CN109943544A - 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法 - Google Patents

一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109943544A
CN109943544A CN201910261137.5A CN201910261137A CN109943544A CN 109943544 A CN109943544 A CN 109943544A CN 201910261137 A CN201910261137 A CN 201910261137A CN 109943544 A CN109943544 A CN 109943544A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme activity
glu
culture medium
bacterial strain
fecl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910261137.5A
Other languages
English (en)
Inventor
唐蕾
朱竹兵
孙亚武
沈微
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201910261137.5A priority Critical patent/CN109943544A/zh
Publication of CN109943544A publication Critical patent/CN109943544A/zh
Priority to PCT/CN2019/120475 priority patent/WO2020199612A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法，属于生物工程技术领域。本发明先将染料脱色过氧化物酶在大肠杆菌中进行异源表达，获得重组菌株，进行发酵，通过在发酵培养基中添加外源物质Glu和/或FeCl2，提高了重组DyP中血红素饱和度，当向培养基中添加100μmol/L的Glu+FeCl2时，可将比酶活提高为对照的1.37倍；当向培养基中添加80μmol/L的FeCl2时，可将酶活提高为对照的1.45倍。该方法简单易操作，添加的外源物质如Glu、FeCl2价格便宜，经济实用。

Description

一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法
技术领域
本发明涉及一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
染料脱色过氧化物酶(DyP)是过氧化物酶家族的新成员，以血红素为辅基，利用过氧化氢作为电子受体催化各种有机物，可以蒽醌染料及木质素模型化合物等为底物，具有潜在的应用价值，可以实现生物法对染料污水的彻底降解，从而避免化学、物理等方法降解的二次污染问题。
目前DyP主要来源于微生物，但是从原始菌中获取DyP，不仅含量低，而且不易与胞内其他蛋白相分离，所以常通过构建基因工程菌的方法生产DyP，如在大肠杆菌中异源表达DyP，但重组蛋白的含量偏低，一般在10mg/L以下。最近有研究发现，DyP与修饰蛋白融合表达，重组蛋白量可增至约200mg/L，然而高度过表达的融合DyP几乎没有活性。通过紫外-可见吸收光谱法和高分辨率质谱法对酶的分析表明，大部分高度过表达的酶只包含有铁缺乏的血红素前体原卟啉IX(PPIX)而不是血红素。在大肠杆菌中血红素合成始于谷氨酸(Glu)，经由关键前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)，和多步生化反应生成原卟啉IX(PPIX)，PPIX螯合铁后形成血红素。改造血红素合成基因提高血红素含量是提高DyP产量的一种方式，但因途径中涉及多个基因且存在反馈控制，提升幅度有限。
在培养基中添加5-ALA是提高DyP产量的另一种方式，但成本较高，不适于大规模推广应用。
因此，提供一种经济、简单、有效的提高DyP产量的方法，对于染料脱色过氧化物酶的进一步应用有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法，其特征在于，在大肠杆菌中异源表达染料脱色过氧化物酶，获得重组菌株，应用所述重组菌株进行发酵，在发酵培养基中添加Glu和/或Fe2+。
在本发明的一种实施方式中，添加的Glu和/或Fe2+的终浓度为40-100μmol/L。
在本发明的一种实施方式中，添加的Glu和/或Fe2+的终浓度为60-100μmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述染料脱色过氧化物酶的NCBI accessionnumber为Q47KB1。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株以大肠杆菌BL21为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株以pET系列载体为载体。
在本发明的一种实施方式中，发酵条件为：种子培养后，以1-5％(v/v)的接种量转接至LB培养基中，200-220r/min、35-38℃培养至菌体OD600达到0.6～0.8，向培养基中添加终浓度为0.1-0.5mmol/L IPTG，28-30℃诱导培养12-20h。
在本发明的一种实施方式中，种子培养是将重组菌株接种到LB培养基中，200-220r/min、35-38℃培养10-15h。
在本发明的一种实施方式中，LB培养基的配方如下:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
本发明的另一个目的是提供上述方法在生物、纺织或化工领域内的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法，先将染料脱色过氧化物酶在大肠杆菌中进行异源表达，获得重组菌株，进行发酵，通过在发酵培养基中添加外源物质Glu和/或Fe2+，提高了重组DyP中血红素饱和度，当向培养基中添加100μmol/L的Glu+FeCl2时，可将比酶活提高为对照的1.37倍；当向培养基中添加80μmol/L的FeCl2时，可将酶活提高为对照的1.45倍。该方法简单易操作，添加的外源物质如Glu，FeCl2价格便宜，经济实用。
附图说明
图1：添加剂对酶活与血红素饱和度的影响。
图2：金属离子和氨基酸对重组DyP酶活性的影响。
图3：FeCl2浓度对重组DyP酶活性的影响。
具体实施方式
(一)酶活的定义及检测方法
向反应体系中依次加入100mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH 4.5)，100μmol/L活性蓝19和适量的酶液，最后加入终浓度为0.1mM过氧化氢启动反应，酶促反应10min，然后通过加入200μL 2％SDS终止反应。在室温下，于波长595nm处检测吸光值变化。蛋白质浓度测定采用BCA法，以牛血清蛋白为标准蛋白。
DyP酶活定义：在25℃，pH 4.5条件下，每分钟氧化1μmol活性蓝19所需的酶量为1U。
比酶活(U/mg)＝酶活(U/mL)×[蛋白浓度(mg/mL)]-1。
实施例1
利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库获得DyP(accession number：Q47KB1)全长蛋白序列，合成编码该蛋白的目的基因，以已购的质粒pET-28a(+)为载体，将含有目的基因的质粒转化到E.coli BL21进行异源表达，获得一株重组菌。
将重组菌株接种到含有卡那霉素的LB培养基中，200r/min、37℃培养12h，以4％(v/v)接种量转接至含有100mL新鲜的LB培养基的500mL摇瓶中，相同条件培养至菌体OD600达到0.6～0.8时。向培养基中添加终浓度为0.3mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃苷(Isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)，30℃诱导培养14h，8000rpm离心20min得到菌体，用50mmol/L的pH 7.4磷酸钾缓冲溶液重新悬浮细胞，超声破碎30min，10000rpm离心30min收集上清液，过0.22μm水系滤膜得到粗酶液，通过1mL His TrapTM HP亲和镍柱分离纯化，收集目的蛋白，进行SDS-PAGE电泳以鉴定重组DyP纯度。
实施例2外源添加物对血红素饱和度的影响
分别将100μmol/L的Glu、FeCl2、CoCl2、MnCl2、Glu+FeCl2加入培养基中，添加的IPTG终浓度为0.3mmol/L，在30℃下诱导培养14h，收集菌体离心、悬浮、破碎、离心，收集上清液过0.22μm水系滤膜得到粗酶液，通过1mL His TrapTM HP亲和镍柱分离纯化，用10个柱体积的洗脱缓冲液进行线性洗脱，对目的蛋白进行全波长扫描和比酶活的计算。
血红素饱和度定义为在408nm处的吸光值与280nm处之比，即A408/A280。
结果表明，CoCl2的加入降低了血红素饱和度，添加MnCl2没有显著影响(表1)，而添加Glu+FeCl2，显著提高了重组DyP中血红素的饱和度。
表1不同外源添加剂对重组DyP中血红素饱和度的影响
注：B为不加任何添加剂的对照组。
实施例3外源添加物对重组DyP表达的影响
向培养基中分别添加终浓度为100μmol/L的His、Glu以及FeCl2、CoCl2、MnCl2、Glu+FeCl2，添加的IPTG终浓度为0.3mmol/L，在30℃下诱导培养14h，收集菌体离心、悬浮、破碎、离心，收集上清液过0.22μm水系滤膜得到粗酶液，通过1mL His TrapTM HP亲和镍柱分离纯化，用10个柱体积的洗脱缓冲液进行线性洗脱，对目的蛋白进行全波长扫描和比酶活的计算。
其中不添加任何添加剂为对照组(B)，考察氨基酸和金属离子对重组DyP酶活和菌体生长的影响。
如图2所示，CoCl2对重组DyP酶活有一定抑制作用，添加His对重组DyP酶活和菌体的生长基本保持不变，外源添加FeCl2、MnCl2以及Glu都能提高重组DyP酶活和菌体生长量。当向培养基中添加100μmol/L的FeCl2时，重组DyP酶活从22.34U/L提高至26.20U/L，菌体生长量从5.45g/L提高至6.17g/L；当向培养基中添加100μmol/L的Glu时，重组DyP酶活从22.34U/L提高至23.33U/L，菌体生长量从5.45g/L提高至5.78g/L。
如图1所示，当向培养基中添加100μmol/L的Glu+FeCl2时，比酶活提高为对照(101U/g)的1.37倍。
实施例4添加不同浓度的FeCl2对重组DyP表达的影响
向培养基中分别添加终浓度为40、60、80、100、120μmol/L的FeCl2，其中不添加任何添加剂为对照组(B)。如图3所示，随着FeCl2浓度增加，酶活先增后降，当浓度为80μmol/L时，酶活达到31.31U/L，是对照的1.45倍，血红素饱和度提高近21.8％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法，其特征在于，在大肠杆菌中异源表达染料脱色过氧化物酶，获得重组菌株，应用所述重组菌株进行发酵，在发酵培养基中添加Glu和/或Fe2+。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，添加的Glu和/或Fe2+的终浓度为40-100μmol/L。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，添加的Glu和/或Fe2+的终浓度为60-100μmol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染料脱色过氧化物酶的NCBI accessionnumber为Q47KB1。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌株以大肠杆菌BL21为宿主。
6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述重组菌株以pET系列载体为载体。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵条件为：种子培养后，以1-5％(v/v)的接种量转接至LB培养基中，200-220r/min、35-38℃培养至菌体OD600达到0.6-0.8，向培养基中添加终浓度为0.1-0.5mmol/L IPTG，28-30℃诱导培养12-20h。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，种子培养是将重组菌株接种到LB培养基中，200-220r/min、35-38℃培养10-15h。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，LB培养基的配方如下:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
10.权利要求1-9任一所述的方法在生物、纺织或化工领域内的应用。
CN201910261137.5A 2019-04-02 2019-04-02 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法 Pending CN109943544A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910261137.5A CN109943544A (zh) 2019-04-02 2019-04-02 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法
PCT/CN2019/120475 WO2020199612A1 (zh) 2019-04-02 2019-11-25 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910261137.5A CN109943544A (zh) 2019-04-02 2019-04-02 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109943544A true CN109943544A (zh) 2019-06-28

Family

ID=67013532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910261137.5A Pending CN109943544A (zh) 2019-04-02 2019-04-02 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN109943544A (zh)
WO (1) WO2020199612A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111593061A (zh) * 2020-07-06 2020-08-28 江南大学 一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法
WO2020199612A1 (zh) * 2019-04-02 2020-10-08 江南大学 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法
CN111849847A (zh) * 2020-07-08 2020-10-30 江南大学 一种提高大肠杆菌胞内血红素含量的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113683813B (zh) * 2021-08-18 2022-09-27 江南大学 染料脱色过氧化物酶在聚苯乙烯降解中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102016205671A1 (de) * 2016-04-06 2017-10-12 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- oder Reinigungsmittel mit lebenden Mikroorganismen
CN107460176A (zh) * 2017-06-28 2017-12-12 江苏大学 一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用
CN108676783A (zh) * 2018-05-28 2018-10-19 南华大学 一种脱色过氧化物酶及其制备方法与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754803B (zh) * 2017-01-18 2020-05-05 四川爱奇生物科技有限公司 DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用
CN109943544A (zh) * 2019-04-02 2019-06-28 江南大学 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102016205671A1 (de) * 2016-04-06 2017-10-12 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- oder Reinigungsmittel mit lebenden Mikroorganismen
CN107460176A (zh) * 2017-06-28 2017-12-12 江苏大学 一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用
CN108676783A (zh) * 2018-05-28 2018-10-19 南华大学 一种脱色过氧化物酶及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHMAD等: "Improved catalytic activities of a dye-decolorizing peroxidase (DyP)by overexpression of ALA and heme biosynthesis genes in Escherichia coli", 《PROCESS BIOCHEMISTRY》 *
陈丹园等: "关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020199612A1 (zh) * 2019-04-02 2020-10-08 江南大学 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法
CN111593061A (zh) * 2020-07-06 2020-08-28 江南大学 一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法
CN111849847A (zh) * 2020-07-08 2020-10-30 江南大学 一种提高大肠杆菌胞内血红素含量的方法
CN111849847B (zh) * 2020-07-08 2022-05-06 江南大学 一种提高大肠杆菌胞内血红素含量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020199612A1 (zh) 2020-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109943544A (zh) 一种提高重组染料脱色过氧化物酶酶活的方法
Williams et al. Proteomic profile changes in membranes of ethanol-tolerant Clostridium thermocellum
Bhushan et al. Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase from an alkalophilic Bacillus sp. BG-11
JP5895004B2 (ja) 組み換え大腸菌及び５−アミノレブリン酸の生産におけるその応用
CN101831414B (zh) 一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法
CN106754601A (zh) 一种应用磷脂酶c将胞内蛋白在胞外表达的方法
Joseph et al. Increased biomass production and glycogen accumulation in apcE gene deleted Synechocystis sp. PCC 6803
Perfetto et al. Production and covalent immobilisation of the recombinant bacterial carbonic anhydrase (SspCA) onto magnetic nanoparticles
JP2024508555A (ja) ヒアルロン酸加水分解酵素を効率的に発現する遺伝子及びその発現方法
CN117887679B (zh) 羰基还原酶突变体及其在制备(s)-玻色因中的应用
CN103131724B (zh) 一种高效表达工程菌重组蛋白的方法及应用
Crowley Compatible solute ectoine review: protection mechanisms and production methods
Phaff Industrial microorganisms
EP1283256B1 (en) Method of culturing microorganisms
Geckil et al. Effect of Vitreoscilla hemoglobin on production of a chemotherapeutic enzyme, l‐asparaginase, by Pseudomonas aeruginosa
CN103667201B (zh) 海洋微生物菌株ys0810产的碱性过氧化氢酶及其分离纯化方法
JPS63500493A (ja) 遺伝子的に修飾された生物体を用いるビタミンｃの製造方法
JP5946080B2 (ja) 藍藻においてプラスチック原料および関連物質を生産する方法
TWI541350B (zh) A Method for Highly Efficient Expression of Recombinant Protein from Engineering Bacteria and Its Application
CN110294799B (zh) 在E.coli中实现rhTβ4完全乙酰化修饰表达的中试生产发酵方法
WO2020213374A1 (ja) ペルオキシダーゼの組換え生産
CN117886923B (zh) 一种重组人源化胶原蛋白及其编码基因与应用
CN106701724A (zh) 一种碱性果胶酶活性包涵体的制备及其应用
CN116333157A (zh) 一种改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用
JP4513967B2 (ja) Ｄ−アミノアシラーゼの活性向上方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190628