CN110734946B - 一种生产长链糖基化染料木素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产长链糖基化染料木素的方法，属于酶工程以及发酵工程技术领域。本发明提供了一种生产长链糖基化染料木素的方法，利用此方法生产长链糖基化染料木素可提高反应液中长链糖基化染料木素的含量以及反应液中长链糖基化染料木素的含量占反应液中总糖基化染料木素含量的比例，将反应液中长链糖基化染料木素的含量提高至10.3g/L，将反应液中长链糖基化染料木素的含量占反应液中总糖基化染料木素含量的比例提高至70％。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产长链糖基化染料木素的方法，属于酶工程以及发酵工程技术领域。
背景技术
染料木素(Genistein)，又称5,7,4-三羟基异黄酮、染料木黄酮或金雀异黄素，广泛分布于自然界中，主要存在于大豆、绿豆、苜蓿、燕麦、大麦、黑麦、小麦、玉米等谷类植物中，是一种具有弱雌激素样作用的非雌激素类化合物，在医药以及保健等领域均具有极高的应用前景。
目前，染料木素类产品主要集中于预防以及治疗心血管疾病、女性更年期综合症、乳腺增生、乳腺癌、前列腺癌等方面，其作为肿瘤细胞的预防剂，具有不杀伤正常细胞的特点，因此受到各国医药界的高度重视。然而，由于染料木素具有很强疏水性，导致其生物利用度低，难以达到临床治疗疾病的目的，这大大限制了其在医药以及保健等领域中的应用。因此，如何提高染料木素在水溶液中的溶解度，成为目前国内外关注的焦点。
有研究表明，二葡萄糖基染料木素和三葡萄糖基染料木素在水中的溶解度分别是染料木素的3700倍和44000倍(具体可见参考文献：Li D,Roh SA,Shim JH,Mikami B,BaikMY,Park CS,Park KH.2005.Glycosylation of genistin into soluble inclusioncomplex form of cyclic glucans by enzymatic modification.J Agric Food Chem53:6516-24)。也有研究表明，将染料木素进行糖基化并不影响其生理生化功能(具体可见参考文献：Chung MJ,Kang AY,Lee KM,Oh E,Jun HJ,Kim SY,Auh JH,Moon TW,Lee SJ,Park KH.2006.Water-soluble genistin glycoside isoflavones up-regulateantioxidant metallothionein expression and scavenge free radicals.J AgricFood Chem 54:3819-26)。并且，有研究表明，糖基化染料木素在体内内会水解为可被人体吸收的葡萄糖与染料木素，安全性较高(具体可见参考文献：Chung MJ,Kang AY,Lee KM,OhE,Jun HJ,Kim SY,Auh JH,Moon TW,Lee SJ,Park KH.2006.Water-soluble genistinglycoside isoflavones up-regulate antioxidant metallothionein expression andscavenge free radicals.J Agric Food Chem54:3819-26)。因此，可通过将染料木素进行糖基化以提高其水溶性。
环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase或CGT酶，EC 2.4.1.19)是常见的可催化糖基化反应的酶，可使用此酶对染料木素进行糖基化。在此基础上，研究表明，糖基化染料木素所连糖链越长，水溶性越好(具体可见参考文献：LiD,Roh SA,Shim JH,Mikami B,Baik MY,Park CS,Park KH.2005.Glycosylation ofgenistin into soluble inclusion complex form of cyclic glucans by enzymaticmodification.J Agric Food Chem 53:6516-24)。因此，生产大量的长链糖基化染料木素对提高其应用价值至关重要。
但是，现有的环糊精葡萄糖基转移酶合成长链糖基染料木素的效率较低，合成短链糖基染料木素的效率较高，这大大限制了利用环糊精葡萄糖基转移酶合成长链糖基化染料木素的产量。因此，急需找到一种产量高的生产长链糖基化染料木素的方法。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种产量高的生产长链糖基化染料木素的方法。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种生产长链糖基化染料木素的方法，所述方法为将含有麦芽糊精、染料木素和环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextringlycosyltransferase，简称CGTase或CGT酶，EC 2.4.1.19)的反应体系于pH为4～8、温度为30～60℃、转速为120～180rpm的条件下进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到长链糖基化染料木素；所述环糊精葡萄糖基转移酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的环糊精葡萄糖基转移酶中的一种或一种以上。所述长链糖基化染料木素是指四糖基化染料木素、五糖基化染料木素和/或六糖基化染料木素。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将染料木素溶解于二甲基亚砜中配制成染料木素溶液；将麦芽糊精溶解于缓冲液A中配制成麦芽糊精溶液；将环糊精葡萄糖基转移酶溶解于缓冲液B中配制成酶液；将染料木素溶液、麦芽糊精溶液和酶液混合得到反应体系；将反应体系于pH为4～8、温度为30～60℃、转速为120～180rpm的条件下进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到长链糖基化染料木素。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的pH为4或8、温度为45～50℃。
在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶为氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示的环糊精葡萄糖基转移酶。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液A为PBS缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸钠缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液B为PBS缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸钠缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液A的浓度为25～75mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液B的浓度为25～75mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述染料木素溶液的浓度为5～15g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糊精溶液的浓度为20～60g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述酶液的浓度为10～20U/L。
在本发明的一种实施方式中，所述染料木素溶液、麦芽糊精溶液和酶液的体积比为2～4:4～6:1～3。
在本发明的一种实施方式中，所述反应的时间为20～24h。
本发明还提供了上述方法在生产长链糖基化染料木素中的应用。
[有益效果]
本发明提供了一种产量高的生产长链糖基化染料木素的方法，利用此方法生产长链糖基化染料木素可提高反应液中长链糖基化染料木素的含量以及反应液中长链糖基化染料木素的含量占反应液中总糖基化染料木素含量的比例，将反应液中长链糖基化染料木素的含量提高至10.3g/L，将反应液中长链糖基化染料木素的含量占反应液中总糖基化染料木素含量的比例提高至70％。
附图说明
图1：反应温度对反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例的影响。
图2：反应pH对反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109以及大肠杆菌E.col iBL21(DE3)购自北纳生物，pET-20b(+)质粒购自Novagen公司。(上述菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、氨苄青霉素100μg·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g·L-1、氨苄青霉素100μg·L-1。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定方法：取酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的浓度为30g·L-1的可溶性淀粉溶液中，在40℃下反应10min后，加入1.0mL 1.0M的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙，在16℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。
环糊精葡萄糖基转移酶酶活的定义：在该条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需酶量为一个酶活力单位。
实施例1：不同环糊精葡萄糖基转移酶的制备及表达
具体步骤如下：
化学合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因(基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；将获得的基因与pET-20b(+)质粒经双酶切(NcoI和Xho I)后进行连接，转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的重组质粒pET20b-CGT；将测序正确的重组质粒pET20b-CG转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，即获得重组大肠杆菌pET20b-CGT/E.coliBL21。
利用全质粒PCR技术，以获得的重组质粒pET20b-CGT为模板进行定点突变，获得突变体A156V/L174P(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)、A156V/L174P/A166Y(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)、A156V/L174P/A166V(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)、A156V/L174P/A166G(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)、A156V/L174P/A166K(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)、A156S、A156L以及L174M；
其中，突变A156V所用引物如下：
正向引物：5’-GCAGAAAATGGTGTTCTGTAT-3’(SEQ ID No.8)；
反向引物：5’-GTTATCATACAGAACACCATT-3’(SEQ ID No.9)；
突变L174P所用引物如下：
正向引物：5'-GACACCGCTGGCCCGTTCCAT-3'(SEQ ID No.10)；
反向引物：5'-GTTGTGATGGAACGGGCCAGC-3'(SEQ ID No.11)；
突变A166Y所用引物如下：
正向引物：5'-TCACTGCTGGGTTACTACTCGAAT-3'(SEQ ID No.12)；
反向引物：5'-GTCATTCGAGTAGTAACCCAGCAG-3'(SEQ ID No.13)；
突变A166V所用引物如下：
正向引物：5'-TCACTGCTGGGTGTTTACTCGAAT-3'(SEQ ID No.14)；
反向引物：5'-GTCATTCGAGTAAACACCCAGCAG-3'(SEQ ID No.15)；
突变A166G所用引物如下：
正向引物：5'-TCACTGCTGGGTGGTTACTCGAAT-3'(SEQ ID No.16)；
反向引物：5'-GTCATTCGAGTAACCACCCAGCAG-3'(SEQ ID No.17)；
突变A166K所用引物如下：
正向引物：5'-TCACTGCTGGGTAAATACTCGAAT-3'(SEQ ID No.18)；
反向引物：5'-GTCATTCGAGTATTTACCCAGCAG-3'(SEQ ID No.19)；
突变A156S所用引物如下：
正向引物：5'-GCAGAAAATGGTTCTCTGTAT-3'(SEQ ID No.20)；
反向引物：5'-GTTATCATACAGAGAACCATT-3'(SEQ ID No.21)；
突变A156L所用引物如下：
正向引物：5'-GCAGAAAATGGTCTGCTGTAT-3'(SEQ ID No.22)；
反向引物：5'-GTTATCATACAGCAGACCATTG-3'(SEQ ID No.23)；
突变L174M所用引物如下：
正向引物：5'-GACACCGCTGGCATGTTCCAT-3'(SEQ ID No.24)；
反向引物：5'-GTTGTGATGGAACATGCCAGC-3'(SEQ ID No.25)，
PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)5μL，2.5mM dNTPs 4μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，2.5U/μL PrimeSTAR Taq HS 0.5μL，加入双蒸水至50μL；
PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；随后进行98℃10s，57℃15s，72℃6min，30个循环；最后72℃保温10min。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将Dpn I处理后的扩增产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的含有编码突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的基因的重组质粒；将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，即获得含有编码突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的基因的重组大肠杆菌。
将获得的重组大肠杆菌pET20b-CGT/E.coli BL21以及编码突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的基因的重组大肠杆菌涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入LB液体培养基，于37℃培养12～14h，获得种子液；将种子液按照4％(v/v)的接种量接入LB液体培养基，于30℃、120rpm培养至OD600＝0.6后，在发酵液中加入终浓度为0.01mM的IPTG，于25℃、120rpm继续诱导培养90h，得到发酵液；将发酵液于4℃、1000rpm离心20min后，收集发酵上清液；在发酵上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含20～480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含环糊精葡萄糖基转移酶酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6)中透析过夜后，分别得到突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的纯酶，并冻干备用。
实施例2：不同环糊精葡萄糖基转移酶对不同糖基化染料木素的产物特异性
具体步骤如下：
将染料木素(购自Sigma公司)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配制成终浓度为7.5g/L的染料木素溶液；将麦芽糊精(购自上海生工生物工程有限公司)溶解于PBS缓冲液(50mM，pH6.5)中配制成终浓度为40g/L的麦芽糊精溶液；分别将实施例1获得的冻干后的突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的纯酶溶解于PBS缓冲液(50mM，pH6.5)中配制成终浓度为15U/L的CGTase酶液；分别取300μL染料木素溶液，500μL麦芽糊精溶液和200μL CGTase酶液混合于2mL的带盖小管内，放于40℃、120rpm摇床缓慢振荡20～24h，得到反应液。
通过HPLC检测反应液中短链糖基化染料木素(此处短链糖基化染料木素为一糖基化染料木素、二糖基化染料木素和三糖基化染料木素的混合物)和长链糖基化染料木素(此处长链糖基化染料木素为四糖基化染料木素、五糖基化染料木素和六糖基化染料木素的混合物)的摩尔含量，并计算反应液中短链糖基化染料木素和长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例(％)以及反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量(g/L)，检测结果见表1-2；其中，HPLC检测反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量占反应液中总糖基化染料木素含量的比例(％)的方法为：反应液通过0.22μm滤膜过滤，使用Amethyst C18-H柱(4.6×250mm,Sepax,America)检测(具体检测条件见表3)；其中，长链糖基化染料木素的含量＝六糖基化染料木素的摩尔含量×六糖基化染料木素的分子量+五糖基化染料木素的摩尔含量×五糖基化染料木素的分子量+四糖基化染料木素的摩尔含量×四糖基化染料木素的分子量，短链糖基化染料木素的含量＝三糖基化染料木素的摩尔含量×三糖基化染料木素的分子量+二糖基化染料木素的摩尔含量×二糖基化染料木素的分子量+一糖基化染料木素的摩尔含量×一糖基化染料木素的分子量。
由表1-2可知，仅有突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K对长链糖基化染料木素的产物特异性高较野生型有了明显的提高；
其中，利用突变体A156V/L174P以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了62.5％；
利用突变体A156V/L174P/A166Y以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了165％；
利用突变体A156V/L174P/A166V以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了112.5％；
利用突变体A156V/L174P/A166G以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了37.5％；
利用突变体A156V/L174P/A166K以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了59.4％。
表1不同环糊精葡萄糖基转移酶反应得到的反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例(％)
表2不同环糊精葡萄糖基转移酶反应得到的反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量(g/L)
| 组别 | 长链基染料木素 | 短链糖基化染料木素 |
| 野生型 | 3.2 | 11.4 |
| A156S | 1.2 | 8.83 |
| A156L | 0.7 | 7.64 |
| L174M | 1.0 | 8.87 |
| A156V/L174P | 5.2 | 9.7 |
| A156V/L174P/A166V | 6.8 | 9.5 |
| A156V/L174P/A166G | 4.4 | 10.9 |
| A156V/L174P/A166K | 5.1 | 10.1 |
| A156V/L174P/A166Y | 8.5 | 8.0 |
表3HPLC检测反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量的条件
实施例3：反应温度对长链糖基化染料木素产量的影响
具体步骤如下：
在实施例2的基础上，选择对长链糖基化染料产物特异性最高的突变体A156V/L174P/A166Y，并且，将反应温度分别替换为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。
参照实施例2，通过HPLC检测反应液中短链糖基化染料木素(此处短链糖基化染料木素为一糖基化染料木素、二糖基化染料木素和三糖基化染料木素的混合物)和长链糖基化染料木素(此处长链糖基化染料木素为四糖基化染料木素、五糖基化染料木素和六糖基化染料木素的混合物)的摩尔含量，并计算反应液中短链糖基化染料木素和长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例(％)以及反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量(g/L)，检测结果见表4和图1。
由表4可知，当温度为45～50℃时，利用突变体A156V/L174P/A166Y以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量最高，可达10.2～10.4g/L，较温度为40℃时提高了21.4～23.8％。
由图1可知，温度越高，利用突变体A156V/L174P/A166Y反应获得的反应液中长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例越高，可达49％以上，较温度为40℃时提高了21％以上。
可见，利用突变体A156V/L174P/A166Y以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素时，应控制温度为45～50℃。
表4不同温度下反应得到的反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量(g/L)
| 温度 | 长链基染料木素 | 短链糖基化染料木素 |
| 30℃ | 6.8 | 8.9 |
| 35℃ | 7.6 | 8.5 |
| 40℃ | 8.4 | 8.0 |
| 45℃ | 10.1 | 6.8 |
| 50℃ | 10.0 | 6.6 |
| 55℃ | 8.9 | 5.6 |
| 60℃ | 5.7 | 3.6 |
实施例4：反应pH对长链糖基化染料木素产量的影响
具体步骤如下：
在实施例2的基础上，选择对长链糖基化染料产物特异性最高的突变体A156V/L174P/A166Y，将反应温度控制为50℃，并且，将反应pH分别替换为4、5、6、7、8。
参照实施例2，通过HPLC检测反应液中短链糖基化染料木素(此处短链糖基化染料木素为一糖基化染料木素、二糖基化染料木素和三糖基化染料木素的混合物)和长链糖基化染料木素(此处长链糖基化染料木素为四糖基化染料木素、五糖基化染料木素和六糖基化染料木素的混合物)的摩尔含量，并计算反应液中短链糖基化染料木素和长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例(％)以及反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量(g/L)，检测结果见表5和图2。
由表5可知，当pH为4或8时，利用突变体A156V/L174P/A166Y以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量最高，可达10.2～10.3g/L，较pH为6.5时提高了20％左右。
由图2可知，当pH为4时，利用突变体A156V/L174P/A166Y反应获得的反应液中长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例最高，可达70％，较pH为6.5时提高了30％。
可见，利用突变体A156V/L174P/A166Y以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素时，应控制pH为4。
表5不同pH下反应得到的反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量(g/L)
| pH | 长链基染料木素 | 短链糖基化染料木素 |
| 4 | 10.2 | 2.6 |
| 5 | 7.2 | 8.8 |
| 6 | 8.5 | 8.0 |
| 7 | 9.7 | 5.5 |
| 8 | 10.3 | 3.6 |
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种生产长链糖基化染料木素的方法
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn
20 25 30
Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu
35 40 45
Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly
50 55 60
Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val
65 70 75 80
Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser
85 90 95
Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe
100 105 110
Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His
115 120 125
Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala
130 135 140
Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn
145 150 155 160
Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His
165 170 175
His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys
180 185 190
Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp
195 200 205
Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp
210 215 220
Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys
225 230 235 240
Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe
245 250 255
Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys
260 265 270
Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln
275 280 285
Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu
290 295 300
Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn
305 310 315 320
Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala
325 330 335
Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr
340 345 350
Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr
355 360 365
Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr
370 375 380
Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys
385 390 395 400
Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn
405 410 415
Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu
420 425 430
Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu
435 440 445
Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu
450 455 460
Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn
465 470 475 480
Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro
485 490 495
Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro
500 505 510
Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly
515 520 525
Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser
530 535 540
Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly
545 550 555 560
Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr
565 570 575
Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe
580 585 590
Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val
595 600 605
Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly
610 615 620
Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp
625 630 635 640
Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys
645 650 655
Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr
660 665 670
Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn
675 680 685
<210> 2
<211> 2061
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcaccggaca cctcagtgga caataaagtt aacttcagca ccgatgttat ctaccagatc 60
gtcacggacc gttttgcgga tggtgaccgc accaacaatc cggcaggcga tgctttcagc 120
ggtgaccgtt ctaatctgaa actgtatttt ggcggtgatt ggcagggcat tatcgataaa 180
attaacgacg gttacctgac cggcatgggt gtgacggcgc tgtggatcag ccaaccggtg 240
gaaaacatca cctcagttat caaatactcg ggcgtcaaca atacgtctta tcatggttac 300
tgggcccgtg attttaaaca gaccaacgac gcgtttggcg atttcgccga ctttcaaaat 360
ctgattgata ccgcacatgc tcacaacatt aaagtggtta tcgatttcgc cccgaaccac 420
acctctccgg cagatcgcga caatccgggc tttgcagaaa atggtgctct gtatgataac 480
ggctcactgc tgggtgcata ctcgaatgac accgctggcc tgttccatca caacggcggt 540
acggatttta gtaccattga agacggtatc tataaaaatc tgtacgatct ggctgacatc 600
aaccataaca ataacgcgat ggatgcctat ttcaaatcag caattgacct gtggctgggc 660
atgggtgttg atggcatccg ctttgacgcg gtcaaacaca tgccgttcgg ttggcagaaa 720
tcgtttgtga gcagcattta tggcggtgat cacccggttt ttaccttcgg cgaatggtat 780
ctgggtgctg atcagacgga tggcgacaat atcaaatttg cgaacgaatc tggtatgaat 840
ctgctggatt ttgaatatgc acaagaagtc cgtgaagtgt ttcgcgataa aacggaaacc 900
atgaaagacc tgtacgaagt gctggcctca accgaatcgc agtatgatta cattaataac 960
atggtgacct tcatcgacaa tcacgatatg gaccgttttc aggttgcggg ctcaggtacg 1020
cgcgccaccg aacaagcgct ggcactgacg ctgacctcgc gtggcgttcc ggcgatttat 1080
tacggcaccg aacagtatat gacgggcgat ggtgacccga ataaccgcgc catgatgacg 1140
agtttcaata ccggcaccac ggcatataaa gtgattcaag cactggctcc gctgcgtaaa 1200
tccaacccgg caatcgccta cggcaccacc accgaacgtt gggtgaataa cgatgttctg 1260
attatcgaac gcaaatttgg tagttccgcg gccctggtcg ccattaatcg caactcatcg 1320
gcagcttatc cgatcagtgg tctgctgagc agcctgccag cgggcaccta ctccgatgtg 1380
ctgaatggcc tgctgaatgg taacagcatt accgtgggct ctggcggtgc ggttacgaac 1440
tttaccctgg cagcgggcgg caccgcagtt tggcagtata cggctccgga aaccagcccg 1500
gcgatcggta atgtcggtcc gacgatgggc caaccgggta acattgtgac gatcgatggt 1560
cgtggtttcg gcggtacggc tggcaccgtg tactttggta cgaccgcggt caccggcagt 1620
ggtattgtgt cctgggaaga tacgcagatt aaagcggtca tcccgaaagt ggcagctggc 1680
aaaaccggtg tcagcgtgaa aacgagttcc ggcaccgcca gtaatacgtt caaatccttt 1740
aacgttctga ccggtgatca ggttacggtc cgctttctgg tcaaccaagc gaataccaac 1800
tatggcacga atgtttacct ggtcggcaac gcggccgaac tgggttcctg ggacccgaat 1860
aaagccattg gtccgatgta taaccaggtt atcgcaaaat acccgagctg gtattacgat 1920
gtgagcgttc cggcgggcac caaactggac ttcaaattca ttaaaaaagg cggtggcacg 1980
gtgacctggg aaggtggcgg taaccatacc tacacgaccc cggcgagcgg cgttggcacg 2040
gtgacggtgg attggcaaaa t 2061
<210> 3
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn
20 25 30
Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu
35 40 45
Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly
50 55 60
Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val
65 70 75 80
Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser
85 90 95
Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe
100 105 110
Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His
115 120 125
Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala
130 135 140
Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Val Leu Tyr Asp Asn
145 150 155 160
Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Pro Phe His
165 170 175
His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys
180 185 190
Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp
195 200 205
Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp
210 215 220
Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys
225 230 235 240
Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe
245 250 255
Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys
260 265 270
Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln
275 280 285
Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu
290 295 300
Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn
305 310 315 320
Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala
325 330 335
Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr
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Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr
355 360 365
Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr
370 375 380
Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys
385 390 395 400
Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn
405 410 415
Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu
420 425 430
Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu
435 440 445
Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu
450 455 460
Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn
465 470 475 480
Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro
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515 520 525
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530 535 540
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565 570 575
Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe
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<210> 4
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
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Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu
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355 360 365
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Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu
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450 455 460
Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn
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Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro
485 490 495
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Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly
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Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Val Leu Tyr Asp Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
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85 90 95
Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe
100 105 110
Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His
115 120 125
Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala
130 135 140
Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Val Leu Tyr Asp Asn
145 150 155 160
Gly Ser Leu Leu Gly Gly Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Pro Phe His
165 170 175
His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys
180 185 190
Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp
195 200 205
Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp
210 215 220
Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys
225 230 235 240
Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe
245 250 255
Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys
260 265 270
Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln
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Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu
290 295 300
Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn
305 310 315 320
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Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn
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<210> 7
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
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1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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225 230 235 240
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245 250 255
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325 330 335
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340 345 350
Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr
355 360 365
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370 375 380
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Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn
405 410 415
Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu
420 425 430
Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu
435 440 445
Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu
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465 470 475 480
Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro
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Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcagaaaatg gtgttctgta t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
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gttatcatac agaacaccat t 21
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<212> DNA
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<400> 10
gacaccgctg gcccgttcca t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gttgtgatgg aacgggccag c 21
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
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<400> 12
tcactgctgg gttactactc gaat 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtcattcgag tagtaaccca gcag 24
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<211> 24
<212> DNA
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tcactgctgg gtgtttactc gaat 24
<210> 15
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<212> DNA
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<212> DNA
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tcactgctgg gtggttactc gaat 24
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<212> DNA
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gtcattcgag taaccaccca gcag 24
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<400> 18
tcactgctgg gtaaatactc gaat 24
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<212> DNA
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<400> 19
gtcattcgag tatttaccca gcag 24
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<211> 21
<212> DNA
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gcagaaaatg gttctctgta t 21
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<212> DNA
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gttatcatac agagaaccat t 21
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<212> DNA
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<400> 22
gcagaaaatg gtctgctgta t 21
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<400> 24
gacaccgctg gcatgttcca t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gttgtgatgg aacatgccag c 21
Claims (9)
1.一种生产长链糖基化染料木素的方法，其特征在于，所述方法为将含有麦芽糊精、染料木素和环糊精葡萄糖基转移酶的反应体系于pH为4～8、温度为30～60℃、转速为120～180rpm的条件下进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到长链糖基化染料木素；所述环糊精葡萄糖基转移酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的环糊精葡萄糖基转移酶。
2.如权利要求1所述的一种生产长链糖基化染料木素的方法，其特征在于，所述方法为将染料木素溶解于二甲基亚砜中配制成染料木素溶液；将麦芽糊精溶解于缓冲液A中配制成麦芽糊精溶液；将环糊精葡萄糖基转移酶溶解于缓冲液B中配制成酶液；将染料木素溶液、麦芽糊精溶液和酶液混合得到反应体系；将反应体系于pH为4～8、温度为30～60℃、转速为120～180rpm的条件下进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到长链糖基化染料木素。
3.如权利要求1或2所述的一种生产长链糖基化染料木素的方法，其特征在于，所述反应的pH为4或8、温度为45～50℃。
4.如权利要求3所述的一种生产长链糖基化染料木素的方法，其特征在于，所述缓冲液A为PBS缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸钠缓冲液。
5.如权利要求4所述的一种生产长链糖基化染料木素的方法，其特征在于，所述缓冲液B为PBS缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸钠缓冲液。
6.如权利要求5所述的一种生产长链糖基化染料木素的方法，其特征在于，所述染料木素溶液的浓度为5～15g/L。
7.如权利要求6所述的一种生产长链糖基化染料木素的方法，其特征在于，所述酶液的浓度为10～20U/L。
8.如权利要求7所述的一种生产长链糖基化染料木素的方法，其特征在于，所述染料木素溶液、麦芽糊精溶液和酶液的体积比为2～4:4～6:1～3。
9.权利要求1-8任一所述的方法在生产长链糖基化染料木素中的应用。
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