CN112410315A

CN112410315A - 一种生产长链糖基化槐角苷的方法

Info

Publication number: CN112410315A
Application number: CN202011374947.0A
Authority: CN
Inventors: 韩瑞枝; 柴宝成; 姜钰琳; 倪晔
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112410315B

Abstract

本发明公开了一种生产长链糖基化槐角苷的方法，属于酶工程以及发酵工程技术领域。本发明提供了一种生产长链糖基化槐角苷的方法，此方法中利用了环糊精葡萄糖基转移酶突变体S77N、Y195S、Y195I、S77N、S77N/Y195S以及S77N/Y195I，使得长链糖基化槐角苷含量显著提升，通过对反应条件的优化，将反应液中长链糖基化槐角苷的含量提高至9.8g/L，将反应液中长链糖基化槐角苷的含量占反应液中总糖基化槐角苷含量的比例提高至45％。

Description

一种生产长链糖基化槐角苷的方法

技术领域

本发明涉及一种生产长链糖基化槐角苷的方法，属于酶工程以及发酵工程技术领域。

背景技术

槐角苷，豆科植物槐树果实，广泛分布于自然界中，主要存在于大豆、绿豆、苜蓿、燕麦、大麦、黑麦、小麦、玉米等谷类植物中，是一种具有弱雌激素样作用的非雌激素类化合物，在医药以及保健等领域均具有极高的应用前景。

现代药理研究表明，槐角苷对慢性肝炎病人的降谷丙转氨酶效果良好，还能同时抑制由巴豆油诱导的耳水肿和角叉菜胶引起的爪水肿。临床研究也证实，槐角苷可用于防治妇女绝经后骨质疏松的症状。槐角浸羔注射于家兔，能使血糖一时性增高。据南京药物研究所报道，从槐角中提出的染料木素和山柰酚，具有干扰孕卵运输、终止孕卵着床和抗早期妊娠等作用，可能与其雌性激素活性有关；小量长期服用染料木素和槐角甙，对雌性小鼠在不影响交配率和生长的情Chemicalbook况下，有显著的抗生育作用。毒性作用，槐角浸羔能使家兔及豚鼠的红细胞减少，尤以荚果作用为大。槐树种子提取液能使兔、猪、人的红细胞凝集，种子、荚、果肉均含有抗A、抗B、抗H凝集素；中国槐为含有植物血凝素类药物，并具有促进淋巴细胞的转化作用。有研究表明，二葡萄糖基槐角苷和三葡萄糖基槐角苷在水中的溶解度更高。也有研究表明，将槐角苷进行糖基化并不影响其生理生化功能。并且，有研究表明，糖基化槐角苷在体内会水解为可被人体吸收的葡萄糖与染料木素，安全性较高。因此，可通过将槐角苷进行糖基化以提高其水溶性。

前期实验表明，以二葡萄糖基染料木素槐角苷为底物更能提高糖基化效率，所以将槐角苷直接作为底物。

环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase或CGT酶，EC2.4.1.19)是常见的可催化糖基化反应的酶，可使用此酶对槐角苷进行糖基化。

但是，现有的环糊精葡萄糖基转移酶合成长链槐角苷的效率较低，合成短链糖基槐角苷的效率较高，这大大限制了利用环糊精葡萄糖基转移酶合成长链糖基化槐角苷的产量。因此，急需找到一种产量高的生产长链糖基化槐角苷的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种产量高的生产长链糖基化槐角苷的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种生产长链糖基化槐角苷的方法，所述方法利用了环糊精葡萄糖基转移酶突变体，在麦芽糊精的体系中，对槐角苷进行催化，制备得到长链糖基化槐角苷。

本发明提供了环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶为亲本，将亲本第77位和/或第195位突变，所示突变体为如下(a)～(e)任一：

(a)将亲本第77位突变为天冬酰胺；

(b)将亲本第195位突变为丝氨酸；

(c)将亲本第195位突变为异亮氨酸；

(d)将亲本第77位突变为天冬酰胺，并将亲本第195位突变为丝氨酸；

(e)将亲本第77位突变为天冬酰胺，并将亲本第195位突变为异亮氨酸。

在本发明的一种实施方式中，编码亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第77位突变为天冬酰胺，得到突变体S77N，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第195位突变为丝氨酸，得到突变体Y195S，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第195位突变为异亮氨酸，得到突变体Y195I，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第77位突变为天冬酰胺，并将亲本第195位突变为丝氨酸，得到突变体S77N/Y195S，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本第77位突变为天冬酰胺，并将亲本第195位突变为异亮氨酸，得到突变体S77N/Y195I，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明提供了携带所述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒为pET、pUC系列载体。

本发明提供了表达所述突变体的宿主细胞，或携带所述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为出发菌株。

一种生产长链糖基化槐角苷的方法，以槐角苷为底物，以所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体为催化剂，制备得到长链糖基化槐角苷。

在本发明的一种实施方式中，所述长链糖基化槐角苷是指四糖基化槐角苷、五糖基化槐角苷和/或六糖基化槐角苷。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的添加量不低于15U/g底物。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉为可溶性淀粉。

在本发明的一种实施方式中，将槐角苷溶解于二甲基亚砜中配制成槐角苷溶液；将麦芽糊精溶解于缓冲液A中配制成麦芽糊精溶液；将环糊精葡萄糖基转移酶溶解于缓冲液B中配制成酶液；将槐角苷溶液、麦芽糊精溶液和酶液混合得到反应体系；将反应体系于pH为5-8、温度为30-60℃、转速为120-200rpm的条件下进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到长链糖基化槐角苷。

在本发明的一种实施方式中，反应pH为7.0-8.0。

在本发明的一种实施方式中，反应温度为45-50℃，共反应20-24h。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液A为PBS缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸钠缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液B为PBS缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸钠缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液A的浓度为25-75mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液B的浓度为25-75mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述槐角苷溶液的浓度为1-10g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糊精溶液的浓度为20-60g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述酶液的浓度为10-20U/L。

在本发明的一种实施方式中，所述槐角苷溶液、麦芽糊精溶液和酶液的体积比为(2～4):(4～6):(1～3)。

本发明还提供了所述突变体，或所述基因，或所述重组质粒，或所述宿主细胞在制备长链糖基化槐角苷中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一种产量高的生产长链糖基化槐角苷的方法，在此方法中利用了环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是将原始的环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到突变体S77N、Y195S、Y195I、S77N、S77N/Y195S以及S77N/Y195I，这些突变体可使制备得到的长链糖基化槐角苷含量显著提升，通过制备条件的优化，能提高反应液中长链糖基化槐角苷的含量占反应液中总糖基化槐角苷含量的比例，将反应液中长链糖基化槐角苷的含量提高至9.8g/L，将反应液中长链糖基化槐角苷的含量占反应液中总糖基化槐角苷含量的比例提高至45％。

附图说明

图1为反应温度对反应液中短链糖基化槐角苷以及长链糖基化槐角苷的摩尔含量占反应液中总糖基化槐角苷摩尔含量的比例的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

(1)下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109以及大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET-20b(+)质粒购自Novagen公司。

(2)下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L-1、氨苄青霉素100μg·L^-1。

LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉15g·L^-1、氨苄青霉素100μg·L^-1。

(3)下述实施例中涉及的检测方法如下：

环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定方法：取酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH 6.5)配制的浓度为30g·L^-1的可溶性淀粉溶液中，在40℃下反应10min后，加入1.0mL 1.0M的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙，在16℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。

环糊精葡萄糖基转移酶酶活的定义：在该条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需酶量为一个酶活力单位。

实施例1：不同环糊精葡萄糖基转移酶的制备及表达

具体步骤如下：

化学合成编码环糊精葡萄糖基转移酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；将获得的基因与pET-20b(+)质粒经双酶切(NdeI和Xho I)后进行连接，转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的重组质粒pET20b-CGT；将测序正确的重组质粒pET20b-CGT转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，即获得重组大肠杆菌pET20b-CGT/E.coli BL21。

利用全质粒PCR技术，以获得的重组质粒pET20b-CGT为模板进行定点突变，获得突变体S77N、Y195I、Y195S、S77N/Y195S、S77N/Y195I；

其中，突变S77N用引物如下：

正向引物：5’-CTGTGGATCAACCAACCGGTGGAAAA-3’(SEQ ID NO.8)；

反向引物：5’-CACCGGTTGGTTGATCCACAGCGCCG-3’(SEQ ID NO.9)；

突变Y195I所用引物如下：

正向引物：5’-TATAAAAATCTGATCGATCTGGCTGA-3’(SEQ ID NO.10)；

反向引物：5’-TGTCAGCCAGATCGATCAGATTTTTA-3’(SEQ ID NO.11)；

突变Y195S所用引物如下：

正向引物：5’-TATAAAAATCTGTCTGATCTGGCTGA-3’(SEQ ID NO.12)；

反向引物：5’-TGTCAGCCAGATCAGACAGATTTTTA-3’(SEQ ID NO.13)；

PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)5μL，2.5mM dNTPs 4μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，2.5U/μLPrimeSTARTaqHS 0.5μL，加入双蒸水至50μL；

PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；随后进行98℃10s，57℃15s，72℃6min，30个循环；最后72℃保温10min。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(DpnI)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将Dpn I处理后的扩增产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的含有编码突变体S77N(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)、Y195S(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)、Y195I(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)、S77N/Y195S(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)以及S77N/Y195I(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)的基因的重组质粒；将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，即获得含有编码突变体S77N、Y195S、Y195I、S77N、S77N/Y195S以及S77N/Y195I的基因的重组大肠杆菌。

将获得的重组大肠杆菌pET20b-CGT/E.coli BL21以及编码突变体S77N、Y195S、Y195I、S77N、S77NY/195S以及S77N/Y195I的基因的重组大肠杆菌涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入LB液体培养基，于37℃培养12～14h，获得种子液；将种子液按照4mL/100mL的接种量接入TB液体培养基，于30℃、120rpm培养至OD₆₀₀＝0.6后，在发酵液中加入终浓度为0.01mM的IPTG，于25℃、120rpm继续诱导培养90h，得到发酵液；将发酵液于4℃、1000rpm离心20min后，收集发酵上清液；在发酵上清液中加入30％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含20～480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含环糊精葡萄糖基转移酶酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6)中透析过夜后，分别得到突变体S77N、Y195S、Y195I、S77N、S77N/Y195S以及S77N/Y195I的纯酶，并冻干备用。

实施例2：不同环糊精葡萄糖基转移酶对不同糖基化槐角苷的产物特异性

具体步骤如下：

将槐角苷(购自Sigma公司)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配制成终浓度为1g/L的槐角苷溶液；将水溶性淀粉溶解于PBS缓冲液(50mM，pH 7)中配制成终浓度为40g/L的麦芽糊精溶液；分别将实施例1获得的冻干后的突变体S77N、Y195S、Y195I、S77N、S77N/Y195S以及S77N/Y195I的纯酶溶解于PBS缓冲液(50mM，pH 7)中配制成终浓度为15U/L的CGTase酶液；分别取200μL槐角苷溶液，600μL水溶性淀粉溶液和200μLCGTase酶液混合于2mL的带盖小管内，放于40℃、120rpm摇床缓慢振荡20～24h，得到反应液。

通过HPLC检测反应液中短链糖基化槐角苷(此处短链糖基化槐角苷为一糖基化槐角苷、二糖基化槐角苷和三糖基化槐角苷的混合物)和长链糖基化槐角苷(此处长链糖基化槐角苷为四糖基化槐角苷、五糖基化槐角苷和六糖基化槐角苷的混合物)的摩尔含量，并计算反应液中短链糖基化槐角苷和长链糖基化槐角苷的摩尔含量占反应液中总糖基化槐角苷摩尔含量的比例(％)，检测结果见表1；其中，HPLC检测反应液中短链糖基化槐角苷以及长链糖基化槐角苷的含量占反应液中总糖基化槐角苷含量的比例(％)的方法为：反应液通过0.22μm滤膜过滤，使用Amethyst C18-H柱(4.6×250mm,Sepax,America)检测(具体检测条件见表2)。

由表1可知，突变体S77N、Y195S、Y195I、S77N、S77NY195S以及S77NY195I对长链糖基化槐角苷的产物特异性高较野生型有了明显的提高；

表1不同环糊精葡萄糖基转移酶反应得到的反应液中短链糖基化槐角苷以及长链糖基化槐角苷的含量(g/L)

表2 HPLC检测反应液中短链糖基化槐角苷以及长链糖基化槐角苷的含量的条件

实施例3：反应温度对长链糖基化槐角苷产量的影响

具体步骤如下：

在实施例2的基础上，选择突变体S77N/Y195I，并且，将反应温度分别替换为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。

参照实施例2，通过HPLC检测反应液中短链糖基化槐角苷(此处短链糖基化槐角苷为一糖基化槐角苷、二糖基化槐角苷和三糖基化槐角苷的混合物)和长链糖基化槐角苷(此处长链糖基化槐角苷为四糖基化槐角苷、五糖基化槐角苷和六糖基化槐角苷的混合物)的摩尔含量，并计算反应液中短链糖基化槐角苷和长链糖基化槐角苷的摩尔含量占反应液中总糖基化槐角苷摩尔含量的比例(％)，检测结果见表3。

由表3可知，当温度为45～50℃时，利用突变体S77N/Y195I以水溶性淀粉作为糖基供体，以槐角苷作为糖基受体生产长链糖基化槐角苷的产量较高。

可见，利用突变体S77NY195I以水溶性淀粉作为糖基供体，以槐角苷作为糖基受体生产长链糖基化槐角苷时，应控制温度为45～50℃。

表3不同温度下反应得到的反应液中短链糖基化槐角苷以及长链糖基化槐角苷的含量(g/L)

实施例4：反应pH对长链糖基化槐角苷产量的影响

具体步骤如下：

在实施例2的基础上，选择对长链糖基化槐角苷产物特异性最高的突变体S77N/Y195I，将反应温度控制为50℃，并且，将反应pH分别替换为5、6、7、8。

参照实施例2，通过HPLC检测反应液中短链糖基化槐角苷(此处短链糖基化槐角苷为一糖基化槐角苷、二糖基化槐角苷和三糖基化槐角苷的混合物)和长链糖基化槐角苷(此处长链糖基化槐角苷为四糖基化槐角苷、五糖基化槐角苷和六糖基化槐角苷的混合物)的摩尔含量，并计算反应液中短链糖基化槐角苷和长链糖基化槐角苷的摩尔含量占反应液中总糖基化槐角苷摩尔含量的比例(％)，检测结果见图1。

可见，利用突变体S77N/Y195I以麦芽糊精作为糖基供体，以槐角苷作为糖基受体生产长链糖基化槐角苷时，在pH为5、6、7、8时，长链糖基化槐角的比例分别为40％、45％、25％、25％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种生产长链糖基化槐角苷的方法

<130> BAA201302A

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2061

<212> DNA

<213> Paenibacillus macerans

<400> 1

tcaccggaca cctcagtgga caataaagtt aacttcagca ccgatgttat ctaccagatc 60

gtcacggacc gttttgcgga tggtgaccgc accaacaatc cggcaggcga tgctttcagc 120

ggtgaccgtt ctaatctgaa actgtatttt ggcggtgatt ggcagggcat tatcgataaa 180

attaacgacg gttacctgac cggcatgggt gtgacggcgc tgtggatcag ccaaccggtg 240

gaaaacatca cctcagttat caaatactcg ggcgtcaaca atacgtctta tcatggttac 300

tgggcccgtg attttaaaca gaccaacgac gcgtttggcg atttcgccga ctttcaaaat 360

ctgattgata ccgcacatgc tcacaacatt aaagtggtta tcgatttcgc cccgaaccac 420

acctctccgg cagatcgcga caatccgggc tttgcagaaa atggtgctct gtatgataac 480

ggctcactgc tgggtgcata ctcgaatgac accgctggcc tgttccatca caacggcggt 540

acggatttta gtaccattga agacggtatc tataaaaatc tgtacgatct ggctgacatc 600

aaccataaca ataacgcgat ggatgcctat ttcaaatcag caattgacct gtggctgggc 660

atgggtgttg atggcatccg ctttgacgcg gtcaaacaca tgccgttcgg ttggcagaaa 720

tcgtttgtga gcagcattta tggcggtgat cacccggttt ttaccttcgg cgaatggtat 780

ctgggtgctg atcagacgga tggcgacaat atcaaatttg cgaacgaatc tggtatgaat 840

ctgctggatt ttgaatatgc acaagaagtc cgtgaagtgt ttcgcgataa aacggaaacc 900

atgaaagacc tgtacgaagt gctggcctca accgaatcgc agtatgatta cattaataac 960

atggtgacct tcatcgacaa tcacgatatg gaccgttttc aggttgcggg ctcaggtacg 1020

cgcgccaccg aacaagcgct ggcactgacg ctgacctcgc gtggcgttcc ggcgatttat 1080

tacggcaccg aacagtatat gacgggcgat ggtgacccga ataaccgcgc catgatgacg 1140

agtttcaata ccggcaccac ggcatataaa gtgattcaag cactggctcc gctgcgtaaa 1200

tccaacccgg caatcgccta cggcaccacc accgaacgtt gggtgaataa cgatgttctg 1260

attatcgaac gcaaatttgg tagttccgcg gccctggtcg ccattaatcg caactcatcg 1320

gcagcttatc cgatcagtgg tctgctgagc agcctgccag cgggcaccta ctccgatgtg 1380

ctgaatggcc tgctgaatgg taacagcatt accgtgggct ctggcggtgc ggttacgaac 1440

tttaccctgg cagcgggcgg caccgcagtt tggcagtata cggctccgga aaccagcccg 1500

gcgatcggta atgtcggtcc gacgatgggc caaccgggta acattgtgac gatcgatggt 1560

cgtggtttcg gcggtacggc tggcaccgtg tactttggta cgaccgcggt caccggcagt 1620

ggtattgtgt cctgggaaga tacgcagatt aaagcggtca tcccgaaagt ggcagctggc 1680

aaaaccggtg tcagcgtgaa aacgagttcc ggcaccgcca gtaatacgtt caaatccttt 1740

aacgttctga ccggtgatca ggttacggtc cgctttctgg tcaaccaagc gaataccaac 1800

tatggcacga atgtttacct ggtcggcaac gcggccgaac tgggttcctg ggacccgaat 1860

aaagccattg gtccgatgta taaccaggtt atcgcaaaat acccgagctg gtattacgat 1920

gtgagcgttc cggcgggcac caaactggac ttcaaattca ttaaaaaagg cggtggcacg 1980

gtgacctggg aaggtggcgg taaccatacc tacacgaccc cggcgagcgg cgttggcacg 2040

gtgacggtgg attggcaaaa t 2061

<210> 2

<211> 687

<212> PRT

<213> Paenibacillus macerans

<400> 2

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 3

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Asn Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 4

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Ser Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 5

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Ile Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 6

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Asn Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Ser Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 7

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Asn Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Ile Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgtggatca accaaccggt ggaaaa 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caccggttgg ttgatccaca gcgccg 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tataaaaatc tgatcgatct ggctga 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtcagccag atcgatcaga ttttta 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tataaaaatc tgtctgatct ggctga 26

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgtcagccag atcagacaga ttttta 26

Claims

1.环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶为亲本，将亲本第77位和/或第195位突变，所示突变体为如下(a)～(e)任一：

(a)将亲本第77位突变为天冬酰胺；

(b)将亲本第195位突变为丝氨酸；

(c)将亲本第195位突变为异亮氨酸；

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。

4.表达权利要求1所述突变体的宿主细胞，或携带权利要求3所述重组质粒的宿主细胞。

5.一种生产长链糖基化槐角苷的方法，其特征在于，以槐角苷为底物，以权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体为催化剂，制备长链糖基化槐角苷。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的添加量不低于15U/g底物。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应体系中还含有淀粉。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应pH为7.0-8.0。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应温度为45-50℃，共反应20-24h。

10.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述重组质粒，或权利要求4所述宿主细胞在制备长链糖基化槐角苷中的应用。