CN102465118A

CN102465118A - 一种碱性酯酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102465118A
Application number: CN2010105439159A
Authority: CN
Inventors: 张立新; 傅成章; 谢峰; 郭徽; 代焕琴
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-11-10
Also published as: CN102465118B

Abstract

本发明公开了一种酯酶及其编码基因与应用。本发明公开的酯酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)其氨基酸序列为序列表中的序列2；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能催化水解羧酸酯的由(a)衍生的蛋白质。本发明还公开了编码该酯酶的基因。本发明的酯酶适用于化工、食品、生物转化、医药工业和其它相关工业。

Description

一种碱性酯酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种碱性酯酶及其编码基因与应用。

背景技术

自然界中存在的能够降解酯类的酶包括脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3)，酯酶(esterase)或羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3.1.1.1)，以及各种磷脂酶(phospholipase)，它们广泛存在于微生物、植物种子和动物组织中(Jaeger KE，et al.Annu.Rev.Microbiol.1999，53：315-351)。脂肪酶可以定义为一类能够催化具有较长酰基链(C原子数目＞10)的甘油酯类化合物降解和合成的酶，脂肪酶的标准底物是甘油三油酸酯。相反，酯酶则是一类催化具有较短酰基链(C原子数目＜10)的甘油酯类化合物的降解和合成(Jaeger KE，et al.FEMS Microbiol.Rev.1994，15：29-63)。原核生物来源的酯酶具有一个高度保守五肽序列Gly-X-Ser-X-Gly，其中的丝氨酸和一个天冬氨酸或谷氨酸残基通过氢键与一个组氨酸相连以形成催化三联体。基于氨基酸序列以及生物活性的比较，原核来源的酯酶可以分为8个不同家族(Jaeger KE，et al.Biochem.J.(1999)343，177-183)。

酯酶作为重要的工业用酶，主要应用于有机合成、酯交换、立体异构体的转化和拆分等催化反应。酯酶的催化反应具有不需要辅酶、稳定性好、反应条件温和、方法简便、催化活性高、选择性强、产物易于分离和易于回收等优点，因此被广泛应用于食品加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学、药物、农药、化妆品和香料的生产等(Jaeger KE，et al.Trends in Biotechnology，1998，16(9)：396-403；中国专利，CN101225369，2008年7月23日；Haki GD，et al.Bioresour.Technol.2003，89：17-34，JaegerKE，Curr.Opin.Biotechnol.2002，13：390-397)。

现有微生物酯酶大多是从可培养的微生物中分离所得(Jürgen Pleiss et al.Journalof Molecular Catalysis B：Enzymatic.2000，10(5)：491-508)。国内外许多专利和文献中已经报道了从不同微生物中分离的酯酶蛋白及编码基因(Jaeger KE，et al.FEMSMicrobiol.Rev.1994，15：29-63；Arpigny JL，Jaeger KE.Biochem J.1999，343：177-183)。我国学者孙谧等报道了来源于海洋微生物Bacillus sp.MP-2的酯酶(CN101225369，2008年7月23日)；Zhangjian等报道了从Thermoanaerobacter tengcongensis中分离得到的一种耐热酯酶基因(Jian Zhang et al.Biotechnology Letters.2003，25：1463-1467.)；Yuji Hotta等从嗜热古菌Pyrobaculum calidifontis分离得到一种耐热酯酶(Yuji Hotta，etal.Appl Environ Microbiol.2002，68：3925-3931)；Alessandra Morana报道了一种从嗜热菌Sulflobus solfataricus中得到的酯酶基因(Alessandra Morana，Gene.2002，283：107-115)；Young等报道了Lactobacillus casei CL96的酯酶基因(Young J.Choi et al.Appl Environ Microbiol.2004，70(6)：3213-3221)；Satoshi Kakugawa等报道了Thermotoga maritima的酯酶基因(Satoshi Kakugawa et al.Appl Microbiol Biotechnol.2007，74：585-591)。

然而有研究表明，目前环境中可培养微生物仅占其总量的不到1％，超过99％的微生物尚未得到分离培养(Manuel Ferrer et al.Current Opinion in Biotechnology.2005，16(6)：588-593)，因此有巨大量的微生物基因资源被我们所遗漏。为了能够利用这一我们以前从未触及的巨大基因资源库，宏基因组学(Metagenomics)技术应运而生。宏基因组学是指不依赖于微生物的纯培养，而直接从环境或共生体中分离出其中所存在的所有基因组DNA，然后将合适大小的DNA片段连接到载体上体，再导入宿主以构建宏基因组文库，之后再基于所构建的宏基因组文库进行筛选，以期待获得新颖的酶基因或新颖的活性天然产物(Jo Handelsman et al.Current Opinion in Biotechnology.2003，14：303-310；Manuel Ferrer et al.Current Opinion in Biotechnology.2005，16(6)：588-593)。

从宏基因组文库中筛选酯酶，目前有两种方法：一、基于活性的筛选；二、基于序列的筛选。目前已有利用宏基因组学技术从土壤、淡水和海洋等环境中克隆新的酯酶基因的报道(Lee SW et al.Appl Microiol Biotechnol.2004，65：720-726；Jin-Kyu Rheeet al.Appl Environ Microbiol.2005，71：817-825；Ravi Ranjan et al.Biochemical andBiophysical Research Communications.2005，335：57-65；F Hardeman et al.FEMSMicrobiology Ecology.2007，59：524-534)。海洋环境，尤其是深海由于其独特且多样的生态环境赋予了海洋微生物与其环境相适应的独特代谢途径和基因表达产物，因此，海洋微生物逐渐成为人们获取新基因资源的天然宝库。我国幅员辽阔，拥有广阔的海域，从中获得新的微生物天然资源已经逐渐引起了人们的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性酯酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的碱性酯酶，命名为LipNR，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)其氨基酸序列为序列表中的序列2；

(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能催化水解羧酸酯的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列2由401个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的LipNR便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的LipNR可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的LipNR的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码LipNR的基因也属于本发明的保护范围。

编码LipNR的基因具体可为如下(a)或(b)或(c)的基因：

(a)其核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

(b)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码能催化水解羧酸酯的蛋白的DNA分子；

(c)与(a)的基因具有90％以上的同源性，且编码能催化羧酸酯水解的蛋白的DNA分子。

所述步骤(c)中的基因，与(a)的基因最好有95％以上的同源性。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt’s液，100ug/ml鲑鱼精DNA的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由1203个碱基组成，自序列1的5′末端第1-1203位核苷酸为编码序列，编码具有序列表中序列2所示的蛋白质，自5′末端第1-3位为起始密码子。

扩增上述LipNR基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述LipNR基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明的LipNR基因来源于深海环境，并证实其在较低的温度条件下具有良好活性和稳定性，适用于化工、食品、生物转化、医药工业和其它相关工业。

附图说明

图1为重组质粒pFOS::LipNR的构建示意图。

图2为重组质粒pUC18::LipNR的构建示意图。

图3为重组质粒pET28b::LipNR的构建示意图。

图4为重组蛋白LipNR的酯催化底物选择性结果。

具体实施方式

实施例1：深海沉积物宏基因组DNA的提取

深海沉积物取自中国南海，水深778.5米，经度110°22.47′E，纬度17°33.35′N。称取5g沉积物样品，加入13.5ml DNA提取液(100mmol Tris-HCl，100mmol EDTA，100mmol磷酸钠，1.5mol NaCl，1g/100ml CTAB，pH8.0)，再加入100μl蛋白酶K(10mg/ml)，225rpm水平摇床37℃振荡30分钟，然后加入1.5ml 20g/100ml的SDS，65℃水浴2小时，每隔15-20分钟轻柔颠倒几次，室温6000×g离心10分钟；收集上清，转移至50ml离心管，沉淀中加入4.5ml DNA提取液和0.5ml 20g/100ml SDS，65℃水浴10分钟，6000×g离心10分钟，收集上清与上次上清合并；重复上述操作，收集上清与前两次上清合并；上清与等体积的氯仿-异戊醇混合液(氯仿与异戊醇体积比24∶1)混合，离心，吸取水相转移至另一50ml离心管，以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀1小时，16000×g离心20分钟，收集沉淀，用冷70％(体积百分浓度)乙醇溶液洗涤沉淀，沉淀晾干后重悬于灭菌去离子水，脉冲场琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA片段。

实施例2：深海沉积物宏基因组文库的构建与筛选

将上述粗提DNA进行脉冲场琼脂糖凝胶电泳，电洗脱纯化回收36-48kb大片段DNA，用CopyControl^TM Fosmid Library Production Kits的End-Repair Enzyme Mix进行末端补平。然后以0.5×TE缓冲液(Tris-HCl/EDTA，pH8.0)进行点透析2小时，换30g/100ml PEG8000浓缩DNA。紫外分光光度计测定DNA浓度，按插入片段分子数：pCC2FOS载体(美国EPICENTRE公司)分子数为1∶10的比例以Fast-Link DNA连接酶室温2小时进行连接，再次以0.5×TE缓冲液(Tris-HCl/EDTA，pH8.0)进行点透析2小时，换30g/100ml PEG8000浓缩DNA，取10μl连接后的DNA加入到25μl冰上融化的MaxPlax Lambda Packaging Extracts，30℃，90分钟温育后加入另外25μl MaxPlaxLambda Packaging Extracts，30℃，90分钟温育，加入PDB缓冲液(10mM Tris-HCl[pH8.3]，100mM NaCl和10mM MgCl₂)至终体积1ml。取大肠杆菌EPI300-T1^R单菌落(美国EPICENTRE公司)接入LB液体培养基220rpm，37℃过夜培养进行活化。5ml过夜培养物加入到50ml新鲜LB培养基(含10mM MgSO₄)，37℃，220rpm振荡至OD₆₀₀＝0.8-1.0。取50μl包装后混合物加入950μl上述培养的大肠杆菌，37℃，20分钟温育，取部分菌液涂布于含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基，37℃过夜培养计算文库克隆数；剩余菌液加入终浓度20ml/100ml的甘油，储存于-80℃。

取部分文库涂于添加终质量百分浓度为1％的三丁酸甘油酯、终质量百分浓度为1％阿拉伯胶和终浓度为12.5μg/ml氯霉素的LB固体培养基，30℃培养24-48小时，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆，结果获得一个阳性克隆，将此阳性克隆命名为EPI300LipNR。将EPI300LipNR划线分离单菌落接入含12.5μg/ml氯霉素的5ml液体LB培养基，并加入5μl的1000×CopyControl Autoinduction Solution，37℃，200rpm培养17小时后，使用OMEGA公司的小量质粒提取试剂盒提取质粒，此质粒命名为pFOS::LipNR，图1为pFOS::LipNR的构建示意图，酶切分析证明pFOS::LipNR含有的插入片段，大小约为36kb。

将pFOS::LipNR以Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收2-3kb DNA片段。取2μl回收的DNA片段加入0.5μl BamHI酶切后去磷酸化处理的质粒pUC18(北京Tiangen公司)，以T4 DNA连接酶于16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5a(北京Tiangen公司)感受态细胞，涂于添加了终浓度100μg/ml氨苄青霉素、终质量百分浓度1％三丁酸甘油酯和终质量百分浓度1％阿拉伯胶的LB固体培养基，37℃培养16小时，菌落周围有明显水解圈的即为阳性克隆。提取阳性克隆质粒，命名为pUC18::LipNR，图2为pUC18::LipNR的构建示意图，酶切鉴定，重组质粒pUC18::LipNR含有的外源DNA片段，大小约为2.0kb，含pUC18::LipNR的大肠杆菌命名为大肠杆菌DH5αLipNR。

将重组质粒pUC18::LipNR在华大基因进行测序，测序得到插入片段总长度1.9kb，含有一个1203碱基的开放阅读框，经分析该开放阅读框的核苷酸序列含有1203碱基的推定LipNR编码基因，LipNR基因如序列1所示，其编码序列表中序列2的蛋白质。序列比对表明此蛋白为脂肪酶/酯酶超家族的蛋白，与已有数据库中Dethiosulfovibrio peptidovorans DSM 11002的酯酶具有最高相似性25％。

实施例3：LipNR基因的获得

人工合成一对引物LipNR-f(5’-GTCCATATGAAAACCGGCCG-3’)和LipNR-r(5’-CCCAAGCTTATCAAGATTTTCG-3’)，以pUC18::LipNR为模板按以下条件进行PCR扩增获得大小约为1.2kb的两端含有限制性内切酶NdeI和HindIII酶切位点的产物：25μl体系(含有2.5μl TAKARA 10×PCR buffer，0.2mM dNTP，1.5U TAKARA rTaq，0.4μM LipNR-f，0.4μM LipNR-r，1μl模板)下95℃预变性4分钟，接着25轮循环的95℃变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，最后额外延伸10分钟。将PCR产物测序表明，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

将PCR产物进行NdeI和HindIII双酶切后，与经过同样酶切的质粒pET28b(+)(NOVAGEN)在T4DNA连接酶作用下16℃连接半小时，获得重组质粒pET28b::LipNR，图3为重组质粒pET28b::LipNR的构建示意图。重组质粒pET28b::LipNR转化感受态大肠杆菌BL21(NOVAGEN)，涂于添加终浓度为50μg/L的卡那霉素、终质量百分浓度1％的三丁酸甘油酯、终质量百分浓度1％的阿拉伯胶的LB培养基上，37℃培养16小时，根据透明圈获得阳性克隆，将阳性克隆进行鉴定，将鉴定正确的阳性克隆命名为BL21LipNR。将载体pET28b(+)转化感受态大肠杆菌BL21，得到的重组菌BL21-28b，作为对照。

同时，人工合成序列表中序列1的核苷酸，并在其两端加入限制性内切酶NdeI和HindIII酶切位点，按照上述方法将合成片段用插入经过同样酶切的质粒pET28b(+)中，获得重组载体，将重组载体进行测序验证，将验证正确的载体命名为pET28b::LipNR-1，将pET28b::LipNR-1转化感受态大肠杆菌BL21获得的鉴定正确的重组BL21菌命名为BL21LipNR-1。

将重组菌BL21LipNR-1、BL21LipNR和BL21-28b单菌落分别接种于添加终浓度为50μg/L的卡那霉素、终质量百分浓度1％的三丁酸甘油酯、终质量百分浓度1％的阿拉伯胶的LB培养基上，37℃培养16小时。结果表明，重组菌BL21LipNR-1和BL21LipNR接种处均产生了透明圈，而BL21-28b没有产生透明圈。说明重组菌BL21LipNR-1、BL21LipNR所含的质粒中具有可表达酯酶的基因，该基因为具有序列1中所示的核苷酸序列的LipNR基因。

重组菌BL21LipNR-1、BL21LipNR和BL21-28b单菌落分别接种于含50μg/L卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养16小时后，按体积百分比为1％接种量转接新鲜含50μg/ml卡那霉素的50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，37℃振荡培养4小时。

培养4小时后，将培养物在12,000转/分钟下离心15分钟。倾去上清，获得菌体沉淀。将菌体沉淀用磷酸缓冲液溶液洗涤两次，并溶于裂解缓冲液中(NaCl 500mM，咪唑20mM，Na₂HPO₄ 20mM，pH 7.4)，用超声破碎仪进行细胞破碎，12,000转/分钟离心30分钟收集上清。取预装1ml镍离子亲和层析柱填料的HistrapFF柱(美国GE公司)，先用10个柱体积的结合缓冲液(NaCl 500mM，咪唑20mM，Na₂HPO₄20mM，pH 7.4)平衡柱子，流速控制为1ml/min。将超声破碎产物离心所得上清与5X结合缓冲液以体积比4∶1混匀，调节pH为7.4。用0.45μm无菌滤头过滤后上柱，流速为1ml/min。用结合缓冲液冲洗柱子，直至洗下的溶液的蛋白特异吸收值达到稳定的基线水平。用含500mM咪唑的洗脱缓冲液(NaCl 500mM，咪唑500mM，Na₂HPO₄20mM，pH 7.4)冲洗柱子，收集洗脱液，获得纯化的LipNR蛋白溶液，将纯化的LipNR蛋白经SDS-PAGE检测。

SDS-PAGE检测结果表明，重组菌BL21LipNR-1、BL21LipNR表达的蛋白均为单一条带，分子量约为45,420道尔顿。而相应的携带pET28b(+)空质粒的BL21-28b在SDS-PAGE胶的同样位置没有这条重组表达的蛋白条带。

实施例4：重组菌BL21LipNR-1、BL21LipNR的酯水解活性

向LB培养基中添加终质量百分浓度1％的三丁酸甘油酯，终质量百分浓度1％的阿拉伯胶(用作乳化三丁酸甘油酯)，高压灭菌后，加入终浓度为50μg/ml卡那霉素，铺制平板。平板冷却后涂布8μl 500mM IPTG，待吸干后分别点种重组菌重组菌BL21LipNR-1、BL21LipNR和BL21-28b，30℃培养36小时。

配置添加1％p-nitrophenyl butyrate或p-nitrophenyl caprate，0.1％酚红，pH7.2-7.3的50mM Tris-HCl溶液。分装1ml该溶液至1.5ml EP管，分别加入重组LipNR蛋白和BL21-28b菌体裂解物，37℃反应30min。

观察结果如图4所示，表明重组菌重组菌BL21LipNR、BL21LipNR-1在三丁酸甘油酯琼脂平板上均形成明显的透明圈(图中A所示为BL21LipNR-1)，对照(重组菌BL21-28b)无透明圈(图中B所示)；而加入重组LipNR蛋白的含p-nitrophenylbutyrate(图中D所示)或p-nitrophenyl caprate(图中E所示)颜色均可由红变黄，说明这两种底物都可以被重组LipNR蛋白水解，产生了自由酸，使得pH降低，导致溶液颜色变黄，而加入BL21-28b菌体裂解物的含p-nitrophenyl butyrate溶液孵育后颜色未发现显著变化(图中C所示)。这证明了LipNR基因表达的重组蛋白具有酯水解活性，且对含长短碳链的酯均有一定活性。

Claims

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)其氨基酸序列为序列表中的序列2；

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述编码基因为如下(a)或(b)或(c)的基因：

(a)其核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

(c)与(a)的基因具有90％以上的同源性，且编码能催化水解羧酸酯的蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。

6.扩增权利要求2或3所述基因全长或任一片段的引物对。

7.权利要求1所述的蛋白在催化水解羧酸酯中的应用。

8.权利要求2或3所述基因在制备催化水解羧酸酯的酯酶中的应用。