CN115820590A - 一种热稳定性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种热稳定性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体及应用，属于基因工程和酶工程技术领域，主要为提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，氨基酸突变位点为环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列SEQ ID NO.2的第211、255位氨基酸之一或两者以上；本发明提供的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的热稳定性相较于野生型明显提高，本发明对于环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义，并提高该酶在医药、食品、生物行业中的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体及应用。
背景技术
环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyl transfer,CGTase,EC2.4.1.19)属于α-淀粉酶家族(糖苷水解酶13_2,GH13_2)，是一种多功能酶，其能够以为淀粉、麦芽糊精等为底物来催化歧化、环化、偶合和水解反应。其中，歧化反应是发生在两个不同分子间的转糖苷反应，可以将直链低聚糖被切断的部分转移到另一受体上；环化反应是分子内发生的转糖苷反应，这是CGTase的特征反应，工业上多利用此反应来生产环糊精；偶合反应是环化反应的逆反应，可以打开环糊精的环，将糖苷转移到直链麦芽低聚物上。
目前对于CGTase的应用十分广泛，但是现有技术中，对于其热稳定性提高的相关研究却较少，热稳定性差的缺陷，极大的限制了CGTase的工业化应用范围。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种热稳定性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体及应用。
本发明所要解决的技术问题是通过对来源于Bacillus sp.G1的β-CGTase进行改造，以此来获得热稳定性提高的突变体。
本发明中所述来源于芽孢杆菌属(Bacillus sp.G1)的环糊精葡萄糖基转移酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明的技术方案如下：
一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，氨基酸突变位点为环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列SEQ ID NO.2的第211、255位氨基酸之一或两者以上。
根据本发明优选的，所述突变体为：
第211位的丝氨酸(S)甘氨酸(G)，命名为S211G；
第255位的组氨酸(H)突变为色氨酸(W)，命名为H255W。
上述突变体的编码基因，根据氨基酸的突变位点，在环糊精葡萄糖基转移酶的编码核苷酸序列SEQ ID NO.1上，进行定点突变获得。
一种重组表达载体，包含上述突变体的编码基因。
一种重组菌株，包含上述突变体的编码基因。
上述突变体的编码基因、重组表达载体或重组菌株在制备环糊精葡萄糖基转移酶中的应用。
上述突变体在制备偶合糖中的应用。
上述突变体在制备海藻糖中的应用。
有益效果
本发明提供的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的热稳定性相较于野生型明显提高，本发明对于环糊精葡萄糖基转移酶工业化生产具有一定意义，并提高该酶在医药、食品、生物行业中的应用前景。
附图说明
图1为单点突变基因电泳检测结果图；
图中：1、2、3、4、5、泳道分别代表S211G、I212R、H255W、H255F和H255Y位点突变PCR验证条带。
图2为野生型与突变体的最适温度图。
图3为野生型与突变体最适温度下的半衰期图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中使用的药品及试剂，若无特殊说明，则为已上市普通产品，实施例中未详加说明的内容，均按本领域现有技术。
下述实施例中涉及的培养基和检测方法如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，余量水。
TB培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，甘油4mL/L，余量水。
环糊精葡萄糖基转移酶催化歧化反应活力的测定方法：
以50mmol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液为溶剂，分别配制12mM的EPS(4，6-亚乙基-对硝基苯-α-D麦芽七糖苷)和20mM麦芽糖溶液，各取300μL的12mM EPS和20mM麦芽糖溶液分别置于45-65℃水浴锅中预热，加入100μL稀释后的酶液，精确反应10min后，加入50μL 3MHCl，5min后加入3M NaOH中和，然后加入100μLα-葡萄糖苷酶于37℃水浴锅静置反应60min以上，加入100μL 1M Na2CO3溶液将pH调节到8.0以上，最后于401nm测定吸光值。环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活力酶活定义为，每分钟转化1μmol EPS所需要的的酶量。
实施例1
野生型环糊精葡萄糖基转移酶的制备及表达
来源于Bacillus sp.G1的环糊精葡萄糖基转移酶(Cgt)的基因来源于人工合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并构建表达载体pET-28a(+)/Cgt，导入Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达，得到野生型环糊精葡萄糖基转移酶。于LB液体培养基中(含100mg/L卡那霉素)37℃，200rpm培养10h，制得种子液，按体积比5％接种量将种子液接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)，37℃，200rpm培养2h后加入终浓度0.2mM IPTG，调整温度为25℃，200rpm培养8h，将一定体积发酵液于4℃、12000rpm离心10min，取发酵上清，即为野生酶的粗酶液。
实施例2
环糊精葡萄糖基转移酶的单突变制备及表达
(1)根据Bacillus sp.G1环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，分别设计并合成引入单突变的引物，对环糊精葡萄糖基转移酶Cgt进行定点突变，分别测序确认环糊精葡萄糖基转移酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变环糊精葡萄糖基转移酶。
定点突变体编码基因的PCR扩增：利用快速PCR技术，以携带编码野生型环糊精葡萄糖基转移酶基因的表达载体pET-28a(+)/Cgt为模板。
引入S211G突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物：
5'-GAAGATGGAATTTATAGAAATCTGTATGATTTGGCAGACTACG-3'(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物：
5'-TATAAATTCCATCTTCATATGATGAAAAATCTGTGCCGCC-3'(下划线为突变碱基)；
引入I212R突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物：
5'-GATTCAAGGTATAGAAATCTGTATGATTTGGCAGACTA-3'(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物：
5'-TCTATACCTTGAATCTTCATATGATGAAAAATCTGTGCCGCC-3'(下划线为突变碱基)；
引入H255W突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物：
5'-GTTAAATGGATGTCAGAAGGCTGGC-3'(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物：
5'-CTGACATCCATTTAACTGCATCAACTCTAATGCC-3'(下划线为突变碱基)；
引入H255F突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物：
5'-GTTAAATTTATGTCAGAAGGCTGGCAAACATC-3'(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物：
5'-CTGACATAAATTTAACTGCATCAACTCTAATGCCATC-3'(下划线为突变碱基)；
引入H255Y突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物：
5'-TAAATACATGTCAGAAGGCTGGCAAACATC-3'(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物：
5'-CTGACATGTATTTAACTGCATCAACTCTAATGCC-3'(下划线为突变碱基)。
PCR反应体系均为：10μM正向引物和反向引物各2.5μL，2×Phanta Max MasterMix 25μL，模板2.5μL，加双蒸水补齐50μL。
PCR条件为：95℃预变性5min；随后进行25个循环(95℃15s，55℃15s，72℃3min50s)72℃延伸5min；最后4℃保存。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，突变基因PCR验证结果见图1。
将上述验证正确的PCR产物进行DpnⅠ消化，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板上，经37℃过夜培养，平板上挑取10个单菌落，转入含100mg/L卡那霉素的LB液体培养基，8h后提取质粒并验证，选取3个验证正确的质粒测序，将测序正确的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)得到表达单突变体的重组大肠杆菌。
(2)突变体的表达
将本实施例步骤(1)制备得到的表达单突变体的重组大肠杆菌，按照实施例1中野生酶的粗酶液制备方法，制备单突变体的粗酶液。
实施例3
环糊精葡萄糖基转移酶的半衰期分析
将实施例1和实施例2所得到的发酵上清粗酶液分别进行最适温度的相关实验，从图2可以判断突变体相对于野生型在最适温度上并没有明显的差别，都为55℃。在最适温度，即55℃下，测得野生型与突变型酶活没有明显差异，其中S211G、H255W在70℃条件下的相对酶活分别是野生型的1.41、1.34倍，可以证明该突变使酶热稳定性质得到提高。继而进行在最适温度即55℃下酶活半衰期的研究，即保持在55℃水浴条件下，分别于不同时间取样检测酶活，实验证明如图3所示野生型在最适温度下的半衰期为58min，而突变体S211G、H255W的半衰期分别为94min和86min，有着明显的延长，其余突变体半衰期相对于野生型并没有明显的变化。
本发明构建的突变体S211G、H255W其歧化酶活的热稳定性与野生酶相比有明显提高，尤其是S211G酶活半衰期明显延长，应用于工业化生产可延长反应时间，降低生产成本，并可利用其歧化反应活性，对于其在转糖苷化合物，如在生产海藻糖中的应用，在L-抗坏血酸、甜菊苷等物质改性上的应用，有效提高了其应用前景。
Claims (8)
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，氨基酸突变位点为环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列SEQ ID NO.2的第211、255位氨基酸之一或两者以上。
2.如权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体为：
第211位的丝氨酸(S)甘氨酸(G)，命名为S211G；
第255位的组氨酸(H)突变为色氨酸(W)，命名为H255W。
3.权利要求2或权利要求3所述突变体的编码基因，其特征在于，根据氨基酸的突变位点，在环糊精葡萄糖基转移酶的编码核苷酸序列SEQ ID NO.1上，进行定点突变获得。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求3所述突变体的编码基因。
5.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求3所述突变体的编码基因。
6.权利要求3所述突变体的编码基因、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5所述重组菌株在制备环糊精葡萄糖基转移酶中的应用。
7.权利要求1或权利要求2所述突变体在制备偶合糖中的应用。
8.权利要求1或权利要求2所述突变体在制备海藻糖中的应用。
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