカーを含むプラスミドｐＫＬＮ０７−２１由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩフラグメントとライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−８４とした。プラスミドｐＳＷ０７−８４を使用して、Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをＥ．ｃｏｌｉのｔｒｅＢに直接組み込んだ。
プラスミドｐＳＷ０７−８４＃１を７１０７−６０７（２）、７１０７−６０７（３）および７１０７−６０７（４）株中へ形質転換した。温度選択プロトコールを使用して、ｔｒｅＢ部位に組み込まれたＴ７−ｌａｃ ＧＮＡ１配列を選択した。染色体のｔｒｅＢにおけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットについて、カナマイシン感受性コロニーをＰＣＲでスクリーニングした。標準高ストリンジェント条件で、ＳｃＧＮＡ１コード配列を染色体中に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの３個のコピーを有するプローブとして用いて、株をサザンハイブリダイゼーションで確認した。これらの株を７１０７−６０８（１）および７１０７−６０８（２）と呼ぶ。
（ＧＮＡ１の第四コピーのｍｅｌＲＡＢ部位への組み込み）
Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの４個のコピーのＮＡＧ生産株中への組み込みの標的を、染色体のｍｅｌＲおよびｍｅｌＡＢ領域とした。Ｅ．ｃｏｌｉ中で、この領域はメリビオースの取り込みおよび加水分解に関与するタンパク質をコードする。α−ガラクトシダーゼおよびメリビオースパーミエースＩＩをそれぞれコードするｍｅｌＡ遺伝子およびｍｅｌＢ遺伝子はオペロンを形成する。様々に転写されたｍｅｌＲ遺伝子はメリビオースオペロンのレギュレーターをコードする。以前の組み込み標的と同じ様に、ゲノムのｍｅｌＡＢへのＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込みは、グルコースを炭素源とする培地中のＥ．ｃｏｌｉの生育能、およびＮ−アセチルグルコサミン合成能の何れにも影響してはならない。
ｍｅｌＡＢを標的とする組み込みベクターを開発するストラテジーとして、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｅｌＲ、ｍｅｌＡおよびｍｅｌＢプライマーの公開された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：ｐ１４５３−１４７４）に基づいて０７−１２２および０７−１２３を合成した。標準条件でＰＣＲを行い、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡからｍｅｌＲ、ｍｅｌＡおよびｍｅｌＢを含むフラグメントを増幅した。順方向プライマー０７−１２２および逆方向プライマー０７−１２３は以下の配列を有する：０７−１２２：５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＡＧ ＣＣＧ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＴＣ ＴＧＧ ＣＧＧ Ｃ−３’（配列番号７６）、および０７−１２３：５’−ＧＡＴ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＡＣ Ｃ−３’（配列番号７７）。
プライマー０７−１２２はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号７６のヌクレオチド４〜１１で表される）と、その後の翻訳停止コドンから始まるｍｅｌＲコード配列の２３ヌクレオチド（並列番号７６のヌクレオチド１２〜３４で表される）を含む。プライマー０７−１２３はＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＴＣＧＡＣ、配列番号７７のヌクレオチド１２〜３４で表される）と、その後の翻訳停止コドンから始まるｍｅｌＢコード配列の２７ヌクレオチド（並列番号７７のヌクレオチド１１〜３７で表される）を含む。ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接するｍｅｌＲおよびｍｅｌＡＢコード配列を含むＰＣＲフラグメントをベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−８１＃５を作製した。
ベクター構築の次の工程は、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐＳＷ０７−８１＃５のｍａｌＡＢ領域へライゲートすることである。プラスミドｐＳＷ０７−８１＃５を制限エンドヌクレアーゼＢｌｇＩＩおよびＡｓｉＳＩで消化し、全ｍａｌＡコード配列を含む１６７６塩基対とｍｅｌＢコード領域の最初の１９９ヌクレオチドを除去した。
標準条件下、順方向プライマー０７−１２４および逆方向プライマー０７−１２５でＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５からＰＣＲで増幅した。それぞれのプライマーは以下の配列を有する： ０７−１２４：５’−ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＡＣ ＣＧＣ ＡＣＣ ＴＧＴ ＧＧＣ−３’（配列番号７８）、および０７−１２５：５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＣＣ−３’（配列番号７９）。
プライマー０７−１２４はＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ、配列番号７８のヌクレオチド４〜９で表される）を含み、プラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７プロモーターの上流の７６ヌクレオチドから増幅する。プライマー０７−１２５はＡｓｉＳＩ部位（ＧＣＧＡＴＣＧＣ、配列番号７９のヌクレオチド４〜１１で表される）を含み、プラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７プロモーターの下流の１８ヌクレオチドから増幅する。Ｔ７ｋａｃ−ＳｃＧＮＡ１を含むＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｉＳＩで消化し、ＢｇｌＩＩおよびＡｓｉＳフラグメントとライゲートしてプラスミドｐＳＷ０７−８２を作製した。従って、プラスミドｐＳＷ０７−８２は、１６７６塩基対ｍｅｌＡＢ領域がＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットで置換されたｍｅｌ遺伝子をベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）中に含む。
温度感受性組み込みベクターを作製するため、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン（ Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７−４６２２、その全体を本明細書中で参考として援用する）、およびプラスミドｐＵＣ４Ｋのカナマイシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒａｍｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むフラグメントを制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いてプラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切除した。
プラスミドｐＳＷ０７−８２を制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化し、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットで隔てられたｍｅｌ遺伝子を含むフラグメントを単離した。このフラグメントをプラスミドｐＫＬＮ０７−２１由来の温度感受性複製起点とカナマイシン耐性マーカーを含むＮｏｔＩおよびＳａｌＩフラグメントとライゲートした。得られたプラスミドｐＳＷ０７−８４をＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをＥ．ｃｏｌｉのｍｅｌＡＢ部位への直接組み込むために使用することができる。
プラスミドｐＳＷ０７−８４を７１０７−６０８（１）および７１０７−６０８（２）株中に形質転換した。実施例６に記載の温度感受性プロトコールを用いて、ｍｅｌＡＢ部位へ組み込まれたＴ７−ｌａｃＧＮＡ１配列を有する株を選択した。染色体のｍｅｌＡＢにおけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの存在につき、カナマイシン感受性コロニーをＰＣＲでスクリーニングした。染色体中に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの４個のコピーを有するＳｃＧＮＡコード配列をプローブとして、高ストリンジェント条件を用いてサザンハイブリダイゼーションで株を確認した。７１０７−６０８（１）および７１０７−６０８（２）由来の得られた株をそれぞれ７１０７−６１２および７１０７−６０３と呼ぶ。
プラスミドｐＳＷ０７−８４も７１０７−６０７（２）、７１０７−６０７（３）および７１０７−６０７（４）株中に形質転換し、染色体にＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１の第三のコピーを加えた。株を上記の様にスクリーニングし、染色体中に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの３個のコピーを有するプローブとしてのＳｃＧＮＡ１コード配列で、標準高ストリンジェント条件を用いてサザンハイブリダイゼーションで確認した。７１０７−６０７（２）、７１０７−６０７（３）および７１０７−６０７（４）株由来の株を７１０７−６０９、７１０７−６１０および７１０７−６１１と呼ぶ。
（ＧＮＡ１遺伝子コピー数のＧＮＡ１抑制レベルおよびＮ−アセチルグルコサミン生産に対する効果）
ＧＮＡ１遺伝子コピー数のＧＮＡ１抑制レベルおよびＮ−アセチルグルコサミン生産に対する効果を評価するため、組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの様々なコピー数を有する株を振盪フラスコ中で試験した。酵素活性によるＧＮＡ１タンパク質の発現の分析と、ＮＡＧ力価の測定のため試料を採取した。
グルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）活性、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）活性およびＮ−アセチルグルコサミン生産に対する組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットのコピー数の効果を評価するため、振盪フラスコスクリーニング５３を行った。０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ｌのグルコース、４０ｇ／ｌのラクトース、５ｇ／ｌのリボースおよび５ｇ／ｌの酵母抽出物を補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で株を生育させた。培養細胞を最初の２４時間３０℃で生育させ、２５℃に置いた。２４〜４８時間の時点で、培養液のｐＨを７．２に調整し、ＨＰＬＣの結果に基づきグルコースを各フラスコに一日当たり３０ｇ／ｌで添加し、アンモニアレベル１／Ｌ以下で５ｇ／ｌの硫酸アンモニウムを添加した。試料を２４、４８および７２時間に取り出し、ＮＡＧ生産の評価と酵素分析を行った。試験した全ての株は同程度のＯＤ６００に生育し、同程度のグルコサミンシンテターゼ活性を有した（表１８）。グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性とＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１コピー数の間にかなりの相関があり、３個のコピーを有する株が最高の比活性を有した。しかしながら、振盪フラスコ実験では、この比活性の増加によりＮＡＧ生産が増加する結果とはならなかった。
Figure 2013009690
（組み込みＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの異なったコピー数を有する株の１リッター醗酵槽中における評価）
コピー数１〜４の範囲で組み込みＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１をそれぞれ含む７１０７−９２（１）、７１０７−６０７（２）、７１０７−６０８（２）および７１０７−６１２（１）株を１Ｌ醗酵槽中で評価した。醗酵槽２３７〜２４０を初期容積４７５ｍｌで設定した。醗酵培地の成分を表１９に挙げる。ｐＨを６．９に制御するため、７５％ＮＨ４ＯＨを用いて醗酵を行った。醗酵中、温度を３７℃に保った。曝気および攪拌を調節して溶存酸素濃度を空気飽和濃度の２０％に保った。コンピュータープログラムで供給速度を制御して６５％グルコースを培地に供給し、接種時で生育速度０．４０／時間、最高速度５ｍｌ／時間を６０秒間に達成した。培養を１０時間で５ｇ／ｌで添加した食品グレードラクトースで誘導し、グルコースを連続的に供給した。
Figure 2013009690
醗酵の結果は以下の様にまとめられる。ＧＮＡ１カセットのコピー数はＮＧＡレベルに若干効果がある。醗酵の終点で、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットのコピーを３個有する７１０７−６０８（２）株は、カセットコピー数１個を有する株より１６％多く、カセットコピー数２個を有する株より５％多くＮＡＧを生産した。この実験で、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＮＡ１を４コピー添加しても７１０７−６０８（２）の改善は行われなかった。言うまでもなく、生産株におけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１株のコピー数を増加させることの有用性が実証された。
（実施例１７）
以下の例で、グルコサミン合成に対する燐酸化糖の効果を説明する。
様々な燐酸化糖の存在でグルコサミンシンテターゼ活性を検討した。振盪フラスコ中で２４時間、ラクトース誘導で生育させた７１０７−１８細胞から粗酵素抽出物を調整した。結果を以下の表２０にまとめる。先に観察した様に、データはグルコサミン−６−Ｐが比較的高い濃度でグルコサミンシンテターゼを強く阻害することを示した。グルコサミン−１−Ｐも１０ｍＭで酵素を阻害した。Ｎ−アセチルグルコサミン燐酸では阻害は観測されなかった。
Figure 2013009690
（実施例１８）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミン合成に関与する他の酵素に対する燐酸化糖の生化学的効果を説明する。
先に議論した燐酸化糖（グルコサミン−６−Ｐ糖の化合物）の潜在的毒性効果は、アミノ糖の代謝に直接関与する酵素に限られていた。しかしながら、糖の毒性の一般的現象は、糖代謝が損なわれた様々な突然変異体で以前から観測されていた。これは、一般的に少なくとも一つの酵素標的を阻害し、細胞の代謝を損なう異常に高いレベルの燐酸化糖中間体に帰せられる。ＧｌｍＳの生成物阻害はこの一例である。
図３は他の標的に対するいくつかの可能性を示唆する。アミノ酸代謝が阻害された突然変異体を扱う論文（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０１：３８４、１９７０）にこの現象が記載され、ペントース糖が阻害を回復させ得ることが示される。従って、いくつかの酵素に対するグルコサミン−６−ｐおよびＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐの効果を検討した。
グルコサミン−６−ＰはＰｇｉの阻害剤であることが文献（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、６４：４８９、１９５６）に報告されている。図１５はＰｇｉを示す（２種のアミノ糖によるホスフォグルコイソメラーゼ阻害）。阻害は双方の化合物で観察されるが、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐではかなり少ない。
グルコサミン−６−Ｐはホスフォグルコイソメラーゼの阻害剤であることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２１６：６７、１９５５）。図１６はグルコース−６−Ｐのペントース燐酸経路への入口であるグルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）に対する燐酸化アミノ糖の効果を示す。再言すると、グルコサミン−６−ＰはＮ−アセチルグルコサミンより強力な酵素の阻害剤である様に思われる。ホスフォグルコムターゼ（Ｐｍｇ）でも同様な傾向が見られた。
炭水化物代謝に関連する上記およびその他の可能な酵素に対するグルコサミン−６−Ｐの阻害効果は、７１０７−１８株で観察されたグルコサミン生産性に対する見掛けの限界に対する説明になると思われる。多分、高濃度のグルコサミン−６−Ｐがいくつかの酵素の活性を妨害する。アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）を経路へ添加することは、グルコサミン−６−ｐの細胞内レベルの減少をもたらすものと思われる。これが多分、生産性を減少すると同時にＮ−アセチルグルコサミンの安定性を増大させる主な理由であると考えられる。
実際、Ｎ−アセチルグルコサミンは試験管内分析でＺｗｆまたはＰｇｉをそれほど阻害しない。細胞の生育およびＮ−アセチルグルコサミン合成に対するリボースとグルコン酸の正の効果は、ペントース燐酸経路の少なくとも一つの工程が燐酸化アミノ糖で影響されることを示唆している。一方、グルコサミンＮ−アセチルトランスフェラーゼはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐによる有為の生成物阻害を示さなかった。
（実施例１９）
本実施例は醗酵槽中内のＮ−アセチルグルコサミン生産中の酵素活性を説明する。
Ｎ−アセチルグルコサミン生産に関与する様々な酵素活性を醗酵槽中で調べた。分さ期した酵素はグルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）、グルコサミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）、およびペントース燐酸経路で鍵となる酵素であるグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼである（図３参照）。
（ＧＮＡ１プラスミドを有する株（醗酵槽＃１０２））
関連する酵素活性を醗酵槽１０２からの７０１７−８７（２５）株の試料で検討した。この株はプラスミド上にアセチルトランスフェラーゼ遺伝子コンストラクトを含む。この実験で８０ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンが生産された。酵素活性とＮ−アセチルグルコサミン濃度の結果を図１７に示す。誘導直後に高いアセチルトランスフェラーゼ活性が見られ、実験中、高いままであった。興味のあることに、その後の９０時間でもアセチルトランスフェラーゼ活性が存在したが、この時点でグルコサミンシンテターゼ活性は消滅していた。約７０時間でＮ−アセチルグルコサミンの生産は基本的に停止していた。グルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼ活性は実験中一定であった。
（組み込みＧＮＡ１コンストラクトを有する株（醗酵槽＃１２１〜１２８））
これらの実験には組み込みアセチルトランスフェラーゼコンストラクトを含むＥ．ｃｏｌｉ ７０１７−９２（１）株を使用した。検討した醗酵変数は培地に添加した鉄の量、外部からの発現の鉄の供給、および燐酸緩衝液レベル（１Ｘ＝４０ｇ／ｌ）であった。酵素活性を表２１にまとめる。醗酵１２１に用いた最低の鉄レベルを除いて、他の７個の醗酵槽ではグルコサミンシンテターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ活性は実験を通じて非常に高かった。先に観察した様に、アセチルトランスフェラーゼ活性は高レベルを保つ傾向がある。さらに鉄を供給し、または供給せずに検討した場合でも、グルコサミンシンテターゼ活性は他の鉄レベル（５〜２０ｐｐｍ）では適切であった。鉄が少ないとＮ−アセチルグルトランスフェラーゼ活性は高いが、グルコサミンシンテターゼ活性は低かった。この活性の減少は、高いＮ−アセチルグルコサミン生産にさらに適当であった。
Figure 2013009690
（実施例２０）
本実施例はグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン生産のためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代謝遺伝子工学を説明する。具体的には、生産物耐性グルコサミンシンターゼであるＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ＊５４およびＢａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳをコードする遺伝子、およびグルコサミン−６−燐酸 Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードするＳ． ｃｅｒｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１をコードする遺伝子を酵母発現ベクター中へクローニングし、過剰発現のために酵母中へ導入した。
グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生産の上記実施例に記載した主な要素は、生成物耐性ＧｌｍＳとＧＮＡ１の過剰発現である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ ａｌｎｉｃａｎｓ等の天然型ＧＮＡ１遺伝子を有する宿主では、生成物耐性ＧｌｍＳを過剰発現することにより、Ｎ−アセチルグルコサミン生産レベルを増加させることができた。しかしながら、アミノ糖の主生成物はグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンである必要がある。主生成物としてＮ−アセチルグルコサミンを生産するためには、ＧＮＡ１遺伝子が過剰発現しなければならない。
中性の醗酵ｐＨでグルコサミンを生産するためには、グルコサミンの分解が隘路である。酵母とバクテリアのあるものは比較的低いｐＨに適応し、通常はグルコサミンが安定である４〜５のｐＨ範囲で生育するので、この型のホスト中で生成物耐性ＧｌｍＳ酵素を過剰発現することで、グルコサミンの直接生産のための商業的に有用なプロセスを開発することができる。さらに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはＧＲＡＳ菌であり、外毒素を生産しないので、製品の応用を目的とするグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミンを生産するための好ましい宿主となり得る。
（酵母中で発現するためのＥ．ｃｏｌｉ突然変異体ｇｌｍＳ＊５４のクローニング）
Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異体ｇｌｍＳ＊５４遺伝子を発現ベクターｙＥｐ３５２−ＡＤＨ１中へクローニングした。このベクターを、標準的な技術を利用してｙＥｐ３５２（Ｈｉｌｌら、１９８６、Ｙｅａｓｔ ２：１６３〜１６７）から誘導した。その遺伝子は酵母細胞当たり複数のコピーで複製され、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーターおよびターミネーターを含む。このベクターはＥ．ｃｏｌｉ選択のためのアンピシリン耐性マーカーと、酵母中での選択のためのＵＲＡ３マーカーを有する。
順方向プライマーｎＭＤ７１０７−０２１および逆方向プライマーｎＭＤ７１０７−０２２をＥ．ｃｏｌｉ突然変異体ｇｌｍＳ＊５４遺伝子のコード配列のＰＣＲ増幅のために設計した。クローニングを助長するため、制限部位を末端に取り込んだ。以下の配列を有する順方向プライマーｎＭＤ７１０７−０２１（ＳａｃＩ）および逆方向プライマーｎＭＤ７１０７−０２２（ＨｉｎｄＩＩＩ）を用いて、ｇｌｍＳ＊５４コード配列を標準条件下で増幅した：ｎＭＤ７１０７−０２１（ＳａｃＩ）：５’−ＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＴＧＧＣＧＣＧＡ−３’（配列番号８０）およびｎＭＤ７１０７−０２２（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＴＡＣＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＡＡＣＣＧＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴ ＧＣ−３’（配列番号８１）。プライマーｎＭＤ７１０７−０２１は配列番号８０のヌクレオチド１１〜３２で表されるｇｌｍＳ＊５４コード配列の２２ヌクレオチドを含み、プライマーｎＭＤ７１０７−０２２は配列番号８１のヌクレオチド９〜３２で表されるｇｌｍＳ＊５４コード配列の２４ヌクレオチドを含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ＊５４遺伝子（米国特許第６、３７２、４５７号に記載）を含むプラスミドｐＫＬＮ２３−５４をＰＣＲ反応におけるＤＮＡの鋳型として使用した。使用されるサイズのＰＣＲ生成物の単一バンドが、Ｔａｑポリメラーゼを用いる標準ＰＣＲ条件下で生成した。ＰＣＲ生成物を制限酵素ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲルで精製し、同じ酵素で予め消化したｙＥＰ−３５２−ＡＤＨ−１中へクローニングした。ＤＮＡライゲーション生成物をアンピシリン選択でＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡより入手）中へ形質転換した。まず、コロニーの１０個のプール（プール当たり１０コロニー）を順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いるＰＣＲでスクリーニングした。次いで陽性プール中の個々のコロニーをＰＣＲで同定し、制限酵素消化で確認した。組換えプラスミドＭＤ７１０７−２３８およびＭＤ７１０７−２３９は、ＡＤＨプロモーターおよびターミネーターを有する酵母発現カセット中にＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ＊５４遺伝子を含んでいた。
Ｇｅｉｔｚら（１９９５）によるＬｉＯＡｃ法の後に、組換えプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＷＹ５細胞中へ形質転換した。酵母株はｕｒａおよびｈｉｓ栄養要求選択マーカーを有する。酵母形質転換体を２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジンを補充したＳＣＥ（−）培地のプレーと上で選択した（表２２）。形質転換酵母細胞株を分析してＧｌｍＳおよびＧＮＡ１活性、およびグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンレベルを分析する。
Figure 2013009690
（酵母中の発現のためのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子のクローニング）
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ野生型ｇｌｍＳを発現ベクターｙＥｐ３５２−ＡＤＨ１中にクローニングした。順方向プライマーｎＤＭ７１０７−０２３および逆転プラーマーｎＤＭ７１０７−０２４を合成し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ野生型ｇｌｍＳ遺伝子のコード配列を増幅した。クローニングを助長するため、制限部位を末端に取り込んだ。以下の配列を有する順方向プライマーｎＤＭ７１０７−０２３および逆転プラーマーｎＤＭ７１０７−０２４を用いて、ｇｌｍＳコード配列を標準条件下にてＰＣＲで増幅した：ｎＭＤ７１０７−０２３（ＫｐｎＩ）：５’−ＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＣＧＴＡＧＧＴＴＡＴＡＴＣ−３’（配列番号８２）およびｎＭＤ７１０７−０２４（ＳｐｈＩ）：５’−ＴＡＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＣＴＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡ−３’（配列番号８３）。プライマーＤＭ７１０７−０２３は配列番号８２のヌクレオチド１１〜３４で表されるｇｌｍＳコード配列の２４ヌクレオチドを含み、プライマーｎＭＤＭ７１０７−０２４は配列番号８３のヌクレオチド１０〜３４で表されるｇｌｍＳコード配列の２５ヌクレオチドを含む。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｍＳ遺伝子を含むプラスミドｐＳＷ０７−１５＃８３（実施例２に記載のプラスミド）をＰＣＲ反応のＤＮＡ鋳型として使用した。予想されるサイズのＰＣＲ生成物の単一バンドがＴａｑポリメラーゼを用いる標準ＰＣＲ条件下で生成した。ＰＣＲ生成物を適当な制限酵素で消化し、アガロースゲルで精製し、同じ酵素で予め消化したｙＥＰ３５２−ＡＤＨ−１中へクローニングした。ＤＮＡライゲーション生成物をアンピシリン選択でＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中へ形質転換した。まず、コロニーの１０個のプール（プール当たり１０コロニー）を順方向および逆方向プライマーを用いるＰＣＲでスクリーニングした。次いで陽性プール中の個々のコロニーをＰＣＲで同定し、制限酵素消化で確認した。組換えプラスミドＭＤ７１０７−２４０およびＭＤ７１０７−２４１は、ＡＤＨプロモーターおよびターミネーターを有する酵母発現カセット中にＢａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｍＳ遺伝子を含んでいた。
組換えプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＷＹ５細胞中へ形質転換した。形質転換した酵母を２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジンを補充したＳＣＥ（−）培地のプレート上で選択した。形質転換細胞株を分析してＧｌｍＳおよびＧＮＡ１活性、およびグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンレベルを測定した。
（酵母中の過剰発現のためのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１のクローニング
ＳｃＧＮＡ１コード配列を含むフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩを使用し、プラスミドｐＳＷ０７―６０＃３（上記実施例１３に記載）から消化した。得られたフラグメントをシャトルベクターｐＡＤＨ３１３−９５６のＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ部位中にライゲートした。この方法のクローニングはＳｃＧＮＡ１コード配列をＡＤＨ１プロモーターとターミネーターの間に置く。このベクターはヒスチジン選択マーカーを含む。得られたプラスミドｐＳＷ０７−１１４（＃１および＃１８）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＷＹ５細胞中へ形質転換した。酵母形質転換体を２０ｍｇ／ｌのウラシルを補充したＳＣＥ（−）培地のプレーと上で選択した。形質転換酵母細胞株を分析して、ＧｌｍＳおよびＧＮＡ１活性、およびグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンレベルを測定する。
ＳｃＧＮＡ１発現カセットを有するプラスミドも、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ＊５４コンストラクトまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｍＳコンストラクトで既に形質転換された酵母細胞株中に形質転換される。
（実施例２１）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミン生産を改選するためのＥ．ｃｏｌｉ株７１０７−９２の無秩序突然変異誘発を説明する。
７１０７−９２株（染色体中に組み込まれたＴ７−ｇｌｍＳ＊５４およびＴ７−ＳｃＧＮＡ１を有する；実施例１６に記載）をＵＶ光線で突然変異させ、米国特許第６、３７２、４５７Ｂ１号に記載の通り８８２個の単離コロニーをＧｌｃＮ栄養要求バイオアッセイで分析した。グルコサミン栄養要求株Ｅ．ｃｏｌｉ ２１２３−１５を指示株として使用した。ハローサイズに基づき、１９個の突然変異体を選択し、単離のためにストリークし、各５個のコロニーを再評価した。２種の突然変異体７１０７−５１２および７１０７−５１３が最大のハロー直径を示した。それらをフラスコ培養での評価のために保存した。突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７−５１２（ＡＴＣＣ番号 ）および７１０７−５１３（ＡＴＣＣ番号 ）を、ブダペスト条約（特許手続きのための微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約）の条項により、２００３年７月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｕｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）に寄託した。
突然変異体を親株と比較した。全ての株は５ｇ／ｌのリボースと５ｇ／ｌの酵母抽出物を湯含むＭ９Ｂ培地中、二つの異なった条件下で生育した。一つのセットの培養細胞は３０ｇ／ｌのグルコースと０．２ｍＭのＩＰＴＧを含む培地中で生育した（ＩＰＴＧ誘導）。もう一方のセットの培養細胞は１０ｇ／ｌのグルコースと４０ｇ／ｌのラクトースを含む培地中で生育した。一度グルコースが欠乏すると培養細胞はラクトースで誘導された（ラクトース誘導）。ＩＰＴＧ誘導下では、突然変異体７１０７−５１２によるＮ−アセチルグルコサミンの生産は親株と同程度であった。突然変異体７１０７−５１３は親株より多くのグルコサミン、すなわち７１時間の時点で３６％多く生産した。先に観察された様に、親株はラクトース誘導下でＩＰＴＧ誘導下より高いレベルのＮ−アセチルグルコサミンを生産した。２種の突然変異体は同じレベルのグルコサミンを生産したが、それは７１時間の時点で親株より約２８％高かった。突然変異の遺伝子座は未定であり、突然変異体中でＮ−アセチルグルコサミン生産の向上の機構は知られていない。僅か９００個の突然変異体クローンがスクリーニングされただけなので、データは無秩序突然変異誘導で生産宿主がさらに改善される可能性を明らかに示している。
Figure 2013009690
（実施例２２）
以下の実施例は、ＮＡＧ生産が生育と組み合わされない様なｐｆｋＡ欠失を有する突然変異ＮＡＧ生産株の作製を説明する。
ホスフォフラクトキナーゼはフラクトース−６−燐酸（Ｆ−６−Ｐ）からフラクトース−１、６−二燐酸の精製を触媒する、グリコリシスにおける主な調節酵素である。ｐｆｋＡでコードされるＥ．ｃｏｌｉ中の主要ホスフォフラクトキナーゼは、ホスフォフラクトキナーゼ活性の９０％を提供する。活性の残りの１０％はｐｆｋＢでコードされる少数のホスフォフラクトキナーゼで供給される。ＮＡＧ生産株では、過剰発現されたＧｌｍＳ＊５４がＦ−６−Ｐのグルコサミン−６−燐酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）への変換を触媒し、過剰発現したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）の作用によりＧｌｃＮ−６−ＰはＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐへ変換される。
実施例２２に記載された実験の根拠は以下の通りである。炭素源の組み合わせ（すなわちグルコースおよびフラクトース）によるｐｆｋＡ突然変異株の生育により、生育がＮＡＧ生産と結合しなくなる。ｐｆｋＡ突然変異株はグルコースを炭素源として良好に生育しないので、細胞生育にフラクトースが使用される。取り込まれたフラクトースはｆｒｕＡおよびｆｒｕＫ遺伝子生成物の作用によりフラクトース−１、６−二燐酸に変換され、それがグリコリシス経路に入ることができる。取り込みによりグルコースが燐酸化され、生成したグルコース−６−燐酸がｐｇｉ遺伝子生産物、すなわちホスフォグルコースイソメラーゼによりＦ−６−Ｐに変換される。ｐｆｋＡ遺伝子が欠失すると、少数のＰｆｋＢアイソザイムのみがＦ−６−ＰのＦ−１、６−二燐酸への変換に関与する。この変換は制限され得る。その結果、過剰発現ＧｌｍＳ＊５４によりグルコサミン−６−燐酸への変換に使用し得るＦ−６−Ｐの量が増加すると考えられる。従って、ｐｆｋＡの欠失はＦ−６−Ｐのグリコリシス経路中への流れを減少させ、より多くの炭素をグルコサミン生産へ向ける潜在力となる。ＳｃＧＮＡ１を過剰発現する生産株では、これにより究極的にＮＡＧ力価が増加することになる。
（ｐｆｋＡ欠失株の作製）
温度感受性選択法を用いて生産株のゲノムにｐｆｋＡ欠失が加えられた。これには欠失のためにｐｆｋＡを標的とする組み込みベクターの構築が必要であった。ベクター構築の第一工程はｐｆｋＡコード配列＋Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡ由来の隣接領域を含む配列を増幅することである。ｐｆｋＡの公開された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）に基づき、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子からプライマーを合成した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは順方向プライマー０７−８９および逆方向プライマー０７−９０であり、以下の配列を有した：０７−８９：５’−ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＴＣＡＡＴＣＴＴＡＴＧＧＡＣＧＧＣ−３’（配列番号８６）および０７−９０：５’−ＧＡＧ ＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＡＡＣＧＴＡＣ−３’（配列番号８７）。
プライマー０７−８９はＮｏｔＩ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号８６のヌクレオチド３〜１０で表される）を含み、ｐｆｋＡ ＡＴＧ開始コドン（配列８６のヌクレオチド１１〜３２で表される）の上流の１０８３塩基対に位置するｙｉｉＰコード配列のＡＴＧ開始コドンを増幅する。プライマー０７−９０はＳａｌＩ部位（ＧＴＣＧＡＣ、配列番号８７のヌクレオチド３〜８で表される）を含み、ｐｆか停止コドン（配列番号８７のヌクレオチド９〜３７で表される）の下流の３１０塩基対に位置するｓｂｐコード配列の翻訳停止コドンから増幅する。標準プロトコールを使用してＰＣＲを行い、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側面するｙｉｉＰ、ｐｆｋＡおよびｓｂｐコード領域を含むフラグメントを生成する。製造業者が供給する材料と指示書を用いて、このフラグメントをベクターｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡＭＰＳＫ（＋）（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＷ０７−６１と呼ぶ。
温度感受性組み込みベクターを作成するため、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７―４６２）、およびプラスミドｐＵＣ４Ｋのカナマイシン耐性カセット（ＡｍｅｒｈａｍＰｈａｒａｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩでプラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切除した。ｐｆｋＡ＋側面領域をプラスミドｐＳＷ０７−６１〜制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。二つのフラグメントを互いににライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−６３を作成した。
ｐｆｋＡのコード配列に欠失を作成するため、プラスミドｐＳＷ０７−６３をＰｖｕＩＩで完全に消化し、次いでＡｈｄＩで部分消化した。これによりｐｆｋＡコード配列の７８１塩基対を除去した。ｐｆｋＡ欠失を含むフラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、末端に充填し、得られた鈍端フラグメント自体をライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−６４を得た。
ｐｆｋＡ欠失を含む株を作るため、プラスミドｐＳＷ０７−６４をＥ．ｃｏｌｉ７１０７−１８中に形質転換した。温度感受性選択と継代培養プロトコールの後、グルコースを炭素源として含む制限培地プレート上の遅延生育でカナマイシン感受性コロニーをスクリーニングした。ｔｉｉＰ部分およびｐｆｋＡ配列を含む１１５３塩基対フラグメントを用い、標準ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで株を確認した。これらの株を７１０７−９０１）および７１０７−９０（２）と呼ぶ。
０．０５４および０．０３５ｍｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１タンパク質のｐｆｋの比活
性が７１０７−９０（１）および７１０７−９０（２）株でそれぞれ観測された。野生型ｐｆｋＡ遺伝子を有する対照株では、０．７８のｍｍｏｌｍｉｎ−１ｍｇ−１タンパク
質の比活性が検出された。従って、ｐｋｆＡ突然変異体は対照株で観測された活性の約５〜６％のＰｆｋ活性を有していた。この残存Ｐｆｋ活性はＰｆｋＢアイソザイムの寄与であることは疑いない。
（Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの７１０７−９０（１）および７１０７−９０（２）株中への組み込み）
７１０７−９０株がグルコサミン生産株７１０７−１８株から誘導され、従ってそれらの株は測定し得るＮＡＧを生産しない。ｐｆｋＡ欠失を有するＮＡＧ生産株を作成するためには、Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを株中に導入する必要がある。先に記載した戦略後、Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＮＧＡ１の発現カセットを７１０７−９０（１）および７１０７−９０（２）株中の染色体のｍａｎＸＴＺ部位へ組み込み、７１０７―６０２および７１０７−６０３株をそれぞれ作成した。ＳｃＧＮＡ１コード配列を含むフラグメントをプローブとして用いる標準高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで、これらの株がｍａｎＸＹＺ欠失部位に組み込みＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を有することを確認した。
（７１０７−６０２および７１０７−６０３株の振盪フラスコスクリーニング）
グルコース／フラクトースの様々な混合物を用い、７１０７−６０２（１）および７１０７−６０３（１）株を振盪フラスコスクリーニング４８で試験した。培養細胞を０．２ｍＭＩＰＴＧで２４時間後に誘導した。これらの株は対照株７１０７−９２８１）より多くのＮＡＧを生産しなかったが、興味のあることに、これらの株は試験したどの条件下でもほとんど酢酸を生成しなかった。振盪フラスコスクリーニング５３により、７１０７−６０２（１）および７１０７―６０３（１）株をラクトース誘導条件下で再度試験したが、これらの株で酢酸は生成されず、ＮＡＧレベルは対照株７１０７−９２（１）で見られたレベルと同程度であった。
７１０７−６０２（１）株中の酢酸生成をさらに評価するため、酵母抽出物（ＹＥ）、リボースまたはごく微量元素（ＴＥ）の添加を含む、通常は酢酸生成を増加させる条件下で振盪フラスコスクリーニング５６を行った。培養細胞を修飾Ｍ９Ｂ培地中で生育させた［６ｇ／ｌＫＨ２ＰＯ４、２４ｇ／ｌＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／ｌクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４（燐酸塩でｐＨ７．４に調整）］。低レベルの微量金属（０．３ｍｇ／ｌＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３７５ｍｇ／ｌＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｍｇ／ｌＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇＬＨ３ＢＯ３、および０．００１ｍｇ／ｌＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）または高レベルの微量金属（１２ｍｇ／ｌＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３７５ｍｇ／ｌＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｍｇ／ｌＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇＬＨ３ＢＯ３、および０．００１ｍｇ／ｌＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を表２４に示す様に加えた。培養液に０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ｌのグルコースおよび２０ｇ／ｌのラクトースを補充した。さらに５ｇ／ｌのリボースおよび／または５ｇ／ｌの酵母抽出物を表２４に示す様に加えた。培養細胞を３６℃で２４時間培養し、ついで２５℃に切り替えた。１２時間でグルコース欠乏培地に２０ｇ／ｌのグルコースを加え、ｐＨを７．２に調節した。２４、３０、４８および５４時間で培養液のｐＨを７．２に調節し、ＨＰＬＣの結果に基づいてグルコースを一日当たり３０ｇ／ｌ加えた。５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を２４、３０、４８および５２時間でアンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下したフラスコに加えた。
（表２４．７１０７−６０２（１）および７１０７−９２（１）株における酢酸生成に対する微量金属、リボースおよび酵母抽出物レベル変化の効果）
Figure 2013009690
対照株７１０７−９２（１）が高レベルの酢酸を生産する様に誘導するために設計された条件下でも、７１０７−６０２（１）株中の酢酸生成はないか比較的低い（表２３）。さらに、ＯＤ測定値は７１０７−６０７（２）株で低い傾向にあったが、これらの培養で全体的により高い力価が見られた。従って、ｐｆｋＡ突然変異体はＮＡＧ生産宿主として使用するに適している様に思われる。
（実施例２３）
本実施例はグルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）遺伝子のクローニングと過剰発現、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み、およびＧｌｃＮ／ＧｌｃＮＡｃに対するｇｌｎＡ遺伝子の過剰発現の効果を説明する。
グルタミンは窒素をアミノ糖その他の化合物に提供するアンモニア同化作用の１次生成物である。ｇｌｎＡでコードされるグルタミンシンテターゼはＮＨ３とＡＴＰを要求する反応でＬ−グルタミンのＬ−グルタミン酸への変換を触媒する。Ｌ−グルタミンはグルコサミン−６−燐酸の生合成に必要であり、ＧｌｍＳはＬ−グルタミンとＦ−６−ＰがＤ−グルコサミン−６−ＰおよびＬ−グルタミンに変換される反応を触媒する。ＧｌｃＮ／ＧｌｃＮＡＣ生産が最高レベルになるためには、細胞内に適切なレベルのグルタミンが存在することが必須である。ｇｌｎＡ遺伝子の過剰発現はグルタミンレベルを増加させ、最終的にＧｌｃＮおよび／またはＮＡＧ力価を増加させると思われる。
（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＡ遺伝子のクローニングと過剰発現）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＡのクローニングと過剰発現のために、ｇｌｎＡの公表された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）に基づいて合成した。Ｅ．ｃｏｌｉｇｌｎＡ遺伝子コード配列のヌクレオチド配列が配列番号８８と呼ばれる配列ファイル中に列記されている。Ｅ．ｃｏｌｉＧｌｎＡタンパク質の推定アミノ酸配列が配列番号８９と呼ばれる配列ファイルに列記されている。プライマーを使用してＥ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）ゲノムＤＮＡからｇｌｎＡコード配列をＰＣＲで増幅した。増幅に使用したプライマーは前方プライマー０７−ｇｌｎおよび逆方向プライマー０７−１５であり、以下の配列を有する：０７−ｇｌｎ：５’−ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＴＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＣＧＴＡＣＴＧＡＣ−２’（配列番号９０）、および０７−１５：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＣＧＴＴＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号９１）。
プライマー０７−ｇｌｎはＢｓａＩ部位（ＧＧＴＣＴＣ、配列番号９０のヌクレオチド５〜１０で表される）、およびＡＴＧ開始コドンからのｈｌｎＡコード領域の２３ヌクレオチド（配列番号９０のヌクレオチド１３〜３５で表される）を含む。プライマー０７−１５はＸｈｏ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号９１のヌクレオチド５〜１０で表される）、および翻訳停止コドンからのｇｌｎＡコード配列の２１ヌクレオチドを含む。標準条件下でＰＣＲを行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側面するｇｌｎＡコード配列を含むフラグメントを作成した。
ｇｌｎＡを含むＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位へライゲートしてプラスミドｐＫＬＮ０７−２８を作成した。この方法によるクローニングは、ｇｌｎＡ配列をＴ７ｌａｃプロモーターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｎＡの発現カセットを生成する。
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換えｇｌｎＡの機能発現）
ｇｌｎＡの機能発現を試験するため、組み換えプラスミドｐＫＬＮ０７−２８を７１０７−１８株中に形質転換し、７１０７−１６３株を作成した。７１０７−１８株をｐＥＴ２４ｄ（＋）空ベクターで形質転換して対照株７１０７−８８を調製した。培養細胞をＬＢ中で生育させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する標準誘導プロトコールに従った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料を採取し、ＧｌｎＡタンパク質の過剰発現を確認した。ＧｌｎＡタンパク質の予想されるタンパク質サイズは約５２ｋＤａである。約５２ｋＤａの過剰発現タンパク質が見出された。ほとんどの過剰発現タンパク質は不溶性である様に思われ、可溶性分画には僅かしか見出されなかった。対照株にはこの様な過剰発現タンパク質は見られず、過剰発現タンパク質がＧｌｎＡ酵素であることを示している。
（Ｅ．ｃｏｌｉ染色体中へＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡを直接組み込むためのベクターの構築）
ｇｌｎＡ遺伝子の過剰発現が成功したことを確認したので、次の工程はＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを生産株のゲノムに組み込むことである。この目的のために組み込みベクターを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉｐｆｋＢ遺伝子を組み込みの標的部位として選んだ。ｐｆｋＢは全ホスフォフラクトキナーゼ活性のわずか１０％を占めるＥ．ｃｏｌｉ中のホスフォフラクトキナーゼの少数アイソザイムをコードする。従って、この遺伝子座へのこのカセットの組み込みは株の性能に重大な影響を及ぼしてはならない。
組み込みベクターを作成する戦略の一部として、ｐｆｋＢ＋側面領域をＰＣＲでＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０から増幅した。ｐｆｋＢ＋その側面領域の公開された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）に基づいてプライマーを合成した。ｐｆｋＢ領域を増幅するために用いたプライマーは前方プライマー０７−１６および逆方向プライマー０７−１７であり、以下の配列を有した：０７−１６：５’−ＧＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号９２）、および０７−１７：５’−ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＡＴＡＡＴＣＴＡＴＣＣ−３’（配列番号９３）。
プライマー０７−１６はＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＧＧＧＣ、配列番号９２のヌクレオチド５〜１０で表される）と、ｐｆｋＢ開始コドンの上流の１０４２塩基対に位置する推定翻訳停止コドンで始まるＯＲＦｂ１７７２の１９塩基対（配列番号９２のヌクレオチド１１〜２９で表される）を含む。プライマー０７−１７はＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＧＣＡＧ、配列番号９３のヌクレオチド５〜１０で表される）、およびｐｆｋＢ停止コドンの下流の１３５７塩基対に位置する推定翻訳停止コドンで始まるＯＲＦｂ１７２５の２２塩基対（配列番号９３のヌクレオチド１１〜３２で表される）を含む。標準条件下でＰＣＲを行い、ＮａｅＩおよびＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側面するＯＲＦｂ１７２２、ｐｆｋＢ、ＰＲＦｂ１７２４およびＰＲＦｂ１７２５を含むフラグメントを作成した。得られたフラグメントをベクターＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）中にライゲートし、プラスミドｐＫＬＮ０７−１４を作成した。
次の工程はプラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＰｈａｒａｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のカナマイシン耐性カセットをプラスミドｐＫＬＮ０７−１４に加えることである。カナマイシン耐性カセットをｐＵ４Ｋから制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで切除した。プラスミドｐＫＬＮ０７−１４を同様に制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、それによりＯＲＦｂ１７２５推定コード配列の３８５塩基対を含むプラスミドの４１２塩基対を除去した。カナマイシン耐性カセットをプラスミドｐＫＬＮ０７−１４の骨格のＰｓｔＩ部位中へライゲートし、プラスミドｐＫＬＮ０７−１７を作成した。次にプラスミドｐＫＬＮ０７−１７を制限エンドヌクレアーゼＳｎａＢＩおよびＢｔｒＩで消化し、プラスミドからｐｆｋＢコード配列の８７０塩基対を除去した。
Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを含むフラグメントをプラスミドｐＫＬＮ０７−２８から制限エンドヌクレアーゼＮａｅＩで切除し、Ｔ７プロモーターの上流の５０塩基対と１６４Ｔ７ターミネーターの下流の１６４塩基対が側面するＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを含むフラグメントをベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）から作成した。ＮａｅＩフラグメントをプラスミドｐＫＬＮ０７−１７のＳｎａＢおよびＢｔｒＩ部位中にライゲートし、プラスミドｐＫＬＮ０７−２９を作成した。
最終工程はｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レプリコンを、ｐｆｋＢ欠失部位中のＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを含むプラスミドｐＫＬＮ０７−２９由来のフラグメントと、カナマイシン耐性カセットへ加えることである。プラスミドｐＫＬＮ０７−２９を制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｎＡとカナマイシン耐性カセットを含むフラグメントをｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ骨格から放出した。プラスミドｐＫＬＮ０７−２０（上記）をＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、温度感受性レプリコンを含むフラグメントを切除した。二つのフラグメントを共にライゲートし、温度感受性レプリコン、カナマイシン耐性カセット、およびｐｆｋＢ欠失部位中へライゲートされたＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡを含むＥ．ｃｏｌｉゲノム配列を含むプラスミドｐＫＬＮ０７−３０を作成した。温度感受性選択および継代培養プロトコール後に、プラスミドｐＫＬＮ０７−３０を使用してＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを染色体のｐｆｋＢへ直接組み込むことができる。
プラスミドｐＫＬＮ０７−３０をグルコサミン生産株７１０７−１８中へ形質転換した。温度感受性選択と継代培養プロトコールに従い、ｐｆｋＢ欠失部位におけるＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットの存在につき、カナマイシン感受性コロニーを標準ＰＣＲプロトコールを用いてスクリーニングした。ｇｌｎＡコード配列を含むフラグメントをプローブとして用い、ＰＣＲで同定されたいくつかの株を高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで確認した。これらの株を７１０７−１１８および７１０７−１２３と呼ぶ。
（７１０７−１１８、７１０７−１１９０７０および７１０７−１２０株中へのＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込み）
７１０７−１１８、７１０７−１１９０７０および７１０７−１２０株をグルコサミン生産株７１０７−１８から誘導した；従ってそれらの株は測定可能なＮＡＧを生産しない。ｇｌｎＡ発現カセットを有するＮＡＧ生産株を作成するためには、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを株中に導入する必要がある。上記の様に、Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１の発現カセットを７１０７−１１８、７１０７−１１９および７１０７−１２０株の染色体のｍａｎＸＹＺへ組み込み、７１０７−１２５株（７１０７−１１９由来）、７１０７−１２６株（７１０７−１２０由来）、７１０７−１３２株（７１０７−１１８由来）、７１０７−１３３株（７１０７−１１８由来）および７１０７−１３４株（７１０７−１１９由来）を作成した。ＳｃＧＮＡ１コード配列を含むフラグメントをｍａｎＸＹＺ欠失部位に組み込みＴ７ｌａｃ−ＳｖＧＮＡ１を有するプローブとして用い、これらの株を高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで確認した。
（振盪フラスコスクリーニング５１：ＮＡＧ生産の背景における組み込みＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡの過剰発現試験）
組み込みＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを含む７１０７−１２５、７１０７−１２６および７１０７−１３３株を評価するため、振盪フラスコスクリーニング５１を行った。培養細胞を微量金属と以下の物質を補充したＭ９Ｂ培地中で生育させた：０．６ｇ／ｌＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ｌグルコース、４０ｇ／ｌラクトース、５ｇ／ｌ リボースおよび５ｇ／ｌ酵母抽出物。培養細胞を３０℃で２５時間生育させ、次いで２５℃に切り替えた。２４時間および４８時間で培養液のｐＨを７．２に調節し、グルコースを３０ｇ／ｌに加え、アンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に下がったフラスコ中に（ＮＨ４）２ＳＯ４を２４時間および４８時間に加えた。ＮＡＧレベルのＯＤ測定のため２４時間、４８時間および７２時間で試料を採取した。酵素活性分析のため培養細胞を７２時間で収穫した。
表２５に示す様に、ｇｌｎＡを過剰発現する株は対照株７１０７−９２（１）より若干良好で、約８％多いＮＡＧを生産した。窒素制限で無いので、アンモニアが不足する株はなかった。ｇｌｎＡ過剰発現株中のＧｌｍＳおよびＧＮＡ１酵素活性は対照株７１０７−９２（１）と同程度であった。まとめると、ｇｌｎＡの過剰発現により、最適条件下で顕著であるＧＮＡ力価が若干改善する様に思われる。
（表２５．ｇｌｎＡを過剰発現する株における細胞生育、酵素活性およびＧｌｃＮＡｃ生産）
Figure 2013009690
１）ＯＤ、酵素活性およびＧｌｃＮＡｃレベルを７２時間の時点で測定した。
２）酵素活性はμｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１タンパク質で記載されている。
（組み込みＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡを有するＮＧＡ生産株を試験するための醗酵実験）
次に組み込みＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを含む７１０７−１３３株を１リッター醗酵槽中で評価した。醗酵槽を初期容積４７５ｍｌに設定した。醗酵培地の成分を表２６に列記する。７５％ＮＨ４ＯＨをｐＨ制御に用いて醗酵を行った。醗酵中、温度を３７℃に保った。溶存酸素濃度を飽和濃度の２０％に保つため、曝気と攪拌を調節した。６５％グルコースをコンピュータープログラムで制御された供給速度で供給し、接種時の生育速度０．４０／時間、６時間で最大速度５ｍｌ／時間とした。グルコースを連続的に供給し、１０時間で５ｇ／ｌの食品グレードラクトースを添加して培養細胞を、誘導した。
７１０７−１３３株からの醗酵結果を、同じ条件で行った醗酵２３７で先に行った７１０７−９２（１）株の結果と比較した。これらの株は双方とも、組み込みＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１の１個のコピーを含む。その結果は７１０７−１３３株中のＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットの存在が、７１０７−９２（１）株より若干有利であることを示している。７１０７−９２（１）株において５９．８時間で９６．６ｇ／ｌのＮＡＧと比較して、７１０７−１３３株は５９．６時間で１０７．１ｇ／ｌのＮＡＧを達成した。
（表２６．醗酵培地の成分）
Figure 2013009690
＊微量金属組成はＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ５ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ３．７５ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０．６ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．１００２ｍｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．１００２ｍｇ／ｌ
（実施例２４）
本実施例はクローニング、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）遺伝子の過剰発現、Ｔ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み、およびＴ７プロモーターの制御下におけるｚｆｗ過剰発現のＮＡＧ生産に対する効果を説明する。
ペントース燐酸経路でアミノ酸、ヌクレオチドおよび細胞壁生合成のための中間体が提供される。さらに、ペントース燐酸経路の酸化部分は細胞中のＮＡＤＰＨも重要な材料である。Ｅ．ｃｏｌｉのｚｗｆ遺伝子はペントース燐酸回路で第一工程を触媒するグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＦＨ）をコードし、グルコース−６−燐酸をグルクノ−１、５−ラクトンに変換する。ｚｗｆ遺伝子の発現は細胞生育速度と同調する（Ｒｏｗｌｅｙ、Ｄ．およびＷｏｌｆ、Ｒ．、Ｊ．Ｂａｃ．、１９９１、１７３（３）：９６８−９７７）。
ＮＡＧまたはＧｌｃＮで生育可能なＥ．ｃｏｌｉ単離株が文献に報告されている（Ｊ．Ｂａｃ．、１９７０、１０１：３８４−３９１）。著者らは、アミノ糖燐酸の蓄積がホスホヘキソースイソメラーゼおよびフルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼで触媒される反応を阻害し、ペントース欠乏になり得ると推定している。ペントースまたはグルコン酸の添加により、これらの株の阻害が解除された。
ＧｌｃＮ／ＧｌｃＮＡｃを生産する組換えＥ．ｃｏｌｉ株はアミノ糖燐酸をあるレベルで蓄積し得る。この場合、グルコン酸またはリボース等のペントースの添加により、ＮＡＧ生産が増加する結果となる。ＮＡＧ生産株７１０７−８７＃２５で行われた振盪フラスコ実験は、リボースまたはグルコン酸の添加により、生育とＮＡＧ力価の両方が増加したことを示した。従って、ペントースまたはグルコン酸の添加により軽減されるペントース欠乏をＮＧＡ生産株が経験した様に思われる。
外因性ペントースを添加せずにペントース欠乏を軽減する戦略として、ＮＡＧ生産株中でｚｗｆ遺伝子を過剰発現することが決定された。ｚｗｆの過剰発現が燐酸化アミノ糖のペントース燐酸経路に対する阻害を減少し得ると推察された。その場合、これにより我々の株中のＮＡＧ力価を増加させるためにペントースまたはグルコン酸を供給する必要がなくなると思われる。
（Ｅ．ｃｏｌｉ ｚｗｆのクローニングと発現）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｚｗｆの発現をクローニングするため、公開されたｚｗｆの配列に基づいてプライマーを合成した（Ｂｌａｔｔｅｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）。Ｅ．ｃｏｌｉｚｗｆ遺伝子コード配列のヌクレオチド配列が配列番号９４と呼ばれる配列ファイルに列挙される。Ｅ．ｃｏｌｉＺＷＦタンパク質の推定アミノ酸配列が配列番号９５と呼ばれる並列ファイルに列挙される。プライマーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＢＡ由来のｚｗｆコード配列をＰＣＲで増幅した。増幅に使用したプライマーは以下の配列を有する：０７−１０１：５’ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号９６）、および０７−１０２：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＣ−３’（配列番号９７）。
プライマー０７−１０１はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＧＴＣＴＣ、配列番号９６のヌクレオチド５〜１０で表される）と、ＡＴＧ開始コドンからのｚｗｆコード配列の２０ヌクレオチド（配列番号９６のヌクレオチド１３〜３２で表される）を含む。プライマー０７−１０２はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号９７のヌクレオチド５〜１０で表される）と、翻訳停止コドンから開始するｚｗｆコード配列の２７ヌクレオチド（配列番号９７のヌクレオチド１１〜３７で表される）を含む。ＰＣＲを標準条件下で行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側面するｚｗｆコード配列を含むフラグメントを作成した。
ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）（ＮｏｖａｇｅｎＩｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７１を作成した。この方法のクローニングはｚｗｆ配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモーターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ―ｚｗｆの発現カセットを生成する。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中の組み換えＺＷＦタンパク質の機能的発現）
それぞれｐＥＴ２４ｄ（＋）中にＴ７ｌａｃ−ｚｗｆ発現カセットを含むプラスミドｐＳＷ０７−７１＃１７、＃２０および／または＃３３をＮＡＧ生産株７１０７−９２８１）中に形質転換し、７１０７−９６（１）株（ｐＳＷ０７−７１＃１７で形質転換）、７１０７−９６（２）株および７１０７−９６（３）株（ｐＳＷ０７−７１＃２０で形質転換）および７１０７−９６（２）株および７１０７−９６（３）株（ｐＳＷ０７−７１＃２０で形質転換）、および７１０７−９６（４）株（ｐＳＷ０７−７１＃３３で形質転換）を作成した。ｐＥＴ２４ｄ（＋）により７１０７−９２（１）株を形質転換して対照株７１０７−９５を調製した。培養細胞ＬＢ中で生育し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する標準誘導プロトコールに従った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に試料を誘導培養細胞から採取した。その結果から、Ｇ６ＰＤＨの予想されるサイズに相当する約５６ｋＤａのタンパク質の過剰発現が確認された。しかしながら、過剰発現されたタンパク質のほとんどは不溶性型であるように思われた。
４時間のＩＰＴＧ誘導後、培養細胞を収穫しグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ活性を分析した。対照株７１０７−９５の活性０．０４ｍｍｏｌ−１ｍｉｎ−１ｍｇ−１タンパク質と比較して、７１０７−９６（２）、７１０７−９６（３）および７１０７−９６（４）株はそれぞれ６９．７、７８．１および９０．１ｍｍｏｌ−１ｍｉｎ−１ｍｇ−１タンパク質のＧ６ＰＤＨ活性を有した。これにより、ＮＡＧ生産株中のｚｗｆの過剰発現に成功したことが確認された。
（Ｔ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み）
Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−９２＃１中の組み換えＺＷＦタンパク質の機能性発現を確認したので、次の工程はＴ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットをＮＡＧ生産株の染色体中へ安定に組み込むことであった。カセットを染色体のｒｈａ領域へ組み込むことを標的とするため、組み込みベクターを設計した。Ｅ．ｃｏｌｉのｒｈａＢＡＤ遺伝子はラムノキナーゼ、Ｌ−ラムノースイソメラーゼおよびラムヌロース−１−燐酸アルドラーゼをそれぞれコードするオペロンを形成する。これらの遺伝子はラムノースの別な炭素源としての利用に関与し、非必須遺伝子と考えられている。従って、この領域の妨害が生育またはＮＡＧ生産に影響してはならない。
組み込みベクターを作成する最初の工程はＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡからｒｈａＢＡＤ領域をクローニングすることであった。ｒｈａＢＡＤオペロン＋側面領域の公開された配列に基づきプライマーを合成した（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）。ｒｈａ領域を増幅するために用いたプライマーは前方プライマー０７−１０７および逆方向プライマー０７−１０８であり、以下の配列を有した：０７−１０７：５’−ＣＧＡＡＴＡＴＣＡＣＧＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＣ−３’（配列番号９８）、および５’−ＣＡＣＡＴＧＧＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＣＣ−３’（配列番号９９）。
プライマー０７−１０７はｒｈａ開始コドンの上流の１０９６塩基対から増幅する。プライマー０７−１０８はｒｈａ停止コドンの下流の９６６塩基対から増幅する。ＰＣＲを標準条件で行い、ｒｈａＢＡＤオペロン＋側面領域を含むフラグメントを生成した。ＰＣＲフラグメントをベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にクローニングし、プラスミドｐＳＷ０７−７２を作成した。
組み込みベクターを作成する次の工程は、Ｔ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットをプラスミドｐＳＷ０７−７２中へ加えることであった。標準条件を用いて、Ｔ７−ｌａｃ−ｚｗｆカセットをプラスミドｐＳＷ０７−７１から増幅した。ＰＣＲの増幅は前方プライマー０７−１１および逆方向プライマー０７−１２２を用いて行ったが、それらのプライマーは以下の配列を有した：０７−１１１：５‘−ＧＡＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１００）、および０７−１１２：５’−ＧＡＴＣＡＧＣＧＣＴＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣ−３’（配列番号１０１）。
プライマー０７−１１１はＸｃｍ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＣＡＮＮＮＮＮＮ ＮＮＮ ＴＧＧ、配列番号１００のヌクレオチド３〜１７で表される）を含み、ｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７プロモーター配列の上流の８０ｂｐ（配列番号１００のヌクレオチド１８〜３５）から増幅する。プライマー０７−１１２はＡｆｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡＧＣＧＣＴ、配列番号１０１のヌクレオチド５〜１０で表される）を含み、Ｔ７ターミネーターの下流の２５ｂｐ（配列番号１０１のヌクレオチド１１〜４０で表される）から増幅する。得られた１．８ｋｂのＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼＸｃｍＩおよびＡｆｅＩで消化した。
プラスミドｐＳＷ０７−７２を制限酵素ＸｃｍおよびＡｆｅＩで消化し、ｐＳＷ０７−７２骨格から３．６ｂｐフラグメントを切除した。ＸｃｍＩおよびＡｆｅＩ末端を有するＴ７ｌａｃ−ｚｗｆを含むＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＳＷ０７−７２中の切除部位中にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７３を作成した。従って、プラスミドｐＳＷ０７−７３はほとんど全てのｒｈａＢＡＤオペロンの３．６ｋｂ欠失を有し、Ｔ７−ｌａｃ−ｚｗｆが欠失部位に挿入される。
組み込みプラスミド構築の最終工程は、プラスミドｐＫＬＮ０７−２１由来の温度感受性レプリコンとカナマイシン耐性カセットを加えることである。プラスミドｐＫＬＮ０７−２１をＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、温度感受性レプリコンとカナマイシン耐性カセットを含むフラグメントを切除した。プラスミドｐＳＷ０７−７３を制限酵素ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ骨格由来のｒｈａＢＡＤ側面を有するＴ７−ｌａｃ−ｚｗｆを含むフラグメントを放出した。この二つのフラグメントを共にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７４を作成した。プラスミドｐＳＷ０７−７４を用いて、Ｔ７ｌａｃ−ｚｗｆをＥ．ｃｏｌｉ染色体のｒｈａ領域に直接組み込むことができる。
プラスミドｐＳＷ０７−７４をＮＡＧ生産株７１０７−９２（１）中に形質転換した。温度感受性選択と継代培養プロトコールに従い、ｒｈａＢＡＤ欠失部位のＴ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットの存在につき、標準ＰＣＲプロトコールを用いてカナマイシン感受性コロニーをスクリーニングした。ｚｗｆコード配列の１．０ｋｂフラグメントをプローブとして用い、ＰＣＲで同手されたいくつかの株が高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで確認した。これらの株を７１０７−６０６（２）、７１０７−６０６（３）および７１０７−６０６（４）と呼ぶ。
（組み込みＴ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットを有する株中におけるＮＡＧ生産）
７１０７−６０６（１）および７１０７−６０６（３）株中のＮＧＡ生産に対するＴ７プロモーター制御下のｚｗｆ過剰発現の効果を評価するため、振盪フラスコスクリーニング４６を行った。先に議論した様に、ｚｗｆの過剰発現がペントース欠乏を解除し、燐酸化アミノ糖で生じた生育阻害をなくすことができると推定されている。０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、４０ｇ／ｌのグルコースおよび０．２ｍＭのＩＰＴＧ（遅延誘導フラスコではＩＰＴＧは２４時間に添加した）を補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で培養細胞を生育させた。表２７に示す様に１０ｇ／ｌのリボースと５ｇ／ｌの酵母抽出物を培養液に加えた。培養細胞を３０℃で２４時間インキュベーションし、その後２５℃に切り替えた。２４時間および４８時間で、培養液のｐＨを７．２に調製し、グルコースを１日当たり３０ｇ／ｌに添加した。アンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下したフラスコに５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えた。ＯＤおよびＮＡＤレベルの測定のため、試料を２４、４８および７２時間に採取した。培養細胞を７２時間で収穫して酵素分析を行った。
（表２７．ｚｗｆ過剰発現株における生育、酵素活性およびＧｌｃＮＡｃ生産に対する誘導時間の変化、リボースおよび酵母抽出物の添加の効果）
Figure 2013009690
１遅延誘導のためＩＰＴＧを２４時間に添加
２酵素活性はμｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質で表す
３ＮＤ：測定されず
結果は、Ｔ７プロモーターで駆動されるｚｗｆ過剰発現株が対照株より５０〜１００倍大きいＧ６ＰＤＨ活性を有することを示す。対照株の生育と比較すると、ｚｗｆ過剰発現によりリボースを添加しない培地中で生育が若干改善された。しかしながら、ｚｗｆを過剰発現する株ではＧｌｍＳ活性が減少する傾向にあり、ＮＡＧ生産レベルは対照株７１０７−９２（１）で見られたレベルに達しなかった。これはグルコース経路から離れてペントース経路へ入り込む炭素の量が多すぎることを示している。
（実施例２５）
本実施例はグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）遺伝子のクローニング、天然型プロモーターを有するｚｗｆ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み、および天然型プロモーターの制御下におけるｚｗｆ過剰発現発現の細胞生育およびＮＡＧ生産に対する効果を説明する。
（天然型プロモーターおよび調節領域を有するＥ．ｃｏｌｉのクローニング）
実施例２４に記載した通り、生育とＮＡＧ生産を改善するための戦略の一部として、組み込みＴ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットを有する株を構築した。ｚｗｆの過剰発現により燐酸化アミノ糖のペントース燐酸経路に対する阻害が減少すると推定された。その場合、我々の株中のＮＡＧ力価を増大するためにさらに、ペントースまたはグルコースを供給する必要がなくなると考えられる。
組み込みＴ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットを含む７１０７−６０６株は対照株より若干生育が良く、ペントース欠乏が部分的に軽減されていることを示している。しかしながら、ＮＡＧ生産に関しては対照株ほど良くなかった。これは、高すぎるＺＷＦタンパク質の発現レベルを与える強いＴ７プロモーターを使用しているためと思われる。グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの活性が高すぎると、ペントース燐酸経路へ流れる炭素の量が多すぎて望ましくない。従って、ｚｗｆの発現が細胞で調節される様に、ｚｗｆをその天然型プロモーターで過剰発現させることを決定した。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｚｗｆは生育速度に依存して調節されている。さらに、ｚｗｆはｚｏｘＲＳレギュロンと複数の抗生物質耐性（ｍａｒ）の一員である。従って、天然型ｚｗｆのクローニングには天然型プロモターばかりでなく、“Ｓｏｘｂｏｘ”等の調節領域も含まれる（Ｆａｗｃｅｔｔ、Ｗ．およびＷｏｌｆ．Ｒ．、Ｊ．Ｂａｃ．、１７７（７）：１７４２−１７５０）。染色体上にｚｗｆのコピーが二つ存在することは、ＮＡＧ生産経路等、他の経路を通る炭素フローに大きく影響せず、ペントース燐酸経路を通るフローを増加し得ると考えられる。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｚｗｆの発現をクローニングするため、ｚｗｆ遺伝子の公開された配列に基づいてプライマーを合成した（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）。Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０下のゲノムＤＮＡからｚｗｆコード配列＋調節領域をＰＣＲをで増幅するためにプライマーを使用した。増幅に用いたプライマーは反転プラーマー０７−１９２および前方プライマー０７−１３０であり、以下の配列を有する：０７−１９２：５’−ＧＡＴＧＣＴＡＧＣＴＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１０３）、および５’−ＧＡＴＴＴＣＧＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＴＴＴＴＴＡＣＣＣ−３’（配列番号１０３）。
前方プライマー０７−１３０はＢｓｔＢ部位（ＴＴＣＧＡＡ、配列番号１０２のヌクレオチド４〜９で表される）を含み、ｚｗｆ開始コドンの上流の２０３塩基対から増幅する。反転プラーマー０７−１２９はＮｈｅＩ部位（ＧＣＴＡＧＣ、配列番号１０３のヌクレオチド４〜９で表される）を含み、ｚｗｆ停止コドンの下流の１５４塩基対から増幅する。標準条件でＰＣＲを行い、ＮｈｅＩおよびＮｓｔＢＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側面する１．８ｋｂフラグメントを生成した。
（組み換えｚｗｆのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み）
ゲノムｒｈａ領域を標的としてｚｗｆカセットを組み込むため、組み込みベクターを設計した。Ｅ．ｃｏｌｉのｒｈａＢＡＤ遺伝子はラムロキナーゼ、Ｌ−ラムノースイソメラーゼおよびラムノース−１−燐酸アルドラーゼそれぞれをコードするオペロンを形成する。これらの遺伝子はラムノースを別な炭素源として利用することに関与し、非必須遺伝子であると考えられている。従って、この領域を妨害することが我々の株における生育とＮＡＧ生産に影響してはならい。
プラスミドｐＳＷ０７−７２＃４５（実施例５４に記載）を組み込みベクター作成の第一工程に利用した。ｒｈａＢＡＤオペロン＋側面配列を含むこのプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＢおよびＮｈｅＩで消化した。これによりｒｈａＢおよびｒｈａＡコード配列部分を含む７０２塩基対をプラスミドから除去した。ｚｗｆコード配列＋調節レギュロンを含むＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＢおよびＮｈｅＩで消化し、ｐＳＷ０７−７２＃４５のＢｓｔＢおよびＮｈｅＩ部位へライゲートしてプラスミドｐＳＷ０７−８６を作成した。
プラスミドｐＳＷ０７−８６を制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｒｈａ遺伝子が側面するｚｗｆを含む６．９ｋｂフラグメントを放出した。ｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７２（９）：４６１７−４６２２）とｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性カセット（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むｐＫＬＮ０７−２１由来の４．２ｋｂＫｐｎＩ／ＮｏｔＩフラグメントと、このフラグメントをライゲートした。得られたプラスミドｐＳＷ０７−８７を用いて、ｚｗｆをＥ．ｃｏｌｉ染色体のｒｈａＢＡ領域へ組み込むことができる。
ＳｃＧＮＡ１カセットの１個または少なくとも２個のコピーをそれぞれ含む７１０７−９２（１）および７１０７−６０７（２）株中へ、プラスミドｐＳＷ０７−８７を形質転換した。温度感受性選択と継代培養プロトコールに従い、ｒｈａＢＡ欠失部位におけるＴ７ｌａｃ−ｚｗｆの存在につき、カナマイシン感受性コロニーを標準ＰＣＲプロトコールを用いてスクリーニングした。ＰＣＲで同定されたいくつかの株を、ｚｗｆコード配列を含むフラグメントをプローブとして用いて、高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで確認した。７１０７−６０７（２）由来の株を７０１７−６３３、７１０７−９２（１）由来の株を７００７−６３４と呼ぶ。
（天然型プロモーター制御下のＮＡＧ生産株におけるｚｗｆの過剰発現）
ＮＡＧ生産に対する天然型プロモーターの制御下でｚｗｆの過剰発現の効果を評価するため、７１０７−６３３および７１０７−６３４株をスクリーニングした。０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｇ／ｌの酵母抽出物、１０Ｇ／Ｌのフルコースおよび４０ｇ／ｌのラクトースを補充したＭ９Ｂ培地中培養細胞をで生育させた。株を３０℃で２４時間生育させ、次いで実験の残りを２５℃に切り替えた。２４および４８時間で各培養液のｐＨを７．２に調節し。ＨＰＬＣの結果に基づき一日当たりグルコースを３０ｇ／ｌで加えた。アンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下下フラスコに５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を２４および４８時間で添加した。ＯＤおよびＮＡＧレベルを測定するため、試料を２４、４８および７２時間に採取した。結果を表２８に示す。
（表２８．天然型プロモーターでｚｗｆを過剰発現する株の生育とＧｌｃＮＡｃ生産）
Figure 2013009690
結果は、過剰発現ｚｗｆを有する細胞の生育が、天然型またはＴ７プロモーターで増加すること、すなわちペントース欠乏が少なくとも部分的に軽減することを示す。これらの株のいくつかでＮＡＧの生産も増加した。例えば、７１０７−６３４（２）株は対照株７１０７−９２８１）より約２５％多いＮＡＧを生産した。この実験で、過剰発現ｚｗｆを有するＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの２個のコピーを有する株は、２個のカセットのコピーと過剰発現ｚｗｆを有する株以上に改善されなかった。
（ｚｗｆ遺伝子を過剰発現する株の１リッター醗酵槽中の評価）
次にｚｗｆを過剰発現する株を１Ｌ醗酵槽中で評価した。これらの結果を、別な醗酵槽中で予め行われた７１０７−９２（１）株からの結果とも比較した。醗酵槽を初期容積４７５ｍｌに設定した。醗酵培地の成分は表２６に列挙されている。７５％ＮＨ４ＯＨでｐＨを制御して醗酵を行った。醗酵中、温度を３７℃に保った。溶存酸素濃度を飽和の２０％に保つため、曝気と攪拌を調節した。コンピュータープログラムで供給速度を制御して６５％グルコースを醗酵培地に供給し、接種時の生育速度を０．４０／時間、６時間での最大速度を５ｍｌ／時間とした。１０時間で食品グレードのラクトースを供給し、グルコースを連続的に供給して培養細胞を誘導した。
醗酵の結果は、７１０７−６０６（１）株が対照株より高いＯＤ６００を、特に初期の時点で達成することを示した。これはこの株中のペントースの供給が増加したことによると思われる。一方、天然型プロモーターでｚｗｆを過剰発現する株は、対照株とほぼ同じＯＤ６００で生育した。この実験で、ｚｗｆを過剰発現する株は何れも、ＧｌｃＮＡｃの生産で対象株７１０７−６０７（２）または７１０７−９２（１）を上回らなかった。しかしながら、醗酵条件は生産株７１０７−９２（１）および７１０７−９２（２）に対し最適であった。生育とＮＡＧ生産を改善する潜在能力を示すためには、ｚｗｆ過剰発現株が若干異なった醗酵条件を要求することは有り得る。
（実施例２６）
本実施例はホスフォグルコースイソメラーゼ（ｐｇｉ）遺伝子のクローニング、Ｔ７ｌａｃ−ｐｇｉカセットのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み、およびＮＡＧ生産に対するｐｇｉ遺伝子過剰発現の効果を説明する。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｉ遺伝子は、グルコース−６−燐酸とフラクトース−６−燐酸の相互変換を触媒するホスフォグルコースイソメラーゼをコードする。ｐｇｉの過剰発現は、Ｆ−６−Ｐのプールを増加し、従ってＧｌｃＮ／ＧｌｃＮＡｃの生産が増加する。この可能性を試験するため、ｐｇｉ遺伝子をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉＮＡＧ生産背景中に過剰発現させた。
（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｉのクローニングと過剰発現）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｉのクローニングと過剰発現のため、ｐｇｉ遺伝子の公開された配列に基づいてプライマーを合成した（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）。Ｅ．ｃｏｌｉｐｇｉ遺伝子コード配列のヌクレオチド配列は配列番号１０４と呼ばれる配列中に列記されている。Ｅ．ｃｏｌｉＰＧＩ酵素の推定アミノ酸配列は配列番号１０５と呼ばれる配列中に列記されている。プライマーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡからｐｇｉコード配列をＰＣＲで増幅した。使用した前方プライマー０７−１０３および逆方向プライマー０７−１０４は以下の配列を有する：０７−１０３：５’−ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＡＴＣＣＡＡＣＧＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１０６）、および５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＧＣＴＴＴＡＴＡＧＣ−３’（配列番号１０７）。
プライマー０７−１０３はＢｓａＩ部位（ＧＧＴＴＣＴ、配列番号１０６のヌクレオチド５〜１０で表される）と、ＡＴＧ開始コドンからのｐｇｉ配列の２６ヌクレオチド（配列番号１０６のヌクレオチド１３〜３８で表される）を含む。プライマー０７−１０４はＸｈｏ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号１０７のヌクレオチド５〜１０で表される）と、翻訳停止コドンからｐｇｉコード配列の２３ヌクレオチド（配列番号１０７の１１〜３３ヌクレオチドで現れる）を含む。標準条件下でＰＣＲを行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側面するｐｇｉコード配列を含むフラグメントを生成した。
ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＢｓａＩおよびＸｈｏＩ部位へライゲートしてプラスミドＰＫＬＮ０７−３６とＰＫＬＮ０７−３７を作成した。この方法によるクローニングはｐｇｉ配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモーターの下流に置き、発現カセットＴ７ｌａｃ−ｐｇｉを生成する。
（Ｅ．ｃｏｌｉ中の組み換えｐｇｉの機能性発現）
プラスミドｐＫＬＮ０７−３６をＮＡＧ生産株７１０７−９２（１）中へ形質転換し、７１０−１２４株を作成した。ｐＥＴ２４ｄ（＋）空ベクターを有する７１０７−９２（１）を形質転換して対照株７１０７−９５を作成した。標準プロトコールに従い、培養細胞をＬＢ中で生育させ１ｍＭＩＰＴＧで誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために誘導および非誘導培養細胞から採取した。結果から、ＰＧＩタンパク質の予想サイズに対応する約６２ｋＤａのタンパク質の過剰生産が確認された。全および可溶性タンパク質の量をＩＰＴＧ誘導の４時間後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。７１０７−１２４（１）および７１０７−１２４８２）由来の試料は６２ｋＤａタンパク質の過剰生産を示し、組み換えＰＧＩタンパク質の過剰発現の成功を示した。誘導および非誘導培養細胞中の過剰生産タンパク質の存在は、誘導剤がない場合のｐｇｉ遺伝子の漏出発現を示す。対照株７１０７−９５由来の試料にはこの様なタンパク質バンドは見られなかった。全ＰＧＩタンパク質の少なくとも半分は可溶性型である様に思われる。
４時間の誘導後、ホスフォグルコースイソメラーゼ活性を測定するため培養細胞を収穫した。対照株に比活性０．９４ｍｍｏｌｍｉｎ−１ｍｇ−１と比較して、７１０７−１
２４（１）、７１０７−１２４（２）および７１０７−１２４（３）株が比活性２４２、１５８および２１５ｍｍｏｌｍｉｎ−１ｍｇ−１タンパク質をそれぞれ有することが見
出された。これにより対照株に比べて比活性が１００〜２００倍のレベルに達し、Ｐｇｉタンパク質の過剰発現に成功したことが確認された。
（Ｅ．ｃｏｌｉ染色体中へのＴ７ｌａｃ−ｐｇｉＡ組み込みを指向するベクターの構築）
ｐｇｉの機能性発現が確認されたので、次のステップはＥ．ｃｏｌｉ染色体を標的とするＴ７ｌａｃ−ｐｇｉカセットの組み込みである。組み込みのために選ばれた標的はＥ．ｃｏｌｉ染色体のａｒａＢＡＤ領域であった。Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼおよびＬ−リボース−５−Ｐ４−エピメラーゼタンパク質をコードするａｒａＢＡＤオペロンは、炭素源としてＬ−アラビノースの利用に関与している。これらのタンパク質は、ペントース燐酸分岐における中間体であるＬ−アラビノースのＤ−キシルロース−５−燐酸への変換を触媒する。Ｌ−アラビノースはＮＡＧ醗酵プロセスの炭素源として使用されないので、この部位への遺伝子組み込みは細胞生育とＮＡＧ生産に影響してはならない。
組み込みベクターを生成する最初の工程は、ａｒａＢＡＤオペロンを含むゲノム領域をクローニングすることである。ａｒａＢＡＤオペロンの公開された配列に基づきプライマーを合成した（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）。ａｒａＢＡＤ領域を増幅するために使用したプライマーは、順方向プライマー０７−１０５および逆方向プライマー０７−１０６であり、以下の配列を有した：０７−１０５：５’−ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＡＴＣＧＣＡＡＣＴＣ−３’（配列番号１０８）、そして０７−１０６：５’−ＣＧＧＡＣＧＣＡＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＧＴＡＧＡＣ−３’（配列番号１０９）。
プライマー０７−１０５はａｒａＢのＡＴＧ開始コドンの７４塩基対下流から増幅し、プライマー０７−１０６はａｒａＤ翻訳終止コドンの４０４塩基対下流から増幅する。得られたａｒａＢＡＤオペロンを含む４．７ｋｂのＰＣＲフラグメントをベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に連結し、プラスミドｐＫＬＮ０７−３８を生成した。
次の工程は、プラスミドｐＫＬＮ０７−３７由来のＴ７ｌａｃ−ｐｇｉカセットを、プラスミドｐＫＬＮ０７−３８に加えることである。以下の配列を有する順方向プライマー０７−１０９および逆方向プライマー０７−１１０を用いて、Ｔ７ｌａｃ−ｐｇｉカセットを、プラスミドＫＬＮ０７−３７からＰＣＲによって増幅した：０７−１０９：５’−ＧＡＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１１０）、そして０７−１１０：５’−ＧＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣ−３’（配列番号１１１）。
プライマー０７−１０９は、ＢｓｐＥＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＴＣＣＧＧＡ、配列番号１１０のヌクレオチド４〜９で表される）を含み、ｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７プロモーターの８０塩基対上流から増幅する。プライマー０７−１１０は、ＳｅｘＡＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡＣＣＴＧＧＴ、配列番号１１１のヌクレオチド５〜１１で表される）を含み、ｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７プロモーターの１８塩基対下流から増幅する。ＰＣＲを標準条件下で行って、ＢｓｐＥＩおよびＳｅｘＡＩ制限エンドヌクレアーゼ部位によって隣接されるＴ７ｌａｃ−ｐｇｉカセットを含むフラグメントを生成した。このＰＣＲフラグメントを次いで制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＥＩおよびＳｅｘＡＩで消化した。
プラスミドｐＫＬＮ０７−３８を制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＥＩおよびＳｅｘＡＩで消化し、ａｒａＢコード配列の最後の６１２塩基対を含む２４７７塩基対フラグメント、全ａｒａＡコード配列、およびａｒａＤコード配列の最初の５９塩基対を切除した。消化したＴ７ｌａｃ−ｐｇｉＰＣＲフラグメント（上記）を、ｐＫＬＮ０７−３８のＢｓｐＥＩ部位およびＳｅｘＡＩ部位に連結し、プラスミドｐＫＬＮ０７−４１を生成した。従って、プラスミドｐＫＬＮ０７−４１は、ａｒａＢＡＤオペロンの一部のうち２．４ｋｂの欠失を有し、Ｔ７−ｌａｃ−ｐｇｉがその欠失部位に挿入されている。
最後のクローニング工程について、Ｔ７ｌａｃ−ｐｇｉの挿入を有するａｒａＢＡＤ配列を含むフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いてプラスミドｐＫＬＮ０７−４１から消化した。このフラグメントを、ｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．１７１（９）：４６１７−４６２２）、およびｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むｐＫＬＮ０７−２１由来の４．２ｋｂ ＳａｌＩ／ＮｏｔＩフラグメントと連結した。得られたプラスミドｐＫＬＮ０７−４７は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体のａｒａＢＡＤ領域へのｐｇｉの直接組み込みのために使用し得る。
７１０７−９２（１）株を、プラスミドｐＫＬＮ０７−４７で形質転換した。温度選択プロトコールを実施した。カナマイシン感受性コロニーを、染色体上のａｒａＢＡＤ欠失部位でのＴ７ｌａｃ−ｐｇｉの存在について、標準条件下でＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲによって同定されたいくつかの株を、プローブとしてｐｇｉコード配列を含むフラグメント使用して、高ストリンジェントなサザンハイブリダイゼーションによって確認した。これらの株を７１０７−１３６から７１０７−１４１と名付けた。
（７１０７−１３６株および７１０７−１４１株の振盪フラスコ評価）
７１０７−１３６株および７１０７−１４１株を含む株をスクリーニングして、ＮＡＧ生成におけるｐｇｉの過剰発現の効果を評価した。培養物を０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのリボース、１０ｇ／ｌのグルコース、および４０ｇ／ｌのラクトースを補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で増殖させた。株を３０℃で２４時間増殖させ、次いで残りの実験のために２５℃に切り替えた。２４時間および４８時間で、各々の培養物のｐＨを７．２に調整し、ＨＰＬＣの結果に基づいてグルコースを１日当たり３０ｇ／ｌまで加えた。レベルが１ｇ／ｌ以下に減少したフラスコに、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を２４時間および４８時間にて加えた。ＯＤおよびＮＡＧレベルの測定のために、２４時間、４８時間および７２時間でサンプルを取り出した。酵素分析のために、培養物を７２時間で収集した。結果を表２９に示す。
（表２９．ｐｇｉ過剰発現株における増殖とＧｌｃＮＡｃ生成）
Figure 2013009690
この実験において、ｐｇｉを過剰発現した株における有意な改善は見られなかった。しかし、最適化した振盪フラスコまたは発酵条件下では、過剰発現したｐｇｉは、増殖および／またはＮＡＧ生成にポジティブな影響を及ぼし得る。
（１リットル発酵における７１０７−１４１株の評価）
次にｐｇｉを過剰発現する７１０７−１４１株を１Ｌ発酵槽中で評価した。結果を、同一条件下での別の発酵で予め行った７１０７−９２（１）株からの結果と比較した。発酵を、４７５ｍｌの初期容積に設定した。発酵培地の成分を表３に列挙する。６．９にｐＨを制御するために７５％ＮＨ４ＯＨを使用して、発酵を行った。発酵の全体にわたって、温度を３７℃で維持した。曝気と攪拌を調整して、溶存酸素濃度を空気飽和度の２０％に維持した。コンピュータープログラムで制御した供給速度で培養物に６５％グルコースを供給して、播種時で０．４０／時間の増殖速度および６時間までに５ｍｌ／時間の最大速度を達成した。グルコース供給を続けながら、食品用ラクトースを１０時間で５ｇ／ｌの量で加えて、培養物を誘導した。
振盪フラスコ実験と同様に、ｐｇｉ遺伝子を過剰発現する株におけるグルコサミン生成において有意な改善は見られなかった。しかし、先に議論したように、これらの株に対して最適化した条件下では、ｐｇｉ過剰発現は、増殖および／またはＮＡＧ生成にポジティブな影響を及ぼし得る。
（実施例２７）
以下の実施例は、グリコーゲン合成がｇｌｇＸＣＡ遺伝子の欠失によってブロックされるグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生成株の開発を記載する。グルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生成におけるグリコーゲン合成をブロックすることの効果もまた、実証する。
細菌細胞は貯蔵炭素の主要な形態としてグリコーゲンを蓄積する。グリコーゲン合成には、ＡＤＰ−グルコースピロホスフォリラーゼ、グリコーゲンシンターゼおよび分枝酵素の３種の酵素が関与する。これらの酵素はそれぞれ、グルコース−１−リン酸から単糖ドナー（ＡＤＰ−グルコース）の合成、これらの単糖単位の重合によるグルコースの（１−４）ポリマーの形成、およびこのポリマーの再構成による糖鎖内の（１−６）分枝の生成を触媒する。ＡＤＰ−グルコースピロホスフォリラーゼは、グリコーゲン合成の中心的な酵素であり、アロステリックエフェクターにより強く調節される。グリコーゲン合成および分解に関与する遺伝子は、ｇｌｇオペロン（ｇｌｇＢＸＣＡＰ）として組織化され、ｇｌｇＢ（１，４−α−グルカン分枝酵素）、ｇｌｇＸ（グリコシルヒドロラーゼ、脱分枝酵素）、ｇｌｇＣ（ＡＤＰ−グルコースピロホスフォリラーゼ）、ｇｌｇＡ（グリコーゲンシンターゼ）、およびｇｌｇＰ（グリコーゲンマルトテトラオースホスフォリラーゼ）が挙げられる。グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン生成経路への炭素の流れを増加させる努力において、グリコーゲン合成経路は、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンを生成する株において遺伝子欠失によってブロックされた。
以下の配列のＰＣＲプライマーを合成し、ｇｌｇオペロン由来の配列をクローニングした。ＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ１−５：５’−ＧＡＧＴＣＡＴＣＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＡＣＧＣＧＡ−３’（配列番号１１２）、およびＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ２−３：５’−ＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＧＧ−３’（配列番号１１３）。
標準条件を使用してプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０由来のｇｌｇオペロンの５７３７ｂｐフラグメントを生成した。増幅した配列は、ｇｌｇＢからｇｌｇＰに及ぶ。ＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯ ＴＡ クローニングキット、カタログ番号Ｋ４５００−０１）に連結し、組換えプラスミドｐＣＡＬＧ１８−１を生成した。
ｐＣＡＬＧ１８−１をＡｇｅＩで消化して、プラスミドからｇｌｇＸの３’部分、全ｇｌｇＣ、およびｇｌｇＰの５’部分を欠失させた。プラスミドの残りの部分を再環化して、ｐＣＡＬＧ２１−１を生成した。この組換えプラスミドは切断型ｇｌｇオペロン（ｇｌｇＸＣＡＤ）を含む。
ｇｌｇＸＣＡＤをグルコサミン生成株および／またはＮ−アセチルグルコサミン生成株のゲノム中に組み込むのに必要なプラスミドを生成するために、さらに２つの工程を要した。第一に、ｐＵＣ４Ｋ由来のＫａｎｒ遺伝子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２７−４９５８−０１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０６４０４）を、ｐＣＡＬＧ２１−１に加えて、ｐＣＡＬＧ２３−１を生成した。第二に、ｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性複製開始点（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｃ．ら、１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７１：９、ｐｐ４６１７−４６２２）をｐＣＡＬＧ２３−１に加えて、ｐＣＡＬＧ２８−１を生成した。第一の手順を行うために、ｐＣＡＬＧ２１−１およびｐＵＣ４Ｋを、いずれもＢａｍＨＩで消化した。ＢａｍＨＩ消化はｇｌｇＸＣＡ欠失部位の上流のｐＣＡＬＧ２１−１を直線化し、ｐＵＣ４ＫからＫａｎｒフラグメントを放出する。直線化ｐＣＡＬＧ２１−１およびＫａｎｒフラグメントを連結して、ｐＣＡＬＧ２３−１を生成した。ｐＣＡＬＧ２８−１を生成するために、ｐＣＡＬＧ２３−１由来のＫａｎｒ−ｇｌｇＸＣＡＤフラグメントをオリゴヌクレオチドＧＮＴＯＰＯ２−５（配列番号１１４）およびＧＮＴＯＰＯ３−４（配列番号１１５）を使用して、ＰＣＲ増幅した。ＧＮＴＯＰＯ２−５の配列：５’−ＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧ−３’（配列番号１１４）。プライマー配列はｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）のヌクレオチド２３０〜２４６と同一である。ＧＮＴＯＰＯ３−４の配列：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号１１５）。この配列はｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）のヌクレオチド３３４〜３５４と逆相補性である。
ＰＣＲ生成物を、ｐＭＡＫ７０５から単離された温度感受性複製開始点を含むＳｍａＩフラグメントに連結した。得られた組換えプラスミドｐＣＡＬＧ２８−１は、Ｋａｎｒ、ｇｌｇＸＣＤＡ配列および温度感受性複製開始点を含む。
グリコーゲン合成欠乏性株の生成を、内因性ｇｌｇＢＸＣＡＰ配列を組換えｇｌｇＸＣＡＤ配列で置換することによって行った。ｐＣＡＬＧ２８−１を、Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７−１８中に形質転換し、内因性ｇｌｇＢＸＣＡＰがｐＣＡＬＧ２８−１由来の組換えｇｌｇＸＣＡＤ配列で置換されたクローンを、温度選択手順を使用して生成した。所望のクローンをさらにＰＣＲスクリーニングで同定し、ヨウ素蒸気試験で確認した。ＰＣＲスクリーニングを、オリゴヌクレオチドＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ３−５（配列番号１３６）およびＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ４−３（配列番号１３７）を使用して行った。ＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ３−５の配列は以下の通りである：５’−ＧＧＣＧＧＣＴＴＡＡＡＡＴＧＴＣＣＴＧＡＡＴＧ−３’（配列番号１３６）。プライマーは、オリゴヌクレオチドヌクレオチドＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ１−５（配列番号１１２）およびＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ２−３（配列番号１１３）から生成したｇｌｇＢＸＣＡＰ ＰＣＲフラグメントの５’末端のさらに上流に位置する。ＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ４−３の配列は、５’−ＣＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＴＧＣＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＧ−３’（配列番号１３７）である。このプライマーは、オリゴヌクレオチドＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ１−５（配列番号１１２）およびＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ２−３（配列番号１１３）から生成したｇｌｇＢＸＣＡＰ ＰＣＲフラグメントの３’末端のさらに下流に位置する。
ＰＣＲスクリーニングにおいて、２つの株がｇｌｇＸＣＡＤ配列に対して予想されるサイズ（２２９５ｂｐ）のＰＣＲ生成物を生成した。これらの２つの株を、７１０７−３０８および７１０７−３０９と名付けた。次いで、これらの株をヨウ素蒸気試験に供して、これらの株の何れもグリコーゲンを蓄積しないことを実証した。この試験を実施するために、７１０７−１８細胞、７１０７−３０８細胞および７１０７−３０９細胞を有するプレートをヨウ素結晶からの蒸気に曝した。７１０７−１８株のみが暗褐色に変化し、グリコーゲンの存在を示した。
（グリコーゲン欠乏性株におけるＮＡＧ生成を試験するための振盪フラスコ実験）
振盪フラスコスクリーニングにより、ｇｌｇ欠失によってグリコーゲン合成がブロックされた株を評価した。株を、４０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのリボースおよび５ｇ／ｌの酵母抽出物を補充したＭ９Ｂ培地で増殖させた。ｇｌｇ欠失を有する株間でいくつかの興味を引く差異があるようである。いくつかのｇｌｇ欠失株（例えば、７１０７―６０４）は、コントロールよりも良好に増殖したが、ＮＡＧの生成レベルは低かった。７１０７−６０５−１株はコントロールと同程度の増殖を示したが、ＮＡＧ力価は１２％改善した。
（表３０．振盪フラスコ実験におけるｇｌｇ欠失株の増殖とＮＡＧ生成）
Figure 2013009690
（実施例２８）
以下の実施例は、２つのｌａｃＩ遺伝子のうち１つの欠失と、ｌａｃプロモーターのｌａｃＵＶ５プロモーターによる置換の、グルコース抑制の軽減およびグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生成における効果を実証する。
培地中のグルコースの存在が、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｌａｃプロモーターからの発現を抑制することは公知である。ｌａｃオペロンはｌａｃＺ、ｌａｃＹおよびｌａｃＡの３種のタンパク質をコードする。ｌａｃＺ遺伝子は、ラクトースをグルコースおよびガラクトースに切断し、ラクトースをオペロンの真の誘発因子であるアロラクトースに変換する酵素（β−ガラクトシダーゼ）をコードする。アロラクトースはレプレッサ（ｌａｃＩ遺伝子によりコードされる）と相互作用することによってｌａｃオペロンを誘導し、ｌａｃオペレータでの結合を予防する。ｌａｃＹ遺伝子は、ラクトースの細胞中への流入を制御するラクトース透過酵素をコードする。ｌａｃＡ遺伝子は、非代謝性ピラノシドの細胞解毒を補助する酵素であるチオガラクトシドトランスアセチラーゼ（ガラクトシドアセチルトランスフェラーゼ）をコードする。
ｌａｃオペロンの転写は、ｃＡＭＰとそのレセプタータンパク質（ＣＲＰ）との間で形成される複合体である、複合体ＣＲＰ：ｃＡＭＰによるｌａｃプロモーター配列の結合を要する。グルコースが細胞内のｃＡＭＰレベルを減少させることによって、ｌａｃオペロンを抑制すると考えられている。ｌａｃＵＶ５プロモーターは、特定のヌクレオチドの変化を含むｌａｃプロモーターの変異形である。この様な変化に起因して、ｌａｃプロモーターはもはや、転写を活性化するためにＣＲＰ：ｃＡＭＰによる結合を必要としない。このことは、ｌａｃＵＶ５の制御下にあるｌａｃオペロンがグルコース抑制に対して感受性でなくなることを示唆する。従って、ｌａｃプロモーターは、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンを生成するＥ．ｃｏｌｉ株において、ｌａｃＵＶ５プロモーター（本明細書中で配列番号１３５で表される）で置換されて、グルコース抑制を最小にする。
いくつかのＮ−アセチルグルコサミン生成株および／またはグルコサミン生成株は、ｌａｃＩ抑制遺伝子の２つのコピーを含む。一方は、天然のｌａｃオペロンの成分であり、他方は、ＤＥ３要素中に見出される。細胞性ｌａｃＩレプレッサタンパク質の量は、抑制の強度に影響し得る。従って、一方のｌａｃＩ遺伝子の欠失は、グルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生成のラクトース誘導に影響し得る。
（ｌａｃプロモーターのｌａｃＵＶ５プロモーターによる置換）
いくつかの前駆体プラスミドを、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミン生成株中にｌａｃＵＶ５プロモーターを組み込むために使用されるプラスミドの構築の前に、生成した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株由来のｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺフラグメントのＰＣＲ増幅物に含まれる第一前駆体の生成を、オリゴヌクレオチドプライマーＧＮｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ１−５（配列番号１１６）およびＧＮｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ２−３（配列番号１１７）を使用して実施した。ＧＮｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ１−５の配列は以下の通りである：５’−ＡＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１１６）。そして、ＧＮｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ２−３の配列は以下の通りである：５’−ＣＧＡＴＡＣＴＧＡＣＧＧＧＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１１７）。ｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ配列を含む正確なサイズのＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）中にクローニングして、ｐＣＡＬＧ３−１を生成した。
次の前駆体プラスミドは、オリゴヌクレオチドＧＮｌａｃｄｅｌ２−５（配列番号１１８）およびＧＮｌａｃｄｅｌ３−５（配列番号１１９）を使用して、ｐＣＡＬＧ３−１の部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ部位特異的変異誘発キット、カタログ番号２００５１７）から得た。ＧＮｌａｃｄｅｌ２−５の配列は、５’−（リン酸化）ＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＣＣＣＧ−３’（配列番号１１８）であった。このプライマー配列は、ｌａｃＩ開始コドンのＢｓｔＥＩＩ部位５’を付加させるためになされるＡＴＧＧからＣＡＣＣへの変化（配列番号１１８のヌクレオチド１５〜２１で表される）を除いて、Ｗ３１１０ ｌａｃＩ配列と同一である。ＧＮｌａｃｄｅｌ３−５の配列：５’−（リン酸化）ＣＧＧＧＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＧＣＧＡＡＡ−ＧＧＴＴＴＴＧＣ−３’（配列番号１１９）。このオリゴヌクレオチド配列は、ｌａｃＩ開始コドンのＢｓｔＥＩＩ部位５’を付加させるためになされるＣＣＡＴからＧＧＴＧへの変化（配列番号１１９のヌクレオチド１５〜２１で表される）を除いて、Ｗ３１１０ ｌａｃＩ配列と逆相補的である。
ｐＣＡＬＧ３−１の部位特異的変異誘発を、オリゴヌクレオチドＧＮｌａｃｄｅｌ２−５（配列番号１１８）およびＧＮｌａｃｄｅｌ３−５（配列番号１１９）を使用して、ｌａｃＩ開始コドンのＢｓｔＥＩＩ部位５’に加えて、ｐＣＡＬＧ５−１を生成した。この組換えプラスミドは、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）の骨格中にｌａｃＩ開始コドンのＢｓｔＥＩＩ部位５’を有するｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ配列からなる。
次に、ｐＣＡＬＧ５−１をＢｓｔＥＩＩで消化し、ｌａｃＩの３’配列を含むフラグメント、ｌａｃプロモーターを有するｌａｃＺ遺伝子の一部、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）、およびｍｐｈＲ由来の配列を単離した。ｐＣＡＬＧ５―１由来の単離したフラグメントを、それ自体に連結して、ｐＣＡＬＧ１０−１を生成した。組換えｐＣＡＬＧ１０−１プラスミドは、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）の骨格中に、ｍｐｈＲ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＺ配列を含む。
次に、ｐＣＡＬＧ１０−１をＢｓｔＥＩＩおよびＮｄｅＩで消化し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｍｐｈＲ配列を含むフラグメントを単離した。次いで、単離したｐＣＡＬＧ１０−１フラグメントを、２つのＰＣＲ生成物に連結した。ｐＣＡＬ６１０−１から生成した第一のＰＣＲ生成物は、ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有するｌａｃＺ配列を含んだ。標準条件下のＰＣＲ、およびオリゴヌクレオチドプライマーＧＮＬａｃＺ１−５（配列番号１２０）およびＧＮＬａｃＺ２−３（配列番号１２１）を使用して、ｌａｃＺ配列を含むｐＣＡＬＧ１０−１の一部を増幅した。ＧＮＬａｃＺ１−５の配列は以下の通りである：５’−ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧ−３’（配列番号１２０）。このプライマー配列は、ＮｄｅＩ部位を付加するためのＧ１９３２ＣおよびＣ１９３３Ａのヌクレオチド変化（配列番号１２０のヌクレオチド１２〜１７で表される）を除いて、ｐＣＡＬＧ１０−１（ｌａｃプロモーター／ｌａｃＺ接合部）のヌクレオチド１９２１〜１９５０と同一である。ＧＮＬａｃＺ２−３の配列は：５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１２１）である。この配列は、ｐＣＡＬＧ１０−１のヌクレオチド６５２３〜６５４５に対して逆相補的である。
標準条件下のＰＣＲ、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーＧＮＬａｃｕｖ５３−５（配列番号１２２）およびＧＮＬａｃｕｖ５４−３（配列番号１２３）を使用して、７１０１−１７（ＤＥ３）株由来のｌａｃＵＶ５プロモーターである第二のＰＣＲ生成物を増幅した。ＧＮＬａｃｕｖ５３−５の配列は：５’−ＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡ−３’（配列番号１２２）である。この配列は、ｐＣＡＬＧ１０−１のヌクレオチド１２５３〜１２７３と同一であり、ｌａｃＩ内の内因性ＢｓｔＥＩＩ部位（配列番号１２２のヌクレオチド９〜１５で表される）を含む。ＧＮＬａｃｕｖ５４−３の配列は：５’−ＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１２３）である。この配列は、ＮｄｅＩ部位を付加するためのＣ１９３２ＧおよびＧ１９３３Ｔヌクレオチド変化（配列番号１２３のヌクレオチド１４〜１９で表される）を除いて、ｐＣＡＬＧ１０−１（ｌａｃプロモーター／ｌａｃＺ接合部）のヌクレオチド１９２１〜１９５０と逆相補的である。
ＰＣＲで生成したｌａｃＵＶ５プロモーターフラグメントをＢｓｔＥＩＩおよびＮｄｅＩで消化し、そして精製した。同様に、ｌａｃＺ配列を含むＰＣＲ生成物をＮｄｅＩで消化し、精製した。次の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ１０−１由来のｍｐｈＲフラグメント（ＮｄｅＩ−ＢｓｔＥＩＩ）、ｌａｃＵＶ５プロモーターフラグメント（ＢｓｔＥＩＩ−ＮｄｅＩ）、およびｌａｃＺフラグメント（ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ）を一緒に連結した。得られた組換えプラスミドｐＣＡＬＧ１６−３は、ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）中にｍｐｈＲ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌａｃＺ配列（天然型の配列と逆の順序）を含む。ｐＣＡＬＧ１６−３の正確なｌａｃＵＶ５プロモーター配列を、配列決定によって確認した。
次に、ｐＣＡＬＧ１０−１中のｌａｃＺフラグメントを標準条件、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーＧＮｌａｃＺ１−５（配列番号１２０）およびＧＮｌａｃＺ３−３（配列番号１２４）を使用してＰＣＲ増幅した。
ＧＮｌａｃＺ３−３のヌクレオチド配列は：５’−ＧＡＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＡＡＣＧ―３’（配列番号１２４）である。この配列は、ＮｏｔＩ部位を付加するためのＴ３６２５Ｃ、Ｃ３６２６Ｇ、およびＣ３６３０Ｇヌクレオチドの変化（配列番号１２４のヌクレオチド７〜１４で表される）を除いては、ｐＣＡＬＧ１０−１ヌクレオチド３６１８〜３６３８と逆相補的である。
ｌａｃＺ ＰＣＲフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして単離した。さらに、ｐＣＡＬＧ１６−３を、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）、ｍｐｈＲ由来の配列、ｌａｃＩＤ、およびｌａｃＵＶ５プロモーターを含むフラグメントを単離した。ｌａｃＺ ＰＣＲフラグメントおよびｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）を含むｐＣＡＬＧ１６−３フラグメント、ｍｐｈＲ由来の配列、ｌａｃＩＤ、およびｌａｃＵＶ５プロモーターを一緒に連結して、ｐＣＡＬＧ２０−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ２０−１プラスミドは、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）、ｍｐｈＲ由来の配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、および５’から３’方向のｌａｃＺコード領域を含む。
先に構築したｐＣＡＬＧ３−１を、ｐＣＡＬＧ２０−１と共に使用して、次の前駆体プラスミドを生成した。ｐＣＡＬＧ３−１とｐＣＡＬＧ２０−１との両方を、ＡｐａＩで消化した。ｌａｃＵＶ５プロモーターおよびｌａｃＺ配列を含むｐＣＡＬＧ２０−１フラグメント、ならびにｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）、ｍｐｈＲ配列、および完全長ｌａｃＩを含むｐＣＡＬＧ３−１フラグメントを単離し、そして一緒に連結してｐＣＡＬＧ２２−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ２２−１は、ｍｐｈＲ配列、完全長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接したＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）を含む。
ｐＣＡＬＧ２２−１およびｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２７−４９５８−０１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０６４０４）を使用して、次の前駆体プラスミドを生成した。ｐＣＡＬＧ２２−１およびｐＵＣ４Ｋを、いずれもＢａｍＨＩで消化した。ｍｐｈＲ配列を含むｐＣＡＬＧ２２−１フラグメント、完全長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌａｃＺ配列、ならびにＫａｎｒを含むｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｐＵＣ４Ｋフラグメントを単離し、一緒に連結してｐＣＡＬＧ２５−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ２５−１は、Ｋａｎｒ、ｍｐｈＲ配列、完全長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）からなる。
次の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ２５−１およびＰＫＬＮ０７−２０（他に記載）を、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化した。Ｋａｎｒ、ｍｐｈＲ配列、完全長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ならびにｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性複製開始点を含むｌａｃＺ配列およびｐＫＬＮ０７−２０フラグメント（先に記載）を含むｐＣＡＬＧ２５−１フラグメントを単離し、一緒に連結してｐＣＡＬＧ２９−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ２９−１プラスミドは、Ｋａｎｒ、ｍｐｈＲ配列、完全長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接したＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性領域を含む。
ｐＣＡＬＧ２９−１を構築した後、これが最後の組み込みベクターであると考えられた。しかし、ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位の付加が、ｌａｃＺの適切な発現を阻害することがその後に確認された。従って、ｐＣＡＬＧ２９−１を、部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ部位特異的変異誘発キット、カタログ番号２００５１７）に供して、ＮｄｅＩ部位を破壊し、ＮｄｅＩヌクレオチド変化を内因性ｌａｃＵＶ５ヌクレオチドに置換した。ｐＣＡＬＧ２９−１に必要な変化を行うために、ｐＣＡＬＧ２９−１を、オリゴヌクレオチドＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ１（配列番号１２５）およびＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ２（配列番号１２６）を使用して、部位特異的変異誘発に供して、ｐＣＡＬＧ３１−１を生成した。
ＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ１のヌクレオチド配列は以下の通りである：５’−ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣ−ＡＣＴＧＧ−３’（配列番号１２５）。この配列は、ｐＣＡＬＧ１０−１のヌクレオチド１９１９〜１９５９と同一である。ＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ２のヌクレオチド配列は以下の通りである：５’−ＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ−ＴＧＴＧ−３’（配列番号１２６）。この配列は、ｐＣＡＬＧ１０−１のヌクレオチド１９１９〜１９５９と逆相補的である。
得られた組換えｐＣＡＬＧ３１−１プラスミドは、Ｋａｎｒ、ｍｐｈＲ配列、完全長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接する内因性ヌクレオチドを有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性複製開始点を含む。
組換えｐＣＡＬ３１−１を７１０７−１８に転換し、ｌａｃＵＶ５プロモーターの置換を有するクローンを、温度選択手順を用いて生成した。正確なクローンを同定するため、ゲノムＤＮＡを調製し、ｌａｃＵＶ５プロモーター領域をＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ生成物を配列決定して、ｌａｃＵＶ５プロモーターの存在を確認した。１つの株が、予想されるサイズのＰＣＲ生成物を生成し、正確なＤＮＡ配列を有していた。この株を７１０７−３１０と名付けた。
（ＬａｃＩ欠失およびｌａｃプロモーターのｌａｃＵＶ５プロモーターによる置換）
Ｎ−アセチルグルコサミン生成株および／またはグルコサミン生成株においてｌａｃオペロンからｌａｃＩを除去し、ｌａｃプロモーターをｌａｃＵＶ５プロモーターで置換するのに必要なプラスミドを生成するために、２つの前駆体プラスミドを発生させた。第一の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ２０−１（上記を参照のこと）およびｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２７−４９５８−０１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０６４０４）を、ＢａｍＨＩで消化した。ｍｐｈＲ配列を含むｐＣＡＬＧ２０−１フラグメント、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、ならびにＫａｎｒを含むｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｐＵＣ４Ｋフラグメントを単離し、一緒に連結してｐＣＡＬＧ２６−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ２６−１は、Ｋａｎｒ、ｍｐｈＲ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）からなる。
次の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ２６−１およびｐＫＬＮ０７−２０（他に記載）を、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化した。Ｋａｎｒ、ｍｐｈＲ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩを有する）、ならびにｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性複製開始点を含むｌａｃＺ配列およびｐＫＬＮ０７−２０フラグメントを含むｐＣＡＬＧ２６−１フラグメントを単離し、一緒に連結してｐＣＡＬＧ３０−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ３０−１プラスミドは、Ｋａｎｒ、ｍｐｈＲ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性複製開始点を含む。
ｐＣＡＬＧ３０−１を構築した後、これが最後の組み込みベクターであると考えられた。しかし、ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位の付加がｌａｃＺの適切な発現を阻害することがその後に確認された。従って、ｐＣＡＬＧ３０−１を、部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ部位特異的変異誘発キット、カタログ番号２００５１７）に供して、ＮｄｅＩ部位を破壊して、ＮｄｅＩヌクレオチド変化を内因性ｌａｃＵＶ５ヌクレオチドで置換した。ｐＣＡＬＧ３０−１に必要な変化を行うために、ｐＣＡＬＧ３０−１を、オリゴヌクレオチドＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ１（配列番号１２５）およびＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ２（配列番号１２６）を使用して、部位特異的変異誘発に供して、ｐＣＡＬＧ３２−２を生成した。得られた組換えｐＣＡＬＧ３２−２プラスミドは、Ｋａｎｒ、ｍｐｈ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接した内因性ヌクレオチドを有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性領域を含む。
この組換えｐＣＡＬＧ３２−２を７１０７−１８へ転換し、ｌａｃＵＶ５プロモーター置換を有するクローンを、温度選択手順を使用して生成した。正確なクローンを同定するため、ゲノムＤＮＡを調製し、ｌａｃＵＶ５プロモーター領域をＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ生成物を配列決定して、ｌａｃＵＶ５プロモーターの存在を確認した。３つの株は予想したサイズのＰＣＲ生成物を生成し、正確なＤＮＡ配列を有した。これらの株を、７１０７−３１３、７１０７−３１４、および７１０７−３１５と名付けた。
（ＤＥ３要素からのＬａｃＩ欠失）
生成株のゲノム中のＤＥ３要素からｌａｃＩ遺伝子を欠失させるため、実施例１３に記載の温度感受性選択法を使用した。この戦略には、ｌａｃＩ欠失のためにＤＥ３要素を標的とする組み込みベクターの構築が含まれる。構築の第一の工程として、ＤＥ３要素のｌａｃＩを含む領域を、Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７―７３ゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムのＴ７ＲＮＡＰおよびａｔｔＢ領域の公開された配列に基づいてプライマーを合成した（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）。以下の配列を有する順方向プライマー０７−７４および／または逆方向プライマー０７−４８を増幅のために使用した：０７―７４：５’−ＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＡＣＧＡＴＴＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号１２７）：および０７−４８：５’−ＧＴＣＡＧＡＧＡＡＧＴＣＧＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号１２８）。
順方向プライマー０７−７４は、ＳｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ、配列番号１２７のヌクレオチド４〜９に表される）を付加し、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムのａｔｔＢ部位の１１９４塩基対上流から増幅する。逆方向プライマー０７−４８は、Ｔ７遺伝子１ＡＴＧ開始コドンの３６塩基対上流から増幅する。得られた約３．２ｋｂのＰＣＲフラグメントを、ベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に連結して、プラスミドｐＳＷ０７−５３＃７および＃１７を生成した。ＤＮＡ配列決定から、このＰＣＲ生成物がＤＥ３要素由来のａｔｔＢ部位およびｌａｃＩ ｌａｃＺ’フラグメントの上流のゲノム領域を含んでいたことが明らかになった。
ｌａｃＩ欠失を生成するために、プラスミドｐＳＷ０７−５３＃１７を、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩおよびＳｆｏＩで消化して、ｌａｃＩコード配列の６４０塩基対フラグメントを除去した。ｐＳＷ０７−５３プラスミドの残りを、Ｔ４ＤＮＡＰで処理して平滑末端を生成し、次いで、それ自体に連結してプラスミドｐＳＷ０７−５５＃１３を生成した。
ｌａｃＩ欠失を有するＤＥ３配列を含むフラグメントを、プラスミドｐＳＷ０７−５５＃１３から制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。このフラグメントを、ｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．１７１（９）：４６１７−４６２２）、およびｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むｐＫＬＮ０７−２１由来の４．２ｋｂのＳａｌＩおよびＮｏｔＩフラグメントと連結した。得られたプラスミドｐＫＬＮ０７−５６＃１３を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体上にＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失を生成した。
ＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失を有する株を生成するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ７１０７−１８をプラスミドｐＳＷ０７−５６＃１３で形質転換した。温度感受性選択および継代培養プロトコールに従って、欠失の存在について標準ＰＣＲプロトコールを使用して株をスクリーニングした。ＰＣＲによって同定されたいくつかの株を、プローブとしてＤＥ３要素のｌａｃＩおよびｌａｃＺフラグメントの部分を含むフラグメントを使用して、高ストリンジェントなサザンハイブリダイゼーションによって確認した。これらの株を、７１０７−８４（１）から７１０７−８４（４）と名付けた。
（振盪フラスコにおけるｌａｃＩＤおよび／またはｌａｃＵＶ５プロモーター置換を有する株におけるグルコサミン生成）
２つの機能性ｌａｃＩ遺伝子を有する７１０７−１８株と対照的に、７１０７−８４（１）株はただ１つの機能性ｌａｃＩ遺伝子を含む。振盪フラスコスクリーニング４２を行って、ラクトース誘導における７１０７−８４（１）株のｌａｃＩ欠失の効果を測定した。過剰のグルコースおよびラクトースの存在下では、ｌａｃオペレーターに結合するＬａｃＩレプレッサタンパク質に起因して、ラクトースによる誘導は７１０７−１８株中では阻害され、転写が阻止されるはずである。ｌａｃオペレーターに結合するために存在すべきＬａｃＩレプレッサタンパク質はより少ないので、グルコースによるこの阻害は７１０７−８４（１）株中で減少されるべきであり、このことが、ｌａｃプロモーターからの増加した転写を可能にする。このことは、細胞中のＴ７ＲＮＡＰのプールを増加させ、その結果、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４カセットからの増加した転写を生じる。最終的に、より高いレベルのグルコサミンが７１０７−８４（１）株中で生じる。同様に、ｌａｃＩ欠失がｌａｃオペロンである株（例えば、７１０７−３１３、７１０７−３１４および７１０７−３１５）は、ラクトース誘導の際により高いレベルのＧｌｃＮ生成を有するべきである。
ｌａｃオペロンからｌａｃＩ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株（７１０７−３１０）、ＤＥ３要素からｌａｃＩ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株（７１０７−８４＃１）、およびｌａｃオペロンからのｌａｃＩ欠失を有しｌａｃプロモーターがｌａｃＵＶ５プロモーターで置換されたＥ．ｃｏｌｉ株（７１０７−３１３、７１０７−３１４および７１０７−３１５）を、振盪フラスコ実験で７１０７−１８株と比較した。すべての株は、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ／ｌおよびＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ／ｌを補充したＭ９Ｂ培地（ＫＨ２ＰＯ４ ６ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ２４ｇ／ｌ、クエン酸Ｎａ３−２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／ｌ（ｐＨをリン酸塩で７．４に調整した）、および微量金属（ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ
０．０１５ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４−Ｈ２Ｏ ０．０１５ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ ０．００１ｍｇ／ｌ、ＮａＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ ０．００１ｍｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ０．００１ｍｇ／ｌ、およびＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ ０．００１ｍｇ／ｌ））を含むフラスコ中で増殖させた。グルコース抑制を試験するために、フラスコに様々な量のグルコースおよびラクトースを加えた。このフラスコに使用したグルコースとラクトースの量を、表４および表５に示す。培養物を、２２５ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で２４時間増殖させ、次いで、２２５ｒｐｍで振盪しながら残りの実験の間、２５℃で静置した。２４時間および４８時間で、各々の培養物のｐＨを７．０に調整し、グルコースをフラスコに約３０ｇ／ｌ加え、そしてアンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下した培地に５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えた。サンプルを２４時間および４８時間で収集した。米国特許第６、３７２、４５７号Ｂ１に記載の改変したＥｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎアッセイを使用して、各時点での培養上澄中のグルコサミン濃度を測定した。グルコサミンレベルを表３１に示す。
予想した通り、７１０７−１８株、７１０７−８４（１）株、７１０７−３１０株および７１０７−３１３株は、グルコース単独またはラクトース単独の存在下で、同様に機能を果たした。誘発因子が存在しないため、グルコース中で増殖させた場合、何れの株でもＧｌｃＮの生成はほとんど見られなかった。ラクトースを誘発因子として用いて株を増殖させた場合、両方の株でグルコサミンの有意な蓄積を生じた。しかし、株をグルコースおよびラクトース両方の存在下で増殖させた場合、染色体からｌａｃＩ遺伝子の１つのコピーを除去すると、ラクトース誘導、すなわちグルコサミン力価が顕著に影響を受けた。４８時間の時点で、７１０７−３１３株および７１０７−８４（１）株は、７１０７−１８株で見られたグルコサミンレベルの約６〜８倍を達成した。このことは、減少したＬａｃＩレプレッサタンパク質がｌａｃプロモーターからの増加した転写を可能にし、グルコサミン生成の増加したレベルが生じるという考えが確認する。
（表３１．振盪フラスコスクリーニング４２による様々なサンプル中のグルコサミン濃度）
Figure 2013009690
（ｌａｃＩＤおよび／またはｌａｃＵＶ５プロモーターの置換を有する株におけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込み）
ＮＡＧ生成株におけるグルコース脱抑制に対するｌａｃＩ欠失の効果を評価するために、７１０７−８４（１）株および７１０７−８４（２）株の染色体にＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットを加えることが必要であった。プラスミドｐＳＷ０７−６８＃５による温度感受性選択によるＧＮＡ１クローニングおよび組み込みについて記載された方法およびプロトコールを、他に詳述されるように使用した。得られた７１０７−９７株および７１０７−９８株は、プローブとしてＳｃＧＮＡ１コード配列を使用して標準的な高ストリンジェントなサザンハイブリダイゼーションによって、染色体のｍａｎＸＹＺ欠失部位に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を有すると確認された。
同様に、潜在的にグルコース脱抑制性の株について他のバージョンを構築した。３１０７−３１０株を、ｌａｃオペロンのプロモーターをプロモーターのｌａｃＵＶ５バージョンに変えることによって構築した。７１０７−３１３株、７１０７−３１４株および７１０７−３１５株は、ｌａｃオペロンのプロモーターをプロモーターのｌａｃＵＶ５バージョンに変えるのに加えて、ｌａｃＩ遺伝子の染色体コピーを欠失することによって構築した。ＮＡＧ生成の背景におけるグルコース脱抑制に対するこれらの変異の効果を評価するために、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットを株の染色体に加えた。プラスミドｐＳＷ０７−６８＃２５を用いる温度感受性選択によるＧＮＡ１のクローニングおよび組み込みついて記載される方法およびプロトコールを、７１０７−３１０株および７１０７−３１３株について使用した。得られた７１０７−１２９株および７１０７−１３０株（７１０７−３１０株由来）、ならびに７１０７−１３１株（７１０７−３１３株由来）は、プローブとしてＳｃＧＮＡ１コード配列を用いる高ストリンジェントなサザンハイブリダイゼーションを使用して、染色体のｍａｎＸＹＺ欠失部位によって組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を有すると確認された。
（振盪フラスコにおけるｌａｃＩＤおよび／またはｌａｃＵＶ５プロモーターの置換を有する株におけるＮ−アセチルグルコサミン生成）
ＮＡＧ生成株におけるグルコース脱抑制に対するＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失の効果を評価するために、スクリーニングを行った。グルコースおよびラクトースのレベルを変化させながら、リボースを添加してかまたは添加せずに７１０７−９７株および７１０７−９８（２）株を試験した。ｌａｃＩの２つのコピーを有するＮＡＧ生成７１０７−９２（１）株をコントロールとして含めた。培養物を、０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、様々な濃度のグルコースおよびラクトース、および５ｇ／ｌの酵母抽出物を補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で増殖させた。株を最初に１０ｇ／ｌのグルコースで増殖させ、一旦グルコースが欠乏するとラクトースの利用に切り替えた。グルコース抑制に対する感度を測定するために、過剰グルコース条件（ラクトースの存在下で）もまた使用した。各々の可変をリボース添加とともにかリボース添加をせずに実施した。培養物を３０℃で２４時間増殖させ、次いで、残りの実験の間は２５℃に切り替えた。２４時間および４８時間の時点で、ｐＨを７．２に調整し、グルコースを合計で３０ｇ／ｌまで加えた。レベルが１ｇ／ｌ以下に低下したフラスコ中には、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を２４時間および４８時間で加えた。サンプルを、２４時間、４８時間および７２時間で、ＮＡＧ生成について分析した。
コントロール株は、非抑制条件下で良好に機能を果たし、２０ｇ／ｌより多くのＮＡＧを生じたが、グルコース過剰ではわずか約５ｇ／ｌであった（表３２）。一方の変異株（７１０７−９８）は、コントロールに対して同様に機能を果たしたが、他方（７１０７−９７）は、過剰のグルコースが存在する場合でさえ、２０ｇ／ｌより多くのＮＡＧを生成し、グルコース耐性を示した。実際に、この株はまた、ＮＡＧ生成と酢酸塩蓄積の観点から、非抑制条件下でコントロールより優れているように思われた。培養物へのリボースの添加は、この実験における増殖またはＮＡＧ力価を有意に増加させなかった。全体的な結果は、ＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失が、少なくとも部分的にグルコース抑制を軽減し、生成株におけるＮＡＧ力価を改善することを示す。
（表３２．様々な量のグルコースおよびラクトースの存在下でのグルコース脱抑制に対するＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失の効果）
Figure 2013009690
１）株：コントロール７１０７−９２（１）：２つのｌａｃｌ遺伝子
７１０７−９７および７１０７−９８（２）：１つのｌａｃｌ遺伝子 のみ（ＤＥ３中の１つは欠失）
２）ＯＤ６００、酢酸塩レベル、およびＮＡＧレベルは７２時間の時点より。
グルコース脱抑制について７１０７−１２９株、７１０７−１３０株および７１０７−１３１株を評価するために、別のスクリーニングを行った。２つのｌａｃＩコピーを有するＮＡＧ生成株７１０７−９２（１）をコントロールとして含めた。培養物を、０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、および０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、様々な濃度のグルコースおよびラクトース、５ｇ／ｌのリボースおよび５ｇ／ｌの酵母抽出物を補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で増殖させた。株を、最初に１０ｇ／ｌのグルコースで増殖し、ラクトースによる誘導を確認するため、一旦グルコースが欠乏するとラクトースの利用に切り替えた。グルコースが常に存在する過剰グルコース条件（ラクトースの存在下で）もまた使用して、７１０７−１３１株を試験し、誘導に関連するグルコースに対する感度を測定した。培養物を、３０℃で２４時間増殖させ、残りの実験の間は２５℃に切り替えた。ｐＨを７．２に調整し、２４時間および４８時間の時点でグルコースを１日あたり合計３０ｇ／ｌまで加えた。レベルが１ｇ／ｌ以下に低下したフラスコに、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を２４時間および４８時間で加えた。２４時間、４８時間、および７２時間でサンプルのＮＡＧ生成を分析した。
表３３に見られるように、ｌａｃＵＶ５変異株（７１０７−１３０）の１つおよびｌａｃＩ欠失を有するｌａｃＵＶ５変異株（７１０７−１３１）の１つは、最初にグルコースで増殖させ、グルコース欠乏後にラクトースに切り替えた場合に、コントロール株より良好に機能した。グルコース過剰の条件では、７１０７−１３１株は、コントロール株７１０７−９２（１）より優れ、約３０％より多いＮＡＧを生成した。このことは、ｌａｃＩの何れかのコピーの欠失が、グルコース抑制軽減を補助し、過剰のグルコースの存在下で誘導が生じることを可能にし、ＮＡＧ力価を改善することを確認する。
（表３３．グルコース制限または過剰条件下におけるｌａｃＩ欠失および／またはｌａｃＵＶ５プロモーターのＮＡＧ生成に対する影響）
Figure 2013009690
１）株：コントロール株７１０７−９２（１）：ｌａｃＩ（ｌａｃ）、ｌａｃ（ＤＥ３）、７１０７−１２９、７１０７−１３０：ｌａｃＵＶ５、ｌａｃＩ（ｌａｃ）、ｌａｃＩ（ＤＥ３）、７１０７−１３１：ｌａｃＵＶ５、ｌａｃＩΔ（ｌａｃ）、ｌａｃＩ（ＤＥ３）
２）ＯＤ６００、酢酸塩レベル、およびＮＡＧレベルは７２時間の時点より。
（実施例２９）
以下の実施例は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミン蓄積におけるガラクトース利用の回復の効果を実証する。
ｇａｌＫΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４コンストラクトを含むラクトース誘導性Ｎ−アセチルグルコサミン生成株および／またはグルコサミン生成株は、ｇａｌＫΔに起因して炭素源としてガラクトースを使用することはできない。これらの株は、β−ガラクトシダーゼによってラクトースをグルコースとガラクトースとに切断することに起因して、ガラクトースを蓄積する。これらの株でガラクトース蓄積を減少させる努力において、Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４発現カセットを異なる染色体位置中に組み込む必要がある。先に構築されたＮ−アセチルグルコサミン生成株および／またはグルコサミン生成株は、ｎａｇΔ：：Ｔｅｔｒを含む。ゲノムのｎａｇΔ：：Ｔｅｔｒ部分を、米国特許第６、３７２、４５７Ｂ１号に記載される様に、親株ＩＢＰＣ５９０（Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５，２０５３−２０６２））からＰ１ファージ感染によって移した。生成株においてＴｅｔｒの存在は望ましくない。従って、Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４でのＴｅｔｒの置換は、単にＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４のための組み込み部位を提供するだけでなく、同じプロセスでＴｅｔｒを除去する。
７１０７−１８株（先に実施例７に記載した）を生成するためのΔｇａｌｋＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４コンストラクトの７１０７−１７（ＤＥ３）への組み込みは、グルコサミン生成における有意な増加をもたらしている。さらに、ｍａｎＸＹＺΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１コンストラクトの７１０７―１８への組み込みは、実施例１６に記載したＮ−アセチルグルコサミンの生成をもたらす。ガラクトースを代謝し得るＮ−アセチルグルコサミン生成株を発生させるために、Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４発現カセットをｎａｇＤ：：Ｔｅｔｒ部位に組み込み、次いで、Ｔ７−ｌａｃ−Ｓｃ ＧＮＡ１発現カセットをｍａｎＸＹＺ部位に挿入した。
ｎａｇΔ：：Ｔ７―ｌａｃ―ｇｌｍＳ＊５４およびｍａｎＸＹＺΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−Ｓｃ ＧＮＡ１を含む株の構築に関する工程は、３つの前駆体プラスミドの生成を含む。第一の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＫＬＮ２３−５４由来のＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４フラグメント（米国特許第６、３７２、４５７Ｂ１号に記載される）を、標準条件を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーＧＮｇｌｍＳｎａｇＥ３−５（配列番号１２９）およびＧＮｇｌｍＳｎａｇＥ４−３（配列番号１３０）を用いてＰＣＲ増幅した。
ＧＮｇｌｍＳｎａｇＥ３−５：５’−ＧＧＡＴＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＧＡＣＣＧＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡ−ＧＴＧ−３’（配列番号１２９）。このプライマーは、以下を除いてｐＫＬＮ２３−５４のヌクレオチド１１０９〜１１４６と同一である：Ｃ１１１５Ａ、Ｃ１１１６Ａ、Ｇ１１２０Ｔ、Ｇ１１２２Ａ、Ｇ１１２５Ａ、Ｇ１１２９ＡおよびＣ１１３３Ｇ。ｐＫＬＮ２３−５４のヌクレオチド１１１５〜１１２５（配列番号１２９のヌクレオチド８、１２、１４、１７、２１および２５に対応する）での変化は、ＰＣＲにおけるプライマーの安定性を増加させるために行い、そしてｐＫＬＮ２３−５４の１１２９および１１３３での変化は、ＡｇｅＩ部位を配列番号１２９（配列番号１２９の位置２１〜２６で表される）に加えるために行った。
ＧＮｇｌｍＳｎａｇＥ４−３：５’−ＣＣＣＴＣＧＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡＧＴＣＡＡＴＴ−ＡＣ−３’（配列番号１３０）。このプライマーは、以下を除いてｐＫＬＮ２３−５４のヌクレオチド３２３７〜３２７４と逆相補的である：Ｔ３２５１Ａ、Ｇ３２５３Ｔ、Ｇ３２５６Ａ、Ａ３２７０Ｃ、およびＴ３２７３Ｃ（配列番号１３０の位置２４、２２、１９、５および２で表される）。３２５１から３２５６での変化は、ＳｗａＩ部位（配列番号１３０の位置１９〜２６で表される）を加えるために行い、３２７０および３２７３での変化はＰＣＲにおけるプライマーの安定性を増加させるために行った。
得られたＰＣＲ生成物をｐＣＲ（登録商標）−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット、カタログ番号Ｋ２８００−２０）に連結した。組換えプラスミドｐＣＡＬＧ３８−２は、５’がＡｇｅＩ部位によって隣接されかつ３’がＳｗａＩ部位によって隣接されるＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４発現カセットを含む。
第二の前駆体カセットを生成するために、ｎａｇΔ：：Ｔｅｔｒ：：ａｓｎフラグメントを、ＧＮｎａｇＥｔｅｔＲ１−５（配列番号１３１）およびＧＮｎａｇＥｔｅｔＲ２−３（配列番号１３２）を使用して、ＰＣＲによってＥ．ｃｏｌｉ ７１０７−１８株から増幅した。ＧＮｎａｇＥｔｅｔＲ１−５のヌクレオチド配列は以下の通りである：５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１３１）。ＧＮｎａｇＥｔｅｔＲ２−３のヌクレオチド配列は以下の通りである：５’−ＣＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号１３２）。
ＰＣＲ生成物をｐＣＲ（登録商標）−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）に連結して、組換えプラスミドｐＣＡＬＧ３５−１を生成した。
第三の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ３８−２を、ＡｇｅＩおよびＳｗａＩで消化し、Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４フラグメントを精製した。さらに、ｐＣＡＬＧ３５−１をＡｇｅＩおよびＮｒｕＩで消化し、ＮｒｕＩおよびａｓｎ−ｐＣＲ（登録商標）−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）−ｎａｇＤフラグメントを精製した。ｐＣＡＬＧ３８−２およびｐＣＡＬＧ３５−１由来の精製したフラグメントを連結して、ｐＣＡＬＧ４０を生成した。組換えｐＣＡＬＧ４０プラスミドは、ｐＣＲ（登録商標）−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）中にｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４：：ａｓｎフラグメントを含む。
組み換えｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４：：ａｓｎフラグメントをゲノムに組み込むために必要な最後のプラスミドを作成するため、以下の作業を行った。ｐＣＡＬＧ４０をＫｐｎＩおよびＮｏＩで消化し、ｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４：：ａｓｎを含むフラグメントを単離した。さらに、ｐＫＬＮ０７−２１（上記）をＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ｋａｎｒ（ｐＵＣ４Ｋ由来、上記）および温度感受性複製開始端（ｐＭＡＫ７０５由来）を含むフラグメントを単離した。ＣＡＬＧ４０由来の、ｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４：：ａｓｎフラグメント、Ｋａｎｒフラグメントおよび温度感受性複製開始点ｐＫＬＮ０７−２１をライゲートしｐＣＡＬＧ４３−２を作成した。
プラスミドｐＣＡＬＧ４３−２を７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換し、ｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４：：ａｓｎをゲノム中に有するクローンを作成した。正しいクローンをＰＣＲで同定し、サザンブロット分析で確認した。クローンをテトラサイクリン耐性の喪失でも確認した。
ｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４：：ａｓｎを含む株をＰＣＲでスクリーニングするため、１対のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。前方プラーマーＧＮｎａｇＥＴ７ｇｌｍＳ１−５は配列５’−ＣＡＣＧＡＣＡＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＴＣＧ−３’（配列番号１３３）を有する。逆方向プライマーＧＮｎａｇＥＴ７ｇｌｍＳ２−２は配列５’−ＣＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣ−３’（配列番号１３４）を有する。前方プライマーおよび逆方向プライマーは、オリゴヌクレオチドＣＮｎａｇＥｔｅＲ１−５（配列番号１３３）およびＧＮｎａｇＥｔｅＲ２−３（配列番号１３４）から精製したｎａｇＤ：：Ｔｅｆ：：ａｓｎＰＣＲフラグメントの５’および３’にそれぞれ位置する。ＰＣＲで４種の株が同定され、７１０７―３２１＃１、＃２、＃３および＃４と名付けられた。
７１０７−３２１株中へのｎａｇΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４の７１０７−３２１株中への組み込みを確認するため、ゲノムＤＮＡを単離し、標準条件下でｎａｇＥ特異性プローブを用いてサザンブロットで分析した。７１０７−３２１株はサザン分析で正しいことが見出された。さらに、７１０７−３２１株がテトラサイクリンを含む培地上で生育できないので、ｎａｇΔ：：Ｔｅｆ：：ａｓｎが存在しないことも確認された。
ｍａｎＸＹＺΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１コンストラクトを加えるため、組み換えｐＳＷ０７−６８プラスミド（上記）を各７１０７−３２１株中に形質転換した。ゲノム中に組み込まれたｍａｎＸＹＺΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を有するクローンを温度選択法を用いて作成した。クローンをＰＣＲで同定し、サザンブロット分析で確認した。１２種の株が予期したサイズのＰＣＲ生成物を生成した。これらの株を７１０７−３２５＃１、＃２および＃３（７１０７−３２１＃１由来）;７１０７３２６＃１、＃２および＃３（７１０７−３２１３＃２由来）;７１０７−３２７＃１、＃２および＃３（７１０７−３２１＃３由来）;および７１０７−３２８＃１、＃２および＃３（７１０７−３２１＃４由来）と名付けた。これらの株はすべて、ＧＮＡ１特異性プローブを用いるサザンブロット分析で正しいことが確認された。
（振盪フラスコ実験におけるガラクトースを代謝し得るＮ−アセチルグルコサミン生産株の評価）
ガラクトースを代謝し得るＮ−アセチルグルコサミン生産株（７１０７−３２５＃１、７１０７−３２６＃１、７１０７−３２７＃１および７１０７−３２８＃１）を振盪フラスコ実験で試験した（表３４）。０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを補充したＭ９Ｂ培地を含むフラスコ中で株を試験した。スクリーニング５４および５５には０．２ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｍｇ／ｌのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌのＨ３ＢＯ３および０．００１ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏの微量金属を補給し、スクリーニング５９および６６には０．５ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３８ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３３ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏおよび０．０１ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏの微量金属を補給した。表３４に示す様に、様々な量のグルコース（Ｇｌｕ）、ラクトース（Ｌａｃ）、酵母抽出物（ＹＥ）およびホエーパーミエート（ＦｏｒｍｏｓｔＷｈｅｙ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）をフラスコ中に使用した。スクリーニング５４および５５では、培養細胞を２２５ｒｐｍで浸透して３０℃で２４時間生育させ、次いで実験の残りの期間、２２５ｒｐｍで浸透して２５℃に置いた。スクリーニング５９および６６では、培養細胞を２２５ｒｐｍで浸透して３０℃で８〜１０時間生育させ、次いで実験の残りの期間、２２５ｒｐｍで浸透して２５℃に置いた。スクリーニング５９および６６では、１０時間でｐＨを７．２に調節し、培養液がグルコース欠乏である場合は２０〜２５ｇ／ｌのグルコースを加えた。四つのスクリーニングの全てで、２４および４８時間に各培養液のｐＨを７．２に調節し、グルコースを約３０ｇ／ｌで加え、アンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下した培養液では５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えた。スクリーニング６６および３０では、必要あれば３０および５４時間でグルコースを加え、ｐＨを７．２に調節し、アンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下した培養液では５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えた。四つのスクリーニングの全てで、試料を２４および／または４８時間で採取し、培養上澄中のＮ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミン濃度をＨＰＬＣ炭水化物カラムを用いて測定した。
異なった試料中のＮ−アセチルグルコサミン濃度が表３４に示される。実験から、ある条件かでは、ｇａｌＫ部位の変わりにｎａｇΔ部位にＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４を組み込むことで、Ｎ−アセチルグルコサミンの生産を改善されることが結論できる。予想通り、ｇａｌＫ部位の変わりにｎａｇΔ部位にＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４を組み込むことでガラクトースの蓄積がなくなった。
（表３４．異なった生育条件下でのＮ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンレベル）
Figure 2013009690
＊対照:非グルコースユーザー株７１０７−９２
他の全ての株はグルコースユーザー同胞株
Ｇｌｕ＝グルコース、Ｌａｃ＝ラクトース、ＹＥ＝酵母抽出物、ＷＰ＝ホエーパーミエート
（１リッター醗酵槽におけるガラクトース代謝可能なＮ−アセチルグルコサミン生産株の評価）
ガラクトースを使用可能な株（７１０７―３２５＃１および７１０７−３２８＃１）をガラクトース非ユーザー株（７１０７−９２＃１）と１リッター醗酵槽中で比較した。醗酵槽を以下の培地を含む初期容積４７５ｍｌに設定した：Ｈ３ＰＯ４４．７９ｇ／ｌ、ＫＯＨ３．１５ｇ／ｌ、クエン酸・Ｈ２Ｏ ３．６５ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２．５ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ０．０５ｇ／ｌ、微量金属（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ５ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ３．７５ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ０．６ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．１００２ｍｇ／ｍＬ、およびＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．１００２ｍｇ／ｌ）、およびＭａｚｕ２０４消泡剤。４５％ＫＯＨを使用してｐＨを７．０に調節した。７５％ＮＨ４ＯＨを使用したｐＨ（６．９）を保ち、温度を３７℃に保ち、曝気と攪拌速度を利用して溶存酸素濃度を飽和濃度の２０％に保った。コンピュータープログラムで制御して６５％グルコースを培養液に供給し、接種時の生育速度を０．４／時間、６時間で最高速度５ｍｌ／時間を達成した。グルコースを連続的に供給し、食品グレードラクトースを加えて培養を誘導した。
醗酵実験中の約１０、２１、２８、３５、４５、５２および６０時間で７種の試料を採取した。各試料につき、培養の健全性をモニターするためのいくつかの他の成分の濃度に加えて、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびガラクトース濃度をＨＰＬＣ炭化水素カラムを用いて測定した。予想通り、対照株７１０７−９２＃１からの培地にはガラクトースが検出されたが（試料７で０．６ｇ／ｌ）、７１０７−３２５＃１および７１０７−３２８＃１株が存在する培地ではガラクトースが蓄積しなかった。ガラクトースを消費し得る株では、この様な条件下でＧｌｍＳ＊５４を発現することがＮ−アセチルグルコサミンの生産を改善しなかった。しかしながら、この醗酵に用いた培地は７１０７−９２＃１株に対して最適化されている。最適性能のためにはグルコースユーザー株は若干異なった醗酵条件を要求すると考えられる。７１０７−３２５＃１および７１０７−３２８＃１株が、７１０７−９２＃１株より多い量のＮ−アセチルグルコサミンを生産し得る培地を作成可能であると考えられる。従って、ｇａｌＫ部位の代わりにｎａｇＤ部位へＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４発現カセットを組み込むことで、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミン生産が有利になることが予想される。
Ｎ−アセチルグルコサミン生産用醗酵プロセス開発
（実施例３０）
本実施例はＳｃＧＮＡ１プラスミドを含む株によるＮＧＡ凄惨の最適化のための振盪フラスコ実験を説明する。
ＳｃＧＮＡ１の過剰発現によりＥ．ｃｏｌｉグルコサミン生産株中で高レベルのＮＡＧが得られることが確定したので、次に工程はＨＡＧ生産条件を最適化することである。用いられたアプローチは振盪フラスコ中で過剰発現の酢酸を製造せず、細胞密度、従ってＮＧＡ力価を増すことである。プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７プロモーター由来のＳｃＧＮＡ１の発現を、最初の最適化実験で用いた。
（酵母抽出物の添加と遅延誘導）
７１０７−８７＃２５中における酵母抽出物添加の生育に対する効果、酢酸の蓄積およびＮＡＧ生産を振盪フラスコで試験した。０．２ｍＭＩＰＴＧによる早期および遅延誘導の効果も試験した。株をＭ９Ｂ培地（上記）中で生育させたが、（ＮＨ４）２ＳＯ４を７．５ｇ／ｌに減少させた。Ｍ９Ｂ培地に３０ｇ／ｌのグルコース、０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した。遅延誘導の場合を除いて０．２ｍＭのＩＰＴＧをフラスコに添加したが、遅延誘導では接種の２４時間後に加えた。対照フラスコには酵母抽出物を添加しなかった。試験フラスコでは、酵母抽出物（０．５〜４．０ｇ／ｌの範囲）を実験開始時、または接種後２４時間で添加した。培養細胞を２４時間まで３０℃で生育し、その後２５℃に置いた。２４および４８時間で、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４および２０ｇ／ｌのグルコースを各フラスコに添加し、ｐＨを７．２に調製した。
表３５に見られる様に、酵母抽出物の添加により生育とＮＡＧ生産が増加した。事実、実験開始時に４ｇ／ｌの酵母抽出物得を添加したフラスコで成績が最も良く、対照フラスコ中で２．９ｇ／ｌのＮＡＧを生産したのに比較して８．９ｇ／ｌのＮＡＧを達成した。しかしながら、フラスコ中に３．０ｇ／ｌの酢酸も蓄積した。酵母抽出物を２４時間の生育後に添加したフラスコでは、実験開始時に酵母抽出物を添加したフラスコと同程度の生育を示したが、酢酸の蓄積は少なかった。しかしながら、これらの条件下で４ｇ／ｌの酵母抽出物を含むフラスコ中ではＮＡＧ生産は４８時間で４．９ｇ／ｌに過ぎなかった。さらに、遅延誘導のフラスコでは、ＮＡＧ生産が遅れたが、０．２ｍＭのＩＰＴＧで初期に誘導したフラスコより生育は良かった。このことは、Ｎ−アセチルグルコサミン合成の誘導が細胞生育に何らかの負の効果を有することを示唆している。
（表３５．７１０７−８７＃２５株における酵母抽出物添加および遅延誘導の生育、酢酸蓄積およびＮＡＧ生産に対する効果）
Figure 2013009690
１）結果は４８時間の時点
（様々な糖と酵母抽出物の添加）
７１０７−８７＃２５株における生育、酢酸蓄積およびＮＡＧ生産に対する酵母抽出物を含む様々な糖の効果を評価するため、振盪フラスコ実験を行った。株をＭ９Ｂ培地（上記）で生育させたが、（ＮＨ４）２ＳＯ４を７．５ｇ／ｌに減少させた。Ｍ９Ｂ培地に０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した。以前の実験で酵母抽出物の正の効果が見られたので、フラスコ中に５ｇ／ｌの酵母抽出物を加えた。０．２ｍＭのＩＰＴＧ、および様々な濃度の糖、すなわちラクトース、グルコース、フラクトースおよびリボースを表３６に示す様に加えた。注意すべき重要なことは、ラクトースの存在で生育させた７１０７−８７＃２５株はラクトース誘導性であり、ＩＰＴＧを要求しないことである。培養細胞を３０℃で２４時間生育させ、２５℃に変えた。
約２４時間で、各培養液のｐＨを７．２に調節し、各フラスコに２．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を加え、ＨＰＬＣの結果に基づいてグルコースを１日当たり３０ｇ／ｌで加えた。３２．５時間で１５ｇ／ｌのグルコース、２．５ｇ／ｌのリボース、および２．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコ７に加えた。４８時間で１０ｇ／ｌのグルコースを各フラスコに加えた。さらに２．５ｇ／ｌのリボースと５．０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を４９．５時間で各フラスコに加えた。２４、４８および７２時間に試料をフラスコから取り出し、ＯＤ６００、Ｎ−アセチルグルコサミンレベルおよびグルコサミンレベルをモニターした。
（表３６．７１０７−８７＃２５株における様々な糖混合物の生育、酢酸蓄積およびＮＡＧ生産に対する効果）
Figure 2013009690
１）７２時間の時点の結果
２）全てのフラスコは酵母抽出物を含む
表３６に示す結果は、３種の糖（ラクトース、グルコースおよびリボース）は生育を良く幇助し、ＮＡＧがかなり蓄積する結果となった。フラクトースを含むフラスコではＮＡＧの力価が９．１ｇ／ｌに達したが、ＯＤ６００は高くならなかった。フラクトースまたはラクトースを含むフラスコ中にグルコースを初期に加えると、生育とＮＡＧ力価が共に改善した。しかしながら、初期にグルコースとフラクトースの両方を含むフラスコで最良の結果が得られた。
ＮＡＧまたはＧｌｃＮで生育できないＥ．ｃｏｌｉ単離体が文献に報告されている（Ｊ．Ｂａｃ．、１９７０、１０１:３８４−３９１）。著者は、アミノ糖燐酸の蓄積がホスフォヘキソースイソメラーゼとグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼで触媒される反応を阻害し、ペントース欠乏になると推論した。ペントースまたはグルコースの添加が突然変異株の生育阻害を反転した。ＮＡＧ生産株７１０７−８７＃２５もアミノ糖燐酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐおよび／またはＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）を蓄積し、ペントース欠乏になる。この場合、リボースまたはグルコースの添加により生育とＮＡＧ生産が改善されると考えられる。事実、リボースの添加で生育とＮ−アセチルグルコサミン生産が改善された。この実験で、２０ｇ／ｌのグルコース＋１０ｇ／ｌのリボースを含むフラスコは最高レベルのＮＡＧを生産し、２７ｇ／ｌに達した。これは３０ｇ／ｌのグルコースを含むフラスコ中で生産された量の２倍である。リボースとグルコースの両方を含むフラスコでも生育は改善された。
（グルコースおよびリボースレベル）
以前の実験は、グルコースを含むフラスコにリボースを添加することは、７１０７−８７＃２５株のＮＡＧ生産に相当な正の効果を有する。異なったグルコース／リボース混合物の生育およびＮＡＧ生産に対する効果を試験するため、振盪フラスコスクリーニング＃３５が行われた。０．６ｇ／ｌもＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２５ｍｌ／ｍｌのカナマイシン、０．２ｍＭのＩＰＴＧ、および５．０ｇ／ｌの酵母抽出物を補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で７１０７−８７＃２５株を生育させた。様々なグルコースとリボースの混合物を、表３７に列記する様に各フラスコに添加した。培養細胞を３０℃で２４時間生育させ、次いで２５℃に移した。約２４および４８時間で、フラスコのｐＨを７．２に調節した。２４時間で５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を全てにフラスコに添加した。さらに２．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコ４〜９に添加し、２９時間でさらに５．０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコ１０〜１５に加えた。約４８時間で、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコ７〜９に加え、２．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコ１０〜１５に加えた。２４および４８時間に、グルコースレベル約３０ｇ／ｌに調節するためにグルコースを添加した。２４、２９、４８および７２時間に試料をフラスコから取り出し、ＯＤ６００,Ｎ−アセチルグルコサミンレベルおよび酢酸レベルをモニターした。酵素分析のため、選択したフラスコを７２時間で収穫した。
表３７に見られる様に、グルコースが残っている限りグルコース濃度はＮＡＧ生産に重大な影響を及ぼさなかった。一方、僅か５ｇ／ｌのリボースでＮＡＧレベルが大きく増加し、リボースがない場合の約１４ｇ／ｌに比べてフラスコ４、５および６で７２時間で約３０ｇ／ｌに達した。１０Ｇ／Ｌのリボースで最良の結果が見られた。これらのフラスコでＮＡＧレベルは７２時間で約３６ｇ／ｌに達した。リボースを含む培養液中で生育も正の影響を受けた。選ばれたフラスコからの酵素分析は、ＧｌｍＳまたはＧＮＡ１双方の活性レベルが培地中にリボースが有っても無くても同じであり、リボースの添加がこれらの酵素の活性レベルに直接影響しないことを明らかにした。このことは、リボース添加の効果が、ペントース燐酸経路中間体の不足が解除される結果である可能性が高いことを示唆している。
（表３７．７１０７−８７＃２５株における生育、酢酸蓄積およびＮＡＧ生産に対するグルコースおよびリボースの効果）
Figure 2013009690
１）７２時間の時点で得られた結果
２）全てのフラスコは酵母抽出物を含む
（ペントース燐酸経路のリボースおよび他の中間体）
グルコースおよびリボース中で生育した培養細胞で見られた正の結果に基づき、振盪フラスコスクリーニング＃３６を行って、いくつかの他の五炭素糖とグルコン酸の、生育とＮＡＧ生産に対する効果を測定した。７１０７−８７＃２５株を、０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５．０ｇ／ｌの酵母抽出物、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび０．２ｍＭのＩＰＴＧを補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で生育させた。グルコース、リボース、キシロース、アラビノースおよびグルコン酸（カリウム塩）を表３８に示す様にフラスコに加えた。培養細胞を３０℃で２４時間生育させ、次いで２５℃に移した。２４および４８時間でｐＨを７．２に調節した。約２４時間で、２４時間の試料からのＨＰＬＣの結果に基づいてグルコースを１日当たり３０ｇ／ｌで添加した。全てのフラスコに５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えた。２４および４８時間に１０ｇ／ｌのリボースをフラスコ１１および１２に加え、４８時間で５ｇ／ｌのリボースをフラスコ３および４に加えた。２８．５時間にさらに１０ｇ／ｌのグルコン酸をフラスコ１０に加えた。グルコースレベルを約３０ｇ／ｌに調節するため、４８時間にグルコースを添加した。さらに、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコ１１および１２に加えた。試料を２４、３０、４８、５４および７２時間に各フラスコから取り出し、ＯＤ６００、Ｎ−アセチルグルコサミンレベルおよび酢酸レベルををモニターした。選択したフラスコを７２時間で収穫し、酵素分析を行った。
（表３８．五炭素化合物とグルコン酸の生育とＮ−アセチルグルコサミン生産に対する効果）
Figure 2013009690
１）７２時間の時点からの結果
２）さらにリボース（１０ｇ／ｌ）を２４および４８時間でフラスコ１１および１２に添加
３）全てのフラスコは酵母抽出物（５．０ｇ／ｌ）を含む
さらにペントースとグルコン酸を添加すると、対照と比較してＮＡＧ力価と生育が改善した（図１８）。これらの培養液も対照より酢酸レベルが低かった。リボースを添加するとＮＡＧ生産がより高くなった。グルコン酸は他の糖より高価でないので、工業スケールで生産するのに魅力的である。グルコン酸の添加により対照株と比較してＮＡＧの生産が増加したので、工業的醗酵でペントース欠乏を解除するのにグルコン酸が潜在的な価値を有することが、この実験で確認される。選ばれたフラスコからの酵素活性レベルは、Ｎ−アセチルグルコサミン生産に対するリボースとグルコン酸の劇的な効果が、ＧｌｍＳまたはＧＮＡ１の活性の影響に帰せられないことを示している。異なったグルコース／リボースレベルの生育と生産に対する効果を比較する振盪フラスコスクリーニングで見られる様に、醗酵培地中にリボースが有っても無くても活性レベルは同程度である。
（実施例３１）
本実施例はＳｃＧＮＡ１プラスミドを含む７１０７−８７＃２５株を用いる、ＮＡＧ生産を最適化するために１リッターフラスコ中で行われた実験を説明する。
（ＩＰＴＧ誘導のタイミング）
実験を行って生育の開始および２４時間後からのＩＰＴＧによる誘導を評価した（細胞密度１３ｇ／ｌ）。生育は初期誘導で大きく阻害され、図１９に見られる様に遅延誘導（７０時間で５０ｇ／ｌ）と比較してＮＡＧ力価も極めて低かった（＜５ｇ／ｌ）。細胞中に蓄積したアミノ糖燐酸がペントース燐酸経路の特定の酵素を阻害するので、生育が阻害されると信じられている。この仮説は、ペントース燐酸中間体の細胞生育とＮＡＧ生産に対する正の効果の発見で支持される。
（ペントース燐酸経路（ＰＰＰ）中間体の効果）
醗酵槽に細胞を低（ＯＤ＝２０）、中間（ＯＤ＝３０）および高（ＯＤ＝４０）の３種の異なった密度で接種した。遅延誘導スキームを用いた（接種後約２４時間での誘導）。より高い細胞密度接種により、より高いＮＡＧ生産が得られた。接種細胞密度に拘わらず、リボースの添加で遅延誘導スキームでもＮＡＧ生産の改善が見られた。
（実施例３２）
本実施例は、組み込みＳｃＧＮＡ１コンストラクトを含む株を用いる、ＮＡＧ生産を最適化するための異なった醗酵実験を説明する。ＳｃＧＮＡ１プラスミドを含む株による先の実験では、ラクトースが極めて効率的でなかったので、ＮＡＧ生産を誘導するためにＩＰＴＧを使用する必要があった。組み込みＳｃＧＮＡ１コンストラクトでは、ＮＡＧ生産をラクトース添加で効果的に誘導することができた。
（ラクトース誘導）
染色体に組み込まれたＳｃＧＮＡ１コンストラクトのコピーを１個含む７１０７−９２＃１株の開発により、ＮＡＧ生産のためのラクトース誘導プロセスの開発が可能になった。初期ＩＰＴＧ誘導による生育阻害を示す振盪フラスコの結果を考慮して、遅延誘導スキームを醗酵槽中で試験した。細胞を最初に接種し、細胞密度約１５〜２０ｇ／ｌに生育させた。次いでグルコースの供給を停止し、ラクトースを１０、２０または３０ｇ／時間で供給した。その後、細胞の連続生育とＮＡＧ生産のためにグルコースの供給を再開した。１０ｇ／ｌの低いラクトースレベルが有効であり、７８時間で時間当たり５０ｇ／ｌに達することが分かった。
ラクトース供給法が異なるとプロセスが複雑になるので、異なったオプションを評価するために一つの実験を行った：不連続グルコース供給によるラクトース供給１０ｇ／ｌ、グルコース連続供給によるＩＰＴＧ誘導、およびグルコースを供給、または供給せずに１０ｇ／ｌラクトースの一点供給。条件を変えた別な試験では、ラクトース供給を４０ｇ／ｌに増やし、その後グルコースを供給した。１点ラクトース供給は他の誘導戦略と同様に有効であった。全ての試験で４５〜５５ｇ／ｌのＮＡＧ生産レベルを達成した。グルコース供給は連続的であるが、その濃度はやはり細胞を制約する（添加すると即座に消費される）。通常はｌａｃオペロンがグルコースの存在で抑制されるので、グルコース供給の制限は明らかにラクトース誘導に対して非抑制条件となる。１点ラクトース添加を用いることで、プロセスが簡略化された。
初期生育期間後の１点ラクトース誘導のレベル（１．２５〜１０ｇ／ｌ）を実験で評価した。２点誘導（各５ｇ／ｌ）も試みた。１．２５ｇ／ｌの低いラクトースレベルが極めて有効で、約１００ｇ／ｌの力価に達した。しかしながら、５ｇ／ｌのラクトース誘導では１００ｇ／ｌ以上のＮＡＧレベルに達した。従って、５ｇ／ｌでのラクトース誘導を以後の試験で安全レベルとして用いた。２点誘導も有効で、より速い初期ＮＡＧ生産速度が得られたが、５〜１０ｇ／ｌのラクトースで最終力価は１点誘導の力価を越えなかった。
（より高い操作ｐＨおよび温度の効果）
主として高いｐＨと温度で活性であるＧＬｃＮの性質のため、低い温度とｐＨを使用することがＧＬｃＮ醗酵を安定化する鍵になる因子であった。しかしながら、ＮＡＧが中性ｐＨで安定であることが示された。実験プログラムを通じてＮＡＧ生産のための醗酵をｐＨ７．７〜７．０の範囲で行った。実験データから、３７℃およびｐＨ７．０でグルコース供給を停止後もＮＡＧは少なくとも５０時間安定であることが示された。
ＧｌｃＮプロセスで使用された比較的低い温度（３０℃および２５℃）はコストが高く、工業スケールでは維持することが困難である。さらに、細胞生育速度は３７℃より３０度ではるかに低い。３０℃の温度を用いることは、高レベルＮＡＧ生産のためのバイオマスを達成するために比較的長い時間が必要になる。従って、誘導前の４つの異なった生育速度を評価するために、３７℃で試験を行った。この方法では、必要なバイオマスをより速く達成することが可能で、総体的により生産性の高いプロセスが得られた。３０℃で必要であった２２〜２４時間に対し、全ての醗酵槽は１０時間で誘導され、生産性が高く、５０時間以内で１００ｇ／ｌ以上のＮＡＧを達成した。ある場合は７０時間で約１２０ｇ／ｌを達成した。この時点以降、生育および生産温度として３７℃を使用した。
（グルコース供給速度の効果）
見掛け速度６ｇ／ｌ・時間（接種後の容積に基づく）をほとんどの試験で用いた。グルコース制限でＮＡＧ生産速度が制約されるかどうかを調べるため、より高いグルコース供給速度を試験した。供給速度を７．５ｇ／ｌに増加することで初期ＮＡＧ生産速度がより速くなったが、最終力価は高くないか、速く到達しなかった。さらに供給速度を９．５ｇ／ｌ・時間に増加すると、さらに速い初期ＮＡＧ生産速度を示した。しかしながら、これらの培養はより早く生産を停止する様に思われ、実際に最終力価が減少した（ＮＡＧ８５から６５ｇ／ｌへ）。同じ実験で、遅い供給速度（６ｇ／ｌ・時間）でＮＡＧレベル１００ｇ／ｌが得られた。この時点以降、ＮＡＧ発酵におけるグルコース供給速度を６．５ｇ／ｌ・時間に保った。
（燐酸レベルの効果）
発酵培地は３０ｇ／ｌの高濃度の全燐酸カリウム塩を含む。ほとんどの塩が細胞で使用されず、生成物生成中に除去しなければならないので、高濃度の燐酸塩は回収に重大な問題を提示した。ＮＡＧプロセスでは、高燐酸レベルが必須であることは示されていない。全燐酸を四分の一の７．５ｇ／ｌに減少したが、ＮＡＧ生産にはほとんど影響がなかった。この燐酸レベルを以後の実験に用いた。
（マグネシウムおよび鉄の重要性）
マグネシウムと鉄は高いバイオマスを達成するために必要な二つの栄養素であり、培養を安定させる。ＧｌｃＮＡｃの生産では、鉄レベルが制限因子の一つであることが分かった。高いバイオマスとラクトース誘導を達成するためにあるレベルが必要であるが、鉄が多すぎると酢酸レベルが高くＧｌｃＮレベルが低くなる。ＧｌｃＮプロセスで決定された鉄レベルは培地中に３ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２０、グルコース供給中にＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む鉄の補給（５μｇ／ｇグルコース）であった。初期のＮＡＧ生産実験でも同じ鉄レベルが選ばれた。グルコース供給に鉄を加えることはプロセスを複雑にする。従って、初期鉄濃度と鉄の供給を評価する努力がなされた。マグネシウム供給の効果も検討された。
最初の実験結果は、５〜１０ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２０レベルで同程度のＮＡＧ生産レベルが得られ、鉄レベルはＧｌｃＮ生産でさほど重要ではないことを示した。鉄、マグネシウムについての追加実験で、鉄の補給が全く必要でないことが示された。マグネシウムの補給は安定化効果を有する様に思われる。この試験は７．５ｇ／ｌ・時間の高い供給速度で行われ、６．５ｇ／ｌ・時間の別な追加実験は生産性が有意に低下せず両者を供給液から除去し得ることを示した。
鉄とマグネシウム両者の重要性は認められるが、供給液からそれらを除去することは生産プロセスを簡略化する観点から望ましい。従って、グルコース供給から鉄とマグネシウムを除外し、鉄をＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．６ｇ／ｌの初期濃度に保った。マグネシウムをＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．６ｇ／ｌの初期速度で添加し、使用された場合はグルコー
ス供給中に５〜１０ｍｇ／ｇ・グルコースで補給した。
マグネシウムも培養に重要であると認識され、制限してはならない。マグネシウムはある滅菌条件下（過剰発現の熱、暴露時間およびｐＨ）で燐酸により隠蔽され、不溶性燐酸塩沈殿として微生物が利用できなくなる。過剰のマグネシウムまたは制限マグネシウムを用いるフラスコ実験では、マグネシウムレベルが実際にＮＡＧ生産に重要であり、マグネシウムレベルが高い場合は、滅菌後にマグネシウムを添加することは沈殿効果を低減するために望ましいことが示された。滅菌の前後でマグネシウムの添加を比較するための実験が行われた。その結果、滅菌前にマグネシウムを添加した培養の効率は悪いことが示された。
初期マグネシウムレベルを１ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏへほぼ倍増し、滅菌後に増加する場合、または添加クエン酸レベルを増加し滅菌前にマグネシウムを酸性にする場合、実験からこのレベルを使用し得ることが示された。このことは、プロトコールの単純化に極めて前向きの意味を持っている。酸性にすることにより、全ての微量元素を滅菌前に添加することを可能にする。従って、グルコースを除く全ての成分を滅菌前に添加し得る培地調製プロトコールが開発された。初期の培地の酸性化は、燐供給のために燐酸カリウム塩を供給する代わりに燐酸を用いて行われた。培地にカリウムを供給する水酸化カリウムで、滅菌後にｐＨを必要な操作ｐＨ（７．０）に調節した。しかしながら、この方法は不必要に多量のカリウムを導入した。培地を酸性にするために１塩基燐酸カリウムを使用し、滅菌後に水酸化アンモニウムでｐＨを調節することでプロトコールをさらに変更した。これにより、培地から硫酸アンモニウム除去を可能にしてさらにプロトコールを簡略化した。
（微量元素の除去および亜鉛の重要性）
最初は微量金属パッケージは、μｇ〜ｍｇ／ｌ量で添加される以下の元素の塩で構成された:鉄、亜鉛、マンガン、銅、コバルト、モリブデンおよび硼素。最終製品中に存在する場合、モリブデンと硼素は毒性を示すが、その他の元素の効果は未知である。従って、どの元素を除去し得るかを決めるための１種除去の実験が行われた。最初の試験ではモリブデンと硼素両方の除去はＮＡＧ生産に重大な負の効果を与えず、以後の実験ではこれらを除去した。コバルトの除去も正の効果を有する様に思われるが、ビタミンＢ１１の全機能に必要であると認められるので、コバルトを除去せず、その後の実験は除去する効果を示さなかった。
亜鉛の除去の結果はＮＡＧ生産に正の効果を示した。さらに検討した結果、完全に亜鉛を制限するとバイオマスレベルが低下し、６０時間で１１８ｇ／ｌまでＮＡＧレベルが実質的に増加することが示された。１０ｍｇ／ｌまでのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏの高い初期鉄レベルでも使用し得るので、このことは特に興味がある。
（実施例３３）
本実施例はＮＡＧ生産のための好ましい発酵プロトコールを説明する。発酵プロトコールは以下に示される。
株：組み換えＥ．ｃｏｌｉ
誘導：細胞密度１５〜２０ｇ／ｌに達した後、５〜１０ｇ／ｌのラクトースを１点添加で加えた。この手順中、グルコースの供給を停止しなかったが、６．５ｇ／ｌで一定（初期容積に対し）にした。
供給：修正せず６５％グルコースを制限濃度で供給
発酵時間：６０〜７２時間
発酵法：バッチ供給、必要に応じ６５％グルコース供給。グルコース制限濃度維持
接種：２．５〜５容積％
ｐＨ：終始６．９、１２Ｎ ＮＨ４ＯＨで制御
温度：終始３７℃
酸素：溶存Ｏ２２０％以上ｍ攪拌で制御
曝気：０．５〜１ｖｖｍ
培地：
Figure 2013009690
グルコース（後に添加）以外の全ての成分を滅菌前に添加した。滅菌後の初期ｐＨは約３．０であり、接種前にＭＨ４ＯＨで６．９に調製した。
（実施例３４）
本実施例は二回の結晶化によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。
濾過またはミクロ濾過により発酵ブロスから細胞を除去した。発酵条件条件により、溶解固形分中のＮ−アセチルグルコサミンの割合は７０〜８７％の範囲であった（乾燥固体に対する重量％）。従って、粗Ｎ−アセチルグルコサミン生成物を精製しなければならない。これは粗ブロス中のＮ−アセチルグルコサミンの純度を増すための陽イオンおよび陰イオン脱塩工程の組み合わせで行われる。異なった結晶化プロトコールを使用し得る。以下の実施例は、Ｎ−アセチルグルコサミン精製のプロトコールと条件を確立するための異なった実験を説明する。例示した様に、９８％以上の純度のＮ−アセチルグルコサミンが実施例３４、３５、３６、４０および４１で説明した方法を用いて得られた。実施例３７に記載の方法で純度をさらに増進させた。
Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−１８−ＤＢ（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ；Ｓｕｐｅｒｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡから入手）と、１ｍｌ／分の１０％（ｖ）アセトニトリルを用いてＮ−アセチルグルコサミンを液体クロマトグラフィーで測定した。市販Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ、≧９９％）を外部標準として用いて、Ｎ−アセチルグルコサミンを２１０ｎｍで測定した。注入容積が４μｌである場合、５ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンまで検出器は直線の応答を示した。試料と標準試料を約３ｇ／ｌで日常的に調製し、少なくとも２回注入した。ピーク面積の偏差は平均値から２％以下であった。
溶解固形分中に７０％（ｗ）のＮ−アセチルグルコサミンを含む発酵試料（３９ｇ／ｌ）に活性炭（１００メッシュＧ−６０、ＮｏｒｉｔＡｍｅｒｉｃａｎｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡから入手）を加え、混合物を室温で１時間攪拌、濾紙を用いて濾過した。濾液の色は減少し、淡黄褐色であった。固形分の量を測定し、固形分中のＮ−アセチルグルコサミンの割合は７５％（ｗ）であった。
７７．５％の溶解固形分を含む上記の活性炭処理試料（そのうち５８．１％はＮ−アセチルグルコサミン）を真空中、４５〜５０℃で固形分５１％（ｗ）に濃縮した（濃縮中に固形分の損失がないとして試料重量から計算）。時々攪拌しながら濃縮液を室温に放置した。沈殿物を中程度の濾紙上に濾過で集め、１００ｍｌの水に溶解した。固形分含有量は１９．７％（ｗ）であった（全固形分量１６．２ｇ）。
次に溶解した試料を溶解固形分４４％（ｗ）に再度濃縮した。約２ｍｇの純Ｎ−アセチルグルコサミン粉末を加え、試料をシェーカー上で室温で２時間混合した。沈殿を濾過で集め、エタノールで洗浄した（固体を懸濁せずに２回、懸濁して２回）。重量が一定になるまで白色固体を真空下に室温で乾燥し、５．３２ｇの製品を得た（９８％のＮ−アセチルグルコサミン、全発酵液からの回収率９％）。
（実施例３５）
本実施例は５０℃から１回の結晶化によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。
溶解固形分中に８７％（ｗ）のＮ−アセチルグルコサミンを含む別バッチの発酵試料を実施例３４と同様に活性炭で処理した。溶解固形分の量を測定し、固形分中のＮ−アセチルグルコサミンの割合は８８％（ｗ）であった。８０．５ｇの固形分（その７１ｇはＮ−アセチルグルコサミン）を含む活性炭処理試料を固形分４５％（ｗ）に真空下で４５〜５０℃で濃縮し（濃縮中に固形分の損失がなかったとして重量から計算）、室温で１６時間振盪した。中程度の濾紙上に沈殿を濾過で集め、エタノールで洗浄した（固体を懸濁せず２回、固体を懸濁して２回）。真空下で乾燥後、３３．２ｇの白色固体を得た（純度１００％のＮ−アセチルグルコサミン、回収率４７％）。
（実施例３６）
本実施例は７０℃から１回の結晶化によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。
活性炭処理発酵試料から１回の結晶化で部分精製Ｎ−アセチルグルコサミンが得られる（実施例３４）。結晶化前の濃縮度と溶解固形分中のＮ−アセチルグルコサミンの初期割合により、Ｎ−アセチルグルコサミンの純度は８６〜９０％の範囲であった。
８６％または９０％のＮ−アセチルグルコサミンを含む固体試料を水と混合して固形分４４％（ｗ）とした。混合物を時々混合して７０℃に加熱し、固体を溶解した。次いで約１６時間、室温に放置した。結晶を濾過で集め、エタノールで洗浄した（固体を懸濁せず２回、懸濁して２回）。真空下に室温で乾燥後、生成物は９９％のＮ−アセチルグルコサミンを含んでいた（回収率２４〜２０％）。
（実施例３７）
本実施例は陽イオン交換処理によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。
陽イオン交換カラムへ通す供給液として脱色発酵ブロスを使用した。カラムは１．６×１５ｃｍで、２０ｇの水素型ＤＯＷＥＸ（商標）Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ８８樹脂（ＤｏｗＣｏｒｐ．、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩより購入）を含んでいた。ＰｈａｒｍａｃｉａＦＰＬＣ（商標）セット（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｓｃａｔａｗ
ａｙ、ＮＪより購入）を用いて４℃で実験を行った。供給液は固形分換算でＮ−アセチルグルコサミン約７６％、電導度１０．５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ約６．５であった。材料を１ｍｌ／分の速度でポンプ送液した。初期流出ｐＨは約２．３であった。カラム許容量に達するとｐＨは上昇し、流入液と実質的に同じになった。約１２５ｍｌで電導度は１０．５ｍＳ／ｃｍ付近から２．５ｍＳ／ｃｍ付近に低下した。ｐＨが上昇すると電導度も増加した。固形分換算で測定したＮ−アセチルグルコサミンの純度もｐＨが約２．５である間に急激に上昇した。純度はＮ−アセチルグルコサミン約８５％に上昇した。カラム容量が飽和すると純度も低下し、２００ｍｌで本質的に流入液と同じであった。Ｎ−アセチルグルコサミン純度は陽イオン処理で増加した。
（実施例３８）
本実施例は陰イオン交換処理によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。脱色し陽イオン交換樹脂で処理したＮ−アセチルグルコサミンブロスを陰イオン交換樹脂ＤｏｗＭｏｎｏｓｐｈｅｒｅ７７の流入液として使用した。実験条件は上記の陽イオン交換樹脂の実験と同じであった。固形分換算で流入液のＮ−アセチルグルコサミン純度は約８１％であり、電導度は３．８ｍＳ／ｃｍ、ｐＨは約３．０であった。流出液のｐＨは急激に８．０付近に上がり、その後２５０ｍｌで約３．８に下降した。電導度は急激に１ｍＳ／ｃｍ以下に下降し、実験中そのレベルに止まった。Ｎ−アセチルグルコサミン純度も上昇し、実質的に高いままであった。Ｎ−アセチルグルコサミン純度は流入液の純度約８１％から約８７％に増加した。
陽イオンと陰イオンの組み合わせ処理は、残乾固形分換算でＮ−アセチルグルコサミン純度を実質的に上昇させる簡単な方法を提供する。
（実施例３９）
本実施例は活性炭と混合ベッドイオン交換による発酵ブロス処理を説明する。
発酵ブロスを最初に実施例３４に記載の通り活性炭で処理し、次に製造業者の推薦に基づき混合ベッドイオン交換樹脂ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で処理した。試料を徐々に負荷し、重力で流出させた。試料負荷量は青色指示薬が金色に代わることで示される、２／３飽和であった。溶解固形分中に最初に７０％（ｗ）および８７％（ｗ）のＮ−アセチルグルコサミンを含む試料が、最終的に溶解固形分中でそれぞれＮ−アセチルグルコサミン純度８９％（ｗ）および９３％（ｗ）を示した。
（実施例４０）
本実施例は精製Ｎ−アセチルグルコサミンの安定化を説明する。
上記結晶化で生成したＮ−アセチルグルコサミン試料（純度９８）は、１０５℃、２時間で淡褐色に変わり、重量減４．７％であった。加熱によるこの色変化と重量減はイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を含む以下の処理（以下に記載）でなくなった。ＩＰＡ（イソプロピルアルコール）はＮ−アセチルグルコサミンの沈殿と１０５℃での試料の着色の除去に有用な試薬である。しかしながら、ＩＰＡの代替として同じ効果を得るために、当業者はアセトニトリルまたはエタノール等の水混和性有機溶剤を選ぶことが可能である。
（予備加熱後の水／ＩＰＡ沈殿）
試料（０．３０ｇ）を１０５℃で２．５時間加熱した。室温に冷却後、０．７ｍｌの水を加えて黄色の懸濁液を作成した。ＩＰＡ（２．８ｍｌ）を加え、混合物を２時間攪拌した。沈殿を濾過で集め、固体を懸濁してＩＰＡで２回洗浄した。母液は淡黄色であった。重量が一定になるまで固体を真空下で乾燥した（０．１８ｇ、回収率６０％）。
（８０：２０または８５：１５のＩＰＡ／水（ｖ／ｖ）中の浸漬処理）
固体１ｇ当たり５または１２ｍｌの混合溶媒で、試料を８０：２０または８５：１５のＩＰＡ／水中で３時間または終夜攪拌した。回収率（上記と同じ手順）は５６〜６７％であった。
（溶解およびＩＰＡでの沈殿）
試料（０．５０ｇ）を２．２７ｍｌの水に溶解した。ＩＰＡ（１２．８６ｍｌ、ＩＰＡ／水＝８５：１５ｖ／ｖ）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。回収手法（５６％）は上記と同じであった。
（水に溶解後、濃縮およびＩＰＡでの沈殿）
試料（８９．６ｇ）を固形分２０％（ｗ／ｗ）で水に溶解した。溶液を真空下に４５〜５０℃で濃縮した。固形分濃度が約４２％（ｗ／ｗ）に達した時、沈殿を生成し始めた。溶液を５５％固形分にさらに濃縮した（濃縮中に固形分の損失がないとして、全試料重量換算で計算）。ＩＰＡを加え（ＩＰＡ／水＝８５：１５ｖ／ｖ）、終夜攪拌した。固体を濾過で集め、固体を懸濁してＩＰＡで２回洗浄した。母液を濃縮乾固して１３ｇの湿った固体を得、これを次いで２０ｍｌの８５：１５ＩＰＡ／水（ｖ／ｖ）中に懸濁した。固体を濾過し、ＩＰＡで２回洗浄した。この固体を最初の濾過の後に得られた固体と合わせ、一定の重量になるまで真空下で乾燥した（８２．１ｇ、Ｎ−アセチルグルコサミン９８％、回収率９２％）。
（実施例４１）
本実施例はＩＰＡによるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。
より高い回収率を得るため、Ｎ−アセチルグルコサミンの精製にＩＰＡを使用した。Ｎ−アセチルグルコサミンを沈殿し、全ての不純物を溶液中に残すためＩＰＡと水の混合物（おそらくｖ／ｖ比で７０：３０〜８５：１５）を使用した。この様にして得られた精製Ｎ−アセチルグルコサミンは１０５℃で暗色化を示さなかった。この混合溶媒の必要量は、最初の試料中の不純物量と、その溶解度に依存する。
（実施例４２）
本実施例はエタノールによるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。９５％純度のＮＡＧ試料（４０ｇ）を１６０ｍｌの水に溶解した。混合物を攪拌しながらエタノール（６４０ｍｌ）を徐々に加えた。懸濁液を室温で終夜攪拌した。固体を濾過で集め、エタノール中に懸濁して２回洗浄した。真空下で乾燥して１６．１２ｇの白色固体を得た（９８％ＮＡＧ、ＮＡＧ回収率４２％）。この物質は１０５℃、２時間で暗色化を示さなかった。当業者は、同じ結果を得るためにエタノールの代替としてＩＰＡ、アセトニトリルまたはメタノールなどの他の水混和性溶剤を使用し得る。
（実施例４３）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンのグルコサミンへの化学的加水分解のためのプロセスを示す。
発酵で製造したＮ−アセチルグルコサミンを最終製品としてＮ−アセチルグルコサミンの形で回収し精製し得ることが予期される。発酵で製造したＮ−アセチルグルコサミンを単離および精製の前後に化学的にグルコサミンに変換することもできる。Ｎ−アセチルグルコサミンのグルコサミンへの化学的変換を示すためのパイロット試料実験が行われた。最初の実験で、Ｎ−アセチルグルコサミン（グルコースなしのＭ９Ａ培地中１０ｇ／ｌ）を様々なレベルの塩酸で１００℃で加水分解した。平行した実験で、加水分解条件下での安定性を測定するため、グルコサミンに同じ処理をした。結果を図２１および２２に示す。
Ｎ−アセチルグルコサミンからグルコサミンへの変換を、加水分解反応で生じたグルコサミンの量をモニターして測定した。Ｗａｙらの報告（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２３：２８６１、２０００）に基づき、グルコサミンをＨＰＬＣ法で測定した。ＨＰＬＣ法の特定の詳細を以下に記す：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ（３）Ｃ１８、５μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡから市販）、１５０×４．６ｍｍ；移動相：１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ オクタンスルホン酸ナトリウムを含むメタノール：水性緩衝液（４：１、ｖ：ｖ）（ｐＨ５．１）；流速：０．７ｍｌ／分；検出器：３０℃の屈折率検出器。
図２１は十分に低いｐＨ（＜１）で加熱した場合のＮ−アセチルグルコサミンのグルコサミンへの定量的な変換を示す。より高いｐＨでは加水分解を生じないか、または生成したグルコサミンが分解した。図２２は、ｐＨ１．０以下でグルコサミンが加熱で安定であったことを示す。より高いｐＨではかなりの量のグルコサミンが失われた。
１．０Ｎ塩酸（ｐＨ＜１）を用いるＮ−アセチルグルコサミンの酸加水分解を異なった温度で調べた。残存Ｎ−アセチルグルコサミン量と生成したグルコサミン量の両方をモニターした。標準炭水化物システムを用いてＮ−アセチルグルコサミンをＨＰＬＣで測定した。特定の詳細を以下に記す：カラム：Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＨＰＸ−８７Ｈ、７．８×３００ｍｍ；移動相：０．１％ＨＮＯ３水溶液：流速：０．８ｍｌ／分；検出器：３０℃の屈折率検出器。グルコサミンは上記のイオン対ＨＰＬＣカラムを用いて測定した。１Ｎ塩酸でｐＨ＜１．０の酸性にしたＭ９Ａ培地（本明細書に上記）中のＮ−アセチルグルコサミン（２０ｇ／ｌ）を３５℃、６０℃および１００℃でインキュベーションした。結果を図２３に示す。１００℃で変換は２．５時間で完結した。生成したグルコサミンの有意な分解は観察されなかった。より低い温度では、ある程度の加水分解が観察されたが、はるかに遅かった。
平行した実験で、グルコサミン（２０ｇ／ｌ）を上記の異なった温度で１Ｎ塩酸とともにインキュベーションした。ＨＰＬＣで測定して２４時間のインキュベーション後に分解は観察されなかった（データを示さず）。
まとめると、Ｎ−アセチルグルコサミンはグルコサミンへ容易に化学的に変換され得、その加水分解生成物であるグルコサミンはこれらの実験で使用された加水分解条件下で極めて安定であることが明らかである。
Ｎ−アセチルグルコサミンのグルコサミンへの酸加水分解はグルコサミン製造工程全体の鍵となる工程である。従って、発酵由来の結晶化Ｎ−アセチルグルコサミン材料または精製Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて加水分解実験を行った。
（実施例４４）
本実施例は高塩酸濃度および短時間でのＮ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を説明する。
９０℃でのＮ−アセチルグルコサミンの酸加水分解を行った。塩酸溶液（１２％および１６％、３７％から容積希釈）中のＮ−アセチルグルコサミン（１０％および２０％、ｗ／ｖ）を使用した。テフロン（登録商標）ライニングキャップを有する一連の１２ｍｌガラススクリューキャップチューブを用いた。各チューブは別々な時点（０分、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分）を表し、２ｍｌのＮ−アセチルグルコサミン／塩酸溶液を含んでいた。チューブを９０℃に平衡した加熱ブロック中で加熱した。チューブを適当な時間に取り出し、氷水中で素早く冷却した。適当な希釈を行い、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンについて試料をＨＰＬＣで分析した。図２４はＮ−アセチルグルコサミンの消失と、グルコサミンの生成を示す。Ｎ−アセチルグルコサミン消失の速度論は４種全ての溶液で基本的に同じであった。９０℃で加水分解は極めて早い。４つの場合全てで約９５％のＮ−アセチルグルコサミンが３０分で加水分解された。４５分後、初期濃度のＮ−アセチルグルコサミンの１％未満が残った。６０分または９０分でＮ−アセチルグルコサミンは検出されなかった。９０℃で１時間後、２０％のＮ−アセチルグルコサミンでもＮ−アセチルグルコサミンはもはや検出されなかった。図２４はまた、１０％グルコサミンを含むチューブ内でのグルコサミンの生成を示す。９０分後に、グルコサミンの大きな損失は観察されなかった。
（実施例４５）
本実施例は高濃度の塩酸で長期間（２４時間）のＮ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を説明する。
９０℃および１００℃におけるグルコサミンの分解を、５％および１０％（ｗ／ｗ）のグルコサミン塩酸塩を用い、１２重量％および２０重量％の塩酸で検討した。試料を１〜２４時間インキュベーションし、アンモニアをグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いて酵素的に分析した。グルコサミンとはグルコサミン塩酸塩のことである。パーセントは全てｗ／ｗである。グルコサミンの分解はアンモニアの生成に基づいている。分解率は５％と１０％溶液で基本的に同じであった。酸濃度が高いほど、分解は有意に高かった。１００℃の実験でも同様な傾向が見られた。１０℃の温度上昇はグルコサミン分解を大きく増加させることは明らかである。
（実施例４６）
本実施例は高い塩酸濃度（３０％）におけるＮ−アセチルグルコサミンの化学的脱アセチル化を説明する。
Ｎ−アセチルグルコサミンを９０℃でハイブリダイゼーション炉を用いてグルコサミンに加水分解した。反応をスクリューキャップガラスチューブの内部で行った。３０％塩酸（３０ｇ）を９０℃で１時間、予備インキュベーションした。この１０ｇの固体Ｎ−アセチルグルコサミンを添加後、素早く溶解し、Ｔ０試料を採取した。その後の３時間にわたり、試料を３０分間の間隔で採取した。３０分以内に溶液は速やかに暗橙／褐色に変わった。この暗色化は、より低い酸濃度で以前に観察されたものより明瞭に速かった。４５〜６０分でかなりの量の固形グルコサミンが観察され、混合物を塩酸中のグルコサミン塩酸塩のスラリーに変えた。試料をアンモニウムで酵素的に分析した。結果が図２５に示される。図２５はまた、より低い塩酸濃度を用いて９０℃で行われたグルコサミン分解実験のデータも示す。かなりのＮ−アセチルグルコサミンが分解し、アンモニアレベルに基づいた分解は３時間で約３．５％である。これは１２％または２０％塩酸中でグルコサミンを用いた場合に観察された値より明らかに高かい。
（実施例４７）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンの酵素的脱アセチル化を説明する。
Ｎ−アセチルグルコサミンを発酵ブロス中、またはそれを回収後に加水分解する酵素プロセスを以下に述べる。三つのタイプの酵素、すなわちＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．３３）、キチンデアシラーゼおよびアシルトランスフェラーゼが候補である。
（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼ）
Ｎ−アセチルグルコサミンを脱アセチル化することが示されている酵素が存在する。ＲｏｓｅｍａｎはＮ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を触媒する酵素活性（ＥＣ３．５．１．３３）を、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｄａｖｅｒｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ中に報告した（Ｒｏｓｅｍａｎ Ｓ．、１９５７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２６：１１５−１２４）。日本人のグループ（Ｙａｍａｎｏ、Ｆｕｊｉｓｈｉｍａら、Ｏｓａｋａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ａｇｅｎｃｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、キチナーゼ生産バクテリアＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ｎｏｎ−Ｏ１および海洋バクテリアＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ由来のＮ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼを研究した。特定の天然生物由来のＮ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼ双方の調製、性質および用途が以下の特許および文献に開示されている：Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ Ｓ．ら、１９６６年、タイトル“Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）”、ＪＰ９２３４０６４Ａ２；Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ Ｓ．ら、１９９７年、タイトル“Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ製造プロセス（Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）”、米国特許第５，７４４，３２５号；およびＦｕｊｉｓｈｉｍａら、１９９６年、タイトル“Ｎ−アセチルグル−Ｄ−コサミン−６−燐酸デアセチラーゼ製造プロセス（Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｅ”、欧州特許第０ ７３２ ４００ Ｂ１号。これらは全文を本明細書に援用する）。
Ｆｕｊｉｓｈｉｍａらが報告したデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）であると同定された。そのＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐとの親和性と効力は、Ｎ−アセチルグルコサミンとの親和性と効力よりはるかに高かった。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたＮ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミンには作用しない。
酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）が、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびノイラミン酸の細胞代謝に重要な工程であるＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐへ変換する役割を有することは周知である。通常、組み換えＥ．ｃｏｌｉ ＮａｇＡタンパク質などのこの酵素は非燐酸化Ｎ−アセチルグルコサミンには活性がない。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｎａｇＡ遺伝子）が多くの生物で見出されている。Ｎ−アセチルグルコサミンのみに活性を有する（従って、ＮａｇＡとは異なる）デアセチラーゼが存在するかどうかは知られていない。
（キチンデアセチラーゼ）
キチンデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．４１）はキチン中のＮ−アセチルグルコサミンユニットの脱アセチル化を触媒し、キトサンとする。キチンでアセチラーゼ活性は、通常、Ｎ−アセチル基において放射標識されたグリコールキチン（部分的にＯ−ヒドロキシエチル化されたキチン）を基質として使用することによって、決定される。この酵素はミクロ結晶キチンおよびカルボキシキチン（可溶性誘導体）にも作用する。しかしながら、Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ由来のキチンデヒドロゲナーゼはＮ−アセチルグルコサミン単量体または２〜３オリゴマーを脱アセチル化しないことが報告されている（ＡｒａｋｉおよびＩｔｏ、１９７５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５５：７１−７８、その全文を本明細書に引用して援用する）。通常のキチンデアシラーゼがグルコサミン単量体を脱アセチル化することは示されていないが、このような活性を有するキチンデアシラーゼ突然変異体を天然から単離または試験管内で創造することは可能である。
Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を、天然型デアセチラーゼを有する生物、または組み換えデアセチラーゼを有する生物に含まれる、またはそれらから単離されるデアセチラーゼを用いて行うことができる。組み換えデアセチラーゼを無秩序または指向性突然変異誘発で改良し得る。
以下にＮ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼを用いるＮ−アセチルグルコサミンの加水分解実験を説明する。
（アシルトランスフェラーゼ）
いくつかのアシルトランスフェラーゼが基質からアセチル基を除去し、他の基質に転移し得る（Ｋｏｎｅｃｎｙら）。この様な酵素がＮ−アセチルグルコサミンを脱アセチル化し得ることは示されていないが、この様な活性を有するアシルトランスフェラーゼ改変体を天然から単離し得るか、または試験管内で作成し得ると考えられる。
天然型アシルトランスフェラーゼを有する生物、または組み換えアシルトランスフェラーゼを有する生物に含まれる、またはそれらから単離されるアシルトランスフェラーゼにより、Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を行うことができる。組み換えアシルトランスフェラーゼを無秩序突然変異誘発または指向性突然変異誘発および／あるいはタンパク質遺伝子工学によって改良できる。
（酵素加水分解条件の決定）
デアセチラーゼを発現する天然型または組み換え細胞を標準条件または最適条件で生育させる。Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を、触媒として全細胞、粗酵素抽出物または精製酵素を用いて行う。まず、０．１ｍｌの２００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０）に基質として０．３ｍｌのＮ−アセチルグルコサミンの１０％溶液を加える。次に、０．１ｍｌの酵素溶液を加える。反応混合物を２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃および５０℃で３０分間、６０分間および１２０分間インキュベーションする。加水分解生成物であるグルコサミンの生成をＨＰＬＣ法で測定する。残存基質Ｎ−アセチルグルコサミンを別のＨＰＬＣ法でモニターする。この二つのＨＰＬＣ法は先の実施例に記載されている。
（発酵で製造されたＮ−アセチルグルコサミンの加水分解）
発酵ブロス中または回収後のＮ−アセチルグルコサミンを、粗酵素抽出物または精製デアシラーゼを触媒として用い、上記の条件下で加水分解する。グルコサミンを塩酸溶液中で結晶化して回収し、エタノール、メタノールまたはイソプロピルアルコールで洗浄する。
（実施例４８）
本実施例は高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。
この試験のための装置は、加熱マントルで加熱される１リッター丸底容器からなる。内容物である１５０ｇの水、２１ｇの９８％Ｎ−アセチルグルコサミンおよび２３８ｇの３６．７％塩酸を混合し、反応容器に加えた。攪拌した反応混合物を７０℃に加熱し３時間混合し、この時点で、混合物をビーカーに移し２０℃に冷却した。若干の結晶が見られた。混合物を反応容器に戻し、１０ｇのＮ−アセチルグルコサミンを加えた。反応容器を７０℃に再加熱し、３時間反応させ、４℃で終夜冷却した。存在する結晶を濾過し、エタノールで洗浄し、真空乾燥し分析した（グルコサミン塩酸塩２０ｇ、９９．９％）。濾液を反応容器に戻し、１０ｇのＮ−アセチルグルコサミンを加えた。反応容器を７０℃に再度加熱し、３時間反応させ、４℃で終夜冷却し、濾過し、エタノール洗浄し、真空乾燥し、そして分析した（グルコサミン塩酸塩１６．１ｇ、９９．６％）。濾液を再度反応容器に戻し、４１．５ｇを加え、反応サイクルを繰り返した。４回目のサイクルから３３ｇのグルコサミン塩酸塩が得られ、分析で９９．５％であった。全収率は８６％であり、製造されたグルコサミン塩酸塩は分析で９９＋であり、白色であった。この物質は再結晶の必要がなかった。
（実施例４９）
本実施例は低純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。
本試験は、発酵ブロスから濃縮し乾燥したＮ−アセチルグルコサミンを用いる実施例４７の条件を繰り返した。固体は５２％のＮ−アセチルグルコサミンを含んでいた。３サイクルを行った。製造されたグルコサミン塩酸塩は、各サイクルごとにより暗色になった。最初の２種の試料は９９．７％および９９．４％であると分析され、再結晶は必要なかった。三番目の試料は９７．７％と分析され、より暗色であり、再結晶が必要と思われた。全体の収率は７１％であった。実施例４８の最終濾液が透明な淡褐色であったのに対し、この最終濾液は暗褐色であった。
（実施例５０）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンが２１．８％に濃縮された発酵ブロスの加水分解を説明する。
本試験用の装置は４リッタージャケット付きガラス容器からなった。反応容器を指定の温度に加熱するために水を用いた。２１８ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンを含む２０００ｍｌの濃発酵ブロスを反応容器に加えた。５００ｍｌの３６．７％塩酸を加えた。反応容器を真空下に攪拌し、７０℃に加熱した。反応を９０分間行い、３１０ｍｌの濃縮液を採集した。反応混合物を濾過し、４℃に冷却して濾過した。固体を２６５ｍｌのエタノールで洗浄し、乾燥した。ブロスおよび濾液中のＮ−アセチルグルコサミン分析に基づく転換率は８９．５％であった。洗浄したグルコサミン塩酸塩を水に溶かし、１５５０ｍｌの溶液とした。１５ｇのＤａｒｃｏ Ｇ−６０活性炭を溶液に加えた。３０分間攪拌後、溶液を濾過し無色の濾液を得た。濾液を５０℃、５５ｃｍＨｇの真空で蒸発させた。固体をエタノールで洗浄し乾燥した。全収率は８２％であった。
（実施例５１）
本実施例は別途濯ぎ洗いを行う低純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。
この試験の目的は、加水分解後の別途行う濯ぎ洗いの工程で、再結晶の必要のない高純度製品が得られるかどうかを試験することであった。実施例４９で使用した装置を、濃縮液回収を行わないで使用した。５４％のＮ−アセチルグルコサミンを含む乾燥発酵ブロスを２０％塩酸に加えた。酸とＮ−アセチルグルコサミン比は２．５：１であった。このシリーズの反応条件は８０℃、１０３分であった。濾過後の湿潤ケーキを５００ｇの水、５２９ｇの３７％酸および４０７ｇのエタノールで洗浄した。その目的は別途設けた洗浄で、再結晶の必要のない製品が得られ得るかどうかを確認することであった。グルコサミン塩酸塩結晶はまだ若干黄褐色であり、再結晶が必要であった。全収率は７０％であり、最初の水洗で７％の収率が減少した。酸洗浄で１％、エタノール洗浄で１．６％の収率減少であった。
（実施例５２）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンの加水分解中の炭素処理を説明する。
不純物を除去するため、活性炭を加水分解後で再結晶前に使用した。本試験は反応前に加水分解溶液に活性炭を添加する工程を含んだ。全体で３４ｇのＤａｒｃｏ Ｇ−６０活性炭をＮ−アセチルグルコサミンおよび塩酸の反応混合液に加え、３０分間混合し、次いで濾過し反応容器に加えた。活性炭を濯ぎ洗いした１０００ｇの水も反応容器に加えた。得られたグルコサミン塩酸塩はほとんど無色であったが、なお再結晶が必要であった。反応条件は８０℃で６０分であった。反応溶媒をさらに水で希釈し、初期塩酸濃度が１４％に減少したため、全収率は２９％であった。
（実施例５３）
本実施例は低純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。
本実施例に用いられた反応条件は温度９０℃、３０分間であった。使用した３０％塩酸とＮ−アセチルグルコサミン比は３：１であった。実施例４９で使用した装置を本実施例でも使用した。加水分解収率は８６％であった。原料グルコサミン塩酸塩を水に再度溶解し、活性炭で処理し、濾過し、５０℃、６０ｃｍＨｇで真空再結晶した。最終分析値は９９．７％であり、全収率は５８％であった。
（実施例５４）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンの加水分解中の炭素処理を説明する。
活性炭処理を用いる加水分解溶液の第二の試験を試みた。５０ｇの活性炭を加水分解混合物に加え、濾過し、活性炭を１，０００ｇの水で濯ぎ洗いした以外は反応条件は実施例５２で用いられた条件であった。２０％塩酸とＮ−アセチルグルコサミンの比率を３：１とし、反応を９０℃で３０分間行った。実施例５２に説明した結果以上の色の改善は見られなかった。加水分解前の活性炭による上記の試験と同様、濾過中に酸を加え、溶解度を減少させるために冷却して収率を改善した。最終収率は３６％であり、９８．４％であった。
（実施例５５）
本実施例は高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。
本実施例の目的は９０℃で高品質Ｎ−アセチルグルコサミンから高純度グルコサミンを再結晶を必要とせず製造し得るかどうかを確認することであった。実施例４９の装置を用い、３２０ｇのＮ−アセチルグルコサミンを９４１ｇの３０％ｗ／ｗ塩酸と混合した。混合液をジャケット付き容器に加え、９０℃に加熱した。反応を加熱時間中、およびさらに９０℃に保って４７分間行った。２０℃に冷却後、湿潤ケーキを濾過し、エタノールで洗浄し５０℃で真空乾燥した。全収率は７１％であり、加水分解液を一回使用した場合と符合した。製造したグルコサミン塩酸塩は白色であったが若干黒色であり、再結晶が必要であった。
（実施例５６）
本実施例は不純なＮ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。
発酵ブロスから単離した固体Ｎ−アセチルグルコサミンを使用して実施例５４に記載と同じ手順を行った。Ｎ−アセチルグルコサミン固体の純度は４８％であった。１，４１１ｇのＮ−アセチルグルコサミンを含む混合物を４，２３６ｇの３０ｗ／ｗ％塩酸と７０℃で３時間反応させ、２０℃に冷却した。濾過後の湿潤ケーキをエタノールで洗浄し、５０℃で真空乾燥した。全収率は９０％であった。
（実施例５７）
本実施例は高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。
３６．７％の塩酸と純Ｎ−アセチルグルコサミンを２：１の比率で用いて加水分解を行った。実施例４９の装置を用い、２，００４ｇのＮ−アセチルグルコサミンを４，００９ｇの３６．７ｗ／ｗ％塩酸と８０℃で５８分間反応させ、次いで２０℃に冷却した。濾過後の湿潤ケーキを洗浄せず、室温で一晩放置して乾燥させた。最終ケーキは６％の塩酸と７５．２％のグルコサミン塩酸塩を含んでいた。反応混合物はかなり粘性で、反応容器の側面に黒い固体が付着していた。全収率は７０％であった。
（実施例５８）
本実施例はリサイクル塩酸を使用する高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。
回収グルコサミン塩酸塩の全体的な収率を増加させる方法の一つは、加水分解母液をリサイクルすることである。加水分解反応後、混合液を冷却し濾過する。濾液を秤量し、反応容器にリサイクルして戻す。最初の重量と戻した濾液の間の重量差を埋めるため、新しい３６．７％塩酸を加える。このシリーズには２．５：１の比率の３６．７％塩酸とＮ−アセチルグルコサミンを８０℃で６０分間反応させる工程が含まれた。純粋な固体Ｎ−アセチルグルコサミンを含む７４℃の反応容器に塩酸を加えた。反応混合液を温度に加熱し、６０分間反応させ、次いで２０℃に冷却し濾過する。塩酸を最初に使用した後、固体グルコサミン塩酸塩を濾過して回収し、収率は８８％であった。濾液を秤量し、反応容器に戻した。第二の等量のＮ−アセチルグルコサミンを加えると同時に、酸重量を最初の反応サイクルレベルに戻すために十分な３６．７％塩酸を加える。この酸の二回目の使用でも、同じ時間と温度で反応を繰り返した。冷却と濾過後に回収率は１０５％であり、最初の酸から溶液中に残されたグルコサミン塩酸塩の一部が第二サイクルの濾過中に回収されたことを示している。第三サイクルを第二サイクルと同じ方法で行い、回収率は６０％であった。３サイクルの全回収率は８７％であった。第三サイクルからの濾液を以後のサイクルのために保存した。
（実施例５９）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンのクロマトグラフィーによる精製を説明する。
Ｎ−アセチルグルコサミンを精製するために、ＤＯＷＥＸＴＭ Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ９９／Ｋ樹脂を使用するクロマトグラフィーを行った。樹脂を使用して、２．６×２３ｃｍのカラムに充填した。カラムベッド容積は１２０ｍｌであり、ボイド容積は３５ｍｌと見積もられた（シリンジを用いて液体をカラムから抜き取って測定）。これらの実験では、陽イオン樹脂および陰イオン樹脂での処理によって脱イオンされたブロスが用いられた。流入原料は約７５．７ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミン濃度と全固形分８３．４ｇ／ｌを含み、純度は約９１％であった。電導度は０．１ｍＳ／ｃｍであった。
最初の実験では、３０ｍｌの試料溶液を２ｍｌ／分でカラムにポンプ送液した。Ｎ−アセチルグルコサミンが何らかの方法で樹脂と相互作用することは明らかであった。Ｎ−アセチルグルコサミンは、約６０ｍｌまでは検出されず、ボイド容積をはるかに過ぎて９０ｍｌに中心のある非常に広いピークで溶出された。Ｎ−アセチルグルコサミンの純度も大きく変わり、９０ｍｌでＮ−アセチルグルコサミンの最高値は約９４．５％であった。この狭い領域で測定した純度は流入材料の純度より高かった。得られた純度値の変動は約２〜３％であった。低い濃度のＮ−アセチルグルコサミンを含む画分では、１２５ｍｌ以上および７５ｍｌ以下で、純度が急激に低下した。
同じカラムを使用する第二の実験を行った。今回はより少ない５ｍｌの試料をより遅い流速１ｍｌ／分で注入した。結果はより多量の試料とより速い流速で見られた結果と同程度であった。唯一の差は、Ｎ−アセチルグルコサミンのピークの中心が９０ｍｌでなく８０ｍｌであったことである。
全固形分の百分率で測定したＮ−アセチルグルコサミンの純度は実験中にかなり変化した。これは、いくらかのクロマトグラフィー分離、またはＮ−アセチルグルコサミンと樹脂の相互作用とは異なった樹脂と他の物質、多分非イオン性化合物との相互作用が存在することを示唆した。他の化合物がＮ−アセチルグルコサミンと同様な方法で樹脂と相互作用しているならば、Ｎ−アセチルグルコサミンはＮ−アセチルグルコサミンを含む全ての画分中でおなじレベルの純度で存在するはずであるが、実際はそうでなかった。
この実験に使用した樹脂を、上記と同じ手順で公知の方法を用いてカルシウム形態に変え、使用した。
（実施例６０）
本実施例は高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解と酢酸除去を同時に行う方法を説明する。
Ｎ−アセチルグルコサミンの塩酸水溶液加水分解からの主な副生物は酢酸であり、これは比較的高沸点を有し加水分解工程で容易には除去できなかった。加水分解工程でエタノールまたはメタノールなどのアルコールを供給すると、酢酸がエステル化され、副生物である酢酸エチルまたは酢酸メチルをそれぞれ生成し、沸点が下がるので、より容易に除去された。使用済み加水分解液に存在する主な不純物である副生物を除去すると、加水分解溶液中の塩酸をより多い回数で再使用することができる。
１７３ｇのメタノール、１８９．４ｇの３６．７ｗ％塩酸水溶液、および２０１ｇのＮ−アセチルグルコサミンの混合物を攪拌加熱したガラス容器に加え、６５℃で還流しながら混合した。１時間で試料を採取した。分析の結果、グルコサミン塩酸塩は８．３％、塩酸は１１．６％であり、滴定で酢酸はほとんど検出されなかった。反応を２時間後に停止し、２０℃に冷却した。固体をメタノールで濯ぎ洗いし乾燥した。グルコサミン塩酸塩の最初の収率は２５．６％であった。加水分解液を４℃で終夜冷却し、そして濾過した。さらに１０％のグルコサミン塩酸塩の収率が得られた。最初の固体の純度は８５％であった。濾液に酢酸は存在しなかった。
本発明の様々な実施態様を詳細に説明したが、当業者はこれらの実施態様の変更と応用が可能であることが明らかである。しかしながら、この様な変更と応用は以下のクレームに記載される本発明の範囲内であることを明確に理解する必要がある。
（配列表）
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