JP2010259449A - グルコサミンおよびｎ−アセチルグルコサミン製造のためのプロセスおよび材料 - Google Patents

Abstract

【課題】グルコサミンを製造する方法を提供すること。
【解決手段】グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生合成法が開示される。この様な方法には、遺伝子修飾された微生物による発酵でグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産する工程が含まれる。グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生産に有用な遺伝子修飾微生物も開示される。さらに、高純度のＮ−アセチルグルコサミンが得られる方法を含む、発酵プロセスで製造されたＮ−アセチルグルコサミンの回収法も説明する。Ｎ−アセチルグルコサミンからグルコサミンの製造法も開示される。
【選択図】なし

Description

本発明は醗酵によるグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの製造法に関する。
本発明はまた、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの製造に有用な遺伝子操作
微生物株に関する。本発明はまた、醗酵工程からグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコ
サミンを回収する方法に関する。本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミン源からグルコ
サミンを製造する方法に関する。

アミノ糖は通常、複雑なオリゴ糖および多糖中の単量体残基として見出される。グルコ
サミンは単純な糖であるグルコースのアミノ誘導体である。Ｎ−アセチルグルコサミンは
グルコサミンのアセチル化誘導体である。グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよ
び他のアミノ糖は多くの天然型多糖の重要な構成要素である。例えば、アミノ糖を含む多
糖は、構造タンパク質と同様に細胞の構造材料を形成し得る。

グルコサミンはとりわけ、動物およびヒトにおける骨関節炎の治療における栄養補給剤
として製造されている。グルコサミンの市場は急速に成長しつつある。さらに、グルコサ
ミンの世界市場における価格の低下は期待できない。Ｎ−アセチルグルコサミンも、多様
な慢性疾患の治療で価値のある薬品である。Ｎ−アセチルグルコサミンの副作用は確認さ
れていない。Ｎ−アセチルグルコサミンは動物体内におけるタンパク質合成の貴重で重要
な成分であるので、組織再生に有用である。Ｎ−アセチルグルコサミンは胃炎、食物アレ
ルギー、炎症性腸炎（ＩＢＤ）、憩室炎、リュウマチ性関節炎および骨関節炎の急性およ
び／または慢性症状の他、骨関節組織の代謝不全から生じる病的状態等、様々な疾患の予
防および／または治療に用いられる可能性がある。

現在、グルコサミンはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから誘導される複雑な炭水化物
であるキチンの酸加水分解により得られる。また、グルコサミンは様々なアセチル化キト
サンの酸加水分解でも得られる。Ｎ−アセチルグルコサミンとグルコサミンの共重合体で
あるキチンは、節足動物および菌類に見出される共通の天然型物質である。キチンは例え
ば甲殻類（ロブスター、エビ、オキアミ、カニおよびクルマエビの外骨格）、ハエ幼虫等
のブタ内蔵の生物分解に用いられる昆虫等の節足動物廃棄物、および最近ではクエン酸生
産に用いられた菌類バイオマス廃棄物等の安価な資源から得られる。廃棄物資源中のキチ
ン含有量が相対的に低いため、比較的少量の製品を得るために大量の廃棄物を処理しなけ
ればならず、処理自体の収率が低く、多くの薬剤とエネルギーを要するため、最終生産物
であるグルコサミン塩は比較的高価である。

キチンを精製する一般的な工業プロセスでは、酸と塩基の組み合わせでキチンを処理し
て廃棄される出発原料に付随する無機質、タンパク質その他の不純物を除去し、高温で濃
塩酸を使用してキチンを１工程で脱重合、脱アセチル化してグルコサミンを精製するが、
この方法は時間がかかり収率が低い。遊離塩基としてのグルコサミンは極めて不安定で分
解され易い。従って、塩酸塩等の安定な塩が製造される。臨床試験で効能が試験された形
態を模倣するため、通常、ＶｉａｒｔｒｉｌおよびＤＯＮＡ（登録商標）２００−Ｓ等、
塩酸塩を基本として用いる他の塩のブレンドが提供されている。これらの組成物は分子式
（グルコサミン）_２硫酸−（ＮａＣｌ）_２および（グルコサミン）_２硫酸−（ＫＣｌ）_２
を有する混合塩の形をとる。最近、低いナトリウムおよびカリウム投与量でグルコサミン
塩を提供する手段として、（グルコサミン）_２亜硫酸ナトリウム−（ＨＣｌ）_２および（
グルコサミン）_２亜硫酸カリウム−（ＨＣｌ）_２が研究されている。

Ｎ−アセチルグルコサミンは市場で広く得られるものではない。現在では、無水酢酸等
の有機アセチル化剤を用いるグルコサミンのアセチル化でＮ−アセチルグルコサミンが生
産されているが、これは高価で困難な工程である。これらの工程の生産収率も低い（基質
からグルコサミンへの転換率は５０％台）。

甲殻類由来の一般的な形のグルコサミンは、甲殻類に過敏な人にアレルギー反応を引き
起こすという消費者への警告が付けられている。そのため、動物由来の副産物のない材料
を求めている消費者が増加している。さらに、原材料（即ちカニの甲羅等のキチン源）の
入手がますます制約されつつある。従って、商品として販売し消費するために、高収率で
グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンを生産するコスト効率の良い方法が産業界
で必要とされている。

ＰＣＴ公報ＷＯ０２／６６６６７には微生物バイオマスからグルコサミンを製造する方
法が開示されている。この製造法は甲殻類アレルギーに伴う問題を克服しているが、収率
が低い点が主な問題である。具体的には、その方法はクエン酸等の他の製品生産の目的の
醗酵で生じるバイオマス廃棄物に依存しているため、グルコサミン製品の市場の増加に合
致する量のグルコサミンを生産するには十分でない。本明細書に参照され援用される米国
特許第６、３７２、４５７号には、微生物醗酵によるグルコサミン生産のためのプロセス
と材料が開示されている。しかしながら、米国特許第６、３７２、４５７号はＮ−アセチ
ルグルコサミンの生産法は開示していない。

（発明の開示）
本発明の実施態様の一つは醗酵によるＮ−アセチルグルコサミンの製造法に関する。こ
の方法は（ａ）グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの活性を増加する遺
伝子修飾の少なくとも一つを有する微生物を醗酵培地中で培養する工程、および（ｂ）グ
ルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン
からなる群より選択される、培養工程で製造された生成物を回収する工程が含まれる。あ
る態様では、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの活性を増加するため
の遺伝子修飾により、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の
増加、微生物によるグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現、グ
ルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐
酸生成物阻害の減少、およびグルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸ア
セチルトランスフェラーゼの親和性の増加からなる群より選択される結果が得られる。他
の態様では、微生物がグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする
核酸を含む組み換え核酸分子の少なくとも一つにより形質転換される。ある態様では、グ
ルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、グルコサミン−
６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾
を有する。他の態様では、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼは、配列
番号３０、３２および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約３５％
同一、または少なくとも約５０％同一、または少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配
列を有し、かつ酵素活性を有する。他の態様では、グルコサミン−６−燐酸アセチルトラ
ンスフェラーゼは配列番号３０、３２および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列
を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ）グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも一
つの遺伝子修飾を含む微生物を発酵培地中で培養する工程；および
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、およびＮ−アセチルグ
ルコサミンでなる群より選ばれる、該培養工程から製造された生成物を採集する工程
を包含する、発酵によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目２）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する前記遺伝子修
飾が、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加；微生物に
よるグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現；グルコサミン−６
−燐酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の
減少；およびグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのグルコサミン−６−
燐酸に対する親和性の増加でなる群から選ばれる結果を提供する、項目１に記載の方法
。
（項目３）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む
少なくとも一つの組み換え核酸分子で、前記微生物が形質転換される、項目１に記載の
方法。
（項目４）
グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする前記核酸配列が、該
グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性を増加する少なくとも一
つの遺伝子修飾を有する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０、配列番号
３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一
であるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが酵
素活性を有する、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０、配列番号
３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約５０％同一
であるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが酵
素活性を有する、項目３に記載の方法。
（項目７）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０、配列番号
３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一
であるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが酵
素活性を有する、項目３に記載の方法。
（項目８）
前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが配列番号３０、配列番号３
２および配列番号３４でなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、項目３に記載の方
法。
（項目９）
前記組み換え核酸分子の発現が誘導可能である、項目３に記載の方法。
（項目１０）
前記組み換え核酸分子の発現がラクトースで誘導可能である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記微生物がラクトースによる転写誘導の阻害を減少する遺伝子修飾をさらに含む、請
求項１０に記載の方法。
（項目１２）
前記遺伝子修飾がＬａｃＩレプレッサータンパク質をコードする遺伝子の部分的または
完全な欠失または不活性化を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記微生物が、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺
伝子修飾をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記微生物がグルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする核酸配列を含む少なくと
も一つの組み換え核酸分子で形質転換される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配
列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４配列番号、配列番号１６、配列番
号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも約３５
％同一であるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有
する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配
列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４配列番号、配列番号１６、配列番
号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０
％同一であるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有
する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配
列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４配列番号、配列番号１６、配列番
号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも約７０
％同一であるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有
する、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列
番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８およ
び配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼと比較して前記グルコサミン−６−燐酸シン
ターゼの生成物阻害を減少する修飾を、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有する、
項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列
番号１０、配列番号１２、および配列番号１４でなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む
、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記微生物がグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺
伝子修飾をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する前記遺伝子修飾が、前記微生物中
でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な
欠失または不活性化を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記微生物がグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺
伝子修飾をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目２４）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する前記遺伝子修飾が、前記微生物中
でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な
欠失または不活性化を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記発酵培地中で炭素源を約０．５％〜約５％の濃度に保つ工程を前記培養工程が含む
、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記培養工程が酵母抽出物を含む発酵培地中で行われる、項目１に記載の方法。
（項目２７）
グルコース、フラクトース、ペントース糖、ラクトースおよびグルコン酸でなる群から
選ばれる炭素源を含む発酵培地中で前記培養工程が行われる、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記ペントース糖がリボース、キシロースおよびアラビノースでなる群より選ばれる、
項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記培養工程がグルコースおよびリボースを含む発酵培地中で行われる、項目１に記
載の方法。
（項目３０）
前記培養工程がグルコースおよびグルコン酸を含む発酵培地中で行われる、項目１に
記載の方法。
（項目３１）
前記培養工程が約２５℃〜約４５℃の温度で行われる、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記培養工程が約３７℃で行われる、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記培養工程が約ｐＨ４〜約ｐＨ７．５のｐＨで行われる、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記培養工程が約ｐＨ６．７〜約ｐＨ７．５のｐＨで行われる、項目１に記載の方法
。
（項目３５）
前記培養工程が約ｐＨ４．５〜約ｐＨ５のｐＨで行われる、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記微生物がバクテリアおよび菌類でなる群より選ばれる、項目１に記載の方法。
（項目３７）
前記微生物がバクテリアおよび酵母でなる群より選ばれる、項目１に記載の方法。
（項目３８）
前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓでなる群から選ばれた属由
来のバクテリアである、項目１に記載の方法。
（項目３９）
前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒ
ｅｖｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓでなる群から選ばれた種由来のバクテリアである、項目１に記
載の方法。
（項目４０）
微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃ
ｈｉａ、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＰｈａｆｆｉａでなる群から選ばれた属由来
の酵母である、項目１に記載の方法。
（項目４１）
微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓ
ｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓおよびＰｈａｆｆｉａ ｒｈｏ
ｄｏｚｙｍａでなる群から選ばれた種由来の酵母である、項目１に記載の方法。
（項目４２）
前記微生物がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｃｈｒｙ
ｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａでなる群から
選ばれた属由来の菌類である、項目１に記載の方法。
（項目４３）
前記微生物がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｂｓｉ
ｄｉａ ｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉ
ｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｎ．ｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉａ、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍ ｒｅｅｓｅｉでなる群から選ばれた種由来の
菌類である、項目１に記載の方法。
（項目４４）
前記微生物中でホスフォグルコイソメラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を、該微生物が
さらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４５）
前記微生物が前記ホスフォグルコイソメラーゼをコードする核酸配列を含む組み換え核
酸分子で形質転換される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ホスフォグルコイソメラーゼが配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、項目４４に記
載の方法。
（項目４７）
前記微生物中でホスフォフラクトキナーゼの部分的または完全な欠失または不活性化を
該微生物がさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４８）
前記微生物がグルタミンシンテターゼ活性を増加する遺伝子修飾をさらに含む、項目
１に記載の方法。
（項目４９）
グルタミンシンテターゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子で前記微生物が
形質転換されている、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記グルタミンシンテターゼが配列番号８９のアミノ酸配列を含む、項目４８に記載
の方法。
（項目５１）
グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ活性を増加する遺伝子修飾を、前記微生物がさ
らに含む、項目１に記載の方法。
（項目５２）
グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子
で、前記微生物が形質転換されている、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼが配列番号９５のアミノ酸配列を含む、請
求項５１に記載の方法。
（項目５４）
前記微生物中でグリコーゲン合成に関与する酵素をコードする遺伝子の部分的または完
全な欠失または不活性化を、該微生物がさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５５）
グリコーゲン合成に関与する酵素をコードする前記遺伝子は、ＡＤＰ−グルコースピロ
ホスフォリラーゼ、グリコーゲンシンターゼおよび分枝酵素を含む、項目５４に記載の
方法。
（項目５６）
前記遺伝子修飾が前記微生物のガラクトース代謝能を阻害しない、項目１に記載の方
法。
（項目５７）
前記採集工程が、細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセ
チルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグル
コサミンおよびグルコサミンでなる群から選ばれる細胞内生成物を前記微生物から回収す
る工程、またはグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれる細胞
外生成物を前記発酵培地から回収する工程を有する、項目１に記載の方法。
（項目５８）
ａ）グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれた生成物を前記
発酵培地から精製する工程；
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−
６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を前記
微生物から回収する工程；
ｃ）グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成
物を脱燐酸し、グルコサミンを製造する工程；
ｄ） Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐
酸でなる群より選ばれた生成物を脱燐酸し、Ｎ−アセチルグルコサミンを製造する工程；
ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセ
チルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を処理し、グルコサミン、グル
コサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれたグルコサミン製
品を製造する工程、
でなる群から選ばれた工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目５９）
Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチル
グルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた前記生成物を、酸および加熱条件下または
酵素的脱アセチル化で加水分解する工程を工程（ｅ）が含む、項目５４に記載の方法。
（項目６０）
Ｎ−アセチルグルコサミンを含む固体を発酵ブロスから沈殿させて、前記発酵法で製造
されたＮ−アセチルグルコサミンを回収する、項目１に記載の方法。
（項目６１）
Ｎ−アセチルグルコサミンを含む固体を発酵ブロスから結晶化させて、前記発酵法で製
造されたＮ−アセチルグルコサミンを回収する、項目１に記載の方法。
（項目６２）
ａ）グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾
を含む微生物を、発酵培地中で培養する工程；ならびに
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグル
コサミンでなる群より選ばれた、培養工程で製造された生成物を採集する工程、
を包含する、発酵によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目６３）
前記微生物によるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの過剰発現；グルコサミン−６
−燐酸デアミナーゼの酵素活性の増加；グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆反応の
増加によるグルコサミン−６−燐酸生成の増加；グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの
正反応の減少によるフラクトース−６−燐酸生成の減少；グルコサミン−６−燐酸デアミ
ナーゼのフラクトース−６−燐酸に対する親和性の増加；グルコサミン−６−燐酸デアミ
ナーゼのグルコサミン−６−燐酸に対する親和性の減少；およびグルコサミン−６−燐酸
デアミナーゼのグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少でなる群より選ばれた結果を、
前記遺伝子修飾が提供する、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子で
、微生物が形質転換されることを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目６５）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修
飾を、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする核酸配列が有することを特徴と
する項目６４に記載の方法。
（項目６６）
配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコサ
ミン−６−燐酸デアミナーゼが有し、ここでグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼが酵素
活性を有することを特徴とする項目６４に記載の方法。
（項目６７）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼが配列番号４２のアミノ酸配列を有することを特
徴とする項目６４に記載の方法。
（項目６８）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有す
ることを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目６９）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾が、微生物中でグルコサ
ミン−６−燐酸シンターゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不
活性化であることを特徴とする項目６８に記載の方法。
（項目７０）
グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を
、微生物がさらに有することを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目７１）
グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加；微生物による
グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの過剰発現；グルコサミン−６−燐
酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少
；およびグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのグルコサミン−６−燐酸
に対する親和性の増加でなる群から選ばれる結果を遺伝子修飾が提供することを特徴とす
る項目７０に記載の方法。
（項目７２）
グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を有す
る組み換え核酸分子で微生物が形質転換されることを特徴とする項目７０に記載の方法
。
（項目７３）
配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４でなる群より選ばれたアミノ酸配列と
少なくとも３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼが有し、グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが酵素
活性を有することを特徴とする項目７０に記載の方法。
（項目７４）
配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４でなる群より選ばれたアミノ酸配列を
、グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが有することを特徴とする請
求項７０に記載の方法。
（項目７５）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有す
ることを特徴とする項目７０に記載の方法。
（項目７６）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾が、微生物中のグルコサ
ミン−６−燐酸シンターゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不
活性化であることを特徴とする項目７５に記載の方法。
（項目７７）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を
微生物がさらに有することを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目７８）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加；Ｎ−アセ
チルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ酵素活性の減少；グルコサミン
−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の微生物による過剰発現；
グルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラー
ゼの親和性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐
酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトラ
ンスフェラーゼの親和性の減少；およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフ
ェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少でなる群より選ばれる
結果を遺伝子修飾が提供することを特徴とする項目７７に記載の方法。
（項目７９）
微生物が二元活性グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセ
チルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを有し、グルコサミン−１−燐
酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性が増加することを特徴とする項目７７に記載の
方法。
（項目８０）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン
−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、またはグルコサミン−１
−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子
で、微生物が形質転換されることを特徴とする項目７７に記載の方法。
（項目８１）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン
−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ、またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルト
ランスフェラーゼをコードする核酸配列が、それぞれグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチ
ルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラー
ゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの活性を増加する少な
くとも一つの遺伝子修飾を有することを特徴とする項目８０に記載の方法。
（項目８２）
配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコサ
ミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸
ウリジルトランスフェラーゼが有し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェ
ラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼがグルコサミ
ン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することを特徴とする項目
８０に記載の方法。
（項目８３）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン
−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが、配列番号５６のアミノ酸配列を有することを
特徴とする項目８０に記載の方法。
（項目８４）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性が減少された、またはその活性を
持たない短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチル
グルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを核酸配列がコードすることを特徴
とする項目８０に記載の方法。
（項目８５）
短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコ
サミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが配列番号５８のアミノ酸配列と少なくと
も約３５％同一であるアミノ酸配列を有し、短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチル
トランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ
がグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することを特徴
とする項目８４に記載の方法。
（項目８６）
短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコ
サミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが配列番号５８のアミノ酸配列を有するこ
とを特徴とする項目８４に記載の方法。
（項目８７）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少させる遺伝子修飾を微生物がさらに有す
ることを特徴とする項目７７に記載の方法。
（項目８８）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少させる遺伝子修飾が、微生物中のグルコ
サミン−６−燐酸シンターゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または
不活性化であることを特徴とする項目８７に記載の方法。
（項目８９）
細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン
−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグ
ルコサミンでなる群から選ばれた細胞内生成物を微生物から回収するか、またはグルコサ
ミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群から選ばれた細胞外生成物を発酵培地から
回収する工程を、採集工程が有することを特徴とする項目６２に記載の方法。
（項目９０）
ａ）グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾
、およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なく
とも一つの遺伝子修飾を有する微生物を発酵培地中で培養する工程；および
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグル
コサミンでなる群より選ばれた生成物の、培養工程から生成された生成物を採集する工程
を有することを特徴とするグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目９１）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する遺伝子修飾が、微生物中でグル
コサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失ま
たは不活性化であることを特徴とする項目９０に記載の方法。
（項目９２）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加；Ｎ−アセ
チルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ酵素活性の減少；グルコサミン
−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の微生物による過剰発現；
グルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラー
ゼの親和性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐
酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトラ
ンスフェラーゼの親和性の減少；およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフ
ェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少でなる群より選ばれた
結果を、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子
修飾が提供することを特徴とする項目９０に記載の方法。
（項目９３）
微生物が二元活性グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセ
チルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを有し、グルコサミン−１−燐
酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性が増加することを特徴とする項目９０に記載の
方法。
（項目９４）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン
−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、またはグルコサミン−１
−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子
で、微生物が形質転換されることを特徴とする項目９０に記載の方法。

（項目９５）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン
−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼをコードする核酸配列が、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランス
フェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性、ま
たはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性をそれぞれ増加する少
なくとも一つの遺伝子修飾を有することを特徴とする項目９４に記載の方法。
（項目９６）
配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコ
サミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐
酸ウリジルトランスフェラーゼが有し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフ
ェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼがグルコサ
ミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することを特徴とする請求
項９４に記載の方法。
（項目９７）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン
−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが、配列番号５６のアミノ酸配列を有することを
特徴とする項目９４に記載の方法。
（項目９８）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性が減少、またはその活性がない短
縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミ
ン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼを核酸配列がコードすることを特徴とする請求
項９４に記載の方法。
（項目９９）
配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を、短縮型
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−
１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが有し、短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチ
ルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラー
ゼがグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することを特
徴とする項目９８に記載の方法。
（項目１００）
短縮型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコ
サミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼが配列番号５８のアミノ酸配列を有するこ
とを特徴とする項目９８に記載の方法。
（項目１０１）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微
生物がさらに有することを特徴とする項目９０に記載の方法。
（項目１０２）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する遺伝子修飾が、グルコサミン−６−
燐酸シンターゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子での微生物の形質転換を
含むことを特徴とする項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配
列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群から選ばれるアミ
ノ酸配列と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列をグルコサミン−６−燐酸シンタ
ーゼが有し、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有することを特徴とする請
求項１０１に記載の方法。
（項目１０４）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配
列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群から選ばれるアミ
ノ酸配列をグルコサミン−６−燐酸シンターゼが有することを特徴とする項目１０１に
記載の方法。
（項目１０５）
野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼと比較してグルコサミン−６−燐酸の生成物
阻害が減少する修飾を、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有することを特徴とする請
求項１０１に記載の方法。
（項目１０６）
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１
４でなる群から選ばれるアミノ酸配列をグルコサミン−６−燐酸シンターゼが有すること
を特徴とする項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン
−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグ
ルコサミンでなる群からから選ばれた細胞内生成物を微生物から回収する工程、またはグ
ルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれた細胞外生成物を発酵培
地から回収する工程を、採集工程が含むことを特徴とする項目９０に記載の方法。
（項目１０８）
ａ）内因性グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼとグルコサミン−６−
燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも１種の遺伝子修飾とを有する微生物を発酵培地
中で培養する工程；および
ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグル
コサミンからなる群から選ばれる、培養工程から生産された生成物を採集する工程、
を有することを特徴とするグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目１０９）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする核酸配列を有する少なくとも一つの組
み換え核酸分子で、微生物が形質転換されることを特徴とする項目１０８に記載の方法
。
（項目１１０）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配
列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれたアミ
ノ酸配列に少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を、グルコサミン−６−燐酸シン
ターゼが有し、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有することを特徴とする
項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配
列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれたアミ
ノ酸配列を、グルタミン−６−燐酸シンターゼが有することを特徴とする項目１０９に
記載の方法。
（項目１１２）
野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼと比較してグルコサミン−６−燐酸シンター
ゼの生成物阻害が減少する修飾を、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有することを特
徴とする項目１０９に記載の方法。
（項目１１３）
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１
４でなる群より選ばれたアミノ酸配列を、グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有するこ
とを特徴とする項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性が減少する少なくとも一つの遺伝子修飾を、
微生物がさらに有することを特徴とする項目１０８に記載の方法。
（項目１１５）
その方法がＮ−アセチルグルコサミンの発酵による製造法であり、Ｎ−アセチルグルコ
サミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミ
ンでなる群より選ばれた、培養工程から製造された生成物を採集する工程を採集工程が有
することを特徴とする項目１０８に記載の方法。
（項目１１６）
グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも一つの
遺伝子修飾を有する遺伝子修飾微生物。
（項目１１７）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微
生物がさらに有することを特徴とする項目１１６に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１１８）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾を、
微生物がさらに有することを特徴とする項目１１６に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１１９）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微
生物がさらに有することを特徴とする項目１１６に記載の遺伝子修飾微生物。

（項目１２０）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有
することを特徴とする遺伝子修飾微生物。
（項目１２１）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有す
ることを特徴とする項目１２０に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２２）
グルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を
、微生物がさらに有することを特徴とする項目１２０に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２３）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有す
ることを特徴とする項目１２２に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２４）
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を
、微生物がさらに有することを特徴とする項目１２０に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２５）
グルコサミン−１−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾を、微生物がさらに有す
ることを特徴とする項目１２４に記載の遺伝子修飾微生物。
（項目１２６）
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾と、
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも一つ
の遺伝子修飾を有することを特徴とする遺伝子修飾微生物。
（項目１２７）
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、微
生物がさらに有することを特徴とする項目１２６に記載の修飾微生物。
（項目１２８）
ａ）発酵プロセスの生成物である可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンを含む発酵ブロスを
得る工程；および
ｂ）発酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を回収する工程、
を有することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミンの製造方法。
（項目１２９）
発酵ブロスから細胞物質を除去する工程をさらに有することを特徴とする項目１２８
に記載の方法。
（項目１３０）
発酵ブロスを脱色する工程をさらに有することを特徴とする項目１２８に記載の方法
。
（項目１３１）
Ｎ−アセチルグルコサミンの繰り返し再結晶、活性炭処理およびクロマトグラフィー脱
色でなる群から、脱色工程が選ばれることを特徴とする項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
発酵ブロスをイオン交換樹脂と接触させる工程をさらに有することを特徴とする項目
１２８に記載の方法。
（項目１３３）
発酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂と接触させる工程を、発酵ブロ
スをイオン交換樹脂と接触させる工程が有することを特徴とする項目１３２に記載の方
法。
（項目１３４）
発酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂の混合ベッドと接触させる工程
を、発酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂と接触させる工程が有するこ
とを特徴とする項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
発酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を沈殿させる工程を、回収工程が
有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１３６）
発酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を結晶化する工程を、回収工程が
有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１３７）
可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンを含む発酵ブロスを濃縮する工程を、回収工程が有す
ることを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１３８）
濃縮工程が大気圧以下で行われることを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
濃縮工程が膜分離で行われることを特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４０）
濃縮工程が約４０℃〜約７５℃の間の温度で行われることを特徴とする項目１３７に
記載の方法。
（項目１４１）
濃縮工程が約４５℃〜約５５℃の間の温度で行われることを特徴とする項目１３７に
記載の方法。
（項目１４２）
発酵ブロス中の固形分が少なくとも約３０％固形になる様に濃縮工程が行われることを
特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４３）
発酵ブロス中の固形分が少なくとも約４０％固形になる様に濃縮工程が行われることを
特徴とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４４）
発酵ブロス中の固形分が少なくとも約４５％になる様に濃縮工程が行われることを特徴
とする項目１３７に記載の方法。
（項目１４５）
濃縮工程の後に発酵ブロスを冷却する工程をさらに有することを特徴とする項目１３
７に記載の方法。
（項目１４６）
発酵ブロスを約−５℃〜約４５℃の間の温度に冷却することを特徴とする項目１４５
に記載の方法。
（項目１４７）
発酵ブロスを約−５℃〜約室温の間の温度に冷却することを特徴とする項目１４５に
記載の方法。
（項目１４８）
発酵ブロスを室温に冷却することを特徴とする項目１４５に記載の方法。
（項目１４９）
発酵ブロスにＮ−アセチルグルコサミン結晶を接種する工程をさらに有することを特徴
とする項目１４５に記載の方法。
（項目１５０）
発酵ブロス中の核生成で形成したＮ−アセチルグルコサミン結晶、および外部から提供
されたＮ−アセチルグルコサミン結晶でなる群からＮ−アセチルグルコサミンの種結晶が
選ばれることを特徴とする項目１４９に記載の方法。
（項目１５１）
回収工程がＮ−アセチルグルコサミンを水混和性溶剤と接触させる工程を有することを
特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１５２）
イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、エタノール、メタノール、アセトン、テトラヒド
ロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびアセトニト
リルでなる群より水混和性溶剤が選ばれることを特徴とする項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
回収されたＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を乾燥する工程をさらに有することを
特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１５４）
Ｎ−アセチルグルコサミンを含む乾燥固体を水混和性溶剤で洗浄する工程をさらに有す
ることを特徴とする項目１５３に記載の方法。
（項目１５５）
回収されたＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を溶解してＮ−アセチルグルコサミン
溶液を形成する工程と、この溶液からＮ−アセチルグルコサミンを含む固体を回収する工
程をさらに有することを特徴とする項目１２８に記載の方法。
（項目１５６）
発酵ブロスを濾過してバクテリア内毒素を除去する工程をさらに有することを特徴とす
る項目１２８に記載の方法。
（項目１５７）
ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセ
チルグルコサミン−１−燐酸でなる群から選ばれたＮ−アセチルグルコサミン源を得る工
程；および
ｂ）工程ａ）のＮ−アセチルグルコサミン源を処理して、Ｎ−アセチルグルコサミン源
からグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸でなる群から
選ばれるグルコサミン製品を製造する工程、
を有するＮ−アセチルグルコサミン源からグルコサミンの製造方法。
（項目１５８）
原料中の乾燥固体の比率としてＮ−アセチルグルコサミン源が少なくとも約４０％のＮ
−アセチルグルコサミンであることを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
Ｎ−アセチルグルコサミン源が発酵プロセスで製造されたＮ−アセチルグルコサミンで
あることを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１６０）
Ｎ−アセチルグルコサミン源が、発酵プロセスで製造されたＮ−アセチルグルコサミン
を含む発酵ブロスであり、発酵ブロスが処理されて実質的に細胞物質が除去されているこ
とを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１６１）
Ｎ−アセチルグルコサミン源が固体として、または溶液中に提供されることを特徴とす
る項目１５７に記載の方法。
（項目１６２）
Ｎ−アセチルグルコサミン源を水性で低沸点の一級または二級アルコール中に懸濁する
ことを特徴とする項目１６１に記載の方法。
（項目１６３）
処理工程ｂ）が酸および加熱条件下にＮ−アセチルグルコサミン源を加水分解する工程
を有することを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１６４）
加水分解工程が約６０℃〜約１００℃の温度で行われることを特徴とする項目１６３
に記載の方法。
（項目１６５）
加水分解工程が約７０℃〜約９０℃の温度で行われることを特徴とする項目１６３に
記載の方法。
（項目１６６）
加水分解工程が約１０重量％〜約４０重量％の濃度の塩酸を用いて行われることを特徴
とする項目１６３に記載の方法。
（項目１６７）
塩酸溶液の重量と純乾燥重量としてのＮ−アセチルグルコサミン源との比率が約１：１
重量比〜約５：１重量比であることを特徴とする項目１６６に記載の方法。
（項目１６８）
加水分解工程が約１０分〜約２４時間行われることを特徴とする項目１６３に記載の
方法。
（項目１６９）
ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン源を加熱条件下で塩酸溶液または循環加水分解母液と組
み合わせて加水分解し、グルコサミン塩酸塩を含む溶液を製造する工程；
ｂ）工程ａ）の溶液を冷却してグルコサミン塩酸塩を沈殿させる工程；および
ｃ）工程ｂ）から沈殿したグルコサミン塩酸塩を含む固体を取り出す工程、
を有することを特徴とする項目１６３に記載の方法。
（項目１７０）
Ｎ−アセチルグルコサミン源を塩酸塩溶液または循環加水分解母液と連続的にブレンド
し、Ｎ−アセチルグルコサミン源を溶解溶液として維持し、次いで加熱条件下に無水塩酸
水溶液を工程ａ）の溶液に加えて加水分解を開始し、Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコ
サミン塩酸塩に変換することで加水分解工程ａ）が行われることを特徴とする項目１６
９に記載の方法。
（項目１７１）
加水分解母液が工程ｃ）で沈殿したグルコサミン塩酸塩を回収した後に残る加水分解溶
液であり、加水分解工程が行われる前、工程中、または工程後に一級または二級アルコー
ルが加水分解溶液に添加されることを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１７２）
一級または二級アルコールがメタノール、イソプロパノール、エタノール、ｎ−プロパ
ノール、ｎ−ブタノールおよびｓｅｃ−ブタノールでなる群より選ばれることを特徴とす
る項目１７１に記載の方法。
（項目１７３）
溶液が約−５℃〜約４０℃になるまで冷却工程が行われることを特徴とする項目１６
９に記載の方法。
（項目１７４）
回収工程が：
ｉ）沈殿したグルコサミン塩酸塩を含む固体を採集する工程；
ｉｉ）グルコサミン塩酸塩を含む固体を水混和性溶剤で洗浄する工程；および
ｉｉｉ）グルコサミン塩酸塩を含む固体を乾燥する工程、
を有することを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１７５）
回収工程が：
ｉ）沈殿したグルコサミン塩酸塩を含む固体を採集する工程；
ｉｉ）工程（ｉ）からの固体を水に溶解して溶液とする工程；
ｉｉ）工程（ｉｉ）の溶液のｐＨを約２．５〜４の間に調整する工程；
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の溶液を活性炭と接触させ、グルコサミン塩酸塩を含む固体を脱
色する工程；
ｖ）工程（ｉｖ）の溶液から活性炭を除去する工程；および
ｖｉ）グルコサミン塩酸塩を工程（ｖ）の溶液から結晶化する工程、
を有することを特徴とする項目１６９に記載の方法。
（項目１７６）
結晶化工程が約７０℃以下の温度でグルコサミン塩酸塩を濃縮する工程を有することを
特徴とする項目１７５に記載の方法。

（項目１７７）
結晶化工程が約５０℃以下の温度でグルコサミン塩酸塩を濃縮する工程を有することを
特徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１７８）
結晶化工程がグルコサミン塩酸塩を大気圧以下で濃縮する工程をさらに有することを特
徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１７９）
結晶化工程（ｖｉ）〜（ｉ）後に残留する溶液を循環する工程をさらに有することを特
徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１８０）
結晶化工程（ｖｉ）から次の結晶化工程後に残留する溶液を循環する工程をさらに有す
ることを特徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１８１）
工程（ｖｉ）後の結晶化グルコサミン塩酸塩を水混和性溶剤で洗浄する工程をさらに有
することを特徴とする項目１７５に記載の方法。
（項目１８２）
水混和性溶剤がメタノール、イソプロパノール、エタノール、アセトニトリル、アセト
ン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびジオキサ
ンでなる群より選ばれることを特徴とする項目１８１に記載の方法。
（項目１８３）
洗浄後の結晶化グルコサミン塩酸塩を約７０℃以下の温度で約６時間以下乾燥する工程
をさらに有することを特徴とする項目１８１に記載の方法。
（項目１８４）
乾燥工程が大気圧以下で行われることを特徴とする項目１８３に記載の方法。
（項目１８５）
乾燥工程が空気吹き付けで行われることを特徴とする項目１８３に記載の方法。
（項目１８６）
Ｎ−アセチルグルコサミン源を水性で低沸点の一級または二級アルコール中に懸濁され
、その方法が、加水分解後、または再使用のために加水分解溶液を循環する前にアルコー
ルで生成したエステルを除去する工程（ａ）〜（ｂ）の間に追加工程を有することを特徴
とする項目１６９に記載の方法。
（項目１８７）
蒸留、フラッシングおよび濃縮でなる群から選ばれたプロセスで、大気圧以下で酢酸エ
ステルが除去されることを特徴とする項目１８６に記載の方法。
（項目１８８）
加水分解工程が約６０℃〜約１００℃の間の温度で行われることを特徴とする項目１
８６に記載の方法。
（項目１８９）
加水分解工程が１気圧で溶液の沸点で行われることを特徴とする項目１８６に記載の
方法。
（項目１９０）
塩酸と乾燥重量としてのＮ−アセチルグルコサミン源との比率が約３：１〜約５：１で
、約８０℃以下の温度で加水分解工程が行われることを特徴とする項目１６９に記載の
方法。
（項目１９１）
工程（ｃ）で回収されたグルコサミン塩酸塩を水混和性溶剤で洗浄する工程を有するこ
とを特徴とする項目１９０に記載の方法。
（項目１９２）
水混和性溶剤がメタノール、イソプロパノール、エタノール、アセトニトリル、アセト
ン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびジオキサ
ンでなる群より選ばれることを特徴とする項目１９１に記載の方法。
（項目１９３）
洗浄後の結晶化グルコサミン塩酸塩を約７０℃以下の温度で約６時間以下乾燥する工程
をさらに有することを特徴とする項目１９１に記載の方法。
（項目１９４）
乾燥工程が大気圧以下で行われることを特徴とする項目１９３に記載の方法。
（項目１９５）
乾燥工程が空気吹き付けで行われることを特徴とする項目１９３に記載の方法。
（項目１９６）
処理工程（ｂ）がＮ−アセチルグルコサミン源を脱アセチル化酵素と接触させ、グルコ
サミン製品を製造する工程を有することを特徴とする項目１５７に記載の方法。
（項目１９７）
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミンデ
アセチラーゼでなる群より脱アセチル化酵素が選ばれることを特徴とする項目１９６に
記載の方法。
（項目１９８）
脱アセチル化酵素が、Ｎ−アセチルグルコサミンモノマーを脱アセチル化しグルコサミ
ンを製造する様に修飾されたか、またはそのような能力についてキチンデアシラーゼであ
ることを特徴とする項目１９６に記載の方法。
（項目１９９）
結晶化で製造したグルコサミン製品を回収する工程をさらに有することを特徴とする請
求項１９６に記載の方法。
（項目２００）
沈殿で製造したグルコサミン製品を回収する工程をさらに含むことを特徴とする項目
１９６に記載の方法。
（項目２０１）
脱アセチル化酵素が基質に固定化されていることを特徴とする項目１９６に記載の方
法。
（項目２０２）
塩化ナトリウムまたは塩化カルシウム水溶液の存在でＮ−アセチルグルコサミン源を脱
アセチル化酵素と接触させる工程を、接触工程が有することを特徴とする項目１９６に
記載の方法。
（項目２０３）
結晶化または沈殿でグルコサミン製品を回収する工程をさらに有することを特徴とする
項目２０２に記載の方法。
（項目２０４）
アルコールの存在下、Ｎ−アセチルグルコサミン源を脱アセチル化酵素と接触させ、ア
ルコールをエステル化する工程を接触工程が有することを特徴とする項目１９６に記載
の方法。
（項目２０５）
塩をグルコサミン製品と混合し、その混合物をイオン交換媒体と接触させる工程をさら
に有することを特徴とする項目１９６に記載の方法。
（項目２０６）
塩が塩化物、燐酸塩、硫酸塩、沃素塩および亜硫酸塩でなる群より選ばれることを特徴
とする項目２０５に記載の方法。
（項目２０７）
ａ）グルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分
子で形質転換された微生物を、発酵培地中で培養する工程であって、組み換え核酸分子の
発現がラクトース誘導で制御され、発酵工程が
ｉ）グルコースを炭素源として含む培地中、約ｐＨ４．５〜約７のｐＨ、約２５℃〜
約３７℃の温度で微生物を生育させる工程と；
ｉｉ）それ以上のグルコースを添加せず、発酵培地にラクトースを添加して核酸配列
の転写を誘導する工程と；
ｉｉｉ）グルコースの存在で、約４．５〜６．７のｐＨ、約２５℃〜３７℃の温度で
工程（ｉｉ）の後に微生物発酵を行う工程と
を有する工程；および
ｂ）グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミンでなる群より選ばれた、培養工程で製
造された生成物を採集する工程、
を有する発酵によるグルコサミンの製造方法。
（項目２０８）
微量元素源を発酵工程（ｉｉｉ）に添加することを特徴とする項目２０７に記載の方
法。
（項目２０９）
微量元素が鉄を含むことを特徴とする項目２０８に記載の方法。
（項目２１０）
グルコースを炭素源として含む発酵培地中、約ｐＨ６．９で微生物を生育させる工程を
、工程（ｉｉ）が有することを特徴とする項目２０７に記載の方法。
（項目２１１）
工程（ｉｉ）の後にグルコースの存在下で、約４．５〜５のｐＨで微生物発酵を行う工
程を、工程（ｉｉｉ）が有することを特徴とする項目２０７に記載の方法。
（項目２１２）
工程（ｉｉ）の後にグルコースの存在で、ｐＨ約６．７で微生物発酵を行う工程を、工
程（ｉｉｉ）が有することを特徴とする項目２０７に記載の方法。

本発明の実施態様の他の態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸デアミナー
ゼの活性を減少する、少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。グルコサミン−６−燐酸デ
アミナーゼの活性を減少する遺伝子修飾には、微生物中のグルコサミン−６−燐酸デアミ
ナーゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全欠失または不活性化を含み得るが、
それらに限定されない。

本発明の実施態様のある態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸シンターゼ
の活性を増加する、少なくとも一つの遺伝子修飾を含む。ある態様では、微生物はグルコ
サミン−６−燐酸シンテターゼをコードする核酸配列を有する少なくとも一つの組み換え
核酸で形質転換される。この様なグルコサミン−６−燐酸シンターゼは、配列番号２、４
、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群より選択されるアミノ酸
配列と少なくとも約３５％同一、または少なくとも約５０％同一、または少なくとも約７
０％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ酵素活性を有するグルコサミン−６−燐酸シン
ターゼを含み得る。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸シンターゼは配列番号２、４
、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群より選択されるアミノ酸
配列を有する。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸シンターゼは野生型グルコサミン
−６−燐酸シンターゼと比較してグルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害を減少
する修飾を有する。この様なグルコサミン−６−燐酸シンターゼには配列番号４、６、８
、１０、１２および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含
み得るが、それに限定されない。また別な態様では、この微生物はグルコサミン−６−燐
酸デアミナーゼの活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾をさらに有する。グルコサ
ミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する遺伝子修飾は、微生物中のグルコサミン−
６−燐酸デアミナーゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性
化を含み得るが、これらに限定されない。

本発明の他の実施態様は、（ａ）グルコース−６−燐酸デアミナーゼの活性を増加する
少なくとも一つの遺伝子修飾を有する微生物を醗酵培地中で培養する工程、および（ｂ）
グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコ
サミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、およびＮ−アセチルグルコサ
ミンからなる群より選択される培養工程で生産された生成物を回収する工程を有する醗酵
により、グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを製造する方法に関する。本態様
では、遺伝子修飾により微生物によるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの過剰発現、
グルコサミン−６−燐酸の酵素活性の増加、グルコサミン−６−燐酸の生成量を増加させ
るグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆反応の増加、グルコサミン−６−燐酸の生成
量を減少させるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの正反応の減少、グルコサミン−６
−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの親和性の減少、およびグルコサミ
ン−６−燐酸デアミナーゼのグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少からなる群より選
択される結果が得られることが好ましい。ある態様では、微生物がグルコーサミン−６−
燐酸デアミナーゼをコードする配列を有する組み換え核酸分子で形質転換される。ある態
様では、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードするアミノ酸配列は、グルコーサ
ミン−６−燐酸デアミナーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する
。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼは配列番号４２と、少なくとも約
３５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列
を有し、そのグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼは酵素活性を有する。ある態様では、
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼはアミノ酸配列番号４２を有する。

本実施態様のある態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸シンテターゼの活
性を減少する遺伝子修飾を有する。例えば、グルコサミン−６−燐酸シンテターゼの活性
を減少する遺伝子修飾は微生物中でグルコサミン−６−燐酸シンテターゼをコードする内
在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含み得るが、それに限定されない
。

本実施態様の他の態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼの活性を増加する遺伝子修飾を有する。遺伝子修飾によりグルコサミン−
６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの酵素活性の増加、微生物によるグルコサミン
−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの過剰発現、グルコサミン−６−燐酸Ｎ−ア
セチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少、お
よびグルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェ
ラーゼの親和性の増加からなる群より選択される結果が得られる。ある態様では、先の本
明細書の実施態様で説明した様に、微生物がグルコサミン−６−燐酸Ｎ−アセチルトラン
スフェラーゼをコードする核酸を含む組み換え核酸分子で形質転換される。グルコサミン
−６−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの様々な態様が先行する実施態様に記載され
、本明細書に組み込まれる。ある態様では、微生物はさらにグルコサミン−６−燐酸シン
テターゼの活性を減少する遺伝子修飾を有する。この様な修飾は微生物中でグルコサミン
−６−燐酸シンテターゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活
性化を含み得るが、それに限定されない。

本実施態様のさらに別な態様では、微生物はグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼの活性を増加する遺伝子修飾をさらに有する。この遺伝子修飾はグルコサ
ミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの高
活性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性の減
少、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性の微生物による過剰発
現、グルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェ
ラーゼの親和性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミンに対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−
アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフ
ェラーゼの親和性の減少、およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラー
ゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少からなる群より選択される結
果を与え得る。ある態様では、微生物は２元活性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）グルコサ
ミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチル−１−燐酸ウリジルトラ
ンスフェラーゼを有し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性が
増加する。他の態様では、微生物がグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラ
ーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする組
み換え核酸分子、またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコー
ドする組み換え核酸分子で形質転換される。ある態様では、グルコサミン−１−燐酸アセ
チルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラ
ーゼ、またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸
配列は、グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミ
ン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルト
ランスフェラーゼそれぞれの活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。他の
態様では、グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼはアミノ酸配列番号５６と約３５％同一であ
るアミノ酸配列を有し、かつ酵素活性を有する。他の態様では、グルコサミン−１−燐酸
アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフ
ェラーゼはアミノ酸配列番号５６を有する。他の態様では、切断グルコサミン−１−燐酸
アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフ
ェラーゼはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ
酸配列番号５８と少なくとも約３５％同一であるアミノ酸配列を有する短縮型グルコサミ
ン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジ
ルトランスフェラーゼを含むがそれに限定されないＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸
ウリジルトランスフェラーゼ活性が減少しているか、その活性がない。ある態様では、切
断グルコサミン−１−燐酸アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１
−燐酸ウリジルトランスフェラーゼはアミノ酸配列番号５８を有する。本態様では、上記
の様に微生物はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼの活性を減少する遺伝子修飾をさら
に有する。

本発明のさらに別な実施態様は、（ａ）グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を
減少する少なくとも一つの遺伝子修飾と、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランス
フェラーゼの活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する微生物を醗酵培地中で
培養する工程、および（ｂ）培養工程で生産される、グルコサミン−６−燐酸、グルコサ
ミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−６−燐酸、およびＮ−アセチルグルコサミンでからなる群より選択される生
成物を採集する工程を有する醗酵によるＮ−アセチルグルコサミン製造法に関する。ある
態様では、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する遺伝子修飾は、微生物
中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全
な欠失または不活性化を含む。他の態様では、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼの活性を増加する遺伝子修飾により、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチ
ルトランスフェラーゼの酵素活性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジル
トランスフェラーゼ活性の減少、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラー
ゼ活性を有する酵素の微生物による過剰発現、グルコサミン−１−燐酸に対するグルコサ
ミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−
アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの親和性の減少、およびグ
ルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１
−燐酸生成物阻害の減少からなる群より選択される結果が得られる。この様な２元活性グ
ルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１
−燐酸ウリジルトランスフェラーゼは上記先行実施態様に記載され、本明細書にも採用さ
れる。

本実施態様のある態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼを増加する
少なくとも一つの遺伝子修飾をさらに有する。この様な修飾の様々な態様は先行実施態様
に記載され、本明細書に採用される。

本発明のさらに別な実施態様は（ａ）内在性グルコサミン−６−燐酸アセチルトランス
フェラーゼと、グルコサミン−６−燐酸シンテターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺
伝子修飾を有する微生物を醗酵培地中で培養する工程、および（ｂ）グルコサミン−６−
燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より
選択される、培養工程で製造される生成物を回収する工程を有するＮ−アセチルグルコサ
ミンの製造法に関する。ある態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼを
コードする核酸配列を有する少なくとも一つの組み換え核酸分子で形質転換される。この
修飾の様々な態様が上記に記載され、本明細書に包含される。ある態様では、微生物は上
記に記載された様なグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する遺伝子修飾をさ
らに有する。ある態様では、その方法は醗酵でＮ−アセチルグルコサミンを製造する方法
であって、回収する工程はＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、培養工程で
生産される生成物を回収する工程を含む。

上記実施態様の何れか一つの態様では、上記組み換え核酸分子の何れか一つの発現は、
ラクトース等により誘導可能であるが、それに限定されない。ある態様では、微生物はラ
クトースによる転写誘導阻害を減少する遺伝子修飾をさらに有する。この様な遺伝子修飾
にはＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする遺伝子の部分的または完全な欠失また
は不活性化を含み得るが、それに限定されない。

醗酵によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造法に関連する本発明の
上記実施態様の何れかで、以下の議論が当てはめられる。ある態様では、培養工程には醗
酵培地中の炭素源を約０．５％〜約５％の濃度に保つ工程が含まれる。他の態様では、培
養工程は酵母抽出物を含む醗酵培地中で行われる。また別な態様では、培養工程はグルコ
ース、フラクトース、ペントース糖、ラクトースおよびグルコン酸からなる群より選択さ
れる炭素源を含む醗酵培地中で行われる。ペントース糖にはリボース、キシロースおよび
アラビノースが含まれるがそれに限定されない。他の態様では、培養工程はグルコースお
よびリボースを含む醗酵培地中で行われ、他の態様では培養工程はグルコースおよびグル
コン酸を含む醗酵培地中で行われる。ある態様では、培養工程は約２５℃〜４５℃の温度
で、他の態様では約３７℃で行われる。ある態様では、培養工程は約ｐＨ４〜約ｐＨ７．
５で、他の態様では約ｐＨ６．７〜７．５で、さらに別な態様では約ｐＨ４．５〜５で行
われる。

醗酵法によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造法の任意の上記実施
態様で、微生物には以下の少なくとも１種の修飾を含み得る。ある態様では、微生物には
微生物中でホスホグルコイソメラーゼ活性を増加する遺伝子修飾がさらに含まれる。例え
ば、アミノ酸配列番号１０５を有するホスホグルコイソメラーゼをコードする核酸配列を
有するホスホグルコイソメラーゼを含む組み換え核酸で、微生物を形質転換することがで
きる。他の態様では、微生物中でさらにホスホフラクトキナーゼが部分的に欠失または完
全に不活性化されている。他の態様では、微生物はさらにグルタミンシンテターゼ活性が
増加する遺伝子修飾を有する。例えば、アミノ酸配列番号８９を有するグルタミンシンテ
ターゼを含むグルタミンシンテターゼをコードする核酸配列を有する組み換え核酸分子で
、微生物を形質転換することができる。他の態様では、微生物はグルコース−６−燐酸デ
ヒドロゲナーゼ活性を増加する遺伝子修飾をさらに含むことができる。例えば、アミノ酸
配列番号９５を有する、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を
有する組み換え核酸分子で、微生物を形質転換することができる。他の態様では、ＡＤＰ
−グルコースピロホスホリラーゼ、グリコーゲンシンターゼまたは分枝酵素を含むがそれ
に限定されない、微生物中でグリコーゲン合成を担う酵素をコードする遺伝子の部分的ま
たは完全な欠失または不活性化を微生物はさらに含み得る。上記修飾の何れも微生物のガ
ラクトース代謝を阻害しないことが好ましい。

醗酵によるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン製造法の上記実施態
様の何れにおいても、採集工程には微生物から細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサ
ミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１
−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはグルコサミンからなる群より選択される細胞内
生成物を回収する工程、または醗酵培地からグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミ
ンからなる群より選択される細胞外生成物を回収する工程が含まれる。ある態様では、こ
の工程には（ａ）グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択され
る生成物を精製する工程、（ｂ）微生物から、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−
１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−
燐酸からなる群より選択される生成物を回収する工程、（ｃ）グルコサミン−６−燐酸お
よびグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択される生成物を脱燐酸化し、グルコサミ
ンを生産する工程、（ｄ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグル
コサミン−１−燐酸からなる群より選択される生成物を脱燐酸化し、Ｎ−アセチルグルコ
サミンを生産する工程、（ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−
６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択される生成物を
処理し、グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸からなる
群より選択されるグルコサミン製品を製造する工程する工程から選ばれる工程が含まれる
。ある態様では、工程（ｅ）はＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−
６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択される生成物を
、酸および加熱条件または酵素的脱アセチル化により加水分解工程が含まれる。ある態様
では、Ｎ−アセチルグルコサミン含有固体を醗酵ブロスから沈殿させて、醗酵法で生産さ
れたＮ−アセチルグルコサミンを回収する。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン含
有固体を醗酵ブロスから結晶化して、醗酵法で生産されたＮ−アセチルグルコサミンを回
収する。

本発明の他の実施態様は、遺伝子修飾された上記微生物の任意の何れかに関連する。

上記の実施態様の何れか一つにおける遺伝子修飾した微生物にはバクテリアと菌類より
選ばれる。適当なバクテリアにはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからなる
属より選択される種由来のバクテリアが含まれるが、それに限定されない。適当なバクテ
リアにはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ
、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔｒｅｐｒｏｍｙｃｅｓｌｉ
ｖｉｄａｎｓからなる種より選択される種由来のバクテリアがさらに含まれるが、それに
限定されない。適当な酵母にはＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅ
ｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｈａｆｆｉａからなる群よ
り選択される属由来の酵母が含まれるが、それに限定されない。適当な酵母にはＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ． ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｕｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓおよびＰｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａからなる群よ
り選択される種由来の酵母が含まれるが、それに限定されない。適当な真菌類にはＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒ
ａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａからなる群より選択される属由来の真菌類が含まれるが
、それに限定されない。適当な真菌類にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎ
ｉｄｕｌａｎｓ、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｒｈｉｚｐｐｕｓｏｒｙｚａｅ、
Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓ
ｓａ、Ｎ． ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍｒｅｅｓｅｉからなる群
より選択される種由来の真菌類が含まれるが、それに限定されない。

本発明のさらに別な実施態様は、（ａ）醗酵生産物である可溶化Ｎ−アセチルグルコサ
ミンを含む醗酵ブロスを得る工程、および（ｂ）醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミ
ン含有固体を回収する工程を含む、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造法に関する。ある態
様では、その方法には醗酵ブロスから細胞物質を除去する工程がさらに含まれる。ある態
様では、その方法には醗酵ブロスを脱色する工程がさらに含まれる。この様な脱色工程に
はＮ−アセチルグルコサミンの繰り返し結晶化、活性炭処理、およびクロマトグラフィー
による脱色が含まれるが、それに限定されない。ある態様では、その方法には醗酵ブロス
をイオン交換樹脂に接触させる工程が含まれる。例えば、醗酵ブロスをイオン交換樹脂に
接触させる工程には、醗酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂に接触させ
る工程が含まれるが、それに限定されない。醗酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオ
ン交換樹脂に接触させる工程には、醗酵ブロスを陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹
脂の混合床に接触させる工程が含まれる。

本発明のある実施態様では、回収工程はＮ−アセチルグルコサミン含有固体を醗酵ブロ
スから沈殿する工程が含まれる。

本実施態様のある態様では、回収工程には醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンを
結晶化する工程が含まれる。

本実施態様のある態様では、回収工程は可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンを含む醗酵ブ
ロスの濃縮工程が含まれる。ある態様では、濃縮工程は大気圧以下で行われる。他の態様
では、濃縮工程は膜分離で行われる。他の態様では、濃縮工程は約４０℃〜約７５℃の間
の温度で行われる。他の態様では、濃縮工程は約４５℃〜約５５℃の間の温度で行われる
。他の態様では、濃縮工程は醗酵ブロス中の固体含有量が少なくとも約３０％になる様に
行われる。他の態様では、濃縮工程は醗酵ブロス中の固体含有量が少なくとも約４０％に
なる様に行われる。他の態様では、濃縮工程は醗酵ブロス中の固体含有量が少なくとも約
４５％になる様に行われる。他の態様では、濃縮工程は濃縮後の醗酵ブロスを冷却する工
程が含まれる。例えば、醗酵ブロスを約−５℃〜約４５℃の間の温度に冷却し、他の態様
では約−５℃からほぼ室温の間の温度に、または他の態様ではほぼ室温に冷却する。

濃縮工程の他の態様には、冷却工程後にＮ−アセチルグルコサミンの結晶を醗酵ブロス
の種結晶とする工程がさらに含まれる。ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミンの種結
晶は醗酵ブロス中の核生成で形成されたＮ−アセチルグルコサミン結晶、または外部から
提供したＮ−アセチルグルコサミン結晶でなる群から選ばれる。

本実施態様の様々な態様の任意の態様で、回収工程にはＮ−アセチルグルコサミンを水
混和性溶剤に接触させる工程が含まれる。水混和性溶剤にはイソプロピルアルコール（Ｉ
ＰＡ）、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチ
ルホルムアミド、ジオキサンおよびアセトニトリルが含まれるが、それに限定されない。

本実施態様の様々な態様の任意の態様で、回収法には回収されたＮ−アセチルグルコサ
ミン含有固体を乾燥する工程が含まれる。この工程には乾燥されたＮ−アセチルグルコサ
ミン含有固体を水混和性溶剤で洗浄する工程が含まれる。

本実施態様の様々な態様の任意の態様で、回収法には回収されたＮ−アセチルグルコサ
ミン含有固体を溶解してＮ−アセチルグルコサミン溶液を作成し、その溶液からＮ−アセ
チルグルコサミン含有固体を回収する工程が含まれる。

本実施態様の様々な態様の任意の態様で、回収法にはさらに醗酵ブロスを濾過してバク
テリア外毒素を除去する工程が含まれる。

本発明のさらに別な実施態様は、（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグル
コサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸からなる群より選択され
るＮ−グルコサミン源を得る工程、および（ｂ）（ａ）のＮ−アセチルグルコサミン源を
処理して、グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸からな
る群より選択されるグルコサミン製品をＮ−アセチルグルコサミン源から生産する工程を
含む、Ｎ−アセチルグルコサミン源からグルコサミンを製造する別な方法に関する。ある
態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源はその中の乾燥固体の割合として少なくとも約４
０％のＮ−アセチルグルコサミンを含む。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源は
醗酵法で生産されたＮ−アセチルグルコサミンである。また別な実施態様では、Ｎ−アセ
チルグルコサミン源は醗酵法で生産されたＮ−アセチルグルコサミンを含む醗酵ブロスで
あって、その醗酵ブロスは細胞物質を実質的に除去する様に処理されている。他の態様で
は、Ｎ−アセチルグルコサミン源は固体または溶液中に存在する。他の態様では、Ｎ−ア
セチルグルコサミン源は水性、低沸点第一級または第二級アルコール中に懸濁される。

本実施態様のある態様では、処理工程（ｂ）はＮ−アセチルグルコサミン源を酸および
加熱条件で加水分解する工程を含む。ある態様では、加水分解工程は約６０℃〜約１００
℃の温度で行われる。他の態様では、加水分解工程は約７０℃〜約９０℃の温度で行われ
る。他の態様では、加水分解工程は約１０重量％〜約４０重量％の濃度の塩酸を使用して
行われる。他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミンの純粋な乾燥重量に対する塩酸の重
量の比は約１：１〜５：１である。他の態様では、加水分解工程は約１０分〜約２４時間
行われる。

ある態様では、加水分解工程は（ａ）加熱条件下でＮ−アセチルグルコサミン源と塩酸
溶液を組み合わせて、または加水分解母液を循環して、グルコサミン塩酸塩を含む溶液を
製造する工程、（ｂ）溶液（ａ）を冷却してグルコサミン塩酸塩を沈殿させる工程、およ
び（ｃ）工程（ｂ）から沈殿したグルコサミン塩酸塩を含む固体を回収する工程を含む。
ある態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源を塩酸溶液と連続的に混合して、または加水
分解母液を循環させてＮ−アセチルグルコサミン源を溶液に保ち、次いで加熱条件下で無
水塩酸を溶液（ａ）に加えて加水分解を開始し、Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミ
ン塩酸塩に転換することで加水分解工程（ａ）が行われる。他の態様では、加水分解母液
は工程（ｃ）で沈殿したグルコサミン塩酸塩を回収後に残留する加水分解溶液であって、
加水分解工程が行われる前、加水分解工程中、または加水分解工程後に第一級または第二
級アルコールが添加される。この様な第一または第二アルコールにはメタノール、エタノ
ール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノールおよびｓｅｃ−ブタノールが含まれるが、それ
に限定されない。ある態様では、冷却工程は溶液が約−５℃〜約４０℃になるまで行われ
る。

他の態様では、回収工程は（ｉ）グルコサミン塩酸塩含有固体を回収する工程、（ｉｉ
）グルコサミン塩酸塩含有固体を水混和性溶剤で洗浄する工程、および（ｉｉｉ）グルコ
サミン塩酸塩含有固体を乾燥する工程を含む。

また別な態様では、回収工程は（ｉ）グルコサミン塩酸塩含有固体を回収する工程、（
ｉｉ）工程（ｉ）由来の固体を水に溶解して溶液を形成する工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ
）の溶液のｐＨを２．５〜４の間に調節する工程、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の溶液を活性
炭に接触させてグルコサミン塩酸塩含有固体を脱色する工程、（ｖ）工程（ｉｖ）の溶液
から活性炭を除去する工程、および（ｖｉ）工程（ｖ）の溶液からグルコサミン塩酸塩を
結晶化する工程を含む。この態様では、結晶化工程はグルコサミン塩酸塩を約７０℃以下
の温度で濃縮する工程を含む。ある態様では、結晶化工程はグルコサミン塩酸塩を約５０
℃以下の温度で濃縮する工程を含む。他の態様では、結晶化工程はグルコサミン塩酸塩を
大気圧以下で濃縮する工程を含む。他の態様では、その方法は結晶化工程（ｖｉ）からそ
の後の回収工程（ｉ）後に残留する溶液を循環する工程をさらに含む。他の態様では、そ
の方法は結晶化工程（ｖｉ）からその後の結晶化工程後に残留する溶液を循環する工程を
さらに含む。この態様では、その方法は、メタノール、イソプロパノール、エタノール、
アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホル
ムアミドおよびジオキサンを含むがそれに限定されない、水混和性溶剤で、工程（ｖｉ）
由来の結晶化グルコサミン塩酸塩を洗浄する工程を含み得る。ある態様では、その方法は
洗浄後の結晶化グルコサミン塩酸塩を約７０℃以下の温度で約６時間乾燥する工程をさら
に含む。乾燥工程は大気圧以下で行い得る。ある態様では、乾燥工程は空気吹き付けで行
われる。

本実施態様の他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン源を水性低沸点第一級または第
二級アルコールに懸濁するが、その方法は加水分解後にアルコールで生成した酢酸エステ
ルを除去する工程（ａ）および（ｂ）の間、または加水分解溶液を再利用のため循環する
前に別な工程を有する。ある態様では、酢酸エステルは大気圧以下で蒸留、フラッシュお
よび濃縮からなる群より選択される方法で除去される。他の態様では、加水分解工程は約
６０℃〜約１００℃の間の温度で行われる。他の態様では、加水分解工程は１気圧におけ
る溶剤沸点で行われる。他の態様では、加水分解工程はＮ−アセチルグルコサミン乾燥重
量に対して塩酸溶液の比率が重量比約３：１〜約５：１、および約８０℃以下の温度で行
われる。ある態様では、その方法は工程（ｃ）で回収されたグルコサミン塩酸塩を水混和
性溶剤で洗浄する、および／または結晶化グルコサミン塩酸塩を上記の様に乾燥する工程
をさらに含む。

本発明の本実施態様のまた別な態様では、処理工程（ｂ）はＮ−アセチルグルコサミン
源を脱アセチルグルコサミン化酵素と接触させてグルコサミン製品を製造する工程を含む
。この様な脱アセチルグルコサミン化酵素にはＮ−アセチルグルコサミンモノマーを脱ア
セチル化してグルコサミンを製造する様に修飾されているかまたはその能力について選択
されたＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンデ
アセチラーゼ、および／またはキチンデアセチラーゼが含まれるが、それに限定されない
。ある態様では、グルコサミン製品は結晶化で製造される。ある態様では、その方法には
沈殿でグルコサミン製品を回収する工程が含まれる。ある態様では、脱アセチル化酵素は
基質に固定化される。ある態様では、接触工程はＮ−アセチル源を塩化ナトリウムまたは
カルシウム水溶液中で脱アセチル化酵素に接触させる工程を有する。この態様では、その
方法にはさらに結晶化または沈殿によりグルコサミン製品を回収する工程が含まれる。あ
る態様では、接触工程にはＮ−アセチルグルコサミン源をアルコール中で脱アセチル化酵
素に接触させ、アルコールをエステル化する工程が含まれる。他の態様では、その方法に
は塩化物、燐酸塩、硫酸塩、沃化物および亜硫酸塩捕含むが、それに限定されない塩をグ
ルコサミンと混合し、混合物をイオン交換媒体と接触させる工程がさらに含まれる。

本発明のさらに別な実施態様は、（ａ）グルコサミン−６−燐酸シンテターゼをコード
する核酸配列を有する組み換え核酸分子で形質転換体された微生物を、醗酵培地中で培養
する工程を有する醗酵によるグルコサミンの製造法であって、培養工程は（ｉ）グルコー
スを炭素源として含み、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ７、約２５℃〜約３７℃の温度で醗酵培地
中で微生物を生育させる工程、（ｉｉ）培地にそれ以上のグルコースを添加せず、ラクト
ースを醗酵培地に添加することにより、核酸配列の転写を誘導する工程、（ｉｉｉ）約４
．５〜６．７のｐＨ、約２５℃〜３７℃の温度で工程（ｉｉ）後にグルコースを加えて微
生物を培養する工程、および（ｂ）グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミンでなる群
より選ばれた、培養工程で生産された生成物を回収する工程を有する製造法に関する。あ
る態様では、鉄を含むがそれに限定されない微量元素源を醗酵工程（ｉｉｉ）で添加する
。ある態様では、工程（ｉｉ）はｐＨ約６．９でグルコースを炭素源として含む醗酵培地
中で微生物を生育させる工程を含む。ある態様では、工程（ｉｉｉ）は約ｐＨ４．５〜５
でグルコースを加えて工程（ｉｉ）後に微生物を培養する工程を有する。ある態様では、
工程（ｉｉｉ）は約ｐＨ６．７でグルコースを加えて工程（ｉｉ）後に微生物を培養する
工程を有する。

図１は組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるグルコサミンの生合成と代謝経路の模式図である。 図２は組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるグルコサミンとＮ−アセチルグルコサミンの過剰生産経路の新規修飾の模式図である。 図３はグルコースからグルコサミンへの経路および他の競合経路の概要である（Ｐｇｉ＝ホスホグルコイソメラーゼ；Ｐｇｍ＝ホスホグルコムターゼ；Ｐｆｋ＝ホスホフラクトキナーゼ；Ｚｗｆ＝グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ；ＧｌｍＳ＝グルコサミン−６−Ｐシンテターゼ；ホスファターゼ＝グルコサミン−６−燐酸の加水分解に拘わるホスファターゼ活性） 図４は組み換えＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＧｌｍＳ酵素活性に対するグルコサミン−６−燐酸の影響を示すグラフである。 図５は低レベルグルコサミン−６−燐酸における様々なＣｌｍＳタンパク質のグルコサミンシンテターゼ活性を示すグラフである。 図６は振盪フラスコ培養における酵素活性の経時変化を示すグラフである。 図７は振盪フラスコ中の異なった条件でラクトースにより誘導されたグルコサミン生産レベルを示す棒グラフである（ラクトース誘導株は７１０７−１６、および対照株は２１２３−５４）。 図８は初期生育期後にラクトースにより誘導された細胞培養におけるグルコサミン生産への微量元素の効果を示す線グラフである。 図９は培養器中のグルコサミン生産に対する燐酸レベルおよび鉄供給の効果を示す線グラフである。 図１０は異なったｐＨにおける２０ｇ／リッター濃度のグルコサミンの生育曲線を示す線グラフである。 図１１は異なった環境条件下の１リッター培養器中の２１２３−５４株によるグルコサミン生産を示す線グラフである。 図１２は異なったｐＨにおけるグルコサミン分解を示す線グラフである。 図１３はＭ９Ａ培地中（グルコースなし）のＮ−アセチルグルコサミンの安定性を示す線グラフである。安定性は二つのＮ−アセチルグルコサミン濃度（４０および８０ｇ／リッター）と二つのｐＨ（５．５および７．０）で試験された。 図１４はＮ−アセチルグルコサミン生産の別な経路の概要である。 図１５はホスホグルコイソメラーゼ活性（Ｐｇｉ）に対する燐酸化アミノ糖の効果を示す線グラフである。 図１６はグルコース−６−デヒドロゲナーゼに対する燐酸化アミノ糖の効果を示す線グラフである。 図１７はＮ−アセチルグルコサミン醗酵中の酵素活性レベルを示す線グラフである。 図１８は振盪フラスコ実験におけるＮ−アセチルグルコサミン生産に対するペントースおよびグルコネートの効果を示す線グラフである。 図１９は培養器中の初期および後期ＩＰＴＧ誘導を伴う＃７１０７−８７＃２５によるＮ−アセチルグルコサミン生産を示す線グラフである。 図２０はＮ−アセチルグルコサミン生産に対する亜鉛および鉄濃度の効果、特に亜鉛除去の有益な効果を示す線グラフである。 図２１はＮ−アセチルグルコサミン（Ｍ９Ａ培地中１０ｇ／リッター）の酸／熱加水分解を示す線グラフである。 図２２は酸／熱加水分解でのグルコサミン（Ｍ９Ａ培地中１０ｇ／リッター）の安定性を示す線グラフである。 図２３は０．１Ｎ塩酸を用いる、異なった温度におけるＮ−アセチルグルコサミン（Ｍ９Ａ培地中１０ｇ／リッター）の加水分解を示す線グラフである。 図２４は９０℃におけるＮ−アセチルグルコサミン／グルコサミンの加水分解を示す線グラフである。 図２５は９０℃におけるＮ−アセチルグルコサミン／グルコサミンからのアンモニア生成を示す線グラフである。

（発明の詳細な説明）
本発明はグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン生産のための生合成法に関する
。この様な方法にはグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを製造するた
めの遺伝子修飾した微生物の醗酵工程が含まれる。本発明はまた、グルコサミンおよびＮ
−アセチルグルコサミン生産に有用な遺伝子修飾した微生物に関する。さらに、本発明は
高純度でＮ−アセチルグルコサミンを得る方法を含む、醗酵法で製造したＮ−アセチルグ
ルコサミンの回収法に関する。本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミンからグルコサミ
ンを製造する方法に関する。本発明以前に、Ｎ−アセチルグルコサミンはグルコサミンの
アセチル化により製造されており、従ってＮ−アセチルグルコサミンから市場で有用なグ
ルコサミンを製造する方法が報告されているとも、その方法が商業的に実施可能であると
も考えられていなかった。本発明は全く天然の生物学的方法によるＮ−アセチルグルコサ
ミンの直接生産を最初に示すものである。

具体的には、本発明は全体として微生物醗酵によるグルコサミンおよびＮ−アセチルグ
ルコサミンの製造法に関するものである。その方法にはアミノ糖代謝経路に遺伝子修飾を
有する微生物を醗酵培地中で培養する第一工程を含み、その代謝経路にはグルコサミン−
６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、またはＮ−
アセチルグルコサミン−１−燐酸を他の化合物に変換する経路；グルコサミン−６−燐酸
、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸またはＮ−アセチルグ
ルコサミン−１−燐酸を合成する経路；グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコ
サミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、
またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を微生物の外へ輸送する経路；グルコサミン
またはＮ−アセチルグルコサミンを微生物内へ輸送する経路；およびグルコサミン−６−
燐酸の生産に関与する基質と競合し、細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１
−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、
Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミン、および／または細胞外グルコサ
ミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを含む生成物を微生物から生産する経路が含まれる
。その方法には細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンおよび／またはグルコサミンを微生物から回収、および／または細胞グルコサミンま
たはＮ−アセチルグルコサミンを醗酵培地から回収して生成物を採集する第二工程が含ま
れ、その工程には回収と精製工程が含まれる（以下に詳細に定義され議論される）。本発
明の醗酵プロセスから回収されるＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン
−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸は、本明細書記載の方法を用いて
脱アセチルグルコサミン化され、グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサ
ミン−１−燐酸が製造される。

本発明の醗酵によるグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの新規製造法は安価
であり、現在の方法で製造されるグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの収率を
越える収率でグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンを製造し得る。さらに、本明
細書に記載の遺伝子修飾された微生物を使用することにより、本発明の方法を特定の問題
に適応し、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生産比率を変える必要性に容
易に変更することができる。さらに、本発明に記載の方法と材料を当業者が使用および／
または変更し、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ポリグルコサミン、ガラクトサミン、
マンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびその誘導
体等の他のアミノ糖を製造することができる。

アミノ糖であるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびグルコサミン（Ｇｌ
ｃＮ）は、主要な高分子、特に糖結合体（すなわち共有結合で結合したオリゴ糖鎖を含む
高分子）の生合成の前駆体であるため、微生物で基本的に重要な分子である。例えば、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉではＮ−アセチルグルコサミンとグルコサミンは細胞外被
の二つの高分子、ペプチドグリカンとリポ多糖の前駆体である。ペプチドグリカンまたは
リポ多糖の生合成を妨害する突然変異は致命的であり、細胞外被の一体性を喪失し、最終
的には溶菌を生じる。

本明細書で用いられるグルコサミン、Ｄ−ガラクトサミンおよびＮ−グルコサミンとい
う用語は相互に交換して用いることができる。同様に、グルコサミン−６−燐酸とＮ−グ
ルコサミン−６−燐酸という用語は互換的に用いられ、グルコサミン−１−燐酸とＮ−グ
ルコサミン−１−燐酸という用語も互換的に用いられる。グルコサミン、グルコサミン−
６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸はそれぞれＣｌｃＮ、ＧｌｃＮ−６−ＰおよびＧ
ｌｃＮ−１−Ｐと略記することができる。Ｎ−アセチルグルコサミンは２−アセトアミド
−２−デオキシ−Ｄ−グルコースとも呼ばれる。Ｎ−アセチルグルコサミンはＮ−アセチ
ルグルコサミドと書くこともできる。グルコサミンとその誘導体と同様に、Ｎ−アセチル
グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−
１−燐酸という用語は、それぞれＧｌｃＮＡｃ（またはＤ−ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｉｃＮ
−６−ＰおよびＧｌｉｃＮ−１−Ｐと略記することができる。Ｎ−アセチルグルコサミン
はＮＡＧとも略記できる。

本明細書で上記で同定したグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン製品の製造に
関連するアミノ糖の代謝経路における酵素を参照する。アミノ糖はサッカライドのアミノ
誘導体（例えばヒドロキシル基の代わりにアミノ基を有するサッカライド）である。本発
明によれば、アミノ糖代謝経路とは、アミノ糖の生合成、同化作用または異化作用に関与
する、または含まれる任意の生化学経路である。本明細書で用いる場合、アミノ糖代謝経
路には、アミノ糖とその前駆体の細胞内へ、および細胞外からの輸送に関与する経路が含
まれ、またアミノ糖の生合成または異化作用に関与する物質と競合する生化学経路も含ま
れ得る。例えば、最初に形成されたアミノ糖の一つに対する直接前駆体は、フルクトース
−６−燐酸（Ｆ−６−Ｐ）であり、生化学反応（グルコサミンシンターゼで触媒される）
またはアンモニウムとの生化学反応（グルコサミンデアミナーゼで触媒される）でグルコ
サミン−６−燐酸を生成する。フルクトース−６−燐酸も解糖経路の中間体である。従っ
て、解糖経路は、基質であるフルクトース−６−燐酸について競合することにより、グル
コサミン−６−燐酸生合成経路と競合する。さらに、グルコサミン−６−燐酸を他のアミ
ノ糖に変換し、一連の生化学反応により様々な高分子中の構成要素を形成することができ
る。この様にして、解糖経路であるフルクトース−６−燐酸／グルコサミン−６−燐酸経
路はグルコサミン−６−燐酸の生合成が影響を与える程度まで、グルコサミン−６−燐酸
／高分子生合成経路はすべて、本発明ではアミノ糖代謝経路であると考えられる。

グルタミン合成の経路および代謝がグルタミンの利用可能性（グルコサミン−６−燐酸
合成のアミノ供与体）を決定し、従ってグルコサミン−６−燐酸の生合成に影響する。従
って、これら全ての経路は本発明ではアミノ糖代謝経路と考えられる。グルコサミン−６
−燐酸からのＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸の合成、およびグルコサミン−１−燐
酸からのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸の合成には、クレブスサイクルの基質でも
あるアセチルＣｏＡの供給が必要である。従って、クレブスサイクルはＮ−アセチルグル
コサミン合成経路と、基質であるアセチルＣｏＡについて競合する。この様にして、アセ
チルＣｏＡの合成および代謝の経路はＮ−アセチルグルコサミン生合成に影響し、本発明
ではアミノ糖代謝経路であると考えられる。

様々な微生物では、アミノ糖代謝経路の多くが明らかになっている。特に、グルコサミ
ンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生合成および異化作用、ならびにその燐酸化誘導体
に対する経路がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで明らかになっている。これらの経路
にはこれらのアミノ糖を炭素源として利用するための複数の輸送系が含まれる。Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるアミノ糖の輸送、異化作用および生合成に直接関連す
る酵素およびタンパク質をコードする遺伝子がクローン化され配列決定されている。さら
に、アミノ糖代謝の実質的に全ての工程が妨害されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
の変異株が単離されている。

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのアミノ糖代謝の既知の経路が図１に示される。米
国特許第６，３７２，４５７号は、あらゆる既知の野生型および変異体の微生物のグルコ
サミン生産能をはるかに越えるグルコサミン生産能を有する、グルコサミン生産微生物を
初めて記載した。米国特許第６，３７２，４５７号に開示される様に、異化作用経路のい
くつかの工程は遺伝子不活性化により妨害され（十字により示す）、ＧｌｃＮ−６−Ｐの
合成を触媒する酵素ＧｌｃＮ−６−Ｐシンターゼが組み替え宿主細胞中で過剰発現された
（太線で示す）。本発明は米国特許第６，３７２，４５７号に記載されないグルコサミン
の生産に対する新規醗酵プロセスを提供するが、それには生産微生物の遺伝子修飾、なら
びにグルコサミン生産に対し米国特許第６，３７２，４５７号に記載されない遺伝子修飾
の組み合わせも記載される。本発明はまた、Ｎ−アセチルグルコサミンの生産に対する微
生物の遺伝子修飾および醗酵プロセスの最初の記載であると確信する。

以下に詳細に議論する様に、アミノ糖代謝経路に関与する経路および遺伝子の多くが解
明されているが、多くの可能な遺伝子修飾のどれが、商業的に有意な量のＮ−アセチルグ
ルコサミンを生産し得る微生物を作製するのに必要であるかは本発明の前には知られてい
なかった。その上、本明細書に記載される様なグルコサミンの生産に対する新規の遺伝子
修飾およびその組み合わせは以前には分かっていなかった。実際、本明細書に記載するグ
ルコサミンの生産に対する遺伝子修飾のあるものは、グルコサミン生産の醗酵法の以前の
開示である、前出の米国特許第６，３７２，４５７号に記載された内容と相反している。

微生物Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのアミノ糖代謝経路を、本発明の特定の実施
態様とする。グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの過剰生産に対して
、本発明で開示されたアミノ糖代謝経路の遺伝子修飾の主な態様が図２に示される。図２
では、本発明で検討される遺伝子工学による代謝フラックスの発生および／または増加が
太線で示される。ＧＮＡｌおよび／またはＮａｇＢへの修飾を含むがそれに限定されず、
ＧｌｍＳとＧＮＡｌ、ＧｌｍＳとＧｌｍＵ、ＮａｇＢとＧＮＡ１、ＮａｇＢとＧｌｍＵの
組み合わせそれ自体、さらに他の遺伝子修飾との組み合わせをさらに含むＮ−アセチルグ
ルコサミンの合成に対するいくつかの異なったアプローチが開示されている。一例として
、本発明はグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生産を最適にするための別な遺伝子
の過剰発現または欠失を検討する。図３および以下の表を説明すると、この図にはグルコ
ースの代謝およびＮ−グルコサミンの生成における様々な他の酵素の関与が示され、この
表にはグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を最適化するために
本発明の微生物宿主に対し付加的に行われ得る様々な修飾が示される。これらの実施態様
の全ては以下に詳細に述べられる。他の微生物も同様なアミノ糖代謝経路を有すると共に
、この様な経路内に類似の構造および機能を有する遺伝子およびタンパク質を有すること
が理解される。この様にして、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに関して以下に議論す
る原理は他の微生物にも適用可能で、本発明に含まれているのは明らかである。

同じ生物活性を有する酵素が、どの生物にその酵素が由来するかによって異なった名前
を有し得ることは当該分野で公知である。以下は、本明細書に参照される酵素の多くの別
名、およびいくつかの生物由来のこの様な酵素をコードする遺伝子の特定の名前の一般的
なリストである。本発明は任意の生物由来の所定の機能の酵素を包含することを意図する
が、酵素名が互換的に用いられ得るか、ある配列または生物で適切に用いられ得る。

例えば、本明細書で一般的に「グルコサミン−６−燐酸シンターゼ」と呼ばれる酵素は
フルクトース−６−燐酸およびグルタミンからグルコサミン−６−燐酸およびグルタメー
トの形成を触媒する。その酵素はグルコサミン−フルクトース−６−燐酸アミノトランス
フェラーゼ（異性化）、ヘキソセホスフェートアミノトランスフェラーゼ、Ｄ−フルクト
ース−６−燐酸アミドトランスフェラーゼ、グルコサミン−６−燐酸イソメラーゼ（グル
タミン生成）、Ｌ−グルタミン−フルクトース−６−燐酸アミドトランスフェラーゼ、お
よびＧｌｃＮ６Ｐシンターゼとしても知られている。Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌由来の
グルコサミン−６−燐酸シンターゼは一般にＧｌｍＳと呼ばれる。酵母および他の供給源
由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼは一般的にＧＦＡまたはＧＦＡＴと呼ばれる。

様々な生物由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼは当該分野で公知であり、本発明
の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼが本明細書に記載されている。Ｅ．ｃｏｌ
ｉ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼは、本明細書で配列番号１で表される核酸配
列でコードされる本明細書で配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する。また、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼも本明細書に記
載されているが、この酵素は本明細書で配列番号１５で表される核酸配列でコードされる
、本明細書で配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有する。また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼが本明細書に
記載されているが、この酵素はその微生物ではグルコサミン−フルクトース−６−燐酸ア
ミノトランスフェラーゼ（ＧＦＡ１）として知られ、本明細書に配列番号１７で表される
核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有する。ま
た本明細書にＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ由来のグルコサミン−６−燐酸シンター
ゼが記載されるが、この酵素はその微生物でグルコサミン−フルクトース−６−燐酸アミ
ノトランスフェラーゼ（ＧＦＡ１）としても知られ、本明細書で配列番号１９で表される
核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有する。ま
た本発明にグルコサミン−６−燐酸シンターゼが含まれるが、この酵素はグルコサミン−
６−燐酸シンターゼの酵素活性の増加、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害
の減少、およびグルコサミン−６−燐酸シンテターゼのその基質に対する親和性の増加か
ら選ばれる結果をもたらす、一以上の遺伝子修飾を有する。一般的に、本発明によれば、
変異酵素または修飾酵素の所定の特性の増加または減少は、同じかまたは同等な条件で測
定または確立された、同じ生物由来の野生型（即ち正常な、修飾されていない）酵素の同
じ特性を参照して行われる（以下により詳細に議論する）。

酵素活性の生成物阻害が減少する結果となる遺伝子修飾を有するグルコサミン−６−燐
酸シンターゼのいくつかも本明細書に記載される。グルコサミン−６−燐酸シンターゼに
対するこの様な修飾は、米国特許第６，３７２，４５７号にも詳細に記載されたが、生成
物阻害が減少した別な明白なＧｌｍＳ突然変異体の少なくとも一つが本明細書に記載され
ている（配列番号１４）。生成物阻害が減少したＥ．ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−６−
燐酸シンターゼ酵素は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号
１２および配列番号１４（それぞれ配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、
配列番号１１および配列番号１３でコードされる）で表されるアミノ酸配列を含むがそれ
に限定されないアミノ酸配列を有する。さらに、生成物阻害が減少した酵素を生じる、野
生型配列（配列番号２）と比較した配列番号１４中のアミノ酸位置を記載する表が、表７
として提供される。配列番号４は配列番号２と比較して以下の変異を有する：位置４にお
けるＩｌｅ→Ｔｈｒ、位置２７２におけるＩｌｅ→Ｔｈｒ、および位置４５０におけるＳ
ｅｒ→Ｐｒｏ。配列番号６は配列番号２と比較して以下の変異を有する：位置３９におけ
るＡｌａ→Ｔｈｒ、位置２５０におけるＡｒｇ→Ｃｙｓ、および位置４７２におけるＧｌ
ｙ→Ｓｅｒ。配列番号８は配列番号２と比較して以下の変異を有する：位置４６９におけ
るＬｅｕ→Ｐｒｏ。配列番号１０および１２はそれぞれ、配列番号２と比較して少なくと
も以下の変異を有する：位置４７２におけるＧｌｙ→Ｓｅｒ。表７に列記した、その中に
示す変異の任意の組み合わせを含む任意の少なくとも一以上の位置において変異を有する
グルコサミン−６−燐酸シンターゼ、または任意の組み合わせを含む配列番号４、配列番
号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４の何れかで表される
別の変異のいずれかを有するグルコサミン−６−燐酸シンターゼが本発明により意図され
る。さらに、他の微生物由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼで相同修飾を行うこと
ができる。最後に、天然に存在するいくつかのグルコサミン−６−燐酸シンターゼでは、
他の微生物由来のグルコサミン−６−燐酸シンターゼより生成物阻害が少ない。例えば、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼは
Ｅ．ｃｏｌｉ変異ＧｌｍＳ酵素にほとんど匹敵する生成物耐性を示すことが本発明者らに
より示されている（実施例のセクションを参照）。

本明細書で一般的にグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵
素は、グルコサミン−６−燐酸およびアセチルＣｏＡをＮ−アセチルグルコサミン−６−
燐酸に変換し、ＣｏＡを放出する。この酵素はグルコサミン−燐酸Ｎ−アセチルトランス
フェラーゼ、ホスホグルコサミントランスアセチラーゼおよびホスホグルコサミンアセチ
ラーゼとしても知られている。その酵母酵素は一般的にＧＮＡ１と呼ばれる。様々な生物
由来のグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが当該分野で公知であり、本
発明の遺伝子工学戦略での使用が意図される。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが本明細
書に記載される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のグルコサミ
ン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼは、本明細書で配列番号２９で表される核酸配
列でコードされる、本明細書で配列番号３０で表されるアミノ酸配列を有する。また、本
明細書で配列番号３１で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号３２で表
されるアミノ酸配列を有するＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ由来のグルコサミン−６
−燐酸アセチルトランスフェラーゼも本明細書に記載される。また本明細書で配列番号３
３で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号３４で表されるアミノ酸配列
を有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のグルコサミン−６−燐酸アセ
チルトランスフェラーゼも本明細書に記載される。グルコサミン−６−燐酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ酵素活性の増加、微生物によるグルコサミン−６−燐酸アセチルトランス
フェラーゼの過剰発現、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセ
チルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少、およびグルコサミン−６−燐酸に対する
グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加から選ばれる結果を
もたらす遺伝子修飾を有するグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼも本発
明に含まれる。

本明細書で一般的にグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼと呼ばれる酵素は、グルコサ
ミン−６−燐酸および水の可逆反応を触媒し、フルクトース−６−燐酸およびアンモニア
を形成する。この酵素はグルコサミン−６−燐酸イソメラーゼ、ＧｌｃＮ６Ｐデアミナー
ゼ、ホスホグルコサミンイソメラーゼ、ホスホグルコサミン−イソメラーゼ、グルコサミ
ン燐酸デアミナーゼ、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸ケトール
イソメラーゼ（脱アミノ化）としても知られている。Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌では、
この酵素は一般にＮａｇＢとして知られている。様々な生物由来のグルコサミン−６−燐
酸デアミナーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図
される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−６−燐酸デア
ミナーゼが本明細書に記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のグルコサミン−６−燐酸デアミナ
ーゼは、本明細書で配列番号４１で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番
号４２で表されるアミノ酸配列を有する。また、グルコサミン−６−燐酸酵素活性の増加
、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆反応の増加により増加した（より多くの）グ
ルコサミン−６−燐酸の形成、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの正反応の減少によ
り増加した（より少量の）フルクトース−６−燐酸の生成、フルクトース−６−燐酸に対
するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの親和性の増加、グルコサミン−６−燐酸に対
するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの親和性の減少、およびグルコサミン−６−燐
酸デアミナーゼのグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少から選ばれる結果をもたらす
遺伝子修飾を有するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼも本発明に含まれる。

本明細書で一般的にグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼと呼ばれ
る酵素は、グルコサミン−１−燐酸およびアセチルＣｏＡをＮ−アセチルグルコサミン−
１−燐酸に変換し、ＣｏＡを放出する。この酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中ではＧ
ｌｍＵとして知られている。細菌ＧｌｍＵ酵素は２機能性酵素である（すなわち、この酵
素は二つの酵素機能を有する；この酵素は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホス
ホリラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンジホスホリラーゼとしても知られるＮ−
アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの機能も有する）。様々な
生物由来のグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは当該分野で公知で
あり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、実際には二機能性
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−
１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼであるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のグ
ルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが本明細書に記載される。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ由来のグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼは、本明細書で配列番号５５で表され
る核酸配列でコードされる、本明細書に配列番号５６で表されるアミノ酸配列を有する。
また本明細書にはＥ．ｃｏｌｉグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ
／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの切断型変異体も記
載され、ここでは、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸Ｎ−ウリジルトランスフェラー
ゼをコードする部分が欠失し、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ
活性のみを有する酵素のみが有効に残される。この切断型グルコサミン−１−燐酸Ｎ−ア
セチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェ
ラーゼは、本発明で配列番号５７で表される核酸配列でコードされる、本発明で配列番号
５８で表されるアミノ酸配列を有する。また、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼ酵素活性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランス
フェラーゼ酵素活性の減少（酵素が二機能性酵素である場合）、グルコサミン−１−燐酸
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのグルコサミン−１−燐酸に対する親和性の増加、Ｎ−
アセチルグルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランス
フェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの親和性
の減少（酵素が二機能性酵素である場合）、およびグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチル
トランスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少から選ばれ
る結果をもたらす遺伝子修飾グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼも
本発明に含まれる。

本明細書で一般的にＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼと呼ばれる酵
素は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸をグルコサミン−６−燐酸およびアセテート
に加水分解する。その酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中でＮａｇＡとして知られてい
る。様々な生物由来のＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼが当該分野で
公知であり、本発明の遺伝子工学戦略での使用が意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼが本明細書
に記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ
は本明細書で配列番号８５で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号８４
で表されるアミノ酸配列を有する。グルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ活性の増加、
グルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの逆反応のＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸
の形成の増加、グルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの正反応の減少によるグルコサミ
ン−６−燐酸形成の減少、グルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸デア
セチラーゼの親和性の増加、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン
−６−燐酸デアセチラーゼの親和性の減少、グルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼのＮ
−アセチルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少から選ばれる結果をもたらす遺伝子
修飾を有するＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼも本発明に含まれる。

本明細書で一般的にホスホグルコサミンムターゼと呼ばれる酵素は、グルコサミン−６
−燐酸とグルコサミン−１−燐酸との間の変換を触媒する。この酵素は一般にＥ．ｃｏｌ
ｉおよび他の細菌中でＧｌｍＭとして知られている。様々な生物由来のホスホグルタミン
ムターゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図される
。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のホスホグルコサミンムターゼが本明
細書に記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホスホグルコサミンムターゼは、本明細書で配列
番号５３で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号５４で表されるアミノ
酸配列を有する。ホスホグルコサミンムターゼ活性の増加、ホスホグルコサミンムターゼ
の正反応の増加によるグルコサミン−１−燐酸生成の増加、ホスホグルコサミンムターゼ
の逆反応減少によるグルコサミン−６−燐酸生成の減少、グルコサミン−６−燐酸に対す
るホスホグルコサミンムターゼの親和性の増加、グルコサミン−１−燐酸に対するホスホ
グルコサミンムターゼの親和性の減少、およびホスホグルコサミンムターゼのグルコサミ
ン−１−燐酸生成物阻害の減少から選ばれた結果をもたらす遺伝子修飾を有するホスホグ
ルコサミンムターゼも本発明に含まれる。

本明細書でホスホグルコイソメラーゼと一般的に呼ばれる酵素は、グルコース−６−燐
酸のフルクトース−６−燐酸への相互変換を触媒する。この酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他
の細菌でホスホグルコイソメラーゼまたはＰｇｉとして知られている。様々な生物由来の
ホスホグルコイソメラーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用する
ことが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のホスホグルコイソ
メラーゼが本明細書に記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホスホグルコイソメラーゼは、本
明細書で配列番号１０４で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号１０５
で表されるアミノ酸配列を有する。

本明細書で一般的にホスホフルクトキナーゼと呼ばれる酵素は、フルクトース−６−燐
酸（Ｆ−６−Ｐ）からフルクトース１，６−二燐酸の生成を触媒する。ｐｆｋＡでコード
されるＥ．ｃｏｌｉの主要ホスホフルクトキナーゼはホスホフルクトキナーゼ活性の９０
％を提供する。残りの１０％の活性はｐｆｋＢでコードされる小数のホスホフルクトキナ
ーゼで供給される。ホスホフルクトキナーゼ酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌でホスホ
フルクトキナーゼまたはＰｆｋとして一般的に知られている。様々な生物由来のホスホフ
ルクトキナーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で使用することが意図
される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＰｆｋＡが本明細書に記載さ
れる。

本明細書でグルタミンシンテターゼと一般的に呼ばれる酵素は、ＮＨ_３およびＡＴＰを
必要とする反応でＬ−グルタミン酸のＬ−グルタミンへの変換を触媒する。この酵素はＥ
．ｃｏｌｉおよび他の細菌中でグルタミンシンテターゼまたはＧｌｎＡとして一般的に知
られている。様々な生物由来のグルタミンシンテターゼが当該分野で公知であり、本発明
の遺伝子工学戦略で使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ由来のグルタミンシンテターゼが本明細書に記載されている。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のグ
ルタミンシンテターゼは本明細書で配列番号８８で表される核酸配列でコードされる、本
明細書で配列番号８９で表されるアミノ酸配列を有する。

本明細書で一般的にグルコース−６−燐酸デヒドロロゲナーゼと呼ばれる酵素は、ペン
トース燐酸経路の第一段階を触媒し、グルコース−６−燐酸をグルコノ−１，５−ラクト
ンへ変換する。この酵素はＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中でｚｗｆでコードされるグルコ
ース−６−燐酸デヒドロゲナーゼとして一般的に知られている。様々な生物由来のグルコ
ース−６−燐酸デヒドロロゲナーゼが当該分野で公知であり、本発明の遺伝子工学戦略で
使用することが意図される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のグルコー
ス−６−燐酸デヒドロゲナーゼは、本明細書で記載される。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ由来のグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼは本明細書中で配列番号９
４で表される核酸配列でコードされる、本明細書で配列番号９５で表されるアミノ酸配列
を有する。

多数の酵素が微生物中のグリコーゲン合成に関与している。この様な酵素にはＡＤＰ−
グルコースピロホスホリラーゼ、グリコーゲンシンターゼおよび分枝酵素が含まれるが、
それらに限定されない。

本明細書に参照される他の遺伝子にはＮ−アセチルグルコサミントランスポーター（Ｉ
Ｉ^Ｎａｇ）、マンノーストランスポーター（ＥＩＩＭ，Ｐ／ＩＩＩ^ｍａｎ）、グルコース
トランスポーター（ＩＩ^Ｇｌｃ）および／またはホスファターゼが含まれるが、それに限
定されない。Ｅ．ｃｏｌｉ中の遺伝子はそれぞれｎａｇＣ、ｎａｇＤ、ｎａｇＥ（Ｎ−ア
セチルグルコサミントランスポーター（ＩＩ^Ｎａｇ））ｍａｎＸＹＺ（マンノーストラン
スポーター（ＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^ｍａｎ））、ｐｔｓＧ（グルコーストランスポーター
（ＩＩ^Ｇｌｃ））またはホスファターゼ遺伝子に対応する。ｎａｇＣ遺伝子はｎａｇ領域
のリプレッサーおよびｇｌｍＵオペロンのアクチベーターおよびリプレッサー両方として
作用する制御タンパク質をコードする。ｎａｇＤ遺伝子の機能は知られていないが、それ
がｎａｇレギュロン内に存在するのでアミノ糖代謝に関係していると考えられている。グ
ルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの分解に関与しているｎａｇ遺伝子（ｎａｇ
Ａ、ｎａｇＢ、ｎａｇＣ、ｎａｇＤ、ｎａｇＥ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
染色体上の１５ｍｉｎに位置するレギュロン（すなわち、ｎａｇレギュロン）として存在
する。マンノーストランスポーター（ＥＩＩＭ、Ｐ／ＩＩＩ^ｍａｎ）（ｍａｎＸＹＺ）は
細胞内へのグルコサミンの輸送を担う。グルコーストランスポーター（ＩＩ^Ｇｌｃ）（ｐ
ｔｓＧ）はグルコースを細胞内に輸送するが、グルコサミンに対しては第二トランスポー
ターとして作用し得る。ホスファターゼが糖燐酸エステルおよびタンパク質の脱燐酸化を
触媒することは周知である。

本発明のある実施態様はグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの醗酵
生産法に関する。この様な方法には一般的に（ａ）微生物中でグルコサミンおよび／また
はＮ−アセチルグルコサミンの生産を増加するに有用であると本明細書中に開示される、
少なくとも一つの特異的遺伝子修飾を有する微生物を醗酵培地中で培養する工程、ならび
に（ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグ
ルコサミンでなる群から選ばれる生成物を培養工程から採集する工程が含まれる。より具
体的には、生成物には微生物から採集される細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミ
ン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−
燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミン、ならびに／または醗酵培
地から採集される細胞外グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンが含まれ得る。あ
る態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ
−アセチルグルコサミン−１−燐酸は加水分解生成物（グルコサミン、グルコサミン−６
−燐酸およびグルコサミン−１燐酸）が安定である酸／加熱条件下で加水分解される。他
の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ
−アセチルグルコサミン−１−燐酸が脱アセチル化酵素を用いて脱アセチル化される。回
収および精製法は以下に詳細に述べられる。

一般的に、本発明の方法に有用な遺伝子修飾された微生物は、代表的には少なくとも一
つのアミノ糖代謝経路に関与する少なくとも１個の修飾された遺伝子を有し、その結果（
ａ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６
−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を他の化合物へ変換する能力
の減少（すなわちグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグル
コサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸の同化作用また
は異化作用経路の阻害）、（ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ
−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸
を生産（即ち合成）する能力の増大、（ｃ）グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグ
ルコサミンを細胞内へ輸送する能力の減少、（ｄ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミ
ン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−
燐酸、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを細胞外へ輸送する能力の
増大、および／または（ｅ）生化学反応と競合する、グルコサミン−６−Ｐ生産に関与す
る基質を使用する能力の減少、および／または（ｆ）生化学反応と競合する、アセチルＣ
ｏＡ（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸
の生産に関与）を使用する能力の減少をもたらす。

一般的に、遺伝子修飾されたアミノ糖代謝経路を有する微生物は、以下に詳細に議論さ
れる様に少なくとも一つの遺伝子修飾を有し、その結果、同じ条件下で培養された野生型
微生物と比較して上記の様な一つ以上のアミノ糖代謝経路の変化をもたらす。アミノ糖代
謝経路におけるこの様な修飾は、微生物のアミノ糖生産能を変化させる。以下に詳細に議
論する様に、本発明によれば遺伝子修飾された微生物では、同じまたは同等の条件下で培
養された同じ種（および好ましくは同じ株）の野生型微生物と比較して、グルコサミンお
よび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産能が増大していることが好ましい。同等の
条件とは、類似しているが必ずしも同じでなく（例えば培地組成、温度、ｐＨおよび他の
条件の若干の変化は許容され得る）、および微生物の増殖、または微生物によるグルコサ
ミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの生産に対する効果が実質的に変化しない培養条件
である。

グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産に影響するするアミノ糖
代謝経路は、以下の種類の経路のうちの少なくとも１つに分類することができる：（ａ）
グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐
酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を他の化合物に変換する経路、（ｂ）グル
コサミン−６−燐酸合成経路、（ｃ）グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサ
ミンの細胞内への輸送経路、（ｄ）グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミ
ン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−
燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミンの細胞外への輸送経路、ならびに（ｅ）
グルコサミン−６−燐酸生産における基質競合経路。

グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産能の増大した微生物の遺伝
子修飾による開発は、古典的株開発および分子遺伝学的技術の両方を用いて達成され得る
。一般的に、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産の増大した微生
物を作製する戦略は（１）グルコサミン−６−燐酸生産の影響が負（例えば阻害する）で
ある、少なくとも一つ、好ましくは一つより多くのアミノ糖代謝経路の不活性化または欠
失、および（２）グルコサミン−６−燐酸生産が増大する、少なくとも一つの、好ましく
は一つより多くのアミノ糖代謝経路の増幅である。

本発明のある実施態様では、微生物がグルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐
酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−
１−燐酸を合成する能力の増大を、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｍＳ
）の発現の増幅（例えば過剰発現）、および／またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ではｎａｇＢ遺伝子であり、その生成物がグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼであるグ
ルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ遺伝子の発現の増幅で達成することができる。グルコ
サミン−６−燐酸デアミナーゼはグルコサミン−６−燐酸が脱アミノ化されてフルクトー
ス−６−燐酸およびアンモニウムを形成する正反応を触媒する。グルコサミン−６−燐酸
デアミナーゼはまた、フルクトース−６−燐酸およびアンモニウムがグルコサミン−６−
燐酸を形成する逆反応を触媒する。シンターゼ反応ではフルクトース−６−燐酸およびグ
ルタミンがグルコサミン−６−燐酸およびグルタミン酸を生成するので、グルコサミン−
６−燐酸デアミナーゼの逆反応はグルコサミン−６−燐酸シンテターゼの作用とは異なっ
ている。グルタミンの適切な細胞内供給がグルコサミン−６−燐酸シンターゼ反応に重要
である。グルコサミン−６−燐酸の合成経路および分解経路を調べると、潜在的に無駄な
サイクルの存在が明らかとなり、それによりフルクトース−６−燐酸およびグルコサミン
−６−燐酸の連続的な相互変換がグルタミンの無駄な枯渇を引き起こしている。従って、
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの逆作用の使用は、デアミナーゼがアミノ酸（グル
タミン）よりもアンモニウムをアミノ供与体として使用するため、グルコサミン−６−燐
酸シンターゼより有利である。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼは、グルコサミン−
６−燐酸のフルクトース−６−燐酸およびアンモニウムへの分解を利用する速度論的平衡
で逆反応を触媒する。従って、本発明の他の実施態様にある様に、逆反応の活性が増加し
正反応の活性が減少した、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの変異誘発形態、または
過剰発現グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼが、グルコサミンおよび／またはＮ−アセ
チルグルコサミンの生産に使用される。本発明の他の実施態様は、Ｖｍａｘが増加し、比
活性が増加し、安定性が増加し、基質であるフルクトース−６−燐酸およびアンモニウム
に対する親和性が増加し、グルコサミン−６−燐酸による生成物阻害が減少したグルコサ
ミン−６−燐酸デアミナーゼを有する微生物を提供することである。この様に改良された
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼを天然から単離してもよく、または遺伝子修飾もし
くはタンパク質工学の任意の適切な方法で生産してもよい。例えば、コンピューターベー
スタンパク質操作工学をこの目的に使用することができる。例えばその全体が本明細書で
参照され援用されるＭａｕｌｉｋら、１９９７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔ
ｅｇｉｅｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．を参照。グルコサミン−６−燐酸デアミナ
ーゼの発現の増幅を、例えばｎａｇＢ遺伝子をコードする組み替え核酸分子を導入するこ
とにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで達成することができる。宿主株中でのグ
ルコサミン−６−燐酸シンターゼがグルコサミン−６−燐酸の合成を触媒することができ
るので、不活性化ｇｌｍＳ遺伝子を有する変異Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株中で
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの発現の増幅を分析しなければならない。この生物
中のグルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性の除去は必要ないが、それも本発明の実施態
様の一つである。

本明細書に記載した他の酵素および他のタンパク質の例では、修飾したグルコサミン−
６−燐酸デアミナーゼは例えば変異（すなわち、遺伝子修飾）グルコサミン−６−燐酸デ
アミナーゼ遺伝子であり、遺伝子修飾の任意の適切な方法で製造することができる。例え
ば、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする組み替え核酸分子を、エラープロ
ーンＰＣＲによりヌクレオチドを挿入、欠失および／または置換する任意の方法で修飾す
ることができる。この方法では、遺伝子が増幅に用いたＤＮＡポリメラーゼによる高頻度
の誤取り込み誤差を生じる条件下で増幅される。その結果、ＰＣＲ生成物に高頻度の変異
を生じる。得られたグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ遺伝子変異体は、変異体遺伝子
を、非変異組み替えグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ核酸分子を有する微生物と比較
して、試験微生物にグルコサミン生産増加を与える能力について試験することによりスク
リーニングされ得る。従って、変異体またはホモロググルコサミン−６−燐酸デアミナー
ゼタンパク質をコードする核酸配列を有する、遺伝子修飾された組み替え核酸分子で形質
転換された微生物を提供することが本発明の実施態様の一つである。この様なグルコサミ
ン−６−燐酸デアミナーゼタンパク質を、本明細書ではグルコサミン−６−燐酸デアミナ
ーゼホモログと言われ得る（以下に詳細に記載される）。

細胞中のグルコサミン−６−燐酸シンターゼまたはグルコサミン−６−燐酸デアミナー
ゼのレベルが、解糖からグルコサミン−６−燐酸合成への炭素の流れの逆流を制御するの
で、本発明のある態様では、ｇｌｍＳまたはｎａｇＢのいずれかの過剰発現はグルコサミ
ン−６−燐酸の細胞間蓄積、最終的にはグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコ
サミンの生産に重要である。

Ｎ−アセチルグルコサミンの生産では、グルコサミン−６−燐酸をＮ−アセチルグルコ
サミン−６−燐酸またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に変換し、それを次に脱燐
酸化および／または培養ブロス中へ分泌しなければならない。本発明のある実施態様では
、微生物がＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンを合成
する能力の増大はグルコース−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現の増幅
で行われ、一例を挙げれば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中では
その遺伝子はＧＮＡ１遺伝子であり、その生成物はグルコサミン−６−燐酸アセチルトラ
ンスフェラーゼである。本発明の他の実施態様では、微生物がＮ−アセチルグルコサミン
−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンを合成する能力の増大は、Ｎ−アセチルグル
コース−６−燐酸デアセチラーゼ遺伝子の増幅で達成され、その遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ中ではｎａｇＡ遺伝子であり、その生成物はＮ−アセチルグルコサミ
ン−６−燐酸デアセチラーゼである。デアセチラーゼは正反応におけるＮ−アセチルグル
コサミン−６−燐酸のグルコサミン−６−燐酸への変換を触媒する。このデアセチラーゼ
はまた、逆反応を触媒して、グルコサミン−６−燐酸からＮ−アセチルグルコサミンへと
変換する。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼは、Ｎ−アセチルグルコ
サミン−６−燐酸のグルコサミン−６−燐酸への脱アセチル化に好都合な動力学的平衡で
可逆反応を触媒する。従って、本発明の他の実施態様として、逆反応の活性が増加し正反
応の活性が減少したＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの変異誘発形態
はグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産に用いられる。

グルコサミン−６−燐酸シンターゼ（ＧｌｍＳ）は生成物であるグルコサミン−６−燐
酸に強く阻害されるので、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（
ＧＮＡ１）および／またはＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ遺伝子（
ｎａｇＡ）の発現増幅は、グルコサミン−６−燐酸の細胞内レベルを減少させ得、Ｇｌｍ
Ｓ酵素の生成物阻害を減少させ得、従ってグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグル
コサミンの生産を増加し得る。

本発明の他の実施態様では、微生物がグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンを
合成する能力を増大することは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉではｇｌｍＭ遺伝子
であり、その生成物がホスホグルコサミンムターゼであるホスホグルコサミンムターゼ遺
伝子の発現の増幅で達成される。ホスホグルコサミンムターゼはグルコサミン−６−燐酸
のグルコサミン−１−燐酸への転換を触媒する。グルコサミン−６−燐酸シンテターゼ（
ＧｌｍＳ）は生成物であるグルコサミン−６−燐酸で強く阻害されるので、ホスホグルコ
サミンムターゼ遺伝子の発現増幅によりグルコサミン−６−燐酸の細胞内レベルが減少し
得、ＧｌｍＳ酵素の生成物阻害が減少し得、従ってグルコサミンおよび／またはＮ−アセ
チルグルコサミンの生産を増加させ得る。

本発明の他の実施態様では、微生物によるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグ
ルコサミン合成能の増大は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉではｇｌｍＵ遺伝子であ
り、その生成物がグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼである二機能性グルコサミン−１
−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジル
トランスフェラーゼ遺伝子の発現の増幅で達成される。本発明にはグルコサミン−１−燐
酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の発現の増幅または活性の増
加も含まれる。二機能性酵素は（グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラー
ゼとして）グルコサミン−１−燐酸のＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸への変換を触
媒し、（Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼとして）生成
物をさらにＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンへ変換する。従って、本発明の他の実施態
様としては、アセチルトランスフェラーゼ作用の活性が増加し、ウリジルトランスフェラ
ーゼ作用の活性が減少したグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ
−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの変異誘発形態が、グル
コサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産に用いられる。グルコサミン−
１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジ
ルトランスフェラーゼが一連の生化学反応によりグルコサミン−６−燐酸が高分子に取り
込まれるアミノ糖代謝経路内で機能するので、ｇｌｍＵ遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉの増殖に必須の遺伝子である。アセチルトランスフェラーゼ作用の活性が増加
し、ウリジルトランスフェラーゼ作用の活性が減少したＧｌｍＵ酵素の変異誘発形態を、
グルコサミン由来の高分子を合成して細胞増殖を支える様に、野生型ｇｌｍＵ遺伝子を有
する宿主株中で使用する必要がある。

グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン合成は、図３に概観する様にグ
ルコース代謝の多くの異なった経路と密接に関連している。グルコースが細胞に取り込ま
れ、同時にグルコース−６−Ｐに変換される。グルコースは図に示される経路を含む多く
の経路で代謝される。グルコサミン合成経路では、グルコース−６−Ｐがフルクトース−
６−Ｐに異性化され、次いでＧｌｍＳが媒介してフルクトース−６−Ｐがグルコサミン−
６−Ｐに変換される。最後に、グルコサミン−６−Ｐが脱燐酸化され、分泌される。グル
コース−６−Ｐの主要な競合別ルートは、ホスホフルクトキナーゼにより解糖に入ること
である。グルコース−６−燐酸の別な重要なルートはグルコノラクトン−６−燐酸への酸
化である（ペントース燐酸経路へ入る）。さらに、グルコース−６−燐酸がグルコース−
１−燐酸に変換され得、その後グリコーゲンが生成し細胞に蓄えられる。以下に詳細に述
べる様に、他の競合経路を調節してグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミ
ンの生産を最大にすることも、本発明の範囲内である。

細菌細胞は貯蔵炭素保存の主な形としてグリコーゲンを蓄積する。グリコーゲン合成に
は３種の酵素が関係する：ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（グルコース−１−燐
酸アデニルトランスフェラーゼとしても知られる）、グリコーゲンシンターゼ、および分
枝酵素。これらの酵素はそれぞれ、グルコース−１−燐酸から単糖供与体（ＡＤＰ−グル
コース）の合成、これらの単糖ユニットの重合によるグルコース（１，４）ポリマーの形
成、およびこのポリマーの再配列による鎖内に（１−６）分枝の形成を触媒する。ＡＤＰ
−グルコースピロホスホリラーゼはグリコーゲン合成の中枢酵素であり、アロステリック
エフェクターにより強く調節される。例えば、３−ホスホグリセレートが酵素活性を刺激
し、オルト燐酸はその活性を阻害する。これらのエフェクターはグリコーゲン合成の制御
においてインビボで重要な役割を果たし得る。増殖条件によっては、細胞内のグリコーゲ
ンの量はその乾燥重量の１０〜６０％を占める。一般に、炭素およびエネルギーの供給が
豊富で、窒素が制限栄養素である条件下でグリコーゲンが蓄積する。増殖培地中で燐酸が
欠乏するとまた、細胞内のグリコーゲン量がより高くなる。細菌におけるＡＤＰ−グルコ
ースの唯一の機能は、グリコーゲン合成の前駆体として作用することである。グリコーゲ
ン合成が妨害されたＥ．ｃｏｌｉ変異体では、細胞の増殖は、悪影響を受けない。グリコ
ーゲン合成の妨害により、グルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生産により多くの炭
素源が利用できる様になる。

グルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミンの生産を最大にするため、ホスホグルコイソ
メラーゼ（ｐｇｉ遺伝子でコードされる）を操作することができる。ｐｇｉ遺伝子の過剰
発現により、グルコサミン−６−Ｐ合成の直接の基質であるフルクトース−６−Ｐへのグ
ルコース−６−Ｐの変換を増加することができる。

グルコースは細胞増殖およびグルコサミン合成を支えるために必要である。ホスホフル
クトキナーゼ（ＰｆｋＡおよびＰｆｋＢ、前者が主なイソ酵素）はフルクトース−６−Ｐ
からフルクトース−１，６−二燐酸への変換を触媒する。その反応はグルコサミン−６−
Ｐ合成と競合して作動する。炭素フラックスの制御では、ＰｆｋＡおよび／またはＰｆｋ
Ｂの発現を調節してより多くのグルコース−６−Ｐをグルコサミン経路へ向かわせること
が望ましい。グルコサミン合成を最大にするためには、グルコースの供給を制限すべきで
あるが、過剰のグルコースは通常酢酸が合成される結果となる。酢酸の蓄積は細胞増殖を
阻害し、全般的な細胞の代謝を低下する信号となるので、避けるべきである。炭素の供給
を管理する一つのアプローチは、グルコサミン合成への炭素フラックスと細胞増殖および
酢酸生成への炭素フラックスの結合を断つことである。これは、ｐｆｋＡ遺伝子を欠失さ
せ、増殖のために細胞にフルクトースを供給することで達成され得る。ｐｆｋＡノックア
ウト変異体では、フルクトース−６−燐酸の解糖へのフラックスが大きく制限される。従
って、実質的に全てのグルコースがグルコサミン合成に使用され得、一方、細胞増殖およ
びエネルギー生産はフルクトースを供給して行われ、これは細胞内に輸送され、燐酸化さ
れてフルクトース−１−燐酸になる。後者はさらに燐酸化されてフルクトース−１，６−
二燐酸になる。

文献には燐酸化アミノ糖がペントース燐酸経路を阻害したことが示唆されている。実際
、Ｎ−アセチルグルコサミン生産により細胞増殖が阻害されたが、グルコネートおよびリ
ボースというこの経路の中間体を供給すると阻害がなくなり得る。グルコネートおよびペ
ントース化合物の補充がＮ−アセチルグルコサミンの生産を増加することも見出された。
アミノ糖による阻害を克服するため、グルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ遺伝
子でコードされる）等のペントース燐酸経路の酵素を過剰発現することもできる。

グルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン合成はアミノ供与体であるグルタミンを消費
する。グルタミン合成にはｇｌｎＡ遺伝子でコードされるグルタミンシンターゼが関与す
る。ｇｌｎＡ遺伝子の過剰発現により、グルタミンプールが増加し得、従ってグルコサミ
ン／Ｎ−アセチルグルコサミンが増加し得る。

従って、本発明による好ましい改変のいくつかを一般的に説明してきたが、ある実施態
様では、微生物は微生物中でグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を
増加させる少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。グルコサミン−６−燐酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾により、グルコサミン−６−燐酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ酵素活性の増加；微生物によるグルコサミン−６−燐酸アセチルトランス
フェラーゼの過剰発現：グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼのＮ−アセ
チルグルコサミン−６−燐酸生成物阻害の減少；および／またはグルコサミン−６−燐酸
に対するグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの親和性の増加から選ばれ
る結果が提供されることが好ましい。ある実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐
酸アセチルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１個の組み替え核酸分子で形質転
換される。この様な核酸分子には、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ
の酵素活性を増加する、または任意の上記結果をもたらす、少なくとも一つの遺伝子修飾
を有するグルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列が含
まれ得る。グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼの機能および代表的な配
列は、上記に記載されている。

他の実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンターゼの活性を増加する少な
くとも一つの遺伝子修飾を有する。グルコサミン−６−燐酸シンターゼの活性を増加する
ためのその遺伝子修飾は、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの酵素活性の増加；グルコ
サミン−６−燐酸シンターゼの過剰発現；グルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻
害の減少；およびその基質に対するグルコサミン−６−燐酸シンターゼの親和性の増加；
から選ばれる結果をもたらすことが好ましい。ある態様では、微生物はグルコサミン−６
−燐酸シンターゼをコードする核酸配列を含む少なくとも１個の組み替え核酸分子で形質
転換される。この様な核酸分子には、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの酵素活性を増
加するか、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害を減少するか、または上記結
果の任意の一つをもたらす、少なくとも一つの遺伝子修飾を有する、グルコサミン−６−
燐酸シンターゼをコードする核酸配列が含まれ得る。グルコサミン−６−燐酸シンターゼ
の機能とそれぞれの配列は、上記に記載されている。

他の実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンターゼの活性を減少する遺伝
子修飾を有する。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸シンターゼの活性を減少する遺
伝子修飾は、微生物中でグルコサミン−６−燐酸シンターゼをコードする内在性遺伝子の
部分的または完全な欠失または不活性化である。

また別な実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を増加す
る少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を
増加するための遺伝子修飾は、微生物によるグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの過剰
発現、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ酵素活性の増加、グルコサミン−６−燐酸デ
アミナーゼの逆反応の増加により増加した（より多くの）グルコサミン−６−燐酸の形成
、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの正反応の減少により減少した（より少ない）フ
ルクトース−６−燐酸の形成、フルクトース−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸
デアミナーゼの親和性の増加、グルコサミン−６−燐酸に対するグルコサミン−６−燐酸
デアミナーゼの親和瀬の減少、およびグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼのグルコサミ
ン−６−燐酸生成物阻害の減少から選ばれる結果をもたらすことが好ましい。ある態様で
は、微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする核酸配列を含む少なくと
も１個の組み替え核酸分子で形質転換される。この様な核酸分子には、グルコサミン−６
−燐酸デアミナーゼの酵素活性を増加する、または上記結果の任意の一つをもたらす、少
なくとも一つの遺伝子修飾を有するグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする核
酸配列が含まれ得る。グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの機能および代表的な配列は
、上記に記載されている。

別の実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼの活性を減少する少
なくとも一つの遺伝子修飾を有する。ある態様では、グルコサミン−６−燐酸デアミナー
ゼの活性を減少する遺伝子修飾は微生物中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコー
ドする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化である。

また別な実施態様では、微生物はグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラ
ーゼ活性を増加する少なくとも１つの遺伝子修飾を有する。好ましくは、その遺伝子修飾
はグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ酵素活性の増加；Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ酵素活性の減少；グルコサミン−
１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の微生物による過剰発現；グ
ルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ
の親和性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸に対するグルコサミン−１−燐酸
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトラン
スフェラーゼの親和性の減少；および／またはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼのＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸生成物阻害の減少から選ばれた結
果を提供する。ある態様では、微生物はグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフ
ェラーゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵
素をコードする核酸配列を含む、少なくとも１個の組換え核酸分子で形質転換される。こ
の様な核酸分子は、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの酵素活性
を増加する、または任意の上記結果をもたらす少なくとも１つの遺伝子修飾を有するグル
コサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含み得る。
グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの機能と代表的な配列は、上記
に記載されている。

他の実施態様では、遺伝子修飾された微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸
デアセチラーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を含む。好ましくは、Ｎ−ア
セチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ活性を増加する遺伝子修飾は、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ活性の増加；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−
燐酸デアセチラーゼの過剰発現；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの
逆反応の増加によるＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸の生成；Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−６−燐酸デアセチラーゼの正反応の減少されて、またはより好ましくは消失されて
グルコサミン−６−燐酸の生成から選ばれた結果をもたらす。ある態様では、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼをコードする核酸配列を有する、少なくとも１
個の組換え核酸分子で微生物が形質転換される。この様な核酸分子には、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼの酵素活性を増加する、または任意の上記結果をも
たらす、少なくとも一つの遺伝子修飾を有するＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デア
セチラーゼをコードする核酸配列が含まれ得る。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デ
アセチラーゼの機能と代表的な配列は上記に記載されている。

他の実施態様では、遺伝子修飾された微生物はホスフォグルコサミンムターゼ活性を増
加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。好ましくは、ホスフォグルコサミンムター
ゼ活性を増加する遺伝子修飾は、ホスフォグルコサミンムターゼ活性の増加；ホスフォグ
ルコサミンムターゼの過剰発現；ホスフォグルコサミンムターゼ活性の増加によるグルコ
サミン−１−燐酸の生成；および／またはホスフォグルコサミンムターゼ活性の減少、ま
たは好ましくは消失によるグルコサミン−６−燐酸の生成から選ばれる結果をもたらす。
ある態様では、微生物はホスフォグルコサミンムターゼをコードする核酸配列を有する、
少なくとも１個の組換え核酸分子で形質転換される。この様な核酸分子にはホスフォグル
コサミンムターゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有するホスフォグ
ルコサミンムターゼをコードする、または上記結果をもたらす核酸配列が含まれ得る。ホ
スフォグルコサミンムターゼの機能と代表的な配列は上記に記載されている。

本明細書中に記載した任意の実施態様で、遺伝子修飾された微生物は、ホスフォグルコ
イソメラーゼ活性を微生物内で増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を有し得る。
好ましくは、ホスフォグルコイソメラーゼを増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾
を有し得る遺伝子修飾された微生物はホスフォグルコイソメラーゼ活性の増加；ホスフォ
グルコイソメラーゼの過剰発現；基質に対するホスフォグルコイソメラーゼの親和性の増
加から選ばれた結果をもたらす。ある実施態様では、微生物はホスフォグルコイソメラー
ゼをコードする核酸配列を有する組換え核酸分子の少なくとも１個で形質転換される。こ
の様な核酸分子は、ホスフォグルコイソメラーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの
遺伝子修飾を有するホスフォグルコイソメラーゼをコードする、または任意の上記結果を
もたらす核酸配列を含み得る。ホスフォグルコイソメラーゼの機能と代表的な配列は上記
に記載されている。

本明細書に記載された任意の実施態様で、遺伝子修飾された微生物はホスフォフルクト
キナーゼ活性を減少する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を微生物中に有し得る。ある
局面では、ホスフォフルクトキナーゼ活性を減少する遺伝子修飾は、微生物中でホスフォ
フルクトキナーゼをコードする内在性遺伝子の部分的または完全な欠失もしくは不活性化
である。ホスフォフルクトキナーゼの機能と代表的な配列は、上記に記載されている。

本明細書に記載された任意の実施態様で、遺伝子修飾された微生物はグルタミンシンテ
ターゼ活性を増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を微生物中に有し得る。好まし
くは、グルタミンシンテターゼを増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を有し得る
遺伝子修飾された微生物はグルタミンシンテターゼ活性の増加；グルタミンシンテターゼ
の過剰発現；基質に対するグルタミンシンテターゼの親和性の増加から選ばれた結果をも
たらす。ある実施態様では、グルタミンシンテターゼをコードする核酸配列を有する少な
くとも１個の組換え核酸分子で微生物が形質転換される。この様な核酸分子には、グルタ
ミンシンテターゼの酵素活性を増加する、または上記の任意の結果をもたらす、少なくと
も一つの遺伝子修飾を有するグルタミンシンテターゼをコードする核酸配列が含まれ得る
。グルタミンシンテターゼの機能と代表的な配列は上記に記載されている。

本明細書に記載の任意の実施態様では、遺伝子修飾した微生物は、グルコース−６−燐
酸デヒドロゲナーゼ活性を微生物中で増加する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を有し
得る。好ましくは、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼを増加する、少なくとも一つ
の別な遺伝子修飾を有し得る遺伝子修飾した微生物はグルコース−６−燐酸デヒドロゲナ
ーゼ活性の増加、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの過剰発現、基質に対するグル
コース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの親和性の増加から選ばれた結果をもたらすことが好
ましい。ある態様では、微生物はグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼをコードする核
酸配列を有する、少なくとも１個の組換え核酸分子で形質転換される。この様な核酸分子
には、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増加する少なくとも一つの遺
伝子修飾を有するグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼをコードする、または任意の上
記結果をもたらす核酸配列が含まれ得る。グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの機能
と代表的な配列は上記に記載されている。

本明細書に記載の任意の実施態様では、遺伝子修飾した微生物は、グリコーゲン合成に
関与する一つ以上の酵素の活性を減少する、少なくとも一つの別な遺伝子修飾を微生物中
に有し得る。この様な酵素にはＡＤＰグルコースピロホスフォリラーゼ、グリコーゲン合
成および分枝酵素を有するグリコーゲン合成が含まれるがそれに限定されない。ある局面
では、グリコーゲン合成に関与する酵素の活性を減少する遺伝子修飾は、微生物中でグリ
コーゲン合成に関与する酵素をコードする、１個以上の内在性遺伝子の部分的または完全
な欠失または不活性化である。

本明細書に記載の任意の実施態様において、遺伝子修飾された微生物はホスファターゼ
活性を増加する少なくとも一つのさらなる遺伝子修飾を有し得る。本明細書に記載された
、遺伝子修飾された微生物の最初の細胞内生成物はグルコサミン−６−燐酸、グルコサミ
ン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−
燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ．ｃｏｌｉを含む多くの微生物で、アンモニウムの適切な細胞内への供給が、グル
コサミン−６−燐酸デアミナーゼの反応に重要である。グルコサミン−６−燐酸、グルコ
サミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミ
ン−１−燐酸は、代表的に細胞外へ輸送する前にグルコサミンおよび／またはＮ−アセチ
ルグルコサミンに脱燐酸化される。それにも拘わらず、グルコサミン−６−燐酸、グルコ
サミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグ
ルコサミン−１−燐酸の脱燐酸化のための適当なホスファターゼ活性を有する様に遺伝子
修飾された微生物を提供することが本発明のなお他の実施態様である。この様なホスファ
ターゼには例えばアルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ホスフォ糖ホスファター
ゼおよびホスフォアミノ糖ホスファターゼが含まれ得るが、それに限定されない。好まし
い実施態様では、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉはホスファターゼ活性（すなわ
ちホスファターゼ作用）のレベルが増大（すなわち、増加）している。

上記の任意の一つの実施態様で、微生物はＮ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼ、
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター（Ｉ
Ｉ^Ｎａｇ）、グルコサミンシンターゼ、ホスフォグルコサミンムターゼ、グルコサミン−
１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジ
ルトランスフェラーゼ、マンノーストランスポーター（ＥＩＩＭ／ＩＩＩ^ｍａｎ）、ホス
フォフルクトキナーゼ、グルコーストランスポーター（ＩＩ^Ｇｌｃ）、グルコサミン−６
−燐酸アセチルトランスフェラーゼおよび／またはホスファターゼでなる群から選択され
る酵素の活性を増加または減少する、少なくとも一つのさらなる遺伝子修飾を有し得る。
Ｅ．ｃｏｌｉ中の遺伝子はＮａｇＡ、ｎａｇＢ、ｎａｇＣ、ｎａｇＤ、ｎａｇＥ、ｇｌｍ
Ｓ、ｇｌｍＭ、ｇｌｍＵ、ｍａｎＸＹＺ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｐｔｓＧ、ＧＮＡＩまた
はホスファターゼ遺伝子にそれぞれ対応する。

上記に定義した様々な遺伝子修飾を組み合わせて、一つ以上の修飾を有する所望の微生
物を形成し、微生物によるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産
を増大することができる。例えば、ある実施態様では、微生物は以下の遺伝子修飾を有す
る：（１）グルコサミン燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾
；および（２）グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する遺伝子修飾。より好ま
しい実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する遺伝子
修飾も有する。

他の実施態様では、微生物は以下の遺伝子修飾を有する：（１）グルコサミン燐酸Ｎ−
アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する遺伝子修飾；および（２）グルコサミン−６
−燐酸デアミナーゼ活性を増加する遺伝子修飾。より好ましい実施態様では、微生物はま
た、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾も有する。

他の実施態様では、微生物は以下の遺伝子修飾を有する：（１）グルコサミン−６−燐
酸デアミナーゼ活性を増加する遺伝子修飾；および（２）グルコサミン−１−燐酸Ｎ−ア
セチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェ
ラーゼ活性を増加する遺伝子修飾、および好ましくはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチ
ルトランスフェラーゼ活性を増加する、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−
燐酸ウリジルトランスフェラーゼ活性を減少する遺伝子修飾。より好ましい実施態様では
、微生物はまた、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を減少する遺伝子修飾も有する
。

他の実施態様では、微生物は以下の遺伝子修飾を有する：（１）グルコサミン−６−燐
酸シンターゼ活性を増加する遺伝子修飾；および（２）グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセ
チルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラ
ーゼ活性を増加する遺伝子修飾、および好ましくはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチル
トランスフェラーゼ活性を増加し、そして／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸
ウリジルトランスフェラーゼ活性を減少する遺伝子修飾。より好ましい実施態様では、微
生物はまた、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する遺伝子修飾も有する。

他の実施態様では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾した微生物は、内因性グルコー
ス−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ（例えば酵母は内因性グルコサミン−６−燐酸
アセチルトランスフェラーゼを有する）および、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性
を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を有する。より好ましい実施態様では、微生物は
グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する遺伝子修飾を有し得る。

他の実施態様では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾した微生物は、転写制御配列と
結合して作動するグルコサミン−６−燐酸シンターゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナ
ーゼ、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン
−６−燐酸デアセチラーゼ、ホスフォグルコサミンムターゼまたはグルコサミン−１−燐
酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトラ
ンスフェラーゼをコードする組換え核酸分子で形質転換される。組換え核酸分子は、酵素
作用に影響する遺伝子修飾を有することができる。組換え核酸分子の発現により、グルタ
ミン−６−燐酸シンターゼ、グルタミン−６−燐酸デアミナーゼ、グルコサミン−６−燐
酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ、
ホスフォグルコサミンムターゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェ
ラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼの微生物によ
る発現および／または生物活性が、組換え核酸分子がない場合の発現レベルまたはタンパ
ク質の生物活性と比較して増加する。好ましい実施態様では、組換え核酸分子が微生物の
ゲノムに組み込まれる。さらなる実施態様では、微生物はグルコサミン−６−燐酸シンテ
ターゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デ
アセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン特異的酵素ＩＩ^Ｎａｇ、ホスフォグルコサミン
ムターゼ、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグル
コサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、ＰＥＰ、
グルコースＰＴＳ、ＥＩＩＭの酵素ＩＩ^Ｇｌｃ、ＰＥＰ、マンノースＰＴＳのＰＩＩＩ^Ｍ
ａｎ、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ、および／またはホスファタ
ーゼの群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも一つのさらなる遺伝
子修飾を有する。遺伝子修飾は、ホスファターゼの作用が増加することが好ましいホスフ
ァターゼの場合を除いて、タンパク質の作用を増加または減少する。別な好ましい実施態
様では、微生物はＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ、グルコサミン−
６−燐酸デアミナーゼおよびＮ−アセチルグルコサミン特異的酵素ＩＩ^Ｎａｇをコードす
る遺伝子が修飾され、その遺伝子修飾はタンパク質の作用を減少または増加する。ある実
施態様では、遺伝子修飾は遺伝子の少なくとも一部の欠失である。

他の実施態様では、本発明の遺伝子修飾された微生物は転写制御配列と作動可能に連結
して作動するグルコサミン−６−燐酸シンターゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ
、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６
−燐酸デアセチラーゼ、ホスフォグルコサミンムターゼまたはグルコサミン−１−燐酸Ｎ
−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランス
フェラーゼをコードする組換え核酸分子；およびＮ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デ
アセチラーゼ、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン特異的
酵素ＩＩ^Ｎａｇ，ホスフォグルコサミンムターゼ、グルコサミン−１−燐酸Ｎ−アセチル
トランスフェラーゼ−Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸ウリジルトランスフェラーゼ
、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｐ
ＥＰ：グルコースＰＴＳおよび／またはＥＩＩＭの酵素ＩＩ^Ｇｌｃ，および／またはＰＥ
Ｐ：マンノースＰＴＳのＩＩＩ^Ｍａｎの群から選ばれたタンパク質をコードする遺伝子中
の少なくとも一つの遺伝子修飾的修飾を有する。遺伝子修飾により、タンパク質の作用が
増加または減少し、組換え核酸分子の発現が、微生物による酵素の発現を増加する。他の
実施態様では、微生物はホスファターゼ遺伝子中に少なくとも一つの遺伝子修飾を有し、
そのためにこの様な遺伝子でコードされたホスファターゼの作用が増加する。好ましい実
施態様では、組換え核酸分子が微生物のゲノム中に組み込まれる。

本明細書に記載の変異の種々の他の組み合わせが本発明に含まれ、その多くが実施例の
項に記載される。

さらに、本発明に開示されたプロセスおよび材料を当業者が使用し得そして／または変
更し得、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ポリグルコサミン、ガラクトサミン、マンノ
サミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびそれらの誘導体
等の他のアミノ糖を製造することができる。

上記の様に、本発明の醗酵法でグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン
をかなりの高い収率で製造するためには、微生物を遺伝子修飾してグルコサミンおよび／
またはＮ−アセチルグルコサミンの生産を増大する。本明細書で用いられるように、遺伝
子修飾された微生物は、その正常な形（すなわち野生型または天然起原）から修飾された
（すなわち変異または変化した）ゲノムを有する。ある態様では、この様な生物は目的の
タンパク質をコードする遺伝子を内在的に含有し発現することが可能で、遺伝子修飾は遺
伝子の遺伝子修飾であり得、それにより、修飾は遺伝子の発現および／または活性にある
影響（例えば、増加、減少、欠失）を及ぼす。他の態様では、この様な生物は目的のタン
パク質を内在的に含有し発現することが可能で、遺伝子修飾は少なくとも１個の外来核酸
配列（例えば組換え核酸分子）の導入であり得、外来核酸配列は目的のタンパク質および
／またはタンパク質の活性またはそのタンパク質をコードする遺伝子の活性に影響するタ
ンパク質をコードする。微生物に導入される外来核酸分子は野生型タンパク質をコードす
ることが可能であるか、または野生型タンパク質または正常なタンパク質と比較してコー
ドされたタンパク質の発現および／または活性に影響する、一つ以上の修飾を受けること
ができる。また別な態様では、その生物が目的のタンパク質をコードする遺伝子を必ずし
も内在的に（自然に）含有する必要はなく、遺伝子修飾されて目的のタンパク質の生物活
性を有するタンパク質をコードする少なくとも１個の組換え核酸分子を誘導する。再び、
組換え核酸分子は野生型タンパク質をコードすることができるか、または組換え核酸配列
を修飾して、野生型タンパク質と比較してコードされたタンパク質の発現および／または
活性に影響することができる。他の実施態様では、様々な発現制御配列（例えばプロモー
ター）を微生物に導入して、微生物中で内在性遺伝子を発現させることができる。これら
の態様のそれぞれに関連する様々な実施態様を、以下により詳細に議論する。

本明細書で使用されるように、遺伝子修飾された微生物には、バクテリア、原生生物、
微細藻類、菌類その他の微生物を含む任意の遺伝子修飾された微生物が含まれ得る。この
様な遺伝子修飾された微生物は、所定の結果（例えば酵素の発現および／または活性が増
加、減少その他の修飾、および／または修飾によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグル
コサミン生産の修飾）が得られる様に、その正常な形（すなわち野生型または天然起原）
が修飾された（すなわち変異または変化した）、および／または染色体外遺伝物質（例え
ば組換え核酸分子）を発現するように修飾されたゲノムを有する。より具体的には、微生
物に対する修飾は、微生物のゲノム（例えば内在性ゲノム）の修飾で行われ得るか、およ
び／または遺伝物質（例えば組換え核酸分子）を微生物中に導入して行われ、その遺伝子
は染色体外に存在するか、または宿主微生物遺伝子中に組み込まれ得る。この結果、遺伝
子修飾には微生物中の内在性核酸配列、または組換えで導入された核酸配列の発現を調節
する調節配列の導入または修飾、野生型または修飾された組換え核酸分子（例えば野生型
または修飾タンパク質をコードする）の導入、微生物中の内在性遺伝子の修飾、または酵
素の発現および／または生物活性に関して特定の特徴を有する微生物が得られる任意の他
の修飾が含まれ得る。微生物の遺伝子修飾は古典的な株の開発、および／または分子遺伝
子技術を用いて行われ得る。この様な技術は公知であり、微生物でも一般的に開示されて
いる（例えばＳａｍｂｒｏｏｏｋら、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｂｓ Ｐ
ｒｅｓｓ）。Ｓａｍｂｒｏｏｋらの参考文献はその全体が参考として本明細書に援用され
る。遺伝子修飾された微生物には、核酸分子が挿入、欠失および／または修飾された（す
なわち、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、置換および／または反転により変異された）
微生物が含まれ、この様な修飾により微生物内に所望の効果を生じる。本発明によれば、
遺伝子修飾された微生物には、組換え技術を用いて修飾された微生物が含まれる。

本発明のある実施態様では、微生物の遺伝子修飾により本発明によるアミノ糖代謝経路
に含まれるタンパク質の活性が増加または減少する。この様な遺伝子修飾には任意の型の
修飾が含まれ、特に組換え技術および／または古典的突然変異誘発で行われた修飾が含ま
れる。本発明で使用されるように、遺伝子発現、遺伝子の機能または遺伝子生成物（すな
わち遺伝子でコードされるタンパク質）の機能の減少をもたらす遺伝子修飾とは、遺伝子
の不活性化（完全または部分的）、欠失、妨害、遮断、抑制または下方調節を言い得る。
例えば、この様な遺伝子でコードされるタンパク質の機能が減少する結果となる遺伝子の
遺伝子修飾により、遺伝子の完全な欠失（すなわち遺伝子が存在せず、従ってタンパク質
も存在しない）、タンパク質が不完全に翻訳または翻訳されない遺伝子の変異（例えばタ
ンパク質が発現しない）、またはタンパク質の本来の機能が減少または失われた遺伝子の
変異（例えば酵素活性または作用が減少または失われたタンパク質が発現する）がもたら
される。具体的には、本明細書で議論される酵素の作用または活性の減少とは、一般的に
問題とする微生物の任意の遺伝子修飾のことであり、酵素の発現および／または機能（生
物活性）が減少する結果となり、それには酵素活性（例えば比活性）の減少、酵素の阻害
または分解の増加ならびに、酵素の発現の減少または喪失が含まれる。例えば、本発明の
酵素の作用または活性が、酵素の生産を妨害または減少、酵素活性の減少、または酵素活
性の阻害により減少し得る。この様な修飾のいくつかの組み合わせもまた可能である。酵
素生産の妨害または減少には、生育培地中に誘導化合物の存在が必要であるプロモーター
の制御下にある酵素をコードする遺伝子を導入することが含まれる。培地に誘導因子が欠
乏する様な条件を与えることにより、その酵素をコードする遺伝子の発現（従って酵素合
成）を切り離すことができる。酵素活性の妨害または減少には、本明細書に参考として組
み込まれる米国特許第４、７４３、５４６号に記載の技術と類似の切除技術アプローチの
使用も含まれる。このアプローチを使用するためには、目的の酵素をコードする遺伝子が
、ゲノムから遺伝子の特異的かつ制御された切除が可能である特定の遺伝子配列間にクロ
ーニングされる。例えば米国特許第４、７４３、５４６号に記される様に培養における培
養温度の変更を、または他の物理的または栄養信号を変えることにより、切除が促され得
る。

遺伝子の発現または機能を増加させる遺伝子修飾とは、遺伝子の増幅、過剰生産、過剰
発現、活性化、増大、付加または上方制御のことであり得る。具体的には、本明細書で議
論する酵素または他のタンパク質の作用（または活性）の増加とは、一般的に問題とする
微生物で酵素またはタンパク質の発現および／または機能（生物活性）の増加をもたらす
任意の遺伝子修飾のことであり、酵素活性（例えば比活性またはインビボでの酵素活性）
の増加、酵素阻害または分解の減少、および酵素の過剰発現を含む。例えば、遺伝子コピ
ー数が増加するか、天然型プロモーターの発現レベルより高い発現レベルを与えるプロモ
ーターの使用により発現レベルが増加され得、または遺伝子工学もしくは古典的突然変異
誘発により遺伝子を変化させ、酵素の生物活性を増加することができる。この様な修飾の
いくつかの組み合わせも可能である。

一般に、本発明によれば、変異体または修飾酵素のある特性（例えば酵素活性）の増加
または減少は、同じまたは同等の条件で測定または確立された、同じ生物由来（同じ起原
または親配列）の野生型（すなわち正常で修飾されていない）酵素の同じ特性を参照して
行われる。同様に、遺伝子修飾された微生物の特性（例えばタンパク質の発現および／も
しくは生物活性、または生成物の生産）の増加または減少は、同じ種の野生型微生物、好
ましくは同じ株の同じ特性を同じまたは等価の条件で参照して行われる。この様な条件に
は、タンパク質の活性（例えば発現または生物活性）または微生物の他の特性が測定され
るアッセイまたは培養条件（例えば培地成分、温度、ｐＨ等）と共に、使用したアッセイ
のタイプ、評価される宿主微生物等が含まれる。上記に議論した様に、等価な条件とは、
類似しているが必ずしも同じ（例えば条件の保存性変化は許容され得る）でない条件（例
えば培養条件）、および同じ条件で行われた対照と比較して微生物生育、酵素発現または
生物活性に対する効果を実質的に変えない条件である。

好ましくは、あるタンパク質（例えば酵素）の活性を増加または減少する遺伝子修飾を
有する遺伝子修飾された微生物は、タンパク質の活性（例えば発現、生産および／または
生物活性）が、野生型微生物中の野生型タンパク質の活性と比較して好ましくは少なくと
も約５％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、よ
り好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは
少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、より好ましくは少なくとも約
４０％、より好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より
好ましくは少なくとも約５５％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少
なくとも約６５％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約７５％、より好ましくは
少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約
９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、または任意の割合、すなわち５％〜１００
％の間の任意の整数（たとえば６％、７％、８％等）の間でそれぞれ増加または減少して
いる。単離された修飾核酸分子またはタンパク質を単離された野生型核酸分子またはタン
パク質と直接比較する場合（例えばインビボと対照して比較をインビトロで行う場合）、
同じ差であることが好ましい。

本発明の他の態様では、あるタンパク質（例えば酵素）の活性を増加または減少する遺
伝子修飾を有する遺伝子修飾された微生物は、野生型微生物中の野生型タンパク質の活性
と比較して、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少な
くとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約３０
倍、より好ましくは少なくとも約４０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ま
しくは少なくとも約７５倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少な
くとも約１２５倍、より好ましくは少なくとも約１５０倍、または少なくとも約２倍から
出発する任意の全整数倍増加（例えば３倍、４倍、５倍、６倍等）で、それぞれタンパク
質の活性（例えば発現、生産および／または生物活性）が増加または減少している。

活性（発現、比活性、インビボ活性などを含む）を増加または減少する微生物の遺伝子
修飾は、微生物中のグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生合成経路ま
たはアミノ糖代謝経路の活性に影響することが好ましく、その経路は内在性で遺伝子修飾
された経路、生物内に一つ以上の組換え核酸分子を導入した内在性の経路、または完全に
組換え技術で作製された経路である。本発明によれば、「グルコサミンおよび／またはＮ
−アセチルグルコサミン生合成経路の活性への影響」には、遺伝子修飾がない場合と比較
して微生物により発現する、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生合
成経路に任意の検出可能なまたは測定可能な変化または修飾を生じる任意の遺伝子修飾が
含まれる。グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生合成経路中の任意の
検出可能な変化または修飾には、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン
生合成経路中の少なくとも一つの生成物生産の検出可能な変化、または微生物による細胞
内および／または細胞外グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン生産の検出可能な
変化が含まれるが、それに限定されない。

本発明のある実施態様では、遺伝子修飾には本明細書に記載の特定の酵素または他のタ
ンパク質をコードする核酸配列の修飾が含まれる。この様な修飾を内在性酵素またはタン
パク質に行うことができ、その結果この様なタンパク質を自然に含む微生物が例えば古典
的突然変異誘発、および遺伝子工学技術を含む選択技術および／または分子遺伝学技術に
より遺伝子修飾される。遺伝子工学技術には例えば、内在性遺伝子のある部分を欠失する
ため、または改良された酵素または他のタンパク質をコードする配列、または内在性酵素
または他のタンパク質の発現を増加する種々のプロモーターをコードする配列のような相
同配列で、内在性遺伝子の一部を交換するための標的組換えベクターの使用が含まれ得る
。遺伝子工学技術にはまた、組換え技術を用いる遺伝子の過剰発現も含まれ得る。

例えば、非天然型プロモーターを、本明細書に記載されるアミノ糖代謝経路中の目的の
酵素または他のタンパク質をコードする少なくとも１個の遺伝子の上流に導入できる。好
ましくは、内在性遺伝子の５’側の上流配列が誘導プロモーターである構成プロモーター
、または使用する生育条件下で最適発現されるプロモーターで置換される。この方法は、
内在性遺伝子が使用する生育条件下で活性でない、または十分に活性でない場合にとくに
有用である。

本発明の本実施態様の別のある態様では、遺伝子修飾には目的の酵素またはタンパク質
をコードする組換え核酸分子を、宿主中へ導入することが含まれ得る。宿主には（１）特
定の酵素またはタンパク質を発現しない宿主細胞、または（２）特定の酵素またはタンパ
ク質を発現せず、導入された組換え核酸分子が微生物中の酵素または他のタンパク質の活
性を変化または増大する宿主細胞が含まれ得る。本発明は任意の遺伝子修飾された微生物
を包含するよう意図され、その微生物は本発明によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグ
ルコサミンを生産するための醗酵プロセスに適した少なくとも一つの修飾を有する。

遺伝子修飾された微生物を、単離された核酸分子の微生物中への導入等により、組換え
技術で修飾することができる。例えば、遺伝子修飾された微生物を、発現の増加が望まれ
るタンパク質等の目的のタンパク質をコードする組換え核酸分子に感染させることができ
る。感染した核酸分子は、染色体外に存在し得るか、またはこの様式で１個以上の部位が
感染（すなわち組換え）宿主細胞の染色体内に組み込まれ得、発現される能力が維持され
る。好ましくは、本発明の宿主細胞が核酸分子に一度感染すると、核酸分子が宿主細胞ゲ
ノム中に組み込まれる。組み込みの重要な利点は、核酸分子が細胞内に安定に維持される
ことである。好ましい実施態様では、組み込まれた核酸分子は、転写制御配列（下記）に
作動可能に結合し、核酸分子の発現を制御する様に誘導され得る。

核酸分子を無秩序または標的組み込みによって宿主細胞のゲノム中に組み込むことがで
きる。この様な組み込み法は当該分野で公知である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ４
７００２はその上に複製のＣｏｌＥ１開始点を含むプラスミドの維持を不可能にする変異
を含む。この様なプラスミドがこの株中に導入される場合、プラスミド上に含まれる遺伝
子マーカーの選択により、プラスミドが染色体中へ組み込まれる。例えばこの株を目的の
遺伝子と、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃＺ遺伝子の５’−末端および３’−末端で挟まれた選択可
能なマーカーを含むプラスミドで形質転換することができる。ｌａｃＺ配列は導入される
ＤＮＡを染色体に含まれるｌａｃＺ遺伝子に向かわせる。ｌａｃＺ座に組み込むことによ
り、酵素β−ガラクトシダーゼをコードする本来のｌａｃＺ遺伝子が、目的の遺伝子を間
に挟む部分ｌａｃＺ遺伝子で置換される。成功した組み込み体を、β−ガラクトシダーゼ
が無いことで選択することができる。導入バクテリオファージ等を用いるような方法によ
り、受容体細胞ゲノム中へ核酸配列を導入して、遺伝子修飾された微生物を作製すること
もできる。組換え技術および導入バクテリオファージ技術を使用して本発明のいくつかの
種々の遺伝子修飾された微生物を作製することは公知であり、実施例の項に詳細に述べら
れる。

温度シフトによりＥ．ｃｏｌｉ染色体中に標的遺伝子を欠失させ、そして組み込むベク
ターおよび方法が、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：
４６１７−４６２２）により記載された。その方法は異なったグルコサミン生産Ｅ．ｃｏ
ｌｉ株を開発するために採用された。遺伝子組み込みのプロトコールには以下の主な工程
が含まれる。第一の工程では、標的部位の配列をクローニングし、内部欠失を作製し、そ
して／または欠失部位に組み込まれる外来遺伝子を挿入することでる。第二工程は、これ
らの配列を含むフラグメントを、温度感受性複製開始点および抗生物質選択マーカーを含
む温度感受性組み込みベクター中へサブクローニングすることである。第三工程は、組み
込みベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、染色体中に組み込まれた全プラスミ
ドを有するクローンを、非許容温度（４２℃）で単一交差組換え法により選択することで
ある。第四工程は、選択したクローンの細胞を液体培養物中で許容温度（３０℃）で培養
することである。組み込みプラスミドを有する細胞は、プラスミドを失い易い。複製開始
点および抗生物質耐性遺伝子の部分または全プラスミドを喪失した細胞は、培養物中で発
芽後成長する。具体的には、この工程は５０ｍｌＬＢ培地に１０個の内の２個のクローン
のプールからの細胞を接種し、培養細胞を２４時間生育させて行われた。培養細胞を１０
００倍希釈の新鮮な培地に移し、さらに２４時間生育した。第五工程では、細胞をプレー
トに接種し、抗生物質耐性を失ったクローンを選択した。組み込み遺伝子または欠失遺伝
子の性質に応じて、特定の遺伝子選択法を用いることができる。クローン選択の具体的方
法では、染色体内に意図された変化を有するクローンを、その本来の形からＰＣＲ生成物
の大きさで区別できるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。クローンを組み込まれ
た、または欠失したＤＮＡ配列に特異的なプローブを用いるサザンブロット分析を用いて
確認した。

本発明は醗酵プロセスで商業的に有用な量のグルコサミンおよび／またはＮ−アセチル
グルコサミンを生産する能力（すなわち、好ましくは同じ条件で培養された野生型微生物
と比較して、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産能が増大した）
のある、微生物の使用を含む方法を開示することを理解される。本明細書中で用いるよう
に、醗酵プロセスとは、微生物等の細胞を、容器、バイオリアクター、培養器またはその
他の適当な培養チャンバー中で、生成物を細胞から生産するために培養する（すなわち、
培養プロセスの間に細胞が生成物を生産する）プロセスである。生成物は代表的には、実
験または商業目的で有用な生成物である。本発明の醗酵法は、アミノ糖代謝経路に含まれ
るタンパク質をコードし、対応する野生型タンパク質と比較して異なった機能（例えば増
加または減少）を有するタンパク質の生産（発現）をもたらす一つ以上の遺伝子の遺伝子
修飾で行われる。この様な異なった機能により、遺伝子修飾された微生物がグルコサミン
および／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産する能力が増大する。実施例に記載され
る特異的選択技術等、本明細書の何れかに記載された様な、特定の異なった機能（例えば
グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐
酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を生産する増大された能力）を有
する遺伝子修飾された微生物の生産により、与えられた機能的必要性に合致する多くの生
物を作製し得ることは、様々な異なった遺伝子修飾によっても当業者が理解する。例えば
、ある核酸配列中の異なった無秩序ヌクレオチド欠失および／または置換は、同じ遺伝子
型の結果を生じ得る（例えばその配列でコードされるタンパク質の作用の減少）。本発明
は、本明細書に示す特性を有する微生物の作製をもたらす、この様な多くの遺伝子修飾を
企図する。

本発明のある実施態様によれば、遺伝子修飾された微生物にはグルコサミン−６−燐酸
、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−
アセチルグルコサミン−１−燐酸の合成能が増大した微生物が含まれる。本発明によれば
、生成物の「合成能の増大」とは、同じ条件下で培養された野生型微生物と比較して、微
生物がより多くの生成物を生産する様な、生成物の合成に関係するアミノ糖代謝経路にお
ける任意の増大または上方制御のことである。

本発明のある態様では、醗酵法で有用な遺伝子修飾された微生物は、任意の適当な培養
条件、特に本明細書に記載の任意の培養条件で、少なくとも約１ｇ／ｌ、好ましくは少な
くとも約５ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも約１０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくと
も約２０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくと
も約４０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約５０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくと
も約６０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約７０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくと
も約８０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約９０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくと
も約１００ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約１１０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少な
くとも約１２０ｇ／ｌ、さらに好ましくは少なくとも約１５０ｇ／ｌ、さらに好ましくは
少なくとも約１８０ｇ／ｌ、またはさらに多い任意の量、または全整数で少なくとも約１
ｇ／ｌ〜少なくとも約５００ｇ／ｌの範囲の任意の量（例えば２ｇ／ｌ、３ｇ／ｌ等）の
グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコ
サミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン
−１−燐酸を生産する。他の局面では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾された微生物
は少なくとも約２倍以上のグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−
燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／または
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは
少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２５倍、より好ましくは少なくとも約
５０倍、さらに好ましくは少なくとも約１００倍、さらに好ましくは少なくとも約２００
倍（全整数倍の、少なくとも約２倍〜少なくとも約２００倍の間の任意の倍数（すなわち
少なくとも３倍、少なくとも４倍等）を含む）を生産し、遺伝子修飾された微生物と同じ
または等価の条件下で培養された同じ種（好ましくは同じ株）の野生型（すなわち、非修
飾、天然起原）微生物より多くのグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン
−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／
またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸を生産する。この様な特性を有する多くの微
生物が実施例の項で同定されている。

他の態様では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾された微生物は、乾燥細胞重量で少
なくとも約８ｇ／ｌの細胞濃度に、３７℃で約２４時間、１４Ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、１
６ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／ｌのクエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ、５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）
_２ＳＯ_３、２０ｇ／ｌのグルコース、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、１ｍＭのＣａＣｌ_２、およ
び１ｍＭのＩＰＴＧを含むｐＨ７．０の発酵培地中で培養した場合、少なくとも約１ｇ／
ｌのグルコサミンを生産する。他の態様では、本発明の醗酵法で有用な遺伝子修飾された
微生物は、乾燥細胞重量で少なくとも約８ｇ／ｌの細胞濃度に、約２８℃〜約３７℃で約
１０から６０時間、１４ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、１６ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／ｌの
クエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ、５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２０ｇ／ｌのグルコース、
１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、１ｍＭのＣａＣｌ_２、および約０．２ｍＭ〜約１ｍＭのＩＰＴＧ
を含むｐＨ７．０発酵培地中で培養した場合、少なくとも約１ｇ／ｌのグルコサミンを生
産する。好ましい実施形態では、ＩＰＴＧの量は、約０．２ｍＭである。

本発明の醗酵法で使用される微生物（例えば宿主細胞または生産生物）は任意の微生物
（例えばバクテリア、原生生物、藻類、菌類、または他の微生物）であり、最も好ましく
はバクテリア、酵母または菌類である。適当なバクテリア属にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれるが、それに限定されない。適当なバクテリア種には、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａ
ｎｓが含まれるが、それに限定されない。酵母の適当な属にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、
Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｈａｆｆｉａが含まれるが、それに
限定されない。酵母の適当な種にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎ
ｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．
ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓおよびＰｈａ
ｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａが含まれるが、それらに限定されない。適当な菌類属には
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉ
ｕｍ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａが含まれるが、それに限定さ
れない。適当な菌類の種にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ
、Ａｂｓｉｄａ ｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ、Ｎ．ｉｎｔ
ｅｒｍｅｄｉａ、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍ ｒｅｅｓｅｉが含まれるが、それに限定
されない。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの特に有用な株はＫ−１２、ＢおよびＷ、
最も好ましくはＫ−１２が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉが好ましいバク
テリアの一つであり、本発明の様々な実施態様の例に使用されているが、グルコサミンお
よび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産し、グルコサミンおよび／またはＮ−アセ
チルグルコサミンの生産を増加を増大する様に遺伝子修飾し得る任意の微生物も本発明の
方法で使用し得ることを理解する必要がある。本発明の醗酵法に使用される微生物はまた
、生産生物と呼ばれ得る。

好ましい実施態様では、遺伝子修飾された微生物はバクテリアまたは酵母であり、好ま
しくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のバクテリアであり、さらに好ましくはＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉである。遺伝子修飾されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉはｎａｇ
Ａ、ｎａｇＢ、ｎａｇＣ、ｎａｇＤ、ｎａｇＥ、ｍａｎＸＹＺ、ｇｌｍＭ、ｐｆｋＢ、ｐ
ｆｋＡ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＳ、ＧＮＡ１、ｐｔｓＧまたはホスファターゼ遺伝子を含むが
、それに限定されない遺伝子が修飾されている。他の実施態様では、この様な遺伝子修飾
されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉはｎａｇレギュロン遺伝子が欠失し、また別な実
施態様ではｎａｇレギュロン遺伝子の欠失およびｍａｎＸＹＺ遺伝子の遺伝子修飾により
ｍａｎＸＹＺ遺伝子でコードされるタンパク質の作用が減少した。

本発明によれば、本明細書の特定の酵素または他のタンパク質の対照とは、野生型参照
タンパク質の少なくとも一つの生物活性を有する任意のタンパク質をいい、全長タンパク
質、融合タンパク質、または天然起原のタンパク質の任意のホモログ（天然型対立遺伝子
変異体、フラグメント、異なった生物由来の関連タンパク質、および合成または人工由来
の変異体（ホモログ）を含む）である。対照タンパク質のホモログ（突然変異体、変異体
、修飾型）には天然起原の対照タンパク質と少なくとも１個または数個−必ずしも１個ま
たは数個に限られない−のアミノ酸の欠失した（例えば、ペプチドまたはフラグメントの
ようなタンパク質の切断型）、挿入された、反転した、置換されたそして／または誘導体
化された（例えばグリコシル化、燐酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パ
ルミチン化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加に
よる）点で異なるタンパク質が含まれる。好ましいホモログの一つは天然起原のタンパク
質の生物活性フラグメントである。本発明で有用な天然起原タンパク質の他の好ましいホ
モログが以下に詳細に記載される。従って、本発明の単離された核酸分子は、任意の特定
のタンパク質のオープンリーディングフレーム、ドメイン、その生物活性フラグメント、
または生物活性を有する天然起原タンパク質またはドメインの任意のホモログの翻訳産物
をコードすることができる。

本発明による単離されたタンパク質は、天然型環境から除去されたタンパク質（すなわ
ち人間による加工が行われた）であり、例えば精製タンパク質、部分精製タンパク質、組
換えで製造したタンパク質、および合成で製造したタンパク質を含み得る。組換えで製造
したタンパク質のいくつかが実施例の項に記載されている。ここで「単離された」とはタ
ンパク質が精製された程度を反映していない。さらに、「タンパク質Ｘ」と呼ばれる仮定
タンパク質の参照例（すなわち本発明で使用された任意の酵素またはタンパク質をこの用
語で置き換えることができる）では、「Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質Ｘ」とは、Ｅ．ｃｏｌｉ
由来のタンパク質Ｘ（天然起原のタンパク質Ｘのホモログも含む）または構造（例えば配
列）の知識から別法で製造されたタンパク質Ｘのことであり、時々Ｅ．ｃｏｌｉ由来の天
然起原タンパク質Ｘの機能のことである。言い換えれば、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質Ｘには
Ｅ．ｃｏｌｉ由来の天然起原タンパク質Ｘと類似の構造と機能を実質的に有するか、本明
細書に詳細に記載されたＥ．ｃｏｌｉ由来の天然起原タンパク質Ｘの生物活性（すなわち
生物活性を有する）ホモログである任意のタンパク質Ｘが含まれる。従って、Ｅ．ｃｏｌ
ｉタンパク質Ｘには精製された、部分的に精製された、組換え、突然変異／修飾および合
成タンパク質が含まれ得る。この議論は本明細書に開示される他の微生物由来のタンパク
質Ｘにも同様に当てはめられる。

ホモログは、天然型対立遺伝子変異または天然型突然変異の結果であり得る。タンパク
質をコードする核酸の天然起原の対立遺伝子変異体は、この様なタンパク質をコードする
遺伝子のようなゲノムと基本的に同じ遺伝子座（単数または複数）に生じる遺伝子である
が、例えば突然変異または組換えで生じた天然型変異のため、類似ではあるが同一ではな
い配列である。対立遺伝子変異体は代表的には、それと比較される遺伝子でコードされる
タンパク質の活性と類似の活性を有するタンパク質をコードする。あるクラスの対立遺伝
子変異体は同じタンパク質をコードし得るが、遺伝子コードの縮重のために異なった核酸
配列を有し得る。対立遺伝子変異体は遺伝子の５’非翻訳領域または３’非翻訳領域での
変化を含み得る（例えば調節制御領域中に）。対立遺伝子変異体は、当業者に周知である
。

ホモログは、単離された、天然起原のタンパク質の直接修飾、直接タンパク質合成、ま
たは例えば無秩序または標的を定めた突然変異誘発を行うための古典的または組換えＤＮ
Ａ技術を用いる、そのタンパク質をコードする核酸配列の修飾を含むがそれに制限されな
いタンパク質産生のための公知の技術を用いて製造し得る。

野生型タンパク質と比較して、ホモログの修飾は、天然起原のタンパク質と比較しての
ホモログの基本的な生物活性に作用するか、拮抗するか、またはこれを実質的に変化させ
る。一般的に、タンパク質の生物活性または生物作用は、インビボ（すなわちタンパク質
の天然型生理的環境中の）またはインビトロ（すなわち実験室条件下）で測定または観察
される、タンパク質の天然起原型に帰せられる、タンパク質により示されまたは実施され
る任意の機能（単数または複数）のことである。本明細書で用いられる酵素およびタンパ
ク質の生物活性は、上記に詳細に記されている。例えば、本明細書で一般的に「グルコサ
ミン−６−燐酸シンターゼ」と呼ばれる酵素は、フルクトース−６−燐酸およびグルタミ
ンからグルコサミン−６−燐酸とグルタミン酸の生成を触媒する。ホモログ中等のタンパ
ク質の修飾は、天然起原タンパク質と同じレベルの生物活性を有するタンパク質を与え得
るか、または天然起原のタンパク質と比較して減少または増加した生物活性を有するタン
パク質を与え得る。タンパク質の発現の減少、または活性の減少をもたらす修飾は、タン
パク質の不活性化（完全もしくは部分的）、下方調節、または作用低下と呼ばれ得る。同
様に、タンパク質の発現の増加またはタンパク質の活性の増加をもたらす修飾は、増幅、
過剰生産、活性化、増大、上方調節、またはタンパク質作用の増加と呼ばれ得る。機能性
サブユニット、ホモログまたは与えられたタンパク質のフラグメントは、天然型タンパク
質（即ち生物活性を有する）と実質的に同じ（例えば少なくとも定性的に同じ）生物機能
を果たし得ることが好ましい。あるタンパク質の機能性サブユニット、フラグメントまた
は他のホモログは、参照または野生型タンパク質の生物活性を有すると見なされるために
参照または野生型タンパク質と必ずしも同じレベルの生物活性を有することが要求されな
い（即ち定性的類似性で充分である）ことが注目される。ある実施態様では、野生型タン
パク質と比較したホモログ中の修飾が、天然起原タンパク質と比較してタンパク質の基本
的な生物活性を実質的に減少しないことが好ましい。ホモログ中で生物活性が増加する（
例えば酵素活性を増加させる）ことが望ましくあり得る。ホモログはまた、天然起原タン
パク質と比較してある化合物による阻害に対する感受性の減少等、タンパク質の機能的、
または酵素活性以外の特性で、天然起原型と比較して異なり得る。

本発明によれば、生物活性ホモログおよびそのフラグメントを含む単離タンパク質は野
生型、または天然起原タンパク質の生物活性の少なくとも一つの特性を有する。タンパク
質の発現と生物活性を検出および測定する方法にはタンパク質転写の測定、タンパク質翻
訳の測定、タンパク質の細胞局在の測定、タンパク質と他のタンパク質との結合または会
合の測定、タンパク質調節配列をコードする遺伝子とタンパク質または他の核酸との結合
または会合の測定、タンパク質を発現する細胞内のタンパク質の生物活性の増加、減少ま
たは誘導の測定が含まれるが、それに限定されない。

本発明によるタンパク質の発現レベルの測定法にはウエスターンブロット、免疫細胞化
学、フローサイトメトリーまたは他の免疫系分析；リガンド結合、酵素活性または他のタ
ンパク質パートナーとの相互作用を含むがそれに限定されないタンパク質の性質に基づく
分析が含まれるがそれに限定されない。結合分析も周知である。２つのタンパク質間の複
合体の結合乗数を測定するため、例えば、ＢＩＡコア装置を使用することができる。複合
体の解離定数は、緩衝液がチップ上を通り過ぎる時間の屈折率の変化をモニターして求め
ることができる（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：４５７
−４６８（１９９３）；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：３４３−３４７（
１９９３））。あるタンパク質と他のタンパク質との結合を測定する他の適当な分析法は
、例えば免疫分析（酵素結合免疫吸収体分析（ＥＬＩＳＡ）および放射線免疫分析（ＲＩ
Ａ）、またはタンパク質の分光学または光学的特性の変化を、蛍光、ＵＶ吸収、円二色性
または核磁気共鳴（ＮＭＲ））でモニターする結合測定である。本発明で用いられるタン
パク質の酵素活性を測定する分析法は当該分野で周知であり、多くが実施例の項に記載さ
れる。

アミノ糖代謝経路に関与し、修飾のための望ましい標的を示し、本明細書に記載の醗酵
プロセスに用いられる酵素およびタンパク質の多くは、代表的な野生型または突然変異タ
ンパク質の機能とアミノ酸配列（およびそれをコードする核酸配列）に関して上記に記載
されている。本発明のある実施態様では、与えられたタンパク質のホモログ（他の生物由
来の関連タンパク質または与えられたタンパク質の修飾型も含み得る）が、本発明の遺伝
子修飾された生物で使用するために含まれる。本発明に含まれるタンパク質のホモログは
、本発明により修飾または過剰発現し得る酵素またはタンパク質のアミノ酸配列を表す、
本明細書に開示のアミノ酸配列に対し、少なくとも約３５％の同一、より好ましくは少な
くと約も４０％同一、より好ましくは少なくとも約４５％同一、より好ましくは少なくと
約も５０％同一、より好ましくは少なくとも約５５％同一、より好ましくは少なくとも約
６０％同一、より好ましくは少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０
％同一、より好ましくは少なくとも約７５％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同
一、より好ましくは少なくとも約８５％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、
より好ましくは少なくとも約９５％同一、より好ましくは少なくとも約９６％同一、より
好ましくは少なくとも約９７％同一、より好ましくは少なくとも約９８％同一、より好ま
しくは少なくとも約９９％同一、または全整数（すなわち３６％、３７％等）で３５％〜
９９％の間の任意％同一であるアミノ酸を含み得る。ホモログのアミノ酸配列が野生型ま
たは参照タンパク質の生物活性を有することが好ましい。

本明細書で用いられる同一性（％）とは、特に指定しない限りホモロジーの評価を意味
し、以下を用いて行われる：（１）標準デフォルトパラメーターを有するアミノ酸配列の
対しｂｌａｓｔｐを、核酸配列に対しｂｌａｓｔｎを用いるＢＬＡＳＴ２．０Ｂａｓｉｃ
ＢＬＡＳＴホモロジー検索；低複雑度領域に対して質問配列がデフォルトにより篩い分
けられる（Ａｌｔｓｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．、Ｍａｄｄｅｎ、Ｔ．Ｌ．、Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ａ
．Ａ．、Ｚｈａｎｇ、Ｊ．、Ｚｈａｎｇ、Ｚ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．およびＬｉｐｍａｎ
、Ｄ．Ｊ．（１９９７）、“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：
ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａ
ｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−
３４０２、その全文を本明細書に参考として援用する）；（２）ＢＬＡＳＴ２整列（以下
に記載のパラメーターを使用）；および／または（３）標準デフォルトパラメーターを有
するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（位置特異性繰り返しＢＬＡＳＴ）。ＢＬＡＳＴ２．０ Ｂａｓ
ｉｃ ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ２の間の標準的なパラメーターにおける若干の差により、
ＢＬＡＳＴ２プログラムを用いると２個の特定の配列が有意のホモロジーを有すると認識
されるのに対し、配列の一つを質問配列として用いるＢＬＡＳＴ２．０ Ｂａｓｉｃ Ｂ
ＬＡＳＴで行われる検索では、最高一致で第二の配列を同定しない場合があることに注意
されたい。さらに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴでは“プロフィル”検索の自動化された使い易い
バージョンが提供され、配列のホモロジーを求める感度の高い方法となる。そのプログラ
ムはギャップ付きＢＬＡＳＴデータベース検索を最初に行う。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログ
ラムは、データーベース検索の次のラウンドのために質問配列を置き換える位置特異性ス
コアマトリックスを構築するために戻される、任意の有意な整列由来の情報を使用する。
従って、％同一性はこれらのプログラムの何れを使用しても決定可能であることを理解す
る必要がある。

ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ、（１９９９）、“Ｂｌａｓｔ２ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｓ−ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅ
ｔｔ．、１７４：２４７−２５０（その全文は本明細書に参考として援用される）に記載
される。ＢＬＡＳＴ２配列を用いて、２個の特定配列を相互に整列させることができる。
ＢＬＡＳＴ２配列の整列は、二つの配列間でギャップ付きＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ２
．０）を行い、得られた整列中にギャップ（欠失および挿入）を導入し得る、ＢＬＡＳＴ
２．０アルゴリズムを用いて、ｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎにおいて行われる。本明
細書では分かりやすくするため、以下の標準デフォルトパラメーターを用いてＢＬＡＳＴ
２配列の整列が行われる：
以下の０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いるｂｌａｓｔｎでは：
マッチングの報酬＝１
ミスマッチの罰則＝−２
開放ギャップ（５）および延長ギャップ（２）罰則
ギャップ× ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（１１）フィルター
（オン）
以下の０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いるｂｌａｓｔｐでは：
開放ギャップ（１１）および延長ギャップ（１）罰則
ギャップ× ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（３）フィルター（
オン）
本発明で参照および／または使用されたタンパク質には、参照タンパク質のアミノ酸配
列の少なくとも３０個の隣接アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質もまた
含まれ得る（すなわち、上で同定した配列の３０個の隣接アミノ酸と１００％同一を有す
る３０個の隣接アミノ酸残基）。好ましい実施態様では、本発明で参照または使用された
タンパク質には、少なくとも５０個、より好ましくは少なくとも７５個、より好ましくは
少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１１５個、より好ましくは少なくとも１
３０個、より好ましくは少なくとも１５０個、より好ましくは少なくとも２００個、より
好ましくは少なくとも２５０個、より好ましくは少なくとも３００個、より好ましくは少
なくとも３５０個の参照タンパク質のアミノ酸配列の隣接アミノ酸残基を有するアミノ酸
配列を有するタンパク質が含まれる。ある実施態様では、この様なタンパク質は参照タン
パク質の生物活性を有する。

本発明によれば、本発明に記載の核酸またはアミノ酸配列に関する“隣接”または“連
続”と言う用語は、破壊されていない配列中で連結されていることを意味する。例えば、
第二の配列の３０個の隣接（または連続）アミノ酸を有する第一配列では、第一配列に第
二配列中の３０個のアミノ酸残基の破壊されていない配列に対し同一性が１００％である
３０個のアミノ酸残基の破壊されない配列が含まれることを意味する。同様に、第二配列
と同一性１００％を有する第一配列では、ヌクレオチドまたはアミノ酸間にギャップがな
く、第一配列が第二配列と正確に一致することを意味する。

他の実施態様では、ホモログを含む本発明で参照された、または使用されたタンパク質
には、ホモログをコードする核酸配列が中程度の、高度のまたは極めて高度のストリンジ
ェント条件（以下に記載）下で、天然起原のタンパク質をコードする核酸分子に（即ち核
酸分子と）ハイブリダイゼーション可能な（即ち天然起原のタンパク質をコードする核酸
分子鎖の相補体とハイブリダイゼーション可能な）、天然起原のタンパク質のアミノ酸配
列と十分に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。与えられたホモログは
、中程度の、高度のまたは極めて高度のストリンジェント条件下で、野生型または参照タ
ンパク質をコードする核酸分子配列の相補体とハイブリダイゼーションする核酸配列でコ
ードされることが好ましい。

参照核酸配列の核酸配列相補体とは、タンパク質をコードする鎖と相補的である核酸の
核酸配列を意味する。あるアミノ酸配列をコードする二重鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡおよび
、その一本鎖ＤＮＡと相補性である配列を有する相補鎖を有することが理解される。従っ
て、本発明の核酸分子は二重鎖または一本鎖の何れかであり、ストリンジェント条件下で
タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列、および／またはこの様なタンパク質を
コードする核酸配列の相補体と安定なハイブリッドを形成する核酸分子を含む。相補的配
列を推論する方法は当業者に公知である。アミノ酸配列決定と核酸配列決定の技術は全く
誤りがないことはないので、本明細書に提示される配列は、たかだか本発明の参照タンパ
ク質の見掛けの配列を表すことに注意しなければならない。

本明細書で用いるハイブリダイゼーション条件とは、核酸分子が類似の核酸分子を同定
するために用いられる標準ハイブリダイゼーション条件を言う。この様な標準条件は、例
えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ、
１９８９に開示されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（同書）はその全文を本明細書に
参考として援用する（特にｐ９．３１−９．６２参照）。さらに、ヌクレオチドのミスマ
ッチ度を様々に変え得るためのハイブリダイゼーションを達成する適当なハイブリダイゼ
ーション条件および洗浄条件を計算する式は、例えばＭｅｉｎｋｏｔｈら、１９８４、Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８、２６７−２８４；Ｍｅｉｎｋｏｔｈら（同書）に開示
され、その全文を本明細書に参考として援用される。

具体的には、本明細書で言う中程度のストリンジェントハイブリダイゼーションおよび
洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応を検出するために用いられる核酸分子で、少
なくとも約７０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を行うことができる条件のこ
とである（すなわちヌクレオチドの約３０％以下のミスマッチを許容する条件）。本明細
書で言う高いストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とは、ハイブリダ
イゼーション反応を検出するために用いられる核酸分子で、少なくとも約８０％の核酸配
列同一性を有する核酸分子の単離を行うことができる条件のことである（すなわちヌクレ
オチドの約２０％以下のミスマッチを許容する条件）。本明細書で言うきわめて高いスト
リンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション反応
を検出するために用いられる核酸分子で、少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する
核酸分子の単離を行うことができる条件のことである（すなわちヌクレオチドの約１０％
以下のミスマッチを許容する条件）。上記で議論した様に、この様な特定のレベルのヌク
レオチドのミスマッチを行うための適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を計算
するために、当業者はＭｅｉｎｋｏｔｈらの式（上記）を使用することができる。この様
な条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが形成されるか否かにより
変化する。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融点の計算温度は、ＤＢＡ：ＲＮＡハイブリッ
ドのそれより１０℃低い。ある特定の実施態様では、ＤＮＡ：ＤＮＡのストリンジェント
ハイブリダイゼーション条件には、約２０℃〜約３５℃（より低いストリンジェント）、
より好ましくは約２８℃〜約４０℃（よりストリンジェント）、さらに好ましくは、約３
５℃〜約４５℃（さらによりストリンジェント）の間の温度で、適当な洗浄条件でイオン
強度６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ^＋）におけるハイブリダイゼーションが含まれる。特定
の実施態様では、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのストリンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件には、約３０℃〜約４５℃、より好ましくは約３８℃〜約５０℃、さらにより好ま
しくは、約４５℃〜約５５℃の間の温度で、同様なストリンジェント洗浄条件でイオン強
度６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ^＋）におけるハイブリダイゼーションが含まれる。これら
の値は、約１００個のヌクレオチドより大きい分子に対する、０％ホルムアミドおよびＧ
＋Ｃ含有量約４０％における融点の計算に基づいている。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上
記文献ｐ９．３１〜９．６２に記載された様にＴ_ｍを経験的に計算することができる。一
般に、洗浄条件はできるだけストリンジェントであり、選択したハイブリダイゼーション
条件に適している必要がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件には塩条件および特
定のハイブリッドのＴ_ｍの計算値より約２０〜２５℃低い温度条件の組み合わせが含まれ
、洗浄条件には代表的には塩条件および特定のハイブリッドのＴｍの計算値より約１２〜
２０℃低い温度条件の組み合わせが含まれる。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに使用するに
適したハイブリダイゼーション条件の一例には、約４２℃における６×ＳＳＣ（５０％ホ
ルムアミド）中の２〜２４時間のハイブリダイゼーション、次いで約２×ＳＳＣ中の室温
での１回以上の洗浄を含む洗浄工程、次いでさらに高温で低イオン強度（例えば約０．１
〜０．５×ＳＳＣ中で約３７℃での少なくとも１回の洗浄、次いで約６８℃、約０．１〜
０．５×ＳＳＣでの洗浄）の洗浄が含まれる。

ある実施態様では、ホモログは自然対立遺伝子変異または自然突然変異の結果であり得
る。あるタンパク質のホモログはまた、本明細書記載の核酸またはアミノ酸レベルで相互
に少なくともある構造的類似性を有する（例えば少なくとも約３５％同一）、異なる生物
由来の実質的に同じ機能を有する天然起原のタンパク質であり得る。本発明のホモログは
また、例えば古典的または組換えＤＮＡ技術を用いて無秩序または標的を定めた突然変異
誘発を行う、タンパク質の直接修飾またはそのタンパク質をコードする遺伝子の直接修飾
を含むがそれに限定されない公知の技術を用いて作成され得る。あるタンパク質をコード
する核酸の天然起原対立遺伝子変異体は、その所定のタンパク質をコードするが、例えば
突然変異または組換えにより生じた自然変異体のために、類似ではあるが同一でない配列
を有する遺伝子と、基本的に同じゲノム内の遺伝子座（単数または複数）で生じる遺伝子
である。自然対立遺伝子突然変異体は代表的に、比較される遺伝子でコードされるタンパ
ク質の活性と類似の活性を有するタンパク質をコードする。あるクラスの対立遺伝子変異
体は同じタンパク質をコードし得るが、遺伝子コードの縮重のため異なった核酸配列を有
する。対立遺伝子変異体は、遺伝子の５’または３’未翻訳領域（例えば調節制御領域）
の変化を含み得る。対立遺伝子変異体は当業者に周知である。

ある態様では、本発明のタンパク質および／またはホモログの最少サイズはタンパク質
の所望の生物活性を有するために十分なサイズである。他の実施態様では、本発明のある
タンパク質は少なくともアミノ酸長３０、より好ましくは少なくともアミノ酸長約５０、
より好ましくは少なくともアミノ酸長７５、より好ましくは少なくともアミノ酸長１００
、より好ましくは少なくともアミノ酸長１１５、より好ましくは少なくともアミノ酸長１
３０、より好ましくは少なくともアミノ酸長１５０、より好ましくは少なくともアミノ酸
長２００、より好ましくは少なくともアミノ酸長２５０、より好ましくは少なくともアミ
ノ酸長３００、より好ましくは少なくともアミノ酸長３５０である。タンパク質があるタ
ンパク質の一部または全長タンパク質プラス必要あれば追加配列（例えば融合タンパク質
配列）を含み得る点で、実用的な制限以外にこの様なタンパク質の最大サイズに制限はな
い。本発明で用いられる適当な融合セグメントにはタンパク質の安定性を増進し得る、他
の所望の生物活性を提供する（例えば第二酵素の融合）、および／またはタンパク質精製
を補助する（例えば親和性クロマトグラフィーによる）セグメントが含まれるがそれに制
限されない。

本発明のある実施態様では、本明細書に記載の任意のアミノ酸配列を、少なくとも１個
、約２０個までの、特定のアミノ酸配列のＣ−および／またはＮ−末端にそれぞれ隣接す
る別な異種アミノ酸を用いて製造できる。得られたタンパク質またはポリペプチドは特定
のアミノ酸が「から本質的なる」と言うことができる。本発明によれば、相同アミノ酸は
特定のアミノ酸配列ではさまれた、天然に見出されない（即ちインビボで自然に見出され
ない）か、特定のアミノ酸配列の機能と関連しないか、またはあるアミノ酸配列を誘導す
る生物が利用する標準コドンを用いて天然起源配列におけるこのようなヌクレオチドが翻
訳される場合、遺伝子内で生じる様な特定のアミノ酸配列をコードする天然起原核酸配列
に隣接するヌクレオチドによってコードされないアミノ酸の配列である。同様に、本明細
書の核酸配列に参照して用いられる場合「から本質的なる」という句は、特定のアミノ酸
配列をコードする核酸配列の５’および／または３’末端それぞれで少なくとも１個、多
くても約６０個までの別な異種核酸配列に隣接し得る特定のアミノ酸配列をコードする核
酸配列をいう。天然型遺伝子内で生じる様に、特定アミノ酸配列をコードする核酸配列に
隣接する異種ヌクレオチドは天然に見出されない（すなわち生体内で自然に見出されない
）か、任意の別な機能を与えるタンパク質をコードせず、特定のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質の機能も変化させないタンパク質をコードしない。

本発明の実施態様には、本明細書に記載のアミノ糖代謝経路中の酵素または他のタンパ
ク質をコードする核酸分子の使用および／または操作が含まれる。本発明の核酸分子には
、本明細書に記載の任意の酵素または他のタンパク質をコードする核酸配列を含む、その
核酸配列から本質的になる、またはその核酸配列からなる核酸分子が含まれる。

本発明によれば、単離された核酸分子はその天然の環境から除去された（すなわち人に
操作された）核酸分子であり、その天然の環境はその核酸分子が天然に見出されるゲノム
または染色体である。従って、“単離された”とはその核酸分子が精製された程度を必ず
しも反映せず、その核酸分子が天然に見出される全ゲノムまたは全染色体をその分子が含
まないことを示すものである。単離された核酸分子には、本明細書に記載のグルコサミン
−６−燐酸シンテターゼ遺伝子等の遺伝子が含まれ得る。ある遺伝子を含む単離された核
酸分子はこの遺伝子を含む染色体のフラグメントではなく、むしろこの様な遺伝子に関連
するコード領域および調節領域を含むが、同じ染色体上に天然で見出される別な遺伝子を
含まないフラグメントである。単離された核酸分子は、通常は天然で特定の核酸配列に側
面しない別な核酸（すなわち配列の５’および／または３’末端）、隣接する特定の核酸
配列（すなわち異種配列）も含む。単離された核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ（例えばｍＲＮ
Ａ）またはＤＮＡまたはＲＮＡ（例えばｃＲＮＡ）の誘導体を含み得る。“核酸分子”と
言う用語は一次的には体の核酸分子のことであり、「核酸配列」という用語は一次的には
核酸分子上のヌクレオチドの配列を言うが、二つの用語は交換可能に使用され得、特にタ
ンパク質をコードし得る核酸分子または核酸配列に関して交換可能に使用される。

本発明の単離された核酸分子は組換えＤＮＡ技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）増幅、クローニング）または化学合成を使用して製造されることが好ましい。単離さ
れた核酸分子には、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換および／または反転され、その様な
修飾がタンパク質の生物活性に所定の影響を与える様式において、天然型対立遺伝子変異
体および修飾された核酸分子が含まれるが、それに限定されない天然型核酸分子およびそ
のホモログが含まれる。対立遺伝子変異体およびタンパク質ホモログ（例えば核酸ホモロ
グでコードされたタンパク質）は上記に詳細に議論されている。

核酸分子ホモログを当業者に公知のいくつかの方法を使用して製造できる（例えばＳａ
ｍｂｒｏｏｋら（上記）参照）。例えば、部位指向突然変異誘発、突然変異を誘発するた
めの核酸分子の薬品処理、核酸フラグメントの制限酵素切除、核酸フラグメントのライゲ
ーション、ＰＣＲ増幅および／または核酸配列の選択領域の突然変異誘発、オリゴヌクレ
オチド混合物の合成ならびに、核酸分子の混合物およびその組み合わせを“構築”するた
めの混合物群のライゲーション等、古典的突然変異誘発技術および組換えＤＮＡ技術を含
むがそれに限定されない、様々な技術を用いて核酸分子を修飾することができる。核酸お
よび／または野生型遺伝子とのハイブリダイゼーションによりコードされるタンパク質の
機能をスクリーニングして、核酸分子ホモログを修飾核酸の混合物から選択することがで
きる。

本発明の核酸分子の最少サイズは、所望の生物活性を有するタンパク質をコードするに
十分な、または天然型タンパク質をコードする核酸分子の相補配列と（例えば中程度、高
度または極めて高度なストリンジェント条件下、および好ましくは極めて高度のストリン
ジェント条件下で）安定なハイブリッドを生成し得るプローブまたはオリゴヌクレオチド
プライマーを形成するに十分なサイズである。従って、本発明の核酸分子のサイズは、核
酸の組成、および核酸分子と相補配列間の相同性または同一性の割合ならびに、ハイブリ
ダイゼーション条件そのもの（例えば温度、塩濃度、およびホルムアミド濃度）に依存し
得る。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして使用される核酸分子の最少サ
イズは、代表的には核酸分子がＧＧに富んでいる場合は少なくとも約１２〜約１５ヌクレ
オチド長、ＡＴに富んでいる場合は少なくとも約１５〜約１８塩基長である。本発明の核
酸分子の最大サイズには、核酸分子がタンパク質コード配列の一部、全長タンパク質をコ
ードする核酸配列（完全な遺伝子を含み）を含み得る点で、実用的な限度以外は制限がな
い。

本発明のある核酸分子の核酸配列、特に本明細書に詳細に記載された任意の核酸配列の
知見により、当業者は例えば（ａ）これらの核酸分子のコピーを作成する、および／また
は（ｂ）この様な核酸分子の少なくとも一部を含む核酸分子（例えば全長遺伝子、全長コ
ード領域、調節制御配列、切断コード領域を含む核酸分子）を得ることができる。この様
な核酸分子は、適当なライブラリーまたはＤＮＡをスクリーニングするためのオリゴヌク
レオチドプローブを用いる伝統的なクローニング技術、およびオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いる適当なライブラリーまたはＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む様々な方法で得ること
ができる。スクリーニングまたは核酸分子の増幅からの好ましいライブラリーには、バク
テリアまたは酵母ゲノムＤＮＡライブラリー、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉゲ
ノムＤＮＡライブラリーが含まれる。遺伝子をクローニングし増幅する技術は、例えばＳ
ａｍｂｒｏｏｋらの文献（上記）に開示されている。

本発明の他の実施態様には、組換えベクターを有する組換え核酸分子、および本明細書
に記載のアミノ糖代謝経路中の任意の酵素または他のタンパク質の生物活性を有するアミ
ノ酸配列をコードする核酸配列を有する核酸分子が含まれる。本発明によれば、組換えベ
クターは、このような核酸配列を宿主細胞中に導入するため、および最適な核酸配列を操
作するための道具として用いられる、遺伝子工学による（即ち人工的に製造された）核酸
分子である。従って、組換えベクターは、最適な核酸配列を発現および／または宿主細胞
中に配送し組換え細胞を作成するための、最適な核酸配列をクローニング、配列決定およ
び／または他の操作をするために用いるのに適している。代表的にはこの様なベクターは
異種核酸配列を含む。すなわち、その核酸配列はクローニングまたは配送される核酸配列
に隣接して天然では見出されない核酸配列であるが、そのベクターは本発明の核酸分子に
隣接して天然で見出されるか、あるいは本発明の核酸分子の発現に有用である（以下に詳
細に議論される）調節核酸配列（例えばプロモーター、未翻訳領域等）も含み得る。ベク
ターは原核または真核細胞のＲＮＡまたはＤＮＡ、代表的にはプラスミドであり得る。ベ
クターは染色体外要素（例えばプラスミド）として維持され得るか、または組換え生物（
例えば微生物または植物）の染色体中に組み込まれる。ベクター全体が宿主細胞内の正規
の位置に残留し得るか、またはある条件下ではプラスミドＤＮＡが欠失し、本発明の核酸
分子が残され得る。組み込まれた核酸分子は染色体プロモーター制御下、天然またはプラ
スミドプロモーターの制御下に置かれるか、あるいはいくつかのプロモーターの組み合わ
せの制御下に置かれ得る。核酸分子の１個または複数個のコピーを染色体に組み込むこと
もできる。本発明の組換えベクターは少なくとも１個の選択マーカーを含み得る。

ある実施態様では、本発明の組換え核酸分子に用いられる組換えベクターは発現ベクタ
ーである。本明細書で用いられる“発現ベクター”と言う用語は、コードされた生成物（
例えば関心のあるタンパク質）の製造に適したベクターを言う。本実施態様では、製造さ
れる生成物をコードする核酸配列が組換えベクター中に挿入され、組換え核酸分子を生成
する。製造されるタンパク質をコードする核酸配列が核酸配列がベクター中の制御配列に
作動可能に結合する様式でベクター中に挿入され、組換え宿主細胞中で核酸配列の転写お
よび翻訳を可能にする。

他の実施態様では、本発明の組換え核酸分子に用いられた組換えベクターは標的化ベク
ターである。本明細書で用いられる“標的化ベクター”と言う用語は、特定の核酸分子を
組換え宿主細胞中に配送するために用いられるベクターのことであり、その核酸分子は宿
主細胞または微生物内の内因性遺伝子を欠失または不活性化するために用いられる（すな
わち、標的遺伝子の破壊またはノックアウト技術に用いられる）。この様なベクターは当
該分野で“ノックアウト”ベクターとしても知られている。本実施態様のある態様では、
ベクターの一部であるが、より代表的にはベクター中に挿入された核酸分子（すなわちイ
ンサート）は宿主細胞中で標的遺伝子（すなわち欠失または不活性化の標的となる遺伝子
）の核酸配列と相同である核酸配列を有する。ベクターインサートの核酸配列は、標的遺
伝子に結合する様に設計され、標的遺伝子とインサートが相同組換えを行い、その結果（
即ち突然変異または欠失した内因性標的遺伝子の少なくとも一部により）内因性標的遺伝
子が欠失、不活性化または減衰する。

代表的には、組換え核酸分子には、転写制御配列および翻訳制御配列を含む、１個以上
の発現制御配列と作動可能に結合する本発明の少なくとも一つの核酸分子が含まれる。本
明細書で用いる“組換え分子”または“組換え核酸分子”と言う用語は、主に発現制御配
列と作動可能に結合する核酸分子または核酸配列を言うが、この様な核酸分子が本明細書
で議論するような組換え分子である場合、“核酸分子”と言う用語と互換的に用いられ得
る。本発明によれば、“作動可能に結合”と言う用語は、核酸分子を、宿主細胞中にトラ
ンスフェクションさせた（すなわち、形質転換、導入、トランスフェクション、複合化ま
たは誘導された）場合、その分子が発現可能な様式で発現制御配列（例えば転写制御配列
および／または翻訳制御配列）に結合させることを言う。転写制御配列は転写の開始、伸
長または停止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハ
ンサー、オペレーターおよびレプレッサー配列等の転写開始を制御する配列である。適当
な転写制御配列には、組換え核酸分子が導入される宿主細胞または生物中で機能し得る任
意の転写制御配列が含まれる。

本発明の組換え核酸分子は翻訳調節配列、複製起点、および組換え細胞に適応し得る他
の調節配列等の別な調節配列も含むことができる。ある実施態様では、宿主染色体中へ組
み込まれる分子を含む本発明の組換え分子は、分泌シグナル（すなわちシグナルセグメン
ト核酸配列）も含み、発現タンパク質をそのタンパク質を生産する細胞から分泌すること
ができる。適当なシグナルセグメントには発現されるタンパク質と天然で結合するシグナ
ルセグメント、または本発明によるタンパク質の分泌を目的とし得る任意の異種シグナル
セグメントが含まれる。他の実施態様では、本発明の組換え分子は、発現タンパク質を宿
主細胞の膜に配送し挿入し得るリーダー配列を有する。適当なリーダー配列には天然でタ
ンパク質と結合するリーダー配列、またはタンパク質の細胞膜への配送および挿入を目的
とし得る任意の異種リーダー配列が含まれる。

本発明によると、“トランスフェクション”と言う用語は異種核酸分子（即ち組換え核
酸分子）を細胞へ挿入する任意の方法を言う。“形質転換”と言う用語は、この様な用語
が核酸分子を藻類、バクテリアおよび酵母等の微生物細胞中、または植物細胞中へ導入す
る意味で使用されている場合、“トランスフェクション”と言う用語と互換的に用いるこ
とができる。微生物および植物系では、用語“形質転換”は微生物または植物が異種核酸
を取得したことによる遺伝的変化を説明するために用いられ、“トランスフェクション”
と言う用語と本質的に同義語である。従って、トランスフェクション技術には形質転換、
細胞の薬品処理、粒子爆撃、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、リ
ポフェクション、吸着、感染およびプロトプラスト融合が含まれるがそれに限定されない
。

組換え細胞をバクテリアまたは酵母（すなわち宿主細胞）を１個以上の組換え分子で形
質転換して生成することが好ましく、その組換え分子は１個以上の転写制御配列を含む発
現ベクターと作動可能に連結する、それぞれ１個以上の核酸分子を有する。“作動可能に
連結”と言う用語は、その分子が宿主細胞中に形質転換された場合、発現可能である様式
において、核酸分子を発現ベクター中に挿入することを意味する。本明細書で用いる発現
ベクターは、宿主細胞を形質転換し、特定の核酸分子を発現し得るＤＮＡまたはＲＮＡベ
クターである。発現ベクターが宿主細胞内で複製可能であることも好ましい。本発明では
、発現ベクターは代表的にはプラスミドである。本発明の発現ベクターには、酵母宿主細
胞またはバクテリア宿主細胞、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞中
で機能（すなわち直接遺伝子発現）する任意のベクターが含まれる。本発明の好ましい組
換え細胞は実施態様例の項に記載される。

本発明の核酸分子は、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および組換え細胞と適
合し、本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列等の調節配列を含む発現ベクター
と作動可能に連結することができる。特に、本発明の組換え分子は転写制御配列を含む。
転写制御配列は、転写の開始、伸長および停止を制御する配列である。特に重要な転写制
御配列はプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびレプレッサー配列等、転写開
始を制御する配列である。適当な転写制御配列には酵母またはバクテリア細胞、好ましく
はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で機能し得る任意の転写制御配列が含まれる。様
々なこの様な転写制御配列が当業者に公知である。

本明細書に記載の様々な酵素およびタンパク質をコードする核酸配列を有する組換え核
酸分子（それらのホモログを含む）を人工プロモーターの制御下にクローニングすること
が好ましい。そのプロモーターは生産生物中に十分なレベルのコードされたタンパク質を
維持するに必要なレベルの遺伝子発現を行う任意の適当なプロモーターであり得る。適当
なプロモーターは、様々な薬品（例えば、ラクトース、ガラクトース、マルトースまたは
塩）、または生育条件の変化（温度等）で誘導可能なプロモーターであり得る。誘導可能
なプロモーターを使用することにより、遺伝子発現と醗酵プロセスの最適性能を得ること
ができる。高価な誘導因子を添加する必要がないので、好ましいプロモーターは構成プロ
モーターであっても良い。この様なプロモーターにはより弱い突然変異体レプレッサー遺
伝子等による遺伝子修飾により機能的に構造性または“漏出”性となった、通常誘導し得
るプロモーター系が含まれる。使用される特に好ましいプロモーターはｌａｃ、Ｐ_Ｌおよ
にＴ７である。遺伝子投与量（コピー数）は必要とする最大生成生産量により変化し得る
。ある実施態様では、組換え遺伝子が宿主染色体中に組み込まれる。

組換えＤＮＡ技術を使用することで、例えば宿主細胞中の核酸分子のコピー数、これら
の核酸分子の転写効率、得られた転写体の翻訳効率、および翻訳後修飾効率を操作するこ
とにより形質転換核酸分子の発現を改善し得ることは、当業者が理解し得る。本発明の核
酸分子の発現を増加させるために有用な組換え技術には核酸分子の高コピー数プラスミド
への動作可能な連結、宿主細胞染色体への核酸分子の統合、プラスミドへのベクター安定
化配列の付加、転写制御シグナル（例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー）
の置換または修飾、宿主細胞のコドン利用に対応する本発明の核酸分子の修飾、転写制御
シグナルの置換または修飾、転写体を不安定化する配列の欠失、および醗酵中に組換え細
胞の生育を組換え酵素の生産から一時的に切り離す制御シグナルの使用が含まれるがそれ
に限定されない。本発明の発現組換えタンパク質の活性を、この様なタンパク質をコード
する核酸分子を断片化、修飾または誘導体化することにより改善し得る。この様な修飾は
実施態様例の項に詳細に記されている。

本発明の一つ以上の組換え分子を使用して本発明のコードされた生成物を製造すること
ができる。ある実施態様では、コードされた生成物は本明細書に記載の核酸分子の発現で
、タンパク質を生産するに有効な条件下で製造される。コードされたタンパク質を製造す
るための好ましい方法は、宿主細胞を一つ以上の組換え分子でトランスフェクトし、組換
え細胞を作成することである。適当な細胞（例えば宿主細胞または生産細胞）は任意の微
生物（例えばバクテリア、原生生物、藻類、菌類、その他の微生物）であり最も好ましく
は、バクテリア、酵母または菌類である。適当なバクテリア属にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、および
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれるがそれに限定されない。適当なバクテリア種にはＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉ
ｄａｎｓが含まれるがそれに限定されない。酵母の適当な属にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＰｈａｆｆｉａが含まれるがそれ
に限定されない。適当な酵母の種にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉ
ｃａｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ、Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓおよ
びＰｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａが含まれるがそれに限定されない。適当な菌類の
属にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａが含まれるがそれに限
定されない。適当な菌類の種にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｅｒｕｌｅａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｃｈｒ
ｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ
、Ｎ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍ ｒｅｅｓｅｉが含まれるがそ
れに限定されない。宿主細胞は未トランスフェクト細胞または少なくとも一つの他の組換
え核酸分子で既にトランスフェクトされた細胞であり得る。

本発明の別な実施態様には本明細書に記載の任意の遺伝子修飾微生物、および実施例で
具体的に同定された微生物の同定特性を有する微生物が含まれる。この様な同定特性には
、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産能を含む実施例の微生物の
任意の、または全ての遺伝子型および／または表現型特性が含まれる。

上記の様に、本発明のグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの製造法
では、遺伝子修飾されたアミノ糖代謝経路を有する微生物をグルコサミンおよび／または
Ｎ−アセチルグルコサミン生産用の醗酵培地中で培養する。適当な、または有効な醗酵培
地とは、培養により本発明の遺伝子修飾された微生物がグルコサミンおよび／またはＮ−
アセチルグルコサミンを生産し得る任意の培地をいう。この様な培地は代表的に同化可能
な炭素、窒素およびホスフェート原料を含む水性培地である。この様な培地には適当な塩
、無機物およびその他の栄養素も含まれ得る。本明細書に記載の微生物に対する遺伝子修
飾の一つの利点は、この様な遺伝子修飾がアミノ糖の代謝をかなり変化させるが、生産生
物に何らの栄養要求を生じないことである。従って、グルコース、フラクトース、ラクト
ース、グリセロールまたは二種以上の異なった化合物の混合物を唯一の炭素源として含む
最小塩培地が、醗酵培地として使用されることが好ましい。最小塩グルコース培地がグル
コサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン醗酵用の最も好ましい培地であり、こ
れはまた、生成物の回収と精製が促進される。ある態様では、酵母抽出液が培地の成分で
ある。

本発明の微生物を通常の醗酵バイオリアクター中で培養することができる。微生物をバ
ッチ、栄養補給バッチ、細胞循環および連続醗酵を含むがそれに限定されない任意の醗酵
プロセスで培養することができる。本発明の微生物をバッチまたは栄養補給醗酵プロセス
で生育することが好ましい。

本発明のある実施態様では、インキュベーション前に醗酵培地を所望の温度、代表的に
は約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約４５℃、または約２５〜約４０℃に、約２５
〜約３７℃の温度に加温するが、ある実施態様では約３０〜約３７℃がより好ましい。醗
酵条件には本発明の微生物を、約２０〜４０℃の間の全ての温度上昇（すなわち２１℃、
２２℃等）の任意の温度で培養することが含まれ得る。生育と本発明の微生物によるグル
コサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン生産のための最適温度は、様々な因子
で変化し得ることに注意する必要がある。例えば、微生物中の組換え核酸分子の発現のた
めの特定のプロモーターの選択は、最適培養温度に影響し得る。当業者は標準技術を用い
る本発明の任意の微生物に対する最適生育およびグルコサミンおよび／またはＮ−アセチ
ルグルコサミン生産温度を、本発明のある微生物に対して実施例の項に記載した様に、容
易に決定し得る。

活発に生育している遺伝子修飾微生物の培養物を、妥当な生育時間後に高い細胞密度で
生成するに十分な量で培地に播種する。少なくとも約１０ｇ／ｌ、好ましくは約１０〜約
４０ｇ／ｌ、より好ましくは約４０ｇ／ｌの細胞密度で細胞が生育する。このプロセスは
代表的には約１０〜６０時間を要する。

初期の細胞生育中、および代謝の維持、およびグルコサミンおよび／またはＮ−アセチ
ルグルコサミン生産中の細胞の増殖を維持するために、醗酵工程中に十分な酸素を培地に
加えなければならない。培地の攪拌と曝気が酸素供給に便利である。攪拌と振盪等の通常
の方法も培地の攪拌と曝気に使用し得る。培地中の酸素濃度は飽和値（すなわち大気圧で
約３０〜４０℃における酸素の培地中への溶解度）の約１５％以上であることが好ましく
、飽和値の約２０％以上であることがより好ましいが、醗酵に悪影響を与えない場合はよ
り低い濃度へずれること（ｅｘｃｕｒｉｓｉｏｎ）も起こり得る。さらに、生産プロセス
中にグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの安定性および生成が助長さ
れる場合、醗酵中に任意の適当な時間、酸素レベルを極めて低いレベルにすることが可能
であることも理解される。培地の酸素濃度を酸素電極等の通常の方法でモニターすること
ができる。未希釈酸素ガスおよび窒素以外の不活性ガスで希釈された酸素ガス等の他の酸
素源も用いることができる。

醗酵によるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産は唯一の炭素
源としてグルコースの使用に基づくことが好ましいので、好ましい実施態様ではＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中にＰＥＰ：グルコースＰＴＳが誘導される。従って、機能性
ＥＩＩＭ、ＰＥＰ：マンノースＰＴＳのＰ／ＩＩＩ^Ｍａｎ（例えばｍａｎＸＹＺ突然変異
を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中に）がない場合でも、生成物であるグルコ
サミンが誘導されたグルコース輸送系を通して細胞に取り込まれると考えられる。しかし
ながら、過剰発現のグルコースが存在すると、グルコサミンの取り込みは厳しく抑制され
る。従って、醗酵バイオリアクター中の過剰のグルコースを維持することにより生成グル
コサミンの取り込みを阻止することが、本発明の実施態様の一つである。本明細書で用い
る“過剰”のグルコースとは、上記の培養条件等の正常な条件下で微生物の生育を維持す
るに必要な量以上のグルコース量を言う。

グルコース濃度が重量／体積比で醗酵容積の約０．０５〜１５％の濃度に保たれること
が好ましい。他の実施態様では、グルコース濃度が醗酵培地の約０．５ｇ／ｌ〜約１５０
ｇ／ｌに、より好ましくは醗酵培地の約０．５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌに、さらに好まし
くは約５ｇ／ｌ〜約２０ｇ／ｌの濃度に保たれる。ある実施態様では、醗酵培地のグルコ
ース濃度は任意の的様な方法で（例えばグルコース試験ストリップで）モニターされ、グ
ルコース濃度が欠乏またはほとんど欠乏している場合、さらなるグルコースを培地に追加
することができる。他の実施態様では、醗酵培地の半連続または連続補充でグルコース濃
度が維持される。グルコースについて本発明で開示されたパラメーターは、本発明の醗酵
培地において使用される任意の炭素源にも適用することができる。グルコサミンおよび／
またはＮ−アセチルグルコサミンの製造プロセスを助長するならば、醗酵時間中に任意の
適切な時間で炭素源を検出不能のレベルに到達させ得ることがさらに理解される。本発明
の醗酵法で使用できる他の炭素源にはフラクトース、五糖、ラクトースおよびグルコン酸
が含まれるがそれに限定されない。五糖にはリボース、キシロースおよびアラビノースが
含まれるがそれに限定されない。ある態様では、培養工程はグルコースとリボースを含む
醗酵培地中で行われる。

グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産と安定性を維持および／
または増大するために必要な、醗酵培地の他の成分およびパラメーターを補充および／ま
たは制御することが、本発明のまた別な実施態様である。例えば、ある実施態様では、醗
酵培地には硫酸アンモニウムが含まれ、醗酵培地中の硫酸アンモニウム濃度は過剰の硫酸
アンモニウムの添加で補充される。好ましくは、醗酵培地中の硫酸アンモニウムの量は約
０．１％〜約１％（重量／体積）、好ましくは約０．５％のレベルに保たれる。また別な
実施態様では、醗酵培地のｐＨの変動がモニターされる。本発明の醗酵法では、好ましく
は、ｐＨは約ｐＨ４．０〜約ｐＨ８．０に保たれ、ある態様では約ｐＨ４〜約ｐＨ７．５
、他の態様では約ｐＨ６．７〜約ｐＨ７．５、他の実施態様では約ｐＨ４．５〜約ｐＨ５
に保たれる。好ましい実施態様が先に記載されているが、醗酵プロセスは０．１の増加（
すなわちｐＨ４．１、ｐＨ４．２、ｐＨ４．３等）でｐＨ４〜ｐＨ８の間の任意のｐＨで
行うことができる。本発明の方法では、例えば醗酵培地の出発ｐＨがｐＨ７．０である場
合、醗酵培地のｐＨをｐＨ７．０からの有意の変化がモニターされ、それにより例えば水
酸化ナトリウムを添加して調整される。グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコ
サミンの安定と生成のための最適ｐＨは細胞生育のための最適ｐＨと異なる場合もあるの
で、二相（または二相以上）のプロトコールを用いることができる。この様なプロトコー
ルでは、細胞は最初はバイオマスの迅速な生産に最適のｐＨで生育し、次いでグルコサミ
ンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの合成を最大にするが、グルコサミンおよび
／またはＮ−アセチルグルコサミンの分解を最小にする異なるｐＨが使用される。

本発明のまた別な実施態様は、炭素フラックスを酢酸生産からより毒性の少ない副製品
へ反転することである。この様な方法により、醗酵培地中の過剰グルコースに関連する毒
性問題を回避することができる。炭素フラックスを酢酸製造から反転する方法は公知であ
る。

本発明のバッチ、補充バッチ、および／または連続醗酵プロセスでは、細胞外グルコサ
ミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの蓄積で明らかになる様に、グルコサミン
および／またはＮ−アセチルグルコサミンの生成が基本的に停止するまで醗酵を継続する
。全醗酵時間は代表的には約４０〜約６０時間であり、より好ましくは約４８時間である
。連続醗酵プロセスでは、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを、そ
れが培地に蓄積した場合、バイオリアクターから除去することができる。本発明の方法に
より、細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよ
び／またはグルコサミン、または細胞外グルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを
含み得る生成物が生産される。

グルコースおよびＮ−アセチルグルコサミンの合成では、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＴ発現系
を用いて異なった遺伝子が過剰発現した。遺伝子発現はＩＰＴＧおよびラクトースで誘導
される。ＩＰＴＧのコストにより、グルコサミン生産が法外に高価になる。従って、ＩＰ
ＴＧの使用を醗酵プロセスから除外することが理想的である。ラクトースは相対的に安価
であり、大量生産プロセスに使用し得る。ラクトース誘導では、ラクトースを、細胞内の
β−ガラクトシダーゼで真の誘導因子であるアラビノースに最初に変換する必要がある。
２１２３−５４等のグルコサミン生産株では、この株がβ−ガラクトシダーゼ陰性である
ためにラクトースを誘導因子として使用することができない。これはその遺伝子座へのＴ
７−ｇｌｍＳ^＊５４発現カセットの挿入によるｌａｃＺの欠失および分解のためである。

原理的には、ＩＰＴＧ依存性を除外するためにいくつかの異なった方法を使用し得る。
本発明で説明するあるアプローチは、ｌａｃＺ遺伝子を修復することである。これはＴ７
−ｇｌｍＳ^＊５４発現カセットを染色体内のｌａｃＺ以外の異なった部位へ組み込むこと
で行われた。

ｇａｌＫ部位への組み込みにより、ｌａｃＺ遺伝子が無傷で残される。Ｌａｃ^＋株はＩ
ＰＴＧよりはるかに安価なラクトースにより潜在的に誘導可能である。組み込み株もＧａ
ｌ⁻であるため、ｇａｌＫ部位がＴ７−ｇｌｍＳ^＊５４発現カセットの組み込みのために
選ばれた。この様な株ではガラクトースがｌａｃプロモーターのための誘導因子として使
用され得ることが報告されている。従って、アロラクトースによる誘導に加えて、ラクト
ースの加水分解で生成したガラクトースがさらに誘導を増強し得る。準最適量のラクトー
スがグルコサミン生産プロセスで使用された場合、この事は有益であると思われる。組み
込みはまた、挿入が細胞の生育、およびグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコ
サミン生産に何らの負の効果を与えない任意の他の場所のおいて行われ得る。

ラクトース誘導はグルコース抑制で生じる。培養系に高レベルのグルコースが存在する
場合、グルコサミンの生産は行われなかった。しかしながら、一度グルコースが消費され
ると、ラクトースが利用され、グルコサミン生産が誘導された。グルコースとラクトース
の比率が酵素の発現とグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生産に影響することが示
された。天然型ｌａｃオペロンを抑制することにより、グルコース抑制が行われる。グル
コースが存在する場合、ラクトーストランスポーター（ＬａｃＹ）およびβ−ガラクトシ
ダーゼ（ＬａｃＺ）の合成が抑制され、従ってＴ７ＲＮＡポリメラーゼ誘導のための少量
の誘導因子分子（アロラクトースおよびガラクトース）しか生産されなかった。グルコー
ス抑制の詳細な機構は現在研究中である。グルコース抑制は二つのレベルで作用すると思
われる。一つの抑制レベルはｌａｃプロモーター配列に対するｃＡＭＰ媒介作用で行われ
る。他の抑制レベルはラクトース取り込みの阻害で行われ、グルコーストランスポーター
タンパク質、すなわち酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃ（ｃｒｒ遺伝子でコードされる）およびＩＩＣＢ
^Ｇｌｃ（ｐｔｓＧ遺伝子でコードされる）により生じる。ｌａｃＵＶ５プロモーターはグ
ルコース抑制に敏感ではないが、ラクトースが細胞に入ることを排除すると誘導を阻止し
得る（誘導因子）。

グルコース抑制を最適生育および誘導プロトコールを用いて最小にすることができた。
また、異なった遺伝子修飾を導入してグルコース抑制を最小にすることができた。一つの
アプローチは、ｌａｃオペロン中の天然型ｌａｃプロモーターを、グルコースで抑制され
ないと考えれているｌａｃＵＶ５プロモーターで置換することであった。グルコース抑制
はまた、ｃｒｒ遺伝子の遺伝子修飾で最小にすることができた。他のアプローチは、ｌａ
ｃＩレプレッサー遺伝子の１つを欠失することであった。あるＥ．ｃｏｌｉのグルコサミ
ンおよびＮ−アセチルグルコサミン生産株では、ｌａｃＩレプレッサー遺伝子の二つのコ
ピーがあるが、その一つは天然型ｌａｃオペロン中にあり、もう一つはＤＥ３要素中にあ
る。何れかのｌａｃＩ遺伝子を欠失すると、グルコース抑制とグルコサミン／Ｎ−アセチ
ルグルコサミン生産に対する抵抗性が増加した。ラクトースはｌａｃＹでコードされるラ
クトースパーミアーゼで細胞内に輸送されるので、ラクトース誘導はｌａｃＹの過剰発現
に影響された。

グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンレベルは合成速度で決められる
ばかりでなく、培養条件下で生成物が安定でない場合、細胞の代謝と分解によって決めら
れる。本発明で開示する様に、グルコサミンはＥ．ｃｏｌｉの生育に用いられた典型的な
ｐＨ範囲で極めて不安定であることが見出された。また、グルコサミンおよび／またはそ
の分解生成物は７１０７−１８株に毒性を与えた。細胞接種前に培地（ｐＨ７．０）中で
グルコサミンを２０ｇ／ｌの低い濃度で３．５時間、プレインキュベーションした場合で
も毒性が観察された。毒性は少なくとも部分的には出発ｐＨ７．０の培地中のＧｌｃＮ分
解生成物に帰せられた。ＧｌｃＮはより低いｐＨでより安定であり、グルコサミンはｐＨ
４．７以下では分解されない。

経済的なプロセスを開発するためには、グルコサミン生産を最大にする一方、生成物の
分解を最小にしなければならない。さらに、比較的低いｐＨの醗酵槽中で行われるＧｌｃ
Ｎ生産プロトコールは合成されたＧｌｃＮを保存するばかりでなく、毒性の分解生成物を
減少させることにより、このプロセスは細胞も保護する。これらの恩恵は、成長速度およ
びこの方法で生育した細胞の代謝活性の減少と釣り合わなければならない。ＧｌｃＮを連
続的に合成するためには細胞内でエネルギーが定常的に発生することが必要であり、この
様な低いｐＨで生育する細胞は、必要なエネルギーを発生できないと思われる。

一般的に、Ｅ．ｃｏｌｉは６〜７より低いｐＨで極めて遅く成長する。低いｐＨで成長
特性が改良されたＥ．ｃｏｌｉ突然変異体を単離することは有用であると思われる。また
、低いｐＨ条件下で正常に生育する他のバクテリアおよび酵母種中で、グルコサミン合成
増強経路を遺伝子操作することも可能である。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅも生育はｐＨ４〜５の間で最適である。

生成物の分解の問題を解決するための新規の戦略が開発された。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
グルコサミン合成経路は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐの合成に導くグルコサミン
−６−ＰＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）の過剰発現で拡張された。この株
では、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐが合成され、Ｎ−アセチルグルコサミンとして
効率的に培地に分泌されることが示された。Ｎ−アセチルグルコサミンは広い範囲のｐＨ
と温度範囲で極めて安定である。温和な条件を用いて生成物をグルコサミンに変換して戻
すことができる。この戦略を用いることにより、Ｎ−アセチルグルコサミンの力価がグル
コサミン生産株中で７倍高く上昇した。Ｎ−アセチルグルコサミンも最終生成物として回
収された。

いくつかの因子が単純無機塩培地中でのＮ−アセチルグルコサミン生産の高い力価に寄
与していると思われる。第一の因子はＮ−アセチルグルコサミンの安定性である。これに
より生成物が保存されるばかりでなく、グルコサミン分解生成物の毒性効果も避けられる
。第二に、Ｎ−アセチル化工程が合成経路フラックスをこの目的へ引き寄せる強い力とな
る。ＮａｇＢ酵素がＧｌｍＳおよびＧＮＡ１酵素の不在で過剰発現された場合、それは細
胞の生存と生育にアミノ糖を提供するに十分な程度機能することは興味のあることである
。ＧＮＡ１酵素がＮａｇＢと共発現した場合、Ｎ−アセチルグルコサミンがグラムレベル
で生産される結果となり、合成経路におけるアセチル化反応の牽引力であることを示して
いる。第三に、Ｎ−アセチルグルコサミンの合成はアセチル基の供与体としてアセチルＣ
ｏＡを利用する。これは細胞に一種の代謝負荷を与えると見なされるが、実際には酢酸の
生成を回避し、細胞培養物に酢酸が蓄積することで生じる負の効果を阻止する。酢酸の生
成は、酢酸合成に関与する酵素の遺伝子修飾により最小にすることができた。

ＮａｇＢとＧＮＡ１の組み合わせは、フラクトース−６−ＰからＮ−アセチルグルコサ
ミン−６−Ｐへの興味ある経路を提供する。グルタミンとフラクトース−６−Ｐを使用す
るＧｌｍＳと異なり、ＮａｇＢ酵素はアンモニウムのＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐ
中への直接の同化を触媒する。その上、ＮａｇＢタンパク質は約３０ｋＤａであり、Ｇｌ
ｍＳタンパク質（約７０ｋＤａ）よりはるかに小さい。ＧｌｍＳタンパク質と比較して、
Ｅ．ｃｏｌｉ中で過剰発現した場合、ＮａｇＢのより大きい部分が可溶性タンパク質部分
にあることが見出された。

ＧｌｍＳタンパク質は一般に強い生成物阻害を受ける。生成物耐性ＧｌｍＳ酵素の使用
は、グルコサミン力価の上昇、および多分Ｎ−アセチルグルコサミン力価の上昇にも重要
な役割を果たした。生成物耐性ＧｌｍＳ突然変異体はインビトロ突然変異誘発で作成され
た。この様な突然変異体も天然から単離することができた。この方法は、天然型Ｂ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓＧｌｍＳの生成物耐性を示すことで説明された。

以下はグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの差異的生産に対するプロトコー
ルの例である。これらは本発明の作動可能で好ましい実施態様の例にすぎず、本発明の唯
一の実施態様であると解釈してはならない。共にフラスコ培養および培養装置培養用であ
る好ましいいくつかの醗酵プロトコールと醗酵プロセスのパラメーターが実施例の項に詳
細に述べられている。

以下は本発明によるラクトース誘導グルコサミン醗酵プロセスの典型的なプロトコール
である。

上記培地で、グルコース（徐々に増やして添加）およびＦｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｂ、Ｍ
ｏ、Ｃｏ、微量元素（滅菌後添加）以外は滅菌前に添加した。

以下は本発明によるＮ−アセチルグルコサミン醗酵プロセスの典型的なプロトコールの
例である。

上記培地で、全ての成分をグルコース（徐々に増やして添加）以外は滅菌以前に添加した
。滅菌後の初期ｐＨは３．０であり、接種前にＮＨ_４ＯＨで６．９に調節した。

本発明の方法には、細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−ア
セチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンおよび／またはグルコサミン、および／または細胞外グルコサミンおよび／ま
たは細胞外Ｎ−アセチルグルコサミンであり得る生成物を採集する工程がさらに含まれる
。採集の一般的な工程には、生成物（以下に定義）を回収し、必要があれば生成物を精製
する工程が含まれる。回収と精製法の詳細な議論は以下に提供される。グルコサミンまた
はＮ−アセチルグルコサミン等に生成物を「採集」することは、単に醗酵バイオリアクタ
ーから生成物を採集することを言い、分離、回収または精製を意味する必要はない。例え
ば、採集工程はバイオリアクターから培養物全体（すなわち微生物および醗酵培地）を取
り出し、細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを含む醗酵培地を
バイオリアクターから取り出し、および／または細胞内グルコサミン−６−燐酸、グルコ
サミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−
１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンをバイオリアクターか
ら取り出すことを言う。本明細書で用いる「回収する」または「回収」と言う用語は、グ
ルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンがそれぞれ不溶性になり、溶液から沈殿する
か結晶化する点へグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン溶液の溶解度条件を減少
させることを言う。これらの工程の後に精製工程が続く。グルコサミンおよびＮ−アセチ
ルグルコサミンが実質的に純粋な形で回収されることが好ましい。本明細書で用いる「実
質的に純粋」であるとは、市販するための栄養補助化合物としてグルコサミンおよび／ま
たはＮ−アセチルグルコサミンを有効に使用し得る純度を言う。ある実施態様では、グル
コサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン製品は生産生物および／または他の醗
酵培地成分から分離されることが好ましい。この様な分離を行う方法は以下に記載される
。

本発明の方法により、少なくとも約１ｇ／ｌの生成物（即ち、グルコサミン、Ｎ−アセ
チルグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸）が微生物
および／または醗酵培地採集されるか回収されることが好ましい。本発明の方法により、
少なくとも約５ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１０ｇ／ｌ、さらにより好ま
しくは少なくとも２０ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５０ｇ／ｌ、さらにより
好ましくは少なくとも７５ｇ／ｌ、さらにより好ましくは少なくとも１００ｇ／ｌ、さら
により好ましくは少なくとも１２０ｇ／ｌの生成物が回収され、少なくとも約１ｇ／ｌ〜
約１２０ｇ／ｌの間の全増分（即ち２ｇ／ｌ、３ｇ／ｌ等）で回収されることがより好ま
しい。ある実施態様では、生成物は約１ｇ／ｌ〜少なくとも１２０ｇ／ｌの量で回収され
る。

代表的には、本発明のプロセスで生産されるグルコサミンおよび／またはＮ−アセチル
グルコサミンのほとんどは細胞外である。微生物を醗酵培地から濾過または遠心分離等の
通常の方法で除去できる。ある実施態様では、生成物を採集または回収する工程には、醗
酵培地からグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンの精製が含まれる。グ
ルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを細胞を除去した醗酵培地から、ク
ロマトグラフィー、抽出、結晶化（例えば蒸発結晶化）、膜分離、逆浸透圧および蒸留等
の通常の方法で回収できる。好ましい実施態様では、グルコサミンおよび／またはＮ−ア
セチルグルコサミンを細胞を除去した醗酵培地から結晶化で回収する。他の実施態様では
、生成物回収工程には細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを濃
縮する工程が含まれる。

ある実施態様では、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンおよび／またはグルコサミンは細胞内に蓄積し、生成物の回収工程には微生物からグ
ルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸
、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグル
コサミンを単離する工程が含まれる。例えば、生成物（グルコサミン、Ｎ−アセチルグル
コサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸）を分解しない方法
で微生物細胞を溶菌し、溶菌物を遠心分離して不溶性の細胞断片を除去し、次いで生成物
であるグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミ
ン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、および／またはＮ−アセチルグル
コサミン−１−燐酸を上記の様な通常の方法で回収することにより、生成物を採集するこ
とができる。

本明細書に記載の遺伝子修飾微生物中の最初の細胞内生成物はグルコサミン−６−燐酸
、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコ
サミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンである。燐酸
化中間生成物が多分、微生物の細胞周辺空間内のアルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスフ
ァターゼ、糖ホスファターゼ、またはアミノ糖ホスファターゼのために微生物から排出す
る間に脱燐酸化されることは一般的に受け入れられている。本発明のある実施態様では、
グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐
酸、および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸は天然起原ホスファターゼによ
り細胞から排出前、または排出中に脱燐酸化され、所望の生成物であるグルコサミンおよ
び／またはＮ−アセチルグルコサミンの生産が促進される。この実施態様では、細胞内で
の組み換えで提供されるホスファターゼ活性の増幅、または醗酵培地のホスファターゼ処
理の必要性がなくなる。他の実施態様では、生産生物中のホスファターゼレベルが内在性
ホスファターゼ遺伝子の遺伝子修飾、または微生物の組み換え修飾によるホスファターゼ
遺伝子の発現を含むがそれに限定されない方法によって増加する。また別な実施態様では
、上記の様に細胞を溶解した場合、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン−１−燐
酸が、溶解培地中に放出された後、採集した醗酵培地をホスファターゼで処理する。

上記の様に、本発明のプロセスは相当量の細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセ
チルグルコサミンを生産する。特に、このプロセスは約５０％以上の全グルコサミンおよ
び／またはＮ−アセチルグルコサミンが細胞外であり、より好ましくは約７５％以上の全
グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンが細胞外であり、最も好ましくは
約９０％以上の全グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンが細胞外である
様に細胞外グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンを生産する。本発明の
方法により、約１ｇ／ｌ以上、より好ましくは約５ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約
１０ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約２０ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約５０
ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約７５ｇ／ｌ以上、さらにより好ましくは約１００ｇ
／ｌ以上、さらにより好ましくは約１２０ｇ／ｌ以上の細胞外グルコサミンおよび／また
はＮ−アセチルグルコサミンの生産が達成される。

本発明の他の実施態様はＮ−アセチルグルコサミン製造の新規方法に関する。その方法
には上記の様な醗酵プロセスで生産した可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンを含む醗酵ブロ
スを得る工程と、Ｎ−アセチルグルコサミンを含む固体を醗酵ブロスから回収する工程が
含まれる。本発明によれば、醗酵プロセスで生産されるＮ−アセチルグルコサミンは、醗
酵プロセスの生成物であるＮ−アセチルグルコサミンである。言い換えれば、細胞を培養
する醗酵プロセスが、細胞によるＮ−アセチルグルコサミンの生産をもたらす。回収する
または回収という用語は、Ｎ−アセチルグルコサミンがそれぞれ不溶性になり、溶液から
沈殿するか結晶化する点へＮ−アセチルグルコサミン溶液の溶解度条件を減少させること
を言う。Ｎ−アセチルグルコサミンを含む醗酵ブロス、残存培地および細胞性物質を、ま
ず最初に細胞性物質およびバクテリア内毒素を除去して処理する。細胞性物質の除去前に
、醗酵ブロス中の細胞を超音波処理、浸透圧破壊、摩砕／ビーズ処理、フレンチプレス、
爆発性脱圧縮、溶媒処理、臨界点抽出および凍結／溶融を含むがそれに限定されない異な
った方法を用いて溶菌することができる。細胞性物質と内毒素の除去は、ミクロまたは超
濾過またはその組み合わせで行うことができる。公知の他の技術には遠心分離およびダイ
アフォルトレーションが含まれる。細胞性物質の除去後、溶液を内毒素の除去が適切であ
ったかどうか試験できる。

醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミン含有固体を回収する工程の前に、醗酵ブロス
を脱色および／または脱塩することができる。これらのプロセスのブロスの双方を行う場
合、何れかの一つを最初に行うことができる。しかしながら、イオン交換樹脂を用いる脱
塩プロセスによる脱色のため、脱塩工程を最初に行うことにより脱色の必要性が減少する
。脱色工程は繰り返し結晶化、活性炭処理、およびクロマトグラフィーによる脱色で行う
こともできる。クロマトグラフィーによる脱色にはイオン交換樹脂（イオン交換のためで
なく、色の吸着のためだけで）、ＤｏｗＯｐｔｉｐｏｒｅＳＤ２および古典的なシリカ
系クロマトグラフィー媒体が含まれる。

醗酵ブロスをイオン交換樹脂と接触させて脱塩工程を行うことができるが、その工程に
は醗酵ブロスを陰イオン交換樹脂および／または陽イオン交換樹脂と接触させる工程が含
まれる。ある実施態様では、陰イオンおよび陽イオン交換樹脂の混合ベッドが使用される
。陽イオンの除去は強酸または弱酸イオン交換樹脂上で行われ、一方、弱塩基樹脂は醗酵
で生成した有機酸の除去能があるので好ましい。陽イオン交換体からの流出液のｐＨは減
少し、一方、陰イオン交換体空の流出液のｐＨは上昇するので、具体的には陽イオン除去
が陰イオン除去に先行する様に選ばれる。Ｎ−アセチルグルコサミンは高いｐＨでエピマ
ー化する傾向を示し、測定可能なレベルのＮ−アセチルマンノサミンを生成する。陰イオ
ン除去は強塩基または弱塩基樹脂の何れを用いても行うことができる。得られた精製溶液
にはわずかなイオン性物質しか含まれず、水、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび醗酵中に
消費されなかった醗酵槽のフィード由来の炭水化物が主成分である。この中間性品のＮ−
アセチルグルコサミン純度は、典型的にはには工程の全乾燥固体含有量の約９０％以上で
ある。脱塩を完結するためにさらに精製が必要な場合、混合ベッドイオン交換工程が適用
される。この場合、陽イオンおよび陰イオン樹脂が同じイオン交換体を占有し、高度に脱
塩されたこのベッドを通過する。混合ベッドイオン交換はそれぞれ別個の陽イオンおよび
陰イオン交換体を置き換えるものであり、ブロスｐＨの変化が最小になる利点があるが、
樹脂の損失の高い危険性を同時に伴う再生前のイオン交換樹脂の分離のために、別個のベ
ッドを使用する方がより便利である。

醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミン含有固体を回収する工程には、醗酵ブロスか
らＮ−アセチルグルコサミン含有固体を沈殿および／または結晶化する工程が含まれる。
具体的には、回収工程前に醗酵ブロスを濃縮して、沈殿または結晶化を可能にするために
より高い濃度の可溶化Ｎ−アセチルグルコサミンとする。濃縮工程を真空下（即ち少なく
とも大気圧以下）または膜分離で行うことができる。好ましい実施態様では、濃縮工程は
約４０〜７０℃、より好ましくは約４５〜５５℃の温度で行われる。濃縮工程は具体的に
は醗酵ブロス中の固体含有量が少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％
、より好ましくは少なくとも約４５％で行われる。

濃縮後に、醗酵ブロスを冷却する。この様な冷却は受動的、すなわち単にブロスを放置
して室温にするか、または凍結乾燥器、スプレー冷却器、噴射造粒器、フレーカー、およ
び冷却ジャケットを備えたブレンダーまたはエクストルーダーの使用等、積極的であって
も良い。濃縮ブロスの冷却工程のみで、Ｎ−アセチルグルコサミン含有固体の回収には充
分である。例えば、醗酵ブロスを約−５〜４５℃、約−５℃〜室温、または室温に冷却す
ることができる。

醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミン含有固体の回収には、醗酵ブロスにＮ−アセ
チルグルコサミンの結晶を接種し、添加した結晶の清澄で回収を促進することができる。
結晶は醗酵ブロス中の核形成、または外部からＮ−アセチルグルコサミン結晶を添加する
ことで提供される。最初に過飽和溶液を活性状態にさせて核が形成するまで醗酵ブロスを
濃縮および／または冷却するが、その後はそれ以上の核形成を避け既存の結晶の成長を促
進するため徐々に冷却する。または、任意の方法で生成したＮ−アセチルグルコサミン結
晶を種結晶として醗酵ブロス中に導入する。

醗酵ブロスからＮ−アセチルグルコサミンの回収は、ブロス中のＮ−アセチルグルコサ
ミンを水混和性溶剤と接触させることで促進される。Ｎ−アセチルグルコサミンはイソプ
ロピルアルコール（ＩＰＡ）、エタノール、メタノール、アセトン、テトラヒドロフラン
、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびアセトニトリル等の
水混和性溶剤に極めて溶けにくいことが見出されている。従って、この様な水混和性溶剤
をブロス中に導入することにより、Ｎ−アセチルグルコサミンがより溶け難くなり、さら
に回収される。

本発明の回収プロセスを醗酵ブロスのバッチまたは連続結晶化として行うことができる
。濃縮プロセス中に生成した結晶をフィルターまたは遠心機で連続的に収穫し、母液をさ
らに濃縮するため再循環するか、または固体レベルが結晶の除去を要求するまで結晶を母
液中に蓄積することができる。

Ｎ−アセチルグルコサミン固体の回収後、固体を遠心分離または濾過等により醗酵ブロ
スから分離する。得られた固体ケーキを、真空乾燥等の公知の任意の様々な技術で乾燥す
るが、分解と着色を防止するためこの様な工程を低温で行うことが好ましい。最終乾燥製
品は典型的には乾燥固体の少なくとも５０％、より好ましくは乾燥固体の少なくとも７０
％、より好ましくは乾燥固体の少なくとも８５％である。乾燥前に、回収した固体を上記
の様な水混和性溶剤で洗浄することもできる。この様な洗浄工程により、製品が安定化す
る、例えば着色を防止する。

別な実施態様では、固体を溶解し、第二回収工程で回収することにより、回収されたＮ
−アセチルグルコサミン含有固体がさらに精製される。第二回収工程には任意の上記回収
工程が含まれる。回収の第二サイクルの必要性は、最終製品の所定の純度と出発純度で決
められる。

上記の様々な回収プロセスを用いて、高純度のＮ−アセチルグルコサミンが得られる。
特に、本発明のプロセスは少なくとも約７０％純度、より好ましくは少なくとも約９０％
純度、より好ましくは少なくとも約９９％純度のＮ−アセチルグルコサミンを生産し得る
。

様々な回収プロセスの実施態様が好ましい。例えば、細胞を含まないブロスをそれ以上
イオン除去せずに、活性炭による脱色、エネルギー効率のために多段である真空蒸留器中
で乾燥固体約４５％以上へ濃縮（例えば好ましい条件は約６００ｍｍＨｇで液体温度４５
〜５５℃）、暖めた濃縮液にＮ−アセチルグルコサミンの接種および攪拌しながら冷却に
より、固体Ｎ−アセチルグルコサミンを製造するために用いることができる。冷却したブ
ロスを濾過または遠心分離し、固体ケーキを取り出す。回収された固体を真空乾燥し、純
Ｎ−アセチルグルコサミンまたはグルコサミン塩製造の中間体として使用する。Ｎ−アセ
チルグルコサミン純度が８７％以上である場合、一回の結晶化のみで純粋なＮ−アセチル
グルコサミンを製造することができる。母液から接種、冷却および固体回収の代わりに、
過飽和ストリームを冷却で強制的に固化することもできる。適当な冷却装置には凍結乾燥
器、スプレー冷却器、噴射造粒器、フレーカー、および冷却ジャケットを備えたブレンダ
ーまたはエクストルーダーが含まれる。得られた固体はさらに乾燥される。

他の好ましい回収の実施態様では、回収されたＮ−アセチルグルコサミンを前もって乾
燥することなく水に溶解し、第二サイクル、すなわち濃縮、接種、冷却および固体採集が
行われる。採集した固体を水混和性溶剤で洗浄し、真空で乾燥する。２回の結晶化の必要
性は、Ｎ−アセチルグルコサミンの最初の純度で決められる。乾燥固体の割合としての純
度が８７％以上である場合、１回の結晶化が必要である。純度が７０％である場合、２回
の結晶化が必要である。

他の好ましい回収の実施態様は、脱色および７０℃に達する温度で濃縮された材料を用
いる、または部分的に精製された材料を７０℃で溶解し室温に冷却することによる一回の
結晶化で純Ｎ−アセチルグルコサミンの生成である。回収された固体を水混和性溶剤で洗
浄し乾燥する。

他の好ましい回収の実施態様では、脱塩した細胞除去ブロスを、陽イオン交換樹脂を含
むクロマトグラフィー媒体を用いる擬似移動床クロマトグラフィーシステム上の分離でさ
らに精製する。９８％純度ストリームが一度得られると、真空濃縮により以下に記載の安
定化処理のための材料が調製される。

他の好ましい回収の実施態様では、１０５℃での乾燥による分解による重量減少が１％
以下である、高純度と色安定性を有するＮ−アセチルグルコサミンの高度回収を行うため
、水混和性溶剤が使用される。例えば脱色と脱塩で達成した比較的高純度のＮ−アセチル
グルコサミンから出発して、水を真空濃縮で除去し、次いで水可溶性溶剤を添加してさら
に純粋な製品を沈殿させることが可能である。沈殿製品を含水水混和性溶剤で処理するプ
ロセスにより次の乾燥工程を促進し、残存する水による分解反応促進を防止する。

本発明の他の実施態様はＮ−アセチルグルコサミンからグルコサミンの製造法に関する
。Ｎ−アセチルグルコサミンを加水分解して、最終製品としてのグルコサミンを製造する
ことができる。醗酵槽から最初に単離せず、醗酵ブロス中に生成したＮ−アセチルグルコ
サミンを用いて加水分解を行うことができる。または、上記の任意の方法を用いて回収さ
れたＮ−アセチルグルコサミン等、醗酵ブロスから単離された後のＮ−アセチルグルコサ
ミンで加水分解を行うこともできる。さらに、本発明の方法において任意に入手できるＮ
−アセチルグルコサミン原料を使用することもできる。本発明の前は、有機アセチル化剤
を用いるか、またはグルコサミンをキチンから製造するために伝統的に用いられた酸加水
分解と平行し、キチンから直接Ｎ−アセチルグルコサミンを酵素により加水分解してＮ−
アセチルグルコサミンはグルコサミンのアセチル化で製造されていた。従って、Ｎ−アセ
チルグルコサミンから最終製品としてのグルコサミンを製造するための逆反応の必要はな
かった。

従って、本明細書に記載のＮ−アセチルグルコサミン原料とは純粋なＮ−アセチルグル
コサミン原料である必要はなく、グルコサミンへ変換するための一定量のＮ−アセチルグ
ルコサミンを含む任意の原料（固体または溶液）である。上記の醗酵プロセスで製造され
、上記に詳細に述べた様に醗酵ブロスから回収されたＮ−アセチルグルコサミンからグル
コサミン塩酸塩を製造するか、細胞物質が除去されているが、残留する色またはイオン性
成分は除去されていない醗酵槽濃縮物として、醗酵で直接製造されたＮ−アセチルグルコ
サミンをプロセスに使用することができる。また、キチンの酵素化水分解等他の方法で製
造したＮ−アセチルグルコサミンを含む他の任意の適当Ｎ−アセチルグルコサミン原料も
本発明の方法に使用できる。好ましい実施態様では、グルコサミン塩酸塩が、原料内の全
固体の割合として少なくとも３０％のＮ−アセチルグルコサミンを含むＮ−アセチルグル
コサミン原料から製造され、原料内の全固体の割合としてその原料はより好ましくは少な
くとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、よ
り好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少な
くとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、よ
り好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少な
くとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のＮ
−アセチルグルコサミンを含む。一般に、約１％〜１００％の全整数の範囲（即ち１％、
２％、３％、．．．９８％、９９％、１００％）の任意の割合のＮ−アセチルグルコサミ
ンを含む原料からグルコサミン塩酸塩が生産される。Ｎ−アセチルグルコサミンは固体ま
たは水溶液として、またはエタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノー
ル、ｎ−ブタノールまたはｓｅｃ−ブタノールを含むがそれに限定されない水性低沸点第
一または第二アルコール溶液として反応に使用される。好ましい実施態様では、Ｎ−アセ
チルグルコサミン原料は原料内の全乾燥固体の割合として少なくとも約４０％のＮ−アセ
チルグルコサミンを含む。

ある実施態様では、グルコサミン塩酸塩を酸と加熱条件下の加水分解を用いてＮ−アセ
チルグルコサミンから製造できる。酸加水分解は、当該分野で公知である。本発明では、
この化学反応がＮ−アセチルグルコサミンからグルコサミン塩酸塩への変換に特に適用さ
れる。加水分解反応により１モルの酢酸が放出され、グルコサミン塩酸塩に変換されるＮ
−アセチルグルコサミン１モル毎に１モルの塩酸と水が消費される。水、塩酸およびＮ−
アセチルグルコサミンの多くの組み合わせで反応が良好に行われ、従って無水塩酸、乾燥
Ｎ−アセチルグルコサミンおよび水を反応試薬として用いるか、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンおよび塩酸の一方または双方で水を持ち込むことも可能である。反応は過剰の水と塩酸
で行われる。重要なパラメーターは反応時間と温度、および残留塩酸濃度である。変換が
完了後に反応液が冷却され、過剰塩酸の残留濃度と終了温度によりグルコサミン塩酸塩生
成物の溶解度が決められる。溶解度が大きすぎるとグルコサミン塩酸塩の１サイクル当た
りの回収と収率が減少する。グルコサミンが分解し、分解に伴う反応が生じる。反応速度
は温度、溶液中のＮ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミンの濃度、および
溶液中の塩酸濃度と関連する。有利な条件には６０〜１００℃の温度が含まれ、７０〜９
０℃の温度がより好ましい。塩酸溶液とＮ−アセチルグルコサミン固体の許容範囲は重量
比で１：１〜５：１であり、３：１が好ましく２．５：１がより好ましい。塩酸溶液の許
容濃度範囲は１０〜４０％ｗ／ｗであり、より好ましくは約１０〜３７％ｗ／ｗである。
希釈熱を制御し、Ｎ−アセチルグルコサミンを完全に溶解する適切な溶液となるならば、
塩酸水溶液を無水塩酸で置換することが可能である。添加の順番と添加の温度は、組み合
わせが適切ならばあまり重要でない。反応を行う時間は反応温度と酸濃度で変わり、高温
の濃い酸で１０分、低温で希釈濃度で３時間以上（例えば２４時間まで）の範囲である。
グルコサミン塩酸塩を沈殿させるため、溶液を４℃に冷却する。より高い温度またはより
低い温度（例えば約−５〜４０℃の間の任意の温度）も可能であるが、商業的に便利な条
件での加水分解で残存グルコサミンを最小にするために、４℃が便利な温度として選ばれ
た。より不純な、すなわちグルコサミン塩酸塩の相対的乾燥固体組成がより低い加水分解
溶液では、加水分解溶液を飽和に戻すためにはより低い冷却温度と、最終温度により長時
間保持することが必要である。溶液の攪拌を和らげても、結晶化プロセスに加えられた障
害は克服できない。

加水分解反応は過剰の塩酸で行われるので、冷却とグルコサミン塩酸塩除去プロセス後
の加水分解溶液は加水分解に再度使用し得る。各加水分解サイクルで酢酸副生物の濃度が
増加し反応物である塩酸が消費されるので、加水分解溶液の活性が低下し、反応が完結す
るのにより長い時間が必要になる。この反応物を再構成するためには塩化水素を供給して
補給することが可能であるが、各反応サイクルからの生成物である酢酸の増加のため、単
純な加水分解物リサイクルの障害が増加する。これは加水分解工程の前、工程中または工
程後に第一または第二アルコールを添加して酢酸をエステル化することにより克服できる
。酢酸はアルコールとエステルを形成し、Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解前、加水
分解中または加水分解後に蒸留、フラッシングまたは真空蒸発で除去できる。

Ｎ−アセチルグルコサミンを、それが溶解する、または溶解されたままであることを保
証するため、再循環加水分解母液と連続的に混合することができる。次いで、交換用無水
塩酸を添加し、それにより溶液温度を上昇させて加水分解反応を開始し、グルコサミン塩
酸塩の溶解度を最小にする妥当な残硫酸濃度を維持する。圧力を大気圧以上に維持し、反
応器滞在時間が最小となる高温が選ばれる。Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミン塩
酸塩に完全に転換後、反応溶液を冷却し、グルコサミン塩酸塩が濾過または遠心分離で回
収される。目的の温度である約４℃に達するまで濾液または濃縮液を冷却器を通して再循
環し、グルコサミン塩酸塩の大部分を回収する。遠心分離液または濾液を再使用のため再
循環する。反応ロスとなる適量の水がＮ−アセチルグルコサミンで生じる。母液の連続パ
ージ、残留塩酸をパージストリームから分離し次に再使用のために戻すこと、および酢酸
を第一または第二アルコールでエステル化しエステルとして蒸発させることにより、酢酸
等の反応副生物の蓄積が除去される。

本明細書に記載の加水分解プロセスからのグルコサミン回収の詳細は、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンに対する上記内容と類似しており、グルコサミンの回収に対しても本明細書で
採用される。グルコサミン回収の好ましい態様は以下の実施例の項で議論される。

次いで濾過または遠心分離によりグルコサミン塩の固体が回収できる。回収されたモル
収率はＮ−アセチルグルコサミンに対して５０〜９０％である。アルコール洗浄および乾
燥後のグルコサミン純度は９６〜１００％の範囲である。遠心機またはフィルターから回
収された湿潤ケーキをアルコールで洗浄して、生成物が乾燥中に塊を形成する傾向を最小
にする。次いで乾燥原料が製品使用に合致するまで、生成物を真空乾燥機またはＷｙｓｓ
ｍｏｎｔ型乾燥機中で真空で乾燥する。

洗浄または未洗浄の回収Ｎ−アセチルグルコサミン加水分解濾過または遠心分離ケーキ
で解することも可能である。攪拌しながら室温で約２５％（ｗ）濃度にケーキを水に溶解
する。水酸化ナトリウムまたはカリウム等の塩基を加えてｐＨ２．５〜４の間にする。ｐ
Ｈ調整後、完全に溶解した溶液を活性炭で処理する。例えばバッチ法では、グルコサミン
１ｇ当たり０．０２ｇのＤａｒｃｏＧ−６０またはその等価活性炭を加え、最低３０分間
混合する。混合物を濾過して活性炭を除く。活性炭を再結晶するグルコサミン塩酸塩と等
量の水で濯ぎ粗いし、活性炭と濾過装置に吸収されたグルコサミン塩酸塩を溶出する。ま
たは、溶液を活性炭顆粒の充填ベッドに通し、次いで使用済み活性炭の再生または廃棄の
前に吸収されたグルコサミン塩酸塩を回収する溶離工程を行う。

透明な溶液を真空下で攪拌して５０℃に加熱する。５０〜６０ｃｍＨｇの真空が使用さ
れる。蒸発で約半分の容積を除去し、濾過、遠心分離または他の適当な手段で固体を取り
出し、結晶化したグルコサミン塩酸塩を回収する。残りの溶液がさらに回収するため戻さ
れる。固体を集め、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ
−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキ
シド、ジメチルホルムアミドまたはジオキサンを含むがそれに限定されない水混和性溶剤
で洗浄し、乾燥する。

一回使用した加水分解液から結晶化する場合、固体が目に見え、体積が出発体積の２０
〜３０％程度と見積もられる点へ液体をさらに蒸発させる。液体沈殿剤として等容積の水
混和性溶剤を加え、残った溶液から固体を濾過、遠心分離または他の適当な手段で除去し
結晶化したグルコサミン塩酸塩を回収する。次いで残りの溶液を例えば４℃に冷却し、濾
過して残りのグルコサミン塩酸塩を回収する。

複数回使用した加水分解液から結晶化する場合、次のサイクルの活性炭処理加水分解液
を現在のサイクルの回収溶液に加え、蒸発と固体回収で除かれた体積を再現する。次いで
約半分の体積を蒸留で除去し、このサイクルを繰り返す。

再結晶グルコサミン塩酸塩の純度は過剰の酸の中和による塩の量と、第一の加水分解、
結晶化工程から送られた他の不純物の量に依存する。回収されたグルコサミン塩酸塩が純
度仕様に合致しなくなった場合、不純物の量は一回使用した加水分解液再結晶化工程を複
数回使用した加水分解液の再結晶化に置き換えることで制御される。混和性溶剤沈殿中に
回収された、得られたグルコサミン塩酸塩沈殿を再溶解し、その後の一連の再結晶化の一
部に加えられる。

回収されたグルコサミン塩酸塩湿潤ケーキは、生成物が塊を形成し乾燥中に黒ずむ傾向
を最小にするため、アルコールを含んでいる必要がある。湿潤ケーキは次に真空乾燥機ま
たはＷｙｓｓｍｏｎｔ乾燥機中で乾燥減量が製品仕様に合致するまで乾燥される。

ある実施態様では、加水分解工程は（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン原料を塩酸溶液ま
たは再循環加水分解母液と加熱条件下に組み合わせて、グルコサミン塩酸塩を含む溶液を
製造する工程；（ｂ）溶液（ａ）を冷却してグルコサミン塩酸塩を沈殿する工程；および
（ｃ）溶液（ｂ）から沈殿したグルコサミン塩酸塩含有固体を回収する工程を含む。ある
態様では、加水分解工程を、Ｎ−アセチルグルコサミン原料を塩酸溶液または再循環加水
分解母液と連続的に混合し、Ｎ−アセチルグルコサミン原料を溶解液に保ち、次いで加熱
条件下に無水塩酸を溶液（ａ）に添加し加水分解を開始し、Ｎ−アセチルグルコサミンを
グルコサミン塩酸塩に転換することにより加水分解工程が行われる。他の態様では、再循
環加水分解母液は、工程（ｃ）の沈殿したグルコサミン塩酸塩を回収後に残る加水分解溶
液であり、第一または第二アルコールが加水分解工程が行われる前、工程中または工程後
に添加される。この態様では、冷却工程を約−５℃〜４０℃になるまで行うことができる
。

回収工程は（ｉ）沈殿したグルコサミン塩酸塩含有固体を採集する工程；（ｉｉ）グル
コサミン塩酸塩含有固体を水混和性溶剤で洗浄する工程（メタノール、イソプロパノール
、エタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド
、ジメチルホルムアミドおよびジオキサンを含むがそれに限定されない）；および（ｉｉ
ｉ）グルコサミン塩酸塩含有固体を乾燥する工程を有する。

他の態様では、回収工程は（ｉ）沈殿したグルコサミン塩酸塩含有固体を採集する工程
；（ｉｉ）工程（ｉ）由来の固体を水に溶解し、溶液とする工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ
）の溶液のｐＨを（例えば「塩基を加える、洗浄して酸を除く、イオン交換媒体を通過さ
せる、またはその他の適当な方法により）２．５〜４の間に調節する工程；（ｉｖ）工程
（ｉｉｉ）の溶液を活性炭と接触させてグルコサミン塩酸塩含有固体を脱色する工程；（
ｖ）活性炭を工程（ｉｖ）の溶液から除去する工程；および（ｖｉ）工程（ｖ）由来の溶
液よりグルコサミン塩酸塩を結晶化する工程を含み得る。この態様では、結晶化工程には
グルコサミン塩酸塩を約７０℃以下の温度、より好ましくは約５０℃以下の温度で濃縮す
る工程が含まれる。ある態様では、結晶化工程には大気圧以下でグルコサミン塩酸塩を濃
縮する工程が含まれる。他の態様では、そのプロセスはさらに結晶化工程（ｖｉ）後に残
る溶液を次の回収プロセスの工程（ｉ）、または結晶化の次の工程（すなわち再結晶）へ
再循環する工程を含む。

他の態様では、Ｎ−アセチルグルコサミン原料を水性低沸点第一または第二アルコール
中に懸濁した場合、加水分解法には溶液を冷却する前に、加水分解後に、または加水分解
溶液を再使用のため再循環する前に、アルコールで生成した酢酸エステルを除去する別な
工程が含まれる。酢酸エステルは蒸留、フラッシング、および大気圧以下で濃縮を含むが
それに限定されないプロセスで除去される。この実施態様では、加水分解工程は約６０〜
１００℃の温度、好ましくは１気圧での溶液の沸点で行われる。

他の態様では、加水分解が比較的高い酸対Ｎ−アセチルグルコサミン比（例えば約３：
１〜５：１）および比較的低温（例えば約８０℃以下）で行われる場合、製造されたグル
コサミンの結晶の品質は十分に高く、グルコサミンの再結晶の必要はない。この実施態様
では、一回の結晶化工程の後に先に述べた様な水混和性溶剤中での洗浄、および上記の様
な乾燥工程が行われる。

実際、本明細書に記載の任意の加水分解および回収法には、先に述べた様に工程（ｖｉ
）由来の再結晶グルコサミン塩酸塩を水混和性溶剤で洗浄し、その後乾燥する工程がさら
に含まれる。ある態様では、結晶化グルコサミン塩酸塩が７０℃以下の温度で６時間以下
乾燥され、他の実施態様では、５０℃以下の温度で３時間以下乾燥される。乾燥工程を真
空の有無、および空気または不活性ガス吹き付けの有無で行われる。

Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミンへ転換する他の方法は、酵素加水分解法を用
いることである。醗酵ブロス中のＮ−アセチルグルコサミン、またはその回収後の酵素プ
ロセスが実施例の項に記載される。３つのタイプの酵素が候補である：Ｎ−アセチルグル
コサミン−６−Ｐデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンデアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．３３）およびキチンデアシラーゼ。

Ｆｕｊｉｓｈｉｍａらが報告したデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐ
デアセチラーゼであると同定された（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）。それらの酵素
のＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐとの親和性と効力はＮ−アセチルグルコサミンより
はるかに高かった。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたＮ−アセチルグルコサミ
ン−６−ＰデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミンには作用しなかった。

酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、Ｎａ
ｇＡ）の、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンマンノサミンおよびノ
イラミン酸の細胞代謝における必要な過程である、酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−
Ｐデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）の、Ｎ−アセチルグルコサミン−
６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐへ変換する役割は公知である。組み換えＥ．ｃｏｌｉＮａ
ｇＡタンパク質等のこの酵素は通常、非燐酸化Ｎ−アセチルグルコサミンでは活性でない
。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼをコードするＤＮＡ配列（ＮａｇＡ
遺伝子）が多くの異なった生物で決定された。Ｎ−アセチルグルコサミンにのみ活性であ
る（従ってＮａｇＡとは異なる）デアセチラーゼが存在するかどうかは知られていない。

キチンデアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．４１）はキチン内のＮ−アセチルグルコサミン
ユニットの脱アセチル化を触媒し、キトサンとする。キチンデアセチラーゼ活性は、基質
としてＮ−アセチルグルコサミン基に放射線標識したグリコールキチン（部分Ｏ−ヒドロ
キシエチル化キチン）を用いて測定される。この酵素は微結晶キチンおよびカルボキシメ
チルキチン（可溶性誘導体）にも作用する。しかしながら、Ｍｕｃｏｒｒｏｕｘｉｉ由来
のキチンデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミンモノマーまたは２〜３個のオリゴマ
ーを脱アセチル化しないことが報告された（ＡｒａｋｉおよびＩｔｏ、１９７５、Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：７１−７８、その全文を本明細書に参考として援用する）
。通常のキチンデアセチラーゼがグルコサミンモノマーを脱アセチル化するという事実は
ないが、この様な活性を有するキチンデアセチラーゼの変異体が自然から単離されるか、
インビトロで創出し得ると思われる。

いくつかのアセチルトランスフェラーゼはアセチル基を基質から除去し、別な基質へ転
移させる（Ｋｏｎｅｃｎｙら）。この様な酵素がＮ−アセチルグルコサミンを脱アセチル
グルコサミン化し得ることは示されていないが、この様な活性を有するキチンデアセチラ
ーゼの変異体が自然から単離されるか、インビトロで創出し得ると思われる。

Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を、天然型アシルトランスフェラーゼを有す
る生物、または組み換えアシルトランスフェラーゼを有する生物中に含まれるか、そこか
ら単離されたからアシルトランスフェラーゼで行うことができた。組み換えアシルトラン
スフェラーゼを無秩序または指向性突然変異誘発および／またはタンパク質遺伝子工学で
改良することができた。

アシルトランスフェラーゼまたはデアセチラーゼ技術をＮ−アセチルグルコサミンのグ
ルコサミンへの変換に応用する場合、特に外部が窒素原子をプロトン化する低いｐＨ環境
である場合、グルコサミンの溶液中における周知の不安定性のため、様々な機構により生
成物が分解する可能性がある。

単にｐＨを下げることは酸加水分解には適当であるが、酵素触媒には問題である。無緩
衝または非中性ｐＨに晒された場合、酵素はより変性し易くなる。その上、高い塩負荷が
酵素変性と関連することが多い。

従って、酵素の立体配座を固定し、高いイオン濃度に晒される機会を減少し、高価な酵
素の消耗を減らす公知の酵素固定化技術（下記）を採用することが提案される。さらに、
酢酸ナトリウム、酢酸カルシウム、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウム等の他の塩に比
べて、グルコサミン塩酸塩の比較的低い溶解度を利用することが提案されている。

適当な酵素を塩化ナトリウムまたはカルシウム水溶液とＮ−アセチルグルコサミンに接
触させることにより、平衡反応が進行し、酵素に対してｐＨ緩衝剤となる溶解度の高い酢
酸ナトリウムまたはカルシウムが生成する。その反応はまた、比較的不溶性であるが安定
なグルコサミン塩酸塩を生成し、蒸発濃縮または液体沈殿剤の使用により溶液から結晶化
または沈殿する。グルコサミンが溶液から分離すると平衡反応が進み、さらにＮ−アセチ
ルグルコサミンが消費される。残りの母液は残留するグルコサミン塩酸塩、酢酸ナトリウ
ムまたはカルシウム、塩化ナトリウムまたはカルシウム、および少量の未反応Ｎ−アセチ
ルグルコサミンを含む。この母液を液体沈殿剤としてのアルコールで処理すると、可溶性
の酢酸ナトリウムまたはカルシウムとより不溶性のグルコサミン塩酸塩、塩化ナトリウム
またはカルシウム、およびＮ−アセチルグルコサミンが分離され、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンは酵素変換プロセスの最初に再循環される。

Ｎ−アセチルグルコサミンをグルコサミン塩酸塩へ変換するまた別なアプローチは、ア
セチル基をＮ−アセチルグルコサミンから添加したアルコールへ転移してアルコールをエ
ステル化するために酵素触媒を使用することである。加水分解中に生成したエステルを除
去すると、反応が先に進んでＮ−アセチルグルコサミンを消費し、グルコサミン遊離塩基
を生成する。

酵素加水分解で生成したグルコサミン遊離塩基を、塩化物溶液、例えば塩化ナトリウム
との混合物として水素型の陽イオン交換樹脂を通過させることにより安定化することがで
きる。塩の陽イオンが水素イオンと交換され、安定なグルコサミン塩酸塩が形成され、イ
オン交換樹脂は塩の陽イオンを保持する。この方法では、燐酸塩、硫酸塩、沃素塩および
亜硫酸塩を含むがそれに制限されない様々な選択された塩がグルコサミン遊離塩基と混合
され、陽イオン交換樹脂カラムを通過させると、（グルコサミン）_２硫酸塩−（ＮａＣｌ
）_２、（グルコサミン）_２硫酸塩−（ＫＣｌ）_２、（グルコサミン）_２硫酸塩、グルコサ
ミン塩酸塩、グルコサミンヨウ素酸塩、グルコサミン燐酸塩、（グルコサミン）_２亜硫酸
カリウム−（ＨＣｌ）_２、および（グルコサミン）_２亜硫酸ナトリウム−（ＨＣｌ）_２を
含む公知の安定な酸の塩に変換される。

従って、ある実施態様では、上記の組み替え脱アセチルグルコサミン化酵素が固体支持
体に結合し、固定化酵素となる。本明細書で用いる固体支持体に結合した酵素（すなわち
デアシラーゼ）には固定化単離酵素、組み替え酵素等の酵素を含む固定化細胞（固定化バ
クテリア、菌類（例えば酵母）、藻類、昆虫、植物または哺乳動物細胞を含む）、安定化
完全細胞および安定化細胞／細胞ホモジェネートが含まれる。安定化非損傷細胞および安
定化細胞／細胞ホモジェネートには、その酵素を発現する天然起原微生物、または遺伝子
修飾微生物由来の細胞とホモジェネート、遺伝子修飾によりその酵素を発現する、本明細
書で開示された昆虫または哺乳動物細胞が含まれる。従って、酵素を固定化する方法は下
記に議論されるが、この様な方法はバクテリアおよびその他の細胞、および細胞を溶菌す
る実施態様でも応用できる。

酵素を固定化する様々な方法は、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第二版
、Ｇｏｄｆｒｅｙ、Ｔ．およびＷｅｓｔ、Ｓ．編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、Ｈ．Ｙ．、１９６６、ｐ２６７−２７２；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎ
ｚｙｍｅ、Ｃｈｉｂａｔａ、Ｉ．編、ｈａｌｓｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
Ｎ．Ｙ．、１９７８；Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ
ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｓｋｉｎ、Ａ．編、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｉｍ
ｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ、１９８５；およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏ．４、Ｃｈｉｂａｔａ、Ｉ．およびＷｉｎｇａｒ
ｄ、Ｊｒ．Ｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９
８３に開示され、その全文を本明細書に引用して援用する。

簡単に言えば、固体支持体とは、単離された酵素の活性に影響せず、酵素と結合を形成
し得る任意の有機支持体、人工膜、バイオポリマー支持体または無機支持体を言う。有機
固体支持体の例にはポリエステル、ナイロン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、アク
リル共重合体（例えばポリアクリルアミド）、安定化完全全細胞および安定化粗全細胞／
膜ホモジェネートが含まれる。バイオポリマーの例にはセルロース、ポリデキストラン（
例えばセファデックス（登録商標））、アガロース、コラーゲンおよびキチンが含まれる
。無機支持体の例にはガラスビーズ（多孔性および非多孔性）、ステンレススチール、金
属酸化物（例えばＺｒＯ_２、ＴｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３およびＮｉＯ等の多孔性セラミック）
、および砂が含まれる。固体支持体は安定化完全細胞および／または粗細胞ホモジェネー
トから選ばれることが好ましい。この様な支持体の調製には最小の手間と費用しか必要で
ない。さらに、この様な支持体は酵素の安定化に優れる。

吸着、架橋（共有結合を含む）および包含を含む様々な方法で酵素を固体支持体に結合
できる。吸着はファンデルワールス力、水素結合、イオン結合または疎水性結合で行われ
る。吸着固定化のための固体支持体の例にはポリマー吸着体およびイオン交換樹脂が含ま
れる。ベッド型の固体支持体が特に適している。吸着固体支持体の粒径を、固定化酵素が
メッシュフィルター中に保持され、基質（例えばオイル）が所望の速度でリアクターを通
って流れる様に選ぶことができる。多孔性粒子支持体では、酵素またはバクテリア細胞が
粒子の空洞中に包含され、活性を失うことなく保護できる様に吸着プロセスを制御するこ
とができる。

本明細書に引用された各文献および参考資料は、その全文が援用される。

以下の実験結果は説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲を制限することを
意図するものではない。

以下は本明細書で参照および／または記載した様々な遺伝子修飾微生物のリストである
。これらの株のいくつかは米国特許第６，３７２，４５７号（前出）に記載され、本明細
書に具体的に記載した遺伝子修飾のための親株として用いられた。

（Ｅ．ｃｏｌｉ株）

注：
１）表に列記した全ての株は同じ親株Ｗ３１１０由来である。
２）表に列記した株の大部分は７１０７―１８株から開発され（Ｔｅｔ^Ｒ：：ｎａｇ ｍ
ａｎＸＹＺ ＤＥ３ Ｔ７−ｇｌｍＳ＊５４：：ｇａｌｋ）、簡単にするため、これらの
株の遺伝子型が７１０７−１８＋新規変化として列記される。
３）Ｅ．ｃｏｌｉ以外の種由来の遺伝子は２個の文字で同定される。Ｓｃ：Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｃａ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｔ
：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｂｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ。
４）遺伝子組み込みのため、他に指示されていなければ挿入された発現カセットは標的部
位の遺伝子またはオペロンと同じ配向である。

（実施例１）
以下の実施例はより良いグルコサミン生産菌のための突然変異体スクリーニングを説明
する。

その全文を本明細書に引用して援用される米国特許第６，３７２，４５７号は、グルコ
サミンを生産する組み替えＥ．ｃｏｌｉ株を記載している。これらの株は代謝遺伝子工学
アプローチを用いて構成された。このアプローチは３つの工程で構成される。第一工程は
グルコサミンとその６−燐酸誘導体の代謝と取り込みを制限する突然変異を導入すること
であった。第二工程は、生合成酵素の鍵である、グルコサミンシンターゼ（ＧｌｍＳ）を
コードするＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ遺伝子を過剰発現することであった。第三工程は、Ｇ
ｌｍＳの生成物阻害を、酵素の試験管内突然変異誘発により最小にすることであった。組
み替え株２１２３−５４は、Ｔ７プロモーターの制御下にある生成物耐性組み替えＥ．ｃ
ｏｌｉ ｇｌｍＳ突然変異遺伝子を含み、グルコースを補充した単純塩培地中の振盪フラ
スコ培養で高い生成物力価を示した。この株は、さらに改良するための新規株を評価する
参照として用いられた。その株は、細胞生育とＩＰＴＧ誘起グルコサミン生産を改善する
ために設計された実験でも用いられた。

（ＩＰＴＧ誘導性グルコサミン生産株２１２３−５４の遺伝子型）
２１２３―５４はＷ３１１０で指定される実験室Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株から誘導さ
れた。関係する遺伝子型を表１に記す。

（表１．グルコサミン生産株２１２３−５４の遺伝子型）

ｎａｇおよびｍａｎＸＹＺ突然変異はグルコサミン生産に正の効果を有し、新規生産株
中に維持されることが示された。Ｔ７発現系を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ｇｌｍＳ遺伝
子が過剰発現され、ＩＰＴＧ誘導を用いて数倍高いレベルのグルコサミン生産が得られた
。Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ＧｌｍＳはその生成物であるグルコサミン−６−Ｐで強く阻害され
るので、Ｅ．ｃｏｌｉｇｌｍＳ突然変異体のプールが易誤謬性ＰＣＲで作成され、プレー
トフィード分析でグルコサミン生産の増加がスクリーニングされた。改良されたグルコサ
ミン生産株中のｇｌｍＳ^＊突然変異体を発現する発現コンストラクトが、染色体中でｌａ
ｃＺ部位に組み込まれ、安定な生産株を生成した。多くの突然変異株が、生成物耐性であ
るグルコサミンシンターゼを合成した。振盪フラスコ実験では、Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ｇｌ
ｍＳ発現コンストラクトを有する株に比べて、これらの突然変異株は飛躍的に増加したレ
ベルのグルコサミンを生産した。２１２３−５４株（Ｔ７−ｇｌｍＳ^＊５４発現コンスト
ラクトを有する）は１１ｇ／ｌ以上のグルコサミンを生産した。

（簡略化振盪フラスコスクリーニング法の開発）
米国特許第６，３７２，４５７号に記載される様に、異なったグルコサミン生産株を、
振盪フラスコ培養によるグルコサミン生産のためにグルコース補充無機塩培地中で生育し
た。以前の実験では、グルコースと硫酸アンモニウムが欠乏するとそれらを培地に供給し
、連続グルコサミン生産を行っていた。しかしながら、これは３日間の頻繁なモニタリン
グと供給（６〜８時間毎）が必要である。従って、より簡単であるが、異なったグルコサ
ミン生産株の評価に信頼できる振盪フラスコ培養プロトコールを開発することが望まれた
。

グルコサミン生産に使用された単純無機塩培地はＭ９Ａであった（表２）。株の評価の
ために３工程プロトコールが開発された。第一に、ＬＢプレート上に生育した新鮮な細胞
を使用して３ｍｌのＬＢ中で培養を開始し、細胞を３７℃で約８時間生育させた。第二に
、１．５ｍｌの培養液を用いて、２５０ｍｌの振盪フラスコ中の５０ｍｌのＭ９Ａ培地に
接種し、培養液を３７℃でインキュベーションし、約１６時間（終夜）、２２５ｒｐｍで
振盪した。培養液中の細胞濃度を６００ｎｍで測定した。この工程には細胞を最小培地に
適応させることと、グルコサミン生産の再現性のある結果を得ることが含まれる。第三に
、細胞の一部をＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）を含む振盪フラスコ中の５０ｍｌのＭ９Ａ培地に
加えた。初期の細胞ＯＤは０．３であった。細胞を３７℃でインキュベーションし、２２
５ｒｐｍで７２時間振盪した。試料（１ｍｌ）を２４、４８および／または７２時間に取
り出し、培養ブロス中のグルコサミンレベルを測定した。２４時間および４８時間の時点
で、少量のＮａＯＨを加えてｐＨを７．０に調節し、グルコースを２０ｇ／ｌで加えた。
これらの条件下で、対照株２１２３−５４は約６ｇ／ｌのグルコサミンを７２時間の時点
で生産した。

（表２．グルコサミン製造で使用したＭ９ＡおよびＭ９Ｂ^＊）

^＊醗酵のために培地に消泡剤（Ｍａｚｕ２０４、０．２５ｍｌ／Ｌ）を添加する。

（振盪フラスコ実験における突然変異体スクリーニング：）
組み込みｇｌｍＳ突然変異コンストラクトを有する約１５０の組み替えＥ．ｃｏｌｉ株
を最適化プロトコールを用いて再評価した。Ｅｈｒｌｉｃｈ試薬を用いる比色法によりグ
ルコサミンを分析した。２１２３−７２および２１２３−１０３株はグルコサミンを２１
２３−５４株より若干高いレベルでグルコサミンを生産した（表３）。

（表３．振盪フラスコ培養におけるＩＰＴＧ誘導グルコサミン生産）

^＊括弧内に示した割合は、異なった時点における２１２３−５４株に対する相対値である
。

（１リッター醗酵槽中の高グルコサミン生産２１２３−７２および２１２３−１０３株
の評価）
潜在的に優れたグルコサミン生産株２１２３−７２および２１２３−１０３を１リッタ
ー醗酵槽中で２１２３−５４株と比較した。消泡剤（０．２５ｍｌ／ＬのＭａｚｕ２０４
）と微量元素（表４）を添加した初期容積４７５ｍｌのＭ９Ａ培地を醗酵槽に入れた。ｐ
Ｈを６．９に制御するため、７５％ＮＨ_４ＯＨを用いて醗酵槽を運転した。醗酵中、温度
を３０℃に保った。晒気と攪拌を調節した溶存酸素濃度を２０％飽和とした。コンピュー
タープログラムで制御して６５％グルコースを培地へ供給し、接種時に生育速度０．４０
／時間、６時間で最高速度５ｍｌ／時間とした。醗酵はｐＨ、酸素およびグルコース濃度
を正確に制御して行った。フラスコ中より醗酵槽でより高いグルコサミン濃度が得られた
。

各株の２セットを二つの異なった条件下で培養した。1セットの醗酵槽を低濃度グルコ
ース濃度で（１０ｇ／ｌ、グルコース制限）、他のセットをより高いグルコース濃度（４
０ｇ／ｌ、過剰発現グルコース）で開始した。過剰グルコース条件は振盪フラスコ生育条
件により似ている。通常はグルコース制限条件を醗酵実験に使用し、２１２３−５４株で
は一般により高いグルコサミンの生産が得られた。醗酵の開始から、培養は全てＩＰＴＧ
で誘導された。グルコース制限および過剰条件の何れでも、２１２３−７２および２１２
３−１０３株の双方とも２１２３−５４株より成績が良く、２１２３−５４株での１０ｇ
／ｌまでのグルコサミン生産（データは示されない）と比較して５０時間で１４ｇ／ｌま
でのグルコサミンを生産した。

（表４．いくつかの実験で使用された、生育培地に添加された微量元素）

（実施例２）
以下の実施例は、グルコサミン生産のための過剰発現された異なったｇｌｍＳ遺伝子を
説明する。

バクテリアグルコサミンシンターゼ遺伝子（ｇｌｍＳ）および酵母ホモログ（ＧＦＡ遺
伝子）をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させてグルコサミン代謝経路の遺伝子工
学におけるその有用性を示した。異なった遺伝子をＰＣＲでＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｂｔｉ
ｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ ａ
ｌｂｉｃａｎｓから増幅し、発現ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）中のＴ７プロモーターの制
御下に置いた。コンストラクトをＥ．ｃｏｌｉ株７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換
し、自由に複製するプラスミドとして維持した。さらに、Ｔ７プロモーターで駆動するＣ
．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１遺伝子を７１０１−１７（ＤＥ３）株中の染色体中のｌａ
ｃＺ部位に組み込んだ。異なったｇｌｍＳおよびＧＦＡ遺伝子の宿主である株の遺伝子発
現と、ＩＰＴＧ誘導を用いるグルコサミン生産を評価した。

（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子のクローニング）
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子は１８０３ｂｐのオペロン読み取り枠を含み、
約６５ｋＤａのタンパク質（５９９残基、細胞内で通常除去されるイニシエーターメチオ
ニンを除く）をコードする。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ開放読み取り枠のヌクレオチド配列は
配列番号１５に列記されている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＧｌｍＳタンパク質の推定アミノ
酸配列は配列番号１６に列記されている。ｇｌｍＳ遺伝子はＡＴＣＣ２３８５６およびＡ
ＴＣＣ２３８５７株よりＰＣＲで増幅された。前方プライマーはＡＴＧ開始コドンとＢｓ
ａＩ部位（配列番号２１）：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＧＴ
ＧＧＡ ＡＴＣ ＧＴＡ ＧＧＴ ＴＡＴ ＡＴＣ ＧＧＴ Ｃ−３’を含んでいた。逆
方向プライマーは停止コドンとＸｈｏＩ部位（配列番号２２）：５’−ＧＡＴ ＣＣＴ
ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＣＡ ＣＡＧ ＴＡＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＴＣＧ ＣＡＡ
ＧＧＴ ＴＡＣ Ｇ−３を含んでいた。

期待するサイズのＰＣＲ生成物をｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｗ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ）中にライゲートした。そのベクターを酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで
消化した。組み換えプラスミドｐＳＷ０７−１５＃８３を制限酵素分析で確認し、７１０
７−１７（ＤＥ３）中に形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７−２４（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓＡＴＣＣ２３８５６由来のｇｌｍＳ遺伝子）と７１０７−２５（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓＡＴＣＣ２３８５７由来のｇｌｍＳ遺伝子）を作成した。対照として、空のベクターｐ
ＥＴ２４ｄ（＋）も７１０７−１７（ＤＥ３）中に形質転換し、７１０２−２２株を作成
した。

（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＦＡ１遺伝子のクローニング：）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＦＡ１読み取り開放枠は２１５４ｂｐを有し、７１６残
基のペプチドをコードする（イニシエーターであるメチオニンを除く）。Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ＧＦＡ１読み取り開放枠は配列番号１７に列記されている。Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ＧＦＡ１タンパク質の推定アミノ酸配列は配列番号１８に列記されている。
配列から予想されるタンパク質のサイズは約８０ｋＤａである。ＧＦＡ１遺伝子配列には
イントロンが存在しないので、遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣ
Ｃ２０４５０８）から調製したゲノムＤＮＡから増幅した。

ＡＴＧ開始コドンおよびＢｓａＩ部位を含む前方プライマーは以下の配列（配列番号２
３）を有した：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＴＣＴ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＧＴ ＡＴ
Ｃ ＴＴＴ ＧＧＴ ＴＡＣ−３’。停止コドンとＥｃｏＲＩ部位を含む逆方向プライマ
ーは以下の配列（配列番号２４）を有した：５’−ＧＡＴ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＴＴ Ａ
ＴＴ ＣＧＡ ＣＧＧ ＴＡＡ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＡＧ−３’。

約２．２ｋｂのＰＣＲ生成物をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）中へクロ
ーニングした。組み替えプラスミドを制限酵素消化で確認した。ＥｃｏＲ１およびＢｓａ
Ｉで消化してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＧＡ１フラグメントを単離し、ｐＥＴ２４ｄ
（＋）のＥｃｏＲおよびＮｃｏＩ部位へライゲートした。この組み替えプラスミドを制限
酵素解析で確認し、７１０１−１７（ＤＥ３）中へ形質転換してＥ．ｃｏｌｉ株７１０７
−１０１を作成した。

（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１のクローニング）
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１遺伝子にはイントロンがなく、その２１
４２ｂｐの読み取り開放枠は約８０ｋＤａ（７１２残基、イニシエーターであるメチオニ
ンを除く）のペプチドをコードする。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１読み取り開放枠の
ヌクレオチド配列は配列番号１９中に列記される。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１タン
パク質の推定アミノ酸配列は配列番号２０に列記される。ＧＦＡ１コード配列をＡＴＣＣ
１０２６１株から、前方プライマーおよび逆方向プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
前方プライマーはＡＴＧ開始コドンとＢｓａＩ部位：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＴＣＴ Ｃ
ＧＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＴＡＣ ＧＴＣ−３’（配列
番号２５）を含んでいた。逆方向プライマーは停止コドンとＸｈｏＩ部位：５’−ＧＡＴ
ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＡＡ ＣＡＧ ＴＡＡ ＣＴＧ ＡＴＴ ＴＡＧ
ＣＣ−３’（配列番号２６）を含んでいた。

ＰＣＲ生成物をベクターｐＭＯＳＢｌｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）中にクローニングし、組み替えプラスミドを制
限酵素消化で確認した。ＢｓａＩ−Ｘｈｏフラグメントを単離し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏ
Ｉで消化して調製したｐＥＴ２４ｄ（＋）中にライゲートした。得られたプラスミドを宿
主７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７−２３を作成した
。

Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１遺伝子も発現ベクターｐＥＴ２３（＋）（Ｎｏｖａｇ
ｅｎ Ｉｎｃ．）中へクローニングした。ｐＥＴ２４（＋）と異なり、このベクターはｌ
ａｃオペレーター配列をＴ７プロモーターの下流に含んでいなかった。ｌａｃオペレータ
ーがないため、組み替え遺伝子レベルが高くなった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１コ
ード配列を酵母ゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。前方プライマーはＡＴＧ開始コドン
とＮｄｅＩ部位：５’−ＧＣＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＧＴ Ａ
ＴＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＴＡＣ ＧＴ−３’（配列番号２７）を含んでいた。逆方向プラ
イマーはＢａｍＨＩ部位：５’−ＧＣＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＣＴＣ ＡＡＣ Ａ
ＧＴ ＡＡＣ ＴＧＡ ＴＴＴ ＡＧＣ ＣＡ−３’（配列番号２８）を含んでいた。正
しいサイズのＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位のｐＥＴ２３ｂ中にライゲー
トした。組み替えプラスミドを制限酵素分析で確認し、発現宿主７１０１−１７（ＤＥ３
）中に形質転換してＥ．ｃｏｌｉ株７１０７−５８と７１０７−５９を作成した。対照と
して空のベクターｐＥＴ２３ｂを７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換して株７１０７
−５７を作成した。

Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＴ発現系を用いるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓタンパク質の
過剰発現は、先の文献に記載されている（Ｐ．Ｓａｃｈａｄｙｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１９、３４３−３４９、２０
００）。しかしながら、グルコサミンの生産は全く示されず、議論されてもいない。さら
に、報告されたＦＧＡ１遺伝子はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株（ＡＴＣＣ１３１５３）からク
ローニングされた。２つのＦＧＡ１タンパク質は同じアミノ酸配列を有するが、ＡＴＣＣ
１３１５３由来のＦＧＡ１遺伝子はＡＴＣＣ１０２６１株中の様なＴＡＡおよびＧＴＣの
代わりにＣＴＡおよびＧＣＣでそれぞれコードされるＬｅｕ２９およびＡｌａ６５５残基
を有する。残基Ｌｅｕ２９およびＡｌａ６５５の異なったコドンを用いることが、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ中のＧＦＡ１遺伝子発現に影響するかどうかの試験が試みられた。Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
、ＣＡ）に基づく戦略を用いる部位指向突然変異誘発を行ってプラスミドｐＥＴ２３ｂ（
＋）／Ｃ．ａｌａｂｉｃａｎｓＦＧＡ１中のＬｅｕ２９コドンをＣＴＡに、Ａｌａ６５５
コドンをＧＣＣに変換し、プラスミドｐＥＴ２３ｂ（＋）／Ｃ．ａｌａｂｉｃａｎｓＦＧ
Ａ１−Ｍを作成した。新規プラスミド中の双方の突然変異の存在を配列決定で確認し、そ
のプラスミドを７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換してＥ．ｃｏｌｉ株７１０７−６
０および７１０７−６１を作成した。

（ＧｌｍＳおよびＧＦＡタンパク質の過剰発現）
異なったｇｌｍＳおよびＣＦＡ１遺伝子を含むｐＥＴベクターで形質転換した株をＬＢ
培地中で生育させ、ＧｌｍＳおよびＦＧＡ１タンパク質の発現を示した。最初に、細胞を
試験管中、ＬＢ培地中３７℃で終夜生育させた。培地にはカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）
を添加しプラスミドを維持した。次に５０μｌの終夜培養接種液を用いて２５０ｍｌバッ
フル付きフラスコ中で５０ｍｌ培養を開始した。培養液を３７℃でインキュベーションし
、２２５ｒｐｍで３時間振盪した。その時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで添加した。３
時間のインキュベーション時間後、培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために収穫した。負
対照として空のｐＥＴ２４ｄ（＋）ベクターも生育させ、分析した。比較のため、Ｔ７プ
ロモーターで駆動し、ｌａｃＺ部位で染色体中に組み込んだ野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍ
Ｓ遺伝子と突然変異ｇｌｍＳ^＊５４遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ細胞も、抗生物質選択な
しで上記のように生育させた。

標準法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。Ｔ７−Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ発現カセット
がｐＥＴプラスミドにあるか、染色体中に組み込まれた場合、ＧｌｍＳタンパク質が極め
て高いレベルで発現した（データは示さず）。プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）／Ｔ７−Ｂ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳの宿主である細胞は、ＧｌｍＳタンパク質の予想サイズであ
る約６５ｋＤａのタンパク質を過剰発現した（データを示さず）。組み込みカセット由来
の発現レベルは、ｐＥＴプラスミドに含まれるＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ遺伝子を発現する
細胞と同程度であった。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＦＡ１遺伝子の宿主である細胞は、酵母タンパク質の予
想サイズ（８０ｋＤａ、データは示されない）の過剰発現タンパク質バンドを明らかに示
した。Ｔ７−Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１発現カセットを含む（データは示されない
）７１０７−２３株では、８０ｋＤａバンドタンパク質の合成は空のベクターを有する株
と比較して明らかでなかった（データは示されない）。しかしながら、ＧＦＡ１バンドは
、ｐＥＴ２３ｂ（＋）系ベクター上のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＦＧＡ１遺伝子を含む７１
０７−５８株および７１０７−５９株中で過剰発現された（データは示されない）。発現
レベルはｐＥＴ２３ｂ（＋）系ベクターを有する７１０７−２３株より明らかに高かった
。Ｌｅｕ２９およびＡｌａ６５５に対する別なコドンを使用しても、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ
．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１タンパク質発現に影響しなかった。

まとめると、Ｅ．ｃｏｌｉ中の酵母ＧＦＡ１遺伝子の発現レベルはバクテリアｇｌｍＳ
遺伝子と比較して低かった。このことは真核遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ宿主中で発現すること
を試みた場合、共通に観察された。

（グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性分析）
酵素活性とグルコサミン生産を測定するため、Ｍ９Ａ培地中で異なった株を生育させた
。培養液を調製するため、３工程プロトコールを使用した。最初にＬＢプレート上で生育
した新鮮な細胞を３ｍｌのＬＢ中で培養を開始するために使用し、３７℃で約６時間生育
させた。次に１．５ｍｌの培養液を使用して２５０ｍｌのバッフル付きフラスコ中の５０
ｍｌのＭ９Ａに接種し、培養液を３７℃でインキュベーションし２２５ｒｐｍで約１６時
間（終夜）振盪した。この工程は細胞を最小培地に適応させること、およびグルコサミン
生産の再現性のある結果を得るために行われた。三番目に、一定量の細胞を２５０ｍｌの
バッフル付きフラスコ中のＩＰＴＧ（１ｍＭ）を含む５０ｍｌのＭ９Ａ培地に添加した。
最初の細胞密度を０．３ＯＤ_６００に調節した。細胞を３７℃でインキュベーションし、
２２５ｒｐｍで２４時間振盪した。遠心分離後、培養ブロスをグルコサミン分析に使用し
、細胞ペレットをグルコサミンシンターゼ活性の測定に使用した。それぞれの実験からの
データを表５に示す。

Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子（配列番号１６をコード）を発現するＥ．ｃｏ
ｌｉ細胞中では酵素活性が容易に検出できた。活性レベルはＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ（配
列番号２をコード）を有する細胞、およびＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ^＊５４突然変異遺伝子
（配列番号６をコード）を有する細胞と同程度であった。しかしながら、酵母ＦＧＡ１遺
伝子（配列番号１８および配列番号２０をコード）の宿主である細胞中では微量量の酵素
活性しか検出できなかった。Ｍ９Ａ培地中の培養由来の活性データは、一般にＬＢ培地中
で生育した細胞のＳＤＳ−ゲル分析の結果と一致した。低いタンパク質発現レベルは、酵
母ＦＧＡ１遺伝子の宿主である細胞中の僅かな酵素活性を説明する主な理由の一つである
と思われる。

（異なったｇｌｍＳおよびＧＦＡ１遺伝子の発現によるグルコサミンの生産）
空のベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）で形質転換した７１０１−１７（ＤＥ３）株の培養培
地中では、きわめて低いレベルのグルコサミンしか生産されず、分泌されなかった（表５
）。バクテリアｇｌｍＳ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｇｌｍＳ）の発現により、グルコサミン生産は５０倍以上増加した。グルコサミンレベル
の数倍の増加も、酵母ＧＦＡ１遺伝子を発現する培養物中で観察された。ｐＥＴ２４ｄ（
＋）と比較して、ｐＥｔ２３ｂ（＋）を使用するとＣ．ａｌｂｉｃａｎｓタンパク質のレ
ベルおよびグルコサミン生産レベルが高くなった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１遺伝
子中のＬｅｕ２９およびＡｌａ６５５コドンの変化はグルコサミン生産レベルに影響しな
かった。これらの観察は、一般的にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果と一致した。酵素活性分
析で観察された様に、２１２３−１２株で７１０７―２１４株より高いレベルでグルコサ
ミンが生産されたので、染色体中のＴ７−Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ発現カセットの組み込
みは有益である様に思われる。染色体中に組み込まれたＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ^＊５４を
有するＥ．ｃｏｌｉ株は、他の試験された株と比較して明らかにグルコサミン生産に優れ
ていた。

（表５．異なったｇｌｍＳおよびＧＦＡ１ホモログを発現するＥ．ｃｏｌｉ中における
グルコサミンシンターゼ活性およびグルコサミン生産）

注：１）宿主細胞：Ｅ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）、遺伝子型：ｎａｇΔ、ｍａ
ｎＸＹＺ ＤＥ３
２）細胞培養：リッター当たり７．５ｇ（ＭＨ_４）２ＳＯ_４および４０ｇグルコース
を添加したＭ９Ａ培地を含む振盪フラスコ中３０℃、２６時間
３）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＦＡ１（Ｍ）：ＴＡＡおよびＧＣＴからそれぞれＣＴ
ＡおよびＧＣＣに換えたＬｕｅ２９およびＡｌａ６５５コドン
（実施例３）
以下の実施例は異なった生成物耐性ＧｌｍＳ酵素：Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異体および野生
型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＨｌｍＳの特徴付けを示す。

Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧｌｍＳ、天然型Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ、および突然変異体
Ｅ．ｃｏｌｉＧｌｍＳを含む、異なるグルコサミンシンターゼ酵素を、試験管内で研究し
た。様々なＥ．ｃｏｌｉ株の細胞をＭ９Ａ培地中で生育させ、収穫し凍結した。細胞抽出
物を調製し、グルコサミンシンターゼを特徴付けし比較した。強い生成物耐性を示し、組
み替えＥ．ｃｏｌｉ内で高いグルコサミン生産が得られた二つの別なＥ．ｃｏｌｉ ｇｌ
ｍＳ突然変異体に付き、ＤＮＡ配列を決定した。

（グルコサミン−６−Ｐによる阻害に対する感受性）
反応生成物であるグルコサミン−６−Ｐに対する酵素の感受性を調べた。０〜３０ｍＭ
のグルコサミン−６−Ｐの範囲で、グルタミンおよびフルクトース−６−Ｐの飽和レベル
における初期速度を測定した。結果の例を図４および５に示す。２１２３−１２株由来の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ酵素は１ｍＭレベルのグルコサミン−６−Ｐで約５０％の活性を
失った。グルコサミン−６−Ｐのレベルを増加すると、活性は減少し続けた。２１２３−
５４株では、１ｍＭのグルコサミン−６−Ｐは酵素活性に本質的に効果がなかった。この
レベル以上では阻害はほぼ直線的であり、１０ｍＭのグルコサミン−６−Ｐでは約５０％
の活性が残った。２１２３−４、２１２３−５９、２１２３−６４、２１２３−７２、２
１２３−１０３および２１２３―１４等の他の株由来の突然変異ＧｌｍＳ酵素も、Ｇｌｃ
Ｎ−６−Ｐ阻害に対し感受性が減少することが示された。図５は比較的「低い」［グルコ
サミン−６−Ｐ］で活性を示す。この図は野生型ＧｌｍＳとこれらの突然変異ＧｌｍＳ株
の間の顕著な差を浮き彫りにするものである。かなり低いレベルのグルコサミン−６−Ｐ
でも天然型ＧｌｍＳ酵素を有意に阻害する。

野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｍＳ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉで過剰発現された場合、Ｅ．
ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ遺伝子の過剰発現より高いレベルのグルコサミンが生産される。興味
のあることに、天然型Ｂａｃｉｌｌｕｓ酵素はＥ．ｃｏｌｉ突然変異ＧｌｍＳ酵素に極め
て匹敵する生成物耐性を示した（図４）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素の活性を０．２およ
び４ｍＭグルコサミン−６−Ｐで測定した。その酵素は０．６２ｍＭのＫｍ（フルクトー
ス−６−燐酸）と、１．２５ｍＭのＫｉ（グルコサミン−６−Ｐ）を有する（データは示
さず）。

Ｖｍａｘ対［阻害剤］に対する非線形回帰値の２次プロットから、２１２３−１２株に
対し０．５６ｍＭの阻害定数（Ｋｉ）が得られた。突然変異２１２３−５４株とＢ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ酵素はより高いＫｉ値を有する（表６）。これらの突然変異体のいくつかに
対する測定Ｋｉ値は、２１２３−１２株の値の４〜８倍である。振盪フラスコ実験から、
グルコサミン−６−Ｐに対する感受性の減少により、高いグルコサミンレベルの蓄積が可
能であることが明らかである。これは、細胞内［グルコサミン−６−Ｐ］が組み替えＥ．
ｃｏｌｉ株中でかなり高く（複数ミリモル）、グルコサミンシンターゼ活性が減少する結
果となることを示唆する。グルコサミン−６−Ｐに対する感受性の急激な変化は、突然変
異Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ、および野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＧｌｍＳ酵素を過剰発現す
るこれらの株中のグルコサミン合成の増加に対する最も単純な説明を与える。

（基質であるフルクトース−６−Ｐおよびグルタミンに対する親和性）
グルタミンおよびフルクトース−６−Ｐに対するＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定
数を粗抽出物を用いて測定した（表６）。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ酵素（２１２３
−１２株）では、非線型回帰により０．２０ｍＭ（フルクトース−６−Ｐ）および０．１
７ｍＭ（グルタミン）の値が得られた。突然変異ＧｌｍＳ^＊５４（２１２３−５４）での
同様な実験から、０．６４ｍＭ（フルクトース−６−燐酸）および０．７３ｍＭ（グルタ
ミン）の値が得られた。これらの値は天然型酵素で得られた値より若干高かった。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ（７１０７−２４株）中で発現したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｇｌｍ
Ｓ酵素は、突然変異Ｅ．ｃｏｌｉ酵素ＧｌｍＳ^＊５４に極めて類似したＫｍ（フルクトー
ス−６−Ｐ）を示した。

（表６．異なったＧｌｍＳ酵素の特性）

^＊ＮＤ：検出されず
（熱安定性）
５０℃における変性を、異なったＧｌｍＳ酵素の熱安定性の有り得る差を測定するため
に用いた。粗抽出物を５０℃でインキュベーションし、９０分間にわたってサンプリング
した。サンプルのグルコサミンシンターゼ活性を、全ての基質の飽和レベルで２５℃で分
析した。

５０℃における熱安定性とグルコサミン生産の間には何らの有為の関連がないように思
われる（データを示さず）。２１２３−１２４株の熱安定性は最低であるが、最良のグル
コサミン生産株の一つであることが示されている。株１２、５４および５９の間の熱安定
性に有為の差はほとんどないが、本発明の発明者らは株５４がより優れたグルコサミン生
産株であることを知っている。

（実施例４）
以下の実施例はＧｌｍＳ配列解析を説明する。

プラスミドｐＫＩＮ２３−７２およびｐＫ１Ｎ２３−１０３による形質転換および組み
込み実験で、宿主株７１０１−１７（ＤＥ３）から２１２３−７２および２１２３−１０
３株がそれぞれ誘導された。これらのプラスミド中のｇｌｍＳ領域（ｇｌｍＳ^＊７２およ
びｇｌｍＳ^＊１０３）の配列決定を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ^＊７２突然変異体コ
ード配列のヌクレオチド配列は配列番号１３として列記される。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ
^＊７２タンパク質の推定アミノ酸配列は配列番号１４として列記される。

興味のあることに、両方の突然変異体は１５、３８７、４５０および５２５位でアミノ
酸置換される同じ突然変異を有することが分かった（表７）。Ｅ．ｃｏｌｉ野生型Ｇｌｍ
Ｓ（配列番号２）、突然変異ＧｌｍＳ^＊４９（配列番号４）、ＧｌｍＳ^＊５４（配列番号
６）およびＧｌｍＳ^＊１２４（配列番号８）中の関連する位置における残基が比較のため
列記される。ＧｌｍＳ^＊４９およびＧｌｍＳ^＊７２でも見出される、４５０位におけるセ
リンからプロリンへの変化以外は、ＧｌｍＳ^＊７２は他の生成物耐性ＧｌｍＳ突然変異体
と共通の突然変異を持たない。興味のあることに、３種のＧｌｍＳ突然変異酵素（Ｇｌｍ
Ｓ^＊４９、７２および１２４）は、４５０〜４６９領域内で１個の残基がプロリンへ変化
する突然変異を有する。ＧｌｍＳ^＊５４も４７２位で残基が変化する、すなわちグリシン
がセリンで置換される。これらのデータは、タンパク質のこの領域のおける変化が酵素の
生成物耐性に重要な役割を果たし得ることを示唆する。

（表７．生成物耐性グルコサミンシンターゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ突然変異体ｇｌ
ｍＳ遺伝子における塩基の変化）

^＊ 簡単にするため、位置は推定アミノ酸配列の番号付けに従って与えられる。

異なったバクテリアｇｌｍＳコード配列のヌクレオチド配列を、標準設定のＭｅｇａｌ
ｉｇｎプログラム、Ｊ．Ｈｅｉｎ法、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウエア（ＤＮＡ Ｓｔａ
ｒ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて解析した。標準設定のＭｅｇａｌｉｇｎ
プログラム、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ配列、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウエア（Ｄ
ＮＡ Ｓｔａｒ）を用いて、核酸配列から推定したアミノ酸配列も比較された。結果を表
８に示す。

（表８．異なった微生物由来のグルコサミンシンターゼ酵素のペプチドサイズとホモロ
ジー）

^＊アミノ酸残基数には翻訳後に酵素除去されるイニシエーターであるメチオニンは含まれ
ない。
^＊＊ヌクレオチドレベルのホモロジーは括弧で示される。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉホモログより９
残基短いグルコサミンシンターゼの５９９個のアミノ酸残基（通常、翻訳後に酵素除去さ
れるイニシエーターであるメチオニンを除く）をコードする（配列番号１６）。異なった
生成物耐性Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳ突然変異体中に突然変異が見出される位置に対応する
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＧｌｍＳタンパク質のアミノ酸残基が表９に列記される。興味のあ
ることに、１０個の位置のうち６個で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ酵素はＥ．ｃｏｌｉ野生型Ｇｌ
ｍＳとは異なった残基を有するが、どの変化もＥ．ｃｏｌｉ突然変異酵素中と同じでない
。

（表９．生成物耐性突然変異Ｅ．ｃｏｌｉ ＧｌｍＳと野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＧｌｍＳ^＊におけるアミノ酸残基の変化）

^＊ Ｅ．ｃｏｌｉ野生型ＧｌｍＳタンパク質の残基と異なる残基のみを示す。
^＊＊配列中の小さいギャップのため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＧｌｍＳ配列の位置は、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ野生型ＧｌｍＳ配列との整列に基づく。

（実施例５）
以下の実施例は、振盪フラスコ培養内のグルコサミン生産中の酵素活性を示す。

グルコサミン生産に関連する様々な酵素活性を振盪フラスコおよび醗酵槽中で調べた。
これらの酵素のグルコース代謝およびＮ−グルコサミン生成への関与の概要を図３に示す
。グルコースが細胞に取り込まれ、同時にグルコース−６−Ｐに変換される。グルコース
は図に示される経路を含むいくつかの経路で代謝される。グルコサミン合成経路で、グル
コース−６−Ｐはフラクトース−６−Ｐに異性化され、次いでＧｌｍＳが媒介してフラク
トース−６−リン酸がグルコサミン−６−リン酸へ変換される。最後に、グルコサミン−
６−リン酸が脱リン酸化され、分泌される。グルコース−６−リン酸に対する主要な別ル
ートは、ホスフォフラクトキナーゼによりグリコリシスへ入ることである。グルコース−
６−リン酸に対する重要な別ルートは、グルクノラクトン−６−リン酸への酸化である（
ペントースリン酸経路へ入る）。また、グルコース−６−リン酸はグルコース−１−リン
酸へ変換され、それからグリコーゲンが生成し細胞内に貯蔵される。

２１２３−５４株を用いる振盪フラスコ実験における酵素分析の結果が図６に示される
。細胞をＭ９Ａ培地中で生育し、培養の開始から０．２ｍＭＩＰＴＧで誘導された。全実
験を通してグルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）活性は高かった。１２時間で高いレベ
ルのＧｌｍＳ活性があり、２４時間で活性はさらに増加した。その後、ＧｌｍＳ活性は減
少する様に思われた。しかしながら、この減少は急激ではなかった。７２時間における活
性はまだ高く、１２時間で観測された活性と基本的に同じであった。従って、ＧｌｍＳ活
性は実験期間中に有意に減少するとは思われなかった。

ホスフォグルコイソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性は１２時間で高く、２４時間で有意に増加
した。その後、活性は１２時間におけるレベルに戻り、残りの実験中そのレベルのままで
あった。明らかに、この実験条件のセットではグルコースからフラクトース−６−リン酸
の生成はこれらの細胞中の低いＰｇｉ活性で制約されない。

フラクトース−６−リン酸についての他の主要なルートはグリコリシスである。これに
関連する最初の工程はホスフォフラクトキナーゼ（Ｐｆｋ）で媒介される。最大Ｐｆｋ活
性が１２時間で観測され、次の４８時間にわたって減少したが、この活性は検出可能のま
まであった。この活性パターンはＰｆｋに典型的である。対数増殖中は活性は最高であり
、次いで細胞が定常期に入ると減少する。

抽出物中でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕ６Ｐ ＤＨ）が検出され
た。この酵素はＮＡＤＰＨを再生するためにグルコースからペントースリン酸経路へ炭素
を供給する。この酵素の活性は測定された他の酵素と比べて非常に低いが、十分に安定で
あり、実験の最初の２４時間後は若干減少した。ホスフォグルコムターゼ（Ｐｇｍ）の活
性は実験条件下で極めて低いことが見出された。

（実施例６）
以下の実施例は、ラクトース誘導グルコサミン生産のための組み換えＥ．ｃｏｌｉ開発
を記載する。

グルコサミン生産の商業的に利用できるプロセスを開発するためには、二つの因子が必
要であった。第一はグルコサミン力価を増加させることである。第二は醗酵プロセスでＩ
ＰＴＧを使用しないことである。なぜならＩＰＴＧのコストがグルコサミン生産を阻害す
るほど高価になるからである。研究計画の初期に開発されたグルコサミン生産用の株は、
グルコサミンシンテターゼの発現を誘導するために培養培地中にＩＰＴＧを必要とした。

（醗酵プロセスからＩＰＴＧを除外するための戦略）
生産株（例えば、２１２３−５４株）において、醗酵プロセス中におけるＩＰＴＧ要求
は、ＧｌｃＮ６ＰシンセターゼをコードするｇｌｍＳ遺伝子の過剰発現モードから生じる
。ｇｌｍＳ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡから単離され、そしてバクテリオファー
ジＴ７由来のプロモーターの後、発現ベクター中にクローニングされた。このプロモータ
ーは極めて強力で特異的である。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼはこれを認識せず、むしろＴ
７ＲＮＡポリメラーゼがこれを認識する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはＥ．ｃｏｌｉ ｌ
ａｃプロモーターとｌａｃオペレーターで作動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む、Ｄ
Ｅ３と指定される遺伝子要素中に提供される。ＩＰＴＧによる誘導を必要とするのはこれ
らのプロモーターおよびオペレーターである。ｌａｃプロモーターはｌａｃＩ遺伝子でコ
ードされるｌａｃレプレッサーにより負の制御を受ける。誘導因子がない場合は、ｌａｃ
レプレッサーがｌａｃオペレーターに結合し、オペレーターの下流の遺伝子、この場合は
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を妨害する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼがない場合
は、組み換えｇｌｍＳ遺伝子は発現されない。ＩＰＴＧが存在すると、ｌａｃレプレッサ
ーがオペレーターに結合せず、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が発現しｇｌｍＳが過剰発
現する結果となる。

ｌａｃプロモーターの他の誘導因子はアロラクトンである。これはｂ−ガラクトシダー
ゼのラクトースにたいする作用の副生物である。ｌａｃＺ遺伝子の欠失および破壊のため
に、２１２３−５４株等のグルコサミン生産株はｂ−ガラクトシダーゼに対し陰性である
。しかしながら、機能性ｌａｃＺ遺伝子が存在すると、ラクトースはアロラクトンに変換
され、ｇｌｍＳを発現させる上記の連続反応を開始する。

上記を参照すると、ＩＰＴＧ依存性を解消する方法がいくつかある。本実施例で記載す
る一つのアプローチはｌａｃＺ遺伝子を除去することである。これはＴ７−ｇｌｍＳ^＊５
４発現カセットを染色体中の異なった部位へ組み込むことで行われる。ｇａｌＫ部位に組
み込むとｌａｃＺ遺伝子は無傷のままである。Ｌａｃ^＋株はＩＰＴＧより安価であるラク
トースで潜在的に誘導可能である。組み込み株はＧａｌ⁻であるので、ｇａｌＫ部位が選
ばれた。この様な株ではガラクトースをｌａｃプロモーターに対する誘導因子として使用
し得ると報告された。さらに、ラクトースの加水分解で生じたガラクトースがラクトース
誘導を促進し得る。準最適量のラクトースをグルコサミン生産プロセスで使用した場合、
ラクトースは誘導を促進する。理論的には、Ｔ７−ｇｌｍＳ^＊発現カセットを７１０７−
１７（ＤＥ３）株中のｇａｌＫ部位に挿入した場合、得られた株は２１２３−５４株と類
似しているが、グルコサミン生産は、ラクトース、ガラクトースまたはＩＰＴＧの何れか
で誘導可能である。

（温度選択による染色体上の標的部位へ遺伝子組み込みまたは欠失のための一般的プロ
トコール）
温度変化でＥ．ｃｏｌｉ染色体中に標的遺伝子の欠失と遺伝子組み込みを行うためのベ
クターと方法がＨａｍｉｌｔｏｎら（１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６
１７−４６２２）によって報告された。この方法を異なったグルコサミン生産Ｅ．ｃｏｌ
ｉ株を開発するために採用した。遺伝子組み込みのためのプロトコールには以下の主な工
程が含まれる。第一工程では標的部位の配列をクローニングし、内部欠失を行い、および
／またはこの欠失部位に組み込まれるべき外来遺伝子を挿入する。第二工程では、これら
の配列を含むフラグメントを、温度感受性複製開始点および抗生物質選択マーカーを含む
温度感受性組み込みベクター中にサブクローニングする。第三工程では、組み込みベクタ
ーをＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、非許容温度（４２℃）で単一交差組み換えによ
り染色体中に組み込まれた全プラスミドにつき、クローンを選択する。第四工程では、選
択したクローンの細胞を液体培地中に許容温度（３０℃）で生育させる。選択したプラス
ミドを有する細胞はプラスミドを失い易い。複製開始点および抗生物質耐性遺伝子、また
は全プラスミドを失った細胞は培養液中で速く生育する。具体的には、この工程は５０ｍ
ｌのＬＢ培地に２個〜１０個のクローン由来の細胞を接種し、培養細胞を２４時間生育さ
せることで行われた。培養細胞を１０００倍希釈で新鮮な培地に移し、さらに２４時間生
育させた。第五工程では、細胞をプレート上に蒔き、抗生物質耐性を失ったクローンを選
択した。組み込まれた遺伝子または欠失した遺伝子の性質によって、遺伝子特異性手順が
使用された。具体的には、クローンを選択するために、染色体中の意図する変化を有する
クローンを、その天然型からＰＣＲ生成物のサイズによって区別し得るプライマーセット
を用いてＰＣＲを行った。組み込まれた、または欠失したＤＮＡ配列に特異的なプローブ
を用い、クローンをサザンブロットで確認した。

（Ｔ７ｇｌｍＳ^*５４のｇａｌＫ部位への組み込み用ベクターの温度選択による開発）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌオペロン配列の一部を含むベクター、ｐＵＣ４Ｋプラスミド由来
のカナマイシン耐性選択マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、およびｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性ｐＳＣ１
０１複製開始点（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４
６１７−４６２２）を含むベクターを、温度選択プロトコールを用いるｇａｌＫ部位への
遺伝子組み込みのために開発した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌオペロン配列の一部（３．３ｋ
ｂ）をＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０株からＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ生成物はｇａｌＴＫＭ配
列（ｇａｌＴコード配列のＡＴＧ開始コドンの１４ｂｐ上流から開始し、ｇａｌＭコード
配列の停止コドンに続く６８ｂｐで終了）を含み、ベクターｐＣＲＳｃｒｉｐｔ Ａｍｐ
ＳＫ（＋）中にクローニングして組み換えプラスミドｐＫＬＮ２３−１５７を作成した
。０．７ｋｂの欠失をｇａｌＫ配列に作成し（制限部位ＳｆｏＩとＭｌｕＩの間）、ユニ
ーク制限部位（ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩおよびＭｃｓＩ）を欠失部位に加え、プラスミドｐ
ＫＬＮ０７−１を作成した。ＰｓｔＩ消化と平滑末端を生成するためのＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理により、カナマイシン耐性カセットをＰｓｔＩフラグメントとしてｐＵＣ４Ｋ
から単離した。このフラグメントをプラスミドｐＫＬＮ０７−１（配位は未決定）のＮｏ
ｔＩ部位（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化）にライゲートした。ｋａｎ：：ｇａｌ
ＴＫＭフラグメントからプラスミドのＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端化）フラグメントとして除去し、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン（Ｈ
ａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７1：４６１７−４６２２）
を含むＰｖｕＩＩ／ＳｍａＩフラグメントとライゲートしプラスミドｐＳＷ０７−４を作
成した。発現カセットＴ７−ｇｌｍＳ^＊５４をプラスミドｐＫＬＮ２３−５４（米国特許
第６．３７２．４５７号に開示）からＮｏｔＩフラグメントとして消化し、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼで平滑末端した。このフラグメントをＭｓｃＩ部位のｐＳＷ０７−４中にクロ
ーニングし、プラスミドｐＳＷ０７−９を作成した。

（ラクトース誘導株の選択）
Ｅ．ｃｏｌｉ７１０１―１７（ＤＥ３）株をｐＳＷ０７−９で形質転換後、Ｈａｍｉｌ
ｔｏｎら（１９８９）から採用したプロトコールを組み込み突然変異体の温度感受性選択
のために使用した。ｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レプリコンを有するプラスミドでは
プラスミドの複製が３０℃で行われるが、抗生物質選択条件下でプラスミドの組み込みが
非許容温度で強制的に行われる。この結果、形質転換細胞を４２℃でインキュベーション
して組み込みプラスミドを有する株が選択された。これは細胞をカナマイシンを含むプレ
ート上に播種し、プレートを４２℃でインキュベーションしコロニーを選択することで行
われた。通常、全プラスミドが相同組み換えにより染色体中に組み込まれた。ｇａｌＴま
たはｇａｌＭ領域では単一交差が行われた。

複製開始点のため、組み込まれたプラスミドを有する細胞は染色体からプラスミドがル
ープとなってはみ出す傾向がある。全プラスミドが組み込まれた細胞は３０℃での生育が
極めて悪いが、プラスミドまたは複製開始点部分を失った細胞は正常な生育を示す。従っ
て、４２℃で選択した細胞を３２℃で生育させた場合、プラスミドを失った細胞はプラス
ミドが残る細胞より速く成長する。原理的に、相同組み換えにより細胞がプラスミドを失
うには、二つの異なった方法がある。細胞が全プラスミドを失って天然型ｇａｌオペロン
を有する復帰株となるか、または複製開始点と選択マーカーを含むプラスミド部分のみを
失ってｇａｌＫ部位に組み込まれたＴ７−ｇｌｍＳ^＊５４配列を有する株となるかである
。４２℃選択から単離された細胞を液体培地中に３０℃でインキュベーションし、抗生物
質を含まないプレート上に播種した。組み込みによりｇａｌＫ遺伝子が不活性化したので
、組み込み株は単独の炭素源としてガラクトースを利用することができなかった。ガラク
トースプレートをこの様な組み込み株のスクリーニングに使用し、その株をｇａｌＫ配列
をプローブとして用いるサザンブロットハイブリダイゼーションで確認した。これらのラ
クトース誘導グルコサミン生産株は７１０７−１６および７１０７−１８を表わす。

（実施例７）
本実施例はラクトース誘導グルコサミン生産を記載する。

ｇａｌＫ部位に組み込まれたＴ７−ｇｌｍＳ^＊５４発現カセットを有する株（７１０７
−１６および７１０７−１８株）は、ＩＰＴＧまたはラクトースのいずれかによる誘導後
に高レベルのグルコサミンを生産する。ＩＰＴＧ誘導下のコントロール株（２１２３−５
４）は４．２ｇ／ｌを生産した。ラクトース誘導株におけるグルコサミン収量はＩＰＴＧ
誘導２１２３−５４株と同等であった。２１２３−５４株およびラクトース誘導株におけ
るグルコサミンレベルを図７に示す。

グルコサミンシンテターゼ活性をラクトース誘導培養サンプルで分析した。細胞を異な
った量のグルコースおよび／またはラクトース（数字はリッター当たりのグラム数を示す
）を含むＭ９Ａ培地中で生育させた。２４時間の生育後、酵素活性とグルコサミンを分析
した。表１０に示すように、ラクトースはＧｌｍＳ活性とグルコサミン合成を誘導する。
ラクトース誘導は培地中のグルコース量に影響された。高レベルのグルコースはラクトー
ス誘導の強い抑制を示した。７１０７−１８株をラクトース誘導プロトコールのさらなる
開発のために選択した。この株を、振盪フラスコおよび１リッター醗酵槽中での様々なラ
クトース誘導スキームで評価した。
表１０．ラクトース誘導株７１０７−１６におけるグルコサミンシンテターゼ活性および
グルコサミン生産レベル

注：
１）細胞を異なった量のグルコースおよび／またはラクトースを含むＭ９Ａ培地中で生育
させた（数字はリッター当たりのグラム数を示す）。
２）酵素活性とグルコサミンを２４時間の生育後に分析した。

（ラクトース誘導およびグルコース抑制）
醗酵実験では、ラクトース誘導後にラクトースまたはグルコースの供給と共に異なった
ラクトースレベルが試された。を試みた。グルコサミンレベルを７２時間にわたりモニタ
ーした。ラクトース誘導の最初のプロトコールは、接種前にラクトースを添加し（グルコ
ースはｌａｃオペロンを抑制するのでグルコースなしで）、その後生育、ＧｌｃＮ生成お
よびバイオマス維持のために炭素を供給した点でＩＰＴＧ誘導と類似していた。細胞を４
０ｇ／ｌのラクトースで生育させ、ラクトースを連続的に供給した場合、細胞はラクトー
スを消費し続けた。これにより４０ｇ／ｌまでの有意レベルのガラクトースが蓄積された
。グルコサミン生産レベルは、ＩＰＴＧ誘導下の２１２３−５４レベルと同等であった（
約１０ｇ／ｌ）。

細胞を４０ｇ／ｌのラクトースで２４時間生育し、次いでグルコース供給へ切り替えた
。この様な条件下で、残りの試行中、細胞はラクトースの消費を停止し、ガラクトースは
１０ｇ／ｌで一定であった。グルコサミン生産は良好な速度で続き、２１２３−５４株に
匹敵する速度レベルに達した。この結果は、ラクトースの利用が停止した後もガラクトー
ス生産を厳密にグルコースで維持し得ることを示す。このことはまた、誘導には低いレベ
ルのガラクトースのみが蓄積する少量のラクトースのみが、必要であることを意味する。
ラクトース要求が少なく、ガラクトース蓄積が少ないことは、双方ともコスト削減および
生成物回収に望ましいことである。

５０ｇ／ｌおよび６０ｇ／ｌに増加させたラクトースを使用した後、グルコースを供給
する誘導スキームは、グルコース添加後しばらくの間ラクトースの利用が継続したことを
示す。このことは、より高レベルのラクトースでグルコースによる抑制が不完全であるか
、または誘導された酵素が適当なレベルで機能し続け、グルコース添加後のグルコサミン
生産を維持することを示している。

低いレベルのラクトースを使用することが望ましく、この実験は、より少ないレベルの
ラクトースを試験したが、試験される最低レベルのラクトースでグルコース抑制が最小に
なり得ることを示した。以後の開発作業は誘導に必要な最小レベルのラクトース、最適タ
イミングおよび誘導期間、およびラクトース誘導前のグルコースを含む初期生育期の利点
を確立することに集中された。制御醗酵で取り他界細胞密度が望ましい場合、後者は特に
重要であり得る。

細胞がグルコース欠乏になるまで細胞をグルコースで生育させ、その後ラクトースで誘
導することが試みられた。グルコースによる生育で約１７ｇ／ｌの細胞密度に到達させ、
次いでラクトース供給をゆっくり開始した。この様な条件下でＧｌｃＮ生産は１０ｇ／ｌ
に達した。この戦略をＧｌｃＮ生産のその後の実験に使用した。

（酢酸の効果）
酢酸はＥ．ｃｏｌｉ醗酵の共通の副生物である。グルコースが過剰である場合、生育速
度が臨界レベルを超える場合、またはグリコリシス速度と生成した代謝物の酸化が呼吸容
量の飽和のために不均衡である場合、酢酸は好気条件でも生成する。培養液に酢酸を加え
ると、生育およびグルコサミン蓄積の両方に有意の負の効果を示す。酢酸はグルコサミン
生産中も蓄積することが示された。微量元素レベルも酢酸生成レベルに影響した。

プロセス開発による酢酸の蓄積を減らす戦略には、グルコースが飽和しない様にグルコ
ース供給を遅くすることによる生育制限が含まれる。この戦略は全実験計画中に採用され
た。微量元素またはカリウム制限等のある条件で、酢酸レベルは有意なレベルとなった。
低いｐＨは酢酸の粗が憩うかを増加させた。

（温度の効果）
米国特許第６，３７２，４５７号に開示される様に、生育とグルコサミン生産に好まし
い温度は３０℃たった。高い生育温度（３７℃）は生育速度を高くして、グルコース取り
込みを増加し、最終的に酢酸阻害レベルをもたらした。高い温度はまた、不溶性／不活性
組み換えＧｌｍＳタンパク質を含む封入体を生成し得る。誘導後に温度を３０℃から２５
℃に変化した場合、フラスコ内実験で酢酸レベルの有意の減少と相対的なＧｌｃＮレベル
を示した。従って、酢酸の蓄積を減少させるための低い温度（２５℃）を醗酵槽で評価し
た。その結果、グルコース蓄積の条件下でも低温で酢酸の蓄積が減少することが示された
。

（微量元素の効果）
バイオマスをより高い密度に生育するためにある種の微量元素、特に鉄、亜鉛およびマ
ンガンが必要である。全微量元素パッケージの最初の滴定で、微量元素のレベルが低すぎ
る場合はバイオマス生産が限定されることが示された。鉄が主要な制限成長因子であるこ
とが分かったが、過剰にあると鉄はＧｌｃＮ力価を減少し酢酸レベルを高くする。フラス
コ培養ではマンガンは細胞密度とＧｌｃＮレベルに同様ではあるがより弱い効果を与える
。マンガンの効果は鉄の効果に加算的であるように思われる。マンガンの負の効果は、醗
酵槽で確認された（図８）。細胞がラクトースで適切に誘導される様になるためには、適
切な鉄の供給が必要であることが見出された。従って、生育要求、誘導要求と、酢酸およ
びＧｌｃＮ生産への効果とがり合うために、臨界濃度範囲を確立しなければならなかった
。グリコリシスからの炭素フローを制限するための鉄、マンガンおよび亜鉛の制限は、ク
エン酸醗酵の開発に先例がある。

数回の実験後、最終スキームが確立された：培地中の３ｍｇ／ｌの硫酸鉄、および５μ
ｇ／ｇの比率でグルコース供給に添加される硫酸鉄。培地中３ｍｇの硫酸鉄の最初のレベ
ルで、グルコース供給溶液に鉄を添加することが、定レベルのバイオマス生育およびＧｌ
ｃＮ生産の増加を維持するために必要であった。

（リン酸濃度の効果）
細胞にとって、核酸合成、燐脂質およびコエンザイムに主に用いられる燐は必要な主要
栄養要素である。リン酸化代謝中間体も細胞代謝に必要である。Ｍ９Ａ培地中の高いリン
酸濃度は、振盪フラスコ条件下では容易に制御できない培養中のｐＨを緩衝する一つの方
法となる。しかしながら、この培地を醗酵スケールへスケールアップすることは、リン酸
が正常なバイオマスの要求を超えた大過剰となることを意味する。高い塩レベルは、生成
物回収に問題を提示する。従って、リン酸レベルを下げることが望まれた。リン酸レベル
を下げるいくつかの試みはより良い生育を示したが、ＧｌｃＮ生産ははるかに悪くなった
。例えば、リン酸カリウムレベルを３０ｇ／ｌから６ｇ／ｌへ下げた場合、恣意行くは改
善されたがＧｌｃＮの生産は大きく減少した（図９）。

（実施例８）
この実施例は、ラクトース誘導グルコサミン生産株７１０７−１８の生育に対するｐＨ
の効果を記載する。

実施例１１に示すように、グルコサミンはＥ．ｃｏｌｉ生育に用いられる正規のｐＨ範
囲では不安定である。グルコサミンはまた、７１０７−１８に毒性効果をもたらした。細
胞を接種する前にグルコサミンを２０ｇ／ｌの低い濃度で培地（ｐＨ７）中にプレインキ
ュベーションした場合でも、毒性が観察された。出発ｐＨが７．０である培地中で、毒性
は少なくとも部分的にＧｌｃＮ分解生成物に帰せられた。ＧｌｃＮは低いｐＨでより安定
であり、ｐＨ４．７以下でグルコサミンは分解しない。しかしながら、低いｐＨレベルが
細胞生育を制限することが公知である。従って、７１０７−１８株がｐＨ７．０、６．０
、５．５、５．０および４．７で生育する実験が行われた。主な目的はこれらの低いｐＨ
（ＧｌｃＮ含有）での細胞生育の実験、および以前に観察されたＧｌｃＮ分解で生じた細
胞死が低いｐＨで減少し得るかどうかを調べることである。

４０ｇ／ｌのグルコースおよび２０ｇ／ｌのＧｌｃＮを有するＭ９Ａのバッチを５種の
異なったｐＨに調節した。フラスコの一つのセットは即時に７１０７−１８細胞を接種し
た。同じ培地の複製フラスコは、接種前に細胞なしで１０時間インキュベーションした。
４８時間で７回、フラスコをサンプリングしてｐＨ、ＯＤ_６００およびＧｌｃＮ濃度を測
定した。各サンプリングポイントで、培地のｐＨを再調整して最初の設定に戻した。

グルコサミンをプレインキュベーションしない場合は、ｐＨ７．０出の細胞培養は、培
地中のグルコサミンが２０ｇ／ｌの場合でも生育は良好であった（図１０）。ｐＨ７．０
と４．７の間では、ｐＨが減少すると生育速度が減少した。しかしながら、ｐＨ４．７で
細胞は有意の生育を続けた。

先の観察と同様に、ｐＨ７．０で培地をグルコサミンと共にプレインキュベーションし
た後は細胞の生育は良くなかった。プレインキュベーションされた培地中に接種した後の
細胞生育を観察した。試験したｐＨレベルを通じて生育は極めて悪かった。これは低いｐ
Ｈとグルコサミン分解の細胞培養に対する影響の組み合わせの結果であると思われる。

これらの実験に基づき、生成物の損失とグルコサミンの分解で生じる毒性効果を最小に
するためには、７１０７−１８細胞を７．０より低いｐＨレベルで生育することが実行可
能である様に思われた。しかしながら、最適ｐＨと培養条件を注意深く調整しなければな
らない：低いｐＨはグルコサミンを安定化し得るが、細胞代謝と細胞生育に負の効果があ
る。比較的低いｐＨレベルで実行する醗酵槽中のＧｌｃＮ生産プロトコールは、生成する
任意のＧｌｃＮを保存するのに確かに有利であり、分解生成物の濃度を下げてプロセス中
の細胞を保護する。これらの利点は、この方法で生育した細胞の代謝活性の減少と釣り合
わなければならない。連続ＧｌｃＮ合成には細胞内で定常的なエネルギー発生が必要であ
り、これらの低いｐＨレベルでゆっくり生育する細胞は要求される十分なエネルギーを発
生し得るとは思われない。

（実施例９）
本実施例では、グルコサミンを安定化するためのより低いｐＨにおける醗酵を記載する
。

Ｅ．ｃｏｌｉに対する地位上の最適ｐＨは中性（ｐＨ７．０）付近であり、最初は６．
７〜６．９のｐＨがＧＬｃＮ醗酵に用いられる。しかしながら、ＧＬｃＮは特に中性〜ア
ルカリ性ｐＨで溶液中に分解される。微生物はｐＨに敏感であり、ｐＨが減少すると生育
が悪くなる。従って、グルコサミン合成と生育期後の蓄積に対するｐＨの効果を調べる試
験を行った。グルコサミン分解は酸化的であるとされているので、溶存酸素レベルの効果
も試験した。細胞をｐＨ６．７で生育させ、高い細胞密度に到達させた。培養を誘導後、
ｐＨを６．７から５．５に下げ、溶存酸素のレベルも２０％から５％飽和に下げた。この
実施例において、最高のグルコサミンの蓄積は低いｐＨであり、低い酸素レベルも有益で
あったと思われる（図１１）。ｐＨと酸素負荷を変えていくと、低いが一定のグルコース
供給でグルコサミン蓄積の停止後、培養液中の低いｐＨにおける分解はより少なくなった
ので、少なくとも改良の幾分かは低い分解のためであった。

（実施例１０）
本実施例はラクトース誘導グルコサミン醗酵プロセスで用いられた条件を集約する。

グルコサミンのラクトース誘導生産のため、組み換えＥ．ｃｏｌｉを用いて醗酵プロセ
スを開発した。７２時間で生成物力価は約２０ｇ／ｌであった。当業者にとっては、本発
明に開示された観察に基づいてプロセスをさらに最適にし得る。また他の醗酵プロセスの
ために開発された方法をグルコサミン醗酵プロセスに応用し、効率を向上させ得る。本発
明に開示された主要な因子と要素が以下にまとめられる。
株： 組み換えＥ．ｃｏｌｉ
誘導： 細胞密度が３０ｇ／ｌに達した後、ラクトースを添加した（１０時間に
わたり徐々に３５％フィードとして）。グルコース抑制を阻止するため
、
この手順中はグルコースフィードを停止。
フィード： ５μｇＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ／ｇグルコースおよび０．３３μｇＭｎＳ
Ｏ_４・
Ｈ_２Ｏ／ｇグルコースを含む５０％グルコース；グルコースフィードは
制
限濃度。
醗酵時間： ７２時間
醗酵モード： フィードバッチ、必要あれば５０％グルコースを添加し、グルコースの
制限濃度を維持。
接種： ５容積％
ｐＨ： 生育中は６．９、誘導後は６．７、１０ＮＮＨ_４ＯＨで制御
温度： ３０℃、誘導後は２５℃に切り替え
酸素： 溶存酸素２０％以上、攪拌で制御
曝気： ０．５〜１ｖｖｍ
培地

グルコース（徐々に増加して添加）、およびＦｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｂ、Ｃｏ微量元
素（滅菌後添加）以外の全成分を滅菌前に添加した。

（実施例１１）
本実施例はグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの安定性と、そのＥ．ｃｏｌ
ｉに対する効果を記載する。

（グルコサミンの安定性）
グルコサミンの安定性を、４０ｇ／ｌグルコースを添加した無細胞Ｍ９Ａ培地（Ｋ_２Ｈ
ＰＯ_４ １４ｇ／ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １６ｇ／ｌ、クエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ １ｇ／ｌ
、（ＮＨ_４）ＳＯ_４ ５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ_４ １０ｍＭ、ＣａＣｌ_２ １ｍＭ、ｐＨ７．
０）中で試験した。グルコサミンを３０％グルコサミンＨＣｌ濃縮液として調製し、最終
濃度０、４、１３、２６および４２ｇ／ｌ（２５０ｍｌフラスコ中全量５０ｍｌ）で添加
した。培地のｐＨを６．９に調節した。フラスコをシェーカー上に置き、約２２５ｒｐｍ
に調節した。グルコサミンレベルを３０℃で約２４時間モニターした。グルコサミンは不
安定であり、グルコサミン濃度が高いほど分解速度が速く、その分解は濃度に依存した。
グルコサミン４２ｇ／ｌの培地中では、グルコサミンの半分以上が１日以内に分解した。
出発グルコサミン濃度が４ｇ／ｌの場合、分解はわずか約２５％であった。培地のｐＨの
減少に伴ってグルコサミンが分解した。４２ｇ／ｌグルコサミンサンプルでは、培地のｐ
Ｈは２４時間後に０．７単位（６．９から６．２に）減少したが、グルコサミンのない培
地ではｐＨ変化は僅か約０．１５単位であった。

４種の開始ｐＨレベルにおけるグルコサミン（６０ｇ／ｌ）の分解を無細胞Ｍ９Ａ−グ
ルコース（４０ｇ／ｌ）培地中、３０℃でモニターした。各サンプリング時間で溶液のｐ
Ｈを再調整した。各条件を三重で行った。図１２に示すように、分解は強くｐＨに依存し
、高いｐＨでより速かった。グルコサミンの損失はｐＨ７．０で６８％であったが、ｐＨ
５．５では１８％であった。分解速度に対するｐＨの外插により、ｐＨ約４．７以下では
分解を生じないと示唆される。

グルコサミンが分解すると溶液は黄琥珀色になった。発色の程度は３６０−４００ｎｍ
の吸収で見積もることができる。分解速度がより速い初期のサンプリング期間を除いて、
分解したグルコサミンの量と培地中の琥珀色濃度の間には強い相関があった。２種の最低
ｐＨレベルで、グルコサミンの消失と発色の間にかなりの遅れがあり、着色成分がグルコ
サミンの直接分解生成物でないことを示している。試験した全てのｐＨレベルで分解速度
が遅くなった後、分解したグルコサミンと黄色い色の比率は一定であった。

グルコサミンの分解と発色の分子機構はほとんど知られていない。水中および乾燥条件
下でのグルコサミンの熱分解について報告されている（Ｓｈｕ、１９８８、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ
．４６、ｐ１１２９−１１３１）；ＣｈｅｎおよびＨｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．４６、ｐ１９７
１−１９７４；双方ともその全文は本明細書中に援用される）。しかしながら、本実験で
用いられた温和な条件下で、同じタイプの化学反応が生じるかどうかは公知でない。研究
者らはグルコサミンから褐色生成物の生成を観測し、褐色生成物の抗酸化活性を研究した
が（ＯｙａｉｚｕおよびＭａｎｋｏｔｏ、１９８８、ＮｉｐｐｏｎＳｈｏｋｕｈｉｎＫ
ｏｇｙｏ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ、ｖｏｌ．３５、ｐ７７１−７７５、その全文は本明細書
中に援用される）、その研究では褐色生成物が化学的に同定されなかった。グルコサミン
の分子構造を考えると、アルデヒドとアミノ基の双方が分解および／または重合に関与し
ていると思われる。発色は共役二重結合と複合構造の形成を示唆する。

アルデヒド基の関与を試験するため、３０ｇ／ｌのグルコサミンを含み、４０ｇ／ｌの
グルコースを含む、または含まないＭ９Ａ培地中で分解をモニターした。アルデヒド基が
関与している場合、グルコースの存在はグルコサミンの分解／重合速度に影響すると考え
られる。グルコサミン分解に有意な差は見られなかった。この観察はアミノ基のグルコサ
ミン分解への役割を示唆する。

（Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−１８に対するグルコサミンの効果）
グルコサミンは重要な細胞壁成分の合成の前駆体であるので、Ｅ．ｃｏｌｉ生育に極め
て重要である。Ｅ．ｃｏｌｉはグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンを唯一の炭
素源として使用することも可能である。ミノ糖の異化作用には、７１０７−１８株では欠
失しているｎａｇＢ遺伝子でコードされる機能性グルコサミンデアミナーゼを必要とする
。予想通り、７１０７−１８株はグルコサミンを唯一の炭素源として含むプレート上で生
育できなかった。４０ｇ／ｌのグルコースを含む培地中でグルコサミンがＥ．ｃｏｌｉ７
１０７−１８細胞の生育と生存に影響するかどうかを研究する実験を行った。新規に接種
した培養物の生育はリッター当たり１０および２０ｇのグルコサミンでわずかに阻害され
た。細胞プレート培養で示される様に、リッター当たり４０ｇのグルコサミンは細胞生育
を阻止し、約１６時間のインキュベーションで細胞を死滅させはじめた。５２時間後、生
存菌数は最初の数の約１／５に低下した。

Ｅ．ｃｏｌｉ ７１０７−１８についてのグルコサミンの毒性効果を調べるためにさら
に実験を行った。３５ｇ／ｌのグルコサミンを含むＭ９Ａ−グルコース（４０ｇ／ｌ）中
に直ちに接種した細胞はかなり良く生育したが、３．５時間の短い時間プレインキュベー
ションした同じ培地中に接種した場合、細胞は急速に死滅した。このことは、殺菌は接種
前に培地中で生成したグルコサミン分解生成物（複数）によることが多いことを示してい
る。培地調製後直ちに接種した場合、何故細胞が生存し生育し得るかは分かっていない。
一つの記載は、グルコサミンが生成物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに順番に分解され得る。細胞は
比較的低濃度の初期生成物を許容または同化する能力を有するが、その後の生成物および
／または高レベルの初期生成物はより毒性が高くなり得る。この仮説は、より高いグルコ
サミン濃度とより長いプレインキュベーション時間が生存菌数のより低いレベルをもたら
すという観察と一致している。３５ｇ／ｌのグルコサミンでは、生存菌数は接種レベルよ
り１０^５倍低下した。

（Ｎ−アセチルグルコサミンの安定性）
ｐＨの効果で示唆される様に、アミノ基が分解に重要な役割を果たす様に思われる。こ
れが真実である場合、Ｎ−アセチルグルコサミンははるかに安定でなければならない。さ
らに、ｐＨ効果もグルコサミンほど顕著になり得ない。Ｎ−アセチルグルコサミンの安定
性をグルコサミン分解の実験と類似の実験で試験した。ｐＨ５．５および７における８０
および４０ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンの安定性を無グルコースＭ９Ａ培地中で２
日間にわたってモニターしたが、有意な分解を生じなかった（図１３）。これはグルコサ
ミンで見られた分解と明瞭に対照的である。グルコサミンが分解すると、培地は琥珀色に
発色した。Ｎ−アセチルグルコサミンを含むＭ９Ａ培地で４８時間に渡ってこの様な発色
は見られなかった。さらに、インキュベーション中に有意なｐＨ低下がなかった。この結
果より、遊離アミノ基がグルコサミンの分解および／または重合に関与する鍵となる官能
基であることが確認される。

（Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−１８に対するＮ−アセチルグルコサミンの効果）
６２ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンを含むＭ９Ａ−グルコース（４０ｇ／ｌ）中に
細胞を接種した。培地を８時間以上プレインキュベーションした場合でも、有意の生育阻
害は観察されなかった。

まとめると、Ｎ−アセチルグルコサミンはＥ．ｃｏｌｉ７１０７−１８株に対し負の効
果を持たず、グルコサミンよりはるかに安定であった。従って、グルコサミンの代わりに
Ｎ−アセチルグルコサミンを生産することは潜在的に有利である。グルコサミンは細胞内
に輸送され、サブユニットがｍａｎＸＹＺ遺伝子でコードされるマンノーストランスポー
ター、およびｐｔｓＧ遺伝子でコードされるグルコーストランスポーターでリン酸化され
ることが知られている。ｍａｎＸＹＺ遺伝子は７１０７−１８株で欠失しているが、グル
コーストランスポーターでグルコサミン取り込みが行われる。培地中の濃度が高い場合、
相当量のグルコサミンが細胞内に入り得る。７１０７−１８株中のマンノーストランスポ
ーター（ｍａｎＸＹＺ）およびＮ−アセチルグルコサミントランスポーター（ｎａｇＥ）
の欠失のため、細胞内輸送で戻ることなく、Ｎ−アセチルグルコサミンを培地内に高いレ
ベルで蓄積し得る。これはＮ−アセチルグルコサミンのグルコサミンに対するまた別な利
点である。

（実施例１２）
本実施例はグルコサミン測定のＨＰＬＣ法を記載する。

グルコサミンをクロマトグラフィーで定量する簡単な方法を開発することが望ましい。
所望の方法の特性には、最小のサンプル調製と十分に正確なグルコサミン測定が必要であ
る。本明細書に示す方法は、Ｗａｙらの報告に基づいている（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｔａｐｈｙ＆Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｎｏｌ．２３：２８６１、２０００）。Ｗａ
ｙらの方法の移動相を変更することにより、グルコサミンのピークと振盪フラスコ細胞培
養サンプル中に観測される他のピークとの分離が可能になった。

（方法の記載）
カラム： Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＯＤＳ（３）Ｃ_１８−５μ、１５
０×４．６ｍｍ（ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）
移動相： ＭｅＯＨ:水性緩衝液（１:４ｖ／ｖ）１０ｍＭ酢酸ナトリウムと１０ｍＭ

オクタンスルホン酸ナトリウム（ｐＨ５．１）。全移動相を以下のように
調製した。１リッターの脱イオン水に０．８ｇの酢酸ナトリウムと２．１
６ｇのオクタンスルホン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ特級）を加えた。塩を
溶解後、氷酢酸を用いてｐＨを５．１±０．１に調節した。この１リッタ
ー溶液に２５０ｍｌのメタノールを加え、溶液を脱気した。容器とカラム
を室温に保った。
流速： ０．７ｍｌ／分
検出器： 屈折率検出器、３０℃
サンプル： Ｍ９Ａ培地中１０μｌ
滅菌Ｍ９Ａ生育培地を注入すると、クロマトグラム上に２本の主なピークが得られた。
さらに、そのクロマトグラムはＭ９Ａにグルコース、カルシウムおよびマグネシウム塩が
ない場合でも基本的に変化しなかった。グルコサミンをＭ９Ａに注入すると、さらに別な
１本のピークが得られた。この様な条件下でグルコサミンは約１３分に溶出し、その直後
に極めて大きい負ピークを伴った。さらに、ｐＨ、イオン強度、メタノール（ＭｅＯＨ）
濃度またはオクタンスルホン酸濃度を変えてピーク分離を増加することは成功しなかった
。この負のピークはグルコサミンピークに常に続いている。この様な負のピークを除去す
る通常の方法は、移動相でサンプルを希釈することである。しかしながら、サンプルを２
０倍希釈しても負のピークを完全に除去せず、この様な高度希釈は振盪フラスコまたは醗
酵槽由来のサンプルでは実用的でない。

ピーク面積の代わりにピーク高さを用いて積分することで、約５００〜１０、０００ｐ
ｐｍの範囲で非常に正確なグルコサミンの定量が可能であることが見出された。その範囲
を決めるためには、標準サンプルを水または移動相でなくＭ９Ａ中で調製することが必要
であった。従って、サンプルをＭ９Ａ生育培地中で調製し、希釈もＭ９Ａを用いて行った
。各サンプルで分析時間は２０分であった。

（方法の有効性検証）
まず、Ｍ９Ａ中のグルコサミンのいくつかの標準サンプルを調製した。繰り返し注入に
より、極めて正確な結果が得られた（±５％）。

次に、振盪フラスコサンプルを比色分析およびＨＰＬＣで分析した。得られた値は比色
分析で一般に１０％以内であった。比色法に固有の標準偏差のために、ＨＰＬＣと比色法
の間の密接な一致は必ずしも期待すべきでない。例えば、比色法で分析した二つのサンプ
ル（双方とも１０、０００ｐｐｍ）は８．９および９．３ｇ／ｌの値であった。

第三に、振盪フラスコサンプルに既知の量のグルコサミンを添加し分析した。未希釈振
盪フラスコサンプルでは１４９７ｐｐｍの値が得られた。等容積の５０００ｐｐｍグルコ
サミン標準サンプルで希釈後、希釈振盪フラスコサンプルは３４４０（期待値３２４０）
の値を示した。期待値との不一致の一部はＭ９Ａの寄与である可能性が高い。事実、Ｍ９
Ａ単独でも見掛けのグルコサミン「値」約１００ｐｐｍを与える。

振盪フラスコ培養サンプルをＨＰＬＣ法と比色法の両方で分析した。この結果を表１１
に示す。培養上澄液を遠心分離と粒子を除去する濾過で得て、分析まで−２０℃で保存し
た。Ｍ９Ａ培地中で調製した２５００ｐｐｍの１点標準溶液を用いてＨＰＬＣを補正した
。解凍後、サンプルを即座にＨＰＬＣで分析した。オートサンプラー中に終夜置いた後、
サンプルを再度分析した。二つの方法間で一致は極めて良好であった。数週間−２０℃で
保存したサンプルでもグルコサミン濃度の減少は見られなかった。濾過サンプルを室温で
終夜放置しても、グルコサミン濃度は減少しなかった。
表１１．グルコサミン定量のためのＨＰＬＣ法と比色法の比較^＊

＊培養サンプルを遠心分離し、濾過して粒子を除き、分析まで−２０℃で保存した。ＨＰ
ＬＣ分析を解凍サンプル（０時間）で行い、サンプルをオートサンプラー中に室温で終夜
置いた後に分析を繰り返した（２４時間）。グルコサミン濃度はｐｐｍで示される。

（実施例１３）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミン生産のためのグルコサミン−６−リン酸Ｎ−アセ
チルトランスフェラーゼ１遺伝子（ＧＮＡ１）の過剰発現を記載する。

以下の実施例はＮ−アセチルグルコサミン生産を増加するための、異なったグルコサミ
ン−６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ１遺伝子（ＧＮＡ１）の組み換えＥ．ｃ
ｏｌｉ中の過剰発現を記載する。この戦略の実用可能性を、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳｃＧＮＡ１）、酵母Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ（
ＣａＧＮＡ１）および高騰植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＧＮＡ
１）由来のＧＮＡ１遺伝子を含むｐＥＴ系発現ベクターで示した。

ＧＮＡ１のクローニングと発現を、ＧＮＡ１遺伝子コード配列をｐＥＴベクター中のＴ
７ｌａｃプロモーターの後ろにクローニングし、ｐＥＴプラスミドをラクトース誘導グル
コサミン生産株Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７―１８株中に形質転換して行った。遺伝子の機能性
発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性分析で測定した。Ｎ−アセチルグルコサミンの合
成を振盪フラスコ実験でモニターした。

（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧＮＡ１遺伝子のクロ
ーニング）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１遺伝子（ＳｃＧＮＡ１）をクローニングするため
、ＧＮＡ１遺伝子の公開された配列（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９９５、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１０、ｐ２６１−１６８、その全文は本明細書中に援用される）に基づいてプライマ
ーを合成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ
２８８Ｃから単離されたゲノムＤＮＡ由来のＧＮＡ１コード配列を増幅するため、プライ
マーを使用した。増幅に用いたプライマーは前方プライマー０７−８３および反転プライ
ーマー０７−８４であり、以下の配列を有した：０７−８３；５’−ＧＡＴＣＧＧＴＣＴ
ＣＧＣＡＴＧＡＧＣＴＴＡＣＣＣＧＡＴＧＧＡＴＴＴＴＡＴＡＴＡＡＧＧＣ−３’（配列
番号３５）；０７−８４：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＴＴＴＧ
ＣＡＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＴＧＣ−３’（配列番号３６）。プライマー０７−８３はＢｓ
ａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＧＴＣＴＣ、配列番号３５のヌクレオチド５〜１０
に示される）と、その後のＡＴＧ開始コドンから始まるＧＮＡ１コード配列の３１個のヌ
クレオチド（配列番号３６のヌクレオチド１３〜４３に示される）を含む。プライマー０
７−８４はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号３６のヌクレ
オチド５〜１０に示される）と、その後の翻訳停止コドンで始まるＧＮＡ１コード領域の
３０個のヌクレオチド（配列番号３６のヌクレオチド１１〜４０に示される）を含む。標
準プロトコールを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ部位に側面する全Ｓ
ｃＧＮＡ１コード配列を含むＤＮＡフラグメントを生成した。

ＧＮＡ１配列を含むＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋
）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）中にクローニングし、プラスミドｐ
ＳＷ０７−６０を生成した。ＳｃＧＮＡ１フラグメントをＢｓａＩおよびＸｈｏＩ消化で
プラスミドＰＳＷ０７−６０から単離し、発現ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇ
ｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニング
し、プラスミドＳＷ０７−６０を生成した。この方法のクローニングはＳｃＧＮＡ１並列
をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７−ｌａｃプロモーターの後ろに置き、発現カセットＴ７−ｌ
ａｃ−ＳｃＧＮＡ１を作成する。

（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのＣ．ａｌａｂｉｃａｎｓ ＧＮＡ１遺伝子のクロ
ーニング）
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＮＡ１（ＣａＧＮＡ１）のクローニングと発現のために、Ｇ
ＮＡ１の公開された配列（Ｍｉｏら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、ｐ４
２４−４２９、その全文は本明細書中に援用される）に基づいてプライマーを合成した。
ＰＣＲを用いてＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓゲノムＤＮＡ由来のＧＮＡ１コード配
列を増幅するため、プライマー０７−９２および０７−９３を使用した。前方プライマー
０７−９２および逆方向プライマー０７−９３は以下の配列を有した：０７−９２：５’
−ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＡＴＧＴＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＴＴＡＴＡＣ−３’（
配列番号３７）および０７−９３：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＴＡＣ
ＡＴＡＣＣＡＴＴＴＣＡＡＣ−３’（配列番号３８）。プライマー０７−９２はＢｓａＩ
制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＴＴＣＴＣ、配列番号３７のヌクレオチド５〜１０に示
される）と、その後のＡＴＧ開始コドンから開始するＧＮＡ１コード配列の２３個のヌク
レオチド（配列番号３７のヌクレオチド１３〜３５で表される）を含む。プライマー０７
−９３はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号３８のヌクレオ
チド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンで開始するＧＮＡ１コード配列の
２４ヌクレオチド（配列番号３８のヌクレオチド１１〜３４で表される）を含む。ＰＣＲ
増幅を標準条件下で行い、ＢｓａＩとＸｈｏＩ部位に側面する全ＣａＧＮＡ１コード領域
を含むＤＮＡフラグメントを生成した。

ＣａＧＮＡ１配列を含むＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（
＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）のＳｒｆＩ部位中へライゲートし
、プラスミドｐＫＬＮ０７−３３を生成した。ＣａＧＮＡ１フラグメントを制限酵素Ｂｓ
ａＩおよびＸｈｏＩでプラスミドｐＫＬＮ０７−３３から単離し、発現ベクターｐＥＴ２
４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈ
ｏＩ部位へクローニングしてプラスミドｐＫＬＮ０７−３４およびｐＫＬＮ０７−３５を
生成した。この方法のクローニングはＣａＧＮＡ１配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａ
ｃプロモーターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ＣａＧＮＡ１の発現カセットを作製する。

（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＧＮＡ１遺伝子のクロー
ニング）
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＧＮＡ１（ＡｔＧＮＡ１）のクローニング
と発現のため、プライマー０７−９４および０７−９５をＧＮＡ１の公開された配列（Ｇ
ｅｎｅｂａｎｋＡＬ３９１１４４）に基づいて合成した。プライマーをＰＣＲを用いるＢ
ＡＣクローンＦ１４Ｆ８（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒ
ｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ＤＮＡ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）由
来のＧＮＡ１コード配列を増幅するために使用した。前方プライマー０７−９４および逆
方向プライマー０７−９５は以下の配列を有した：０７−９４：５’−ＧＡＴＧＧＴＣＴ
ＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号３９）；および０
７−９５：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＴＴＡＧＡＣＡＴＴ
ＴＧＡＡＴＣ−３’（配列番号４０）。プライマー０７−９４はＢｓａＩ制限エンドヌク
レアーゼ部位（ＧＧＴＣＴＣ、配列番号３９のヌクレオチド４〜９で示される）と、その
後のＡＴＧ開始コドンから開始するＧＮＡ１コード配列の２１個のヌクレオチド（配列番
号３９のヌクレオチド１２〜３２で示される）を含む。プライマー０７−９５はＸｈｏＩ
部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号４０のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻
訳停止コドンで始まるＧＮＡコード配列の２４ヌクレオチド（配列番号４０のヌクレオチ
ド１１〜３８で表される）を含む。標準プロトコールを用いてＰＣＲ増幅を行い、Ｂｓａ
ＩおよびＸｈｏＩ部位に側面する全ＧＮＡ１コード配列を含むＤＮＡフラグメントを作成
した。ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、
発現ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）
のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＳＷ０７−７０を作成し
た。この方法のクローニングはＡｔＧＮＡ１配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロ
モーターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ＡｔＧＮＡ１の発現カセットを作成する。

（別な組換えＧＮＡ１遺伝子の発現とＥ．ｃｏｌｉ中のＮ−アセチルグルコサミン生産
）
組換えプラスミドｐＳＷ０７−６２（Ｓ，ｃｅｒｖｉｓｉａｅＧＮＡ１遺伝子を含む）
、ｐＫＬＮ０７−３４（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子を含む）およびｐＳＷ０７−７０（
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子を含む）をＥ．ｃｏｌｉ株７１０７−１８中に形質転換し、
７１０７−８７株、７１０７−１１７株および７１０７−９３株をそれぞれ作成した。空
のベクターを同じ宿主に形質転換して対照株７１０７−８８を調製した。標準プロトコー
ルに従い、形質転換体の細胞培養物をＬＢ培地中で生育させ、１ｍＭＩＰＴＧで誘導した
。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため誘導培養物から試料を取り、ＧＮＡ１タンパク質の過剰発
現を確認した。ＡｔＧＮＡ１、ＣａＧＮＡ１およびＳｃＧＮＡ１の予想タンパク質サイズ
はそれぞれ１７ｋＤａ、１６．９ｋＤａおよび１８．１ｋＤａであった。予想されたサイ
ズの過剰発現タンパク質が様々なＧＮＡ１遺伝子を発現する誘導培養物由来の試料で見ら
れた。全ての場合で、過剰発現タンパク質は極めて可溶性である様に思われた。予想通り
、対照株７１０７−８８中にはＧＮＡ１遺伝子の予想されたサイズの過剰発現タンパク質
は見られなかった。

異なったＥ．ｃｏｌｉ株のスクリーニングを行って組換えＧＮＡ１遺伝子の機能性発現
を確認した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびａ．ｔｈａｌｉａ
ｎａ発現ベクターの宿主である株をＭ９Ｂ生産培地中で生育させた［６ｇ／ｌ ＫＨ_２Ｐ
Ｏ_４、２４ｇ／ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、１ｇ／ｌクエン酸Ｎａ_３、１０ｇ／ｌ （ＮＨ_４）_２
ＳＯ_４（リン酸塩でｐＨ７．４に調整）＋微量金属（０．２ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ
_２Ｏ、０．０１５ｍｇ／ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０１５ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ_４・
Ｈ_２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌ ＮａＭｏＯ
_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌ Ｈ_３ＢＯ_３および０．００１ｍｇ／ｌＣｏＣｌ_２・
６Ｈ_２Ｏ）、４０ｇ／ｌ グルコース、１０ｇ／ｌ リボース、５ｇ／ｌ 酵母抽出液、
０．６ｇ／ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、２５ｍ
ｇ／ｌカナマイシンおよび０．２ｍＭ ＩＰＴＧを補充］。２４時間目にＨＰＬＣの結果
に基づいてグルコースを１日当たり３０ｇ／ｌ添加し、レベルが１ｇ／ｌ以下に下降して
いる場合は５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をフラスコに添加した。一つのフラスコは２４
時間に収穫し、もう一方のフラスコは４８時間で酵素分析とＮ−アセチルグルコサミンお
よび酢酸レベルを行える様に、二重のフラスコを作成した。

グルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）活性を分析したところ、全ての株は良好な活性
レベルであった。Ｍｉｏら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、１９９９、２７４、ｐ４２４−４２９）が報告した方法に従い、試料のグルコ
サミン−６−Ｐ Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）酵素活性も測定した（表
１２）。予想通り、対照株は有意なレベルのＧＮＡ１活性を示さなかった。酵母および高
等植物ＧＮＡ１遺伝子の発現により、高いアセチルトランスフェラーゼ活性が得られた。
これらのＧＮＡ１形質転換体も非常に高いレベルでＮ−アセチルグルコサミンを合成した
（表１２および１３）。Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ（７１７０−８７）およびＣ．ａｌｂｉ
ｃａｎｓ（７１７０−１１７）由来のＧＮＡ１遺伝子発現株におけるアセチルトランスフ
ェラーゼ活性は同程度であった。しかしながら、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子を発現
する株中でＮ−アセチルグルコサミン生産は４倍高かった。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子
を有する株中のＧＮＡ１酵素活性はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子を有する株より低いが、
Ｎ−アセチルグルコサミン生産は前者中の方が後者中より高かった。明らかに、ＧＮＡ１
活性とＮ−アセチルグルコサミン生産の間に単純な相関はない。様々な起原由来のＧＮＡ
１酵素は酵素特性が異なっていると思われる。データは、Ｎ−アセチルグルコサミンを生
産するための代謝遺伝子工学に異なったＧＮＡ１遺伝子の有用性を示している。試験した
３種のＧＮＡ１遺伝子間で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１がＮ−アセチルグルコ
サミン生産に関して優れていた。従って、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１遺伝子を
本発明に開示した以後の研究用に選択した。

（表１２．３種の異なったＧＮＡ１遺伝子を発現する株におけるグルコサミンシンテタ
ーゼおよびアセチルトランスフェラーゼ活性）

１）酵素活性はμｍｏｌ ｍｉｎ^−１ｍｇ^−１で表される。
２）Ｎ−アセチルグルコサミンレベルは２３時間の時点で採集した試料で測定された。
３）括弧内の数は異なった同胞種を示す。

７１０７−１８株はＨＰＬＣで検出し得る高レベルのグルコサミンを生産する。しかし
ながら、アセチルトランスフェラーゼを過剰発現する株では僅かな（０．５ｇ／ｌ以下）
遊離グルコサミンしか検出されないか、全く検出されなかった。これは中間体であるグル
コサミン−６−ＰがＧＮＡ１形質転換体で有意に精製されなかったことを示し、酵素ＧＮ
Ａ１が高レベルのＮ−アセチルグルコサミンに対する主な駆動力であることを確認した。

酢酸の蓄積が、高レベルの組換えタンパク質およびその他の発酵生成物をＥ．ｃｏｌｉ
中で達成する障害であることが認められている。培地中に過剰のグルコースがあると、Ｅ
．ｃｏｌｉ細胞は高レベルの酢酸およびその他の有機酸を合成する傾向があり、通常、生
育阻害を生じる。酢酸の生成はグルコサミン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株でも問題である。しかし
ながら、Ｎ−アセチルグルコサミン生産株は、対照株が数グラムレベルの酢酸を蓄積する
条件下でも、２３時間の時点でも僅かな酢酸を蓄積するか、全く蓄積しなかった。Ｎ−ア
セチルグルコサミンの合成は酢酸生成の前駆体であるアセチルＣｏＡを消費する。アセチ
ルＣｏＡの使用は細胞に課せられる代謝負担であるが、アセチルＣｏＡをＮ−アセチルグ
ルコサミン生産へ向けることは、酢酸の蓄積を避ける点で明らかに有利である。Ｎ−アセ
チルグルコサミン生産株が対照株より高い細胞密度を示したことに注目することが重要で
ある（表１３）。

（表１３．異なったＧＮＡ１発現コンストラクトで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株にお
ける細胞生育とＮ−アセチルグルコサミン生産）

（異なったＧＮＡ１酵素の配列解析）
様々なＧＮＡ１遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株における比活性とＮＡＧ生産に関
してかなりの差が観察された。しかしながら、全ての酵素は同じ反応を触媒するので、核
酸およびタンパク質レベルで様々なＧＮＡ１間に相同性が予想される。配列番号２９はＳ
．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１遺伝子のコード配列を含む。配列番号２９は本明細書に
おいて配列番号３０で表されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１アミノ酸配列をコー
ドする。配列番号３３はＡ．ｔｈａｌｉａｎａＧＮＡ１遺伝子のコード配列を含む。配列
番号３３は本明細書において配列番号３４で表されるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＧＮＡ１ア
ミノ酸配列をコードする。配列番号３１はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＧＮＡ１遺伝子のコー
ド配列を含む。配列番号３１は本明細書において配列番号３２で表されるＣ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓアミノ酸配列をコードする。Ｊ．Ｈｅｉｎ ＤＮＡ整列法（ＤＮＡ Ｓｔａｒ参照
）で整列した場合、核酸配列は有為の相同性を示した。ＳｃＧＮＡ１とＡｔＧＮＡ１コー
ド配列は４９．７％同一を共有し、ＳｃＧＮＡ１とＣａＧＮＡ１コード配列は５３．１％
同一を共有する。ＣａＧＮＡ１とＡｔＧＮＡ１コード配列は４７．２％同一を共有する。

コード配列をアミノ酸配列に翻訳すると、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎタンパク質整
列法（ＤＮＡ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で整列した場合、様々なＧ
ＮＡ１タンパク質間に有為の相同性があることが分かった。表１４で分かる様に、ＳｃＧ
ＮＡ１配列（配列番号３０）はＧａＧＮＡ１配列（配列番号３２）と４４％同一を共有し
、ＡｔＧＮＡ１（配列番号３４）と３８．９％同一を共有する。ある領域はより高度に保
存されていると思われる；例えばアミノ酸ＣＨＩＥＤは全ての配列で保存されていた（Ｓ
ｃＧＢＡ１配列（配列番号３０）の９６〜１００アミノ酸と整列）。また、配列番号３０
のＳｃＧＮＡ１残基１２９〜１４８に対応する２０残基領域は高度に保存された。この領
域はＣａＧＮＡ１配列中の対応する領域と７５％同一を、ＡｔＧＮＡ１配列中の対応する
領域と７０％同一を有していた。

（表１４．ＳｃＧＮＡ１、ＡｔＧＮＡ１およびＣａＧＮＡ１のペプチドサイズと相同性
）

^＊ヌクレオチドレベルの相同性が括弧内に示される。

（実施例１４）
本実施例はＥ．ｃｏｌｉ ｎａｇＢおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１の過剰
発現によりＮ−アセチルグルコサミンを生産する株の構築を説明する。

グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ（ＮａｇＢ）をコードするｇａｎレギュロンの
一部であるｎｇＢ遺伝子は、ｎａｇレギュロンの一部としてＮ−アセチルグルコサミン（
ＧｌｃＮＡｃ）の異化作用経路に含まれる。ｎａｇレギュロンはオペロンｎａｇＢＡＣＤ
および別に転写され他ｎａｇＥで構成される（Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ、ＪＡ．、１９９１
、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：２０５３−２０６２）。外来性ＧｌｃＮＡＣは細胞
内に輸送されてリン酸化され、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐを生成する。Ｎ−アセチルグルコサ
ミン−６−リン酸デアセチラーゼをコードするｎａｇＡ遺伝子生成物はＧｌｃＮＡｃ−６
−ＰをＧｌｃＮ−６−Ｐへ変換する。次いでＮａｇＢがＧｌｃＮ−６−Ｐのフラクトース
−６−リン酸（Ｆ−６−Ｐ）への変換を触媒する。

Ｅ．ｃｏｌｉ中のｇｌｍＳ遺伝子生成物は、リポ多糖とペプチドグリカン生成経路中の
必須中間体であるのＧｌｃＮ−６−Ｐの合成を触媒する。従って、ｇｌｍＳ欠損変異体は
外来性ＧｌｃＮまたはＧｌｃＮＡｃ依存性である。しかしながら、ＮａｇＢが通常はＧｌ
ｍＳで行われる反応を触媒し、Ｆ−６−ＰをＧｌｃＮ−６−Ｐに変換することが知られて
いる。事実、グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ（ｎａｇＢ）を発現する高コピープ
ラスミドでｇｌｍＳ変異体を形質転換すると、ｇｌｍＳ変異を抑制することが示されてい
る（Ｊ．Ｂａｃ．、１９８９年１２月；１７１（１２）：６５８９−６５９２）。Ｎａｇ
ＢはＦ−６−ＰからＧｌｃＮ−６−Ｐへの変換を触媒し得るので、我々の生産株でｇｌｍ
Ｓ^＊５４の代わりにｎａｇＢを過剰発現することでグルコサミンを蓄積することが可能で
ある。Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットもその株中に存在する場合、ＧｌｃＮ−６−Ｐ
をＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐに変換しＮＡＧとして培地中に蓄積することが可能であると思わ
れる。

ｎａｇＢ遺伝子の過剰発現によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン生産効
率を試験するため、ＮＧＡ１のクローニングと組み込みのために報告された方法とプロト
コールを、Ｅ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）の染色体中のｐｆｋＢ部位にＴ７ｌａ
ｃ−ｎａｇＢ発現カセットをクローニング死組み込むために採用した。外来性ｇｌｍＳ遺
伝子もこの株で不活性化する必要がある。ｇｌｍＳ配列はｇｌｍＳの上流に明白なプロモ
ーター配列を持たず、ｇｌｍＵ配列から下流に位置している。ｇｌｍＵおよびｇｌｍＳは
オペロンｇｌｍＳを形成していると思われる。ｇｌｍＳ配列と側面配列のいくつかがＥ．
ｃｏｌｉゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅され、プラスミドベクター中へクローニングされ
た。ｇｌｍＳ配列由来の内部フラグメントを除去するため、適当な制限消化を用いた。内
部欠失を有するｇｌｍＳ配列を温度感受性複製開始点とカナマイシン選択マーカーにライ
ゲートし、組み込みベクターを作成した。ｇｌｍＳ欠失を有する変異体を選択するため、
温度選択プロトコールを使用した。グルコサミンは細胞壁合成に必要であるので、変異体
の生育のためにグルコサミンを培養培地に補給する必要がある。

（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのｎａｇＢのクローニング）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｎａｇＢ遺伝子の公開された配列に基づく情報（Ｐｅｒｉら、１９９０
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６８、ｐ１２３−１３７）を用いて、ｎａｇＢ
コード配列を増幅するためにプライマーを設計した。異化の配列を有する前方プライマー
０７−１４１および逆方向プライマー０７−１４２を使用し、ｎｇＢコード配列をＥ．ｃ
ｏｌｉゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した：０７−１４１；５’−ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＴ
Ｃ ＧＣＡ ＴＧＡ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＧＡ ｃ−３’（配列番号４
３）、および０７−１４２；５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＣＡ ＧＡＣ
ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＡＴＴ ｃ−３’（配列番
号４４）。

プライマー０７−１４１はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＧｔＣＴＣ、配列
番号４３中のヌクレオチド４〜９で表される）と、その後のＡＴＧ開始コドンから始まる
ｎａｇＢコード配列の２０個のヌクレオチド（配列番号４３中のヌクレオチド１２〜３１
で表される）を含む。プライマー０７−１４２はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（
ＣＴＣＧＡＧ、配列番号４４のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止
コドンからのｎａｇＢコード配列の３３ヌクレオチド（配列番号４４のヌクレオチド１１
〜４４で表される）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ｎａｇＢコード配列とＮａｇＢアミノ酸配列
はそれぞれ配列番号４１と配列番号４２で表される。

ｎａｇＢコード配列を含むＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよ
びＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０
７−９３を作成した。この方法によるクローニングにより、ｎａｇＢ配列をｐＥＴ２４ｄ
（＋）のＴ７−ｌａｃプロモーターの後ろに置き、Ｔ７−ｌａｃ−ｎａｇＢの発現カセッ
トを作成した。

（ｎａｇＢ遺伝子の過剰発現）
プラスミドｐＳＷ０７−９３＃３、＃８および＃１６を７１０１−１７株（ＤＥ３）中
に形質転換し、株７１０７−６３６、７１０７−６３７および７１０７−６３８をそれぞ
れ作成した。ｐＥＴ２４ｄ（＋）プラスミドも７１０１−１７株中に形質転換し、陰性対
照株７１０７−６３９を作成した。形質転換体の培養細胞をＬＢ培地中で生育させ、１ｍ
ＭのＩＰＴＧで誘導する標準誘導実験を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために様々な時点で
誘導培養物から試料を採取し、ＮａｇＢタンパク質過剰発現を確認した。過剰発現Ｎａｇ
Ｂタンパク質の予想サイズは２９．８ｋＤａである。予想されたサイズのＮａｇＢタンパ
ク質に相当するタンパク質が７１０７−６３６および７１０７−６３７株で過剰生産され
た。対照株７１０１−６３９ではこのサイズの過剰生産タンパク質は明瞭でなかった。誘
導２時間後のタンパク質試料は、過剰生産ＮａＢタンパク質のほとんどが可溶性分画中に
あることを示した。しかしながら、誘導後４時間では、可溶性分画中に約２５％のタンパ
ク質しか現れなかった。

（Ｔ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットの染色体中のｐｆｂＫ部位への組み込み）
ＮａｇＢの過剰発現に成功したことを確認後、次の工程はＴ７ｌａｃ−ｎａｇＢ発現ベ
クターをＥ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）の染色体中に組み込むことであった。Ｅ
．ｃｏｌｉ染色体のｐｆｋＢ遺伝子へ組み込みを目標にすることが決定された。ｐｆｋＢ
遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中に存在する全ホスフォフラクトキナーゼの１０％を供給する主
要ホスフォフラクトキナーゼをコードする。従って、この部位に組み込むことを標的とす
ることは、生育またはＮ−アセチルグルコサミン生産を損なわないと考えられる。

Ｔ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットを７１０１−１７（ＤＥ３）株中の染色体のｐｆｋＢに
組み込むことを指向するベクターの開発には、数回のクローニング工程が必要であった。
第一工程は、ｐｆｋコード配列＋側面領域を含むＥ．ｃｏｌｉゲノム由来の領域をクロー
ニングすることである。プライマーを公開された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７（５３３１）：１４５３−１４７４）に基づいて設計し、Ｅ．ｃ
ｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡからｐｆｋＢ＋側面ゲノム領域を増幅した。ＰＣＲでｐｆ
ｋＢ領域を増幅するために用いられたプライマー０７−１６および０７−１７は異化の配
列を有した：０７−１６；５’−ＧＡＴ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＴＴ ＡＣＡ ＴＧＣ Ｔ
ＧＴ ＡＧＣ ＣＣＡＧＣ―３’（配列番号４５）および５’−ＣＡＴ ＣＣＴ ＧＣＡ
ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＴＡ ＡＴＡ ＡＴＣ ＴＡＴＣＣ−３’（配列番号４６
）。

プライマー０７−１６はＮａｅＩ部位（ＧＣＣＧＧＣ、配列番号４５のヌクレオチド５
〜１０で表される）を含み、ｐｆｋＢコード配列開始コドンの上流の１０４５ヌクレオチ
ド（配列番号４５のヌクレオチド１１〜２９で表される）から増幅する。プライマー０７
−１７はＰｓｔＩ部位（ＣＴＧＣＡＧ、配列番号４６のヌクレオチド５〜１０で表される
）を加え、ｐｆｋＢ停止コドンの下流の１３５７塩基対（配列番号４６のヌクレオチド１
１〜３２で表される）から増幅する。ｐｆｋＢ＋側面領域を含む３３３２塩基対ＰＣＲ生
成物のｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏ
ｌｌａ、ＣＡ）中へのライゲーションにより、プラスミドｐＫＬＮ０７−１６を作成した
。

Ｔ７−ｌａｃ−ｎａｇＢカセットを標準ＰＣＲ条件で、前方プライマー０７−１４５お
よび逆方向プライマー０７−１４６を用いてプラスミドｐＳＷ０７−９３＃３（上記参照
）から増幅した。プライマーは以下の配列を有する：０７―１４５；５’−ＧＡＴ ＣＴ
Ａ ＣＧＴ ＡＡＧ ＣＡＡ ＣＣＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＧＣ―３’（配列番号４７
）および０７−１４６；５’−ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＡＴ ＡＴ
Ａ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＧＣ−３’（配列番号４８）。

プライマー０７−１４５はＳｎａＢＩ部位（ＴＡＣＧＴＡ、配列番号４７のヌクレオチ
ド５−１０で表される）を有し、Ｔ７プロモーターの上流の７６ヌクレオチド（配列番号
４７のヌクレオチド１１〜２８で表される）から増幅する。プライマー０７−１４６はＭ
ｆｅＩ部位（ＣＡＡＴＴＧ、配列番号４８のヌクレオチド５〜１０で表される）を有し、
Ｔ７ターミネーターの下流の２５塩基対（配列番号４８のヌクレオチド１１〜３６で表さ
れる）から増幅する。

次のクローニング工程は、Ｔ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットをプラスミドｐＫＬＮ０７−
１４中へライゲートすることである。プラスミドｐＫＬＮ０７−１４を制限エンドヌクレ
アーゼＳｎａＢＩおよびＭｆｅＩで消化し、ｐｆｋＢコード配列の５２３ｂｐ部分を除去
した。Ｔ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットを含むＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアー
ゼＳｎａＢおよびＭｆｅＩで消化し、ｐＫＬＮ０７−１４のＳｎａＢおよびＭｆｅＩ部位
へライゲートしてプラスミドｐＳＷ０７−９７を作成した。従って、プラスミドｐＳＷ０
７−９７はＴ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットで置換されたｐｆｋＢコード配列の５２３ヌク
レオチド領域を有するｐｆｋＢ＋側面ゲノム領域を含む。

ＯＲＦｂ１７２２−ＤｐｆｋＢ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｎａｇＢ−ＯＲＦｂ１７２５プラス
ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＭＣＳを含むフラグメントを、プラスミドｐＳＷ０７−９７か
ら制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。温度感受性レプリコン＋
カナマイシン耐性カセットを含むフラグメントをプラスミドｐＫＬＮ０７−２１から、制
限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで切り出した。この二つのフラグメントを共にライゲート
し、プラスミドｐＳＷ０７−９８を作成した。

プラスミドｐＳＷ０７−９８を用いて染色体のＤｐｋｆＢにＴ７ｌａｄ−ｎａｇＢを有
するＥ．ｃｏｌｉ株を作成した。Ｅ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）株をｐＳＷ０７
−９８で形質転換後、温度選択プロトコールを用いてｐｆｋＢ部位に組み込まれたＴ５−
ｌａｃ−ｎａｇＢを有する株を選択した。得られた株は７１０７−６４５と呼ばれ、その
株を、ｎａｇＢコード領域をプローブとして用いて標準高ストリンジェントサザンハイブ
リダイゼーションで確認した。

（組み込みＴ７ｌａｃ−ｎａｇＢカセットを有するＥ．ｃｏｌｉ株中のｇｌｍＳ遺伝子
の欠失）
Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７−６４５のｇｌｍＳ遺伝子を欠失するため、ｇｌｍＳ配列置換
ベクターを開発した。このベクターを構築するためには数工程を要した。第一工程はｈｌ
ｍＳ遺伝子＋側面配列を含むゲノム領域の増幅である。このフラグメントは次に、温度感
受性レプリコンとカナマイシン耐性カセットを含むｐＫＬＮ０７−２１由来のフラグメン
ト（上記）とライゲートされる。最後に、ｇｌｍＳコード配列の一部を得られたプラスミ
ドから切除し、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムのｇｌｍＳ欠失を標的とする組み込み可能ベクターを
作成する。

最初の工程では、ｇｌｍＳ遺伝子プラス側面領域の公開された配列（参考文献）に基づ
いてプライマーが合成された。このプライマーはＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡ由
来のｇｌｍＵ、ｇｌｍＳおよびｐｓｔＳ遺伝子を含むフラグメントを増幅するために使用
された。増幅に使用されたプライマーは０７−１３９および０７−１４０と呼ばれ、以下
の配列を有する：０７−１３９；５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＴＧＴ ＴＧ
Ａ ＡＴＡ ＡＴＧ ＣＴＡ ＴＧＡ ＧＣＧ ＴＡＧ ＴＧＡ ＴＣ−３’（配列番号
４９）および０７−１４０；５’−ＧＡＴ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＡＧＴ ＡＣＡ
ＧＣＧ ＧＣＴ ＴＡＣ ＣＧＣ ＴＡＣ ＴＧＴＣ―３’（配列番号５０）。

前方プライマー０７−１３９はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＧＧＣＣＧ
Ｃ、配列番号４９のヌクレオチド４〜１１で表される）が先行する、そのＡＴＧ開始コド
ン由来のｇｌｍＵコード配列の最初の３０ヌクレオチド（配列番号４９のヌクレオチド１
２〜４１で表される）を含む。逆方向プライマー０７−１４０はＳａｌＩ制限エンドヌク
レアーゼ部位（ＧＣＴＧＡＣ、配列番号５０の５〜１１ヌクレオチドで表される）が先行
する、その翻訳停止コドンから開始するｐｓｔＳコード配列の２７ヌクレオチド（配列番
号５０のヌクレオチド１１〜３７で表される）を含む。標準条件下でＰＣＲを行って、Ｂ
ｏｔＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に側面するｇｌｍＵ−ｇｌｍＳ−ｐｓ
ｔＳコード配列を作成した。

ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。温
度感受性レプリコン＋カナマイシン耐性カセットフラグメントを制限エンドヌクレアーゼ
ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで、プラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切り出した。二つのフラ
グメントを互いにライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−９４＃４３を作成した。

プラスミドｐＳＷ０７−９４＃４３を制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩＩで消化し、ｇ
ｌｍＳコード配列の９８０ヌクレオチドを除去した。プラスミドの残りをそれ自体にライ
ゲートし、組み込みベクターｐＳ０７−９５を作成した。

Ｅ．ｃｏｌｉ染色体上にｇｌｍＳ変異を生じるための組換え頻度を改善するため、ｇｌ
ｍＵの上流の領域の７７２ヌクレオチドをプラスミドｐＳＷ０７−９５に加えてプラスミ
ドｐＳＷ０７−９９も構築した。ｇｌｍＵ＋側面領域の公開された配列（参考文献）に基
づいてプライマーを合成した。ｇｌｍＵ開始コドンの上流の７２２ヌクレオチドを含むフ
ラグメント、およびＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡ由来のｇｌｍＵコード領域の最
初の２４６ヌクレオチドを含むフラグメントを増幅するためにこのプライマーを使用した
。増幅に使用したプライマーは０７−１４７および０７−１４８と呼ばれ、以下の配列を
有した：０７−１４７；５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＴＧＧ ＣＡＡ ＴＧ
Ａ ＣＴＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＡＣ−３’（配列番号５１）および０７−１４８
；５’−ＣＧＴ ＡＣＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＡＣ
ＣＣ−３’（配列番号５２）。

前方プライマー０４−１４７は、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＧＧＣＣ
ＧＣ、配列番号５１のヌクレオチド１２〜１１で表される）が先行する、ａｔｐＣコード
配列の最初の２４ヌクレオチド（配列番号５１のヌクレオチド１２〜３５で表される）を
含む。逆方向プライマー０７−１４８は、ＡＴＧ開始コドンの下流の２４６塩基対から始
まるｇｌｍＵコード領域の２９ヌクレオチド（配列番号５２のヌクレオチド１〜２９で表
される）を含む。標準条件下でＰＣＲを行い、ａｐｔＣ開始コドンからｇｌｍＵコード配
列のヌクレオチド２４６までのゲノムＤＮＡを含むフラグメントを作成した。ＰＣＲ生成
物を制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳｅｘＡＩで消化し、プラスミドｐＳＷ０７
−９５＃６のＮｏｔＩおよびＳｅｘＡＩ部位中にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−
９９を作成した。

プラスミドｐＳＷ０７−９５およびプラスミドｐＳＷ０７−９９を用いて、染色体上に
ｇｌｍＳ欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ株を作成した。Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７―６４５（２
０）、７１０７−６４５（３０）および７１０７―６４５（４３）のプラスミドｐＳＷ０
７−９５またはｐＳＷ０７−９９による形質転換後、温度選択プロトコールを用いてｇｌ
ｍＳ欠失を有する株を選択した。グルコサミン（２ｇ／ｌ）を継代培養用の全てのフラス
コおよび継代培養後の全てのプレートに加えた。標準ＰＣＲプロトコールを用いて、カナ
マイシン感受性株をｇｌｍＳ欠失の存在で選択／スクリーニングした。ＰＣＲで同定した
潜在的ｇｌｍＳ欠失株を、グルコサミンを添加せずにＬＢプレートに播種し、生育減少を
探した。株の一部はＬＢプレート上で生育が制限されたが、その他の株では生育しなかっ
た。これらの株はｇｌｍＳコード領域を有する２．０ｋｂフラグメントを用い、高ストリ
ンジェント条件下のサザンハイブリダイゼーションでｇｌｍＳ欠失を有すると確認された
。得られた株は７１０７−６４６と呼ばれた。

（ｎａｇＢの機能的発現およびグルコサミン生産に対する効果）
グルコサミン生産および酵素活性につき試験株７１０７−６４６を試験するため、振盪
フラスコスクリーン６１を行った。Ｍ９Ｂ培地を含むフラスコ中で株を試験した［ＫＨ_２
ＰＯ_４ ６ｇ／ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ２４ｇ／ｌ、クエンサン３Ｎａ・Ｈ_２Ｏ １ｇ／ｌ、
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ １０ｇ／ｌ＋微量金属（ＦｅＳＯ_４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ、
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０１５ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２０ ０．０１５ｍｇ／ｌ
、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２０ ０．００１ｍｇ／ｌ、ＮａＭＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．００１ｍｇ
／ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３ ０．００１ｍｇ／ｌおよびＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．００１ｍｇ／
ｌ）］、グルコース １０ｇ／ｌ 、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２０ ０．６ｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２
・２Ｈ_２Ｏ ０．０５ｇ／ｌ、およびＩＰＴＧ ０．２ｍＭ補充。培養細胞を３０℃で２
４時間生育させ、２５℃に置いた。画培養液のｐＨを２４時間および４８時間に７．２に
調節した。２４および４８時間目にグルコースを一日当たり３０ｇ／ｌでフラスコに加え
、レベルが１ｇ／ｌ以下に低下した場合、５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をフラスコに加
えた。試料を２４および４８時間に採取し、米国特許第６、３７２、４５７号に記載の修
正Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ分析を用いて培養液上澄中のグルコサミン濃度を測定した。
どの試料にもグルコサミンは検出されなかった。７１０７−６４６＃７および７１０７−
６４６＃２０株由来の４８時間試料をＮａｇＢ活性について分析した。検出可能な活性が
なかった対照株７１０７―１７（Ｄ３）と比較して、これらの株は５８および５３ｍｍｏ
ｌ・ｍｉｎ^−１・ｍｇ^−１の活性を有し、ｎａｇＢの過剰発現が成功したことを示した。
この実験で７１０７−６４６株が対照株７１０１−１７（ＤＥ３）と同様またはそれ以上
に良い生育を示した事実は、過剰発現ｎａｇＢがｇｌｍＳ変異を抑制し得ることを示した
。しかしながら、ｎａｇＢの過剰発現がグルコサミン蓄積を増加させる結果とはならなか
った。

（Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込み）
ｇｌｍＳ欠失株中のｎａｇＢの過剰発現によりグルコサミンが蓄積しなかったが、これ
は多分、ＮａｇＢが通常はＧｌｃＮ−６−Ｐの脱アミノ化を触媒すると言う事実のためと
思われる。ＮａｇＢ酵素で製造される少量のＧｌｃＮ−６−Ｐは速やかにフラクトース−
６−Ｐに変換して戻り、ＧｌｃＮ−６−Ｐの蓄積を阻止している。しかしながら、ＧＮＡ
１酵素が誘導された場合、ＧＮＡ１はＧｌｃＭ−６−ＰをＧｌｃＡｃ−６−Ｐに変換し、
フラクトース−６−Ｐからグルコサミン−６−Ｐの生成を連続的に駆動する。この可能性
を試験するため、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットを７１０７−６４６（３）および７
１０７−６４６（７）株のｍａｎＸＹＺに組み込んだ。ＧＮＡ１の組み込みはプラスミド
ｐＳＷ０７−６＃２５により実施例１６で行われた。ｍａｎＸＹＺ欠失部位におけるＴ７
ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１の存在について、カナマイシン感受性株を標準ＰＣＲプロトコール
でスクリーニングした。ＰＣＲ陽性の株を、ＳｃＧＮＡ１コード配列をプローブとして含
むフラグメントを用いる標準高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで確認し
た。７１０７−６４６（３）および７１０７−６４６（７）株由来の得られた７１０７−
６６０および７１０７−６６１株それぞれにつき、ＮＡＧ蓄積を試験した。

（ｎａｇＢの機能性発現およびＥ．ｃｏｌｉ中のＮ−アセチルグルコサミン生産）
ｇｌｍＳ欠失、ｐｆｋＢにおけるＴｌａｃ−ｎａｇＢカセット、およびＮ−アセチルグ
ルコサミン生産のためのｍａｎＸＹＺにおけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＢＮＡ１カセットを有す
る株を試験するため、振盪フラスコスクリーニング試験を行った。７１０７−６６０（１
）、７１０７−６６０（４）、７１０７−６６１（１）、７１０７−６６０（４）、７１
０７−６６１（２）および７１０７−６６１（３）株、および対照７１０１−１７および
７１０１−６０７（２）株を、グルコース １０ｇ／ｌ、ラクトース １０ｇ／ｌ、Ｍｇ
ＳＯ_４・７Ｈ_２０ ０．６ｇ／ｌ、およびＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０５ｇ／ｌを補充
したＭ９Ｂ培地（上記）を含む振盪フラスコ中で生育させた。培養細胞を３７℃で８時間
生育させ、その後３０℃に置いた。接種後８時間でグルコースを２５ｇ／ｌで加え、ｐＨ
を７．２に調節した。２４、３１、４８および５６時間で、ＨＰＬＣの結果に基づいてグ
ルコースを１日当たり３０〜４０ｇ／ｌで加え、５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をフラス
コ中に１ｇ／ｌ以下のレベルで加え、ｐＨを７．２に再調節した。２７時間でラクトース
を５ｇ／ｌで加えた。ＮＡＧレベルのＨＰＬＣ分析のため試料を８、２４、４８および７
２時間で取り出した。培養細胞を７２時間で収穫し、グルコサミン−６−リン酸アセチル
トランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）、グルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）およびグルコ
サミン−６−リン酸デアミナーゼ（ＮａｇＢ）活性を分析した。

酵素分析により、７１０７−６６０および７１０７−６６１株は機能性ＧｌｍＳタンパ
ク質が欠けていることが確認された。予想通り、ＮａｇＢ活性はこれらの株中で上昇した
。グルコサミン−６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性は対照株７１０７−６０７
（２）中で見出された活性と同様であり、これらの株中でＧＮＡ１タンパク質の機能的発
現を示していた。

ｎａｇＢおよびＧＮＡ１を過剰発現するｇｌｍＳ株はＮ−アセチルグルコサミンの生産
が可能であった（表１５）。７１０７−６６１株は最良であり、生産株７１０７−６０７
＃２株で達成したＮＡＧレベルの７５％を生産した。興味のあることに、７１０７−６６
０（１）株は他の同胞株より２０倍低いＮａｇＢ活性を示し、その結果はるかに低いレベ
ルのＧｌｃＮＡｃを生産した。グルコサミン−６−ＰアセチルトランスフェラーゼがＮａ
ｇＢで触媒される反応をグルコサミン−６−リン酸生成の方向への駆動を助長する様に思
われる。データはＮ−アセチルグルコサミン合成に対する新規生物学的経路の機能性を示
している。さらに、ＧＮＡ１と組み合わせたｎａｇＢの過剰発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＮ
−アセチルグルコサミンを生産するための効率的な方法である。

（表１５．ｎａｇＢを過剰発現するｇｌｍＳ変異株中の酵素活性およびＧｌｃＮＡｃ生
産）

１）酵素活性とＮ−アセチルグルコサミンレベルは７２時間の時点で採取した試料で測定
した。
２）酵素活性はμｍｏｌ ｍｉｎ^−１ ｍｇ^−１タンパク質で表される。
３）括弧内の数字は異なった同胞株を示す。

（実施例１５）
本実施例は７１０７−１８株中のＮ−アセチルグルコサミン生産に対するｇｌｍＭおよ
びｇｌｍＵのクローニングと過剰発現を説明する。

Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵ遺伝子はＧｌｃＮ−６−ＰをＵＤＰ−Ｇｌ
ａｃＮＡｃに変換する最初の３工程を触媒する。ＵＤＰ−ＧｌａｃＮＡｃは必須細胞外被
化合物の豪勢に必要である。ＧｌｍＭはＧｌｃＮ−１，６−二リン酸が第一および第二基
質の双方として働くＧｌｃＮ−６−ＰとＧｌｃＮ−１−Ｐの相互変換を、２工程ピンポン
反応機構で触媒する。生体内の酵素活性化は知られていないが、ＧｌｍＭはリン酸化型と
してのみ活性であることが知られている。ＧｌｍＭを高いレベルで過剰生産する株では、
リン酸化酵素の全量は増加せず、ＧｌｍＭのリン酸化が厳しく制限されていることを示し
ている（Ｍｅｎｇｎｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕｌｘおよびｖａｎ Ｈｅｉｆｅｎｏｏｒｔ、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９６６、２７１：３２−３９）。ＧｌｍＵはウリジルトランス
フェラーゼとアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ−末端）ドメインが分離している２機能酵
素である。アセチルトランスフェラーゼドメインはＧｌｃＮ−１−ＰのＧｌｃＮＡｃ−１
−Ｐへの転換を触媒する役割があり、ウリジルトランスフェラーゼドメインはＧｌｃＮＡ
ｃ−１−ＰをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する。最近の報告では、ＧｌｍＵの切断型バー
ジョンがＮ−末端Ｈｉｓ６タグで発現し、アセチルトランスフェラーゼおよびウリジルト
ランスフェラーゼ活性が分析された（Ｐｏｍｐｅｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０
０１、２７６：３８３３−３８３９）。全長ＧｌｍＵに対し１３２０分の１に減少したウ
リジルトランスフェラーゼ活性を有するＧｌｍＵの切断型が、タンパク質から最初の７８
個のＮ−末端残基を欠失することで得られた。この切断ＧｌｍＵタンパク質は全長Ｇｌｍ
Ｕに見られるアセチルトランスフェラーゼ活性の６６％を維持していた。

図１４はＧｌｍＭとＧｌｍＵの作用により、ＧｌｃＮ−６−ＰがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
に変換されるバクテリア経路を示す。ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵの過剰発現、またはｇｌｍ
ＭとｇｌｍＵの組み合わせの結果、培地中にＮ−アセチルグルコサミンが蓄積すると考え
られる。従って、これらの遺伝子の過剰発現のために株が構築された。

（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのｇｌｍＭ遺伝子のクローニング）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＭ遺伝子のクローニングと発現のため、ｇｌｍＭ遺伝子の公開さ
れた配列（Ｍｅｎｇｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕｌｘおよびｖａｎ Ｈｅｉｊｅｎｏｏｒｔ、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１：３２−３９）に基づいてプライマーを合成し
た。前方プライマー０７−１６３および逆方向プライマー０７−１６４を用い、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから、ｇｌｍＭコード配列を標準条件下で、ＰＣＲで増幅
した。プライマーは以下の配列を有する：０７−１６３；５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＴＣＴ
ＣＧＡ ＡＴＧ ＡＧＴ ＡＡＴ ＣＧＴ ＡＡＡ ＴＡＴＴＴＣ−３’（配列番号５
９）、および０７−１６４：５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＣＧＧ
ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＡＴＣ−３’（配列番号６０）。

プライマー０７−１６３はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＧＴＣＴＣ、配列
番号５９のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後のＡＴＧ開始コドンから始まる
ｇｌｍＭコード配列の２１ヌクレオチド（配列番号５９のヌクレオチド１３〜３３で表さ
れる）を含む。プライマー０７−１６４はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣ
ＧＡＧ、配列番号６０のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドン
で開始するｇｌｍＭコード配列の２１ヌクレオチド（配列番号６０のヌクレオチド１１〜
３１で表される）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＭコード配列とＧｌｍＭアミノ酸配列は
それぞれ配列番号５３および配列番号５４で表される。標準条件でＰＣＲ増幅を行い、Ｂ
ｓａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に側面する全ｇｌｍＭコード配列を含
むＤＮＡフラグメントを作成した。ＰＣＲ生成物を制限酵素ＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消
化し、プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
Ｉ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲートしプラスミドｐＳＷ０７−１０９を作成
した。この方法のクローニングはｇｌｍＭ配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモ
ーターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭ発現ベクターを生成する。

（Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現のためのｇｌｍＵ遺伝子のクローニング）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＵ遺伝子のクローニングと発現のため、ｇｌｍＵ遺伝子の公開さ
れた配列（Ｍｅｎｇｉｎ−Ｌｅｃｒｅｕｌｘおよびｖａｎ Ｈｅｉｊｅｎｏｏｒｔ、Ｊ．
Ｂａ．、１９９３、１７５：６１５０−６１５７）に基づいてプライマーを合成した。前
方プライマー０７−１６１および逆方向プライマー０７−１６２を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから、ｇｌｍＵコード配列を標準条件下で、ＰＣＲで増幅した。
プライマーは以下の配列を有する：０７−１６１；５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＣＴＣ ＣＧ
Ｃ ＡＴＧ ＴＴＧ ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＧＣ−３’（配列番号６１）
、および０７−１６２：５’−ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＴＴＴ ＴＣ
Ｔ ＴＴＡ ＣＣＧ ＧＡＣ ＧＡＣ−３’（配列番号６２）。

プライマー０７−１６１はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＧＴＣＴＣ、配列
番号６１のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後のＡＴＧ開始コドンで始まるｇ
ｌｍＵコード配列の２１ヌクレオチド（配列番号６１のヌクレオチド１３〜３３で表され
る）を含む。プライマー０７−１６２はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧ
ＡＧ、配列番号６２のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンで
開始するｇｌｍＵコード配列の２３ヌクレオチド（配列番号６２のヌクレオチド１１〜３
１で表される）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＵコード配列とＧｌｍＵアミノ酸配列はそ
れぞれ配列番号５５および配列番号５６で表される。標準条件でＰＣＲ増幅を行い、Ｂｓ
ａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に側面する全ｇｌｍＵコード配列を含む
ＤＮＡフラグメントを作成した。ＰＣＲ生成物を制限酵素ＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化
し、プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ
）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲートしプラスミドｐＳＷ０７−１０８を作成し
た。この方法のクローニングはｇｌｍＵ配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモー
ターの後ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＵ発現ベクターを生成する。

（Ｎ−末端切断ＧｌｍＵ酵素（ＧｌｍＵｔ）のクローニングと発現）
前方プライマー０７−１６５および反転プラーマー０７−１６２を用い、標準条件下で
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから切断ｇｌｍＵコード配列をＰＣＲで増幅した
。プライマー０７−１６５は以下の配列を有した：０７−１６５：５’−ＧＡＴ ＧＴＴ
ＣＴＣ ＧＣＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＴＡ ＣＧＧ ＧＴＣ−３’（
配列番号６３）。

プライマー０７−１６５はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＧＴＣＴＣ、配列
番号６３のヌクレオチド４〜９で表される）と、ＡＴＧ開始コドンの下流の２３２ｂｐで
始まるｇｌｍＵ ＣＤＳ配列（配列番号６３のヌクレオチド１５〜３３で表される）を含
む。この結果、ＧｌｍＵタンパク質の最初の７７個のアミノ酸が欠失する。開始コドンも
プライマー０７−１６５中に含まれる。プライマー０７−１６５および０７−１６２で生
成したＰＣＲ生成物は、最初の７７個のアミノ酸が欠失したｇｌｍＵコード配列を含む。
Ｅ．ｃｏｌｉのＮ−末端切断ｇｌｍＵコード配列とＮ−末端切断ＧｌｍＵアミノ酸配列は
それぞれ、配列番号５７および配列番号５８で表される。ＰＣＲ生成物をＢｓａＩおよび
ＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄ
ｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にライゲートしプラスミドｐＳＷ０７−
１１０を作成した。この方法のクローニングにより、切断ｇｌｍＵ（ｇｌｍＵｔ）配列を
ｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモーターの後ろに置き、発現カセットＴ７ｌａｃ−
ｇｌｍＵｔを生成する。

（Ｅ．ｃｏｌｉ中のＧｌｍＭ、ＧｌｍＵおよびＧｌｍＵｔタンパク質の過剰発現）
ｇｌｍＵ、ｇｌｍＭまたはｇｌｍＵｔを含むプラスミドｐＳＷ０７−１０８、ｐＳＷ０
７−１０９およびｐＳＷ０７−１１０を７１０１−１７（ＤＥ３）株中に形質転換し、表
６に挙げる株を作成した。空のベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）を７１０１−１７（ＤＥ３）
株中に形質転換し、標準株７１０７−２２を作成した。標準誘導実験を行い、形質転換体
の培養細胞をＬＢ培地中で生育させ１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのた
めに誘導培養細胞から試料を様々な時点で採取し、タンパク質の過剰発現を確認した。Ｇ
ｌｍＵ、ＧｌｍＭおよびＧｌｍＵｔタンパク質の予想サイズはそれぞれ５１ｋＤａ、５０
ｋＤａおよび４２ｋＤａであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の予想されたサイズのバンドはｇ
ｌｍＵ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵｔを過剰発現する株由来の試料で見られた。対照株では
ＧｌｍＵ、ＧｌｍＭおよびＧｌｍＵｔの予想サイズ付近に過剰発現タンパク質は見られな
かった。誘導培養液からの試料の全体および可溶性分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。
目視評価で判断すると、約２０％のＧｌｍＵタンパク質は可溶性分画にあった。しかしな
がら、ＧｌｍＵタンパク質の切断型バージョンでは可溶性タンパク質はほとんど見られな
かった。同様に、ほとんどのＧｌｍＭタンパク質は可溶型でなかった。

（表１６．ＧｌｍＵ、Ｎ−末端切断ＧｌｍＵおよびＧｌｍＭタンパク質用の異なったプ
ラスミドを含む株）

（ｎａｇ欠失部位におけるＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵおよびＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵｔの組み
込み）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＧｌｍＵおよびＧｌｍＵｔタンパク質
の過剰発現に成功したことが示された。従って、発現カセットを生産株７１０７−１８中
の染色体中に組み込む戦略が開発された。組み込みのために選ばれた標的は、７１０７−
１８株の染色体上のｎａｇ欠失部位であった。グルコサミン生産株を構築する初期で、オ
ペロンを欠失させ、ＩＢＰＣ５９０株（Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ、１９８９、Ｍｏｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．、３：５０６−５１５；Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ、１９９１、Ｍｏｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５：２０５３−２０６２；Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ、１９９２、Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３８：１０１１−１０１７）から調整したファージで
形質導入の後にＰ１テトラサイクリン耐性カセットを染色体の欠失部位に挿入した。従っ
て、染色体のこの領域を標的とする組み込みは生育または株中のグルコサミン生産に影響
するものではない。

Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＵカセットを染色体のｎａｇ欠失部位への組み込みを標的とするベ
クター開発戦略の一部として、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＵフラグメントをプラスミドｐＳＷ０
７―１０８＃１からＰＣＲで増幅した。ＰＣＲをＧＮＴ７ｎａｇＡ１−５および０７−１
２０プライマーを用いて標準条件下で行った。プライマーは以下の配列を有する：ＧＮＴ
７ｎａｇＡ１−５；５’−ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＴＧ ＣＧＡ
ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＡ−３’（配列番号６４）、および０７−１０７；５’−Ｇ
ＡＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＡＴ ＣＣＧ ＧＡＴ ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ Ｔ
ＴＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＣＣ Ｃ−３’（配列番号６５）。

前方プライマーＧＮＴ７ｎａｇＡ１−５はＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＣ
ＣＧＧＧ、配列番号６４のヌクレオチド１１〜１６で表される）を含み、Ｔ７プロモータ
ーの上流の２９６塩基対から増幅する。プライマー０７−１２０はＢｓｒＩ制限エンドヌ
クレアーゼ部位（ＴＧＴＡＣＡ、配列番号６５のヌクレオチド５〜１０で表される）を含
み、Ｔ７ターミネーターの下流の２５塩基対から増幅する。

プラスミドｐＣＡＬＧ４３（実施例２９に記載）はｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レ
プリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７−４
６２２、その全文を本明細書に引用して援用する）である生産株のｎａｇ欠失と、プラス
ミドｐＵＶ４Ｋのカナマイシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に側面する配列を有する。Ｔ７ｌａｃ−
ｇｌｍＵカセットを含むＰＣＲ生成物を制限酵素ＸｍａＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、ｐ
ＣＡＬＧ４３のＡｇｅＩおよびＢｓｒＨＩ部位へライゲートした。得られたプラスミドｐ
ＳＷ０７−１１２をＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵカセットを、我々の生産株の染色体上のｎａｇ
欠失部位へ直接組み込むために使用することができる。

Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＵ（切断）カセットをＤｎａｇへ組み込むためのプラスミドを作成
するため、プラスミドｐＳＷ０７−１１０＃５３がＰＣＲの鋳型となることを除いて、同
じ戦略とＰＣＲプライマーを使用した。得られたプラスミドをｐＳＷ０７−１１３と呼ぶ
。

プラスミドｐＳＷ０７−１１２およびｐＳＷ０７−１１３を、染色体上のｎａｇ欠失部
位へ組み込まれたＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵまたはＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵｔを有するＥ．ｃｏ
ｌｉ株を作成するために使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−１８をプラスミドで形質転換
後、実施例１３に記載の温度選択プロトコールを用いて挿入部を含む株を選択した。ｎａ
ｇ欠失部位のｇｌｍＵ発現の存在につき、カナマイシン感受性コロニーをＰＣＲでスクリ
ーニングした。切断ｇｌｍＵ ＰＣＲ生成物をプローブとして用い、高ストリンジェント
条件下で行ったサザンハイブリダイゼーションでＰＣＲ陽性株を確認した。７１０７−６
７８および７１０７−６７９株がｎａｇ欠失部位に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵを
有することが確認された。７１０７−６８０および７１０７−６８１株がｎａｇ欠失部位
に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＵｔを有することが確認された。

（Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭのｇｌｇ欠失部位への組み込み）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより、ＧｌｍＭタンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での過剰発現に成
功したことが示された。従って、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭカセットを生産株７１０７−１８
の染色体中へ組み込む戦略が開発された。組み込みのための選ばれた標的はｇｌｇオペロ
ンである。グリコーゲン合成経路を妨害してグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミ
ン生産経路を通る炭素フローを増加させる試みの中で、ｇｌｇ領域は以前に欠失の標的と
されていた。この変異は生育またはＮＡＧ生産に重大な影響を及ぼさなかった。従って、
この染色体部位へのＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＭカセットの組み込みは、生産株に負の影響を与
えないと考えられる。

Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭカセットの組み込みの標的をｇｌｇ部位とするベクターを開発す
る戦略の一部として、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＭフラグメントをプラスミドｐＳＷ０７―１０
９＃２９からＰＣＲで増幅した。プライマーＧＮＴ７ｎａｇＡ１−５およびＧＮＴ７ｎａ
ｇＡ２−３を用いてＰＣＲを標準条件下で行った。プライマーは以下の配列を有した：Ｇ
ＴＮ７ｎａｇＡ１−５：５’−ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＴＧ ＧＧ
Ａ ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＡ−３’（配列番号６６）およびＧＮＴ７ｎａｇＡ２−
３：５’−ＧＣＧ ＣＴＡ ＡＴＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＴＣ ＧＡＧ
ＧＴＧ ＣＣＧ ＴＡＡ−３’（配列番号６７）。

プライマーＧＮＴ７ｎａｇＡ１−５はＸｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ、配列番号６６のヌ
クレオチド１１〜１６で表される）を含み、Ｔ７プロモーターの上流の２９６塩基対から
増幅する。プライマーＧＮＴ７ｎａｇ２−３もＸｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ、配列番号６
７のヌクレオチド１１〜１６で表される）を含み、Ｔ７プロモーターの下流の２５４塩基
対から増幅する。得られたＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＸｍａで消化し
、プラスミドｐＣＡＬＧ２８−２のＡｇｅＩ部位（実施例２９に記載）へライゲートされ
た。この生成したプラスミドｐＳＷ０７−１１１＃３はｇｌｇオペロンと同じ配位でライ
ゲートされたＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＭカセットと、ｇｌｇオペロンの反対配位でライゲート
されたｐＳＷ０７−１１１＃４とを有する。これらのプラスミドを使用して、Ｔ７ｌａｃ
−ｇｌｍＭの生産株へｇｌｇオペロンを直接組み込むことができる。

Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−１８をプラスミドｐＳＷ０７−１１１＃３またはｐＳＷ０７−
１１１＃４で形質転換後、ｇｌｇ部位にＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＭを含む株を選択するため
に温度選択プロトコールを用いた。ｇｌｍＭコード配列をプローブとして用い、高ストリ
ンジェント条件下でサザンハイブリダイゼーションを行った。７１０７−６８２株が染色
体中のｇｌｇ部位に組み込まれたＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＭを有することが確認された（介
在ｇｌｇ遺伝子と同じ配位のｇｌｍ ＭＣＤＳ）。７１０７−６８３株が染色体中のｇｌ
ｇ部位に組み込まれたＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＭを有することが確認された（介在ｇｌｇ遺
伝子と反対配位のｇｌｍＭＣＤＳ）。

（ＧｌｍＭ／ＧｌｍＵの分析）
過剰発現ＧｌｍＭ（変異体）、ＧｌｍＵ（アセチルトランスフェラーゼ／ウリジルトラ
ンスフェラーゼ）およびＮ−末端切断ＧｌｍＵを含む様々な株を試験した。これらの酵素
の活性を本スクリーニングから選択した株で分析した。ホスフォグルコサミンムターゼ（
ＧｌｍＭ）をグルコサミン−１−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への連結反応を用
いて分析した。生成したグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐデアミナーゼ（Ｎ
ａｇＢ）、ホスフォグルコイソメラーゼおよびグルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼを用
いて定量的に６−リン酸に変換した。ＮＡＤＨの生成により、反応を３４０ｎｍでモニタ
ーした。グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＧｌｍＵ）をグルコサ
ミン−１−ｒｉｎｓａｎおよびアセチルＣｏＡを用いて分析した。遊離ＣｏＡの生成を、
試薬ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）を用いる終了点分析で測定した。遊
離ＣｏＡの生成を４１０ｎｍでモニターした。

酵素活性のレベルと、グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンのレベルを表１７
にまとめる。天然型またはＮ−末端切断バージョンの何れでも、過剰発現ＧｌｍＵを有す
る株でかなりの量のＮ−アセチルグルコサミンが生産された。この酵素の活性は、極めて
低いレベルの活性しか示さない対照株７０１７−１８より３０〜５０倍高かった。有為の
量の遊離グルコサミンもこれらの株で生成した。ＧｌｍＭタンパク質が過剰発現してもよ
り高い活性は得られなかった。実験条件下では、ＧｌｍＭの過剰発現により有意な量のＮ
−アセチルグルコサミンが生成しなかった。さらに、ＧｌｍＭ＋ＧｌｍＵの過剰発現でも
、ＧｌｍＵ株に比べてＮ−アセチルグルコサミンレベルが増加しなかった。文献に報告さ
れる様に、ＧｌｍＭ酵素はリン酸化で制御されるが、これは本明細書では言及されない。
リン酸化制御を迂回する、または他の改善された動力学的特徴を有するＧｌｍＭ変異酵素
を作成し使用することは、ＧｌｍＳ−ＧｌｍＭ−ＧｌｍＵまたはＮａｇＢ−ＧｌｍＭ−Ｇ
ｌｍＵ経路によるＮ−アセチルグルコサミン合成の効率を増加させえることが予想される
。

（表１７．ＧｌｍＭ、ＧｌｍＵおよびＧｌｍＵｔ（Ｎ−末端切断型ＧｌｍＵ）を過剰発
現する株の分析）

^＊列記した組換え遺伝子はすべてＴ７プロモーターの制御下で過剰発現された。
ｇｌｍＳ＝グルコサミンシンテターゼ
ｇｌｍＭ＝ホスフォグルコサミンムターゼ
ｇｌｍＵ＝グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ
ｇｌｍＵｔ＝ＧｌｍＵのＮ−末端切断型バージョン。

（実施例１６）
本実施例は、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの少なくとも１個のコピーの、グルコ
サミンまたはＮ−アセチルグルコサミン生産株の染色体への組み込みを説明する。

ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）を用いるＳｃＧＮＡ１の過剰発現により、７２時間の培養
後にＮ−アセチルグルコサミンの生産が２４ｇ／ｌとなった（表１）。倍溶液中の抗生物
質の使用を避け、Ｎ−アセチルグルコサミン生産を最大にするために、Ｔ７ｌａｃ−Ｓｃ
ＧＮＡ１発現カセットを染色体中に組み込むことが決定された。ＮＡＧ生産にＴ７ｌａｃ
―ＳｃＧＮＡ１発現カセットのどれだけのコピー数が最適であるかが未知であるので、カ
セットの複数のコピーを染色体中に組み込むことが決定された。標的遺伝子が細胞生育ま
たはＮ−アセチルグルコサミン生産に必須でないという仮定に基づいて、組み込みのため
の挿入部位が選択された。４個の標的部位が選ばれた；ｍａｎＸＹＺ、ｆｕｃＩＫ、ｔｒ
ｅＢおよびｍｅｌＡＢ。

実施例１３に記載した温度選択の一般的なストラテジーとプロトコールを、染色体中へ
のＧＮＡ１の組み込みに採用した。異なった温度感受性組み込みベクターを開発したが、
それぞれ温度感受性複製起点、抗菌性マーカーおよびＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセ
ットを含んでいた。各ベクターで、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを組換えプラ
スミドｐＳＷ０７−６２＃２５から単離し、所定の組み込み部位からクローニングされた
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ配列のフラグメント中に挿入した。組み込みベクターをＥ．ｃｏｌ
ｉ宿主株中に形質転換し、組み込みＳｃＧＮＡ１を有するクローンを温度変化法を用いて
選択した。

異なった起原由来の他のＧＮＡ１を組み込むために、同じ方法とプロトコールを使用す
ることができる。当業者は、これらの方法とプロトコールを特定遺伝子それぞれに採用す
るためには若干の修正と変更が必要であることを予想できる。この様な修正と変更にはク
ローニングのための異なった制限部位と、染色体への組み込みのための異なった位置の使
用が含まれるが、それに限定されない。

（ｍａｎＸＹＺ部位（ＧＮＡ１の一つのコピー）へのＧＮＡ１の組み込み）
Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを７１０７−１８中のその染色体のｍａｎＸＹ
Ｚ部位にサブクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ ｍａｎＸＹＤはマンノースの取り込みお
よび燐酸化に関与する３個のタンパク質の複合体をコードするオペロンである。グルコー
スを炭素源として含む培地中でＥ．ｃｏｌｉの生育に影響せず、このオペロンを欠失する
ことができる。ｍａｎＸＹＺ部位でのＧＮＡ１遺伝子の組み込みのために、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｍａｎＸＹＺ配列を含むプラスミドを開発した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｍａｎＸＹＺの公開さ
れた配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）、ｐ１
４５３−１４７４、その全体を本明細書中で参考として援用する）に基づき、プラーマー
を合成し、標準ＰＣＲ法を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡからｍａｎＸＹ
Ｚ＋隣接領域を増幅した。増幅に使用したプライマーは順方向プライマー０７−８７およ
び逆方向プライマー０７−８８であり、以下の配列を有した：０７−８７；５’−ＧＡＴ
ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＡＡ ＴＴＡ ＣＣＧ ＣＡＴ ＣＣＡ
ＡＣ−３’（配列番号６８）および０７−８８；５’−ＧＡＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＣ
Ｃ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＴＧＣ ＡＴＣＣ−３’（配列番号６９
）。

プライマー０７−８７はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（配列番号６８のヌクレ
オチド４〜１１として表される、ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を含み、ｍａｎＸ ＡＴＧ開始コド
ンの下流の９０５塩基対で開始する。プライマー０７−８８はＳａｌＩ部位（ＧＴＣＧＡ
Ｃ、配列番号６９の塩基対４〜９で表される）を含み、ｍａｎＺ翻訳停止コドンの下流の
１０１０塩基対から始まる。標準プロトコールを用いてＰＣＲを行い、（ｍａｎＸＹＺ）
＋（ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限部位が隣接する隣接領域）を含むフラグメントを生成す
る。このフラグメントをベクターｐＣＲ^σ２．１−ＴＯＰＯ^σ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、
Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローニングし、プラスミドｐｓＷ０７−６５＃７を作製
した。

ｍａｎＸＹＺに欠失を作製するため、プラスミドｐｓＷ０７−６５＃７を制限酵素Ｈｐ
ａＩで消化した。これにより、ｍａｎＸＹＺのコード配列のほとんどを含むプラスミドの
２６４７ｂｐ部分が放出された。さらに、制限エンドヌクレアーゼＮａｅＩを用いてＴ７
ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１フラグメントをプラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５（先に実施例１
３に記載）から切除した。プラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５はＴ７プロモーターの上流
の４６塩基対、およびＴ７ターミネーターの下流に１４６塩基対にＮａｅＩ部位を含む。
Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１配列を含むＮａｏＩフラグメントをｐＳＷ０７−６５＃７のＨ
ｐａＩ部位中にライゲートした。このライゲーションは平滑末端ライゲーションであるの
で、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１フラグメントを何れの方向でもプラスミド中にライゲート
し得る。従って、制限酵素消化をｍａｎＸＹＺと同じ配位で挿入されたＴ７ｌａｃ−Ｓｃ
ＧＮＡ１カセットを有するプラスミドをスクリーニングするために用いた。得られたプラ
スミドはｐＳＷ０７−６６＃２５と呼ばれる。

温度感受性組み込みベクターを作製するために、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコ
ン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７−４６２２
、その全体を本明細書中で参考として援用する）を含むフラグメントとプラスミドｐＵＣ
４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
，ＮＪ）を制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いてＰＫＬＮ０７−２１から切除した。
プラスミドｐＫＬＮ０７−２１をプラスミドｐＳＷ０７―４（実施例６に記載）から温度
感受性レプリコンのＰＣＲ増幅、ＰＣＲ生成物のベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^ＡＭＰ
ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ、ＣＡ）へのライゲーション、およびプラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）由来のカナマイシン耐
性カセットの付加で構築した。

Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１＋ｍａｎＸＹＺ隣接領域をプラスミドｐＳＷ０７−６６＃２
５から切除するため、制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを使用した。次にこのフラグメン
トをｐＫＬＮ０７−２１由来の温度感受性レプリコン領域起点とカナマイシン耐性マーカ
ーを含むＮｏｔＩ／ＳａｌＩフラグメントとライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−６８
＃５を作製した。このプラスミドは温度感受性複製起点、カナマイシン選択マーカー、お
よびｍａｎＸＹＺ遺伝子座由来の５’上流および３’下流配列に隣接するＴ７ｌａｃ−Ｓ
ｃＧＮＡ１発現カセットを有していた。

プラスミドｐＳＷ０７−６８＃５を使用してｍａｎＸＹＺ部位に組み込まれたＴ７ｌａ
ｃ−ＳｃＧＮＡ１を有するＥ．ｃｏｌｉ株を作製した。米国特許第６、３７２、４５７号
に記載のように、７１０７−１８株中のｍａｎＸＹＺオペロンはＰ１ファージ導入で突然
変異していた。ｐＳＷ０７−６８＃５でＥ．ｃｏｌｉ ７１０７−１８株を形質転換した
後、実施例６記載の温度選択プロトコールを用いてｍａｎＸＹＺ部位に組み込まれたＴ７
ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１配列を有する株を選択した。カナマイシン感受性株をｆｕｃレギュ
ロンでのＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの存在についてＰＣＲでスクリーニングした
。標準的な高ストリンジェントな条件を使用し、ＳｃＧＮＡ１コード配列をプローブとし
て用い、株をサザンハイブリダイゼーションで確認した。１つのＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ
１を伴って得られた株を、７１０７−９２と示す。

（ｆｕｃＩＫ部位におけるＧＮＡ１の第二コピーの組み込み）
Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの第二コピーの組み込みの標的は、別な炭素源とし
てＬ−フコースの利用に関連する酵素をコードする染色体領域であった。ｆｕｃＰ（Ｌ−
フコースパーミアーゼをコードする）、ｆｕｃＩ（Ｌ−フコースイソメラーゼをコードす
る）、ｆｕｃＫ（Ｌ−フコースキナーゼをコードする）およびｆｕｃＵ（未知のタンパク
質）遺伝子は、Ｌ−フコース異化作用に関連するオペロンを形成する。このｆｕｃＲ遺伝
子は、Ｌ−フコース異化レギュロンを活性化する調節タンパク質をコードする。フコース
オペロンでのＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込みは、グルコースを炭素源とし
て含む培地中でのＥ．ｃｏｌｉの生育能、およびそのＮ−アセチルグルコサミン合成能の
何れにも影響しないことが必要である。

ｆｕｃ領域を標的とする組み込みベクターを開発するストラテジーの一部として、フラ
クトースレギュロンの公開された配列（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．、１
９８７、２１０：３３１−３３７）に基づいてプライマーを合成した。標準ＰＣＲ条件下
にプライマー０７−１１３および０７−１１４を用いて、ｆｕｃＩＫＵおよびｆｕｃＲ遺
伝子をＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡから増幅した。これらのプライマーは以下
の配列を有する：０７―１１３；５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＧ
Ｃ ＡＡＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＣＴＧ ＧＣ−３’（配列番号７０）および０７−１１４
：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＴＴＡ ＣＣＡ ＡＡＧ
ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＡＡ ＣＣＴ ＧＧＣ−３’（配列番号７１）。

プライマー０７−１１３はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（配列番号７０のヌク
レオチド４〜１１として表される、ＣＧＣＧＣＣＧＣ）を含み、ｆｕｃＩ ＡＴＧ開始コ
ドンの下流の８２４ｂｐ（配列番号７０のヌクレオチド１２〜３２で表される）から増幅
する。プライマー０７−１１４はＢａｍＩＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ、配列番号７１のヌクレ
オチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コドンで開始するｆｕｃＲコード配列
の３２ヌクレオチド（配列番号７１のヌクレオチド１１〜４２）を含む。標準条件下でＰ
ＣＲを行い、ＢａｂＨおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接するｆｕｃＩＫ
Ｕ配列およびｆｕｃＲ配列を含むフラグメントを作製した。このフラグメントをｐＰＣＲ
−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７５を作
製した。プラスミドｐＳＷ０７−７５を制限エンドヌクレアーゼＨｐａおよびＢｒｓＧＩ
で消化し、ｆｕｃＩ遺伝子およびｆｕｃＫ遺伝子を含む１２３９塩基対フラグメントを除
去した。

標準条件を用い、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐＳＷ０７−６２＃
２５からＰＣＲで増幅した。以下の配列を有する順方向プライマー０７−１１５および逆
方向プライマー０７−１２２を用いてＰＣＲを行った：０７−１１５：５’−ＧＡＴ Ｃ
ＴＧ ＴＡＣ ＡＡＧ ＣＡＡ ＣＣＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＧＧ Ｃ−３’（配列番号
７２）および０７−１１２：５’−ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＧＣ ＴＡＴ ＣＣＧ ＧＡＴ
ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＣＣ Ｃ−３’
（配列番号７３）。

プライマー０７−１１５はＢｓｒＧＩ部位（配列番号７２のヌクレオチド５〜１０で表
される、ＴＧＴＡＣＡ）を含み、ｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７プロモーター配列の上流
の７６塩基対から増幅する。プライマー０７−１１２はＡｆｅＩ部位（ＡＧＣＧＣＴ、配
列番号７３のヌクレオチド５〜１０で表される）を含み、ｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７
ターミネーターの下流から２５塩基対から増幅する。ＰＣＲフラグメントをＢｓｒＧＩお
よびＡｆｅＩで増幅し、プラスミドｐＳＷ０７−７５のＢｓｒＧＩおよびＨｐａＩ部位に
ライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７６を作製した。組換えプラスミドはｆｕｃＩＫ
欠失部位中にライゲートされたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットを含んでいた。

温度感受性組み込みベクターを作製するため、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン
（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７−４６２２、
その全体を本明細書中で参考として援用する）、およびプラスミドｐＵＣ４Ｋのカナマイ
シン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むフラグメントを制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｐｎＩを用いてプ
ラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切除した。プラスミドｐＫＬＮ０７−２１をプラスミド
ｐＳＷ０７−４（実施例６に記載）から温度感受性レプリコンのＰＣＲ増幅、ＰＣＲ生成
物のベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌｌａ、ＣＡ）中へのライゲーション、およびプラ
スミドｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、ＮＪ）由来のカナマイシン耐性カセットの付加で構築した。

プラスミドｐＳＷ０７−７６からＴ７ｌａｃＳｃＧＮＡ１＋ｆｕｃ隣接領域を含むフラ
グメントを切除するため、制限酵素ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩを使用した。次いでこのフラ
グメントをｐＫＬＮ０７−２１由来の温度感受性複製起点とカナマイシン耐性マーカーを
含むＮｏｔＩ／ＫｐｎＩフラグメントとライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７７を生
成した。このプラスミドは温度感受性複製起点、カナマイシン選択マーカー、およびｆｕ
ｃレギュロン由来の５’上流および３’下流配列に隣接するＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発
現カセットを含んでいた。プラスミドｐＳＷ０７−７７をＴ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カ
セットの組み込みをＥ．ｃｏｌｉのｆｕｃレギュロンへ組み込むために使用できる。

プラスミドｐＳＷ０７−７７を７１０７−９２＃１中へ形質転換した。ΔｆｕｃＩＫ部
位に組み込まれたＴ７−ｌａｃＧＮＡ１を有する株を選択するため、温度選択プロトコー
ルを用いた。得られた株を、７１０７−６０７（２）、７１０７−６０７（３）および７
１０７−６０７（４）と称する。

（ＧＮＡ１の第三コピーのｔｒｅＢ部位への組み込み）
Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの第三コピーを、別な炭素源としてトレハロース
の利用に関与する酵素をコードする染色体領域に組み込んだ。トレハローストランスポー
ターおよびトレハロース６−ＰハイドロレースをコードするｔｒｅＢ遺伝子およびｔｒｅ
Ｃ遺伝子それぞれはオペロンを形成する。ｔｒｅＲ遺伝子はトレハロース−６−Ｐで誘導
し得るオペロンを制御するレプレッサータンパク質をコードする（Ｈｏｒｌａｃｈｅｒ、
Ｒ．およびＢｏｏｓ、Ｗ．、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２（２０）：１
３０２６−１３０３２）。先の標的と同じ様に、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１のトレハロー
スレギュロンへの組み込みは、グルコースを炭素源として含む培地中のＥ．ｃｏｌｉ生育
能、およびそのＮ−アセチルグルコサミン生産能の何れにも影響してはならない。

ｔｒｅＢを標的とする組み込みベクターを開発するストラテジーとして、公開された配
列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２（５３３１）：１４５３−
１４７４）に基づきプライマーを合成し、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡからｔｒ
ｅＲ遺伝子、ｔｒｅＢ遺伝子およびｔｒｅＣ遺伝子を増幅した。以下の配列を有するプラ
イマー０７−１１７および０７−１１８を使用してＰＣＲ増幅を行った：０７―１１７：
５’−ＧＡＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＡＴ ＧＣＡ ＡＡＡ ＴＣＧ ＧＣＴ ＧＡＣ Ｃ
ＡＴ Ｃ−３’（配列番号７４）および０７−１１８：５’−ＧＡＴ ＣＧＧ ＧＣＣ
ＣＴＴ ＡＣＴ ＴＣＴ ＧＴＡ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＣＴ Ｃ−３’
（配列番号７５）。

プライマー０７−１１７はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（配列番号７４のヌク
レオチド３〜１０として表される、ＧＣＧＧＣＣＧＣ）と、その後のＡＴＧ開始コドンか
らｔｒｅＲコード領域の２１ヌクレオチド（配列番号７４のヌクレオチド１１〜３１で表
される）を含む。プライマー０７−１１８はＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＧ
ＧＣＣＣ、配列番号７５のヌクレオチド５〜１０で表される）と、その後の翻訳停止コド
ンで開始するｔｒｅＣコード配列の２７ヌクレオチド（配列番号７５のヌクレオチド１１
〜３７で表される）を含む。標準プロトコールを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＮｏｔＩおよ
びＡｐａＩ制限部位が隣接するｔｒｅＲ、ｔｒｅＢおよびｔｒＣを含むＤＮＡフラグメン
トを作製した。４．２ｋｂのＰＣＲ生成物をプラスミドｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭＳＫ
（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、
ＣＡ）中にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７８＃２０を作製した。

プラスミドｐＳＷ０７−７８＃２０を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩで消化し、標
準条件下でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理してフラグメントの末端を鈍化した。平滑末
端化フラグメントを次に制限エンドヌクレアーゼＢｓｒＧＩで消化した。このＢｇｌＩお
よびＢｓｒＧＩによる二重消化によりｔｒｅＢコード配列の１３０塩基対領域をプラスミ
ドｐＳＷ０７−７８＃２０から除去し、プラスミドフラグメントに１個の粘着末端（Ｂｓ
ｒＧＩ）と１個の平滑末端を残した。

次の工程はＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐＳＷ０７−７８＃２０の
ＢｓｒＧＩおよびＧｇｌＩ（充填）部位へライゲートすることである。これを行うため、
順方向プライマー０７−１１５（配列番号７２）および逆方向プライマー０７−１１２（
配列番号７３）を用い、標準条件下でＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐ
ＳＷ０７−６２＃２５からＰＣＲで増幅した。プライマー０７−１１５はＢｓｒＧＩ部位
（ＴＧＴＡＣＡ、配列番号７２のヌクレオチド５〜１０で表される）を含み、ｐＳＷ０７
−６２＃２５のＴ７プロモーター配列の上流の７６塩基対から増幅する。プライマー０７
−１１２はＡｆｅＩ部位（ＡＧＣＧＣＴ、配列番号７３のヌクレオチド５〜１０で表され
る）を含み、ｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７ターミネーター配列の下流の２５塩基対から
増幅する。ＰＣＲフラグメントをＢｓｒＧＩおよびＡｆｅＩで消化し、プラスミドＰＳＷ
０７−７８＃２０のＢｓｒＧＩおよびＮｇｌＩＩ（充填）部位中にライゲートされ、プラ
スミドｐＳＷ０７−８３を生成する。

温度感受性組み込みベクターを作製するため、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン
を含むフラグメント（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４
６１７−４６２２、その全体を本明細書中で参考として援用する）およびプラスミドｐＵ
ＫＣ４Ｋのカナマイシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒａｍｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むフラグメントを、制限酵素ＮｏｔＩおよ
びＡｐａＩを用いてプラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切除した。

Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１＋ｔｒｅ隣接領域をプラスミドｐＳＷ０７−８３から切除す
るため、制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＩを使用した。このフラグメントを、温度感受性
複製起点とカナマイシン耐性マーカーを含むプラスミドｐＫＬＮ０７−２１由来のＮｏｔ
Ｉ−ＡｐａＩフラグメントとライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−８４とした。プラス
ミドｐＳＷ０７−８４を使用して、Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをＥ．ｃｏｌｉ
のｔｒｅＢに直接組み込んだ。

プラスミドｐＳＷ０７−８４＃１を７１０７−６０７（２）、７１０７−６０７（３）
および７１０７−６０７（４）株中へ形質転換した。温度選択プロトコールを使用して、
ｔｒｅＢ部位に組み込まれたＴ７−ｌａｃ ＧＮＡ１配列を選択した。染色体のｔｒｅＢ
におけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットについて、カナマイシン感受性コロニーをＰ
ＣＲでスクリーニングした。標準高ストリンジェント条件で、ＳｃＧＮＡ１コード配列を
染色体中に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの３個のコピーを有するプロ
ーブとして用いて、株をサザンハイブリダイゼーションで確認した。これらの株を７１０
７−６０８（１）および７１０７−６０８（２）と呼ぶ。

（ＧＮＡ１の第四コピーのｍｅｌＲＡＢ部位への組み込み）
Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの４個のコピーのＮＡＧ生産株中への組み込みの標
的を、染色体のｍｅｌＲおよびｍｅｌＡＢ領域とした。Ｅ．ｃｏｌｉ中で、この領域はメ
リビオースの取り込みおよび加水分解に関与するタンパク質をコードする。α−ガラクト
シダーゼおよびメリビオースパーミエースＩＩをそれぞれコードするｍｅｌＡ遺伝子およ
びｍｅｌＢ遺伝子はオペロンを形成する。様々に転写されたｍｅｌＲ遺伝子はメリビオー
スオペロンのレギュレーターをコードする。以前の組み込み標的と同じ様に、ゲノムのｍ
ｅｌＡＢへのＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込みは、グルコースを炭素源とす
る培地中のＥ．ｃｏｌｉの生育能、およびＮ−アセチルグルコサミン合成能の何れにも影
響してはならない。

ｍｅｌＡＢを標的とする組み込みベクターを開発するストラテジーとして、Ｅ．ｃｏｌ
ｉのｍｅｌＲ、ｍｅｌＡおよびｍｅｌＢプライマーの公開された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒ
ら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：ｐ１４５３−１４７４）に基づい
て０７−１２２および０７−１２３を合成した。標準条件でＰＣＲを行い、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡからｍｅｌＲ、ｍｅｌＡおよびｍｅｌＢを含むフラグメントを
増幅した。順方向プライマー０７−１２２および逆方向プライマー０７−１２３は以下の
配列を有する：０７−１２２：５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＡＧ ＣＣＧ
ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＴＣ ＴＧＧ ＣＧＧ Ｃ−３’（配列番号７６）、および０７−
１２３：５’−ＧＡＴ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＣＡＴ Ｃ
ＡＣ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＡＣ Ｃ−３’（配列番号７７）。

プライマー０７−１２２はＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、
配列番号７６のヌクレオチド４〜１１で表される）と、その後の翻訳停止コドンから始ま
るｍｅｌＲコード配列の２３ヌクレオチド（並列番号７６のヌクレオチド１２〜３４で表
される）を含む。プライマー０７−１２３はＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＴ
ＣＧＡＣ、配列番号７７のヌクレオチド１２〜３４で表される）と、その後の翻訳停止コ
ドンから始まるｍｅｌＢコード配列の２７ヌクレオチド（並列番号７７のヌクレオチド１
１〜３７で表される）を含む。ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が隣
接するｍｅｌＲおよびｍｅｌＡＢコード配列を含むＰＣＲフラグメントをベクターｐＰＣ
Ｒ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にライゲートし、プ
ラスミドｐＳＷ０７−８１＃５を作製した。

ベクター構築の次の工程は、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐＳＷ０
７−８１＃５のｍａｌＡＢ領域へライゲートすることである。プラスミドｐＳＷ０７−８
１＃５を制限エンドヌクレアーゼＢｌｇＩＩおよびＡｓｉＳＩで消化し、全ｍａｌＡコー
ド配列を含む１６７６塩基対とｍｅｌＢコード領域の最初の１９９ヌクレオチドを除去し
た。

標準条件下、順方向プライマー０７−１２４および逆方向プライマー０７−１２５でＴ
７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをプラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５からＰＣＲで増幅
した。それぞれのプライマーは以下の配列を有する： ０７−１２４：５’−ＧＡＴ Ｇ
ＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＡＣ ＣＧＣ ＡＣＣ ＴＧＴ ＧＧＣ−３’（配列番号７８
）、および０７−１２５：５’−ＧＡＴ ＧＣＧ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＴＡ ＧＴＴ Ｃ
ＣＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＣＣ−３’（配列番号７９）。

プライマー０７−１２４はＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ、配列番号７８のヌクレオチ
ド４〜９で表される）を含み、プラスミドｐＳＷ０７−６２＃２５のＴ７プロモーターの
上流の７６ヌクレオチドから増幅する。プライマー０７−１２５はＡｓｉＳＩ部位（ＧＣ
ＧＡＴＣＧＣ、配列番号７９のヌクレオチド４〜１１で表される）を含み、プラスミドｐ
ＳＷ０７−６２＃２５のＴ７プロモーターの下流の１８ヌクレオチドから増幅する。Ｔ７
ｋａｃ−ＳｃＧＮＡ１を含むＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡ
ｓｉＳＩで消化し、ＢｇｌＩＩおよびＡｓｉＳフラグメントとライゲートしてプラスミド
ｐＳＷ０７−８２を作製した。従って、プラスミドｐＳＷ０７−８２は、１６７６塩基対
ｍｅｌＡＢ領域がＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットで置換されたｍｅｌ遺伝子をベクタ
ーｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）中に含む。

温度感受性組み込みベクターを作製するため、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン
（ Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７−４６２２
、その全体を本明細書中で参考として援用する）、およびプラスミドｐＵＣ４Ｋのカナマ
イシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒａｍｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むフラグメントを制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いて
プラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切除した。

プラスミドｐＳＷ０７−８２を制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化
し、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットで隔てられたｍｅｌ遺伝子を含むフラグメントを
単離した。このフラグメントをプラスミドｐＫＬＮ０７−２１由来の温度感受性複製起点
とカナマイシン耐性マーカーを含むＮｏｔＩおよびＳａｌＩフラグメントとライゲートし
た。得られたプラスミドｐＳＷ０７−８４をＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットをＥ．ｃ
ｏｌｉのｍｅｌＡＢ部位への直接組み込むために使用することができる。

プラスミドｐＳＷ０７−８４を７１０７−６０８（１）および７１０７−６０８（２）
株中に形質転換した。実施例６に記載の温度感受性プロトコールを用いて、ｍｅｌＡＢ部
位へ組み込まれたＴ７−ｌａｃＧＮＡ１配列を有する株を選択した。染色体のｍｅｌＡＢ
におけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの存在につき、カナマイシン感受性コロニー
をＰＣＲでスクリーニングした。染色体中に組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセ
ットの４個のコピーを有するＳｃＧＮＡコード配列をプローブとして、高ストリンジェン
ト条件を用いてサザンハイブリダイゼーションで株を確認した。７１０７−６０８（１）
および７１０７−６０８（２）由来の得られた株をそれぞれ７１０７−６１２および７１
０７−６０３と呼ぶ。

プラスミドｐＳＷ０７−８４も７１０７−６０７（２）、７１０７−６０７（３）およ
び７１０７−６０７（４）株中に形質転換し、染色体にＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１の第三
のコピーを加えた。株を上記の様にスクリーニングし、染色体中に組み込まれたＴ７ｌａ
ｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの３個のコピーを有するプローブとしてのＳｃＧＮＡ１コード
配列で、標準高ストリンジェント条件を用いてサザンハイブリダイゼーションで確認した
。７１０７−６０７（２）、７１０７−６０７（３）および７１０７−６０７（４）株由
来の株を７１０７−６０９、７１０７−６１０および７１０７−６１１と呼ぶ。

（ＧＮＡ１遺伝子コピー数のＧＮＡ１抑制レベルおよびＮ−アセチルグルコサミン生産
に対する効果）
ＧＮＡ１遺伝子コピー数のＧＮＡ１抑制レベルおよびＮ−アセチルグルコサミン生産に
対する効果を評価するため、組み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの様々なコ
ピー数を有する株を振盪フラスコ中で試験した。酵素活性によるＧＮＡ１タンパク質の発
現の分析と、ＮＡＧ力価の測定のため試料を採取した。

グルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）活性、グルコサミン−６−燐酸アセチルトラン
スフェラーゼ（ＧＮＡ１）活性およびＮ−アセチルグルコサミン生産に対する組み込まれ
たＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットのコピー数の効果を評価するため、振盪フラスコス
クリーニング５３を行った。０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣ
ａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１０ｇ／ｌのグルコース、４０ｇ／ｌのラクトース、５ｇ／ｌのリ
ボースおよび５ｇ／ｌの酵母抽出物を補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で株を生育させた。
培養細胞を最初の２４時間３０℃で生育させ、２５℃に置いた。２４〜４８時間の時点で
、培養液のｐＨを７．２に調整し、ＨＰＬＣの結果に基づきグルコースを各フラスコに一
日当たり３０ｇ／ｌで添加し、アンモニアレベル１／Ｌ以下で５ｇ／ｌの硫酸アンモニウ
ムを添加した。試料を２４、４８および７２時間に取り出し、ＮＡＧ生産の評価と酵素分
析を行った。試験した全ての株は同程度のＯＤ_６００に生育し、同程度のグルコサミンシ
ンテターゼ活性を有した（表１８）。グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラー
ゼ活性とＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１コピー数の間にかなりの相関があり、３個のコピーを
有する株が最高の比活性を有した。しかしながら、振盪フラスコ実験では、この比活性の
増加によりＮＡＧ生産が増加する結果とはならなかった。

（組み込みＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの異なったコピー数を有する株の１リッ
ター醗酵槽中における評価）
コピー数１〜４の範囲で組み込みＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１をそれぞれ含む７１０７−
９２（１）、７１０７−６０７（２）、７１０７−６０８（２）および７１０７−６１２
（１）株を１Ｌ醗酵槽中で評価した。醗酵槽２３７〜２４０を初期容積４７５ｍｌで設定
した。醗酵培地の成分を表１９に挙げる。ｐＨを６．９に制御するため、７５％ＮＨ_４Ｏ
Ｈを用いて醗酵を行った。醗酵中、温度を３７℃に保った。曝気および攪拌を調節して溶
存酸素濃度を空気飽和濃度の２０％に保った。コンピュータープログラムで供給速度を制
御して６５％グルコースを培地に供給し、接種時で生育速度０．４０／時間、最高速度５
ｍｌ／時間を６０秒間に達成した。培養を１０時間で５ｇ／ｌで添加した食品グレードラ
クトースで誘導し、グルコースを連続的に供給した。

醗酵の結果は以下の様にまとめられる。ＧＮＡ１カセットのコピー数はＮＧＡレベルに
若干効果がある。醗酵の終点で、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットのコピーを３個有す
る７１０７−６０８（２）株は、カセットコピー数１個を有する株より１６％多く、カセ
ットコピー数２個を有する株より５％多くＮＡＧを生産した。この実験で、Ｔ７ｌａｃ−
ＳｃＮＡ１を４コピー添加しても７１０７−６０８（２）の改善は行われなかった。言う
までもなく、生産株におけるＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１株のコピー数を増加させることの
有用性が実証された。

（実施例１７）
以下の例で、グルコサミン合成に対する燐酸化糖の効果を説明する。

様々な燐酸化糖の存在でグルコサミンシンテターゼ活性を検討した。振盪フラスコ中で
２４時間、ラクトース誘導で生育させた７１０７−１８細胞から粗酵素抽出物を調整した
。結果を以下の表２０にまとめる。先に観察した様に、データはグルコサミン−６−Ｐが
比較的高い濃度でグルコサミンシンテターゼを強く阻害することを示した。グルコサミン
−１−Ｐも１０ｍＭで酵素を阻害した。Ｎ−アセチルグルコサミン燐酸では阻害は観測さ
れなかった。

（実施例１８）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミン合成に関与する他の酵素に対する燐酸化糖の生化
学的効果を説明する。

先に議論した燐酸化糖（グルコサミン−６−Ｐ糖の化合物）の潜在的毒性効果は、アミ
ノ糖の代謝に直接関与する酵素に限られていた。しかしながら、糖の毒性の一般的現象は
、糖代謝が損なわれた様々な突然変異体で以前から観測されていた。これは、一般的に少
なくとも一つの酵素標的を阻害し、細胞の代謝を損なう異常に高いレベルの燐酸化糖中間
体に帰せられる。ＧｌｍＳの生成物阻害はこの一例である。

図３は他の標的に対するいくつかの可能性を示唆する。アミノ酸代謝が阻害された突然
変異体を扱う論文（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０１：３８４、１９７０）にこの現象が
記載され、ペントース糖が阻害を回復させ得ることが示される。従って、いくつかの酵素
に対するグルコサミン−６−ｐおよびＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐの効果を検討し
た。

グルコサミン−６−ＰはＰｇｉの阻害剤であることが文献（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、６４：４８９、１９５６）に報告されている。図１５はＰ
ｇｉを示す（２種のアミノ糖によるホスフォグルコイソメラーゼ阻害）。阻害は双方の化
合物で観察されるが、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐではかなり少ない。

グルコサミン−６−Ｐはホスフォグルコイソメラーゼの阻害剤であることが報告されて
いる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２１６：６７、１９５５）。図１６はグルコース−６
−Ｐのペントース燐酸経路への入口であるグルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ
）に対する燐酸化アミノ糖の効果を示す。再言すると、グルコサミン−６−ＰはＮ−アセ
チルグルコサミンより強力な酵素の阻害剤である様に思われる。ホスフォグルコムターゼ
（Ｐｍｇ）でも同様な傾向が見られた。

炭水化物代謝に関連する上記およびその他の可能な酵素に対するグルコサミン−６−Ｐ
の阻害効果は、７１０７−１８株で観察されたグルコサミン生産性に対する見掛けの限界
に対する説明になると思われる。多分、高濃度のグルコサミン−６−Ｐがいくつかの酵素
の活性を妨害する。アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）を経路へ添加することは、
グルコサミン−６−ｐの細胞内レベルの減少をもたらすものと思われる。これが多分、生
産性を減少すると同時にＮ−アセチルグルコサミンの安定性を増大させる主な理由である
と考えられる。

実際、Ｎ−アセチルグルコサミンは試験管内分析でＺｗｆまたはＰｇｉをそれほど阻害
しない。細胞の生育およびＮ−アセチルグルコサミン合成に対するリボースとグルコン酸
の正の効果は、ペントース燐酸経路の少なくとも一つの工程が燐酸化アミノ糖で影響され
ることを示唆している。一方、グルコサミンＮ−アセチルトランスフェラーゼはＮ−アセ
チルグルコサミン−６−Ｐによる有為の生成物阻害を示さなかった。

（実施例１９）
本実施例は醗酵槽中内のＮ−アセチルグルコサミン生産中の酵素活性を説明する。

Ｎ−アセチルグルコサミン生産に関与する様々な酵素活性を醗酵槽中で調べた。分さ期
した酵素はグルコサミンシンテターゼ（ＧｌｍＳ）、グルコサミンＮ−アセチルトランス
フェラーゼ（ＧＮＡ１）、およびペントース燐酸経路で鍵となる酵素であるグルコース−
６−燐酸デヒドロゲナーゼである（図３参照）。

（ＧＮＡ１プラスミドを有する株（醗酵槽＃１０２））
関連する酵素活性を醗酵槽１０２からの７０１７−８７（２５）株の試料で検討した。
この株はプラスミド上にアセチルトランスフェラーゼ遺伝子コンストラクトを含む。この
実験で８０ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンが生産された。酵素活性とＮ−アセチルグ
ルコサミン濃度の結果を図１７に示す。誘導直後に高いアセチルトランスフェラーゼ活性
が見られ、実験中、高いままであった。興味のあることに、その後の９０時間でもアセチ
ルトランスフェラーゼ活性が存在したが、この時点でグルコサミンシンテターゼ活性は消
滅していた。約７０時間でＮ−アセチルグルコサミンの生産は基本的に停止していた。グ
ルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼ活性は実験中一定であった。

（組み込みＧＮＡ１コンストラクトを有する株（醗酵槽＃１２１〜１２８））
これらの実験には組み込みアセチルトランスフェラーゼコンストラクトを含むＥ．ｃｏ
ｌｉ ７０１７−９２（１）株を使用した。検討した醗酵変数は培地に添加した鉄の量、
外部からの発現の鉄の供給、および燐酸緩衝液レベル（１Ｘ＝４０ｇ／ｌ）であった。酵
素活性を表２１にまとめる。醗酵１２１に用いた最低の鉄レベルを除いて、他の７個の醗
酵槽ではグルコサミンシンテターゼおよびアセチルトランスフェラーゼ活性は実験を通じ
て非常に高かった。先に観察した様に、アセチルトランスフェラーゼ活性は高レベルを保
つ傾向がある。さらに鉄を供給し、または供給せずに検討した場合でも、グルコサミンシ
ンテターゼ活性は他の鉄レベル（５〜２０ｐｐｍ）では適切であった。鉄が少ないとＮ−
アセチルグルトランスフェラーゼ活性は高いが、グルコサミンシンテターゼ活性は低かっ
た。この活性の減少は、高いＮ−アセチルグルコサミン生産にさらに適当であった。

（実施例２０）
本実施例はグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン生産のためのＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの代謝遺伝子工学を説明する。具体的には、生産物
耐性グルコサミンシンターゼであるＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ^＊５４およびＢａｃｉｌｌｕ
ｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳをコードする遺伝子、およびグルコサミン−６−燐酸
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードするＳ． ｃｅｒｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１をコ
ードする遺伝子を酵母発現ベクター中へクローニングし、過剰発現のために酵母中へ導入
した。

グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンの生産の上記実施例に記載した主な要素
は、生成物耐性ＧｌｍＳとＧＮＡ１の過剰発現である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｎｉｃａｎｓ等の天然型ＧＮＡ１遺伝子を有する宿主では、生成物
耐性ＧｌｍＳを過剰発現することにより、Ｎ−アセチルグルコサミン生産レベルを増加さ
せることができた。しかしながら、アミノ糖の主生成物はグルコサミンまたはＮ−アセチ
ルグルコサミンである必要がある。主生成物としてＮ−アセチルグルコサミンを生産する
ためには、ＧＮＡ１遺伝子が過剰発現しなければならない。

中性の醗酵ｐＨでグルコサミンを生産するためには、グルコサミンの分解が隘路である
。酵母とバクテリアのあるものは比較的低いｐＨに適応し、通常はグルコサミンが安定で
ある４〜５のｐＨ範囲で生育するので、この型のホスト中で生成物耐性ＧｌｍＳ酵素を過
剰発現することで、グルコサミンの直接生産のための商業的に有用なプロセスを開発する
ことができる。さらに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはＧＲＡＳ菌であり、外毒素を生産し
ないので、製品の応用を目的とするグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミンを生産する
ための好ましい宿主となり得る。
（酵母中で発現するためのＥ．ｃｏｌｉ突然変異体ｇｌｍＳ^＊５４のクローニング）
Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異体ｇｌｍＳ^＊５４遺伝子を発現ベクターｙＥｐ３５２−ＡＤＨ１
中へクローニングした。このベクターを、標準的な技術を利用してｙＥｐ３５２（Ｈｉｌ
ｌら、１９８６、Ｙｅａｓｔ ２：１６３〜１６７）から誘導した。その遺伝子は酵母細
胞当たり複数のコピーで複製され、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーター
およびターミネーターを含む。このベクターはＥ．ｃｏｌｉ選択のためのアンピシリン耐
性マーカーと、酵母中での選択のためのＵＲＡ３マーカーを有する。

順方向プライマーｎＭＤ７１０７−０２１および逆方向プライマーｎＭＤ７１０７−０
２２をＥ．ｃｏｌｉ突然変異体ｇｌｍＳ^＊５４遺伝子のコード配列のＰＣＲ増幅のために
設計した。クローニングを助長するため、制限部位を末端に取り込んだ。以下の配列を有
する順方向プライマーｎＭＤ７１０７−０２１（ＳａｃＩ）および逆方向プライマーｎＭ
Ｄ７１０７−０２２（ＨｉｎｄＩＩＩ）を用いて、ｇｌｍＳ^＊５４コード配列を標準条件
下で増幅した：ｎＭＤ７１０７−０２１（ＳａｃＩ）：５’−ＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＴ
ＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＴＧＧＣＧＣＧＡ−３’（配列番号８０）およびｎＭＤ７１０
７−０２２（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＴＡＣＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＡＡＣＣＧＴＡＡ
ＣＣＧＡＴＴＴＴ ＧＣ−３’（配列番号８１）。プライマーｎＭＤ７１０７−０２１は
配列番号８０のヌクレオチド１１〜３２で表されるｇｌｍＳ^＊５４コード配列の２２ヌク
レオチドを含み、プライマーｎＭＤ７１０７−０２２は配列番号８１のヌクレオチド９〜
３２で表されるｇｌｍＳ^＊５４コード配列の２４ヌクレオチドを含む。

Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ^＊５４遺伝子（米国特許第６、３７２、４５７号に記載）を含
むプラスミドｐＫＬＮ２３−５４をＰＣＲ反応におけるＤＮＡの鋳型として使用した。使
用されるサイズのＰＣＲ生成物の単一バンドが、Ｔａｑポリメラーゼを用いる標準ＰＣＲ
条件下で生成した。ＰＣＲ生成物を制限酵素ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ア
ガロースゲルで精製し、同じ酵素で予め消化したｙＥＰ−３５２−ＡＤＨ−１中へクロー
ニングした。ＤＮＡライゲーション生成物をアンピシリン選択でＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１
０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、
ＣＡより入手）中へ形質転換した。まず、コロニーの１０個のプール（プール当たり１０
コロニー）を順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いるＰＣＲでスクリーニング
した。次いで陽性プール中の個々のコロニーをＰＣＲで同定し、制限酵素消化で確認した
。組換えプラスミドＭＤ７１０７−２３８およびＭＤ７１０７−２３９は、ＡＤＨプロモ
ーターおよびターミネーターを有する酵母発現カセット中にＥ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ^＊５
４遺伝子を含んでいた。

Ｇｅｉｔｚら（１９９５）によるＬｉＯＡｃ法の後に、組換えプラスミドをＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ ＳＷＹ５細胞中へ形質転換した。酵母株はｕｒａおよびｈｉｓ栄養要求
選択マーカーを有する。酵母形質転換体を２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジンを補充したＳＣ
Ｅ（−）培地のプレーと上で選択した（表２２）。形質転換酵母細胞株を分析してＧｌｍ
ＳおよびＧＮＡ１活性、およびグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンレベルを分
析する。

（酵母中の発現のためのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｌｍＳ遺伝子のクローニング）
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ野生型ｇｌｍＳを発現ベクターｙＥｐ３５２−ＡＤＨ１中にクロ
ーニングした。順方向プライマーｎＤＭ７１０７−０２３および逆転プラーマーｎＤＭ７
１０７−０２４を合成し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ野生型ｇｌｍＳ遺伝子のコード配列を増
幅した。クローニングを助長するため、制限部位を末端に取り込んだ。以下の配列を有す
る順方向プライマーｎＤＭ７１０７−０２３および逆転プラーマーｎＤＭ７１０７−０２
４を用いて、ｇｌｍＳコード配列を標準条件下にてＰＣＲで増幅した：ｎＭＤ７１０７−
０２３（ＫｐｎＩ）：５’−ＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＣＧＴＡＧＧ
ＴＴＡＴＡＴＣ−３’（配列番号８２）およびｎＭＤ７１０７−０２４（ＳｐｈＩ）：５
’−ＴＡＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＣＴＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡ−３’（
配列番号８３）。プライマーＤＭ７１０７−０２３は配列番号８２のヌクレオチド１１〜
３４で表されるｇｌｍＳコード配列の２４ヌクレオチドを含み、プライマーｎＭＤＭ７１
０７−０２４は配列番号８３のヌクレオチド１０〜３４で表されるｇｌｍＳコード配列の
２５ヌクレオチドを含む。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｍＳ遺伝子を含むプラスミドｐＳＷ０７−１５＃８３（実施例
２に記載のプラスミド）をＰＣＲ反応のＤＮＡ鋳型として使用した。予想されるサイズの
ＰＣＲ生成物の単一バンドがＴａｑポリメラーゼを用いる標準ＰＣＲ条件下で生成した。
ＰＣＲ生成物を適当な制限酵素で消化し、アガロースゲルで精製し、同じ酵素で予め消化
したｙＥＰ３５２−ＡＤＨ−１中へクローニングした。ＤＮＡライゲーション生成物をア
ンピシリン選択でＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中へ形質転換した。まず、コロニー
の１０個のプール（プール当たり１０コロニー）を順方向および逆方向プライマーを用い
るＰＣＲでスクリーニングした。次いで陽性プール中の個々のコロニーをＰＣＲで同定し
、制限酵素消化で確認した。組換えプラスミドＭＤ７１０７−２４０およびＭＤ７１０７
−２４１は、ＡＤＨプロモーターおよびターミネーターを有する酵母発現カセット中にＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｍＳ遺伝子を含んでいた。

組換えプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＷＹ５細胞中へ形質転換した。形質
転換した酵母を２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジンを補充したＳＣＥ（−）培地のプレート上
で選択した。形質転換細胞株を分析してＧｌｍＳおよびＧＮＡ１活性、およびグルコサミ
ンおよびＮ−アセチルグルコサミンレベルを測定した。

（酵母中の過剰発現のためのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＮＡ１のクローニング
ＳｃＧＮＡ１コード配列を含むフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよ
びＳａｃＩを使用し、プラスミドｐＳＷ０７―６０＃３（上記実施例１３に記載）から消
化した。得られたフラグメントをシャトルベクターｐＡＤＨ３１３−９５６のＥｃｏＲＩ
およびＳａｃＩ部位中にライゲートした。この方法のクローニングはＳｃＧＮＡ１コード
配列をＡＤＨ１プロモーターとターミネーターの間に置く。このベクターはヒスチジン選
択マーカーを含む。得られたプラスミドｐＳＷ０７−１１４（＃１および＃１８）をＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＷＹ５細胞中へ形質転換した。酵母形質転換体を２０ｍｇ／ｌ
のウラシルを補充したＳＣＥ（−）培地のプレーと上で選択した。形質転換酵母細胞株を
分析して、ＧｌｍＳおよびＧＮＡ１活性、およびグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコ
サミンレベルを測定する。

ＳｃＧＮＡ１発現カセットを有するプラスミドも、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｍＳ^＊５４コン
ストラクトまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｍＳコンストラクトで既に形質転換された酵母
細胞株中に形質転換される。

（実施例２１）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミン生産を改選するためのＥ．ｃｏｌｉ株７１０７−
９２の無秩序突然変異誘発を説明する。

７１０７−９２株（染色体中に組み込まれたＴ７−ｇｌｍＳ^＊５４およびＴ７−ＳｃＧ
ＮＡ１を有する；実施例１６に記載）をＵＶ光線で突然変異させ、米国特許第６、３７２
、４５７Ｂ１号に記載の通り８８２個の単離コロニーをＧｌｃＮ栄養要求バイオアッセイ
で分析した。グルコサミン栄養要求株Ｅ．ｃｏｌｉ ２１２３−１５を指示株として使用
した。ハローサイズに基づき、１９個の突然変異体を選択し、単離のためにストリークし
、各５個のコロニーを再評価した。２種の突然変異体７１０７−５１２および７１０７−
５１３が最大のハロー直径を示した。それらをフラスコ培養での評価のために保存した。
突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０７−５１２（ＡＴＣＣ番号 ）および７１０７−
５１３（ＡＴＣＣ番号 ）を、ブダペスト条約（特許手続きのための微生物寄託の
国際承認に関するブタペスト条約）の条項により、２００３年７月１日にＡｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１
５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｕｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）に寄託した。

突然変異体を親株と比較した。全ての株は５ｇ／ｌのリボースと５ｇ／ｌの酵母抽出物
を湯含むＭ９Ｂ培地中、二つの異なった条件下で生育した。一つのセットの培養細胞は３
０ｇ／ｌのグルコースと０．２ｍＭのＩＰＴＧを含む培地中で生育した（ＩＰＴＧ誘導）
。もう一方のセットの培養細胞は１０ｇ／ｌのグルコースと４０ｇ／ｌのラクトースを含
む培地中で生育した。一度グルコースが欠乏すると培養細胞はラクトースで誘導された（
ラクトース誘導）。ＩＰＴＧ誘導下では、突然変異体７１０７−５１２によるＮ−アセチ
ルグルコサミンの生産は親株と同程度であった。突然変異体７１０７−５１３は親株より
多くのグルコサミン、すなわち７１時間の時点で３６％多く生産した。先に観察された様
に、親株はラクトース誘導下でＩＰＴＧ誘導下より高いレベルのＮ−アセチルグルコサミ
ンを生産した。２種の突然変異体は同じレベルのグルコサミンを生産したが、それは７１
時間の時点で親株より約２８％高かった。突然変異の遺伝子座は未定であり、突然変異体
中でＮ−アセチルグルコサミン生産の向上の機構は知られていない。僅か９００個の突然
変異体クローンがスクリーニングされただけなので、データは無秩序突然変異誘導で生産
宿主がさらに改善される可能性を明らかに示している。

（実施例２２）
以下の実施例は、ＮＡＧ生産が生育と組み合わされない様なｐｆｋＡ欠失を有する突然
変異ＮＡＧ生産株の作製を説明する。

ホスフォフラクトキナーゼはフラクトース−６−燐酸（Ｆ−６−Ｐ）からフラクトース
−１、６−二燐酸の精製を触媒する、グリコリシスにおける主な調節酵素である。ｐｆｋ
ＡでコードされるＥ．ｃｏｌｉ中の主要ホスフォフラクトキナーゼは、ホスフォフラクト
キナーゼ活性の９０％を提供する。活性の残りの１０％はｐｆｋＢでコードされる少数の
ホスフォフラクトキナーゼで供給される。ＮＡＧ生産株では、過剰発現されたＧｌｍＳ^＊
５４がＦ−６−Ｐのグルコサミン−６−燐酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）への変換を触媒し、過
剰発現したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のグルコサミン−６
−燐酸アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡ１）の作用によりＧｌｃＮ−６−ＰはＧｌｃ
ＮＡｃ−６−Ｐへ変換される。

実施例２２に記載された実験の根拠は以下の通りである。炭素源の組み合わせ（すなわ
ちグルコースおよびフラクトース）によるｐｆｋＡ突然変異株の生育により、生育がＮＡ
Ｇ生産と結合しなくなる。ｐｆｋＡ突然変異株はグルコースを炭素源として良好に生育し
ないので、細胞生育にフラクトースが使用される。取り込まれたフラクトースはｆｒｕＡ
およびｆｒｕＫ遺伝子生成物の作用によりフラクトース−１、６−二燐酸に変換され、そ
れがグリコリシス経路に入ることができる。取り込みによりグルコースが燐酸化され、生
成したグルコース−６−燐酸がｐｇｉ遺伝子生産物、すなわちホスフォグルコースイソメ
ラーゼによりＦ−６−Ｐに変換される。ｐｆｋＡ遺伝子が欠失すると、少数のＰｆｋＢア
イソザイムのみがＦ−６−ＰのＦ−１、６−二燐酸への変換に関与する。この変換は制限
され得る。その結果、過剰発現ＧｌｍＳ^＊５４によりグルコサミン−６−燐酸への変換に
使用し得るＦ−６−Ｐの量が増加すると考えられる。従って、ｐｆｋＡの欠失はＦ−６−
Ｐのグリコリシス経路中への流れを減少させ、より多くの炭素をグルコサミン生産へ向け
る潜在力となる。ＳｃＧＮＡ１を過剰発現する生産株では、これにより究極的にＮＡＧ力
価が増加することになる。

（ｐｆｋＡ欠失株の作製）
温度感受性選択法を用いて生産株のゲノムにｐｆｋＡ欠失が加えられた。これには欠失
のためにｐｆｋＡを標的とする組み込みベクターの構築が必要であった。ベクター構築の
第一工程はｐｆｋＡコード配列＋Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡ由来の隣接領域
を含む配列を増幅することである。ｐｆｋＡの公開された配列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１
９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）に基づき、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ遺伝子からプライマーを合成した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは順方向プラ
イマー０７−８９および逆方向プライマー０７−９０であり、以下の配列を有した：０７
−８９：５’−ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＴＣＡＡＴＣＴＴＡＴＧＧＡＣＧＧＣ−
３’（配列番号８６）および０７−９０：５’−ＧＡＧ ＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＴ
ＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＡＡＣＧＴＡＣ−３’（配列番号８７）。

プライマー０７−８９はＮｏｔＩ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号８６のヌクレオチ
ド３〜１０で表される）を含み、ｐｆｋＡ ＡＴＧ開始コドン（配列８６のヌクレオチド
１１〜３２で表される）の上流の１０８３塩基対に位置するｙｉｉＰコード配列のＡＴＧ
開始コドンを増幅する。プライマー０７−９０はＳａｌＩ部位（ＧＴＣＧＡＣ、配列番号
８７のヌクレオチド３〜８で表される）を含み、ｐｆか停止コドン（配列番号８７のヌク
レオチド９〜３７で表される）の下流の３１０塩基対に位置するｓｂｐコード配列の翻訳
停止コドンから増幅する。標準プロトコールを使用してＰＣＲを行い、ＮｏｔＩおよびＳ
ａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側面するｙｉｉＰ、ｐｆｋＡおよびｓｂｐコード領
域を含むフラグメントを生成する。製造業者が供給する材料と指示書を用いて、このフラ
グメントをベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^ＡＭＰＳＫ（＋）（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣ
ｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にクローニングした。得られた
プラスミドをｐＳＷ０７−６１と呼ぶ。

温度感受性組み込みベクターを作成するため、ｐＭＡＫ７０５の温度感受性レプリコン
（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７１（９）：４６１７―４６２）、
およびプラスミドｐＵＣ４Ｋのカナマイシン耐性カセット（ＡｍｅｒｈａｍＰｈａｒａｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むフラグメントを制限エ
ンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩでプラスミドｐＫＬＮ０７−２１から切除した
。ｐｆｋＡ＋側面領域をプラスミドｐＳＷ０７−６１〜制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ
で消化した。二つのフラグメントを互いににライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−６３
を作成した。

ｐｆｋＡのコード配列に欠失を作成するため、プラスミドｐＳＷ０７−６３をＰｖｕＩ
Ｉで完全に消化し、次いでＡｈｄＩで部分消化した。これによりｐｆｋＡコード配列の７
８１塩基対を除去した。ｐｆｋＡ欠失を含むフラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処
理し、末端に充填し、得られた鈍端フラグメント自体をライゲートし、プラスミドｐＳＷ
０７−６４を得た。

ｐｆｋＡ欠失を含む株を作るため、プラスミドｐＳＷ０７−６４をＥ．ｃｏｌｉ７１０
７−１８中に形質転換した。温度感受性選択と継代培養プロトコールの後、グルコースを
炭素源として含む制限培地プレート上の遅延生育でカナマイシン感受性コロニーをスクリ
ーニングした。ｔｉｉＰ部分およびｐｆｋＡ配列を含む１１５３塩基対フラグメントを用
い、標準ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで株を確認した。これらの株を
７１０７−９０１）および７１０７−９０（２）と呼ぶ。

０．０５４および０．０３５ｍｍｏｌ ｍｉｎ^−１ｍｇ^−１タンパク質のｐｆｋの比活
性が７１０７−９０（１）および７１０７−９０（２）株でそれぞれ観測された。野生型
ｐｆｋＡ遺伝子を有する対照株では、０．７８のｍｍｏｌｍｉｎ^−１ｍｇ^−１タンパク
質の比活性が検出された。従って、ｐｋｆＡ突然変異体は対照株で観測された活性の約５
〜６％のＰｆｋ活性を有していた。この残存Ｐｆｋ活性はＰｆｋＢアイソザイムの寄与で
あることは疑いない。

（Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの７１０７−９０（１）および７１０７−９０
（２）株中への組み込み）
７１０７−９０株がグルコサミン生産株７１０７−１８株から誘導され、従ってそれら
の株は測定し得るＮＡＧを生産しない。ｐｆｋＡ欠失を有するＮＡＧ生産株を作成するた
めには、Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１発現カセットを株中に導入する必要がある。先に記
載した戦略後、Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＮＧＡ１の発現カセットを７１０７−９０（１）およ
び７１０７−９０（２）株中の染色体のｍａｎＸＴＺ部位へ組み込み、７１０７―６０２
および７１０７−６０３株をそれぞれ作成した。ＳｃＧＮＡ１コード配列を含むフラグメ
ントをプローブとして用いる標準高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで、
これらの株がｍａｎＸＹＺ欠失部位に組み込みＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を有することを
確認した。

（７１０７−６０２および７１０７−６０３株の振盪フラスコスクリーニング）
グルコース／フラクトースの様々な混合物を用い、７１０７−６０２（１）および７１
０７−６０３（１）株を振盪フラスコスクリーニング４８で試験した。培養細胞を０．２
ｍＭＩＰＴＧで２４時間後に誘導した。これらの株は対照株７１０７−９２８１）より多
くのＮＡＧを生産しなかったが、興味のあることに、これらの株は試験したどの条件下で
もほとんど酢酸を生成しなかった。振盪フラスコスクリーニング５３により、７１０７−
６０２（１）および７１０７―６０３（１）株をラクトース誘導条件下で再度試験したが
、これらの株で酢酸は生成されず、ＮＡＧレベルは対照株７１０７−９２（１）で見られ
たレベルと同程度であった。

７１０７−６０２（１）株中の酢酸生成をさらに評価するため、酵母抽出物（ＹＥ）、
リボースまたはごく微量元素（ＴＥ）の添加を含む、通常は酢酸生成を増加させる条件下
で振盪フラスコスクリーニング５６を行った。培養細胞を修飾Ｍ９Ｂ培地中で生育させた
［６ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４、２４ｇ／ｌＫ_２ＨＰＯ_４、１ｇ／ｌ クエン酸Ｎａ_３・２Ｈ_２
Ｏ、１０ｇ／ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（燐酸塩でｐＨ７．４に調整）］。低レベルの微量金
属（０．３ｍｇ／ｌＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３７５ｍｇ／ｌＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
、０．０２ｍｇ／ｌＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、
０．００１ｍｇ／ｌＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００１ｍｇＬＨ_３ＢＯ_３、および０
．００１ｍｇ／ｌＣｏＣｌ２・６Ｈ_２Ｏ）または高レベルの微量金属（１２ｍｇ／ｌＦｅ
ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３７５ｍｇ／ｌＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．８ｍｇ／ｌＭｎＳ
Ｏ_４・Ｈ_２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌＮａＭ
ｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００１ｍｇＬＨ_３ＢＯ_３、および０．００１ｍｇ／ｌＣｏＣｌ
２・６Ｈ_２Ｏ）を表２４に示す様に加えた。培養液に０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２
Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ_２Ｏ、１０ｇ／ｌのグルコースおよび２０ｇ／
ｌのラクトースを補充した。さらに５ｇ／ｌのリボースおよび／または５ｇ／ｌの酵母抽
出物を表２４に示す様に加えた。培養細胞を３６℃で２４時間培養し、ついで２５℃に切
り替えた。１２時間でグルコース欠乏培地に２０ｇ／ｌのグルコースを加え、ｐＨを７．
２に調節した。２４、３０、４８および５４時間で培養液のｐＨを７．２に調節し、ＨＰ
ＬＣの結果に基づいてグルコースを一日当たり３０ｇ／ｌ加えた。５ｇ／ｌの（ＮＨ４）
２ＳＯ４を２４、３０、４８および５２時間でアンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下し
たフラスコに加えた。

（表２４．７１０７−６０２（１）および７１０７−９２（１）株における酢酸生成に
対する微量金属、リボースおよび酵母抽出物レベル変化の効果）

対照株７１０７−９２（１）が高レベルの酢酸を生産する様に誘導するために設計され
た条件下でも、７１０７−６０２（１）株中の酢酸生成はないか比較的低い（表２３）。
さらに、ＯＤ測定値は７１０７−６０７（２）株で低い傾向にあったが、これらの培養で
全体的により高い力価が見られた。従って、ｐｆｋＡ突然変異体はＮＡＧ生産宿主として
使用するに適している様に思われる。

（実施例２３）
本実施例はグルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）遺伝子のクローニングと過剰発現、Ｔ
７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み、およびＧｌｃＮ／Ｇ
ｌｃＮＡｃに対するｇｌｎＡ遺伝子の過剰発現の効果を説明する。

グルタミンは窒素をアミノ糖その他の化合物に提供するアンモニア同化作用の１次生成
物である。ｇｌｎＡでコードされるグルタミンシンテターゼはＮＨ_３とＡＴＰを要求する
反応でＬ−グルタミンのＬ−グルタミン酸への変換を触媒する。Ｌ−グルタミンはグルコ
サミン−６−燐酸の生合成に必要であり、ＧｌｍＳはＬ−グルタミンとＦ−６−ＰがＤ−
グルコサミン−６−ＰおよびＬ−グルタミンに変換される反応を触媒する。ＧｌｃＮ／Ｇ
ｌｃＮＡＣ生産が最高レベルになるためには、細胞内に適切なレベルのグルタミンが存在
することが必須である。ｇｌｎＡ遺伝子の過剰発現はグルタミンレベルを増加させ、最終
的にＧｌｃＮおよび／またはＮＡＧ力価を増加させると思われる。

（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＡ遺伝子のクローニングと過剰発現）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｎＡのクローニングと過剰発現のために、ｇｌｎＡの公表された配
列（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−
１４７４）に基づいて合成した。Ｅ．ｃｏｌｉｇｌｎＡ遺伝子コード配列のヌクレオチド
配列が配列番号８８と呼ばれる配列ファイル中に列記されている。Ｅ．ｃｏｌｉＧｌｎ
Ａタンパク質の推定アミノ酸配列が配列番号８９と呼ばれる配列ファイルに列記されてい
る。プライマーを使用してＥ．ｃｏｌｉ７１０１−１７（ＤＥ３）ゲノムＤＮＡからｇｌ
ｎＡコード配列をＰＣＲで増幅した。増幅に使用したプライマーは前方プライマー０７−
ｇｌｎおよび逆方向プライマー０７−１５であり、以下の配列を有する：０７−ｇｌｎ：
５’−ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＴＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＣＧＴＡＣＴＧＡＣ−２
’（配列番号９０）、および０７−１５：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＣＧＴ
ＴＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号９１）。

プライマー０７−ｇｌｎはＢｓａＩ部位（ＧＧＴＣＴＣ、配列番号９０のヌクレオチド
５〜１０で表される）、およびＡＴＧ開始コドンからのｈｌｎＡコード領域の２３ヌクレ
オチド（配列番号９０のヌクレオチド１３〜３５で表される）を含む。プライマー０７−
１５はＸｈｏ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号９１のヌクレオチド５〜１０で表される）、
および翻訳停止コドンからのｇｌｎＡコード配列の２１ヌクレオチドを含む。標準条件下
でＰＣＲを行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側面するｇｌｎ
Ａコード配列を含むフラグメントを作成した。

ｇｌｎＡを含むＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよびＸｈｏＩ
で消化し、ベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、
ＷＩ）のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位へライゲートしてプラスミドｐＫＬＮ０７−２８を
作成した。この方法によるクローニングは、ｇｌｎＡ配列をＴ７ｌａｃプロモーターの後
ろに置き、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｎＡの発現カセットを生成する。

（Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換えｇｌｎＡの機能発現）
ｇｌｎＡの機能発現を試験するため、組み換えプラスミドｐＫＬＮ０７−２８を７１０
７−１８株中に形質転換し、７１０７−１６３株を作成した。７１０７−１８株をｐＥＴ
２４ｄ（＋）空ベクターで形質転換して対照株７１０７−８８を調製した。培養細胞をＬ
Ｂ中で生育させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する標準誘導プロトコールに従った。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥのために試料を採取し、ＧｌｎＡタンパク質の過剰発現を確認した。ＧｌｎＡタ
ンパク質の予想されるタンパク質サイズは約５２ｋＤａである。約５２ｋＤａの過剰発現
タンパク質が見出された。ほとんどの過剰発現タンパク質は不溶性である様に思われ、可
溶性分画には僅かしか見出されなかった。対照株にはこの様な過剰発現タンパク質は見ら
れず、過剰発現タンパク質がＧｌｎＡ酵素であることを示している。

（Ｅ．ｃｏｌｉ染色体中へＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡを直接組み込むためのベクターの構築
）
ｇｌｎＡ遺伝子の過剰発現が成功したことを確認したので、次の工程はＴ７ｌａｃ−ｇ
ｌｎＡカセットを生産株のゲノムに組み込むことである。この目的のために組み込みベク
ターを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉｐｆｋＢ遺伝子を組み込みの標的部位として選んだ。ｐｆ
ｋＢは全ホスフォフラクトキナーゼ活性のわずか１０％を占めるＥ．ｃｏｌｉ中のホスフ
ォフラクトキナーゼの少数アイソザイムをコードする。従って、この遺伝子座へのこのカ
セットの組み込みは株の性能に重大な影響を及ぼしてはならない。

組み込みベクターを作成する戦略の一部として、ｐｆｋＢ＋側面領域をＰＣＲでＥ．ｃ
ｏｌｉＷ３１１０から増幅した。ｐｆｋＢ＋その側面領域の公開された配列（Ｂｌａｔｔ
ｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）に基
づいてプライマーを合成した。ｐｆｋＢ領域を増幅するために用いたプライマーは前方プ
ライマー０７−１６および逆方向プライマー０７−１７であり、以下の配列を有した：０
７−１６：５’−ＧＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＧＣ−３’
（配列番号９２）、および０７−１７：５’−ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣ
ＴＡＡＴＡＡＴＣＴＡＴＣＣ−３’（配列番号９３）。

プライマー０７−１６はＮａｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＧＧＧＣ、配列番
号９２のヌクレオチド５〜１０で表される）と、ｐｆｋＢ開始コドンの上流の１０４２塩
基対に位置する推定翻訳停止コドンで始まるＯＲＦｂ１７７２の１９塩基対（配列番号９
２のヌクレオチド１１〜２９で表される）を含む。プライマー０７−１７はＰｓｔＩ制限
エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＧＣＡＧ、配列番号９３のヌクレオチド５〜１０で表され
る）、およびｐｆｋＢ停止コドンの下流の１３５７塩基対に位置する推定翻訳停止コドン
で始まるＯＲＦｂ１７２５の２２塩基対（配列番号９３のヌクレオチド１１〜３２で表さ
れる）を含む。標準条件下でＰＣＲを行い、ＮａｅＩおよびＰｓｔＩ制限エンドヌクレア
ーゼ部位が側面するＯＲＦｂ１７２２、ｐｆｋＢ、ＰＲＦｂ１７２４およびＰＲＦｂ１７
２５を含むフラグメントを作成した。得られたフラグメントをベクターＰＣＲ−Ｓｃｒｉ
ｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にライゲートし、プラスミドｐＫＬＮ０７−１４を作成した。

次の工程はプラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＰｈａｒａｍａｃｉａＢｉｏｔ
ｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のカナマイシン耐性カセットをプラスミドｐＫＬ
Ｎ０７−１４に加えることである。カナマイシン耐性カセットをｐＵ４Ｋから制限エンド
ヌクレアーゼＰｓｔＩで切除した。プラスミドｐＫＬＮ０７−１４を同様に制限エンドヌ
クレアーゼＰｓｔＩで消化し、それによりＯＲＦｂ１７２５推定コード配列の３８５塩基
対を含むプラスミドの４１２塩基対を除去した。カナマイシン耐性カセットをプラスミド
ｐＫＬＮ０７−１４の骨格のＰｓｔＩ部位中へライゲートし、プラスミドｐＫＬＮ０７−
１７を作成した。次にプラスミドｐＫＬＮ０７−１７を制限エンドヌクレアーゼＳｎａＢ
ＩおよびＢｔｒＩで消化し、プラスミドからｐｆｋＢコード配列の８７０塩基対を除去し
た。

Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを含むフラグメントをプラスミドｐＫＬＮ０７−２８か
ら制限エンドヌクレアーゼＮａｅＩで切除し、Ｔ７プロモーターの上流の５０塩基対と１
６４Ｔ７ターミネーターの下流の１６４塩基対が側面するＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセット
を含むフラグメントをベクターｐＥＴ２４ｄ（＋）から作成した。ＮａｅＩフラグメント
をプラスミドｐＫＬＮ０７−１７のＳｎａＢおよびＢｔｒＩ部位中にライゲートし、プラ
スミドｐＫＬＮ０７−２９を作成した。

最終工程はｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レプリコンを、ｐｆｋＢ欠失部位中のＴ７
ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを含むプラスミドｐＫＬＮ０７−２９由来のフラグメントと、
カナマイシン耐性カセットへ加えることである。プラスミドｐＫＬＮ０７−２９を制限エ
ンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｎＡとカナマイシ
ン耐性カセットを含むフラグメントをｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ骨格から放出した。プラスミ
ドｐＫＬＮ０７−２０（上記）をＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、温度感受性レプリコ
ンを含むフラグメントを切除した。二つのフラグメントを共にライゲートし、温度感受性
レプリコン、カナマイシン耐性カセット、およびｐｆｋＢ欠失部位中へライゲートされた
Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｎＡを含むＥ．ｃｏｌｉゲノム配列を含むプラスミドｐＫＬＮ０７−３
０を作成した。温度感受性選択および継代培養プロトコール後に、プラスミドｐＫＬＮ０
７−３０を使用してＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを染色体のｐｆｋＢへ直接組み込むこ
とができる。

プラスミドｐＫＬＮ０７−３０をグルコサミン生産株７１０７−１８中へ形質転換した
。温度感受性選択と継代培養プロトコールに従い、ｐｆｋＢ欠失部位におけるＴ７ｌａｃ
−ｇｌｎＡカセットの存在につき、カナマイシン感受性コロニーを標準ＰＣＲプロトコー
ルを用いてスクリーニングした。ｇｌｎＡコード配列を含むフラグメントをプローブとし
て用い、ＰＣＲで同定されたいくつかの株を高ストリンジェントサザンハイブリダイゼー
ションで確認した。これらの株を７１０７−１１８および７１０７−１２３と呼ぶ。

（７１０７−１１８、７１０７−１１９０７０および７１０７−１２０株中へのＴ７ｌ
ａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込み）
７１０７−１１８、７１０７−１１９０７０および７１０７−１２０株をグルコサミン
生産株７１０７−１８から誘導した；従ってそれらの株は測定可能なＮＡＧを生産しない
。ｇｌｎＡ発現カセットを有するＮＡＧ生産株を作成するためには、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧ
ＮＡ１発現カセットを株中に導入する必要がある。上記の様に、Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮ
Ａ１の発現カセットを７１０７−１１８、７１０７−１１９および７１０７−１２０株の
染色体のｍａｎＸＹＺへ組み込み、７１０７−１２５株（７１０７−１１９由来）、７１
０７−１２６株（７１０７−１２０由来）、７１０７−１３２株（７１０７−１１８由来
）、７１０７−１３３株（７１０７−１１８由来）および７１０７−１３４株（７１０７
−１１９由来）を作成した。ＳｃＧＮＡ１コード配列を含むフラグメントをｍａｎＸＹＺ
欠失部位に組み込みＴ７ｌａｃ−ＳｖＧＮＡ１を有するプローブとして用い、これらの株
を高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーションで確認した。

（振盪フラスコスクリーニング５１：ＮＡＧ生産の背景における組み込みＴ７ｌａｃ−
ｇｌｎＡの過剰発現試験）
組み込みＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを含む７１０７−１２５、７１０７−１２６お
よび７１０７−１３３株を評価するため、振盪フラスコスクリーニング５１を行った。培
養細胞を微量金属と以下の物質を補充したＭ９Ｂ培地中で生育させた：０．６ｇ／ｌＭｇ
ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１０ｇ／ｌグルコース、４
０ｇ／ｌ ラクトース、５ｇ／ｌ リボースおよび５ｇ／ｌ酵母抽出物。培養細胞を３０
℃で２５時間生育させ、次いで２５℃に切り替えた。２４時間および４８時間で培養液の
ｐＨを７．２に調節し、グルコースを３０ｇ／ｌに加え、アンモニアレベルが１ｇ／ｌ以
下に下がったフラスコ中に（ＮＨ４）_２ＳＯ_４を２４時間および４８時間に加えた。ＮＡ
ＧレベルのＯＤ測定のため２４時間、４８時間および７２時間で試料を採取した。酵素活
性分析のため培養細胞を７２時間で収穫した。

表２５に示す様に、ｇｌｎＡを過剰発現する株は対照株７１０７−９２（１）より若干
良好で、約８％多いＮＡＧを生産した。窒素制限で無いので、アンモニアが不足する株は
なかった。ｇｌｎＡ過剰発現株中のＧｌｍＳおよびＧＮＡ１酵素活性は対照株７１０７−
９２（１）と同程度であった。まとめると、ｇｌｎＡの過剰発現により、最適条件下で顕
著であるＧＮＡ力価が若干改善する様に思われる。

（表２５．ｇｌｎＡを過剰発現する株における細胞生育、酵素活性およびＧｌｃＮＡｃ
生産）

１）ＯＤ、酵素活性およびＧｌｃＮＡｃレベルを７２時間の時点で測定した。
２）酵素活性はμｍｏｌ ｍｉｎ^−１ｍｇ^−１タンパク質で記載されている。

（組み込みＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡを有するＮＧＡ生産株を試験するための醗酵実験）
次に組み込みＴ７ｌａｃ−ｇｌｎＡカセットを含む７１０７−１３３株を１リッター醗
酵槽中で評価した。醗酵槽を初期容積４７５ｍｌに設定した。醗酵培地の成分を表２６に
列記する。７５％ＮＨ４ＯＨをｐＨ制御に用いて醗酵を行った。醗酵中、温度を３７℃に
保った。溶存酸素濃度を飽和濃度の２０％に保つため、曝気と攪拌を調節した。６５％グ
ルコースをコンピュータープログラムで制御された供給速度で供給し、接種時の生育速度
０．４０／時間、６時間で最大速度５ｍｌ／時間とした。グルコースを連続的に供給し、
１０時間で５ｇ／ｌの食品グレードラクトースを添加して培養細胞を、誘導した。

７１０７−１３３株からの醗酵結果を、同じ条件で行った醗酵２３７で先に行った７１
０７−９２（１）株の結果と比較した。これらの株は双方とも、組み込みＴ７ｌａｃ−Ｓ
ｃＧＮＡ１の１個のコピーを含む。その結果は７１０７−１３３株中のＴ７ｌａｃ−ｇｌ
ｎＡカセットの存在が、７１０７−９２（１）株より若干有利であることを示している。
７１０７−９２（１）株において５９．８時間で９６．６ｇ／ｌのＮＡＧと比較して、７
１０７−１３３株は５９．６時間で１０７．１ｇ／ｌのＮＡＧを達成した。

（表２６．醗酵培地の成分）

＊微量金属組成はＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ５ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ３．７５ｍ
ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ０．６ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１００２ｍｇ
／ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ_２Ｏ ０．１００２ｍｇ／ｌ
（実施例２４）
本実施例はクローニング、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）遺伝子の
過剰発現、Ｔ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み、およびＴ
７プロモーターの制御下におけるｚｆｗ過剰発現のＮＡＧ生産に対する効果を説明する。

ペントース燐酸経路でアミノ酸、ヌクレオチドおよび細胞壁生合成のための中間体が提
供される。さらに、ペントース燐酸経路の酸化部分は細胞中のＮＡＤＰＨも重要な材料で
ある。Ｅ．ｃｏｌｉのｚｗｆ遺伝子はペントース燐酸回路で第一工程を触媒するグルコー
ス−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＦＨ）をコードし、グルコース−６−燐酸をグル
クノ−１、５−ラクトンに変換する。ｚｗｆ遺伝子の発現は細胞生育速度と同調する（Ｒ
ｏｗｌｅｙ、Ｄ．およびＷｏｌｆ、Ｒ．、Ｊ．Ｂａｃ．、１９９１、１７３（３）：９６
８−９７７）。

ＮＡＧまたはＧｌｃＮで生育可能なＥ．ｃｏｌｉ単離株が文献に報告されている（Ｊ．
Ｂａｃ．、１９７０、１０１：３８４−３９１）。著者らは、アミノ糖燐酸の蓄積がホス
ホヘキソースイソメラーゼおよびフルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼで触媒される反
応を阻害し、ペントース欠乏になり得ると推定している。ペントースまたはグルコン酸の
添加により、これらの株の阻害が解除された。

ＧｌｃＮ／ＧｌｃＮＡｃを生産する組換えＥ．ｃｏｌｉ株はアミノ糖燐酸をあるレベル
で蓄積し得る。この場合、グルコン酸またはリボース等のペントースの添加により、ＮＡ
Ｇ生産が増加する結果となる。ＮＡＧ生産株７１０７−８７＃２５で行われた振盪フラス
コ実験は、リボースまたはグルコン酸の添加により、生育とＮＡＧ力価の両方が増加した
ことを示した。従って、ペントースまたはグルコン酸の添加により軽減されるペントース
欠乏をＮＧＡ生産株が経験した様に思われる。

外因性ペントースを添加せずにペントース欠乏を軽減する戦略として、ＮＡＧ生産株中
でｚｗｆ遺伝子を過剰発現することが決定された。ｚｗｆの過剰発現が燐酸化アミノ糖の
ペントース燐酸経路に対する阻害を減少し得ると推察された。その場合、これにより我々
の株中のＮＡＧ力価を増加させるためにペントースまたはグルコン酸を供給する必要がな
くなると思われる。

（Ｅ．ｃｏｌｉ ｚｗｆのクローニングと発現）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｚｗｆの発現をクローニングするため、公開されたｚｗｆの配列に基づ
いてプライマーを合成した（Ｂｌａｔｔｅｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７
（５３３１）：１４５３−１４７４）。Ｅ．ｃｏｌｉｚｗｆ遺伝子コード配列のヌクレオ
チド配列が配列番号９４と呼ばれる配列ファイルに列挙される。Ｅ．ｃｏｌｉＺＷＦタ
ンパク質の推定アミノ酸配列が配列番号９５と呼ばれる並列ファイルに列挙される。プラ
イマーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＢＡ由来のｚｗｆコード配列をＰＣ
Ｒで増幅した。増幅に使用したプライマーは以下の配列を有する：０７−１０１：５’Ｇ
ＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号９
６）、および０７−１０２：５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＴ
ＴＣＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＣ−３’（配列番号９７）。

プライマー０７−１０１はＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＧＴＣＴＣ、配列
番号９６のヌクレオチド５〜１０で表される）と、ＡＴＧ開始コドンからのｚｗｆコード
配列の２０ヌクレオチド（配列番号９６のヌクレオチド１３〜３２で表される）を含む。
プライマー０７−１０２はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番
号９７のヌクレオチド５〜１０で表される）と、翻訳停止コドンから開始するｚｗｆコー
ド配列の２７ヌクレオチド（配列番号９７のヌクレオチド１１〜３７で表される）を含む
。ＰＣＲを標準条件下で行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側
面するｚｗｆコード配列を含むフラグメントを作成した。

ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベク
ターｐＥＴ２４ｄ（＋）（ＮｏｖａｇｅｎＩｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＮｃｏＩ
およびＸｈｏＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７１を作成した。この方法
のクローニングはｚｗｆ配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７ｌａｃプロモーターの後ろに置
き、Ｔ７ｌａｃ―ｚｗｆの発現カセットを生成する。

（Ｅ．ｃｏｌｉ中の組み換えＺＷＦタンパク質の機能的発現）
それぞれｐＥＴ２４ｄ（＋）中にＴ７ｌａｃ−ｚｗｆ発現カセットを含むプラスミドｐ
ＳＷ０７−７１＃１７、＃２０および／または＃３３をＮＡＧ生産株７１０７−９２８１
）中に形質転換し、７１０７−９６（１）株（ｐＳＷ０７−７１＃１７で形質転換）、７
１０７−９６（２）株および７１０７−９６（３）株（ｐＳＷ０７−７１＃２０で形質転
換）および７１０７−９６（２）株および７１０７−９６（３）株（ｐＳＷ０７−７１＃
２０で形質転換）、および７１０７−９６（４）株（ｐＳＷ０７−７１＃３３で形質転換
）を作成した。ｐＥＴ２４ｄ（＋）により７１０７−９２（１）株を形質転換して対照株
７１０７−９５を調製した。培養細胞ＬＢ中で生育し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する標準
誘導プロトコールに従った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に試料を誘導培養細胞から採取した。そ
の結果から、Ｇ６ＰＤＨの予想されるサイズに相当する約５６ｋＤａのタンパク質の過剰
発現が確認された。しかしながら、過剰発現されたタンパク質のほとんどは不溶性型であ
るように思われた。

４時間のＩＰＴＧ誘導後、培養細胞を収穫しグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ活
性を分析した。対照株７１０７−９５の活性０．０４ｍｍｏｌ^−１ｍｉｎ^−１ｍｇ^−１
タンパク質と比較して、７１０７−９６（２）、７１０７−９６（３）および７１０７−
９６（４）株はそれぞれ６９．７、７８．１および９０．１ｍｍｏｌ^−１ｍｉｎ^−１ｍ
ｇ^−１タンパク質のＧ６ＰＤＨ活性を有した。これにより、ＮＡＧ生産株中のｚｗｆの過
剰発現に成功したことが確認された。

（Ｔ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み）
Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７−９２＃１中の組み換えＺＷＦタンパク質の機能性発現を確認し
たので、次の工程はＴ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットをＮＡＧ生産株の染色体中へ安定に組み
込むことであった。カセットを染色体のｒｈａ領域へ組み込むことを標的とするため、組
み込みベクターを設計した。Ｅ．ｃｏｌｉのｒｈａＢＡＤ遺伝子はラムノキナーゼ、Ｌ−
ラムノースイソメラーゼおよびラムヌロース−１−燐酸アルドラーゼをそれぞれコードす
るオペロンを形成する。これらの遺伝子はラムノースの別な炭素源としての利用に関与し
、非必須遺伝子と考えられている。従って、この領域の妨害が生育またはＮＡＧ生産に影
響してはならない。

組み込みベクターを作成する最初の工程はＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡからｒ
ｈａＢＡＤ領域をクローニングすることであった。ｒｈａＢＡＤオペロン＋側面領域の公
開された配列に基づきプライマーを合成した（ Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）。ｒｈａ領域を増幅するために用
いたプライマーは前方プライマー０７−１０７および逆方向プライマー０７−１０８であ
り、以下の配列を有した：０７−１０７：５’−ＣＧＡＡＴＡＴＣＡＣＧＣＧＧＴＧＡＣ
ＣＡＧＴＴＡＡＡＣ−３’（配列番号９８）、および５’−ＣＡＣＡＴＧＧＴＧＣＣＧＡ
ＴＧＡＴＴＴＴＧＡＣＣ−３’（配列番号９９）。

プライマー０７−１０７はｒｈａ開始コドンの上流の１０９６塩基対から増幅する。プ
ライマー０７−１０８はｒｈａ停止コドンの下流の９６６塩基対から増幅する。ＰＣＲを
標準条件で行い、ｒｈａＢＡＤオペロン＋側面領域を含むフラグメントを生成した。ＰＣ
ＲフラグメントをベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にクローニングし、
プラスミドｐＳＷ０７−７２を作成した。

組み込みベクターを作成する次の工程は、Ｔ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットをプラスミドｐ
ＳＷ０７−７２中へ加えることであった。標準条件を用いて、Ｔ７−ｌａｃ−ｚｗｆカセ
ットをプラスミドｐＳＷ０７−７１から増幅した。ＰＣＲの増幅は前方プライマー０７−
１１および逆方向プライマー０７−１２２を用いて行ったが、それらのプライマーは以下
の配列を有した：０７−１１１：５‘−ＧＡＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡ
ＣＣＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１００）、および０７−１１２：５’−Ｇ
ＡＴＣＡＧＣＧＣＴＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡ
ＡＣＣＣＣ−３’（配列番号１０１）。

プライマー０７−１１１はＸｃｍ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＣＡＮＮＮＮＮＮ
ＮＮＮ ＴＧＧ、配列番号１００のヌクレオチド３〜１７で表される）を含み、ｐＥＴ２
４ｄ（＋）のＴ７プロモーター配列の上流の８０ｂｐ（配列番号１００のヌクレオチド１
８〜３５）から増幅する。プライマー０７−１１２はＡｆｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部
位（ＡＧＣＧＣＴ、配列番号１０１のヌクレオチド５〜１０で表される）を含み、Ｔ７タ
ーミネーターの下流の２５ｂｐ（配列番号１０１のヌクレオチド１１〜４０で表される）
から増幅する。得られた１．８ｋｂのＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼＸｃｍＩお
よびＡｆｅＩで消化した。

プラスミドｐＳＷ０７−７２を制限酵素ＸｃｍおよびＡｆｅＩで消化し、ｐＳＷ０７−
７２骨格から３．６ｂｐフラグメントを切除した。ＸｃｍＩおよびＡｆｅＩ末端を有する
Ｔ７ｌａｃ−ｚｗｆを含むＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＳＷ０７−７２中の切除部
位中にライゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７３を作成した。従って、プラスミドｐＳ
Ｗ０７−７３はほとんど全てのｒｈａＢＡＤオペロンの３．６ｋｂ欠失を有し、Ｔ７−ｌ
ａｃ−ｚｗｆが欠失部位に挿入される。

組み込みプラスミド構築の最終工程は、プラスミドｐＫＬＮ０７−２１由来の温度感受
性レプリコンとカナマイシン耐性カセットを加えることである。プラスミドｐＫＬＮ０７
−２１をＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、温度感受性レプリコンとカナマイシン耐性カ
セットを含むフラグメントを切除した。プラスミドｐＳＷ０７−７３を制限酵素ＮｏｔＩ
およびＫｐｎＩで消化し、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ骨格由来のｒｈａＢＡＤ側面を有する
Ｔ７−ｌａｃ−ｚｗｆを含むフラグメントを放出した。この二つのフラグメントを共にラ
イゲートし、プラスミドｐＳＷ０７−７４を作成した。プラスミドｐＳＷ０７−７４を用
いて、Ｔ７ｌａｃ−ｚｗｆをＥ．ｃｏｌｉ染色体のｒｈａ領域に直接組み込むことができ
る。

プラスミドｐＳＷ０７−７４をＮＡＧ生産株７１０７−９２（１）中に形質転換した。
温度感受性選択と継代培養プロトコールに従い、ｒｈａＢＡＤ欠失部位のＴ７ｌａｃ−ｚ
ｗｆカセットの存在につき、標準ＰＣＲプロトコールを用いてカナマイシン感受性コロニ
ーをスクリーニングした。ｚｗｆコード配列の１．０ｋｂフラグメントをプローブとして
用い、ＰＣＲで同手されたいくつかの株が高ストリンジェントサザンハイブリダイゼーシ
ョンで確認した。これらの株を７１０７−６０６（２）、７１０７−６０６（３）および
７１０７−６０６（４）と呼ぶ。

（組み込みＴ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットを有する株中におけるＮＡＧ生産）
７１０７−６０６（１）および７１０７−６０６（３）株中のＮＧＡ生産に対するＴ７
プロモーター制御下のｚｗｆ過剰発現の効果を評価するため、振盪フラスコスクリーニン
グ４６を行った。先に議論した様に、ｚｗｆの過剰発現がペントース欠乏を解除し、燐酸
化アミノ糖で生じた生育阻害をなくすことができると推定されている。０．６ｇ／ｌのＭ
ｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、４０ｇ／ｌのグルコース
および０．２ｍＭのＩＰＴＧ（遅延誘導フラスコではＩＰＴＧは２４時間に添加した）を
補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で培養細胞を生育させた。表２７に示す様に１０ｇ／ｌの
リボースと５ｇ／ｌの酵母抽出物を培養液に加えた。培養細胞を３０℃で２４時間インキ
ュベーションし、その後２５℃に切り替えた。２４時間および４８時間で、培養液のｐＨ
を７．２に調製し、グルコースを１日当たり３０ｇ／ｌに添加した。アンモニアレベルが
１ｇ／ｌ以下に低下したフラスコに５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）２ＳＯ_４を加えた。ＯＤおよび
ＮＡＤレベルの測定のため、試料を２４、４８および７２時間に採取した。培養細胞を７
２時間で収穫して酵素分析を行った。

（表２７．ｚｗｆ過剰発現株における生育、酵素活性およびＧｌｃＮＡｃ生産に対する
誘導時間の変化、リボースおよび酵母抽出物の添加の効果）

^１遅延誘導のためＩＰＴＧを２４時間に添加
^２酵素活性はμｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質で表す
^３ＮＤ：測定されず
結果は、Ｔ７プロモーターで駆動されるｚｗｆ過剰発現株が対照株より５０〜１００倍
大きいＧ６ＰＤＨ活性を有することを示す。対照株の生育と比較すると、ｚｗｆ過剰発現
によりリボースを添加しない培地中で生育が若干改善された。しかしながら、ｚｗｆを過
剰発現する株ではＧｌｍＳ活性が減少する傾向にあり、ＮＡＧ生産レベルは対照株７１０
７−９２（１）で見られたレベルに達しなかった。これはグルコース経路から離れてペン
トース経路へ入り込む炭素の量が多すぎることを示している。

（実施例２５）
本実施例はグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）遺伝子のクローニング、
天然型プロモーターを有するｚｗｆ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み、および
天然型プロモーターの制御下におけるｚｗｆ過剰発現発現の細胞生育およびＮＡＧ生産に
対する効果を説明する。

（天然型プロモーターおよび調節領域を有するＥ．ｃｏｌｉのクローニング）
実施例２４に記載した通り、生育とＮＡＧ生産を改善するための戦略の一部として、組
み込みＴ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットを有する株を構築した。ｚｗｆの過剰発現により燐酸
化アミノ糖のペントース燐酸経路に対する阻害が減少すると推定された。その場合、我々
の株中のＮＡＧ力価を増大するためにさらに、ペントースまたはグルコースを供給する必
要がなくなると考えられる。

組み込みＴ７ｌａｃ−ｚｗｆカセットを含む７１０７−６０６株は対照株より若干生育
が良く、ペントース欠乏が部分的に軽減されていることを示している。しかしながら、Ｎ
ＡＧ生産に関しては対照株ほど良くなかった。これは、高すぎるＺＷＦタンパク質の発現
レベルを与える強いＴ７プロモーターを使用しているためと思われる。グルコース−６−
燐酸デヒドロゲナーゼの活性が高すぎると、ペントース燐酸経路へ流れる炭素の量が多す
ぎて望ましくない。従って、ｚｗｆの発現が細胞で調節される様に、ｚｗｆをその天然型
プロモーターで過剰発現させることを決定した。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｚｗｆは生育速度に
依存して調節されている。さらに、ｚｗｆはｚｏｘＲＳレギュロンと複数の抗生物質耐性
（ｍａｒ）の一員である。従って、天然型ｚｗｆのクローニングには天然型プロモターば
かりでなく、“Ｓｏｘｂｏｘ”等の調節領域も含まれる（Ｆａｗｃｅｔｔ、Ｗ．およびＷ
ｏｌｆ．Ｒ．、Ｊ．Ｂａｃ．、１７７（７）：１７４２−１７５０）。染色体上にｚｗｆ
のコピーが二つ存在することは、ＮＡＧ生産経路等、他の経路を通る炭素フローに大きく
影響せず、ペントース燐酸経路を通るフローを増加し得ると考えられる。

Ｅ．ｃｏｌｉ ｚｗｆの発現をクローニングするため、ｚｗｆ遺伝子の公開された配列
に基づいてプライマーを合成した（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
７７（５３３１）：１４５３−１４７４）。Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０下のゲノムＤＮＡか
らｚｗｆコード配列＋調節領域をＰＣＲをで増幅するためにプライマーを使用した。増幅
に用いたプライマーは反転プラーマー０７−１９２および前方プライマー０７−１３０で
あり、以下の配列を有する：０７−１９２：５’−ＧＡＴＧＣＴＡＧＣＴＡＡＣＣＧＧＡ
ＧＣＴＣＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１０３）、および５’−ＧＡＴＴＴＣＧＡＡＴ
ＧＡＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＴＴＴＴＴＡＣＣＣ−３’（配列番号１０３）。

前方プライマー０７−１３０はＢｓｔＢ部位（ＴＴＣＧＡＡ、配列番号１０２のヌクレ
オチド４〜９で表される）を含み、ｚｗｆ開始コドンの上流の２０３塩基対から増幅する
。反転プラーマー０７−１２９はＮｈｅＩ部位（ＧＣＴＡＧＣ、配列番号１０３のヌクレ
オチド４〜９で表される）を含み、ｚｗｆ停止コドンの下流の１５４塩基対から増幅する
。標準条件でＰＣＲを行い、ＮｈｅＩおよびＮｓｔＢＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が側
面する１．８ｋｂフラグメントを生成した。

（組み換えｚｗｆのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み）
ゲノムｒｈａ領域を標的としてｚｗｆカセットを組み込むため、組み込みベクターを設
計した。Ｅ．ｃｏｌｉのｒｈａＢＡＤ遺伝子はラムロキナーゼ、Ｌ−ラムノースイソメラ
ーゼおよびラムノース−１−燐酸アルドラーゼそれぞれをコードするオペロンを形成する
。これらの遺伝子はラムノースを別な炭素源として利用することに関与し、非必須遺伝子
であると考えられている。従って、この領域を妨害することが我々の株における生育とＮ
ＡＧ生産に影響してはならい。

プラスミドｐＳＷ０７−７２＃４５（実施例５４に記載）を組み込みベクター作成の第
一工程に利用した。ｒｈａＢＡＤオペロン＋側面配列を含むこのプラスミドを制限エンド
ヌクレアーゼＢｓｔＢおよびＮｈｅＩで消化した。これによりｒｈａＢおよびｒｈａＡコ
ード配列部分を含む７０２塩基対をプラスミドから除去した。ｚｗｆコード配列＋調節レ
ギュロンを含むＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＢおよびＮｈｅＩで
消化し、ｐＳＷ０７−７２＃４５のＢｓｔＢおよびＮｈｅＩ部位へライゲートしてプラス
ミドｐＳＷ０７−８６を作成した。

プラスミドｐＳＷ０７−８６を制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｒｈａ遺伝
子が側面するｚｗｆを含む６．９ｋｂフラグメントを放出した。ｐＭＡＫ７０５由来の温
度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．、１７２（９）：４
６１７−４６２２）とｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性カセット（ＡｍｅｒｓｈａｍＰ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むｐＫＬＮ０７
−２１由来の４．２ｋｂＫｐｎＩ／ＮｏｔＩフラグメントと、このフラグメントをライゲ
ートした。得られたプラスミドｐＳＷ０７−８７を用いて、ｚｗｆをＥ．ｃｏｌｉ染色体
のｒｈａＢＡ領域へ組み込むことができる。

ＳｃＧＮＡ１カセットの１個または少なくとも２個のコピーをそれぞれ含む７１０７−
９２（１）および７１０７−６０７（２）株中へ、プラスミドｐＳＷ０７−８７を形質転
換した。温度感受性選択と継代培養プロトコールに従い、ｒｈａＢＡ欠失部位におけるＴ
７ｌａｃ−ｚｗｆの存在につき、カナマイシン感受性コロニーを標準ＰＣＲプロトコール
を用いてスクリーニングした。ＰＣＲで同定されたいくつかの株を、ｚｗｆコード配列を
含むフラグメントをプローブとして用いて、高ストリンジェントサザンハイブリダイゼー
ションで確認した。７１０７−６０７（２）由来の株を７０１７−６３３、７１０７−９
２（１）由来の株を７００７−６３４と呼ぶ。

（天然型プロモーター制御下のＮＡＧ生産株におけるｚｗｆの過剰発現）
ＮＡＧ生産に対する天然型プロモーターの制御下でｚｗｆの過剰発現の効果を評価する
ため、７１０７−６３３および７１０７−６３４株をスクリーニングした。０．６ｇ／ｌ
のＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、５ｇ／ｌの酵母抽出
物、１０Ｇ／Ｌのフルコースおよび４０ｇ／ｌのラクトースを補充したＭ９Ｂ培地中培養
細胞をで生育させた。株を３０℃で２４時間生育させ、次いで実験の残りを２５℃に切り
替えた。２４および４８時間で各培養液のｐＨを７．２に調節し。ＨＰＬＣの結果に基づ
き一日当たりグルコースを３０ｇ／ｌで加えた。アンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下
下フラスコに５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を２４および４８時間で添加した。ＯＤおよ
びＮＡＧレベルを測定するため、試料を２４、４８および７２時間に採取した。結果を表
２８に示す。

（表２８．天然型プロモーターでｚｗｆを過剰発現する株の生育とＧｌｃＮＡｃ生産）

結果は、過剰発現ｚｗｆを有する細胞の生育が、天然型またはＴ７プロモーターで増加
すること、すなわちペントース欠乏が少なくとも部分的に軽減することを示す。これらの
株のいくつかでＮＡＧの生産も増加した。例えば、７１０７−６３４（２）株は対照株７
１０７−９２８１）より約２５％多いＮＡＧを生産した。この実験で、過剰発現ｚｗｆを
有するＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの２個のコピーを有する株は、２個のカセット
のコピーと過剰発現ｚｗｆを有する株以上に改善されなかった。

（ｚｗｆ遺伝子を過剰発現する株の１リッター醗酵槽中の評価）
次にｚｗｆを過剰発現する株を１Ｌ醗酵槽中で評価した。これらの結果を、別な醗酵槽
中で予め行われた７１０７−９２（１）株からの結果とも比較した。醗酵槽を初期容積４
７５ｍｌに設定した。醗酵培地の成分は表２６に列挙されている。７５％ＮＨ_４ＯＨでｐ
Ｈを制御して醗酵を行った。醗酵中、温度を３７℃に保った。溶存酸素濃度を飽和の２０
％に保つため、曝気と攪拌を調節した。コンピュータープログラムで供給速度を制御して
６５％グルコースを醗酵培地に供給し、接種時の生育速度を０．４０／時間、６時間での
最大速度を５ｍｌ／時間とした。１０時間で食品グレードのラクトースを供給し、グルコ
ースを連続的に供給して培養細胞を誘導した。

醗酵の結果は、７１０７−６０６（１）株が対照株より高いＯＤ_６００を、特に初期の
時点で達成することを示した。これはこの株中のペントースの供給が増加したことによる
と思われる。一方、天然型プロモーターでｚｗｆを過剰発現する株は、対照株とほぼ同じ
ＯＤ_６００で生育した。この実験で、ｚｗｆを過剰発現する株は何れも、ＧｌｃＮＡｃの
生産で対象株７１０７−６０７（２）または７１０７−９２（１）を上回らなかった。し
かしながら、醗酵条件は生産株７１０７−９２（１）および７１０７−９２（２）に対し
最適であった。生育とＮＡＧ生産を改善する潜在能力を示すためには、ｚｗｆ過剰発現株
が若干異なった醗酵条件を要求することは有り得る。

（実施例２６）
本実施例はホスフォグルコースイソメラーゼ（ｐｇｉ）遺伝子のクローニング、Ｔ７ｌ
ａｃ−ｐｇｉカセットのＥ．ｃｏｌｉ染色体中への組み込み、およびＮＡＧ生産に対する
ｐｇｉ遺伝子過剰発現の効果を説明する。

Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｉ遺伝子は、グルコース−６−燐酸とフラクトース−６−燐酸の相
互変換を触媒するホスフォグルコースイソメラーゼをコードする。ｐｇｉの過剰発現は、
Ｆ−６−Ｐのプールを増加し、従ってＧｌｃＮ／ＧｌｃＮＡｃの生産が増加する。この可
能性を試験するため、ｐｇｉ遺伝子をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉＮＡＧ生産背景中に
過剰発現させた。

（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｉのクローニングと過剰発現）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｇｉのクローニングと過剰発現のため、ｐｇｉ遺伝子の公開された配
列に基づいてプライマーを合成した（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２７７（５３３１）：１４５３−１４７４）。Ｅ．ｃｏｌｉｐｇｉ遺伝子コード配列のヌ
クレオチド配列は配列番号１０４と呼ばれる配列中に列記されている。Ｅ．ｃｏｌｉＰ
ＧＩ酵素の推定アミノ酸配列は配列番号１０５と呼ばれる配列中に列記されている。プラ
イマーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０ゲノムＤＮＡからｐｇｉコード配列をＰＣＲ
で増幅した。使用した前方プライマー０７−１０３および逆方向プライマー０７−１０４
は以下の配列を有する：０７−１０３：５’−ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＡＡＡＡ
ＡＣＡＴＣＡＡＴＣＣＡＡＣＧＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１０６）、および５’−ＧＡ
ＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＧＣＴＴＴＡＴＡＧＣ−３’（配列番号１
０７）。

プライマー０７−１０３はＢｓａＩ部位（ＧＧＴＴＣＴ、配列番号１０６のヌクレオチ
ド５〜１０で表される）と、ＡＴＧ開始コドンからのｐｇｉ配列の２６ヌクレオチド（配
列番号１０６のヌクレオチド１３〜３８で表される）を含む。プライマー０７−１０４は
Ｘｈｏ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号１０７のヌクレオチド５〜１０で表される）と、翻
訳停止コドンからｐｇｉコード配列の２３ヌクレオチド（配列番号１０７の１１〜３３ヌ
クレオチドで現れる）を含む。標準条件下でＰＣＲを行い、ＢｓａＩおよびＸｈｏＩ制限
エンドヌクレアーゼ部位が側面するｐｇｉコード配列を含むフラグメントを生成した。

ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベク
ターｐＥＴ２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＢｓａ
ＩおよびＸｈｏＩ部位へライゲートしてプラスミドＰＫＬＮ０７−３６とＰＫＬＮ０７−
３７を作成した。この方法によるクローニングはｐｇｉ配列をｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７
ｌａｃプロモーターの下流に置き、発現カセットＴ７ｌａｃ−ｐｇｉを生成する。

（Ｅ．ｃｏｌｉ中の組み換えｐｇｉの機能性発現）
プラスミドｐＫＬＮ０７−３６をＮＡＧ生産株７１０７−９２（１）中へ形質転換し、
７１０−１２４株を作成した。ｐＥＴ２４ｄ（＋）空ベクターを有する７１０７−９２（
１）を形質転換して対照株７１０７−９５を作成した。標準プロトコールに従い、培養細
胞をＬＢ中で生育させ１ｍＭＩＰＴＧで誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために誘導および
非誘導培養細胞から採取した。結果から、ＰＧＩタンパク質の予想サイズに対応する約６
２ｋＤａのタンパク質の過剰生産が確認された。全および可溶性タンパク質の量をＩＰＴ
Ｇ誘導の４時間後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。７１０７−１２４（１）および７１０
７−１２４８２）由来の試料は６２ｋＤａタンパク質の過剰生産を示し、組み換えＰＧＩ
タンパク質の過剰発現の成功を示した。誘導および非誘導培養細胞中の過剰生産タンパク
質の存在は、誘導剤がない場合のｐｇｉ遺伝子の漏出発現を示す。対照株７１０７−９５
由来の試料にはこの様なタンパク質バンドは見られなかった。全ＰＧＩタンパク質の少な
くとも半分は可溶性型である様に思われる。

４時間の誘導後、ホスフォグルコースイソメラーゼ活性を測定するため培養細胞を収穫
した。対照株に比活性０．９４ｍｍｏｌｍｉｎ^−１ｍｇ^−１と比較して、７１０７−１
２４（１）、７１０７−１２４（２）および７１０７−１２４（３）株が比活性２４２、
１５８および２１５ｍｍｏｌｍｉｎ^−１ｍｇ^−１タンパク質をそれぞれ有することが見
出された。これにより対照株に比べて比活性が１００〜２００倍のレベルに達し、Ｐｇｉ
タンパク質の過剰発現に成功したことが確認された。

（Ｅ．ｃｏｌｉ染色体中へのＴ７ｌａｃ−ｐｇｉＡ組み込みを指向するベクターの構築
）
ｐｇｉの機能性発現が確認されたので、次のステップはＥ．ｃｏｌｉ染色体を標的とす
るＴ７ｌａｃ−ｐｇｉカセットの組み込みである。組み込みのために選ばれた標的はＥ．
ｃｏｌｉ染色体のａｒａＢＡＤ領域であった。Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−アラビノースイ
ソメラーゼおよびＬ−リボース−５−Ｐ４−エピメラーゼタンパク質をコードするａｒａ
ＢＡＤオペロンは、炭素源としてＬ−アラビノースの利用に関与している。これらのタン
パク質は、ペントース燐酸分岐における中間体であるＬ−アラビノースのＤ−キシルロー
ス−５−燐酸への変換を触媒する。Ｌ−アラビノースはＮＡＧ醗酵プロセスの炭素源とし
て使用されないので、この部位への遺伝子組み込みは細胞生育とＮＡＧ生産に影響しては
ならない。

組み込みベクターを生成する最初の工程は、ａｒａＢＡＤオペロンを含むゲノム領域を
クローニングすることである。ａｒａＢＡＤオペロンの公開された配列に基づきプライマ
ーを合成した（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３３１）：
１４５３−１４７４）。ａｒａＢＡＤ領域を増幅するために使用したプライマーは、順方
向プライマー０７−１０５および逆方向プライマー０７−１０６であり、以下の配列を有
した：０７−１０５：５’−ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＡＴＣＧＣＡＡ
ＣＴＣ−３’（配列番号１０８）、そして０７−１０６：５’−ＣＧＧＡＣＧＣＡＣＡＴ
ＣＧＧＣＣＴＣＧＴＡＧＡＣ−３’（配列番号１０９）。

プライマー０７−１０５はａｒａＢのＡＴＧ開始コドンの７４塩基対下流から増幅し、
プライマー０７−１０６はａｒａＤ翻訳終止コドンの４０４塩基対下流から増幅する。得
られたａｒａＢＡＤオペロンを含む４．７ｋｂのＰＣＲフラグメントをベクターｐＰＣＲ
−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に連結し、プラスミドｐＫＬＮ０７−３８を生成し
た。

次の工程は、プラスミドｐＫＬＮ０７−３７由来のＴ７ｌａｃ−ｐｇｉカセットを、プ
ラスミドｐＫＬＮ０７−３８に加えることである。以下の配列を有する順方向プライマー
０７−１０９および逆方向プライマー０７−１１０を用いて、Ｔ７ｌａｃ−ｐｇｉカセッ
トを、プラスミドＫＬＮ０７−３７からＰＣＲによって増幅した：０７−１０９：５’−
ＧＡＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１１０）、
そして０７−１１０：５’−ＧＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣ
ＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣ−３’（配列番号１１１）。

プライマー０７−１０９は、ＢｓｐＥＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＴＣＣＧＧＡ、
配列番号１１０のヌクレオチド４〜９で表される）を含み、ｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７プ
ロモーターの８０塩基対上流から増幅する。プライマー０７−１１０は、ＳｅｘＡＩ制限
エンドヌクレアーゼ部位（ＡＣＣＴＧＧＴ、配列番号１１１のヌクレオチド５〜１１で表
される）を含み、ｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７プロモーターの１８塩基対下流から増幅する
。ＰＣＲを標準条件下で行って、ＢｓｐＥＩおよびＳｅｘＡＩ制限エンドヌクレアーゼ部
位によって隣接されるＴ７ｌａｃ−ｐｇｉカセットを含むフラグメントを生成した。この
ＰＣＲフラグメントを次いで制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＥＩおよびＳｅｘＡＩで消化
した。

プラスミドｐＫＬＮ０７−３８を制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＥＩおよびＳｅｘＡＩ
で消化し、ａｒａＢコード配列の最後の６１２塩基対を含む２４７７塩基対フラグメント
、全ａｒａＡコード配列、およびａｒａＤコード配列の最初の５９塩基対を切除した。消
化したＴ７ｌａｃ−ｐｇｉＰＣＲフラグメント（上記）を、ｐＫＬＮ０７−３８のＢｓｐ
ＥＩ部位およびＳｅｘＡＩ部位に連結し、プラスミドｐＫＬＮ０７−４１を生成した。従
って、プラスミドｐＫＬＮ０７−４１は、ａｒａＢＡＤオペロンの一部のうち２．４ｋｂ
の欠失を有し、Ｔ７−ｌａｃ−ｐｇｉがその欠失部位に挿入されている。

最後のクローニング工程について、Ｔ７ｌａｃ−ｐｇｉの挿入を有するａｒａＢＡＤ配
列を含むフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いてプラ
スミドｐＫＬＮ０７−４１から消化した。このフラグメントを、ｐＭＡＫ７０５由来の温
度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃ．１７１（９）：４６
１７−４６２２）、およびｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むｐＫＬ
Ｎ０７−２１由来の４．２ｋｂ ＳａｌＩ／ＮｏｔＩフラグメントと連結した。得られた
プラスミドｐＫＬＮ０７−４７は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体のａｒａＢＡＤ領域へのｐｇｉの
直接組み込みのために使用し得る。

７１０７−９２（１）株を、プラスミドｐＫＬＮ０７−４７で形質転換した。温度選択
プロトコールを実施した。カナマイシン感受性コロニーを、染色体上のａｒａＢＡＤ欠失
部位でのＴ７ｌａｃ−ｐｇｉの存在について、標準条件下でＰＣＲによってスクリーニン
グした。ＰＣＲによって同定されたいくつかの株を、プローブとしてｐｇｉコード配列を
含むフラグメント使用して、高ストリンジェントなサザンハイブリダイゼーションによっ
て確認した。これらの株を７１０７−１３６から７１０７−１４１と名付けた。

（７１０７−１３６株および７１０７−１４１株の振盪フラスコ評価）
７１０７−１３６株および７１０７−１４１株を含む株をスクリーニングして、ＮＡＧ
生成におけるｐｇｉの過剰発現の効果を評価した。培養物を０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４−
７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌの
リボース、１０ｇ／ｌのグルコース、および４０ｇ／ｌのラクトースを補充したＭ９Ｂ培
地（上記）中で増殖させた。株を３０℃で２４時間増殖させ、次いで残りの実験のために
２５℃に切り替えた。２４時間および４８時間で、各々の培養物のｐＨを７．２に調整し
、ＨＰＬＣの結果に基づいてグルコースを１日当たり３０ｇ／ｌまで加えた。レベルが１
ｇ／ｌ以下に減少したフラスコに、５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を２４時間および４８
時間にて加えた。ＯＤおよびＮＡＧレベルの測定のために、２４時間、４８時間および７
２時間でサンプルを取り出した。酵素分析のために、培養物を７２時間で収集した。結果
を表２９に示す。

（表２９．ｐｇｉ過剰発現株における増殖とＧｌｃＮＡｃ生成）

この実験において、ｐｇｉを過剰発現した株における有意な改善は見られなかった。し
かし、最適化した振盪フラスコまたは発酵条件下では、過剰発現したｐｇｉは、増殖およ
び／またはＮＡＧ生成にポジティブな影響を及ぼし得る。

（１リットル発酵における７１０７−１４１株の評価）
次にｐｇｉを過剰発現する７１０７−１４１株を１Ｌ発酵槽中で評価した。結果を、同
一条件下での別の発酵で予め行った７１０７−９２（１）株からの結果と比較した。発酵
を、４７５ｍｌの初期容積に設定した。発酵培地の成分を表３に列挙する。６．９にｐＨ
を制御するために７５％ＮＨ_４ＯＨを使用して、発酵を行った。発酵の全体にわたって、
温度を３７℃で維持した。曝気と攪拌を調整して、溶存酸素濃度を空気飽和度の２０％に
維持した。コンピュータープログラムで制御した供給速度で培養物に６５％グルコースを
供給して、播種時で０．４０／時間の増殖速度および６時間までに５ｍｌ／時間の最大速
度を達成した。グルコース供給を続けながら、食品用ラクトースを１０時間で５ｇ／ｌの
量で加えて、培養物を誘導した。

振盪フラスコ実験と同様に、ｐｇｉ遺伝子を過剰発現する株におけるグルコサミン生成
において有意な改善は見られなかった。しかし、先に議論したように、これらの株に対し
て最適化した条件下では、ｐｇｉ過剰発現は、増殖および／またはＮＡＧ生成にポジティ
ブな影響を及ぼし得る。

（実施例２７）
以下の実施例は、グリコーゲン合成がｇｌｇＸＣＡ遺伝子の欠失によってブロックされ
るグルコサミン／Ｎ−アセチルグルコサミン生成株の開発を記載する。グルコサミン／Ｎ
−アセチルグルコサミン生成におけるグリコーゲン合成をブロックすることの効果もまた
、実証する。

細菌細胞は貯蔵炭素の主要な形態としてグリコーゲンを蓄積する。グリコーゲン合成に
は、ＡＤＰ−グルコースピロホスフォリラーゼ、グリコーゲンシンターゼおよび分枝酵素
の３種の酵素が関与する。これらの酵素はそれぞれ、グルコース−１−リン酸から単糖ド
ナー（ＡＤＰ−グルコース）の合成、これらの単糖単位の重合によるグルコースの（１−
４）ポリマーの形成、およびこのポリマーの再構成による糖鎖内の（１−６）分枝の生成
を触媒する。ＡＤＰ−グルコースピロホスフォリラーゼは、グリコーゲン合成の中心的な
酵素であり、アロステリックエフェクターにより強く調節される。グリコーゲン合成およ
び分解に関与する遺伝子は、ｇｌｇオペロン（ｇｌｇＢＸＣＡＰ）として組織化され、ｇ
ｌｇＢ（１，４−α−グルカン分枝酵素）、ｇｌｇＸ（グリコシルヒドロラーゼ、脱分枝
酵素）、ｇｌｇＣ（ＡＤＰ−グルコースピロホスフォリラーゼ）、ｇｌｇＡ（グリコーゲ
ンシンターゼ）、およびｇｌｇＰ（グリコーゲンマルトテトラオースホスフォリラーゼ）
が挙げられる。グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミン生成経路への炭素の流れを
増加させる努力において、グリコーゲン合成経路は、グルコサミンおよびＮ−アセチルグ
ルコサミンを生成する株において遺伝子欠失によってブロックされた。

以下の配列のＰＣＲプライマーを合成し、ｇｌｇオペロン由来の配列をクローニングし
た。ＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ１−５：５’−ＧＡＧＴＣＡＴＣＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＡＣＧ
ＣＧＡ−３’（配列番号１１２）、およびＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ２−３：５’−ＡＴＡＡ
ＡＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＧＧ−３’（配列番号１１３）。

標準条件を使用してプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０
由来のｇｌｇオペロンの５７３７ｂｐフラグメントを生成した。増幅した配列は、ｇｌｇ
ＢからｇｌｇＰに及ぶ。ＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商
標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯ ＴＡ クローニングキット、カタログ番号Ｋ４
５００−０１）に連結し、組換えプラスミドｐＣＡＬＧ１８−１を生成した。

ｐＣＡＬＧ１８−１をＡｇｅＩで消化して、プラスミドからｇｌｇＸの３’部分、全ｇ
ｌｇＣ、およびｇｌｇＰの５’部分を欠失させた。プラスミドの残りの部分を再環化して
、ｐＣＡＬＧ２１−１を生成した。この組換えプラスミドは切断型ｇｌｇオペロン（ｇｌ
ｇＸＣＡＤ）を含む。

ｇｌｇＸＣＡＤをグルコサミン生成株および／またはＮ−アセチルグルコサミン生成株
のゲノム中に組み込むのに必要なプラスミドを生成するために、さらに２つの工程を要し
た。第一に、ｐＵＣ４Ｋ由来のＫａｎ^ｒ遺伝子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２７−４９５８−０１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０６
４０４）を、ｐＣＡＬＧ２１−１に加えて、ｐＣＡＬＧ２３−１を生成した。第二に、ｐ
ＭＡＫ７０５由来の温度感受性複製開始点（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｃ．ら、１９８９、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７１：９、ｐｐ４６１７−４６２２）
をｐＣＡＬＧ２３−１に加えて、ｐＣＡＬＧ２８−１を生成した。第一の手順を行うため
に、ｐＣＡＬＧ２１−１およびｐＵＣ４Ｋを、いずれもＢａｍＨＩで消化した。ＢａｍＨ
Ｉ消化はｇｌｇＸＣＡ欠失部位の上流のｐＣＡＬＧ２１−１を直線化し、ｐＵＣ４Ｋから
Ｋａｎ^ｒフラグメントを放出する。直線化ｐＣＡＬＧ２１−１およびＫａｎ^ｒフラグメン
トを連結して、ｐＣＡＬＧ２３−１を生成した。ｐＣＡＬＧ２８−１を生成するために、
ｐＣＡＬＧ２３−１由来のＫａｎ^ｒ−ｇｌｇＸＣＡＤフラグメントをオリゴヌクレオチド
ＧＮＴＯＰＯ２−５（配列番号１１４）およびＧＮＴＯＰＯ３−４（配列番号１１５）を
使用して、ＰＣＲ増幅した。ＧＮＴＯＰＯ２−５の配列：５’−ＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧ
ＧＴＡＣＣＧ−３’（配列番号１１４）。プライマー配列はｐＣＲ（登録商標）２．１−
ＴＯＰＯ（登録商標）のヌクレオチド２３０〜２４６と同一である。ＧＮＴＯＰＯ３−４
の配列：５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号１１５）
。この配列はｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）のヌクレオチド３３４〜
３５４と逆相補性である。

ＰＣＲ生成物を、ｐＭＡＫ７０５から単離された温度感受性複製開始点を含むＳｍａＩ
フラグメントに連結した。得られた組換えプラスミドｐＣＡＬＧ２８−１は、Ｋａｎ^ｒ、
ｇｌｇＸＣＤＡ配列および温度感受性複製開始点を含む。

グリコーゲン合成欠乏性株の生成を、内因性ｇｌｇＢＸＣＡＰ配列を組換えｇｌｇＸＣ
ＡＤ配列で置換することによって行った。ｐＣＡＬＧ２８−１を、Ｅ．ｃｏｌｉ株７１０
７−１８中に形質転換し、内因性ｇｌｇＢＸＣＡＰがｐＣＡＬＧ２８−１由来の組換えｇ
ｌｇＸＣＡＤ配列で置換されたクローンを、温度選択手順を使用して生成した。所望のク
ローンをさらにＰＣＲスクリーニングで同定し、ヨウ素蒸気試験で確認した。ＰＣＲスク
リーニングを、オリゴヌクレオチドＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ３−５（配列番号１３６）およ
びＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ４−３（配列番号１３７）を使用して行った。ＧＮｇｌｇＢＸＣ
ＡＰ３−５の配列は以下の通りである：５’−ＧＧＣＧＧＣＴＴＡＡＡＡＴＧＴＣＣＴＧ
ＡＡＴＧ−３’（配列番号１３６）。プライマーは、オリゴヌクレオチドヌクレオチドＧ
ＮｇｌｇＢＸＣＡＰ１−５（配列番号１１２）およびＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ２−３（配列
番号１１３）から生成したｇｌｇＢＸＣＡＰ ＰＣＲフラグメントの５’末端のさらに上
流に位置する。ＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ４−３の配列は、５’−ＣＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴ
ＴＧＣＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＧ−３’（配列番号１３７）である。このプライマーは
、オリゴヌクレオチドＧＮｇｌｇＢＸＣＡＰ１−５（配列番号１１２）およびＧＮｇｌｇ
ＢＸＣＡＰ２−３（配列番号１１３）から生成したｇｌｇＢＸＣＡＰ ＰＣＲフラグメン
トの３’末端のさらに下流に位置する。

ＰＣＲスクリーニングにおいて、２つの株がｇｌｇＸＣＡＤ配列に対して予想されるサ
イズ（２２９５ｂｐ）のＰＣＲ生成物を生成した。これらの２つの株を、７１０７−３０
８および７１０７−３０９と名付けた。次いで、これらの株をヨウ素蒸気試験に供して、
これらの株の何れもグリコーゲンを蓄積しないことを実証した。この試験を実施するため
に、７１０７−１８細胞、７１０７−３０８細胞および７１０７−３０９細胞を有するプ
レートをヨウ素結晶からの蒸気に曝した。７１０７−１８株のみが暗褐色に変化し、グリ
コーゲンの存在を示した。

（グリコーゲン欠乏性株におけるＮＡＧ生成を試験するための振盪フラスコ実験）
振盪フラスコスクリーニングにより、ｇｌｇ欠失によってグリコーゲン合成がブロック
された株を評価した。株を、４０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのリボースおよび５ｇ
／ｌの酵母抽出物を補充したＭ９Ｂ培地で増殖させた。ｇｌｇ欠失を有する株間でいくつ
かの興味を引く差異があるようである。いくつかのｇｌｇ欠失株（例えば、７１０７―６
０４）は、コントロールよりも良好に増殖したが、ＮＡＧの生成レベルは低かった。７１
０７−６０５−１株はコントロールと同程度の増殖を示したが、ＮＡＧ力価は１２％改善
した。

（表３０．振盪フラスコ実験におけるｇｌｇ欠失株の増殖とＮＡＧ生成）

（実施例２８）
以下の実施例は、２つのｌａｃＩ遺伝子のうち１つの欠失と、ｌａｃプロモーターのｌ
ａｃＵＶ５プロモーターによる置換の、グルコース抑制の軽減およびグルコサミン／Ｎ−
アセチルグルコサミン生成における効果を実証する。

培地中のグルコースの存在が、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｌａｃプロモーターからの発現を抑制
することは公知である。ｌａｃオペロンはｌａｃＺ、ｌａｃＹおよびｌａｃＡの３種のタ
ンパク質をコードする。ｌａｃＺ遺伝子は、ラクトースをグルコースおよびガラクトース
に切断し、ラクトースをオペロンの真の誘発因子であるアロラクトースに変換する酵素（
β−ガラクトシダーゼ）をコードする。アロラクトースはレプレッサ（ｌａｃＩ遺伝子に
よりコードされる）と相互作用することによってｌａｃオペロンを誘導し、ｌａｃオペレ
ータでの結合を予防する。ｌａｃＹ遺伝子は、ラクトースの細胞中への流入を制御するラ
クトース透過酵素をコードする。ｌａｃＡ遺伝子は、非代謝性ピラノシドの細胞解毒を補
助する酵素であるチオガラクトシドトランスアセチラーゼ（ガラクトシドアセチルトラン
スフェラーゼ）をコードする。

ｌａｃオペロンの転写は、ｃＡＭＰとそのレセプタータンパク質（ＣＲＰ）との間で形
成される複合体である、複合体ＣＲＰ：ｃＡＭＰによるｌａｃプロモーター配列の結合を
要する。グルコースが細胞内のｃＡＭＰレベルを減少させることによって、ｌａｃオペロ
ンを抑制すると考えられている。ｌａｃＵＶ５プロモーターは、特定のヌクレオチドの変
化を含むｌａｃプロモーターの変異形である。この様な変化に起因して、ｌａｃプロモー
ターはもはや、転写を活性化するためにＣＲＰ：ｃＡＭＰによる結合を必要としない。こ
のことは、ｌａｃＵＶ５の制御下にあるｌａｃオペロンがグルコース抑制に対して感受性
でなくなることを示唆する。従って、ｌａｃプロモーターは、Ｎ−アセチルグルコサミン
および／またはグルコサミンを生成するＥ．ｃｏｌｉ株において、ｌａｃＵＶ５プロモー
ター（本明細書中で配列番号１３５で表される）で置換されて、グルコース抑制を最小に
する。

いくつかのＮ−アセチルグルコサミン生成株および／またはグルコサミン生成株は、ｌ
ａｃＩ抑制遺伝子の２つのコピーを含む。一方は、天然のｌａｃオペロンの成分であり、
他方は、ＤＥ３要素中に見出される。細胞性ｌａｃＩレプレッサタンパク質の量は、抑制
の強度に影響し得る。従って、一方のｌａｃＩ遺伝子の欠失は、グルコサミン／Ｎ−アセ
チルグルコサミン生成のラクトース誘導に影響し得る。

（ｌａｃプロモーターのｌａｃＵＶ５プロモーターによる置換）
いくつかの前駆体プラスミドを、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミ
ン生成株中にｌａｃＵＶ５プロモーターを組み込むために使用されるプラスミドの構築の
前に、生成した。

Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株由来のｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺフラグメントのＰＣＲ増
幅物に含まれる第一前駆体の生成を、オリゴヌクレオチドプライマーＧＮｍｐｈＲｌａｃ
ＩｌａｃＺ１−５（配列番号１１６）およびＧＮｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ２−３（配列
番号１１７）を使用して実施した。ＧＮｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ１−５の配列は以下の
通りである：５’−ＡＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＧＧ−３’（配列番号
１１６）。そして、ＧＮｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ２−３の配列は以下の通りである：５
’−ＣＧＡＴＡＣＴＧＡＣＧＧＧＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１１７）。ｍｐｈＲｌａ
ｃＩｌａｃＺ配列を含む正確なサイズのＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ（登録商標）２．１−Ｔ
ＯＰＯ（登録商標）中にクローニングして、ｐＣＡＬＧ３−１を生成した。

次の前駆体プラスミドは、オリゴヌクレオチドＧＮｌａｃｄｅｌ２−５（配列番号１１
８）およびＧＮｌａｃｄｅｌ３−５（配列番号１１９）を使用して、ｐＣＡＬＧ３−１の
部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商
標）ＸＬ部位特異的変異誘発キット、カタログ番号２００５１７）から得た。ＧＮｌａｃ
ｄｅｌ２−５の配列は、５’−（リン酸化）ＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＣＡＣ
ＣＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＣＣＣＧ−３’（配列番号１１８）であった。このプライマー配
列は、ｌａｃＩ開始コドンのＢｓｔＥＩＩ部位５’を付加させるためになされるＡＴＧＧ
からＣＡＣＣへの変化（配列番号１１８のヌクレオチド１５〜２１で表される）を除いて
、Ｗ３１１０ ｌａｃＩ配列と同一である。ＧＮｌａｃｄｅｌ３−５の配列：５’−（リ
ン酸化）ＣＧＧＧＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＧＣＧＡＡＡ−ＧＧＴＴＴＴＧＣ
−３’（配列番号１１９）。このオリゴヌクレオチド配列は、ｌａｃＩ開始コドンのＢｓ
ｔＥＩＩ部位５’を付加させるためになされるＣＣＡＴからＧＧＴＧへの変化（配列番号
１１９のヌクレオチド１５〜２１で表される）を除いて、Ｗ３１１０ ｌａｃＩ配列と逆
相補的である。

ｐＣＡＬＧ３−１の部位特異的変異誘発を、オリゴヌクレオチドＧＮｌａｃｄｅｌ２−
５（配列番号１１８）およびＧＮｌａｃｄｅｌ３−５（配列番号１１９）を使用して、ｌ
ａｃＩ開始コドンのＢｓｔＥＩＩ部位５’に加えて、ｐＣＡＬＧ５−１を生成した。この
組換えプラスミドは、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）の骨格中にｌａ
ｃＩ開始コドンのＢｓｔＥＩＩ部位５’を有するｍｐｈＲｌａｃＩｌａｃＺ配列からなる
。

次に、ｐＣＡＬＧ５−１をＢｓｔＥＩＩで消化し、ｌａｃＩの３’配列を含むフラグメ
ント、ｌａｃプロモーターを有するｌａｃＺ遺伝子の一部、ｐＣＲ（登録商標）２．１−
ＴＯＰＯ（登録商標）、およびｍｐｈＲ由来の配列を単離した。ｐＣＡＬＧ５―１由来の
単離したフラグメントを、それ自体に連結して、ｐＣＡＬＧ１０−１を生成した。組換え
ｐＣＡＬＧ１０−１プラスミドは、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）の
骨格中に、ｍｐｈＲ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＺ配列を含む。

次に、ｐＣＡＬＧ１０−１をＢｓｔＥＩＩおよびＮｄｅＩで消化し、ｐＣＲ（登録商標
）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｍｐｈＲ配列を含むフラグメントを単離した。次
いで、単離したｐＣＡＬＧ１０−１フラグメントを、２つのＰＣＲ生成物に連結した。ｐ
ＣＡＬ６１０−１から生成した第一のＰＣＲ生成物は、ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接
するＮｄｅＩ部位を有するｌａｃＺ配列を含んだ。標準条件下のＰＣＲ、およびオリゴヌ
クレオチドプライマーＧＮＬａｃＺ１−５（配列番号１２０）およびＧＮＬａｃＺ２−３
（配列番号１２１）を使用して、ｌａｃＺ配列を含むｐＣＡＬＧ１０−１の一部を増幅し
た。ＧＮＬａｃＺ１−５の配列は以下の通りである：５’−ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＣＡ
ＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧ−３’（配列番号１２０）。このプライマー配列は
、ＮｄｅＩ部位を付加するためのＧ１９３２ＣおよびＣ１９３３Ａのヌクレオチド変化（
配列番号１２０のヌクレオチド１２〜１７で表される）を除いて、ｐＣＡＬＧ１０−１（
ｌａｃプロモーター／ｌａｃＺ接合部）のヌクレオチド１９２１〜１９５０と同一である
。ＧＮＬａｃＺ２−３の配列は：５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧＣＡ
Ｇ−３’（配列番号１２１）である。この配列は、ｐＣＡＬＧ１０−１のヌクレオチド６
５２３〜６５４５に対して逆相補的である。

標準条件下のＰＣＲ、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーＧＮＬａｃｕｖ５３−５
（配列番号１２２）およびＧＮＬａｃｕｖ５４−３（配列番号１２３）を使用して、７１
０１−１７（ＤＥ３）株由来のｌａｃＵＶ５プロモーターである第二のＰＣＲ生成物を増
幅した。ＧＮＬａｃｕｖ５３−５の配列は：５’−ＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧ
ＣＡＡＡ−３’（配列番号１２２）である。この配列は、ｐＣＡＬＧ１０−１のヌクレオ
チド１２５３〜１２７３と同一であり、ｌａｃＩ内の内因性ＢｓｔＥＩＩ部位（配列番号
１２２のヌクレオチド９〜１５で表される）を含む。ＧＮＬａｃｕｖ５４−３の配列は：
５’−ＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番
号１２３）である。この配列は、ＮｄｅＩ部位を付加するためのＣ１９３２ＧおよびＧ１
９３３Ｔヌクレオチド変化（配列番号１２３のヌクレオチド１４〜１９で表される）を除
いて、ｐＣＡＬＧ１０−１（ｌａｃプロモーター／ｌａｃＺ接合部）のヌクレオチド１９
２１〜１９５０と逆相補的である。

ＰＣＲで生成したｌａｃＵＶ５プロモーターフラグメントをＢｓｔＥＩＩおよびＮｄｅ
Ｉで消化し、そして精製した。同様に、ｌａｃＺ配列を含むＰＣＲ生成物をＮｄｅＩで消
化し、精製した。次の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ１０−１由来のｍ
ｐｈＲフラグメント（ＮｄｅＩ−ＢｓｔＥＩＩ）、ｌａｃＵＶ５プロモーターフラグメン
ト（ＢｓｔＥＩＩ−ＮｄｅＩ）、およびｌａｃＺフラグメント（ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩ）を
一緒に連結した。得られた組換えプラスミドｐＣＡＬＧ１６−３は、ベクターｐＣＲ（登
録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）中にｍｐｈＲ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プ
ロモーター、ｌａｃＺ配列（天然型の配列と逆の順序）を含む。ｐＣＡＬＧ１６−３の正
確なｌａｃＵＶ５プロモーター配列を、配列決定によって確認した。

次に、ｐＣＡＬＧ１０−１中のｌａｃＺフラグメントを標準条件、ならびにオリゴヌク
レオチドプライマーＧＮｌａｃＺ１−５（配列番号１２０）およびＧＮｌａｃＺ３−３（
配列番号１２４）を使用してＰＣＲ増幅した。

ＧＮｌａｃＺ３−３のヌクレオチド配列は：５’−ＧＡＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴ
ＡＡＡＣＧ―３’（配列番号１２４）である。この配列は、ＮｏｔＩ部位を付加するため
のＴ３６２５Ｃ、Ｃ３６２６Ｇ、およびＣ３６３０Ｇヌクレオチドの変化（配列番号１２
４のヌクレオチド７〜１４で表される）を除いては、ｐＣＡＬＧ１０−１ヌクレオチド３
６１８〜３６３８と逆相補的である。

ｌａｃＺ ＰＣＲフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして単離した
。さらに、ｐＣＡＬＧ１６−３を、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＣＲ（登録商標
）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）、ｍｐｈＲ由来の配列、ｌａｃＩＤ、およびｌａｃＵＶ
５プロモーターを含むフラグメントを単離した。ｌａｃＺ ＰＣＲフラグメントおよびｐ
ＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）を含むｐＣＡＬＧ１６−３フラグメント
、ｍｐｈＲ由来の配列、ｌａｃＩＤ、およびｌａｃＵＶ５プロモーターを一緒に連結して
、ｐＣＡＬＧ２０−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ２０−１プラスミドは、ｐＣＲ
（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）、ｍｐｈＲ由来の配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃ
ＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、お
よび５’から３’方向のｌａｃＺコード領域を含む。

先に構築したｐＣＡＬＧ３−１を、ｐＣＡＬＧ２０−１と共に使用して、次の前駆体プ
ラスミドを生成した。ｐＣＡＬＧ３−１とｐＣＡＬＧ２０−１との両方を、ＡｐａＩで消
化した。ｌａｃＵＶ５プロモーターおよびｌａｃＺ配列を含むｐＣＡＬＧ２０−１フラグ
メント、ならびにｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）、ｍｐｈＲ配列、お
よび完全長ｌａｃＩを含むｐＣＡＬＧ３−１フラグメントを単離し、そして一緒に連結し
てｐＣＡＬＧ２２−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ２２−１は、ｍｐｈＲ配列、完
全長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接したＮｄｅ
Ｉ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商
標）を含む。

ｐＣＡＬＧ２２−１およびｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ、カタログ番号２７−４９５８−０１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０６４０４
）を使用して、次の前駆体プラスミドを生成した。ｐＣＡＬＧ２２−１およびｐＵＣ４Ｋ
を、いずれもＢａｍＨＩで消化した。ｍｐｈＲ配列を含むｐＣＡＬＧ２２−１フラグメン
ト、完全長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌａｃＺ配列、ならびにＫａｎ^ｒを含
むｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｐＵＣ４Ｋフラグメントを単
離し、一緒に連結してｐＣＡＬＧ２５−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ２５−１は
、Ｋａｎ^ｒ、ｍｐｈＲ配列、完全長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始
コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＣＲ（登録商
標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）からなる。

次の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ２５−１およびＰＫＬＮ０７−２
０（他に記載）を、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化した。Ｋａｎ^ｒ、ｍｐｈＲ配列、完全
長ｌａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ならびにｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性複製
開始点を含むｌａｃＺ配列およびｐＫＬＮ０７−２０フラグメント（先に記載）を含むｐ
ＣＡＬＧ２５−１フラグメントを単離し、一緒に連結してｐＣＡＬＧ２９−１を生成した
。この組換えｐＣＡＬＧ２９−１プラスミドは、Ｋａｎ^ｒ、ｍｐｈＲ配列、完全長ｌａｃ
Ｉ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接したＮｄｅＩ部位を有
する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性領域を含む。

ｐＣＡＬＧ２９−１を構築した後、これが最後の組み込みベクターであると考えられた
。しかし、ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位の付加が、ｌａｃＺの適切
な発現を阻害することがその後に確認された。従って、ｐＣＡＬＧ２９−１を、部位特異
的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ
部位特異的変異誘発キット、カタログ番号２００５１７）に供して、ＮｄｅＩ部位を破壊
し、ＮｄｅＩヌクレオチド変化を内因性ｌａｃＵＶ５ヌクレオチドに置換した。ｐＣＡＬ
Ｇ２９−１に必要な変化を行うために、ｐＣＡＬＧ２９−１を、オリゴヌクレオチドＧＮ
ｌａｃＺ−Ｎｄｅ１（配列番号１２５）およびＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ２（配列番号１２６
）を使用して、部位特異的変異誘発に供して、ｐＣＡＬＧ３１−１を生成した。

ＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ１のヌクレオチド配列は以下の通りである：５’−ＣＡＣＡＣＡ
ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣ−ＡＣＴＧＧ−３’（
配列番号１２５）。この配列は、ｐＣＡＬＧ１０−１のヌクレオチド１９１９〜１９５９
と同一である。ＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ２のヌクレオチド配列は以下の通りである：５’−
ＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ−ＴＧ
ＴＧ−３’（配列番号１２６）。この配列は、ｐＣＡＬＧ１０−１のヌクレオチド１９１
９〜１９５９と逆相補的である。

得られた組換えｐＣＡＬＧ３１−１プラスミドは、Ｋａｎ^ｒ、ｍｐｈＲ配列、完全長ｌ
ａｃＩ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接する内因性ヌクレ
オチドを有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性複製開始点を
含む。

組換えｐＣＡＬ３１−１を７１０７−１８に転換し、ｌａｃＵＶ５プロモーターの置換
を有するクローンを、温度選択手順を用いて生成した。正確なクローンを同定するため、
ゲノムＤＮＡを調製し、ｌａｃＵＶ５プロモーター領域をＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣ
Ｒ生成物を配列決定して、ｌａｃＵＶ５プロモーターの存在を確認した。１つの株が、予
想されるサイズのＰＣＲ生成物を生成し、正確なＤＮＡ配列を有していた。この株を７１
０７−３１０と名付けた。

（ＬａｃＩ欠失およびｌａｃプロモーターのｌａｃＵＶ５プロモーターによる置換）
Ｎ−アセチルグルコサミン生成株および／またはグルコサミン生成株においてｌａｃオ
ペロンからｌａｃＩを除去し、ｌａｃプロモーターをｌａｃＵＶ５プロモーターで置換す
るのに必要なプラスミドを生成するために、２つの前駆体プラスミドを発生させた。第一
の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ２０−１（上記を参照のこと）および
ｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２
７−４９５８−０１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０６４０４）を、ＢａｍＨＩで消化した
。ｍｐｈＲ配列を含むｐＣＡＬＧ２０−１フラグメント、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロ
モーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列
、ならびにＫａｎ^ｒを含むｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｐＵ
Ｃ４Ｋフラグメントを単離し、一緒に連結してｐＣＡＬＧ２６−１を生成した。この組換
えｐＣＡＬＧ２６−１は、Ｋａｎ^ｒ、ｍｐｈＲ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモー
ター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、お
よびｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）からなる。

次の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ２６−１およびｐＫＬＮ０７−２
０（他に記載）を、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化した。Ｋａｎ^ｒ、ｍｐｈＲ配列、ｌａ
ｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩを有
する）、ならびにｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性複製開始点を含むｌａｃＺ配列および
ｐＫＬＮ０７−２０フラグメントを含むｐＣＡＬＧ２６−１フラグメントを単離し、一緒
に連結してｐＣＡＬＧ３０−１を生成した。この組換えｐＣＡＬＧ３０−１プラスミドは
、Ｋａｎ^ｒ、ｍｐｈＲ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵＶ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コド
ンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位を有する）、ｌａｃＺ配列、およびｐＭＡＫ７０５由来
の温度感受性複製開始点を含む。

ｐＣＡＬＧ３０−１を構築した後、これが最後の組み込みベクターであると考えられた
。しかし、ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接するＮｄｅＩ部位の付加がｌａｃＺの適切な
発現を阻害することがその後に確認された。従って、ｐＣＡＬＧ３０−１を、部位特異的
変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ部
位特異的変異誘発キット、カタログ番号２００５１７）に供して、ＮｄｅＩ部位を破壊し
て、ＮｄｅＩヌクレオチド変化を内因性ｌａｃＵＶ５ヌクレオチドで置換した。ｐＣＡＬ
Ｇ３０−１に必要な変化を行うために、ｐＣＡＬＧ３０−１を、オリゴヌクレオチドＧＮ
ｌａｃＺ−Ｎｄｅ１（配列番号１２５）およびＧＮｌａｃＺ−Ｎｄｅ２（配列番号１２６
）を使用して、部位特異的変異誘発に供して、ｐＣＡＬＧ３２−２を生成した。得られた
組換えｐＣＡＬＧ３２−２プラスミドは、Ｋａｎ^ｒ、ｍｐｈ配列、ｌａｃＩＤ、ｌａｃＵ
Ｖ５プロモーター（ｌａｃＺ開始コドンの５’に隣接した内因性ヌクレオチドを有する）
、ｌａｃＺ配列、およびｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性領域を含む。

この組換えｐＣＡＬＧ３２−２を７１０７−１８へ転換し、ｌａｃＵＶ５プロモーター
置換を有するクローンを、温度選択手順を使用して生成した。正確なクローンを同定する
ため、ゲノムＤＮＡを調製し、ｌａｃＵＶ５プロモーター領域をＰＣＲ増幅した。次いで
、ＰＣＲ生成物を配列決定して、ｌａｃＵＶ５プロモーターの存在を確認した。３つの株
は予想したサイズのＰＣＲ生成物を生成し、正確なＤＮＡ配列を有した。これらの株を、
７１０７−３１３、７１０７−３１４、および７１０７−３１５と名付けた。

（ＤＥ３要素からのＬａｃＩ欠失）
生成株のゲノム中のＤＥ３要素からｌａｃＩ遺伝子を欠失させるため、実施例１３に記
載の温度感受性選択法を使用した。この戦略には、ｌａｃＩ欠失のためにＤＥ３要素を標
的とする組み込みベクターの構築が含まれる。構築の第一の工程として、ＤＥ３要素のｌ
ａｃＩを含む領域を、Ｅ．ｃｏｌｉ７１０７―７３ゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。
Ｅ．ｃｏｌｉゲノムのＴ７ＲＮＡＰおよびａｔｔＢ領域の公開された配列に基づいてプラ
イマーを合成した（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３３１
）：１４５３−１４７４）。以下の配列を有する順方向プライマー０７−７４および／ま
たは逆方向プライマー０７−４８を増幅のために使用した：０７―７４：５’−ＧＡＴＣ
ＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＡＣＧＡＴＴＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号１２７）：お
よび０７−４８：５’−ＧＴＣＡＧＡＧＡＡＧＴＣＧＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＴＧ−３’（
配列番号１２８）。

順方向プライマー０７−７４は、ＳｍａＩ部位（ＣＣＣＧＧＧ、配列番号１２７のヌク
レオチド４〜９に表される）を付加し、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムのａｔｔＢ部位の１１９４塩
基対上流から増幅する。逆方向プライマー０７−４８は、Ｔ７遺伝子１ＡＴＧ開始コドン
の３６塩基対上流から増幅する。得られた約３．２ｋｂのＰＣＲフラグメントを、ベクタ
ーｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に連結して、プラスミドｐＳＷ０７−５３
＃７および＃１７を生成した。ＤＮＡ配列決定から、このＰＣＲ生成物がＤＥ３要素由来
のａｔｔＢ部位およびｌａｃＩ ｌａｃＺ’フラグメントの上流のゲノム領域を含んでい
たことが明らかになった。

ｌａｃＩ欠失を生成するために、プラスミドｐＳＷ０７−５３＃１７を、制限エンドヌ
クレアーゼＭｌｕＩおよびＳｆｏＩで消化して、ｌａｃＩコード配列の６４０塩基対フラ
グメントを除去した。ｐＳＷ０７−５３プラスミドの残りを、Ｔ４ＤＮＡＰで処理して平
滑末端を生成し、次いで、それ自体に連結してプラスミドｐＳＷ０７−５５＃１３を生成
した。

ｌａｃＩ欠失を有するＤＥ３配列を含むフラグメントを、プラスミドｐＳＷ０７−５５
＃１３から制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。このフラグメン
トを、ｐＭＡＫ７０５由来の温度感受性レプリコン（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９、Ｊ
．Ｂａｃ．１７１（９）：４６１７−４６２２）、およびｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン
耐性カセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ、ＮＪ）を含むｐＫＬＮ０７−２１由来の４．２ｋｂのＳａｌＩおよびＮｏｔＩ
フラグメントと連結した。得られたプラスミドｐＫＬＮ０７−５６＃１３を使用して、Ｅ
．ｃｏｌｉ染色体上にＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失を生成した。

ＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失を有する株を生成するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ７１０７−１
８をプラスミドｐＳＷ０７−５６＃１３で形質転換した。温度感受性選択および継代培養
プロトコールに従って、欠失の存在について標準ＰＣＲプロトコールを使用して株をスク
リーニングした。ＰＣＲによって同定されたいくつかの株を、プローブとしてＤＥ３要素
のｌａｃＩおよびｌａｃＺフラグメントの部分を含むフラグメントを使用して、高ストリ
ンジェントなサザンハイブリダイゼーションによって確認した。これらの株を、７１０７
−８４（１）から７１０７−８４（４）と名付けた。

（振盪フラスコにおけるｌａｃＩＤおよび／またはｌａｃＵＶ５プロモーター置換を有
する株におけるグルコサミン生成）
２つの機能性ｌａｃＩ遺伝子を有する７１０７−１８株と対照的に、７１０７−８４（
１）株はただ１つの機能性ｌａｃＩ遺伝子を含む。振盪フラスコスクリーニング４２を行
って、ラクトース誘導における７１０７−８４（１）株のｌａｃＩ欠失の効果を測定した
。過剰のグルコースおよびラクトースの存在下では、ｌａｃオペレーターに結合するＬａ
ｃＩレプレッサタンパク質に起因して、ラクトースによる誘導は７１０７−１８株中では
阻害され、転写が阻止されるはずである。ｌａｃオペレーターに結合するために存在すべ
きＬａｃＩレプレッサタンパク質はより少ないので、グルコースによるこの阻害は７１０
７−８４（１）株中で減少されるべきであり、このことが、ｌａｃプロモーターからの増
加した転写を可能にする。このことは、細胞中のＴ７ＲＮＡＰのプールを増加させ、その
結果、Ｔ７ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４カセットからの増加した転写を生じる。最終的に、よ
り高いレベルのグルコサミンが７１０７−８４（１）株中で生じる。同様に、ｌａｃＩ欠
失がｌａｃオペロンである株（例えば、７１０７−３１３、７１０７−３１４および７１
０７−３１５）は、ラクトース誘導の際により高いレベルのＧｌｃＮ生成を有するべきで
ある。

ｌａｃオペロンからｌａｃＩ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株（７１０７−３１０）、
ＤＥ３要素からｌａｃＩ遺伝子が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株（７１０７−８４＃１）、およ
びｌａｃオペロンからのｌａｃＩ欠失を有しｌａｃプロモーターがｌａｃＵＶ５プロモー
ターで置換されたＥ．ｃｏｌｉ株（７１０７−３１３、７１０７−３１４および７１０７
−３１５）を、振盪フラスコ実験で７１０７−１８株と比較した。すべての株は、ＭｇＳ
Ｏ_４−７Ｈ_２Ｏ ０．６ｇ／ｌおよびＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ ０．０５ｇ／ｌを補充した
Ｍ９Ｂ培地（ＫＨ_２ＰＯ_４ ６ｇ／ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ２４ｇ／ｌ、クエン酸Ｎａ_３−２
Ｈ_２Ｏ １ｇ／ｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ １０ｇ／ｌ（ｐＨをリン酸塩で７．４に調整し
た）、および微量金属（ＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ ０．２ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ
０．０１５ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ_４−Ｈ_２Ｏ ０．０１５ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２
Ｏ ０．００１ｍｇ／ｌ、ＮａＭｏＯ_４−２Ｈ_２Ｏ ０．００１ｍｇ／ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３
０．００１ｍｇ／ｌ、およびＣｏＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ ０．００１ｍｇ／ｌ））を含むフラ
スコ中で増殖させた。グルコース抑制を試験するために、フラスコに様々な量のグルコー
スおよびラクトースを加えた。このフラスコに使用したグルコースとラクトースの量を、
表４および表５に示す。培養物を、２２５ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で２４時間増殖
させ、次いで、２２５ｒｐｍで振盪しながら残りの実験の間、２５℃で静置した。２４時
間および４８時間で、各々の培養物のｐＨを７．０に調整し、グルコースをフラスコに約
３０ｇ／ｌ加え、そしてアンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下した培地に５ｇ／ｌの（
ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を加えた。サンプルを２４時間および４８時間で収集した。米国特許第
６、３７２、４５７号Ｂ１に記載の改変したＥｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎアッセイを使用し
て、各時点での培養上澄中のグルコサミン濃度を測定した。グルコサミンレベルを表３１
に示す。

予想した通り、７１０７−１８株、７１０７−８４（１）株、７１０７−３１０株およ
び７１０７−３１３株は、グルコース単独またはラクトース単独の存在下で、同様に機能
を果たした。誘発因子が存在しないため、グルコース中で増殖させた場合、何れの株でも
ＧｌｃＮの生成はほとんど見られなかった。ラクトースを誘発因子として用いて株を増殖
させた場合、両方の株でグルコサミンの有意な蓄積を生じた。しかし、株をグルコースお
よびラクトース両方の存在下で増殖させた場合、染色体からｌａｃＩ遺伝子の１つのコピ
ーを除去すると、ラクトース誘導、すなわちグルコサミン力価が顕著に影響を受けた。４
８時間の時点で、７１０７−３１３株および７１０７−８４（１）株は、７１０７−１８
株で見られたグルコサミンレベルの約６〜８倍を達成した。このことは、減少したＬａｃ
Ｉレプレッサタンパク質がｌａｃプロモーターからの増加した転写を可能にし、グルコサ
ミン生成の増加したレベルが生じるという考えが確認する。
（表３１．振盪フラスコスクリーニング４２による様々なサンプル中のグルコサミン濃度
）

（ｌａｃＩＤおよび／またはｌａｃＵＶ５プロモーターの置換を有する株におけるＴ７
ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットの組み込み）
ＮＡＧ生成株におけるグルコース脱抑制に対するｌａｃＩ欠失の効果を評価するために
、７１０７−８４（１）株および７１０７−８４（２）株の染色体にＴ７ｌａｃ−ＳｃＧ
ＮＡ１カセットを加えることが必要であった。プラスミドｐＳＷ０７−６８＃５による温
度感受性選択によるＧＮＡ１クローニングおよび組み込みについて記載された方法および
プロトコールを、他に詳述されるように使用した。得られた７１０７−９７株および７１
０７−９８株は、プローブとしてＳｃＧＮＡ１コード配列を使用して標準的な高ストリン
ジェントなサザンハイブリダイゼーションによって、染色体のｍａｎＸＹＺ欠失部位に組
み込まれたＴ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を有すると確認された。

同様に、潜在的にグルコース脱抑制性の株について他のバージョンを構築した。３１０
７−３１０株を、ｌａｃオペロンのプロモーターをプロモーターのｌａｃＵＶ５バージョ
ンに変えることによって構築した。７１０７−３１３株、７１０７−３１４株および７１
０７−３１５株は、ｌａｃオペロンのプロモーターをプロモーターのｌａｃＵＶ５バージ
ョンに変えるのに加えて、ｌａｃＩ遺伝子の染色体コピーを欠失することによって構築し
た。ＮＡＧ生成の背景におけるグルコース脱抑制に対するこれらの変異の効果を評価する
ために、Ｔ７ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１カセットを株の染色体に加えた。プラスミドｐＳＷ０
７−６８＃２５を用いる温度感受性選択によるＧＮＡ１のクローニングおよび組み込みつ
いて記載される方法およびプロトコールを、７１０７−３１０株および７１０７−３１３
株について使用した。得られた７１０７−１２９株および７１０７−１３０株（７１０７
−３１０株由来）、ならびに７１０７−１３１株（７１０７−３１３株由来）は、プロー
ブとしてＳｃＧＮＡ１コード配列を用いる高ストリンジェントなサザンハイブリダイゼー
ションを使用して、染色体のｍａｎＸＹＺ欠失部位によって組み込まれたＴ７ｌａｃ−Ｓ
ｃＧＮＡ１を有すると確認された。

（振盪フラスコにおけるｌａｃＩＤおよび／またはｌａｃＵＶ５プロモーターの置換を
有する株におけるＮ−アセチルグルコサミン生成）
ＮＡＧ生成株におけるグルコース脱抑制に対するＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失の効果を評
価するために、スクリーニングを行った。グルコースおよびラクトースのレベルを変化さ
せながら、リボースを添加してかまたは添加せずに７１０７−９７株および７１０７−９
８（２）株を試験した。ｌａｃＩの２つのコピーを有するＮＡＧ生成７１０７−９２（１
）株をコントロールとして含めた。培養物を、０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、０
．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、様々な濃度のグルコースおよびラクトース、およ
び５ｇ／ｌの酵母抽出物を補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で増殖させた。株を最初に１０
ｇ／ｌのグルコースで増殖させ、一旦グルコースが欠乏するとラクトースの利用に切り替
えた。グルコース抑制に対する感度を測定するために、過剰グルコース条件（ラクトース
の存在下で）もまた使用した。各々の可変をリボース添加とともにかリボース添加をせず
に実施した。培養物を３０℃で２４時間増殖させ、次いで、残りの実験の間は２５℃に切
り替えた。２４時間および４８時間の時点で、ｐＨを７．２に調整し、グルコースを合計
で３０ｇ／ｌまで加えた。レベルが１ｇ／ｌ以下に低下したフラスコ中には、５ｇ／ｌの
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を２４時間および４８時間で加えた。サンプルを、２４時間、４８時
間および７２時間で、ＮＡＧ生成について分析した。

コントロール株は、非抑制条件下で良好に機能を果たし、２０ｇ／ｌより多くのＮＡＧ
を生じたが、グルコース過剰ではわずか約５ｇ／ｌであった（表３２）。一方の変異株（
７１０７−９８）は、コントロールに対して同様に機能を果たしたが、他方（７１０７−
９７）は、過剰のグルコースが存在する場合でさえ、２０ｇ／ｌより多くのＮＡＧを生成
し、グルコース耐性を示した。実際に、この株はまた、ＮＡＧ生成と酢酸塩蓄積の観点か
ら、非抑制条件下でコントロールより優れているように思われた。培養物へのリボースの
添加は、この実験における増殖またはＮＡＧ力価を有意に増加させなかった。全体的な結
果は、ＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失が、少なくとも部分的にグルコース抑制を軽減し、生成
株におけるＮＡＧ力価を改善することを示す。

（表３２．様々な量のグルコースおよびラクトースの存在下でのグルコース脱抑制に対
するＤＥ３要素のｌａｃＩ欠失の効果）

１）株：コントロール７１０７−９２（１）：２つのｌａｃｌ遺伝子
７１０７−９７および７１０７−９８（２）：１つのｌａｃｌ遺伝子 の
み（ＤＥ３中の１つは欠失）
２）ＯＤ_６００、酢酸塩レベル、およびＮＡＧレベルは７２時間の時点より。

グルコース脱抑制について７１０７−１２９株、７１０７−１３０株および７１０７−
１３１株を評価するために、別のスクリーニングを行った。２つのｌａｃＩコピーを有す
るＮＡＧ生成株７１０７−９２（１）をコントロールとして含めた。培養物を、０．６ｇ
／ｌのＭｇＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、および０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、様々な濃
度のグルコースおよびラクトース、５ｇ／ｌのリボースおよび５ｇ／ｌの酵母抽出物を補
充したＭ９Ｂ培地（上記）中で増殖させた。株を、最初に１０ｇ／ｌのグルコースで増殖
し、ラクトースによる誘導を確認するため、一旦グルコースが欠乏するとラクトースの利
用に切り替えた。グルコースが常に存在する過剰グルコース条件（ラクトースの存在下で
）もまた使用して、７１０７−１３１株を試験し、誘導に関連するグルコースに対する感
度を測定した。培養物を、３０℃で２４時間増殖させ、残りの実験の間は２５℃に切り替
えた。ｐＨを７．２に調整し、２４時間および４８時間の時点でグルコースを１日あたり
合計３０ｇ／ｌまで加えた。レベルが１ｇ／ｌ以下に低下したフラスコに、５ｇ／ｌの（
ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を２４時間および４８時間で加えた。２４時間、４８時間、および７２
時間でサンプルのＮＡＧ生成を分析した。

表３３に見られるように、ｌａｃＵＶ５変異株（７１０７−１３０）の１つおよびｌａ
ｃＩ欠失を有するｌａｃＵＶ５変異株（７１０７−１３１）の１つは、最初にグルコース
で増殖させ、グルコース欠乏後にラクトースに切り替えた場合に、コントロール株より良
好に機能した。グルコース過剰の条件では、７１０７−１３１株は、コントロール株７１
０７−９２（１）より優れ、約３０％より多いＮＡＧを生成した。このことは、ｌａｃＩ
の何れかのコピーの欠失が、グルコース抑制軽減を補助し、過剰のグルコースの存在下で
誘導が生じることを可能にし、ＮＡＧ力価を改善することを確認する。

（表３３．グルコース制限または過剰条件下におけるｌａｃＩ欠失および／またはｌａ
ｃＵＶ５プロモーターのＮＡＧ生成に対する影響）

１）株：コントロール株７１０７−９２（１）：ｌａｃＩ（ｌａｃ）、ｌａｃ（ＤＥ３）
、７１０７−１２９、７１０７−１３０：ｌａｃＵＶ５、ｌａｃＩ（ｌａｃ）、ｌａｃＩ
（ＤＥ３）、７１０７−１３１：ｌａｃＵＶ５、ｌａｃＩΔ（ｌａｃ）、ｌａｃＩ（ＤＥ
３）
２）ＯＤ_６００、酢酸塩レベル、およびＮＡＧレベルは７２時間の時点より。

（実施例２９）
以下の実施例は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはグルコサミン蓄積における
ガラクトース利用の回復の効果を実証する。

ｇａｌＫΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４コンストラクトを含むラクトース誘導性
Ｎ−アセチルグルコサミン生成株および／またはグルコサミン生成株は、ｇａｌＫΔに起
因して炭素源としてガラクトースを使用することはできない。これらの株は、β−ガラク
トシダーゼによってラクトースをグルコースとガラクトースとに切断することに起因して
、ガラクトースを蓄積する。これらの株でガラクトース蓄積を減少させる努力において、
Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４発現カセットを異なる染色体位置中に組み込む必要がある
。先に構築されたＮ−アセチルグルコサミン生成株および／またはグルコサミン生成株は
、ｎａｇΔ：：Ｔｅｔ^ｒを含む。ゲノムのｎａｇΔ：：Ｔｅｔ^ｒ部分を、米国特許第６、
３７２、４５７Ｂ１号に記載される様に、親株ＩＢＰＣ５９０（Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ（
１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５，２０５３−２０６２））からＰ１ファージ
感染によって移した。生成株においてＴｅｔ^ｒの存在は望ましくない。従って、Ｔ７−ｌ
ａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４でのＴｅｔ^ｒの置換は、単にＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４のため
の組み込み部位を提供するだけでなく、同じプロセスでＴｅｔ^ｒを除去する。

７１０７−１８株（先に実施例７に記載した）を生成するためのΔｇａｌｋＴ７−ｌａ
ｃ−ｇｌｍＳ^＊５４コンストラクトの７１０７−１７（ＤＥ３）への組み込みは、グルコ
サミン生成における有意な増加をもたらしている。さらに、ｍａｎＸＹＺΔ：：Ｔ７−ｌ
ａｃ−ＳｃＧＮＡ１コンストラクトの７１０７―１８への組み込みは、実施例１６に記載
したＮ−アセチルグルコサミンの生成をもたらす。ガラクトースを代謝し得るＮ−アセチ
ルグルコサミン生成株を発生させるために、Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４発現カセット
をｎａｇＤ：：Ｔｅｔ^ｒ部位に組み込み、次いで、Ｔ７−ｌａｃ−Ｓｃ ＧＮＡ１発現カ
セットをｍａｎＸＹＺ部位に挿入した。

ｎａｇΔ：：Ｔ７―ｌａｃ―ｇｌｍＳ^＊５４およびｍａｎＸＹＺΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−
Ｓｃ ＧＮＡ１を含む株の構築に関する工程は、３つの前駆体プラスミドの生成を含む。
第一の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＫＬＮ２３−５４由来のＴ７−ｌａｃ−ｇ
ｌｍＳ^＊５４フラグメント（米国特許第６、３７２、４５７Ｂ１号に記載される）を、標
準条件を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーＧＮｇｌｍＳｎａｇＥ３−５（配列番
号１２９）およびＧＮｇｌｍＳｎａｇＥ４−３（配列番号１３０）を用いてＰＣＲ増幅し
た。

ＧＮｇｌｍＳｎａｇＥ３−５：５’−ＧＧＡＴＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＧＡＣ
ＣＧＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡ−ＧＴＧ−３’（配列番号１２９）。このプライマーは、以
下を除いてｐＫＬＮ２３−５４のヌクレオチド１１０９〜１１４６と同一である：Ｃ１１
１５Ａ、Ｃ１１１６Ａ、Ｇ１１２０Ｔ、Ｇ１１２２Ａ、Ｇ１１２５Ａ、Ｇ１１２９Ａおよ
びＣ１１３３Ｇ。ｐＫＬＮ２３−５４のヌクレオチド１１１５〜１１２５（配列番号１２
９のヌクレオチド８、１２、１４、１７、２１および２５に対応する）での変化は、ＰＣ
Ｒにおけるプライマーの安定性を増加させるために行い、そしてｐＫＬＮ２３−５４の１
１２９および１１３３での変化は、ＡｇｅＩ部位を配列番号１２９（配列番号１２９の位
置２１〜２６で表される）に加えるために行った。

ＧＮｇｌｍＳｎａｇＥ４−３：５’−ＣＣＣＴＣＧＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＴＴ
ＡＡＡＴＴＣＡＧＴＣＡＡＴＴ−ＡＣ−３’（配列番号１３０）。このプライマーは、以
下を除いてｐＫＬＮ２３−５４のヌクレオチド３２３７〜３２７４と逆相補的である：Ｔ
３２５１Ａ、Ｇ３２５３Ｔ、Ｇ３２５６Ａ、Ａ３２７０Ｃ、およびＴ３２７３Ｃ（配列番
号１３０の位置２４、２２、１９、５および２で表される）。３２５１から３２５６での
変化は、ＳｗａＩ部位（配列番号１３０の位置１９〜２６で表される）を加えるために行
い、３２７０および３２７３での変化はＰＣＲにおけるプライマーの安定性を増加させる
ために行った。

得られたＰＣＲ生成物をｐＣＲ（登録商標）−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣ
Ｒクローニングキット、カタログ番号Ｋ２８００−２０）に連結した。組換えプラスミド
ｐＣＡＬＧ３８−２は、５’がＡｇｅＩ部位によって隣接されかつ３’がＳｗａＩ部位に
よって隣接されるＴ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４発現カセットを含む。

第二の前駆体カセットを生成するために、ｎａｇΔ：：Ｔｅｔ^ｒ：：ａｓｎフラグメン
トを、ＧＮｎａｇＥｔｅｔＲ１−５（配列番号１３１）およびＧＮｎａｇＥｔｅｔＲ２−
３（配列番号１３２）を使用して、ＰＣＲによってＥ．ｃｏｌｉ ７１０７−１８株から
増幅した。ＧＮｎａｇＥｔｅｔＲ１−５のヌクレオチド配列は以下の通りである：５’−
ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１３１）。ＧＮ
ｎａｇＥｔｅｔＲ２−３のヌクレオチド配列は以下の通りである：５’−ＣＧＧＡＡＧＡ
ＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号１３２）。

ＰＣＲ生成物をｐＣＲ（登録商標）−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）に連結し
て、組換えプラスミドｐＣＡＬＧ３５−１を生成した。

第三の前駆体プラスミドを生成するために、ｐＣＡＬＧ３８−２を、ＡｇｅＩおよびＳ
ｗａＩで消化し、Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４フラグメントを精製した。さらに、ｐＣ
ＡＬＧ３５−１をＡｇｅＩおよびＮｒｕＩで消化し、ＮｒｕＩおよびａｓｎ−ｐＣＲ（登
録商標）−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）−ｎａｇＤフラグメントを精製した。
ｐＣＡＬＧ３８−２およびｐＣＡＬＧ３５−１由来の精製したフラグメントを連結して、
ｐＣＡＬＧ４０を生成した。組換えｐＣＡＬＧ４０プラスミドは、ｐＣＲ（登録商標）−
ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）中にｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ＊５４
：：ａｓｎフラグメントを含む。

組み換えｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４：：ａｓｎフラグメントをゲノム
に組み込むために必要な最後のプラスミドを作成するため、以下の作業を行った。ｐＣＡ
ＬＧ４０をＫｐｎＩおよびＮｏＩで消化し、ｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４
：：ａｓｎを含むフラグメントを単離した。さらに、ｐＫＬＮ０７−２１（上記）をＫｐ
ｎＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ｋａｎ^ｒ（ｐＵＣ４Ｋ由来、上記）および温度感受性複製
開始端（ｐＭＡＫ７０５由来）を含むフラグメントを単離した。ＣＡＬＧ４０由来の、ｎ
ａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４：：ａｓｎフラグメント、Ｋａｎ^ｒフラグメン
トおよび温度感受性複製開始点ｐＫＬＮ０７−２１をライゲートしｐＣＡＬＧ４３−２を
作成した。

プラスミドｐＣＡＬＧ４３−２を７１０１−１７（ＤＥ３）中に形質転換し、ｎａｇＤ
：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４：：ａｓｎをゲノム中に有するクローンを作成した。
正しいクローンをＰＣＲで同定し、サザンブロット分析で確認した。クローンをテトラサ
イクリン耐性の喪失でも確認した。

ｎａｇＤ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４：：ａｓｎを含む株をＰＣＲでスクリーニ
ングするため、１対のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。前方プラーマーＧＮｎ
ａｇＥＴ７ｇｌｍＳ１−５は配列５’−ＣＡＣＧＡＣＡＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣ
ＴＣＧ−３’（配列番号１３３）を有する。逆方向プライマーＧＮｎａｇＥＴ７ｇｌｍＳ
２−２は配列５’−ＣＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣ−３’（
配列番号１３４）を有する。前方プライマーおよび逆方向プライマーは、オリゴヌクレオ
チドＣＮｎａｇＥｔｅＲ１−５（配列番号１３３）およびＧＮｎａｇＥｔｅＲ２−３（配
列番号１３４）から精製したｎａｇＤ：：Ｔｅｆ：：ａｓｎＰＣＲフラグメントの５’お
よび３’にそれぞれ位置する。ＰＣＲで４種の株が同定され、７１０７―３２１＃１、＃
２、＃３および＃４と名付けられた。

７１０７−３２１株中へのｎａｇΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４の７１０７−３
２１株中への組み込みを確認するため、ゲノムＤＮＡを単離し、標準条件下でｎａｇＥ特
異性プローブを用いてサザンブロットで分析した。７１０７−３２１株はサザン分析で正
しいことが見出された。さらに、７１０７−３２１株がテトラサイクリンを含む培地上で
生育できないので、ｎａｇΔ：：Ｔｅｆ：：ａｓｎが存在しないことも確認された。

ｍａｎＸＹＺΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１コンストラクトを加えるため、組み換
えｐＳＷ０７−６８プラスミド（上記）を各７１０７−３２１株中に形質転換した。ゲノ
ム中に組み込まれたｍａｎＸＹＺΔ：：Ｔ７−ｌａｃ−ＳｃＧＮＡ１を有するクローンを
温度選択法を用いて作成した。クローンをＰＣＲで同定し、サザンブロット分析で確認し
た。１２種の株が予期したサイズのＰＣＲ生成物を生成した。これらの株を７１０７−３
２５＃１、＃２および＃３（７１０７−３２１＃１由来）;７１０７３２６＃１、＃２お
よび＃３（７１０７−３２１３＃２由来）;７１０７−３２７＃１、＃２および＃３（７
１０７−３２１＃３由来）;および７１０７−３２８＃１、＃２および＃３（７１０７−
３２１＃４由来）と名付けた。これらの株はすべて、ＧＮＡ１特異性プローブを用いるサ
ザンブロット分析で正しいことが確認された。

（振盪フラスコ実験におけるガラクトースを代謝し得るＮ−アセチルグルコサミン生産
株の評価）
ガラクトースを代謝し得るＮ−アセチルグルコサミン生産株（７１０７−３２５＃１、
７１０７−３２６＃１、７１０７−３２７＃１および７１０７−３２８＃１）を振盪フラ
スコ実験で試験した（表３４）。０．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏおよび０．０５ｇ
／ｌのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏを補充したＭ９Ｂ培地を含むフラスコ中で株を試験した。ス
クリーニング５４および５５には０．２ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０１５ｍ
ｇ／ｌのＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００１ｍｇ／ｌのＨ_３ＢＯ_３および０．００１ｍ
ｇ／ｌのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏの微量金属を補給し、スクリーニング５９および６６には
０．５ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３８ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０
．０３３ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、０．０１ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏおよ
び０．０１ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏの微量金属を補給した。表３４に示す様に、
様々な量のグルコース（Ｇｌｕ）、ラクトース（Ｌａｃ）、酵母抽出物（ＹＥ）およびホ
エーパーミエート（ＦｏｒｍｏｓｔＷｈｅｙ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）をフラスコ中に使用
した。スクリーニング５４および５５では、培養細胞を２２５ｒｐｍで浸透して３０℃で
２４時間生育させ、次いで実験の残りの期間、２２５ｒｐｍで浸透して２５℃に置いた。
スクリーニング５９および６６では、培養細胞を２２５ｒｐｍで浸透して３０℃で８〜１
０時間生育させ、次いで実験の残りの期間、２２５ｒｐｍで浸透して２５℃に置いた。ス
クリーニング５９および６６では、１０時間でｐＨを７．２に調節し、培養液がグルコー
ス欠乏である場合は２０〜２５ｇ／ｌのグルコースを加えた。四つのスクリーニングの全
てで、２４および４８時間に各培養液のｐＨを７．２に調節し、グルコースを約３０ｇ／
ｌで加え、アンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下した培養液では５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）
_２ＳＯ_４を加えた。スクリーニング６６および３０では、必要あれば３０および５４時間
でグルコースを加え、ｐＨを７．２に調節し、アンモニアレベルが１ｇ／ｌ以下に低下し
た培養液では５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を加えた。四つのスクリーニングの全てで、
試料を２４および／または４８時間で採取し、培養上澄中のＮ−アセチルグルコサミンお
よびグルコサミン濃度をＨＰＬＣ炭水化物カラムを用いて測定した。

異なった試料中のＮ−アセチルグルコサミン濃度が表３４に示される。実験から、ある
条件かでは、ｇａｌＫ部位の変わりにｎａｇΔ部位にＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４を組み
込むことで、Ｎ−アセチルグルコサミンの生産を改善されることが結論できる。予想通り
、ｇａｌＫ部位の変わりにｎａｇΔ部位にＴ７ｌａｃ−ｇｌｍＳ^＊５４を組み込むことで
ガラクトースの蓄積がなくなった。

（表３４．異なった生育条件下でのＮ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンレベ
ル）

^＊対照:非グルコースユーザー株７１０７−９２
他の全ての株はグルコースユーザー同胞株
Ｇｌｕ＝グルコース、Ｌａｃ＝ラクトース、ＹＥ＝酵母抽出物、ＷＰ＝ホエーパーミエ
ート
（１リッター醗酵槽におけるガラクトース代謝可能なＮ−アセチルグルコサミン生産株
の評価）
ガラクトースを使用可能な株（７１０７―３２５＃１および７１０７−３２８＃１）を
ガラクトース非ユーザー株（７１０７−９２＃１）と１リッター醗酵槽中で比較した。醗
酵槽を以下の培地を含む初期容積４７５ｍｌに設定した：Ｈ_３ＰＯ_４４．７９ｇ／ｌ、Ｋ
ＯＨ ３．１５ｇ／ｌ、クエン酸・Ｈ２Ｏ ３．６５ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ_４５ｇ／
ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ２Ｏ２．５ｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２／２Ｈ_２Ｏ０．０５ｇ／ｌ、微量
金属（ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ５ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ３．７５ｍｇ／ｌ、Ｍ
ｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ０．６ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１００２ｍｇ／ｍＬ、お
よびＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ０．１００２ｍｇ／ｌ）、およびＭａｚｕ２０４消泡剤。４５
％ＫＯＨを使用してｐＨを７．０に調節した。７５％ＮＨ４ＯＨを使用したｐＨ（６．９
）を保ち、温度を３７℃に保ち、曝気と攪拌速度を利用して溶存酸素濃度を飽和濃度の２
０％に保った。コンピュータープログラムで制御して６５％グルコースを培養液に供給し
、接種時の生育速度を０．４／時間、６時間で最高速度５ｍｌ／時間を達成した。グルコ
ースを連続的に供給し、食品グレードラクトースを加えて培養を誘導した。

醗酵実験中の約１０、２１、２８、３５、４５、５２および６０時間で７種の試料を採
取した。各試料につき、培養の健全性をモニターするためのいくつかの他の成分の濃度に
加えて、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびガラクトース濃度をＨＰＬＣ炭化水素カラムを
用いて測定した。予想通り、対照株７１０７−９２＃１からの培地にはガラクトースが検
出されたが（試料７で０．６ｇ／ｌ）、７１０７−３２５＃１および７１０７−３２８＃
１株が存在する培地ではガラクトースが蓄積しなかった。ガラクトースを消費し得る株で
は、この様な条件下でＧｌｍＳ^＊５４を発現することがＮ−アセチルグルコサミンの生産
を改善しなかった。しかしながら、この醗酵に用いた培地は７１０７−９２＃１株に対し
て最適化されている。最適性能のためにはグルコースユーザー株は若干異なった醗酵条件
を要求すると考えられる。７１０７−３２５＃１および７１０７−３２８＃１株が、７１
０７−９２＃１株より多い量のＮ−アセチルグルコサミンを生産し得る培地を作成可能で
あると考えられる。従って、ｇａｌＫ部位の代わりにｎａｇＤ部位へＴ７−ｌａｃ−ｇｌ
ｍＳ＊５４発現カセットを組み込むことで、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミ
ン生産が有利になることが予想される。
Ｎ−アセチルグルコサミン生産用醗酵プロセス開発
（実施例３０）
本実施例はＳｃＧＮＡ１プラスミドを含む株によるＮＧＡ凄惨の最適化のための振盪フ
ラスコ実験を説明する。

ＳｃＧＮＡ１の過剰発現によりＥ．ｃｏｌｉグルコサミン生産株中で高レベルのＮＡＧ
が得られることが確定したので、次に工程はＨＡＧ生産条件を最適化することである。用
いられたアプローチは振盪フラスコ中で過剰発現の酢酸を製造せず、細胞密度、従ってＮ
ＧＡ力価を増すことである。プラスミドｐＥＴ２４ｄ（＋）のＴ７プロモーター由来のＳ
ｃＧＮＡ１の発現を、最初の最適化実験で用いた。

（酵母抽出物の添加と遅延誘導）
７１０７−８７＃２５中における酵母抽出物添加の生育に対する効果、酢酸の蓄積およ
びＮＡＧ生産を振盪フラスコで試験した。０．２ｍＭＩＰＴＧによる早期および遅延誘導
の効果も試験した。株をＭ９Ｂ培地（上記）中で生育させたが、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を７
．５ｇ／ｌに減少させた。Ｍ９Ｂ培地に３０ｇ／ｌのグルコース、０．６ｇ／ｌのＭｇＳ
Ｏ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏおよび２５ｍｇ／ｍｌのカナマ
イシンを補充した。遅延誘導の場合を除いて０．２ｍＭのＩＰＴＧをフラスコに添加した
が、遅延誘導では接種の２４時間後に加えた。対照フラスコには酵母抽出物を添加しなか
った。試験フラスコでは、酵母抽出物（０．５〜４．０ｇ／ｌの範囲）を実験開始時、ま
たは接種後２４時間で添加した。培養細胞を２４時間まで３０℃で生育し、その後２５℃
に置いた。２４および４８時間で、５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４および２０ｇ／ｌのグ
ルコースを各フラスコに添加し、ｐＨを７．２に調製した。

表３５に見られる様に、酵母抽出物の添加により生育とＮＡＧ生産が増加した。事実、
実験開始時に４ｇ／ｌの酵母抽出物得を添加したフラスコで成績が最も良く、対照フラス
コ中で２．９ｇ／ｌのＮＡＧを生産したのに比較して８．９ｇ／ｌのＮＡＧを達成した。
しかしながら、フラスコ中に３．０ｇ／ｌの酢酸も蓄積した。酵母抽出物を２４時間の生
育後に添加したフラスコでは、実験開始時に酵母抽出物を添加したフラスコと同程度の生
育を示したが、酢酸の蓄積は少なかった。しかしながら、これらの条件下で４ｇ／ｌの酵
母抽出物を含むフラスコ中ではＮＡＧ生産は４８時間で４．９ｇ／ｌに過ぎなかった。さ
らに、遅延誘導のフラスコでは、ＮＡＧ生産が遅れたが、０．２ｍＭのＩＰＴＧで初期に
誘導したフラスコより生育は良かった。このことは、Ｎ−アセチルグルコサミン合成の誘
導が細胞生育に何らかの負の効果を有することを示唆している。

（表３５．７１０７−８７＃２５株における酵母抽出物添加および遅延誘導の生育、酢
酸蓄積およびＮＡＧ生産に対する効果）

１）結果は４８時間の時点
（様々な糖と酵母抽出物の添加）
７１０７−８７＃２５株における生育、酢酸蓄積およびＮＡＧ生産に対する酵母抽出物
を含む様々な糖の効果を評価するため、振盪フラスコ実験を行った。株をＭ９Ｂ培地（上
記）で生育させたが、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を７．５ｇ／ｌに減少させた。Ｍ９Ｂ培地に０
．６ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ_２Ｏおよび２５
ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した。以前の実験で酵母抽出物の正の効果が見られたの
で、フラスコ中に５ｇ／ｌの酵母抽出物を加えた。０．２ｍＭのＩＰＴＧ、および様々な
濃度の糖、すなわちラクトース、グルコース、フラクトースおよびリボースを表３６に示
す様に加えた。注意すべき重要なことは、ラクトースの存在で生育させた７１０７−８７
＃２５株はラクトース誘導性であり、ＩＰＴＧを要求しないことである。培養細胞を３０
℃で２４時間生育させ、２５℃に変えた。

約２４時間で、各培養液のｐＨを７．２に調節し、各フラスコに２．５ｇ／ｌの（ＮＨ
_４）_２ＳＯ_４を加え、ＨＰＬＣの結果に基づいてグルコースを１日当たり３０ｇ／ｌで加
えた。３２．５時間で１５ｇ／ｌのグルコース、２．５ｇ／ｌのリボース、および２．５
ｇ／ｌの（ＮＨ_４）２ＳＯ_４をフラスコ７に加えた。４８時間で１０ｇ／ｌのグルコース
を各フラスコに加えた。さらに２．５ｇ／ｌのリボースと５．０ｇ／ｌの（ＮＨ_４）２Ｓ
Ｏ_４を４９．５時間で各フラスコに加えた。２４、４８および７２時間に試料をフラスコ
から取り出し、ＯＤ_６００、Ｎ−アセチルグルコサミンレベルおよびグルコサミンレベル
をモニターした。

（表３６．７１０７−８７＃２５株における様々な糖混合物の生育、酢酸蓄積およびＮ
ＡＧ生産に対する効果）

１）７２時間の時点の結果
２）全てのフラスコは酵母抽出物を含む
表３６に示す結果は、３種の糖（ラクトース、グルコースおよびリボース）は生育を良
く幇助し、ＮＡＧがかなり蓄積する結果となった。フラクトースを含むフラスコではＮＡ
Ｇの力価が９．１ｇ／ｌに達したが、ＯＤ_６００は高くならなかった。フラクトースまた
はラクトースを含むフラスコ中にグルコースを初期に加えると、生育とＮＡＧ力価が共に
改善した。しかしながら、初期にグルコースとフラクトースの両方を含むフラスコで最良
の結果が得られた。

ＮＡＧまたはＧｌｃＮで生育できないＥ．ｃｏｌｉ単離体が文献に報告されている（Ｊ
．Ｂａｃ．、１９７０、１０１:３８４−３９１）。著者は、アミノ糖燐酸の蓄積がホス
フォヘキソースイソメラーゼとグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼで触媒される反応
を阻害し、ペントース欠乏になると推論した。ペントースまたはグルコースの添加が突然
変異株の生育阻害を反転した。ＮＡＧ生産株７１０７−８７＃２５もアミノ糖燐酸（Ｇｌ
ｃＮ−６−Ｐおよび／またはＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）を蓄積し、ペントース欠乏になる。
この場合、リボースまたはグルコースの添加により生育とＮＡＧ生産が改善されると考え
られる。事実、リボースの添加で生育とＮ−アセチルグルコサミン生産が改善された。こ
の実験で、２０ｇ／ｌのグルコース＋１０ｇ／ｌのリボースを含むフラスコは最高レベル
のＮＡＧを生産し、２７ｇ／ｌに達した。これは３０ｇ／ｌのグルコースを含むフラスコ
中で生産された量の２倍である。リボースとグルコースの両方を含むフラスコでも生育は
改善された。

（グルコースおよびリボースレベル）
以前の実験は、グルコースを含むフラスコにリボースを添加することは、７１０７−８
７＃２５株のＮＡＧ生産に相当な正の効果を有する。異なったグルコース／リボース混合
物の生育およびＮＡＧ生産に対する効果を試験するため、振盪フラスコスクリーニング＃
３５が行われた。０．６ｇ／ｌもＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２・
２Ｈ_２Ｏ、２５ｍｌ／ｍｌのカナマイシン、０．２ｍＭのＩＰＴＧ、および５．０ｇ／ｌ
の酵母抽出物を補充したＭ９Ｂ培地（上記）中で７１０７−８７＃２５株を生育させた。
様々なグルコースとリボースの混合物を、表３７に列記する様に各フラスコに添加した。
培養細胞を３０℃で２４時間生育させ、次いで２５℃に移した。約２４および４８時間で
、フラスコのｐＨを７．２に調節した。２４時間で５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を全て
にフラスコに添加した。さらに２．５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をフラスコ４〜９に添
加し、２９時間でさらに５．０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をフラスコ１０〜１５に加え
た。約４８時間で、５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をフラスコ７〜９に加え、２．５ｇ／
ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をフラスコ１０〜１５に加えた。２４および４８時間に、グルコ
ースレベル約３０ｇ／ｌに調節するためにグルコースを添加した。２４、２９、４８およ
び７２時間に試料をフラスコから取り出し、ＯＤ６００,Ｎ−アセチルグルコサミンレベ
ルおよび酢酸レベルをモニターした。酵素分析のため、選択したフラスコを７２時間で収
穫した。

表３７に見られる様に、グルコースが残っている限りグルコース濃度はＮＡＧ生産に重
大な影響を及ぼさなかった。一方、僅か５ｇ／ｌのリボースでＮＡＧレベルが大きく増加
し、リボースがない場合の約１４ｇ／ｌに比べてフラスコ４、５および６で７２時間で約
３０ｇ／ｌに達した。１０Ｇ／Ｌのリボースで最良の結果が見られた。これらのフラスコ
でＮＡＧレベルは７２時間で約３６ｇ／ｌに達した。リボースを含む培養液中で生育も正
の影響を受けた。選ばれたフラスコからの酵素分析は、ＧｌｍＳまたはＧＮＡ１双方の活
性レベルが培地中にリボースが有っても無くても同じであり、リボースの添加がこれらの
酵素の活性レベルに直接影響しないことを明らかにした。このことは、リボース添加の効
果が、ペントース燐酸経路中間体の不足が解除される結果である可能性が高いことを示唆
している。

（表３７．７１０７−８７＃２５株における生育、酢酸蓄積およびＮＡＧ生産に対する
グルコースおよびリボースの効果）

１）７２時間の時点で得られた結果
２）全てのフラスコは酵母抽出物を含む
（ペントース燐酸経路のリボースおよび他の中間体）
グルコースおよびリボース中で生育した培養細胞で見られた正の結果に基づき、振盪フ
ラスコスクリーニング＃３６を行って、いくつかの他の五炭素糖とグルコン酸の、生育と
ＮＡＧ生産に対する効果を測定した。７１０７−８７＃２５株を、０．６ｇ／ｌのＭｇＳ
Ｏ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、５．０ｇ／ｌの酵母抽出物、
２５ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび０．２ｍＭのＩＰＴＧを補充したＭ９Ｂ培地（上記）
中で生育させた。グルコース、リボース、キシロース、アラビノースおよびグルコン酸（
カリウム塩）を表３８に示す様にフラスコに加えた。培養細胞を３０℃で２４時間生育さ
せ、次いで２５℃に移した。２４および４８時間でｐＨを７．２に調節した。約２４時間
で、２４時間の試料からのＨＰＬＣの結果に基づいてグルコースを１日当たり３０ｇ／ｌ
で添加した。全てのフラスコに５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を加えた。２４および４８
時間に１０ｇ／ｌのリボースをフラスコ１１および１２に加え、４８時間で５ｇ／ｌのリ
ボースをフラスコ３および４に加えた。２８．５時間にさらに１０ｇ／ｌのグルコン酸を
フラスコ１０に加えた。グルコースレベルを約３０ｇ／ｌに調節するため、４８時間にグ
ルコースを添加した。さらに、５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４をフラスコ１１および１２
に加えた。試料を２４、３０、４８、５４および７２時間に各フラスコから取り出し、Ｏ
Ｄ_６００、Ｎ−アセチルグルコサミンレベルおよび酢酸レベルををモニターした。選択し
たフラスコを７２時間で収穫し、酵素分析を行った。

（表３８．五炭素化合物とグルコン酸の生育とＮ−アセチルグルコサミン生産に対する
効果）

１）７２時間の時点からの結果
２）さらにリボース（１０ｇ／ｌ）を２４および４８時間でフラスコ１１および１２に添
加
３）全てのフラスコは酵母抽出物（５．０ｇ／ｌ）を含む
さらにペントースとグルコン酸を添加すると、対照と比較してＮＡＧ力価と生育が改善
した（図１８）。これらの培養液も対照より酢酸レベルが低かった。リボースを添加する
とＮＡＧ生産がより高くなった。グルコン酸は他の糖より高価でないので、工業スケール
で生産するのに魅力的である。グルコン酸の添加により対照株と比較してＮＡＧの生産が
増加したので、工業的醗酵でペントース欠乏を解除するのにグルコン酸が潜在的な価値を
有することが、この実験で確認される。選ばれたフラスコからの酵素活性レベルは、Ｎ−
アセチルグルコサミン生産に対するリボースとグルコン酸の劇的な効果が、ＧｌｍＳまた
はＧＮＡ１の活性の影響に帰せられないことを示している。異なったグルコース／リボー
スレベルの生育と生産に対する効果を比較する振盪フラスコスクリーニングで見られる様
に、醗酵培地中にリボースが有っても無くても活性レベルは同程度である。

（実施例３１）
本実施例はＳｃＧＮＡ１プラスミドを含む７１０７−８７＃２５株を用いる、ＮＡＧ生
産を最適化するために１リッターフラスコ中で行われた実験を説明する。

（ＩＰＴＧ誘導のタイミング）
実験を行って生育の開始および２４時間後からのＩＰＴＧによる誘導を評価した（細胞
密度１３ｇ／ｌ）。生育は初期誘導で大きく阻害され、図１９に見られる様に遅延誘導（
７０時間で５０ｇ／ｌ）と比較してＮＡＧ力価も極めて低かった（＜５ｇ／ｌ）。細胞中
に蓄積したアミノ糖燐酸がペントース燐酸経路の特定の酵素を阻害するので、生育が阻害
されると信じられている。この仮説は、ペントース燐酸中間体の細胞生育とＮＡＧ生産に
対する正の効果の発見で支持される。

（ペントース燐酸経路（ＰＰＰ）中間体の効果）
醗酵槽に細胞を低（ＯＤ＝２０）、中間（ＯＤ＝３０）および高（ＯＤ＝４０）の３種
の異なった密度で接種した。遅延誘導スキームを用いた（接種後約２４時間での誘導）。
より高い細胞密度接種により、より高いＮＡＧ生産が得られた。接種細胞密度に拘わらず
、リボースの添加で遅延誘導スキームでもＮＡＧ生産の改善が見られた。

（実施例３２）
本実施例は、組み込みＳｃＧＮＡ１コンストラクトを含む株を用いる、ＮＡＧ生産を最
適化するための異なった醗酵実験を説明する。ＳｃＧＮＡ１プラスミドを含む株による先
の実験では、ラクトースが極めて効率的でなかったので、ＮＡＧ生産を誘導するためにＩ
ＰＴＧを使用する必要があった。組み込みＳｃＧＮＡ１コンストラクトでは、ＮＡＧ生産
をラクトース添加で効果的に誘導することができた。

（ラクトース誘導）
染色体に組み込まれたＳｃＧＮＡ１コンストラクトのコピーを１個含む７１０７−９２
＃１株の開発により、ＮＡＧ生産のためのラクトース誘導プロセスの開発が可能になった
。初期ＩＰＴＧ誘導による生育阻害を示す振盪フラスコの結果を考慮して、遅延誘導スキ
ームを醗酵槽中で試験した。細胞を最初に接種し、細胞密度約１５〜２０ｇ／ｌに生育さ
せた。次いでグルコースの供給を停止し、ラクトースを１０、２０または３０ｇ／時間で
供給した。その後、細胞の連続生育とＮＡＧ生産のためにグルコースの供給を再開した。
１０ｇ／ｌの低いラクトースレベルが有効であり、７８時間で時間当たり５０ｇ／ｌに達
することが分かった。

ラクトース供給法が異なるとプロセスが複雑になるので、異なったオプションを評価す
るために一つの実験を行った：不連続グルコース供給によるラクトース供給１０ｇ／ｌ、
グルコース連続供給によるＩＰＴＧ誘導、およびグルコースを供給、または供給せずに１
０ｇ／ｌラクトースの一点供給。条件を変えた別な試験では、ラクトース供給を４０ｇ／
ｌに増やし、その後グルコースを供給した。１点ラクトース供給は他の誘導戦略と同様に
有効であった。全ての試験で４５〜５５ｇ／ｌのＮＡＧ生産レベルを達成した。グルコー
ス供給は連続的であるが、その濃度はやはり細胞を制約する（添加すると即座に消費され
る）。通常はｌａｃオペロンがグルコースの存在で抑制されるので、グルコース供給の制
限は明らかにラクトース誘導に対して非抑制条件となる。１点ラクトース添加を用いるこ
とで、プロセスが簡略化された。

初期生育期間後の１点ラクトース誘導のレベル（１．２５〜１０ｇ／ｌ）を実験で評価
した。２点誘導（各５ｇ／ｌ）も試みた。１．２５ｇ／ｌの低いラクトースレベルが極め
て有効で、約１００ｇ／ｌの力価に達した。しかしながら、５ｇ／ｌのラクトース誘導で
は１００ｇ／ｌ以上のＮＡＧレベルに達した。従って、５ｇ／ｌでのラクトース誘導を以
後の試験で安全レベルとして用いた。２点誘導も有効で、より速い初期ＮＡＧ生産速度が
得られたが、５〜１０ｇ／ｌのラクトースで最終力価は１点誘導の力価を越えなかった。

（より高い操作ｐＨおよび温度の効果）
主として高いｐＨと温度で活性であるＧＬｃＮの性質のため、低い温度とｐＨを使用す
ることがＧＬｃＮ醗酵を安定化する鍵になる因子であった。しかしながら、ＮＡＧが中性
ｐＨで安定であることが示された。実験プログラムを通じてＮＡＧ生産のための醗酵をｐ
Ｈ７．７〜７．０の範囲で行った。実験データから、３７℃およびｐＨ７．０でグルコー
ス供給を停止後もＮＡＧは少なくとも５０時間安定であることが示された。

ＧｌｃＮプロセスで使用された比較的低い温度（３０℃および２５℃）はコストが高く
、工業スケールでは維持することが困難である。さらに、細胞生育速度は３７℃より３０
度ではるかに低い。３０℃の温度を用いることは、高レベルＮＡＧ生産のためのバイオマ
スを達成するために比較的長い時間が必要になる。従って、誘導前の４つの異なった生育
速度を評価するために、３７℃で試験を行った。この方法では、必要なバイオマスをより
速く達成することが可能で、総体的により生産性の高いプロセスが得られた。３０℃で必
要であった２２〜２４時間に対し、全ての醗酵槽は１０時間で誘導され、生産性が高く、
５０時間以内で１００ｇ／ｌ以上のＮＡＧを達成した。ある場合は７０時間で約１２０ｇ
／ｌを達成した。この時点以降、生育および生産温度として３７℃を使用した。

（グルコース供給速度の効果）
見掛け速度６ｇ／ｌ・時間（接種後の容積に基づく）をほとんどの試験で用いた。グル
コース制限でＮＡＧ生産速度が制約されるかどうかを調べるため、より高いグルコース供
給速度を試験した。供給速度を７．５ｇ／ｌに増加することで初期ＮＡＧ生産速度がより
速くなったが、最終力価は高くないか、速く到達しなかった。さらに供給速度を９．５ｇ
／ｌ・時間に増加すると、さらに速い初期ＮＡＧ生産速度を示した。しかしながら、これ
らの培養はより早く生産を停止する様に思われ、実際に最終力価が減少した（ＮＡＧ８５
から６５ｇ／ｌへ）。同じ実験で、遅い供給速度（６ｇ／ｌ・時間）でＮＡＧレベル１０
０ｇ／ｌが得られた。この時点以降、ＮＡＧ発酵におけるグルコース供給速度を６．５ｇ
／ｌ・時間に保った。

（燐酸レベルの効果）
発酵培地は３０ｇ／ｌの高濃度の全燐酸カリウム塩を含む。ほとんどの塩が細胞で使用
されず、生成物生成中に除去しなければならないので、高濃度の燐酸塩は回収に重大な問
題を提示した。ＮＡＧプロセスでは、高燐酸レベルが必須であることは示されていない。
全燐酸を四分の一の７．５ｇ／ｌに減少したが、ＮＡＧ生産にはほとんど影響がなかった
。この燐酸レベルを以後の実験に用いた。

（マグネシウムおよび鉄の重要性）
マグネシウムと鉄は高いバイオマスを達成するために必要な二つの栄養素であり、培養
を安定させる。ＧｌｃＮＡｃの生産では、鉄レベルが制限因子の一つであることが分かっ
た。高いバイオマスとラクトース誘導を達成するためにあるレベルが必要であるが、鉄が
多すぎると酢酸レベルが高くＧｌｃＮレベルが低くなる。ＧｌｃＮプロセスで決定された
鉄レベルは培地中に３ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２０、グルコース供給中にＦｅＳＯ_４
・７Ｈ_２Ｏを含む鉄の補給（５μｇ／ｇグルコース）であった。初期のＮＡＧ生産実験で
も同じ鉄レベルが選ばれた。グルコース供給に鉄を加えることはプロセスを複雑にする。
従って、初期鉄濃度と鉄の供給を評価する努力がなされた。マグネシウム供給の効果も検
討された。

最初の実験結果は、５〜１０ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２０レベルで同程度のＮＡＧ
生産レベルが得られ、鉄レベルはＧｌｃＮ生産でさほど重要ではないことを示した。鉄、
マグネシウムについての追加実験で、鉄の補給が全く必要でないことが示された。マグネ
シウムの補給は安定化効果を有する様に思われる。この試験は７．５ｇ／ｌ・時間の高い
供給速度で行われ、６．５ｇ／ｌ・時間の別な追加実験は生産性が有意に低下せず両者を
供給液から除去し得ることを示した。

鉄とマグネシウム両者の重要性は認められるが、供給液からそれらを除去することは生
産プロセスを簡略化する観点から望ましい。従って、グルコース供給から鉄とマグネシウ
ムを除外し、鉄をＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．６ｇ／ｌの初期濃度に保った。マグネシウム
をＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．６ｇ／ｌの初期速度で添加し、使用された場合はグルコー
ス供給中に５〜１０ｍｇ／ｇ・グルコースで補給した。

マグネシウムも培養に重要であると認識され、制限してはならない。マグネシウムはあ
る滅菌条件下（過剰発現の熱、暴露時間およびｐＨ）で燐酸により隠蔽され、不溶性燐酸
塩沈殿として微生物が利用できなくなる。過剰のマグネシウムまたは制限マグネシウムを
用いるフラスコ実験では、マグネシウムレベルが実際にＮＡＧ生産に重要であり、マグネ
シウムレベルが高い場合は、滅菌後にマグネシウムを添加することは沈殿効果を低減する
ために望ましいことが示された。滅菌の前後でマグネシウムの添加を比較するための実験
が行われた。その結果、滅菌前にマグネシウムを添加した培養の効率は悪いことが示され
た。

初期マグネシウムレベルを１ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏへほぼ倍増し、滅菌後に増
加する場合、または添加クエン酸レベルを増加し滅菌前にマグネシウムを酸性にする場合
、実験からこのレベルを使用し得ることが示された。このことは、プロトコールの単純化
に極めて前向きの意味を持っている。酸性にすることにより、全ての微量元素を滅菌前に
添加することを可能にする。従って、グルコースを除く全ての成分を滅菌前に添加し得る
培地調製プロトコールが開発された。初期の培地の酸性化は、燐供給のために燐酸カリウ
ム塩を供給する代わりに燐酸を用いて行われた。培地にカリウムを供給する水酸化カリウ
ムで、滅菌後にｐＨを必要な操作ｐＨ（７．０）に調節した。しかしながら、この方法は
不必要に多量のカリウムを導入した。培地を酸性にするために１塩基燐酸カリウムを使用
し、滅菌後に水酸化アンモニウムでｐＨを調節することでプロトコールをさらに変更した
。これにより、培地から硫酸アンモニウム除去を可能にしてさらにプロトコールを簡略化
した。

（微量元素の除去および亜鉛の重要性）
最初は微量金属パッケージは、μｇ〜ｍｇ／ｌ量で添加される以下の元素の塩で構成さ
れた:鉄、亜鉛、マンガン、銅、コバルト、モリブデンおよび硼素。最終製品中に存在す
る場合、モリブデンと硼素は毒性を示すが、その他の元素の効果は未知である。従って、
どの元素を除去し得るかを決めるための１種除去の実験が行われた。最初の試験ではモリ
ブデンと硼素両方の除去はＮＡＧ生産に重大な負の効果を与えず、以後の実験ではこれら
を除去した。コバルトの除去も正の効果を有する様に思われるが、ビタミンＢ_１１の全機
能に必要であると認められるので、コバルトを除去せず、その後の実験は除去する効果を
示さなかった。

亜鉛の除去の結果はＮＡＧ生産に正の効果を示した。さらに検討した結果、完全に亜鉛
を制限するとバイオマスレベルが低下し、６０時間で１１８ｇ／ｌまでＮＡＧレベルが実
質的に増加することが示された。１０ｍｇ／ｌまでのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏの高い初期鉄
レベルでも使用し得るので、このことは特に興味がある。

（実施例３３）
本実施例はＮＡＧ生産のための好ましい発酵プロトコールを説明する。発酵プロトコー
ルは以下に示される。
株：組み換えＥ．ｃｏｌｉ
誘導：細胞密度１５〜２０ｇ／ｌに達した後、５〜１０ｇ／ｌのラクトースを１点添加で
加えた。この手順中、グルコースの供給を停止しなかったが、６．５ｇ／ｌで一定（初期
容積に対し）にした。
供給：修正せず６５％グルコースを制限濃度で供給
発酵時間：６０〜７２時間
発酵法：バッチ供給、必要に応じ６５％グルコース供給。グルコース制限濃度維持
接種：２．５〜５容積％
ｐＨ：終始６．９、１２Ｎ ＮＨ４ＯＨで制御
温度：終始３７℃
酸素：溶存Ｏ２２０％以上ｍ攪拌で制御
曝気：０．５〜１ｖｖｍ
培地：

グルコース（後に添加）以外の全ての成分を滅菌前に添加した。滅菌後の初期ｐＨは約
３．０であり、接種前にＭＨ_４ＯＨで６．９に調製した。

（実施例３４）
本実施例は二回の結晶化によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。

濾過またはミクロ濾過により発酵ブロスから細胞を除去した。発酵条件条件により、溶
解固形分中のＮ−アセチルグルコサミンの割合は７０〜８７％の範囲であった（乾燥固体
に対する重量％）。従って、粗Ｎ−アセチルグルコサミン生成物を精製しなければならな
い。これは粗ブロス中のＮ−アセチルグルコサミンの純度を増すための陽イオンおよび陰
イオン脱塩工程の組み合わせで行われる。異なった結晶化プロトコールを使用し得る。以
下の実施例は、Ｎ−アセチルグルコサミン精製のプロトコールと条件を確立するための異
なった実験を説明する。例示した様に、９８％以上の純度のＮ−アセチルグルコサミンが
実施例３４、３５、３６、４０および４１で説明した方法を用いて得られた。実施例３７
に記載の方法で純度をさらに増進させた。

Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−１８−ＤＢ（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ；Ｓｕｐｅｒ
ｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡから入手）と、１ｍｌ／分の１０％（ｖ）アセトニト
リルを用いてＮ−アセチルグルコサミンを液体クロマトグラフィーで測定した。市販Ｎ−
アセチルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ、≧９９％）を外部標準として用いて、Ｎ−アセチル
グルコサミンを２１０ｎｍで測定した。注入容積が４μｌである場合、５ｇ／ｌのＮ−ア
セチルグルコサミンまで検出器は直線の応答を示した。試料と標準試料を約３ｇ／ｌで日
常的に調製し、少なくとも２回注入した。ピーク面積の偏差は平均値から２％以下であっ
た。

溶解固形分中に７０％（ｗ）のＮ−アセチルグルコサミンを含む発酵試料（３９ｇ／ｌ
）に活性炭（１００メッシュＧ−６０、ＮｏｒｉｔＡｍｅｒｉｃａｎｓ、Ａｔｌａｎｔａ
、ＧＡから入手）を加え、混合物を室温で１時間攪拌、濾紙を用いて濾過した。濾液の色
は減少し、淡黄褐色であった。固形分の量を測定し、固形分中のＮ−アセチルグルコサミ
ンの割合は７５％（ｗ）であった。

７７．５％の溶解固形分を含む上記の活性炭処理試料（そのうち５８．１％はＮ−アセ
チルグルコサミン）を真空中、４５〜５０℃で固形分５１％（ｗ）に濃縮した（濃縮中に
固形分の損失がないとして試料重量から計算）。時々攪拌しながら濃縮液を室温に放置し
た。沈殿物を中程度の濾紙上に濾過で集め、１００ｍｌの水に溶解した。固形分含有量は
１９．７％（ｗ）であった（全固形分量１６．２ｇ）。

次に溶解した試料を溶解固形分４４％（ｗ）に再度濃縮した。約２ｍｇの純Ｎ−アセチ
ルグルコサミン粉末を加え、試料をシェーカー上で室温で２時間混合した。沈殿を濾過で
集め、エタノールで洗浄した（固体を懸濁せずに２回、懸濁して２回）。重量が一定にな
るまで白色固体を真空下に室温で乾燥し、５．３２ｇの製品を得た（９８％のＮ−アセチ
ルグルコサミン、全発酵液からの回収率９％）。

（実施例３５）
本実施例は５０℃から１回の結晶化によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する
。

溶解固形分中に８７％（ｗ）のＮ−アセチルグルコサミンを含む別バッチの発酵試料を
実施例３４と同様に活性炭で処理した。溶解固形分の量を測定し、固形分中のＮ−アセチ
ルグルコサミンの割合は８８％（ｗ）であった。８０．５ｇの固形分（その７１ｇはＮ−
アセチルグルコサミン）を含む活性炭処理試料を固形分４５％（ｗ）に真空下で４５〜５
０℃で濃縮し（濃縮中に固形分の損失がなかったとして重量から計算）、室温で１６時間
振盪した。中程度の濾紙上に沈殿を濾過で集め、エタノールで洗浄した（固体を懸濁せず
２回、固体を懸濁して２回）。真空下で乾燥後、３３．２ｇの白色固体を得た（純度１０
０％のＮ−アセチルグルコサミン、回収率４７％）。

（実施例３６）
本実施例は７０℃から１回の結晶化によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する
。

活性炭処理発酵試料から１回の結晶化で部分精製Ｎ−アセチルグルコサミンが得られる
（実施例３４）。結晶化前の濃縮度と溶解固形分中のＮ−アセチルグルコサミンの初期割
合により、Ｎ−アセチルグルコサミンの純度は８６〜９０％の範囲であった。

８６％または９０％のＮ−アセチルグルコサミンを含む固体試料を水と混合して固形分
４４％（ｗ）とした。混合物を時々混合して７０℃に加熱し、固体を溶解した。次いで約
１６時間、室温に放置した。結晶を濾過で集め、エタノールで洗浄した（固体を懸濁せず
２回、懸濁して２回）。真空下に室温で乾燥後、生成物は９９％のＮ−アセチルグルコサ
ミンを含んでいた（回収率２４〜２０％）。

（実施例３７）
本実施例は陽イオン交換処理によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。

陽イオン交換カラムへ通す供給液として脱色発酵ブロスを使用した。カラムは１．６×
１５ｃｍで、２０ｇの水素型ＤＯＷＥＸ（商標）Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ８８樹脂（Ｄｏｗ
Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩより購入）を含んでいた。ＰｈａｒｍａｃｉａＦＰ
ＬＣ（商標）セット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｓｃａｔａｗ
ａｙ、ＮＪより購入）を用いて４℃で実験を行った。供給液は固形分換算でＮ−アセチル
グルコサミン約７６％、電導度１０．５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ約６．５であった。材料を１ｍ
ｌ／分の速度でポンプ送液した。初期流出ｐＨは約２．３であった。カラム許容量に達す
るとｐＨは上昇し、流入液と実質的に同じになった。約１２５ｍｌで電導度は１０．５ｍ
Ｓ／ｃｍ付近から２．５ｍＳ／ｃｍ付近に低下した。ｐＨが上昇すると電導度も増加した
。固形分換算で測定したＮ−アセチルグルコサミンの純度もｐＨが約２．５である間に急
激に上昇した。純度はＮ−アセチルグルコサミン約８５％に上昇した。カラム容量が飽和
すると純度も低下し、２００ｍｌで本質的に流入液と同じであった。Ｎ−アセチルグルコ
サミン純度は陽イオン処理で増加した。

（実施例３８）
本実施例は陰イオン交換処理によるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。脱色
し陽イオン交換樹脂で処理したＮ−アセチルグルコサミンブロスを陰イオン交換樹脂Ｄｏ
ｗＭｏｎｏｓｐｈｅｒｅ７７の流入液として使用した。実験条件は上記の陽イオン交換樹
脂の実験と同じであった。固形分換算で流入液のＮ−アセチルグルコサミン純度は約８１
％であり、電導度は３．８ｍＳ／ｃｍ、ｐＨは約３．０であった。流出液のｐＨは急激に
８．０付近に上がり、その後２５０ｍｌで約３．８に下降した。電導度は急激に１ｍＳ／
ｃｍ以下に下降し、実験中そのレベルに止まった。Ｎ−アセチルグルコサミン純度も上昇
し、実質的に高いままであった。Ｎ−アセチルグルコサミン純度は流入液の純度約８１％
から約８７％に増加した。

陽イオンと陰イオンの組み合わせ処理は、残乾固形分換算でＮ−アセチルグルコサミン
純度を実質的に上昇させる簡単な方法を提供する。

（実施例３９）
本実施例は活性炭と混合ベッドイオン交換による発酵ブロス処理を説明する。

発酵ブロスを最初に実施例３４に記載の通り活性炭で処理し、次に製造業者の推薦に基
づき混合ベッドイオン交換樹脂ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒ
ｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で処理した。試料を徐々に負荷し、重力で流出させた。試料負荷量は
青色指示薬が金色に代わることで示される、２／３飽和であった。溶解固形分中に最初に
７０％（ｗ）および８７％（ｗ）のＮ−アセチルグルコサミンを含む試料が、最終的に溶
解固形分中でそれぞれＮ−アセチルグルコサミン純度８９％（ｗ）および９３％（ｗ）を
示した。

（実施例４０）
本実施例は精製Ｎ−アセチルグルコサミンの安定化を説明する。

上記結晶化で生成したＮ−アセチルグルコサミン試料（純度９８）は、１０５℃、２時
間で淡褐色に変わり、重量減４．７％であった。加熱によるこの色変化と重量減はイソプ
ロピルアルコール（ＩＰＡ）を含む以下の処理（以下に記載）でなくなった。ＩＰＡ（イ
ソプロピルアルコール）はＮ−アセチルグルコサミンの沈殿と１０５℃での試料の着色の
除去に有用な試薬である。しかしながら、ＩＰＡの代替として同じ効果を得るために、当
業者はアセトニトリルまたはエタノール等の水混和性有機溶剤を選ぶことが可能である。

（予備加熱後の水／ＩＰＡ沈殿）
試料（０．３０ｇ）を１０５℃で２．５時間加熱した。室温に冷却後、０．７ｍｌの水
を加えて黄色の懸濁液を作成した。ＩＰＡ（２．８ｍｌ）を加え、混合物を２時間攪拌し
た。沈殿を濾過で集め、固体を懸濁してＩＰＡで２回洗浄した。母液は淡黄色であった。
重量が一定になるまで固体を真空下で乾燥した（０．１８ｇ、回収率６０％）。

（８０：２０または８５：１５のＩＰＡ／水（ｖ／ｖ）中の浸漬処理）
固体１ｇ当たり５または１２ｍｌの混合溶媒で、試料を８０：２０または８５：１５の
ＩＰＡ／水中で３時間または終夜攪拌した。回収率（上記と同じ手順）は５６〜６７％で
あった。

（溶解およびＩＰＡでの沈殿）
試料（０．５０ｇ）を２．２７ｍｌの水に溶解した。ＩＰＡ（１２．８６ｍｌ、ＩＰＡ
／水＝８５：１５ｖ／ｖ）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。回収手法（５６％）は
上記と同じであった。

（水に溶解後、濃縮およびＩＰＡでの沈殿）
試料（８９．６ｇ）を固形分２０％（ｗ／ｗ）で水に溶解した。溶液を真空下に４５〜
５０℃で濃縮した。固形分濃度が約４２％（ｗ／ｗ）に達した時、沈殿を生成し始めた。
溶液を５５％固形分にさらに濃縮した（濃縮中に固形分の損失がないとして、全試料重量
換算で計算）。ＩＰＡを加え（ＩＰＡ／水＝８５：１５ｖ／ｖ）、終夜攪拌した。固体を
濾過で集め、固体を懸濁してＩＰＡで２回洗浄した。母液を濃縮乾固して１３ｇの湿った
固体を得、これを次いで２０ｍｌの８５：１５ＩＰＡ／水（ｖ／ｖ）中に懸濁した。固体
を濾過し、ＩＰＡで２回洗浄した。この固体を最初の濾過の後に得られた固体と合わせ、
一定の重量になるまで真空下で乾燥した（８２．１ｇ、Ｎ−アセチルグルコサミン９８％
、回収率９２％）。

（実施例４１）
本実施例はＩＰＡによるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。

より高い回収率を得るため、Ｎ−アセチルグルコサミンの精製にＩＰＡを使用した。Ｎ
−アセチルグルコサミンを沈殿し、全ての不純物を溶液中に残すためＩＰＡと水の混合物
（おそらくｖ／ｖ比で７０：３０〜８５：１５）を使用した。この様にして得られた精製
Ｎ−アセチルグルコサミンは１０５℃で暗色化を示さなかった。この混合溶媒の必要量は
、最初の試料中の不純物量と、その溶解度に依存する。

（実施例４２）
本実施例はエタノールによるＮ−アセチルグルコサミンの精製を説明する。９５％純度
のＮＡＧ試料（４０ｇ）を１６０ｍｌの水に溶解した。混合物を攪拌しながらエタノール
（６４０ｍｌ）を徐々に加えた。懸濁液を室温で終夜攪拌した。固体を濾過で集め、エタ
ノール中に懸濁して２回洗浄した。真空下で乾燥して１６．１２ｇの白色固体を得た（９
８％ＮＡＧ、ＮＡＧ回収率４２％）。この物質は１０５℃、２時間で暗色化を示さなかっ
た。当業者は、同じ結果を得るためにエタノールの代替としてＩＰＡ、アセトニトリルま
たはメタノールなどの他の水混和性溶剤を使用し得る。

（実施例４３）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンのグルコサミンへの化学的加水分解のためのプロ
セスを示す。

発酵で製造したＮ−アセチルグルコサミンを最終製品としてＮ−アセチルグルコサミン
の形で回収し精製し得ることが予期される。発酵で製造したＮ−アセチルグルコサミンを
単離および精製の前後に化学的にグルコサミンに変換することもできる。Ｎ−アセチルグ
ルコサミンのグルコサミンへの化学的変換を示すためのパイロット試料実験が行われた。
最初の実験で、Ｎ−アセチルグルコサミン（グルコースなしのＭ９Ａ培地中１０ｇ／ｌ）
を様々なレベルの塩酸で１００℃で加水分解した。平行した実験で、加水分解条件下での
安定性を測定するため、グルコサミンに同じ処理をした。結果を図２１および２２に示す
。

Ｎ−アセチルグルコサミンからグルコサミンへの変換を、加水分解反応で生じたグルコ
サミンの量をモニターして測定した。Ｗａｙらの報告（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｑｕ
ｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、２３：２８６１、２０００）に基づき、グルコサミンをＨＰＬＣ法で測定した。Ｈ
ＰＬＣ法の特定の詳細を以下に記す：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ
ＯＤＳ（３）Ｃ１８、５μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡから市販
）、１５０×４．６ｍｍ；移動相：１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ オクタンスル
ホン酸ナトリウムを含むメタノール：水性緩衝液（４：１、ｖ：ｖ）（ｐＨ５．１）；流
速：０．７ｍｌ／分；検出器：３０℃の屈折率検出器。

図２１は十分に低いｐＨ（＜１）で加熱した場合のＮ−アセチルグルコサミンのグルコ
サミンへの定量的な変換を示す。より高いｐＨでは加水分解を生じないか、または生成し
たグルコサミンが分解した。図２２は、ｐＨ１．０以下でグルコサミンが加熱で安定であ
ったことを示す。より高いｐＨではかなりの量のグルコサミンが失われた。

１．０Ｎ塩酸（ｐＨ＜１）を用いるＮ−アセチルグルコサミンの酸加水分解を異なった
温度で調べた。残存Ｎ−アセチルグルコサミン量と生成したグルコサミン量の両方をモニ
ターした。標準炭水化物システムを用いてＮ−アセチルグルコサミンをＨＰＬＣで測定し
た。特定の詳細を以下に記す：カラム：Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＨＰＸ−８７Ｈ、７．８×３０
０ｍｍ；移動相：０．１％ＨＮＯ_３水溶液：流速：０．８ｍｌ／分；検出器：３０℃の屈
折率検出器。グルコサミンは上記のイオン対ＨＰＬＣカラムを用いて測定した。１Ｎ塩酸
でｐＨ＜１．０の酸性にしたＭ９Ａ培地（本明細書に上記）中のＮ−アセチルグルコサミ
ン（２０ｇ／ｌ）を３５℃、６０℃および１００℃でインキュベーションした。結果を図
２３に示す。１００℃で変換は２．５時間で完結した。生成したグルコサミンの有意な分
解は観察されなかった。より低い温度では、ある程度の加水分解が観察されたが、はるか
に遅かった。

平行した実験で、グルコサミン（２０ｇ／ｌ）を上記の異なった温度で１Ｎ塩酸ととも
にインキュベーションした。ＨＰＬＣで測定して２４時間のインキュベーション後に分解
は観察されなかった（データを示さず）。

まとめると、Ｎ−アセチルグルコサミンはグルコサミンへ容易に化学的に変換され得、
その加水分解生成物であるグルコサミンはこれらの実験で使用された加水分解条件下で極
めて安定であることが明らかである。

Ｎ−アセチルグルコサミンのグルコサミンへの酸加水分解はグルコサミン製造工程全体
の鍵となる工程である。従って、発酵由来の結晶化Ｎ−アセチルグルコサミン材料または
精製Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて加水分解実験を行った。

（実施例４４）
本実施例は高塩酸濃度および短時間でのＮ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を説
明する。

９０℃でのＮ−アセチルグルコサミンの酸加水分解を行った。塩酸溶液（１２％および
１６％、３７％から容積希釈）中のＮ−アセチルグルコサミン（１０％および２０％、ｗ
／ｖ）を使用した。テフロン（登録商標）ライニングキャップを有する一連の１２ｍｌガ
ラススクリューキャップチューブを用いた。各チューブは別々な時点（０分、１５分、３
０分、４５分、６０分、９０分）を表し、２ｍｌのＮ−アセチルグルコサミン／塩酸溶液
を含んでいた。チューブを９０℃に平衡した加熱ブロック中で加熱した。チューブを適当
な時間に取り出し、氷水中で素早く冷却した。適当な希釈を行い、グルコサミンおよびＮ
−アセチルグルコサミンについて試料をＨＰＬＣで分析した。図２４はＮ−アセチルグル
コサミンの消失と、グルコサミンの生成を示す。Ｎ−アセチルグルコサミン消失の速度論
は４種全ての溶液で基本的に同じであった。９０℃で加水分解は極めて早い。４つの場合
全てで約９５％のＮ−アセチルグルコサミンが３０分で加水分解された。４５分後、初期
濃度のＮ−アセチルグルコサミンの１％未満が残った。６０分または９０分でＮ−アセチ
ルグルコサミンは検出されなかった。９０℃で１時間後、２０％のＮ−アセチルグルコサ
ミンでもＮ−アセチルグルコサミンはもはや検出されなかった。図２４はまた、１０％グ
ルコサミンを含むチューブ内でのグルコサミンの生成を示す。９０分後に、グルコサミン
の大きな損失は観察されなかった。

（実施例４５）
本実施例は高濃度の塩酸で長期間（２４時間）のＮ−アセチルグルコサミンの脱アセチ
ル化を説明する。

９０℃および１００℃におけるグルコサミンの分解を、５％および１０％（ｗ／ｗ）の
グルコサミン塩酸塩を用い、１２重量％および２０重量％の塩酸で検討した。試料を１〜
２４時間インキュベーションし、アンモニアをグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いて酵
素的に分析した。グルコサミンとはグルコサミン塩酸塩のことである。パーセントは全て
ｗ／ｗである。グルコサミンの分解はアンモニアの生成に基づいている。分解率は５％と
１０％溶液で基本的に同じであった。酸濃度が高いほど、分解は有意に高かった。１００
℃の実験でも同様な傾向が見られた。１０℃の温度上昇はグルコサミン分解を大きく増加
させることは明らかである。

（実施例４６）
本実施例は高い塩酸濃度（３０％）におけるＮ−アセチルグルコサミンの化学的脱アセ
チル化を説明する。

Ｎ−アセチルグルコサミンを９０℃でハイブリダイゼーション炉を用いてグルコサミン
に加水分解した。反応をスクリューキャップガラスチューブの内部で行った。３０％塩酸
（３０ｇ）を９０℃で１時間、予備インキュベーションした。この１０ｇの固体Ｎ−アセ
チルグルコサミンを添加後、素早く溶解し、Ｔ_０試料を採取した。その後の３時間にわた
り、試料を３０分間の間隔で採取した。３０分以内に溶液は速やかに暗橙／褐色に変わっ
た。この暗色化は、より低い酸濃度で以前に観察されたものより明瞭に速かった。４５〜
６０分でかなりの量の固形グルコサミンが観察され、混合物を塩酸中のグルコサミン塩酸
塩のスラリーに変えた。試料をアンモニウムで酵素的に分析した。結果が図２５に示され
る。図２５はまた、より低い塩酸濃度を用いて９０℃で行われたグルコサミン分解実験の
データも示す。かなりのＮ−アセチルグルコサミンが分解し、アンモニアレベルに基づい
た分解は３時間で約３．５％である。これは１２％または２０％塩酸中でグルコサミンを
用いた場合に観察された値より明らかに高かい。

（実施例４７）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンの酵素的脱アセチル化を説明する。

Ｎ−アセチルグルコサミンを発酵ブロス中、またはそれを回収後に加水分解する酵素プ
ロセスを以下に述べる。三つのタイプの酵素、すなわちＮ−アセチルグルコサミン−６−
Ｐデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミンデア
セチラーゼ（ＥＣ３．５．１．３３）、キチンデアシラーゼおよびアシルトランスフェラ
ーゼが候補である。

（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ＰデアセチラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミン
デアセチラーゼ）
Ｎ−アセチルグルコサミンを脱アセチル化することが示されている酵素が存在する。Ｒ
ｏｓｅｍａｎはＮ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を触媒する酵素活性（ＥＣ３．
５．１．３３）を、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｄａｖｅｒｉｓおよびＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ中に報告した（Ｒｏｓｅｍａｎ Ｓ．、１９５７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．、２２６：１１５−１２４）。日本人のグループ（Ｙａｍａｎｏ、Ｆｕｊｉｓ
ｈｉｍａら、Ｏｓａｋａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、
Ａｇｅｎｃｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）は、キチナーゼ生産バクテリアＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ｎｏｎ−Ｏ
１および海洋バクテリアＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ由来のＮ−アセチルグルコサミンデアセ
チラーゼを研究した。特定の天然生物由来のＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアセチ
ラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼ双方の調製、性質および用途が以
下の特許および文献に開示されている：Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ Ｓ．ら、１９６６年、タイ
トル“Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸デアセチラーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃ
ｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）”、ＪＰ９２３４
０６４Ａ２；Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ Ｓ．ら、１９９７年、タイトル“Ｎ−アセチルグルコ
サミン−６−燐酸デアセチラーゼ製造プロセス（Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃ
ｉｎｇ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅａｃ
ｅｔｙｌａｓｅ）”、米国特許第５，７４４，３２５号；およびＦｕｊｉｓｈｉｍａら、
１９９６年、タイトル“Ｎ−アセチルグル−Ｄ−コサミン−６−燐酸デアセチラーゼ製造
プロセス（Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌ
ｕｃｏｓａｍｉｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｅ”、欧州特許第０ ７３２ ４００ Ｂ１号
。これらは全文を本明細書に援用する）。

Ｆｕｊｉｓｈｉｍａらが報告したデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐ
デアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、ＮａｇＡ）であると同定された。そのＮ−アセ
チルグルコサミン−６−Ｐとの親和性と効力は、Ｎ−アセチルグルコサミンとの親和性と
効力よりはるかに高かった。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたＮ−アセチルグ
ルコサミン−６−ＰデアセチラーゼはＮ−アセチルグルコサミンには作用しない。

酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐデアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．２５、Ｎａｇ
Ａ）が、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびノイラミン酸の細
胞代謝に重要な工程であるＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐへ
変換する役割を有することは周知である。通常、組み換えＥ．ｃｏｌｉ ＮａｇＡタンパ
ク質などのこの酵素は非燐酸化Ｎ−アセチルグルコサミンには活性がない。Ｎ−アセチル
グルコサミン−６−ＰデアセチラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｎａｇＡ遺伝子）が多く
の生物で見出されている。Ｎ−アセチルグルコサミンのみに活性を有する（従って、Ｎａ
ｇＡとは異なる）デアセチラーゼが存在するかどうかは知られていない。

（キチンデアセチラーゼ）
キチンデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．４１）はキチン中のＮ−アセチルグルコサミ
ンユニットの脱アセチル化を触媒し、キトサンとする。キチンでアセチラーゼ活性は、通
常、Ｎ−アセチル基において放射標識されたグリコールキチン（部分的にＯ−ヒドロキシ
エチル化されたキチン）を基質として使用することによって、決定される。この酵素はミ
クロ結晶キチンおよびカルボキシキチン（可溶性誘導体）にも作用する。しかしながら、
Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ由来のキチンデヒドロゲナーゼはＮ−アセチルグルコサミン単
量体または２〜３オリゴマーを脱アセチル化しないことが報告されている（Ａｒａｋｉお
よびＩｔｏ、１９７５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５５：７１−７８、その全文を
本明細書に引用して援用する）。通常のキチンデアシラーゼがグルコサミン単量体を脱ア
セチル化することは示されていないが、このような活性を有するキチンデアシラーゼ突然
変異体を天然から単離または試験管内で創造することは可能である。

Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を、天然型デアセチラーゼを有する生物、ま
たは組み換えデアセチラーゼを有する生物に含まれる、またはそれらから単離されるデア
セチラーゼを用いて行うことができる。組み換えデアセチラーゼを無秩序または指向性突
然変異誘発で改良し得る。

以下にＮ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼおよび／またはＮ−アセチルグルコサ
ミン−６−Ｐデアセチラーゼを用いるＮ−アセチルグルコサミンの加水分解実験を説明す
る。

（アシルトランスフェラーゼ）
いくつかのアシルトランスフェラーゼが基質からアセチル基を除去し、他の基質に転移
し得る（Ｋｏｎｅｃｎｙら）。この様な酵素がＮ−アセチルグルコサミンを脱アセチル化
し得ることは示されていないが、この様な活性を有するアシルトランスフェラーゼ改変体
を天然から単離し得るか、または試験管内で作成し得ると考えられる。

天然型アシルトランスフェラーゼを有する生物、または組み換えアシルトランスフェラ
ーゼを有する生物に含まれる、またはそれらから単離されるアシルトランスフェラーゼに
より、Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アセチル化を行うことができる。組み換えアシルト
ランスフェラーゼを無秩序突然変異誘発または指向性突然変異誘発および／あるいはタン
パク質遺伝子工学によって改良できる。

（酵素加水分解条件の決定）
デアセチラーゼを発現する天然型または組み換え細胞を標準条件または最適条件で生育
させる。Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を、触媒として全細胞、粗酵素抽出物また
は精製酵素を用いて行う。まず、０．１ｍｌの２００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ４．５、５．
０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０）に基質として０．３ｍｌの
Ｎ−アセチルグルコサミンの１０％溶液を加える。次に、０．１ｍｌの酵素溶液を加える
。反応混合物を２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃および５０℃で３０分間、６０
分間および１２０分間インキュベーションする。加水分解生成物であるグルコサミンの生
成をＨＰＬＣ法で測定する。残存基質Ｎ−アセチルグルコサミンを別のＨＰＬＣ法でモニ
ターする。この二つのＨＰＬＣ法は先の実施例に記載されている。

（発酵で製造されたＮ−アセチルグルコサミンの加水分解）
発酵ブロス中または回収後のＮ−アセチルグルコサミンを、粗酵素抽出物または精製デ
アシラーゼを触媒として用い、上記の条件下で加水分解する。グルコサミンを塩酸溶液中
で結晶化して回収し、エタノール、メタノールまたはイソプロピルアルコールで洗浄する
。

（実施例４８）
本実施例は高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。

この試験のための装置は、加熱マントルで加熱される１リッター丸底容器からなる。内
容物である１５０ｇの水、２１ｇの９８％Ｎ−アセチルグルコサミンおよび２３８ｇの３
６．７％塩酸を混合し、反応容器に加えた。攪拌した反応混合物を７０℃に加熱し３時間
混合し、この時点で、混合物をビーカーに移し２０℃に冷却した。若干の結晶が見られた
。混合物を反応容器に戻し、１０ｇのＮ−アセチルグルコサミンを加えた。反応容器を７
０℃に再加熱し、３時間反応させ、４℃で終夜冷却した。存在する結晶を濾過し、エタノ
ールで洗浄し、真空乾燥し分析した（グルコサミン塩酸塩２０ｇ、９９．９％）。濾液を
反応容器に戻し、１０ｇのＮ−アセチルグルコサミンを加えた。反応容器を７０℃に再度
加熱し、３時間反応させ、４℃で終夜冷却し、濾過し、エタノール洗浄し、真空乾燥し、
そして分析した（グルコサミン塩酸塩１６．１ｇ、９９．６％）。濾液を再度反応容器に
戻し、４１．５ｇを加え、反応サイクルを繰り返した。４回目のサイクルから３３ｇのグ
ルコサミン塩酸塩が得られ、分析で９９．５％であった。全収率は８６％であり、製造さ
れたグルコサミン塩酸塩は分析で９９＋であり、白色であった。この物質は再結晶の必要
がなかった。

（実施例４９）
本実施例は低純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。

本試験は、発酵ブロスから濃縮し乾燥したＮ−アセチルグルコサミンを用いる実施例４
７の条件を繰り返した。固体は５２％のＮ−アセチルグルコサミンを含んでいた。３サイ
クルを行った。製造されたグルコサミン塩酸塩は、各サイクルごとにより暗色になった。
最初の２種の試料は９９．７％および９９．４％であると分析され、再結晶は必要なかっ
た。三番目の試料は９７．７％と分析され、より暗色であり、再結晶が必要と思われた。
全体の収率は７１％であった。実施例４８の最終濾液が透明な淡褐色であったのに対し、
この最終濾液は暗褐色であった。

（実施例５０）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンが２１．８％に濃縮された発酵ブロスの加水分解
を説明する。

本試験用の装置は４リッタージャケット付きガラス容器からなった。反応容器を指定の
温度に加熱するために水を用いた。２１８ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミンを含む２０
００ｍｌの濃発酵ブロスを反応容器に加えた。５００ｍｌの３６．７％塩酸を加えた。反
応容器を真空下に攪拌し、７０℃に加熱した。反応を９０分間行い、３１０ｍｌの濃縮液
を採集した。反応混合物を濾過し、４℃に冷却して濾過した。固体を２６５ｍｌのエタノ
ールで洗浄し、乾燥した。ブロスおよび濾液中のＮ−アセチルグルコサミン分析に基づく
転換率は８９．５％であった。洗浄したグルコサミン塩酸塩を水に溶かし、１５５０ｍｌ
の溶液とした。１５ｇのＤａｒｃｏ Ｇ−６０活性炭を溶液に加えた。３０分間攪拌後、
溶液を濾過し無色の濾液を得た。濾液を５０℃、５５ｃｍＨｇの真空で蒸発させた。固体
をエタノールで洗浄し乾燥した。全収率は８２％であった。

（実施例５１）
本実施例は別途濯ぎ洗いを行う低純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する
。

この試験の目的は、加水分解後の別途行う濯ぎ洗いの工程で、再結晶の必要のない高純
度製品が得られるかどうかを試験することであった。実施例４９で使用した装置を、濃縮
液回収を行わないで使用した。５４％のＮ−アセチルグルコサミンを含む乾燥発酵ブロス
を２０％塩酸に加えた。酸とＮ−アセチルグルコサミン比は２．５：１であった。このシ
リーズの反応条件は８０℃、１０３分であった。濾過後の湿潤ケーキを５００ｇの水、５
２９ｇの３７％酸および４０７ｇのエタノールで洗浄した。その目的は別途設けた洗浄で
、再結晶の必要のない製品が得られ得るかどうかを確認することであった。グルコサミン
塩酸塩結晶はまだ若干黄褐色であり、再結晶が必要であった。全収率は７０％であり、最
初の水洗で７％の収率が減少した。酸洗浄で１％、エタノール洗浄で１．６％の収率減少
であった。

（実施例５２）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンの加水分解中の炭素処理を説明する。

不純物を除去するため、活性炭を加水分解後で再結晶前に使用した。本試験は反応前に
加水分解溶液に活性炭を添加する工程を含んだ。全体で３４ｇのＤａｒｃｏ Ｇ−６０活
性炭をＮ−アセチルグルコサミンおよび塩酸の反応混合液に加え、３０分間混合し、次い
で濾過し反応容器に加えた。活性炭を濯ぎ洗いした１０００ｇの水も反応容器に加えた。
得られたグルコサミン塩酸塩はほとんど無色であったが、なお再結晶が必要であった。反
応条件は８０℃で６０分であった。反応溶媒をさらに水で希釈し、初期塩酸濃度が１４％
に減少したため、全収率は２９％であった。

（実施例５３）
本実施例は低純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。

本実施例に用いられた反応条件は温度９０℃、３０分間であった。使用した３０％塩酸
とＮ−アセチルグルコサミン比は３：１であった。実施例４９で使用した装置を本実施例
でも使用した。加水分解収率は８６％であった。原料グルコサミン塩酸塩を水に再度溶解
し、活性炭で処理し、濾過し、５０℃、６０ｃｍＨｇで真空再結晶した。最終分析値は９
９．７％であり、全収率は５８％であった。

（実施例５４）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンの加水分解中の炭素処理を説明する。

活性炭処理を用いる加水分解溶液の第二の試験を試みた。５０ｇの活性炭を加水分解混
合物に加え、濾過し、活性炭を１，０００ｇの水で濯ぎ洗いした以外は反応条件は実施例
５２で用いられた条件であった。２０％塩酸とＮ−アセチルグルコサミンの比率を３：１
とし、反応を９０℃で３０分間行った。実施例５２に説明した結果以上の色の改善は見ら
れなかった。加水分解前の活性炭による上記の試験と同様、濾過中に酸を加え、溶解度を
減少させるために冷却して収率を改善した。最終収率は３６％であり、９８．４％であっ
た。

（実施例５５）
本実施例は高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。

本実施例の目的は９０℃で高品質Ｎ−アセチルグルコサミンから高純度グルコサミンを
再結晶を必要とせず製造し得るかどうかを確認することであった。実施例４９の装置を用
い、３２０ｇのＮ−アセチルグルコサミンを９４１ｇの３０％ｗ／ｗ塩酸と混合した。混
合液をジャケット付き容器に加え、９０℃に加熱した。反応を加熱時間中、およびさらに
９０℃に保って４７分間行った。２０℃に冷却後、湿潤ケーキを濾過し、エタノールで洗
浄し５０℃で真空乾燥した。全収率は７１％であり、加水分解液を一回使用した場合と符
合した。製造したグルコサミン塩酸塩は白色であったが若干黒色であり、再結晶が必要で
あった。

（実施例５６）
本実施例は不純なＮ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。

発酵ブロスから単離した固体Ｎ−アセチルグルコサミンを使用して実施例５４に記載と
同じ手順を行った。Ｎ−アセチルグルコサミン固体の純度は４８％であった。１，４１１
ｇのＮ−アセチルグルコサミンを含む混合物を４，２３６ｇの３０ｗ／ｗ％塩酸と７０℃
で３時間反応させ、２０℃に冷却した。濾過後の湿潤ケーキをエタノールで洗浄し、５０
℃で真空乾燥した。全収率は９０％であった。

（実施例５７）
本実施例は高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説明する。

３６．７％の塩酸と純Ｎ−アセチルグルコサミンを２：１の比率で用いて加水分解を行
った。実施例４９の装置を用い、２，００４ｇのＮ−アセチルグルコサミンを４，００９
ｇの３６．７ｗ／ｗ％塩酸と８０℃で５８分間反応させ、次いで２０℃に冷却した。濾過
後の湿潤ケーキを洗浄せず、室温で一晩放置して乾燥させた。最終ケーキは６％の塩酸と
７５．２％のグルコサミン塩酸塩を含んでいた。反応混合物はかなり粘性で、反応容器の
側面に黒い固体が付着していた。全収率は７０％であった。

（実施例５８）
本実施例はリサイクル塩酸を使用する高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解を説
明する。

回収グルコサミン塩酸塩の全体的な収率を増加させる方法の一つは、加水分解母液をリ
サイクルすることである。加水分解反応後、混合液を冷却し濾過する。濾液を秤量し、反
応容器にリサイクルして戻す。最初の重量と戻した濾液の間の重量差を埋めるため、新し
い３６．７％塩酸を加える。このシリーズには２．５：１の比率の３６．７％塩酸とＮ−
アセチルグルコサミンを８０℃で６０分間反応させる工程が含まれた。純粋な固体Ｎ−ア
セチルグルコサミンを含む７４℃の反応容器に塩酸を加えた。反応混合液を温度に加熱し
、６０分間反応させ、次いで２０℃に冷却し濾過する。塩酸を最初に使用した後、固体グ
ルコサミン塩酸塩を濾過して回収し、収率は８８％であった。濾液を秤量し、反応容器に
戻した。第二の等量のＮ−アセチルグルコサミンを加えると同時に、酸重量を最初の反応
サイクルレベルに戻すために十分な３６．７％塩酸を加える。この酸の二回目の使用でも
、同じ時間と温度で反応を繰り返した。冷却と濾過後に回収率は１０５％であり、最初の
酸から溶液中に残されたグルコサミン塩酸塩の一部が第二サイクルの濾過中に回収された
ことを示している。第三サイクルを第二サイクルと同じ方法で行い、回収率は６０％であ
った。３サイクルの全回収率は８７％であった。第三サイクルからの濾液を以後のサイク
ルのために保存した。

（実施例５９）
本実施例はＮ−アセチルグルコサミンのクロマトグラフィーによる精製を説明する。

Ｎ−アセチルグルコサミンを精製するために、ＤＯＷＥＸ^ＴＭ Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ
９９／Ｋ樹脂を使用するクロマトグラフィーを行った。樹脂を使用して、２．６×２３ｃ
ｍのカラムに充填した。カラムベッド容積は１２０ｍｌであり、ボイド容積は３５ｍｌと
見積もられた（シリンジを用いて液体をカラムから抜き取って測定）。これらの実験では
、陽イオン樹脂および陰イオン樹脂での処理によって脱イオンされたブロスが用いられた
。流入原料は約７５．７ｇ／ｌのＮ−アセチルグルコサミン濃度と全固形分８３．４ｇ／
ｌを含み、純度は約９１％であった。電導度は０．１ｍＳ／ｃｍであった。

最初の実験では、３０ｍｌの試料溶液を２ｍｌ／分でカラムにポンプ送液した。Ｎ−ア
セチルグルコサミンが何らかの方法で樹脂と相互作用することは明らかであった。Ｎ−ア
セチルグルコサミンは、約６０ｍｌまでは検出されず、ボイド容積をはるかに過ぎて９０
ｍｌに中心のある非常に広いピークで溶出された。Ｎ−アセチルグルコサミンの純度も大
きく変わり、９０ｍｌでＮ−アセチルグルコサミンの最高値は約９４．５％であった。こ
の狭い領域で測定した純度は流入材料の純度より高かった。得られた純度値の変動は約２
〜３％であった。低い濃度のＮ−アセチルグルコサミンを含む画分では、１２５ｍｌ以上
および７５ｍｌ以下で、純度が急激に低下した。

同じカラムを使用する第二の実験を行った。今回はより少ない５ｍｌの試料をより遅い
流速１ｍｌ／分で注入した。結果はより多量の試料とより速い流速で見られた結果と同程
度であった。唯一の差は、Ｎ−アセチルグルコサミンのピークの中心が９０ｍｌでなく８
０ｍｌであったことである。

全固形分の百分率で測定したＮ−アセチルグルコサミンの純度は実験中にかなり変化し
た。これは、いくらかのクロマトグラフィー分離、またはＮ−アセチルグルコサミンと樹
脂の相互作用とは異なった樹脂と他の物質、多分非イオン性化合物との相互作用が存在す
ることを示唆した。他の化合物がＮ−アセチルグルコサミンと同様な方法で樹脂と相互作
用しているならば、Ｎ−アセチルグルコサミンはＮ−アセチルグルコサミンを含む全ての
画分中でおなじレベルの純度で存在するはずであるが、実際はそうでなかった。

この実験に使用した樹脂を、上記と同じ手順で公知の方法を用いてカルシウム形態に変
え、使用した。

（実施例６０）
本実施例は高純度Ｎ−アセチルグルコサミンの加水分解と酢酸除去を同時に行う方法を
説明する。

Ｎ−アセチルグルコサミンの塩酸水溶液加水分解からの主な副生物は酢酸であり、これ
は比較的高沸点を有し加水分解工程で容易には除去できなかった。加水分解工程でエタノ
ールまたはメタノールなどのアルコールを供給すると、酢酸がエステル化され、副生物で
ある酢酸エチルまたは酢酸メチルをそれぞれ生成し、沸点が下がるので、より容易に除去
された。使用済み加水分解液に存在する主な不純物である副生物を除去すると、加水分解
溶液中の塩酸をより多い回数で再使用することができる。

１７３ｇのメタノール、１８９．４ｇの３６．７ｗ％塩酸水溶液、および２０１ｇのＮ
−アセチルグルコサミンの混合物を攪拌加熱したガラス容器に加え、６５℃で還流しなが
ら混合した。１時間で試料を採取した。分析の結果、グルコサミン塩酸塩は８．３％、塩
酸は１１．６％であり、滴定で酢酸はほとんど検出されなかった。反応を２時間後に停止
し、２０℃に冷却した。固体をメタノールで濯ぎ洗いし乾燥した。グルコサミン塩酸塩の
最初の収率は２５．６％であった。加水分解液を４℃で終夜冷却し、そして濾過した。さ
らに１０％のグルコサミン塩酸塩の収率が得られた。最初の固体の純度は８５％であった
。濾液に酢酸は存在しなかった。

本発明の様々な実施態様を詳細に説明したが、当業者はこれらの実施態様の変更と応用
が可能であることが明らかである。しかしながら、この様な変更と応用は以下のクレーム
に記載される本発明の範囲内であることを明確に理解する必要がある。

（配列表）

Claims (41)

1. ａ）グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を含む微生物を発酵培地中で培養する工程；および
   ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、およびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれる、培養工程から製造された生成物を採集する工程
   を包含する、発酵によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法であって、
   該微生物は、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも一つの組み換え核酸分子で、形質転換される、方法。
2. ａ）内因性グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼとグルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも１種の遺伝子修飾とを含む微生物を発酵培地中で培養する工程；および
   ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選ばれる、培養工程から生産された生成物を採集する工程、
   を包含する、発酵によるグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法であって、
   該微生物は、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも一つの組み換え核酸分子で、形質転換される、方法。
3. 前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが酵素活性を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが酵素活性を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが酵素活性を有する、請求項１に記載の方法。
6. 前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが、１つまたは複数のアミノ酸欠失、置換および／または付加を有する、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有し、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有する、請求項１に記載の方法。
7. 前記グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼが配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４でなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
8. 前記組み換え核酸分子の発現が誘導可能である、請求項１に記載の方法。
9. 前記組み換え核酸分子の発現がラクトースで誘導可能である、請求項８に記載の方法。
10. 前記微生物がラクトースによる転写誘導の阻害を減少する遺伝子修飾をさらに含み、該遺伝子修飾がＬａｃＩレプレッサータンパク質をコードする遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記微生物が、グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾をさらに含み、該微生物は、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも一つの組み換え核酸分子で、形質転換される、請求項１に記載の方法。
12. 前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有する、請求項２または１１に記載の方法。
13. 前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有する、請求項２または１１に記載の方法。
14. 前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有する、請求項２または１１に記載の方法。
15. 前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、１つまたは複数のアミノ酸欠失、置換および／または付加を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０でなる群より選ばれるアミノ酸配列を含み、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが酵素活性を有する、請求項２または１１に記載の方法。
16. 前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項２または１１に記載の方法。
17. 野生型グルコサミン−６−燐酸シンターゼと比較して前記グルコサミン−６−燐酸シンターゼの生成物阻害を減少する修飾を、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが有し、該グルコサミン−６−燐酸シンターゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項２または１１に記載の方法。
18. 前記微生物が、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾をさらに含み、グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する該遺伝子修飾が、該微生物中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含む、請求項１、２、または１１に記載の方法。
19. 前記発酵培地中で炭素源を０．５％〜５％の濃度に保つ工程を前記培養工程が含む、請求項１、または、２に記載の方法。
20. 前記培養工程が酵母抽出物を含む発酵培地中で行われる、請求項１、または、２に記載の方法。
21. グルコース、フラクトース、ペントース糖、ラクトースおよびグルコン酸でなる群から選ばれる炭素源を含む発酵培地中で前記培養工程が行われる、請求項１、または、２に記載の方法。
22. 前記ペントース糖がリボース、キシロースおよびアラビノースでなる群より選ばれる、請求項１、または、２に記載の方法。
23. 前記培養工程がグルコースおよびリボースを含む発酵培地、ならびにグルコースおよびグルコン酸を含む発酵培地でなる群より選ばれる発酵培地中で行われる、請求項１、または、２に記載の方法。
24. 前記培養工程が２５℃〜４５℃の温度で行われる、請求項１、または、２に記載の方法。
25. 前記培養工程がｐＨ４〜ｐＨ７．５のｐＨで行われる、請求項１、または、２に記載の方法。
26. 前記微生物がバクテリア、菌類および酵母でなる群より選ばれる、請求項１、または、２に記載の方法。
27. 前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓでなる群から選ばれた属由来のバクテリアである、請求項１、または、２に記載の方法。
28. 微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＰｈａｆｆｉａでなる群から選ばれた属由来の酵母である、請求項１、または、２に記載の方法。
29. 前記微生物がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａでなる群から選ばれた属由来の真菌類である、請求項１、または、２に記載の方法。
30. 前記微生物中でホスフォグルコイソメラーゼ活性を増加する遺伝子修飾を、該微生物がさらに含み、該微生物が配列番号１０５を含む前記ホスフォグルコイソメラーゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子で形質転換される、請求項１、または、２に記載の方法。
31. 前記微生物中でホスフォフラクトキナーゼの部分的または完全な欠失または不活性化を該微生物がさらに含む、請求項１、または、２に記載の方法。
32. 前記微生物がグルタミンシンテターゼ活性を増加する遺伝子修飾をさらに含み、配列番号８９を含むグルタミンシンテターゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子で該微生物が形質転換されている、請求項１、または、２に記載の方法。
33. グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ活性を増加する遺伝子修飾を、前記微生物がさらに含み、配列番号９５を含むグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子で、該微生物が形質転換されている、請求項１、または、２に記載の方法。
34. 前記微生物中でグリコーゲン合成に関与する酵素をコードする遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を、該微生物がさらに含み、前記遺伝子修飾が該微生物のガラクトース代謝能を阻害しない、請求項１、または、２に記載の方法。
35. グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を含む遺伝子修飾微生物であって、該微生物は、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも一つの組み換え核酸分子で、形質転換される、遺伝子修飾微生物。
36. グルコサミン−６−燐酸シンターゼ活性を増加する少なくとも一つの遺伝子修飾を、前記微生物がさらに含み、該微生物は、該グルコサミン−６−燐酸アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも一つの組み換え核酸分子で、形質転換される、請求項３５に記載の遺伝子修飾微生物。
37. グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する少なくとも一つの遺伝子修飾を、前記微生物がさらに含み、該グルコサミン−６−燐酸デアミナーゼ活性を減少する該遺伝子修飾が、該微生物中でグルコサミン−６−燐酸デアミナーゼをコードする内因性遺伝子の部分的または完全な欠失または不活性化を含む、請求項３５に記載の遺伝子修飾微生物。
38. 前記採集工程が、細胞内の、グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンでなる群から選ばれる細胞内生成物を前記微生物から回収する工程、またはグルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれる細胞外生成物を前記発酵培地から回収する工程を包含する、請求項１、または、２に記載の方法。
39. ａ）グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンでなる群より選ばれた生成物を前記発酵培地から精製する工程；
    ｂ）グルコサミン−６−燐酸、グルコサミン−１−燐酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を前記微生物から回収する工程；
    ｃ）グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を脱燐酸し、グルコサミンを製造する工程；
    ｄ） Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を脱燐酸し、Ｎ−アセチルグルコサミンを製造する工程；ならびに
    ｅ）Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた生成物を処理し、グルコサミン、グルコサミン−６−燐酸およびグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれたグルコサミン製品を製造する工程、
    でなる群から選ばれた工程をさらに包含する、請求項１、または、２に記載の方法。
40. Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−燐酸およびＮ−アセチルグルコサミン−１−燐酸でなる群より選ばれた前記生成物を、酸および加熱条件下または酵素的脱アセチル化で加水分解する工程を工程（ｅ）が含む、請求項３９に記載の方法。
41. Ｎ−アセチルグルコサミンの固体を発酵ブロスから沈殿または結晶化させて、前記発酵法で製造されたＮ−アセチルグルコサミンが回収される、請求項１、または、２に記載の方法。

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