CN115386587A - 一种长片段基因质粒转化及提取方法 - Google Patents
一种长片段基因质粒转化及提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115386587A CN115386587A CN202210814614.8A CN202210814614A CN115386587A CN 115386587 A CN115386587 A CN 115386587A CN 202210814614 A CN202210814614 A CN 202210814614A CN 115386587 A CN115386587 A CN 115386587A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- bacterial liquid
- long fragment
- minutes
- supernatant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 133
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 60
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 64
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 55
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 39
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 14
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101000922080 Homo sapiens Cubilin Proteins 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100031096 Cubilin Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物技术领域,公开了一种长片段基因质粒转化及提取方法,将长片段基因的质粒加入到EPI400感受态细胞中,加入无抗生素的肉汤培养基,摇菌,离心,弃上清,重悬菌液;涂布菌液于质粒相应抗性的平板上,孵箱生长,挑单克隆入与质粒相应抗性的LB培养基,加入CopyCutterInductionSolution,摇菌,保存;采用SDS碱裂解法裂解菌液,离心;加入溶液P1重悬菌液,再加入溶液P2,颠倒混匀,静置;加入溶液P3后,上清液离心后加入加入内毒素清除剂冰浴离心,吸取上清后异丙醇沉淀DNA;将上清液过硅胶膜柱子,洗涤,空柱离心,洗脱,静置,离心。本发明可以提高质粒拷贝数而至正常状态,同时不会影响基因DNA的完整性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域,尤其涉及一种长片段基因质粒转化及提取方法。
背景技术
目前,质粒是广泛存在于细菌、真菌等生物体,存在于染色体外可以携带遗传信息的的环状双链DNA分子。目前被改造为分子生物学最常用的工具,在生命科学领域中用于研究基因功能,开发新型治疗药物等。质粒载体含有3个结构:复制子,抗性基因,多克隆位点。通过选择多克隆位点内的限制性内切酶切断质粒的双链DNA,体外通过同源重组的方式引入外源性的基因,再将重组的质粒转化感受态细胞;摄取和容纳外来质粒DNA的感受态细胞生长于抗性琼脂糖平板上,过夜生长后平板中会出现许多菌落,挑选单个菌落到对应抗生素的肉汤培养基中,经过37℃摇床摇菌后,获得大量的菌液;最后通过经典的SDS碱裂解法裂解大肠杆菌细胞壁,释放宿主细胞的质粒,提取高纯度高质量的质粒,用于进行后续的酶切、转染等操作。
目前常用的感受态细胞是DH5α菌株,使用pUC19常见质粒DNA进行检测检测,发现其转化效率≥108cfu/μg,可满足于搭载小片段基因的质粒扩增。对于长片段常使用XL10菌株制备的化学转化超级感受态细胞,转化效率同样超过108cfu/μg。感受态细胞从起始复制子开始启动复制,生产大量的质粒,但对于超过10000bp的片段,因其远远超过载体的长度,复制难度极大。采用DH5α菌株和XL10菌株时,宿主细胞细胞为了维持载体的大量复制,在压力选择下会切割基因片段,使得片段无法完整转化,而影响质粒的完整性。因此降低载体的复制对于质粒DNA的完整复制非常重要。
转化感受态细胞后还需要提取宿主细胞产生的质粒,因此得到高浓度、高质量的质粒对于后续的功能基因的研究至关重要。经典的质粒提取方法采用SDS碱裂解法,主要由三种溶液组成:溶液P1(葡萄糖、Tris-Cl、EDTA、RNase),溶液P2(NaOH、SDS),溶液P3(醋酸钾、盐酸胍)。大肠杆菌在NaOH强碱性的条件下破坏细胞壁,配合SDS使蛋白质和染色体DNA变性,将质粒DNA释放到上清中,随后加入醋酸中和上清的pH值,并且钾离子置换SDS中的钠使蛋白质和染色体DNA发生沉淀。通过内毒素清除剂清除质粒DNA的内毒素,再加入异丙醇抽提质粒DNA,最后二氧化硅吸附柱特异性地吸附质粒DNA。尽管质粒DNA较小,短时间处于强碱的环境中不易被破坏,但需要在5分钟内加入醋酸中和以保护质粒DNA。长片段的质粒DNA在强碱环境中更易发生断裂,所以控制提取过程中的条件非常重要。
目前长片段(≥10000bp)基因质粒采用普通的DH5a,XL10等感受态细胞转化易导致片段丢失,且质粒提取后浓度较低,无法用于后续的细胞转染。
通过上述分析,现有技术存在的问题及缺陷为:
(1)现有技术中,由于常用的DH5a,XL10等感受态细胞转化易导致超过10000bp的片段丢失,压力选择下宿主细胞常会切割基因片段,使得片段无法完整转化,从而影响质粒的完整性。
(2)现有技术中,常规提取质粒步骤并未重视三种溶液的比例达到控制提取环境中的pH值的目的,否则导致质粒提取浓度较低,无法获得足量质粒用于后续细胞的转染。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种长片段基因质粒转化及提取方法。
本发明是根据感受态细胞的特异性降低质粒载体的复制,实现长片段基因的完整复制,并且在提取质粒过程中注意各试剂比例加入以控制pH值获得大量的质粒。通过EPI400感受态细胞和摇菌过程中添加诱导剂实现长片段基因片段的完整转化,并且在质粒提取过程中限定试剂的比例加入以控制pH值而发明一种长片段基因质粒转化及提取方法,所述长片段基因质粒转化及提取方法包括以下步骤:
步骤一,将长片段基因的质粒加入到EPI400感受态细胞中,冰上静置,热激,再次冰上静置,加入无抗生素的肉汤培养基,利用摇床摇菌;该步骤可以将质粒最大量的转化EPI400。
步骤二,将摇好的菌液置于离心机内,离心,弃上清,用移液器重悬菌液;用玻璃三角棒涂布菌液于质粒相应抗性的平板上,孵箱过夜生长;该步骤是让感受态细胞在适宜的条件下生长。
步骤三,第二天从孵箱中取出,挑一个单克隆入一个与质粒相应抗性的肉汤培养基,加入200X的CopyCutterInductionSolution,利用摇床摇菌;该步骤可以将EPI400转化的质粒恢复至正常产量。
步骤四,取出菌液并置于30%甘油中,冰箱保存,后续再次摇菌时需要划单线,挑单克隆入培养基摇菌;该步骤可以最大限度的保存且恢复菌种活力。
步骤五,提取质粒时采用SDS碱裂解法裂解菌液,将菌液重复离心收集在离心管中,离心加入溶液P1重悬菌液,再加入溶液P2,轻柔颠倒混匀,静置;加入溶液P3后,控制pH值在6.5,上清液离心后加入内毒素清除剂冰浴离心,吸取上清后异丙醇沉淀DNA;该步骤可以提取高质量的质粒
步骤六,将上清液过6层或8层硅胶膜柱子,用含有Tris-HCl的体积75%的无水乙醇洗涤;空柱离心,用无酶水洗脱,静置,离心,重复一次。该步骤利用硅胶膜柱子特异性吸附DNA的能力,达到纯化质粒的目的
进一步,所述步骤一中,取1μL长片段基因的质粒加入到100μL的EPI400感受态细胞中,冰上静置30分钟,42℃热激45秒,冰上静置2分钟。
进一步,所述步骤一中,加入900μL无抗生素的肉汤培养基,摇床温度设定为37℃,速度208rpm,摇菌1小时。
进一步,所述步骤二中,将摇好的菌液放在离心机内,速度5000rpm离心5分钟,弃950μL的上清,37℃孵箱生长15小时30分钟。
进一步,所述步骤三中,挑单克隆入20mL与质粒相应抗性的LB培养基,加入CopyCutter Induction Solution 100μL,37℃摇床208rpm摇菌15小时30分钟。
进一步,所述步骤四中,取500μL菌液加到500μL的30%甘油中,在-20℃冰箱内放置1天后,放入-80℃冰箱长期保存。
进一步,所述步骤四中,使用时,利用接种针沾取菌液,在质粒相应抗性的平板上划单线,37℃孵箱生长15小时30分钟,第二天挑单克隆菌摇菌。
进一步,所述步骤五中,提取质粒时,将20ml菌液分成2份,每管收集10ml菌液,采用重复离心的方式,12000rpm离心1分钟收集在2mL离心管中,去除上清液。
进一步,所述步骤五中,加入溶液P1250μL重悬菌液,再加入溶液P2250μL,轻柔颠倒混匀7次,静置4分钟,加入250μL溶液P3后,轻柔颠倒混匀7次,同时检测上清的pH值,上清液pH值应控制在6.5,12000rpm离心10分钟后吸取上清,加入0.1倍体积的内毒素清除剂,置于冰上孵育10分钟,期间颠倒混匀,再置于42℃金属浴孵育30秒,12000rpm离心10分钟,吸取上清,上清液加入0.5倍异丙醇沉淀DNA。
进一步,所述步骤六中,将所有上清液分别过1个6层或者8层的硅胶膜柱子,用含有Tris-HCl的体积75%的无水乙醇洗涤2次,12000rpm离心1分钟,弃去下层液体,空柱12000rpm离心2分钟,用35μLpH=7的无酶水洗脱,静置1分钟,12000rpm离心1分钟,再重复一次,收集下层离心的质粒,即为纯化后的质粒。
结合上述的技术方案和解决的技术问题,请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为:
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度,紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等,详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题,解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下:
本发明利用感受态细胞EPI400将质粒完整转化,能够保证长片段基因的完整性。本发明运用经典的碱裂解法提取质粒,且注意各试剂比例加入以控制pH值达到充分裂解提高质粒浓度的目的,可以确保质粒的完整性的同时提高质粒的产量。
本发明使用EPI400感受态细胞,其中删除了控制质粒拷贝数的pcnb基因,可以显著降低质粒的拷贝数,这样可以达到完整复制长片段DNA片段的目的;配合CopyCutter诱导液(200X)使用,可以提高质粒拷贝数而至正常状态,同时不会影响基因DNA的完整性。
本发明在提取质粒过程中把试剂P1-P2-P3的体积限定为250ul-250ul-250ul,同时测量局部环境的PH值,发现PH值为6.5,这一条件控制后可以充分裂解以提高质粒浓度。
第二,把技术方案看做一个整体或者从产品的角度,本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点,具体描述如下:本发明能完整转化长片段基因质粒及提取高浓度的质粒。
第三,作为本发明的权利要求的创造性辅助证据,还体现在以下几个重要方面:
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为:
本发明可以使长片段基因质粒完整转化,预期可以获得完整的长片段基因,有助于在分子层面研究功能基因的机制。在质粒提取过程中注意各试剂比例加入以控制pH值以及选用硅胶模柱子吸附质粒DNA可以得到高质量的DNA,提高质粒DNA提取效率。
(2)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题:
长片段基因质粒在转化过程中容易导致基因片段的丢失,因此本发明利用EPI400感受态细胞可以实现质粒的完整转化;长片段质粒提取过程难度大,传统的SDS碱裂解法的pH值不确定,导致pH值变化剧烈,那么控制提取环境的PH值可以提升质粒的提取效率,本发明可以使长片段基因质粒完整转化并且提取高浓度的质粒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍,显而易见地,下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的长片段基因质粒转化及提取方法流程图;
图2是本发明实施例提供的质粒图谱;
图3是本发明实施例提供的利用载体的通用引物双向测序结果示意图;
图4是本发明实施例提供的提取出的质粒经过1%凝胶电泳结果示意图;
图5是本发明实施例提供的经蛋白印记法得到的显影条带示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种长片段基因质粒转化及提取方法,下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现,该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
如图1所示,本发明实施例提供的长片段基因质粒转化及提取方法包括以下步骤:
S101,将长片段基因的质粒加入到EPI400感受态细胞中,冰上静置,热激,再次冰上静置,加入无抗生素的肉汤培养基,利用摇床摇菌;
S102,将摇好的菌液置于离心机内,离心,弃上清,用移液器重悬菌液;用玻璃三角棒涂布菌液于质粒相应抗性的平板上,孵箱生长;
S103,第二天从孵箱中取出,挑一个单克隆入一个与质粒相应抗性的LB培养基,加入200X的CopyCutter Induction Solution,利用摇床摇菌;
S104,取出菌液并置于30%甘油中,冰箱保存;提取质粒时采用SDS碱裂解法裂解菌液,将菌液重复离心收集在离心管中,离心;
S105,加入溶液P1重悬菌液,再加入溶液P2,轻柔颠倒混匀,静置;加入溶液P3后,控制pH值,上清液离心后加入内毒素清除剂,离心吸取上清再加入异丙醇沉淀DNA;
S106,将上清液过硅胶膜柱子,用含有Tris-HCl的体积75%的无水乙醇洗涤;空柱离心,用无酶水洗脱,静置,离心。
实施例1
本发明所要解决的技术问题是能完整转化长片段基因质粒及提取高浓度的质粒。
1.长片段基因的质粒取1μL加入到100μL的EPI400感受态细胞中,冰上静置30分钟,42℃热激45秒,冰上静置2分钟,加入900μL无抗生素的肉汤培养基,摇床温度设定为37℃,速度208rpm,摇菌1小时,然后将摇好的菌液放在离心机内,速度5000rpm离心5分钟,弃950μL的上清,用移液器重悬菌液,然后用玻璃三角棒涂布菌液于质粒相应抗性的平板上,37℃孵箱生长15小时30分钟。
2.第二天从孵箱中取出,挑一个单克隆入一个20mL与质粒相应抗性的LB培养基,加入CopyCutter Induction Solution(200X)100μL,37℃摇床208rpm摇菌15小时30分钟。时间到后取出菌液,取500μL菌液加到500μL的30%甘油中,在-20℃冰箱内放置1天,然后放入-80℃冰箱长期保存。下一次用时用接种针沾取一些菌液,在质粒相应抗性的平板上划单线,37℃孵箱生长15小时30分钟,第二天挑单克隆菌摇菌即可。
3.提取质粒时采用SDS碱裂解法裂解菌液,将20ml菌液分两管收集,重复离心收集在2mL离心管中,离心条件是12000rpm离心1分钟。加入溶液P1250μL重悬菌液,再加入溶液P2250μL,轻柔颠倒混匀7次,静置4分钟,加入250μL溶液P3后,pH值控制在6.5,上清液12000rpm离心10分钟后加入0.1倍体积的内毒素清除剂,置于冰上孵育10分钟,期间颠倒混匀,再置于42℃金属浴孵育30秒,12000rpm离心10分钟,吸取上清,再加入0.5倍异丙醇沉淀DNA,将上清液分别过1个6层或者8层的硅胶膜柱子,用含有Tris-HCl的体积75%的无水乙醇洗涤2次,最后空柱离心12000rpm2分钟,用35μL的pH=7的无酶水洗脱,静置1分钟,12000rpm离心1分钟,再重复一次。
实施例2
1.本发明将以质粒PCMV-CUBN作为实例说明,PCMV为质粒载体,搭载的长片段基因是CUBN(10869bp),质粒图谱见图2。
2.取1μL质粒PCMV-CUBN加入到100μL的EPI400感受态细胞中,冰上静置30分钟,42℃热激45秒,冰上静置2分钟,加入900μL无抗生素的肉汤培养基,摇床温度设定为37℃,速度208rpm,摇菌1小时,然后将摇好的菌液放在离心机内,速度5000rpm离心5分钟,弃950μL的上清,用移液器重悬菌液,然后用玻璃三角棒涂布菌液于质粒相应抗性的平板上,37℃孵箱生长15小时30分钟。
3.第二天从孵箱中取出,挑一个单克隆入一个20mL与质粒相应抗性的LB培养基,加入CopyCutter Induction Solution(200X)100μL,37℃摇床208rpm摇菌15小时30分钟。时间到后取出菌液,取500μL菌液加到500μL的30%甘油中,在-20℃冰箱内放置1天,然后放入-80℃冰箱长期保存。下一次用时用接种针沾取一些菌液,在质粒相应抗性的平板上划单线,37℃孵箱生长15小时30分钟,第二天挑单克隆菌摇菌即可。
4.提取质粒时采用SDS碱裂解法裂解菌液,将20ml菌液分成2份,每管收集10ml重复离心的菌液,离心条件是12000rpm离心1分钟。加入溶液P1 250μL重悬菌液,再加入溶液P2 250μL,轻柔颠倒混匀7次,静置4分钟,加入250μL溶液P3后,pH值控制在6.5,上清液12000rpm离心10分钟后加入0.1倍体积的内毒素清除剂,置于冰上孵育10分钟,期间颠倒混匀,再置于42℃金属浴孵育1分钟,12000rpm离心10分钟,吸取上清,再加入0.5倍异丙醇沉淀DNA,将所有上清液过1个6层或者8层的硅胶膜柱子,用含有Tris-HCl的体积75%的无水乙醇洗涤2次,最后空柱离心12000rpm2分钟,用35μL的pH=7的无酶水洗脱,静置1分钟,12000rpm离心1分钟,再重复一次。
二、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果,和现有技术相比的确具备很大的优势,下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
5.提取好的质粒送基因公司测序,利用载体的通用引物CMV-F和M13R双向测序,序列比对成功,见图3。
6.同时将提取的质粒经Nanodropone测浓度,浓度均超过1000ng/μL,且A260/A280的比值均为1.9,纯度好。
7.提取出来的质粒经过1%凝胶电泳,选用15000bp大小的分子标记物,分子标记物的上样量为20ng/2μL,样品取2μL上样电泳,从亮度可以判定其浓度超过1000ng/μL。
8.质粒转染HEK293T细胞,转染48小时后收取细胞蛋白,经过经典的蛋白印迹方法,用该基因的特殊蛋白抗体检测发现其大小为400Kda,判定细胞完整产生了其蛋白,证明其质粒的完整性。
提取出来的两个质粒上机测量浓度见表1,均超过1000ng/μL,且A260/A280的比值均为1.9,纯度评价可以。
表1质粒上机测量浓度
样品名称 | 核酸(ng/uL | A260/A280 | A260/A230 | A260 | A280 | 核酸系数 | 基线矫正 | 基线吸光度 |
样品1 | 1326.322 | 1.911 | 2.678 | 26.526 | 13.884 | 50 | 340 | -0.028 |
样品2 | 1664.89 | 1.929 | 2.701 | 33.298 | 17.264 | 50 | 340 | 0.113 |
图2是本方案涉及的质粒载体是pCMV,连接的长片段DNA为基因CUBN(10869bp),质粒DNA全长为14392bp。
图3是提取出来的质粒送基因公司测序,利用载体的通用引物CMV-F和M13R双向测序,序列比对成功。
图4是提取出来的质粒经过1%凝胶电泳,选用15000bp大小的marker,上样量为20ng/2μL,样品取2μL上样电泳。
图5是经蛋白印记法得到的显影条带,大小400Kda。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述长片段基因质粒转化及提取方法根据感受态细胞的特性降低载体的复制,实现长片段基因的完整复制,并且在提取质粒过程中注意各试剂的加入比例以达到控制pH值的方法,达到提高质粒浓度的目的;通过EPI400感受态细胞和摇菌过程中添加诱导剂实现长片段基因片段的完整转化。
2.如权利要求1所述的长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述长片段基因质粒转化及提取方法包括以下步骤:
步骤一,将长片段基因的质粒加入到EPI400感受态细胞中,冰上静置,热激,再次冰上静置,加入无抗生素的肉汤培养基,利用摇床摇菌;
步骤二,将摇好的菌液置于离心机内,离心,弃上清,用移液器重悬菌液;用玻璃三角棒涂布菌液于质粒相应抗性的平板上,孵箱生长;
步骤三,第二天从孵箱中取出,挑一个单克隆入一个与质粒相应抗性的LB培养基,加入200X的CopyCutter Induction Solution,利用摇床摇菌;
步骤四,取出菌液并置于30%甘油中,冰箱保存;提取质粒时采用SDS碱裂解法裂解菌液,将菌液重复离心收集在离心管中,离心;
步骤五,加入溶液P1重悬菌液,再加入溶液P2,轻柔颠倒混匀,静置;加入溶液P3后,控制pH值,上清液离心后加入异丙醇沉淀DNA;
步骤六,将上清液过硅胶膜柱子,用含有Tris-HCl的体积75%的无水乙醇洗涤;空柱离心,用无酶水洗脱,静置,离心。
3.如权利要求1所述长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述步骤一中,取1μL长片段基因的质粒加入到100μL的EPI400感受态细胞中,冰上静置30分钟,42℃热激3分钟,冰上静置2分钟;
所述步骤一中,加入900μL无抗生素的肉汤培养基,摇床温度设定为37℃,速度208rpm,摇菌1小时。
4.如权利要求1所述长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述步骤二中,将摇好的菌液放在离心机内,速度5000rpm离心5分钟,弃950μL的上清,37℃孵箱生长15小时30分钟。
5.如权利要求1所述长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述步骤三中,挑单克隆入20mL与质粒相应抗性的LB培养基,加入CopyCutter Induction Solution 100μL,37℃摇床208rpm摇菌15小时30分钟。
6.如权利要求1所述长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述步骤四中,取500μL菌液加到500μL的30%甘油中,在-20℃冰箱内放置1天后,放入-80℃冰箱长期保存。
7.如权利要求1所述长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述步骤四中,使用时,利用接种针沾取菌液,在质粒相应抗性的平板上划单线,37℃孵箱生长15小时30分钟,第二天挑单克隆菌摇菌。
8.如权利要求1所述长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述步骤四中,提取质粒时,将20ml菌液分成2份,每管收集10ml菌液,重复离心收集在1.5mL离心管中,12000rpm离心1分钟。
9.如权利要求1所述长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述步骤五中,加入溶液P1250μL重悬菌液,再加入溶液P2250μL,轻柔颠倒混匀7次,静置4分钟,加入250μL溶液P3后,pH值控制在6.5,12000rpm离心10分钟后上清液加入0.1倍体积的内毒素清除剂,置于冰上孵育10分钟,期间颠倒混匀,再置于42℃金属浴孵育30秒,12000rpm离心10分钟,吸取上清,再加入0.5倍异丙醇沉淀DNA。
10.如权利要求1所述长片段基因质粒转化及提取方法,其特征在于,所述步骤六中,将所有上清液分别过1个6层或者8层的硅胶膜柱子,用含有Tris-HCl的体积75%的无水乙醇洗涤2次后,空柱12000rpm离心2分钟,用35μL pH=7的无酶水洗脱,静置1分钟,12000rpm离心1分钟,再重复一次。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210814614.8A CN115386587A (zh) | 2022-07-12 | 2022-07-12 | 一种长片段基因质粒转化及提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210814614.8A CN115386587A (zh) | 2022-07-12 | 2022-07-12 | 一种长片段基因质粒转化及提取方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115386587A true CN115386587A (zh) | 2022-11-25 |
Family
ID=84116716
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210814614.8A Pending CN115386587A (zh) | 2022-07-12 | 2022-07-12 | 一种长片段基因质粒转化及提取方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115386587A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101353649A (zh) * | 2008-09-22 | 2009-01-28 | 中国科学院微生物研究所 | 一种酯酶及其编码基因与应用 |
CN102465118A (zh) * | 2010-11-10 | 2012-05-23 | 中国科学院微生物研究所 | 一种碱性酯酶及其编码基因与应用 |
CN104561059A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-04-29 | 山东大学 | 一种海洋适冷酯酶及其编码基因e40与应用 |
CN113373171A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-09-10 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) | 一种在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒及其构建方法 |
-
2022
- 2022-07-12 CN CN202210814614.8A patent/CN115386587A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101353649A (zh) * | 2008-09-22 | 2009-01-28 | 中国科学院微生物研究所 | 一种酯酶及其编码基因与应用 |
CN102465118A (zh) * | 2010-11-10 | 2012-05-23 | 中国科学院微生物研究所 | 一种碱性酯酶及其编码基因与应用 |
CN104561059A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-04-29 | 山东大学 | 一种海洋适冷酯酶及其编码基因e40与应用 |
CN113373171A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-09-10 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) | 一种在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒及其构建方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
EPICENTRE: "MA219E CopyCutter™ EPI400™ Cells and Induction Solution", pages 1 - 6, Retrieved from the Internet <URL:www.lucigen.com> * |
LESLIE A. MITCHELL, 等: "Synthesis, debugging, and effects of synthetic chromosome consolidation: synVI and beyond", SCIENCE, vol. 355, pages 174 - 176 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sawers et al. | Expression and operon structure of the sel genes of Escherichia coli and identification of a third selenium-containing formate dehydrogenase isoenzyme | |
Meyer et al. | Physical and genetic studies with restriction endonucleases on the broad host-range plasmid RK2 | |
US4387162A (en) | Hybrid plasmids and microorganisms containing them | |
CN111621458B (zh) | Bvg90_11450基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌 | |
Ma et al. | Analysis of the promoter and regulatory sequences of an oxygen-regulated bch operon in Rhodobacter capsulatus by site-directed mutagenesis | |
Kámán-Tóth et al. | A simplified and efficient Agrobacterium tumefaciens electroporation method | |
JPS5879997A (ja) | ストレプトマイセス属およびその類縁菌に使用するプラスミドpEL7および関連クロ−ニング・ベクタ− | |
US4806480A (en) | Novel E. coli hybrid plasmid vector conferring sucrose fermenting capacity | |
US4532211A (en) | Coliform bacillus having a gene for the production of staphylokinase and a process for production of staphylokinase therewith | |
CN115386587A (zh) | 一种长片段基因质粒转化及提取方法 | |
CN116286931B (zh) | 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用 | |
CN109321618B (zh) | 一种通过糖多孢红霉菌sace_5717基因提高红霉素产量的方法 | |
Schweizer et al. | Cloning and nucleotide sequence of the glpD gene encoding sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase of Pseudomonas aeruginosa | |
Weaver et al. | Complementation of a Rhodopseudomonas sphaeroides ribulose bisphosphate carboxylase-oxygenase regulatory mutant from a genomic library | |
CN115806922A (zh) | 运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用 | |
EP0307171A1 (en) | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode insopenicillin n synthetase from aspergillus nidulans | |
US6218145B1 (en) | Bacterial expression systems based on plastic or mitochondrial promoter combinations | |
CN113583931A (zh) | 魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用 | |
CN111718884A (zh) | Bvg90_08615基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌 | |
CN113621608B (zh) | 一种提取细菌质粒dna的菌体裂解液、试剂盒及方法 | |
CN114774421B (zh) | 运动发酵单胞菌内源性启动子突变体 | |
CN114806992B (zh) | 一种rsh过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法 | |
CN117867000A (zh) | 一种高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株及其制备和应用 | |
CN116463342A (zh) | 康乃馨DcU6启动子在CRISPR/Cas9基因编辑系统中的应用以及基因编辑方法 | |
KR920007682B1 (ko) | 선별시스템을 갖는 플라스미드와 그의 제조방법 및 선별방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |