CN113846084A - 卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用 - Google Patents
卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用，其中卤醇脱卤酶通过序列的突变形成卤醇脱卤酶突变体、对编码卤醇脱卤酶突变体的编码基因、携带编码基因的重组质粒、表达重组质粒的基因工程菌，最终制得的基因工程菌在催化合成(S)‑1‑氯‑3‑苯氧基‑2‑丙醇时的立体选择性较高，相较卤醇脱卤原始酶的催化合成拆分的纯度和收率更高，有利于工业生产。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种卤醇脱卤酶突变体、编码基因、重组质粒、基因工程菌及其应用。
背景技术
手性1-氯-3-苯氧基-2-丙醇是一种重要的有机合成中间体，可用于合成大量生物活性分子，广泛应用于医药化学品、农用化学品等行业。手性邻卤醇的合成受到研究者们的广泛关注，现有技术报道了不对称硼氢化法、(转移)氢化法、R-氯酮的生物催化还原和卤代从的动态动力学拆分等方法。但是传统的化学合成方法使用金属催化剂，毒性大，对环境污染严重，并且反应条件苛刻，往往需要较高的反应温度和较长的反应时间，反应收率低，同时反应的立体选择性不高。与化学法相比，生物法催化法具有底物谱广、对映选择性高、反应条件温和、环境友好等特点使其在制备手性化合物中具有无可比拟的优势。
立体选择性卤醇脱卤酶是一种重要的手性合成工具酶，在制备手性邻卤醇方面具有广阔的应用前景，日益受到重视。目前虽然已报道卤醇脱卤酶大约80余种，主要分为7大类型。但是目前已知的绝大部分卤醇脱卤酶立体选择性不尽人意，严重制约了其在手性中间体合成中的开发应用。高健课题组从Pseudomonas umsongensis中克隆、异源表达卤醇脱卤酶得到了新的卤醇脱卤酶基因，催化10mM 1-氯-3-苯氧基-2- 丙醇合成(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇，收率只有16.97％(化工进展, 2019,38(8):3823-3828)。另外，该课题组从一株细菌中的克隆的卤醇脱卤酶AbHHDH, 催化20mM 1-氯-3-苯氧基-2-丙醇合成(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇，收率只有30.7％ (Catalysis Letters,2019,149:629–637)。
因此，通过分子生物学的方法对卤醇脱卤酶进行改造，以提高其在手性化合物的合成收率，尤其是催化合成手性1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的收率具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用，具体地说是，卤醇脱卤酶通过序列的突变形成卤醇脱卤酶突变体、对编码卤醇脱卤酶突变体的编码基因、携带编码基因的重组质粒、表达重组质粒的基因工程菌，最终制得的基因工程菌在催化合成拆分(S)1-氯-3-苯氧基-2-丙醇时的立体选择性较高，相较卤醇脱卤原始酶的催化合成的纯度和收率更高，有利于工业生产
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种卤醇脱卤酶突变体，卤醇脱卤酶突变体在SEQ ID NO.1所示序列中R位进行组合突变，所述R位为R1到R21，且在其N端添加6个组氨酸。
进一步地，所述R1位为第3位赖氨酸，R2位为第6位天冬酰胺、R3位为第9位异亮氨酸、R4位为第16位的缬氨酸、R5位为第21位的丙氨酸、R6位为第22位的丝氨酸、R7位为第23位的缬氨酸、R8位为第25位的异亮氨酸、R9位为第27位的谷氨酸、R10位为第37位的丝氨酸、R11位为第39位的缬氨酸、R12位为第41位的谷氨酸、R13位为第42位的天冬酰胺、R14位为第45位的亮氨酸、R15位为第48位的丝氨酸、R16位为第51位的缬氨酸、R17位为第56位的脯氨酸、R18位为第61位的天冬氨酸、R19位为第63位的谷氨酸、R20位为第66位的亮氨酸、R21位为第179 位天冬酰胺。
进一步地，R1到R21的组合突变为第3位赖氨酸突变为天冬酰胺；将第6位天冬酰胺突变为异亮氨酸；将第9位异亮氨酸突变为缬氨酸；将第16位缬氨酸突变为亮氨酸；将第21位丙氨酸突变为异亮氨酸；将第22位丝氨酸突变为苏氨酸；将第 23位缬氨酸突变为丙氨酸；将第25位异亮氨酸突变为缬氨酸；将第27位谷氨酸突变为天冬氨酸；第37位丝氨酸突变为精氨酸；第39位缬氨酸突变为苏氨酸；第41 位谷氨酸突变为赖氨酸；第42位天冬酰胺突变为谷氨酰胺；第45位亮氨酸突变为天冬氨酸；第48位丝氨酸突变为谷氨酸；第51位缬氨酸突变为异亮氨酸；第56位脯氨酸突变为丙氨酸；第61位天冬氨酸突变为缬氨酸；第63位天冬氨酸突变为丝氨酸；第66位亮氨酸突变为异亮氨酸；第179位天冬酰胺突变为亮氨酸。
本发明还公开了一种编码基因，所述编码基因编码如上述任一项所述的卤醇脱卤酶突变体的基因。
本发明还公开了一种质粒，所述质粒携带上述的编码基因。
进一步地，所述质粒的表达载体为pET28a(+)。
本发明还公开了一种基因工程菌，大肠杆菌为宿主，表达上述任一项所述的质粒。
本发明还公开了一种基因工程菌的应用，所述基因工程菌作为催化剂，以催化合成拆分(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供的卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用，具体地说是，卤醇脱卤酶突变体通过在SEQ ID NO.1所示序列中R1到R21序列进行组合突变，且在其N端添加6个组氨酸，相较现有技术中的卤醇脱卤酶突变体在后续过程中对于基因工程菌在进行催化合成拆分(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的收率及对映体选择率均较高，另外单纯仅对序列中R1到R21为位进行组合突变或者单纯仅在其N 端添加6个组氨酸均无法达到催化合成拆分的效果。利用编码基因编码上述卤醇脱卤酶突变体，在将携带上述编码基因的重组之力进行表达，得到的基因工程菌，在催化合成拆分(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇时的立体选择性和纯度均较高，其中纯度高于 99.99％，收率均在45％以上，相较原始酶催化反应，对映体选择率提高了5.5-7.2倍，在进行手性1-氯-3-苯氧基-2-丙醇催化反应制备时选择对应的(S)1-氯-3-苯氧基 -2-丙醇的工业化应用价值更高。
本发明适用于编码卤醇脱卤酶突变体的编码基因、重组质粒、基因工程菌的制备，以及催化合成拆分(S)1-氯-3-苯氧基-2-丙醇。
本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1为标样1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的高效液相色谱图；
图2为实施例4中原始酶催化反应的高效液相色谱图；
图3为实施例4中具有卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌催化反应的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1一种卤醇脱卤酶突变体
一种卤醇脱卤酶突变体，其中卤醇脱卤酶突变体以原始卤醇脱卤酶为再提进行突变，原始卤醇脱卤酶的氨基酸序列如下：
上述氨基酸序列中的字母为氨基酸的单字母缩写，具体氨基酸序列中的缩写字母代表的氨基酸名称，详见下表中所示：
本实施例中的使用的原始卤醇脱卤酶的基因序列如下：
卤醇脱卤酶突变体在SEQ ID NO.1所示序列中R1到R21为位进行组合突变，且在其N端添加6个组氨酸。其中，R1到R21的组合突变为第3位赖氨酸突变为天冬酰胺；将第6位天冬酰胺突变为异亮氨酸；将第9位异亮氨酸突变为缬氨酸；将第 16位缬氨酸突变为亮氨酸；将第21位丙氨酸突变为异亮氨酸；将第22位丝氨酸突变为苏氨酸；将第23位缬氨酸突变为丙氨酸；将第25位异亮氨酸突变为缬氨酸；将第27位谷氨酸突变为天冬氨酸；第37位丝氨酸突变为精氨酸；第39位缬氨酸突变为苏氨酸；第41位谷氨酸突变为赖氨酸；第42位天冬酰胺突变为谷氨酰胺；第45 位亮氨酸突变为天冬氨酸；第48位丝氨酸突变为谷氨酸；第51位缬氨酸突变为异亮氨酸；第56位脯氨酸突变为丙氨酸；第61位天冬氨酸突变为缬氨酸；第63位天冬氨酸突变为丝氨酸；第66位亮氨酸突变为异亮氨酸；第179位天冬酰胺突变为亮氨酸。
本发明中的卤醇脱卤酶突变体在SEQ ID NO.1所示序列中R1到R21为位进行组合突变且在其N端添加6个组氨酸后的氨基酸序列为：
上述氨基酸序列中的字母为氨基酸的单字母缩写，具体氨基酸序列中的缩写字母代表的氨基酸名称，详见前述表格中所示。
本发明中的卤醇脱卤酶突变体的基因序列为：
CATCATCACCACCACCACATGCTGAACAACAAAATCATCCTGGTTACCGACGCGACCCATTTTCTGGGTAAACCGGGTATTACCGC TCTGGTACGTGACGGCGCAACCGTTTTTGCACAAGATGCGCGTTTTACCGATAAACAAGCACGCGACGCATTTGAAGAACTGATTC CGGGCGTTACCGCACTGGCAGAACAAGTTCCGAGCGAAGTTATTAAAGCGGTTCTGGCGATTGCGGGTCATCTGGACGTTCTGGTT AACAACGACGCATATCCGGCAATTCGCGCAAGCATTGACGAAGCGGATATCGAAGACTTTCGTAACACCCTGGATGCACTGCTGGT TCGCGGTTTTACCTACGCGAAATACGTCGCCGCGCACATGAAAAAACGCGGTAGCGGCAAAATCATCTTCATTAGCTCTGCAGTTC CGAAACACGGTCTGCCGAACTATAGTATGTACGTAGCTGCTCGCGGCGGTGCAAATGCACTGGCAGTTACCCTGGCAAAAGAACTG GGCAAAAGCGGTATCCAGGTTAACAGTCTGGCACCGCTGTTTATTGAAAGCCCGACCTACTTCCCGAAAGAACTGCTGGAGAACGA AGAAACCCTGAAAAAGATTACCAAACCGATTCCGCTGGGTCGTCTGGGTAAACCGGAAGAAGCAGGCGAATATCTGGCATTTCTGA GCAGCGACAAAAGCGATTACATCACCGGTCAGGTTCTGTATTTTGCAGGCGGTTGGGCATAA
本发明采用原始氨基酸位置替换的氨基酸来表示突变体，其中位置的编号对应于卤醇脱卤酶的氨基酸序列位置。
本发明中提供的卤醇脱卤酶突变体的序列中R1到R21为位进行组合突变，且在其N端添加6个组氨酸，相较现有技术中的卤醇脱卤酶突变体在后续过程中对于基因工程菌在进行催化合成拆分(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的收率及对映体选择率均较高，另外单纯仅对序列中R1到R21为位进行组合突变或者单纯仅在其N端添加6个组氨酸均无法达到催化合成拆分的效果。
实施例2一种编码卤醇脱卤酶突变体的编码基因及携带上述基因的重组质粒
对实施例1中的卤醇脱卤酶突变体进行编码，形成带有卤醇脱卤酶突变体的编码基因，具体为通过基因工程操作以全合成的方法合成SEQ ID NO.2，即为带有突变酶的编码基因，卤醇脱卤酶编码基因序列为HHDHmut。
卤醇脱卤酶编码基因与大肠杆菌表达载体pET28a都分别用NcoI和Xho I进行双酶切，酶切3-6h后，回收酶切产物，利用T4DNA连接酶在16℃下连接16h，得到重组质粒pET28a-HHDHmut。上述使用的T4DNA连接酶、限制性内切酶Nco I和 Xho I购自Fermetens公司。
实施例3一种基因工程菌
一种基因工程菌，以大肠杆菌为宿主，表达实施例2所述的重组质粒。
具体方式为：将重组质粒pET28a-HHDHmut转化至E.coliBL21(DE3)受体菌，涂布于含卡那霉素(浓度50mg/L)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜后，平板上长出菌落。随机挑取单克隆，培养后提取质粒进行测序，测序结果表明得到基因工程菌，即阳性克隆E.coli BL21(DE3)/pET28a-HHDHmut。
将上述基因工程菌在质量浓度为50mg/L的卡那霉素的50mL LB培养基中于 37℃，200r/min条件下培养10h；然后以1vt.％的接种量接种到新的含质量浓度为 50mg/L的卡那霉素的50mL LB培养基中，仍以37℃，200r/min培养，待培养至光学密度(OD600)为0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，至终浓度为0.15mM，在28℃，200r/min下诱导表达12h。5000×g，5min离心收集菌体，并以pH 8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬洗涤，5000×g离心5min，收集 E.coli菌体，于-20℃储存备用。
其中，LB琼脂平板的组成包括：胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂15.0-20.0g/L。在121℃高压灭菌20min备用。
实施例4一种基因工程菌的应用
利用卤醇脱卤酶突变体表达出的基因工程菌，催化拆分底物1-氯-3-苯氧基-2-丙醇级联反应如下：
催化拆分底物1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的具体方法为：称取0.50g基因工程菌悬浮于10mL 40mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH 7.5，100mM)，加入浓度为30 mM的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇，30℃恒温水浴反应，定时取样0.5mL，反应60-120min 后，取样加入1mL乙酸乙酯，振荡后静置15min，取出800μL乙酸乙酯，用0.22μm 的有机膜过滤后，萃取液加入无水硫酸钠干燥。结果显示基因工程菌优先水解(R)-1- 氯-3-苯氧基-2-丙醇，且催化的对映体选择率达117.2；催化生成的(S)-1-氯-3-苯氧基-2- 丙醇的ee值大于99.99％，且收率为45.3％。
使用上述同样的应用方法将基因工程菌置换为卤醇脱卤酶原始酶，其余的反应条件均相同，最终的结果显示，卤醇脱卤酶原始酶也优先水解(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇，催化的对映体选择率达16.6。由上述结果可看出，基因工程菌催化的对映体选择率为卤醇脱卤酶原始酶的7.0倍。
底物1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的高效液相分析方法为：采用Agilent-1220系统，色谱柱类型：Chiralcel OD-H柱(Daicel Co.,Japan；4.6×250mM，5μm)；色谱条件：柱温30℃；
色谱参数为：流动相为正己烷：异丙醇＝88:12(v/v)；流速：0.8mL/min；UV波长为220nm时，如图1所示，标样1-氯-3-苯氧基-2-丙醇中(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇和 (R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇保留时间(min)分别约为10.4和17.7。底物ees＝[(S-R)/(S+R)] ×100％或者ees＝[(R-S)/(R+S)]×100％；E＝ln[(1-c)×(1-ees)]/ln[(1-c)×(1+ees)]。其中， R和S为(R)-和(S)-底物的峰面积，c为rac-底物转化率。
本实施例中利用卤醇脱卤酶原始酶催化拆分底物1-氯-3-苯氧基-2-丙醇，最终拆分结果如图2所示，在(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇在10.5min出峰，(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇被完全转化未出峰，同时剩余的S构型峰面积较小，收率较低，只有26.5％。相较卤醇脱卤酶原始酶催化拆分，具有卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌催化拆分效果更佳，如图3所示，(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇在10.3min出峰，(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇被完全转化未出峰，其在10.3min的出峰面积更大，收率更高达45.3％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catcatcacc accaccacat gctgaacaac aaaatcatcc tggttaccga cgcgacccat 60
tttctgggta aaccgggtat taccgctctg gtacgtgacg gcgcaaccgt ttttgcacaa 120
gatgcgcgtt ttaccgataa acaagcacgc gacgcatttg aagaactgat tccgggcgtt 180
accgcactgg cagaacaagt tccgagcgaa gttattaaag cggttctggc gattgcgggt 240
catctggacg ttctggttaa caacgacgca tatccggcaa ttcgcgcaag cattgacgaa 300
gcggatatcg aagactttcg taacaccctg gatgcactgc tggttcgcgg ttttacctac 360
gcgaaatacg tcgccgcgca catgaaaaaa cgcggtagcg gcaaaatcat cttcattagc 420
tctgcagttc cgaaacacgg tctgccgaac tatagtatgt acgtagctgc tcgcggcggt 480
gcaaatgcac tggcagttac cctggcaaaa gaactgggca aaagcggtat ccaggttaac 540
agtctggcac cgctgtttat tgaaagcccg acctacttcc cgaaagaact gctggagaac 600
gaagaaaccc tgaaaaagat taccaaaccg attccgctgg gtcgtctggg taaaccggaa 660
gaagcaggcg aatatctggc atttctgagc agcgacaaaa gcgattacat caccggtcag 720
Claims (8)
1.一种卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，卤醇脱卤酶突变体在SEQ ID NO. 1所示序列中R位进行组合突变，所述R位为R1到R21，且在其N端添加6个组氨酸。
2.根据权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，所述R1位为第3位赖氨酸，R2位为第6位天冬酰胺、R3位为第9位异亮氨酸、R4位为第16位的缬氨酸、R5位为第21位的丙氨酸、R6位为第22位的丝氨酸、R7位为第23位的缬氨酸、R8位为第25位的异亮氨酸、R9位为第27位的谷氨酸、R10位为第37位的丝氨酸、R11位为第39位的缬氨酸、R12位为第41位的谷氨酸、R13位为第42位的天冬酰胺、R14位为第45位的亮氨酸、R15位为第48位的丝氨酸、R16位为第51位的缬氨酸、R17位为第56位的脯氨酸、R18位为第61位的天冬氨酸、R19位为第63位的谷氨酸、R20位为第66位的亮氨酸、R21位为第179位天冬酰胺。
3.根据权利要求2所述的卤醇脱卤酶突变体，其特征在于， R1到R21的组合突变为第3位赖氨酸突变为天冬酰胺；将第6位天冬酰胺突变为异亮氨酸；将第9位异亮氨酸突变为缬氨酸；将第16位缬氨酸突变为亮氨酸；将第21位丙氨酸突变为异亮氨酸；将第22位丝氨酸突变为苏氨酸；将第23位缬氨酸突变为丙氨酸；将第25位异亮氨酸突变为缬氨酸；将第27位谷氨酸突变为天冬氨酸；第37位丝氨酸突变为精氨酸；第39位缬氨酸突变为苏氨酸；第41位谷氨酸突变为赖氨酸；第42位天冬酰胺突变为谷氨酰胺；第45位亮氨酸突变为天冬氨酸；第48位丝氨酸突变为谷氨酸；第51位缬氨酸突变为异亮氨酸；第56位脯氨酸突变为丙氨酸；第61位天冬氨酸突变为缬氨酸；第63位天冬氨酸突变为丝氨酸；第66位亮氨酸突变为异亮氨酸；第179位天冬酰胺突变为亮氨酸。
4.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如权利要求1-3中任一项所述的卤醇脱卤酶突变体的基因。
5.一种质粒，其特征在于，所述质粒携带如权利要求4所述的编码基因。
6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述质粒的表达载体为pET28a(+)。
7.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达如权利要求5或6中所述的质粒。
8.一种基因工程菌的应用，其特征在于，以所述权利要求7中的基因工程菌作为催化剂，以催化合成拆分(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇。
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| GR01 | Patent grant | ||
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