BRPI1003752A2 - mÉtodo para aumentar a produÇço de biomassa de planta e/ou sementes e mÉtodo para produzir planta capaz de produzir quantidade aumentada de biomassa e/ou sementes - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇçO DE BIOMASSA DE PLANTA E/OU SEMENTES E MÉTODO PARA PRODUZIR PLANTA CAPAZ DE PRODUZIR QUANTIDADE AUMENTADA DE BIOMASSA E/OU SEMENTES. A presente invenção refere-se á produção de biomassa e/ou sementes que é adicionalmente aumentada. A produção de biomassa e/ou sementes por uma planta pode ser aumentada adicionalmente através do fornecimento de glutationa a uma planta na qual um gene que codifica uma proteína fosfatase 20 que tem sequências consenso características foi introduzido.
Description
Relatorio Descritivo da Patente de Inven^ao para "METODO PARA AUMENTAR A PRODUQAO DE BIOMASSA DE PLANTA E/OU SEMENTES E METODO PARA PRODUZIR PLANTA CAPAZ DE PRODUZIR QUANTIDADE AUMENTADA DE BIOMASSA E/OU SEMEN- TES".
Antecedentes da Invencao Campo da Invenc^o
A presente invengao refere-se a um metodo para aumentar adi- cionalmente a produ9ao de biomassa e/ou sementes por uma planta que ρ rod uz uma quantidade aumentada de biomassa e/ou sementes como um resuItado da introdu9ao de um dado gene na planta; e um metodo para pro- duzir esta planta capaz de produzir uma quantidade aumentada de biomassa e/ou sementes. Antecedentes da Tecnica O termo "biomassa" geralmente refere-se a quantidade total de
organismos que habitam ou existem em uma determinada area. Quando es- te termo e usado com rela^ao a plantas, em particular, ele refere-se ao peso a seco por unidade de area. As unidades de biomassa sao quantificadas em termos de massa ou energia. A expressao "biomassa" e sinonimo de "Sei- butsutairyo" ou "Seibutsuryo". No caso de biomassa de planta, ο termo orga- nismos por area" e ocasionalmente usado para "biomassa". Como a bio- massa de planta e gerada pela fixapao de dioxido de carbono atmosferico com ο uso de energia solar, ela pode ser considerada como a chamada "e- nergia neutra de carbono". Consequentemente, um aumento da biomassa de plantas e eficaz para a preservagao ambiental global, para a prevengao do aquecimento global, e mitigagao de emissoes de gases estufa. Desta forma, as tecnologias para aumentar a produgao de biomassa de planta tem stdo significativas industrialmente.
As plantas sao cultivadas com ο proposito de usar alguns de seus tecidos (por exemplo, sementes, raizes, folhas, ou hastes) ou com ο proposito de produzir varios materials, tais como gorduras e oleos. Exemplos
de gorduras e oleos produzidos a partir de plantas que sao conhecidos ate ο mumeiito induem 0ieo de soja. oieo de gergeiim: oieo de oliva, oleo de coco, oleo de arroz, oleo de carogo de algodao, oleo de girassol, oleo de milho, oleo de agafrao, oleo de babagu, e oleo de semente de colza. Estas gordu- ras e oleos sao muito usados para aplicagoes domesticas e industriais. Ain- da, as gorduras e oleos produzidos a partir de plantas sao usados como ma- terias-primas para combustivel biodiesel ou bioplastico, e a sua aplicabilida- de esta aumentando para energia alternativa ao petroleo.
Em particular, um cultivo para geragao de energia, tal como ca- na-de-agiicar, pode ser usado como uma materia-prima para biocombustivel. Entaol espera-se a produgao aumentada da massa total de uma ρIanta em si (a quantidade de biomassa de planta). Sob estas circunstancias, ο aprimo- ramento na produtividade por unidade de area de cultivo e necessaria de modo a aumentar a produgao da quantidade de biomassa de planta. Desco- briu-se que se ο ηCimero de plantas cultivadas for considerado constante por unidade de area de cultivo, um aprimoramento na quantidade de biomassa por planta seria necessario.
Entretanto1 acredita-se que ja que muitos genes estao envolvi- dos na quantidade de biomassa de planta (um chamado ”tipo de caracteris- tica quantitativa"), a introdu^ao de um gene individual ou modificagao geneti- ca individual pode nao Ievar a um aumento eficaz na produgao. Entretanto, muitas dificuldades estao associadas a rntrodugao de muitos genes em um estado desejado em uma planta. Esta introdupao genica tambem e ρ rob Ie- matica porque se ocorrer uma introdugao bem-sucedida, as caracteristicas desejaveis podem nem sempre ser adquiridas. Varias tecnicas para introdupao de genes sao conhecidas como
tecnicas para aumentar a produgao de biomassa de planta, conforme apre- sentado nos documentos de patente 1 a 7, por exemplo. Entretanto, nenhu- ma destas tecnicas pode ser considerada como exercendo efeito suficiente de aumento da produgao de biomassa. Documentos de Patente
Documento de patente 1: Publica^ao de Patente JP (Kohyo) N0
2001-505410 A Documento cie patente ι Pubhca^ao de Patente JP (Kohyo) N0 2001-519659 A
Documento de patente 3: Publica^ao de Patente JP (Kohyo) N0 2007-530063 A
Documento de patente 4: Publicapao de Patente JP (Kokai) N0
2005-130770 A
Documento de patente 5: Publicagao de Patente JP (Kohyo) N0 2000-515020 A
Documento de patente 6: Publicagao de Patente JP (Kohyo) N0
9-503389 A
Documento de patente 7: Publicagao de Patente JP (Kokai) N0 2005-52114 A Sumario da Invenp^o
Os presentes inventores buscaram genes que possuem novas fun^oes de melhorar drasticamente a quantidade de biomassa de planta e identificaram genes capazes de aumentar drasticamente a produgao de bio- massa de planta (PCT/JP2009/054983). Os presentes inventores examina- ram ainda plantas nas quais estes genes foram introduzidos. Como um re- sultado, um objetivo da presente inven^ao e fornecer uma tecnica para au- mentar adicionalmente a produgao de biomassa e/ou sementes.
Como um resuItado de estudos intensivos para se obter ο objeto acima, os presentes inventores fizeram ο novo achado de que a produgao de biomassa e/ou sementes pode ser aumentada adicionalmente atraves do fornecimento de glutationa a uma planta na qual um gene que codifica uma proteina fosfatase 2C que tern sequencias consenso caracteristicas foi intro- duzido. Desta forma, eles completaram a presente invengao.
Especificamente，ο metodo para aumentar a produ9ao de bio- massa e/ou sementes de acordo com a presente invenpao compreende uma etapa de fornecer glutationa a uma planta na qual foi introduzido um gene que codifica proteina fosfatase 2C que tern 3 sequencias consenso que compreendem as sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID Nos: 1 a ¾:. J7/7,-厶
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3 nesta ordem a partir da porgao terminal N. AdicionaimeiUe, υ 丨iietodo para produzir uma ρIanta de acordo com a presente inven^ao compreende uma etapa de fornecer gIutationa a uma planta na qual foi introduzido um gene que codifica a proteina fosfatase 2C que tem 3 sequencias consenso que compreendem as sequencias de aminoacido mostradas em SEQ ID Nos: 1 a 3 nesta ordem a partir da por^ao terminal N.
Na presente invengao, ο gene acima que codifica a proteina fos- fatase 2C pode ser pelo menos um tipo de gene selecionado do grupo que consiste em At1g03590-AtPP2C6-6, At1g16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g16800, At3g05640, At5g27930-AtPP2C6-7, At2g20050, e At3g06270, ou um gene funcionalmen- te equivalente a estes.
Na presente ίηνβηφδο, ο gene acima que codifica a proteina fos- fatase 2C codifica, de preferencia, qualquer uma das seguintes proteinas (a) a (c):
(a) uma proteina que compreende a sequencia de aminoacidos mostrada em SEQ ID N0: 5;
(b) uma proteina que compreende uma sequencia de aminoacido que tem uma delegao’ uma substituipao, uma adi9ao, ou uma inser^ao de um
ou de uma pluralidade de aminoacidos com relapao a sequencia de aminoaci- do mostrada em SEQ ID N°: 5 e tem atividade de proteina fosfatase 2C; e
(c) uma proteina que e codificada por um polinucleotideo que hi- bridiza sob condigoes estringentes a um polinucleotideo que compreende uma sequencia de nucleotideos complementar a sequencia de nucleotideo
mostrada em SEQ ID N0: 4 e tem atividade de proteina fosfatase 2C.
Adicionalmente1 na presente inver^ao, um exemplo do gene funcionalmente equivalente acima e um gene de proteina fosfatase 2C de um organismo diferente de Arabidopsis thaliana. Outro exemplo de um orga- nismo diferente de Arabidopsis thaliana e um organismo selecionado do gru- po que consiste em arroz (Oryza sativa), choupo-do-Canada preto (Populus trichocarpa), uva europeia (Vit is vinifera), Medicago truncatula (Medicago truncatula), aIfafa (Medicago sativa), PhyscomitreHa patens (Physcomitrella patens), barrilha (MesernbfydiHhtimum ufystailinum), Chlamydomonas rei- nhardtii {Chlamydomonas reinhardtii), milho (Zea mays), colza (Brassica ra- pa), tomate (Solatium lycopersicum), mimulus {Mimulus guttatus), e alga vermelha monocelular (Cyanidioschyzon merolae).
Exemplos de plantas a ser submetidas a presente inven^ao in-
cluem dicotiledoneas tais como plantas da fa mi Iia Brassicaceae. Exemplos de plantas da familia Brassicaceae incluem Arabidopsis thaliana e colza. Outros exemplos de plantas a ser submetidas a presente ίηνβηφδο incluem monocotiledoneas, tais como plantas da familia Gramineae. Exemplos de plantas da familia Gramineae incluem arroz e cana-de-agucar.
De acordo com ο metodo para aumentar a produgao de biomas- sa e/ou sementes de acordo com a presente inven^ao, a produpao adicio- nalmente aumentada de biomassa e/ou sementes se torna possivel atraves de tratamento muito conveniente e de baixo custo de uma planta que produz uma quantidade aumentada de biomassa e/ou sementes como um resuItado da introdupao de um determinado gene na planta.
Ainda1 de acordo com ο metodo para produzir uma planta de a- cordo com a presente inver^ao, uma planta capaz de produzir uma quanti- dade adicionalmente aumentada de biomassa e/ou sementes pode ser obti- da atraves de tratamento muito conveniente e de baixo custo da planta que produz uma quantidade aumentada de biomassa e/ou sementes como um resuItado da introdugao de um determinado gene na planta. Breve Descricao dos Desenhos
A figura 1-1 e um diagrama caracteristico mostrando os resulta- dos da analise por alinhamento com ο uso de um programa de alinhamento de miiltiplas sequencias CLUSTAL W (1.83) para as sequencias de aminoa- cido codificadas por At1g03590-AtPP2C6-6, Atlg 16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g 16800, At3g05640, At5g27930-AtPP2C6-7, At2g20050, e At3g06270. A figura 1-2 e um diagrama caracteristico mostrando os resuIta-
dos da analise por alinhamento com ο uso de um programa de alinhamento de miiltiplas sequencias CLUSTAL W (1.83) para as sequencias de aminoa- Cido codificada por At1g03590-AtPP2C6-6, At1g16220, Atlg/9630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g 16800, At3g05640, At5g27930-AtPP2C6-7, At2g20050, e At3g06270.
A figura 1-3 e um diagrama caracteristico mostrando os resulta- dos da analise por alinhamento com ο uso de um programa de alinhamento de miiltiplas sequencias CLUSTAL W (1.83) para as sequencias de aminoa- cido codificadas por At1g03590-AtPP2C6-6, Atlg 16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g16800, At3g05640, At5g27930-AtPP2C6-7, At2g20050, e At3g06270.
A figura 2-1 e um diagrama caracteristico mostrando os resulta- dos da analise por alinhamento com ο uso de um programa de alinhamento de mijltiplas sequencias CLUSTAL W (1.83) para as sequencias de aminoa- cido codificadas por At1 g03590-AtPP2C6-6, At1 g 16220, At1 g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g 16800, At3g05640, e At5g27930-AtPP2C6-7.
A figura 2-2 e um diagrama caracteristico mostrando os resulta- dos da analise por alinhamento com ο uso de um programa de alinhamento de miiltiplas sequencias CLUSTAL W (1.83) para as sequencias de aminoa- cido codificadas por At1 g03590-AtPP2C6-6, At1 g 16220’ At1 g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g16800, At3g05640, e At5g27930-AtPP2C6-7.
A figura 2-3 e um diagrama caracteristico mostrando os resulta- dos da analise por alinhamento com ο uso de um programa de alinhamento de miiltiplas sequencias CLUSTAL W (1.83) para as sequencias de aminoa- cido codificadas por At1g03590-AtPP2C6-6, At1g16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g 16800, At3g05640, e At5g27930-AtPP2C6-7.
A figura 3 e uma foto mostrando as partes aereas de plantas do tipo selvagem e plantas transformadas nas quais foi introduzido um fragmen- to contendo ORF do gene PP2C (proteina fosfatase 2C) (At3g05640).
A figura 4 e um diagrama caracteristico mostrando os resuItados da medigao das quantidades de biomassa das partes aereas de plantas do tipo selvage·" e pldiitas tiansformadas nas quais foi introduzido um fragmen- to contendo ORF do gene PP2C (proteina fosfatase 2C) (At3g05640). O resuItado para as plantas do tipo selvagem e ο valor medio para 12 plan- tas do tipo selvagem individuals e cada resuItado para a planta transformada e ο valor medio para 5 plantas transformadas individuals.
A figura 5 e um diagrama caracteristico mostrando os resultados da medico das quantidades de sementes de plantas do tipo selvagem e plantas transformadas nas quais foi introduzido um fragmento contendo ORF do gene PP2C (proteina fosfatase 2C) (At3g05640). O resultado para as plantas do tipo selvagem e ο valor medio para 12 plantas do tipo selvagem individuais e cada resultado para a planta transformada e ο valor medio para plantas transformadas individuais.
A figura 6 e uma foto mostrando as partes aereas de plantas do tipo selvagem, plantas transformadas nas quais foi introduzido um gene PP2C, e plantas transformadas nas quais foi introduzido um gene FBA1, que foram tratadas com glutationa e, entao, cultivadas.
A figura 7 e um diagrama caracteristico mostrando os resultados da medi^ao das quantidades de biomassa das partes aereas de: plantas transformadas nas quais foi introduzido um gene PP2C e plantas transfor- madas nas quais foi introduzido um gene FBA1, que foram tratadas com glu- tationa e, entao, cultivadas; e as mesmas plantas transformadas que servem como plantas de controle, que foram tratadas com agua.
A figura 8 e um diagrama caracteristico mostrando os resultados da medigao das quantidades de sementes de: plantas transformadas nas quais foi introduzido um gene PP2C e plantas transformadas nas quais foi introduzido um gene FBA1, que foram tratadas com glutationa e, entao, cul- tivadas; e as mesmas plantas transformadas que servem como plantas de controle, que foram tratadas com agua. Descricao das Modalidades Preferenciais A presente invengao sera descrita em detalhe da seguinte forma.
O metodo de acordo com a presente inven9ao compreende for-
necer glutationa a uma planta na qual um determinado gene foi introduzido Aqui, ο IeifTio "fornecer giutationa' refere-se a cultivar uma planta na presen- 9a de giutationa durante pelo menos um dos periodos de todos os estagios de crescimento apos a semeadura. Exemplos de um metodo para fornecer giutationa incluem um metodo que envolve a aspersao de uma solugao de giutationa sob re a superficie do solo no qual as sementes da planta sao se- meadas e um metodo que envolve a mistura de solo com um veiculo (por exemplo, bentonita, argila, talco, ou vermiculita) contend ο giutationa.
Como a giutationa a ser usada na presente inven^ao, podem ser usadas giutationa reduzida ou giutationa oxidada, ou ambas. Devido aos efeitos do aumento da produgao de biomassa e/ou sementes, giutationa oxi- dada e, de preferencia, usada. A quantidade definida acima de giutationa a ser fornecida pode ser fornecida em um ύηίοο suprimento ou em suprimen- tos divididos.
Uma planta a qual ο metodo de acordo com a presente invengao e aplicado e produzida pela introdugao de um gene que codifica a proteina fosfatase 2C que tem sequencias consenso caracteristicas. As plantas assim produzidas produzem uma quantidade significativamente aprimorada (au- mentada) de biomassa em comparagao a plantas do tipo selvagem. Esta planta pode ser produzida pela introdi^ao do gene da proteina fosfatase 2C para expressao em todos os tecidos de planta ou introdugao do mesmo para expressao em pelo menos alguns dos tecidos da planta. Aqui1 ο termo "teci- do(s) de planta" refere-se a orgao(s) da planta, tal como, folhas, hastes, se- mentes, raizes, e flores. O termo "introduzir um gene" e usado aqui em rela- gao a uma situa9ao na qual 0 nivel de expressao de um gene-alvo e deter- minado para aumentar significativamente em comparagao ao nivel de ex- pressao em um organismo do tipo selvagem. Portanto, ο termo "introdu9ao de um gene" para uso na presente inven^ao, refere-se a uma forma atraves da qual um gene-alvo e introduzido de fora e uma forma atraves da qual ο nivel de expressao e aprimorado pela aIteragao de uma regiao de controle da expressao de um gene endogeno. Gene da Proteina Fosfatase 2C
O gene da proteina fosfatase 2C a ser introduzido em uma plan- 9 , A \ 戋^.卡j
ta codifica a proteina fosfatase 2C que tem ό sequencias consenso que ! compreendem as sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID Nos. 1 a 3 nesta ordem a partir da porgao terminal N. Alem disso, um grupo de genes classificado como grupo E conforme a figura 1 do cladograma topografico (na pagina 237 da referencia: TRENDS in Plant Science Vol. 9 N0 5 de maio de 2004 paginas 236-243) codifica a proteina fosfatase 2C que tem 3 se- quencias consenso que compreendem as sequencias de aminoacido mos- tradas nas SEQ ID Nos: 1 a 3 nesta ordem a partir da porpao terminal N. Alem disso, a referencia preve a presenga de 76 genes da proteina fosfatase 2C em Arabidopsis thaliana e apresenta os resultados da produ^ao de uma arvore filogenetica destes genes com ο uso do programa T-Coffee (referen- da; Notredame, C. et al. 2000 T-Coffee: a novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. J. Mol. Biol. 302, 205-247) conforme a figura 1. Nesta arvore filogenetica, os genes da proteina fosfatase 2C classificados como membros do grupo E codificam uma proteina fosfatase 2C que tem 3 sequencias consenso que compreendem as sequencias de aminoacido mos- tradas nas SEQ ID NoS: 1 a 3 nesta ordem a partir da por^ao terminal N. As 3 sequencias consenso que compreendem as sequencias de aminoacido mos- tradas nas SEQ ID Nos: 1 a 3 sao sequencias caracteristicas no grupo E na classificapao acima mencionada e servem como uma base para uma clara diferenciagao dos outros grupos.
O grupo E na classificado acima inclui genes da proteina fosfa- tase 2C especificados por At1g03590-AtPP2C6-6, At1g16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g16800, At3g05640, At5g27930-AtPP2C6-7, At2g20050, e At3g06270 derivados de Arabidopsis thaliana. A figura 1 mostra os resultados da analise por alinha- mento com ο uso de um prog ram a de alinhamento de mOltiplas sequencias CLUSTAL W (1.83) (que pode ser usado junto ao DDBJ do National Institute of Genetics (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)) para as sequencias de aminoacido codificadas por estes genes da proteina fosfatase 2C derivados de Arabidopsis thaliana, At1g03590-AtPP2C6-6, At1g16220, At1g79630,
At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g 16800, At3g05640. At5g27930-AtPP2C6-7. At2g20050, e At3g062/U (com a matriz de substituigao (da sequencia) de aminoacido) usada aqui sendo uma matriz padrao conhecida como BLOSUM (Blocos da matriz da substituigao do ami- noacido)). Conforme mostrado na figura 1, estes genes da proteina fosfatase 2C classificados como membros do grupo E tem sequencias consenso ca- racteristicas nas regioes chamadas de I a III. Estas regioes chamadas I a III sao submetidas, com um gene da proteina fosfatase 2C derivados de arroz (descritos posteriormente), a uma analise por alinhamento, para que as 3 sequencias consenso que compreendem as sequencias de aminoacido mos- tradas nas SEQ ID Nos: 1 a 3 possam ser definidas.
Aqui, na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 1, um residuo de aminoacido chamado "Xaa," pode ser qualquer aminoacido, e nao e Iimitado a nenhum aminoacido particular. Entretanto, ο 1° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 1 e, de preferencia, Ieucina (codigo de tres caracteres: Leu e codigo de um caractere: L; ο mesmo se aplica aos seguintes) ou fenilalanina (Phe1 F). O 4° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 1 e, de preferencia, valina (VaI, V), isoleucina (lie, I), ou metionina (Met, M). O 16° residuo de aminoacido da porpao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N°: 1 e, de preferencia, serina (Ser, S) ou alanina (Ala, A). 0 17° residuo de ami- noacido da por^ao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 1 e, de preferencia, Iisina (Lys1 K), arginina (Arg, R), glutamina (Gln1 Q), ou asparagina (Asn, N). Isto e, uma sequencia consenso que com- preende a sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 1 e, de prefe- rencia, (L/F)XG(V/I/M)FDGHGXXGXXX(S/A)(K/R/Q/N)XV. Nesta sequencia de aminoacido, varios aminoacidos entre parenteses representam as possi- veis variagoes dos residuos de aminoacido nas posigoes relevantes. Ainda, nas sequencias de aminoacido, "X" significa que qualquer residuo de amino- acido pode estar presente na posigao relevante.
Ainda, tal sequencia consenso pode ser uma sequencia que
contem os seguintes 3 residuos de aminoacido na porgao terminal N da Re- 1
giao I "a fiyura 1. (D/E/N)XX.
Aqui, na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 2, um residuo de aminoacido chamado "Xaa," pode ser qualquer aminoacido, e nao e Iimitado a nenhum aminoacido particular. Entretanto1 ο 5° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 2 e, de preferencia, glicina (Gly, G), alanina (Ala, A), ou serina (Ser, S). O 6° residuo de aminoacido da por^ao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 2 e, de preferencia, valina (Val, V), Ieucina (Leu, L), ou isoleucina (lie, I). O 9° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N°: 2 e, de preferencia, isoleucina (lie, I), valina (Val, V), fenilalanina (Phe, F), metionina (Met, M), ou Ieucina (Leu1 L). O 12° residuo de aminoacido da porgao termi- nal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N°: 2 e, de prefe- rencia, glicina (Gly, G) ou alanina (Ala, A). O 15° residuo de aminoacido da por9§o terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N°: 2 e, de preferencia, Ieucina (Leu, L), valina (Val, V), ou isoleucina (lie, I). O 17° residuo de aminoacido da por^ao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 2 e, de preferencia, isoleucina (lie, I), valina (Val, V), ou metionina (Met, M). O 18° residuo de aminoacido da por9ao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 2 e, de preferencia, glicina (Gly1 G) ou alanina (Ala, A). O 22° residuo de aminoacido da porpao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 2 e, de preferencia, acido aspartico (Asp, D) ou histidina (His, H). O 26° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 2 e, de preferencia, valina (Val, V) ou isoleucina (lie, I). O 27° residuo de aminoacido da por^ao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 2 e, de preferencia, Ieucina (Leu, L), metionina (Met, M) ou isoleucina (lie, I). Isto e, uma sequencia consenso que com pre- ende a sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N°: 2 e, de preferen- cia,
SGXT(G/A/S)(V/M)XX(I/V/F/M/L)XX(G/A)XX(L/V/I)X(I/V/M)(A/G)NXG(D/H)S
RA(V/I)(L/M/I). Nesta sequencia de aminoacido, varios aminoacidos entre 产%‘ .
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parenteses representam as possiveis vanagoes dos residuos de aminoacido nas posigoes relevantes. Ainda1 nas sequencias de aminoacido, "X" signifies que qualquer residuo de aminoacido ρ ode estar presente na posigao rele- vante.
Aqui, na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3,
um residuo de aminoacido chamado "Xaa," ρ ode ser qualquer aminoacido, e nao e Iimitado a nenhum aminoacido particular. Entretanto1 ο 4° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, metionina (Met, M), valina (Val1 V), ou fenila- Ianina (Phe1 F). O 5° residuo de aminoacido da ροΓφδο terminal N na se- quencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N°: 3 e, de preferencia, serina (Ser, S), alanina (Ala, A), ou treonina (Thr, T). O 7° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N°: 3 e, de preferencia, alanina (Ala, A) ou serina (Ser, S). O 8° residuo de ami- noacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, fenilalanina (Phe1 F), isoleucina (lie, I), ou valina (Val1 V). O 14° residuo de aminoacido da porpao terminal N na se- quencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, Iisina (Lys1 K) ou acido glutamico (Glu, E). 0 180 residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada em SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, valina (Val, V) ou Ieucina (Leu, L). 0 19° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N°: 3 e, de preferencia, isoleucina (lie, I) ou valina (Val, V). O 23° residuo de a- minoacido da porpao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, acido glutamico (Glu, E), glutamina (Gin, Q), ou acido aspartico (Asp, D). O 24° residuo de aminoacido da por^ao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N°: 3 e, de preferencia, isoleucina (lie, I), valina (Val, V), ou fenilalanina (Phe, F). O 29° residuo de aminoacido da porpao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, isoleucina (lie, I), Ieucina (Leu1 L), ou valina (Val1 V). O 30° residuo de aminoacido da porpao terminal N na sequencia de
aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, serina (Ser1 S), tre- uiiina (Thr1 Τ), ou asparagina (Asn. N). O 33° residuo de aminoacido da por- gao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, acido aspartico (Asp, D), asparagina (Asn, N), ou histidina (His, H). O 35° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de ami- noacido mostrada na SEQ ID N°: 3 e, de preferencia, fenilalanina (Phe1 F) ou tirosina (Tyr, Y). O 36° residuo de aminoacido da porpao terminal N na se- quencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, Ieucina (Leu, L), isoleucina (He, I), valina (Val, V), fenilalanina (Phe, F), ou metionina (Met, M). O 37° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N°: 3 e, de preferencia, valina (Val, V), Ieucina (Leu, L), ou isoleucina (lie, I). O 38° residuo de aminoacido da por- gao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, Ieucina (Leu1 L) ou valina (Val1 V). O 40° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, treonina (Thr, T) ou serina (Ser, S). O 43° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, valina (Val1 V), isoleucina (lie, I), ou metioni- na (Met, M). O 44° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequen- cia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, triptofano (Trp, W) ou fenilalanina (Phe, F). O 45° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de pre- ferencia, acido aspartico (Asp, D) ou acido glutamico (Glu, E). O 47° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, Ieucina (Leu1 L), isoleucina (lie, I), ou me- tionina (Met, M). O 48° residuo de aminoacido da porgao terminal N na se- quencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, serina (Ser, S), treonina (Thr, T), ou prolina (Pro, P). O 49° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N°: 3 e, de preferencia, asparagina (Asn, N) ou serina (Ser, S). O 52° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, de preferencia, valina (Val, V) ou alanina (Ala, A). O 55° re-
siduo de aminoacido da porpao N- terminal Na sequencia de aminoacido iiiosliada na SEQ ID N。： 3 e, de preferencia, ieucina (Leu, L), valina (Val1 V), isoleucina (lie, I), ou metionina (Met, M). O 56° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N°: 3 e, de preferencia, isoleucina (lie, I) ou valina (VaI, V). Isto e, uma sequencia consenso que compreende a sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, mais especificamente,
GXA(M/V/F)(S/A/T)R(A/S)(F/I/V)GDXXX(K/E)XXG(V/L)(I/V)XXP(E/Q/D)(I/V/F )XXXX(I/LA/)(T/S)XX(D/N/H)X(F/Y)(L/I/V/F)(V/L/I)(UV)A(T/S)DG(V/I/M)(W/F) (D/E)X(L7l/M)(S/T/P)(N/S)XX(V/A)XX(L7V/l/M)(l/V). Nesta sequencia de ami- noacido, varios aminoacidos entre parenteses representam as possiveis va- riagoes dos residuos de aminoacido nas posigoes relevantes. Ainda, nas sequencias de aminoacido, "X" significa que quaiquer residuo de aminoacido pode estar presente na posipao relevante.
Aqui1 ο 20° residuo de aminoacido da porgao terminal N na se- quencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N°: 3 e, com mais preferencia, alanina (Ala, A), serina (Ser, S), ou cisteina (Cys, C). Ainda, ο 50° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 3 e, com mais preferencia, acido aspartico (Asp, D), acido glu- tamico (Glu, E), Iisina (Lys, K), glutamina (Gin, Q), ou asparagina (Asn, N). Varia90es dos residuos de aminoacido que podem estar presen-
tes em determinadas posigoes sao determinadas com base nas seguintes razoes. Conforme descrito na referenda (1) ("McKee Biochemistry," 3a ed., Capitulo 5 Amino AcidxPeptidexProtein 5.1 Amino Acid; supervisor editorial: Atsushi Ichikawa; supervisor de tradupao: Shinichi Fukuoka; editora: Ryosu- ke Sone; escritorio de edipao: Kagaku-Dojin Publishing Company, INC, ISBN4-7598-0944-9), e bem-conhecido que os aminoacidos sao classifica- dos com base nas cadeias laterals que tern propriedades si mi Ia res (por e- xemplo, propriedades quimicas e tamanhos fisicos). Tambem e bem- conhecido que ocorre substituigao evolucionaria molecular frequentemente dentre residuos de aminoacido classificados em um determinado grupo, em- bora a atividade da proteina seja mantida . Com base nestes conceitos, uma
matriz de pontuagao de substituigao (mutagao) (BLOSUM: Blocos da matriz 'ί ^ Y、 '·.
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da substitui9ao do aminoacido) para os residuos de aminoacido e proposta na figura 2 da referenda (2): Henikoff S., Henikoff J. G., Amino-acid substitu- tion matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 10915- 10919 (1992) e e amplamente usada. A referencia (2) e baseada em um a- chado de que as substituipoes de aminoacido que ocorrem entre aminoaci- dos com cadeias Iaterais que tem propriedades quimicas similares resultam em menos a Iterates estruturais ou funcionais na proteina completa. De acordo com as referencias (1) e (2) acima, os grupos das cadeias Iaterais de aminoacido a serem usados no alinhamento multiplo pod em ser considera- dos com base em indices, tais como as propriedades quimicas e tamanhos fisicos. Eles sao mostrados como grupos de aminoacido com uma pontua- 9ao de O ou mais e, de preferencia, como grupos de aminoacido com uma pontua?ao de 1 ou mais atraves do uso da matriz de pontua^oes (BLOSUM) apresentada na referencia (2). Os grupos tipicos sao os seguintes 8 grupos. Adicionalmente, grupos de aminoacido precisamente agrupados podem ser grupos de aminoacido com uma pontuapao de O ou mais, de preferencia, uma pontua9ao de 1 ou mais, e adicionalmente, de preferencia uma pontua- 9ao de 2 ou mais.
1) Grupo de aminoacido hidrofobico alifatico (grupo ILMV) Este grupo e um grupo de aminoacidos que tem cadeias Iaterais
hidrofobicas aIifaticas, dentre os aminoacidos nao polares neutros apresen- tados na referencia (1) acima, e que e compost。por V (VaI, valina), L (Leu1 leucina), I (lie, isoleucina), e M (Met, metionina). Dentre os aminoacidos classificados como aminoacidos nao polares neutros de acordo com a refe- rencia (1), FGACWP nao esta incluido neste "grupo de aminoacido hidrofo- bico alifatico" por causa das seguintes razoes: G (Gly, glicina) e A (Ala, ala- nina) tem ο mesmo tamanho que, ou sao menores que, um grupo metila e possuem efeitos nao polares fracos; C (Cys, cisteina) ρ ode desempenhar um importante papel nas liga?6es S-S e tem uma propriedade de formagao de uma ponte de hidrogenio com um atomo de oxigenio ou um atom ο de nitrogenio; F (Phe1 fenilalanina) e W (Trp1 triptofano) possuem cadeias late-
rals com pesos molecuiares significativamente maiores e possuem fortes ？ A
efeitos aioriiaticos, P (Pro. proiina) tern fortes eteitos de immoacido, de modo a fixar ο angulo da cadeia principal do polipeptideo. 2) Grupo contendo grupo hidroximetileno (grupo ST)
Este grupo e um grupo de aminoacidos (dentre aminoacidos po- lares neutros) que tem grupos hidroximetileno nas cadeias laterals, que e composto por S (Ser1 serina) e T (Thr, treonina). Os grupos hidroxi que exis- tem nas cadeias laterals de S e T constituem sitios de Iigagao de apijcar, entao estes sitios sao frequentemente importantes para um polipeptideo (proteina) ter uma atividade especifica. 3) Aminoacido acidico (grupo DE)
Este grupo e um grupo de aminoacidos que tem grupo carboxila acidicos nas cadeias laterals, e que e composto por D (Asp, acido aspartico) e E (Glu, acido glutamico). 4) Aminoacido basico (grupo KR) Este grupo e um grupo de aminoacidos basicos, que e composto
por K (Lys, lisina) e R (Arg, arginina). Estes KeR sao carregados positiva- mente dentro de uma ampla faixa de pH e possuem propriedades basicas. Por outro lado, a H (His, histidina) classificada como aminoacido basico qua- se nunca esta ionizada em pH 7, entao a H nao esta classificada neste gru- po.
1) Grupo metileno = grupo polar (grupo DHN)
Este grupo e caracterizado pelo fato de que: em todos os casos, um grupo metileno como uma cadeia lateral se Iiga a um element。de carbo- no- aIem do qual esta presente um grupo polar; e os tamanhos fisicos dos grupos metileno (grupos nao polares) sao muito parecidos entre si. Este gru- po e composto de N (Asn, asparagina; ο grupo polar e um grupo amida), D (Asp, acido aspartico; os grupos polares sao grupos carboxila), e H (His, his- tidina; os grupos polares sao grupos imidazol).
2) Grupo dimetileno = grupo polar (grupo EKQR)
Este grupo e caracterizado pelo fato de que: em todos os casos,
um hidrocarboneto linear que tem um comprimento maior que ο de um grupo
dimetileno se Iiga como uma cadeia lateral a um elemento de carbono-a, alem du qua丨 esta presente um grupo polar; e os tamanhos fisicos dos gru- pos dimetileno que sao grupos nao polares, sao muito semelhantes entre si. Este grupo e composto de E (Glu1 acido glutamico, ο grupo polar e um grupo carboxila), K (Lys, lisina; os grupos polares sao grupos amino), Q (Gin, glu- tamina; os grupos polares sao grupos amida), e R (Arg1 arginina; os grupos polares sao grupos imino e grupos amino).
3) Serie aromatica (grupo FYW)
Este grupo e um grupo de aminoacidos aromaticos que tern ηύ- cleos de benzeno nas cadeias laterals e e caracterizado por ter propriedades quimicas exclusivas nas series aromaticas. Este grupo e composto de F (Phe, fenilalanina), Y (Tyr, tirosina), e W (Trp, triptofano).
4) Anel & polar (grupo HY)
Este grupo e um grupo de aminoacidos que tem tanto estruturas de anel nas cadeias Iaterais como polaridade, e e composto por H (H, histi- dina; ambas as estruturas de anel e grupos polares sao grupos imidazol), e Y (Tyr1 tirosina; as estruturas de anel sao niicleos de benzeno e os grupos polares sao grupos hidroxi).
Conforme descrito acima, entende-se que: nas determinadas sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID Nos: 1 a 3, um residuo de aminoacido chamado de Xaa pode ser qualquer aminoacido; ou residuos de aminoacido chamados de Xaa podem ser substituidos uns com os outros dentro dos grupos acima 1) a 8). Entao, na presente inven^ao, ο gene da proteina fosfatase 2C a ser introduzido em uma ρIanta pode ser um gene da ρ rote ι na fosfatase 2C de qualquer ρ lanta, contanto que ele tenha 3 sequen- cias consenso que compreendem as sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID Nos: 1 a 3 nesta ordem a partir da porgao terminal N.
Mais especificamente, os exemplos de um gene que codifica a proteina fosfatase 2C de Arabidopsis thaliana que tem as 3 sequencias con- senso (que compreendem as sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID Nos: 1 a 3) nesta ordem a partir da porgao terminal N incluem At1g03590-AtPP2C6-6, At1g16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g16800, At3g05640, At5g27930- -.Ov'" .... 18 一 "丄一-
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AtPP2C6-7, At2g20050, e At3g06270. Na presente inven^ao, peio menos um tipo de gene selecionado a partir do grupo do gene e introduzido. Parti- cularmente, na presente invengao, e preferivel introduzir pelo menos um tipo de gene selecionado dentre At1g03590-AtPP2C6-6, At1g16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g 16800, At3g05640, e At5g27930-AtPP2C6-7. Particularmente1 na presente 丨nven_ pao, e mais preferivel introduzir pelo menos um tipo de gene selecionado dentre At3g16800, At3g05640, e At5g27930-AtPP2C6-7 eeo mais preferivel introduzir um gene especificado por At3g05640. Alem disso, a figura 2 mostra os resuItados da analise por ali-
nhamento com ο uso de um programa de alinhamento de multiplas sequen- cias CLUSTAL W (1.83) (que pode ser usado junto ao DDBJ do National Ins- titute of Genetics (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)) para sequencias de aminoacido codificadas por At1 g03590-AtPP2C6-6, At1 g 16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g 16800, At3g05640, e At5g27930-AtPP2C6-7 (a matriz de substituigao (da sequencia) de aminoacido usada aqui e a matriz padrao, BLOSUM (Blo- cos da matriz da substituipao do aminoacido)).
Isto e, a figura 2 mostra as 3 sequencias consenso na proteina fosfatase 2C codificadas por At1g03590-AtPP2C6-6, Atlg 16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g 16800, At3g05640, e At5g27930-AtPP2C6-7. As regioes chamadas 丨 a "I na figura 2 sao submetidas, junto com um ortologo de um gene da proteina fosfatase 2C derivado de arroz (descrito posteriormente) a uma analise por alinhamento, para que as 3 sequencias consenso que compreendem as sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ 丨D Nos: 1 a 3 acima possam ser definidas com ο as 3 sequencias consenso que compreendem as sequencias de ami- noacido mostradas em SEQ ID N0$: 31’ 32, e 33, respectivamente.
A sequencia consenso mostrada na SEQ ID N0: 31 e, mais es- pecificamente, (L/F)CG(V/I/M)FDGHGXXGXX(V/I)(S/A)(K/R)XV. A sequen- cia consenso mostrada na SEQ ID N0: 32 e, mais especificamente,
SGXT(G/A/S)(V/L)XX(I/V/F/L)XX(G/A)XX(L/V/I)X(I/V/M)(A/G)NXG(D/H)SRA( V/I)(L/'M/I). A sequencid uuiisenso fnostrada na SEQ iD N0: 33 e, mais espe- cificamente,
GLA(M/V)(S/A)R(A/S)(F/L)GDXX(L/I/V)KX(Y/F/H)G(V/L)(I/V)XXP(E/Q/D)(I/V/ F)XXXX(I/L/V)(T/S)XXDX(F/Y)(L/I/V/M)(V/M)LA(T/S>DG(V/I/M)WDX(L/I/M/V) (SyT)NX(E/D)(V/A)XX(l_/V/l)(l/V).
Alem dtsso, nestas sequencias de aminoacido, varios aminoaci- dos entre parenteses representam as possiveis variapoes dos residuos de aminoacido nas posigoes relevantes. Ainda, nestas sequencias de aminoa- cido, "X" significa que qualquer residuo de aminoacido pode estar presente na posi^ao relevante.
Aqui, ο 9° residuo de aminoacido da por^ao terminal N na se- quencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 32 e, com mais preferencia, isoleucina (lie, I), valina (Val, V), ou fenilalanina (Phe, F). Ainda ο 11° resi- duo de aminoacido da por^ao terminal N na sequencia de aminoacido mos- trada em SEQ ID N0: 32 e, com mais preferencia, glutamina (Gln1 Q) ou his- tidina (His, H). Alem disso, ο 13° residuo de aminoacido da porpao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 32 e, com mais pre- ferencia, Iisina (Lys1 K), acido glutamico (Glu, E), serina (Ser, S), glutamina (Gin, Q), acido aspartico (Asp, D), ou asparagina (Asn, N). Aqui1 ο 7° residuo de aminoacido da porgao terminal N na se-
quencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N°: 33 e, com mais preferencia, alanina (Ala, A). Ainda1 ο 8° residuo de aminoacido da porpao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 33 e, com mais preferen- cia, fenilalanina (Phe, F). Alem do mais, ο 11° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 33 e, com mais preferencia, fenilalanina (Phe, F) ou tirosina (Tyr, Y). Adicional- mente, ο 13° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 33 e, com mais preferencia, Ieucina (Leu, L) ou isoleucina (lie, I). Alem disso, ο 15° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 33 e, com mais preferencia, acido aspartico (Asp, D), serina (Ser, S), ou acido
glutamico (Glu, E). Alem disso, ο 20° residuo de aminoacido da por^ao ter- (riinai N na sequencia de aminoacido mostrada na StU ID Nw: ό'ό e, com mais preferencia, serina (Ser, S), alanina (Ala, A), ou cisteina (Cys, C). Adi- cionalmente, ο 27° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequen- cia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 33 e, com mais preferencia, his- tidina (His, H) ou arginina (Arg, R). Alem disso, ο 34° residuo de aminoacido da por^ao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 33 e, com mais preferencia, glutamina (Gin, Q), acido gIutamico (Glu1 E), ou histidina (His, H). Alem disso, ο 36° residuo de aminoacido da por^ao termi- nal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 33 e, com mais preferencia, Ieucina (Leu, L), isoleucina (lie, I), ou valina (VaI, V). Alem disso, ο 47° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoa- cido mostrada na SEQ ID N0: 33 e, com mais preferencia, Ieucina (Leu, L), isoleucina (lie, I), ou valina (VaI, V). Alem disso, ο 50° residuo de aminoacido da porgao terminal N na sequencia de aminoacido mostrada na SEQ ID N0: 33 e, com mais preferencia, Iisina (Lys, K), acido gIutamico (Glu, E), glutami- na (Gin, Q), acido aspartico (Asp, D), ou asparagina (Asn, N).
Como exemplos, a sequencia de nucleotideos da regiao codifi- cante no gene especificado por At3g05640 e mostrada na SEQ ID N0: 4 e a sequencia de aminoacidos da proteina fosfatase 2C codificada pelo gene especificado por At3g05640 e mostrada na SEQ ID N0: 5. Ainda1 a sequen- cia de nucleotideos da regiao codificante no gene especificado por At5g27930 e mostrada na SEQ ID N0: 34 e a sequencia de aminoacidos da proteina fosfatase 2C codificada pelo gene especificado por At5g27930 e mostrada na SEQ ID N0: 35. Alem disso, a sequencia de nucleotideos da regiao codificante no gene especificado por At3g02750 e mostrada na SEQ ID N0: 36 e a sequencia de aminoacidos da proteina fosfatase 2C codificada pelo gene especificado por At3g02750 e mostrada na SEQ ID N°: 37. Alem disso, a sequencia de nucleotideos da regiao codificante no gene especifi- cado por At3g 16800 e mostrada na SEQ ID N0: 38 e a sequencia de amino- acidos da proteina fosfatase 2C codificada pelo gene especificado por At3g 16800 e mostrada na SEQ ID N。： 39.
Adicionalmente, na presente invenpao, genes funcionalmente .C^da-α 々 q.
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equivaientes aos genes mencionados acima podem, tambem, ser introduzi- dos. Aqui, ο termo "gene funcionalmente equivalente" refere-se a, por exem- plo, um gene (de um organismo diferente de Arabidopsis thaliana) que: tem as 3 sequencias consenso (de preferencia, as 3 sequencias consenso com- preendendo as sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID Nos: 31 a 33. O mesmo se aplica aos seguintes) que compreendem as sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID NoS: 1 a 3 nesta ordem a partir da porgao terminal N; e codifica a proteina fosfatase 2C. Ainda1 ο termo "gene funcio- nalmente equivalente" refere-se a um gene que codifica uma proteina que tem atividade de proteina fosfatase 2C. O termo "atividade de proteina fosfa- tase 2C" refere-se a atividade de serina/treonina fosfatase (Ser/Thr fosfata- se) dependente de Mg2+ ou Mn2+. Portanto, pode-se confirmar se um gene codifica ou nao uma proteina que tem atividade de proteina fosfatase 2C pelo exame de se ο produto genico tem ou nao atividade de serina/treonina fosfatase na presenpa de Mg2+ ou Mn2+· Tecnicas convencionalmente co- nhecidas podem ser empregadas de forma apropriada para determinar a atividade de serina/treonina fosfatase. Por exemplo, um kit de determina^ao de atividade comercialmente disponivel ProFluor® Ser/Thr Phosphatase As- say (Promega) pode ser usado. Aqui, os exemplos de organismos diferentes de Arabidopsis tha-
liana nao sao particularmente limitados, mas incluem arroz (Oryza sativa). Especificamente, um exemplo de um gene funcionalmente equivaIente e um gene 0s05g0358500 de arroz. A sequencia de nucleotideo de uma regiao codificante do gene 0s05g0358500 e mostrada na SEQ ID N0: 6 e a se- quencia de aminoacido da proteina codificada pelo gene e mostrada na SEQ ID N°: 7. Ainda, exemplos do gene funcionalmente equivalente derivado de arroz acima mencionado incluem Os11g0109000 (a sequencia de nucleoti- deos e a sequencia de aminoacidos sao mostradas nas SEQ ID Nos: 8 e 9, respectivamente), 0s12g0108600 (a sequencia de nucleotideos e a sequen- cia de aminoacidos sao mostradas nas SEQ ID Nos: 10 e 11, respectivamen- te), 0s02g0471500 (a sequencia de nucleotideos e a sequencia de aminoa-
cidos sao mostradas nas SEQ ID Nos: 12 e 13, respectivamente), 0s04g0321800 (a sequencia de nucieotideos e a sequencia de aminoacidos sao mostradas nas SEQ ID NoS:14 e 15, respectivamente), 0s11g0417400 (a sequencia de nucieotideos e a sequencia de aminoacidos sao mostradas nas SEQ ID N°s:16 e 17, respectivamente), 0s07g0566200 (a sequencia de nucieotideos e a sequencia de aminoacidos sao mostradas nas SEQ ID Nos: 18 e 19, respectivamente), 0s08g0500300 (a sequencia de nucieotideos e a sequencia de aminoacidos sao mostradas nas SEQ ID Nos: 20 e 21, respec- tivamente), 0s02g0224100 (a sequencia de nucieotideos e a sequencia de aminoacidos sao mostradas nas SEQ ID Nos: 22 e 23，respectivamente), e 0s02g0281000 (a sequencia de nucieotideos e a sequencia de aminoacidos sao mostradas nas SEQ ID Nos: 40 e 41, respectivamente).
Alem disso, exemplos dos genes funcionalmente equivaIentes acima mencionados de plantas diferentes de Arabidopsis thaliana e de arroz incluem os genes (N0 de acesso na base de dados UniProt A9P973, A9PFS0, e A9P7U4) de Choupo-do-Canada preto (Populus trichocarpa), os genes (N0 de acesso na base de dados UniProt A7PRZ8, A7Q8H4, A7PV59, A5C3B0, A5BF43, A7QFG6, A7P4H7, A5C0C9, A5AP53, A7QQF9, e A5BDP5) da uva europeia (Vitis vinifera), genes (N° de acesso na base de dados UniProt Q2HW33 e Q4L0F8) de Medicago truncatula (Medicago trun- catula), um gene (N0 de acesso da base de dados do GenBank AY651248) de aIfafa (Medicago sativa), genes (Nos de acesso na base de dados UniProt A9SE70, A9SE69, e A9RFU1) de Physcomitrella patens (Physcomitrella pa- tens), um gene (N° de acesso na base de dados UniProt 2511453C) de bar- rilha (Mesembryanthemum crystallinum), um gene (N0 de acesso na base de dados UniProt A8HQG8) de Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas reinhardtii), os genes (N0 de acesso na base de dados do GenBank BT024031, BT017414, e BT024134) de milho (Zea mays), genes (N0 de a- cesso na base de dados do GenBank AC189312 e AC189579) de colza (Brassica rapa), os genes (N° de acesso na base de dados do GenBank AP009550, AP009302, e AP009278) de tomate (Solanum lycopersicum), um gene (N0 de acesso na base de dados do GenBank AC 182571) de mimulus
(Mimulus guttatus), e um gene (N° de acesso na base de dados do GenBank AP006489) de alga veimelha (iiuiiuoeiuiaf (Cyanidioschyzon meroiae)
Nestas ρIantas diferentes de Arabidopsis thaliana, que sao re- presentadas pelos exemplos acima, um gene que codifica a proteina fosfa- tase 2C que tem as 3 sequencias consenso que compreendem as sequen- cias de aminoacido mostradas nas SEQ ID N°s: 1 a 3 nesta ordem a partir da porgao terminal N podem ser faciImente buscadas e/ou identificadas a partir de uma bases de dados conhecida, tal como GenBank1 com base na sequencia de nucleotideos Iistada acima do gene da proteina fosfatase 2C derivado de Arabidopsis thaliana ou na sequencia de aminoacidos da protei- na fosfatase 2C.
Alem disso, um gene da proteina fosfatase 2C a ser introduzido na presente invengao nao e Iimitando aos genes da proteina fosfatase 2C descritos acima que compreendem as sequencias de nucleotideo e as se- quencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID Nos: 4 a 23 e 34 a 39. Entao, ο gene da proteina fosfatase 2C pode ser um gene que contem uma se- quencia de aminoacido que tem uma delegao, uma substitui^ao, uma adigao ou uma inser^ao de um ou uma variedade de aminoacidos com relapao as sequencias de aminoacido mostradas nos nitmeros impares das SEQ ID Nos: 4 a 23 e 34 a 39，e, que tem atividade de proteina fosfatase 2C. Aqui, ο termo "uma variedade de aminoacidos" refere-se a 1 a 20, de preferencia, 1 a 10，com mais preferencia, 1 a 7, ainda de preferencia, 1 a 5, e particular- mente de preferencia 1 a 3 aminoacidos, por exemplo. Alem disso, a dele- pao, substituipao, ou adipao de aminoacidos pode ser realizada pela altera- gao de uma sequencia de nucleotideos que codifica ο gene da proteina fos- fatase 2C acima por uma tecnica conhecida na tecnica. Uma muta^ao pode ser introduzida em uma sequencia de nucleotideo por uma tecnica conheci- da, tal como ο metodo de Kunkel ou ο metodo de "Gapped duplex" ou um metodo baseado nos mesmos. Por exemplo, uma mutapao e introduzida com um kit de mutagenese com ο uso de mutagenese sitio-dirigida (por e- xemplo, Mutant-K ou Mutant-G (ambos sao nomes comerciais da TAKARA Bio)) ou similares, ou um LA PCR in vitro Mutagenesis series kit (nome co-
mercial, TAKARA Bio). Adicionalmente, um metodo de mutagenese pode ^d3V / ‘
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ser: um metodo que usa uiii agente de mutagao quimica representado peto EMS (metanossulfonato de etila), 5-bromouracila, 2-aminopurina, hidroxila- mina, N-metil-N'-nitro-N nitrosoguanidina, ou outros compostos carcinogeni- cos; ou um metodo que envolve tratamento com radiagao ou tratamento com ultravioleta [UV] tipicamente com ο uso de raios X, raios alfa, raios beta, rai- os gama, um feixe de ions, ou similares.
Ainda1 os genes da protein a fosfatase 2C a serem introduzidos na presente inven^ao podem ser genes homologos aos genes da protein a fosfatase 2C que compreendem as sequencias de nucleotideo e as sequen- cias de aminoacido mostradas nas SEQ ID Uo5A a 23. Aqui, ο termo "gene homologo" geralmente refere-se a um gene que se ramificou evolutivamente a partir de um gene ancestral comum, incluindo um gene homologo (ortolo- go) de 2 tipos de especies e um gene homologo (paralogo) gerado por rami- ficagao por sobreposi^ao que ocorre dentro da mesma especie. Em outras palavras, ο termo acima "gene funcionalmente equivalente" refere-se a um gene homologo, tal como’ um ortologo ou um paralogo. Alem disso, ο termo acima "gene funcionalmente equivalente" pode, tambem referir-se a um ge- ne que nao evolui a partir de um gene em comum, mas apenas tem fungoes analogas.
Exemplos de genes analogos aos genes da proteina fosfatase
2C que compreendem as sequencias de nucleotideo e as sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID N°s: 4 a 23 e 34 a 39 incluem genes que codificam proteinas que tem: sequencias de aminoacido que possuem 70% ou mais, de preferencia, 80% ou mais, com mais preferencia 90% ou mais, e, com a maxima preferencia, 95% ou mais similaridade a estas sequencias de aminoacido; as 3 sequencias consenso que compreendem as sequencias de aminoacido mostradas nas SEQ ID NoS: 1 a 3 nesta ordem a partir da porpao terminal N; e atividade de proteina fosfatase 2C. Aqui1 ο valor de si- milaridade refere-se a um valor que pode ser encontrado com base nos ajus- tes padrao com ο uso de um computador equipado com um programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) e uma base de dados contendo
informagoes sob re a sequencia do gene. / w . í Jf ■ */. -
Adicionalmente, genes análogos aos genes cia proteína fosfata- se 2C que compreendem as seqüências de nucleotídeo e as seqüências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NoS:4 a 23 e 34 a 39 podem ser identifi- cados, quando as informações sobre o genoma da planta permanecer não esclarecido, através da extração do genoma a partir de uma planta-alvo, ou construção de uma biblioteca de cDNA para uma planta-alvo e, então, iso- lamento de uma região genômica ou cDNA que hibridiza sob condições es- tringentes a pelo menos uma porção dos genes da proteína fosfatase 2C que compreendem as seqüências de nucleotídeo mostradas nos números pares das SEQ ID Nos: 4 a 23 e 34 a 39. Aqui, o termo "condições estringen- tes" refere-se às condições sob as quais um híbrido específico é formado, mas um híbrido inespecífico nunca é formado. Por exemplo, estas condições compreendem hibridização a 45°C com 6X SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio), seguido de lavagem a 50°C até 65°C com 0,2 a 1X SSC e 0,1% de SDS. Alternativamente, estas condições compreendem hibridização a 65°C a 70°C com 1X SSC1 seguido de lavagem a 65°C até 70°C com 0,3X SSC. A hibridização pode ser realizada por um método convencionalmente conheci- do, tal como um método descrito em J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Quando a presente invenção é aplicada a uma planta, a planta
terá uma quantidade significativamente aprimorada de biomassa e/ou se- mentes em comparação com as plantas do tipo selvagem, como um resulta- do da introdução de um gene da proteína fosfatase 2C que tem 3 seqüên- cias consenso descritas acima, que compreendem as seqüências de amino- ácido mostradas nas SEQ ID NoS:1 a 3 a partir da porção terminal N nesta ordem. Exemplos de uma técnica para a introdução deste gene da proteína fosfatase 2C incluem uma técnica para modificação de um promotor de um gene da proteína fosfatase 2C endógeno em uma planta-alvo, uma técnica para introduzir um vetor de expressão no qual um gene da proteína fosfatase 2C exógeno é disposto sob o controle de um promotor que permite expres- são constitutiva, e uma técnica pela qual as duas técnicas acima são reali- zadas simultaneamente. Uni exemplo preferenciai é uma técnica para introduzir um vetor de expressão no qual o gene da proteína fosfatase 2C acima é disposto sob o controle de um promotor que permite expressão constitutiva em uma plan- ta-a Ivo.
Vetor de Expressão
Um vetor de expressão é construído para conter um promotor que permite expressão dentro de uma planta e o gene da proteína fosfatase 2C descrito acima. Como um vetor que serve como um corpo mãe para um vetor de expressão, vários vetores convencionalmente conhecidos podem ser usados. Por exemplo, plasmídios, fagos, cosmídios ou similares, podem ser usados e este vetor pode ser adequadamente selecionado dependendo das células de planta nas quais ele é introduzido e dos métodos de introdu- ção. Exemplos específicos deste vetor incluem os vetores pBR322, pBR325, pUC19, pUC119, pBluescript, pBluescriptSK, e pBI. Particularmente, quando um método para a introdução de um vetor em uma planta usa Agrobacteri- um, um vetor binário pBI é, de preferência, usado. Exemplos específicos deste vetor binário pBI incluem pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, e pBI221.
Um promotor a ser usado aqui não é particularmente limitado, contanto que ele permita a expressão de um gene da proteína fosfatase 2C em uma planta. Qualquer promotor conhecido pode ser apropriadamente usado. Exemplos deste promotor incluem um promotor 35S do vírus do mo- saico da couve-flor (CaMV35S), vários promotores do gene da actina, vários promotores do gene de ubiquitina, um promotor do gene de nopalina sintase, um promotor do gene PR1a de tabaco, um promotor do gene da subunidade pequena de ribulose 1,5-bifosfato carboxilase-oxidase de tomate, um promo- tor do gene de napina e um promotor do gene de oleosina. Destes, um pro- motor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, um promotor do gene da acti- na, ou um promotor do gene de ubiquitina podem ser usados com mais pre- ferência. O uso de cada um dos promotores acima permite forte expressão de qualquer gene quando ele é introduzido nas células de planta.
Adicionalmente, um promotor que tem funções de causar ex- pressão sítio-específica em uma planta pode também ser usado na presente
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invenção. Qualquer promotor convencionaímeníe conhecido pode ser usado como este promotor. Quando o gene da proteína fosfatase 2C descrito aci- ma é introduzido de forma sítio-específica com o uso deste promotor, um órgão da planta no qual o gene é introduzido pode ser mais aumentado do que os órgãos das plantas do tipo selvagem.
Além disso, um vetor de expressão pode, ainda, conter outros segmentos de DNA em adição ao promotor e ao gene da proteína fosfatase 2C acima. Estes outros segmentos de DNA não são particularmente limita- dos e exemplos destes incluem um terminador, um marcador de seleção, um intensificador, e uma seqüência de nucleotídeo para acentuar a eficiência da tradução. Além disso, o vetor de expressão recombinante acima pode, ain- da, ter uma região de T-DNA. Uma região de T-DNA pode acentuar a efici- ência da introdução do gene particularmente quando o vetor de expressão recombinante acima é introduzido em uma planta com o uso de Agrobacteri- um.
Um terminador de transcrição não é particularmente limitado, contanto que ele tenha funções como um sítio de término de transcrição e possa ser qualquer terminador de transcrição conhecido. Por exemplo, es- pecificamente, uma região de terminação de transcrição de um gene de no- palina sintase (terminador Nos), uma região de terminação de transcrição de vírus do mosaico da couve-flor 35S (terminador de CaMV35S), ou similares podem ser preferivelmente usados. Destes, o terminador Nos pode ser usa- do com mais preferência. No caso do vetor recombinante acima, uma fenô- meno, tal como um transcrito desnecessariamente comprido ser sintetizado e um promotor forte diminuir os números de cópias de um plasmídio após a introdução em células de planta, pode ser evitado por colocar um terminador de transcrição em uma posição adequada .
Como um marcador de seleção transformante, um gene de re- sistência a medicamentos pode ser usado, por exemplo. Exemplos específi- co deste gene de resistência a medicamentos incluem genes de resistência a medicamentos contra higromicina, bleomicina, canamicina, gentamicina, cloranfenicol, e similares. As plantas transformadas podem ser facilmente 28 fr /
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selecionadas através da seleção de plantas que podem crescer em meio contendo os antibióticos acima.
Um exemplo de uma seqüência de nucleotídeo para aumentar a eficiência da tradução é uma seqüência ômega do vírus do mosaico do ta- baco. Esta seqüência ômega é disposta em uma região não traduzida (5'UTR) de um promotor, para que a eficiência de tradução do gene de fusão possa ser aumentada. Como tal, o vetor de expressão recombinante pode conter vários segmentos de DNA dependendo das finalidades.
Um método para construir um vetor de expressão recombinante não é particularmente limitado. A um vetor adequadamente selecionado que serve como um corpo mãe, o promotor acima e o gene da proteína fosfatase 2C acima, e se necessário, os outros segmentos de DNA acima podem ser introduzidos em uma ordem predeterminada. Por exemplo, o gene da proteí- na fosfatase 2C acima e um promotor (e, se necessário, um terminador de transcrição ou similares) são ligados para construir um cassete de expressão e, então, o cassete pode ser introduzido em um vetor Na construção de um cassete de expressão, por exemplo, sítios de clivagem de segmentos de DNA são preparados para ter extremidades protuberantes complementares entre si e, então, uma reação é realizada com uma enzima de ligação, tor- nando possível especificar a ordem dos segmentos de DNA. Além disso, quando um cassete de expressão contém um terminador, os segmentos de DNA podem ser dispostos na seguinte ordem a partir da região à montante: um promotor, o gene da proteína fosfatase 2C acima, e um terminador. Ain- da, reagentes para a construção de um vetor de expressão (isto é, tipos de enzimas de restrição, enzimas de ligação, e similares) também não são par- ticularmente limitados. Então, reagentes comercialmente disponíveis podem ser adequadamente selecionados e usados.
Ainda, um método para replicação (um método para produção) do vetor de expressão acima não é particularmente limitado e métodos de replicação convencionalmente conhecidos podem ser usados na presente invenção. Em geral, este vetor de expressão pode ser replicado dentro de Escherichia coli como um hospedeiro. Neste momento, tipos preferenciais de
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Eschenohia vuli podem ser selecionados dependendo dos tipos de vetor. Transformação
O vetor de expressão descrito acima é introduzido em uma plan- ta-alvo por um método de transformação geral. Um método para introduzir um vetor de expressão em células de planta (método de transformação) não é particularmente limitado. Métodos de introdução apropriados convencio- nalmente conhecidos podem ser usados dependendo das células de planta. Especificamente, um método que usa Agrobacterium ou um método que en- volve a introdução direta nas células de planta pode ser usado, por exemplo. Como um método que usa Agrobacterium, um método descrito em Bechtold, E., Ellis, J. e Pelletier1 G. (1993) In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sei. Paris Sei. Vie, 316, 1194-1199., ou um método descrito em Zyprian E1 Kado Cl, Agro- bacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunc- tion with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256, podem ser empregados, por exemplo.
Como um método para introduzir diretamente um vetor de ex- pressão em células de planta, microinjeção, eletroporação, um método com polietileno glicol, um método com arma de partículas, fusão de protoplasto, um método com fosfato de cálcio, ou similares, podem ser empregados.
Ainda, quando um método para introduzir diretamente DNA nas células de planta é empregado, o DNA que pode ser usado aqui contém uni- dades transcricionais necessárias para a expressão de um gene-alvo, tal como, um promotor e um terminador de transcrição, e um gene-alvo. As fun- ções do vetor não são essenciais neste caso. Além disso, um DNA que con- tém somente uma região codificante de proteína de um gene-alvo e não tem unidade transcricional, pode ser usado aqui, contanto que ele seja integrado em uma unidade transcricional do hospedeiro e, então, o gene-alvo pode ser expresso.
Exemplos de células de planta nas quais o vetor de expressão
acima ou um cassete de expressão que não contém um vetor de expressão, mas sim um gene-alvo, é introduzido incluem células de cada tecido de ór- 30 «? ^
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yãus de planta, tais como fiores, foihas, e raízes, calos, e céiuias cultivadas em suspensão. Neste momento, um vetor de expressão adequado pode ser construído de acordo com os tipos de planta a ser produzidas ou um vetor de expressão versátil pode ser construído antecipadamente e, então, intro- duzido nas células de planta.
As plantas nas quais um vetor de expressão é introduzido ou, em outras palavras, as plantas necessárias para aumentar a produção de bíomassa não são particularmente limitadas. Especificamente, através da introdução do gene da proteína fosfatase 2C descrito acima, os efeitos de aumentar a produção de biomassa podem ser esperados para todas as plan- tas. Exemplos de plantas-alvo incluem, mas não se limitam a, dicotiledôneas e monocotiledôneas, tais como plantas que pertencem às famílias Brassica- ceae, Gramineae, Solanaceae, Leguminosae, Salicaceae, e similares (vide abaixo).
Família Brassicaceae: Arabidopsis thaliana (.Arabidopsis thalia-
na), colza (Brassica rapa, Brassica napus, Brassica campestris), repolho (,Brassiea oieraeea var. eapitata), repolho chinês (Brassiea rapa var. peki- nensis), ging-geng-cai (Brassica rapa var. ehinensis), nabo (Brassiea rapa var. rapa), nabo (Brassiea rapa var. hakabura), erva mostarda (Brassiea rapa var. laneinifolia), Komatsuna (Brassiea rapa var. peruvirídis), pak choi (Bras- siea rapa var. ehinensis), rabanete (Raphanus sativus), raiz-forte (Wasabia japoniea), e similares.
Família Solanaceae: tabaco (Nieotiana tabaeum), berinjela (So- Ianum melongena), batata (Solaneum tuberosum), tomate (Lyeopersieon Iy- eopersieum), pimentão (Capsieum annuum), petunia, e similares.
Família Leguminosae: soja (Glycine max), ervilha (Pisum sati- vum), fava (Vicia faba), glicínia (Wisteria floribunda), amendoim (Araehis hy- pogaea), cornichão (Lotus eornieulatus var. japonieus), feijão comum (Ph a- seolus vulgaris), feijão azuki (Vigna angularis), acácia, e similares. Família Asteraceae: crisântemo (Chrysanthemum morifolium), gi-
rassol (Helianthus annuus), e similares.
Família Arecaceae: palmeira de óleo (Elaeis guineensis, Elaeis V ' 31
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oleifera), υουυ (Colos nuuifeia), tamareira (Phoenix àactyitfera), copernicia, e similares.
Família Anacardiaceae: árvore de cera (Rhus succedanea), cas- tanha de caju (.Anacardium occidentale), árvore da Iaca (Toxicodendron ver- nicifluum), manga (Mangifera indica), pistache (Pistacia vera), e similares.
Família Cucurbitaceae: abóbora (Cucurbita maxima, Cucurbita mosehata, Cueurbita pepo), pepino (Cueumis sativus), abóbora serpente (Triehosanthes eueumeroides), abóbora (Lagenaria steeraria var. gourda), e similares.
Família Rosaceae: amêndoa {,Amygdalus eommunis), rosa (Ro-
sa), morango (Fragaria), cereja (Prunus), maçã (Malus pumila var. domesti- ca), e similares.
Família Caryophyllaceae: cravo (Dianthus caryophyllus) e simila- res.
Família Salicaceae: choupo (Populus triehocarpa, Populus nigra,
ou Populus tremula) e similares.
Família Gramineae: milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa), ce- vada (Hordeum vulgare), trigo (Triticum aestivum), bambu (PhyIIostachys), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), capim-napiê (Pennisetum pupu- reum), erianthus (Erianthus ravenae), miscanthus (Japanese silver grass) (Miseanthus virgatum), sorgo (Sorghum) e gramínea do tipo switch grass {Panieum), e similares.
Família Liliaceae: tulipa (Tulipa), lírio (Lilium), e similares.
Destes exemplos, cultivos para geração de energia, tais como cana-de-açúcar, milho, colza, e girassol, que podem servir como matérias- primas para biocombustíveis, podem ser alvos preferíveis. Isto é porque os custos para o biocombustíveis, tal como, bioetanol, biodiesel, biometanol, bioDME, bioGTL (BTL), e biobutanol podem ser reduzidos mediante o au- mento da produção de biomassa com o uso de cultivos para geração de e- nergia.
Ainda, conforme descrito acima, os genes da proteína fosfatase 2C que podem ser usados na presente invenção podem ser isolados de vá- <
rias plantas e usados. Estes genes da proteína fosfatase 2C podem ser ade- quadamente selecionados e usados, dependendo dos tipos de planta alvo necessárias para aumentar a produção de biomassa. Especificamente, quando uma planta que se deseja aumentar a produção de biomassa é uma monocotiledônea, um gene da proteína fosfatase 2C que é isolado de uma monocotiledônea é, de preferência, introduzido. Em particular, quando uma planta que se deseja aumentar a produção de biomassa é arroz, o gene da proteína fosfatase 2C derivado de arroz (SEQ ID N°: 6) é, de preferência, introduzido.
Além disso, na presente invenção, mesmo quando uma planta
que se deseja aumentar a produção de biomassa é uma monocotiledônea, um gene da proteína fosfatase 2C derivado de dicotiledônea pode ser intro- duzido. Especificamente, por exemplo, o gene da proteína fosfatase 2C deri- vado de Arabidopsis thaiiana (SEQ ID N0: 4) pode ser introduzido não ape- nas em dicotiledôneas, mas também em uma variedade de plantas que são classificadas como monocotiledôneas. Outras etapas e métodos
Após a transformação acima, uma etapa de seleção dos trans- formantes apropriados a partir das plantas pode ser realizada por um méto- do convencionalmente conhecido. Este método de seleção não é particular- mente limitado. Por exemplo, a seleção pode ser feita com base em resis- tência a medicamentos, tal como, resistência à higromicina. Alternativamen- te, após o crescimento dos transformantes, as plantas são pesadas direta- mente ou qualquer um dos seus órgãos ou tecidos são pesados, e os pesos são comparados com os das plantas do tipo selvagem, e, então, as plantas com pesos significativamente aumentados podem ser selecionadas.
Ainda, plantas de progênie podem ser obtidas a partir das plan- tas transformadas obtidas pela transformação de acordo com um método convencional. As plantas de progênie que retém uma característica, tal que o nível de expressão do gene da proteína fosfatase 2C acima é significativa- mente aprimorado em comparação com as plantas do tipo selvagem, são selecionadas com base na quantidade de biomassa. Portanto, uma linhagem 33
de planta estável capaz de produzir uma quantidade aumentada de biomas- sa por ter a característica acima pode ser produzida. Ainda, as células de planta ou materiais reprodutivos, tais como, sementes, frutas, estoques, ca- los, tubérculos, espigas cortadas, ou agregados, podem ser obtidos a partir de uma planta transformada ou uma planta descendente da mesma. Uma linhagem de planta estável capaz de produzir uma quantidade aumentada de biomassa por ter a característica acima pode ser produzida em massa com base nestes materiais.
a produção da biomassa e/ou sementes de plantas (já capazes de exercer produção de biomassa e/ou sementes por planta significativamente aumen- tada) pode ser aumentada ainda mais em comparação às plantas do tipo selvagem através da introdução do gene da proteína fosfatase 2C descrito acima. Especificamente, quando a glutationa é fornecida a uma planta na qual o gene da proteína fosfatase 2C acima foi introduzido, a produção de biomassa e/ou sementes por planta é significativamente aumentada, em comparação a um caso no qual a glutationa não foi fornecida à planta. Aqui, o termo "produção de biomassa significativamente aumentada" refere-se a uma situação na qual o peso total de cada planta é estatisticamente signifi- cativamente aumentado quando a glutationa é suprida à planta na qual o gene da proteína fosfatase 2C acima foi introduzido. Nesse caso, mesmo quando alguns tecidos de planta se tornam especificamente grandes e os tamanhos dos outros tecidos são equivalentes aos das plantas às quais não foi fornecida glutationa, conclui-se que a quantidade de biomassa é aumen- tada caso o peso total da planta inteira seja maior. Ainda, o termo "produção de sementes significativamente aumentada" refere-se a uma situação na qual a quantidade total e/ou o número total de sementes colhidas de uma planta é estatisticamente significativamente maior em comparação às plan- tas às quais não foi fornecida glutationa. Isto é, o termo "produção de se- mentes significativamente aumentada" pode se referir a qualquer dentre: um caso no qual o tamanho de cada semente é aumentado; um caso onde o tamanho por semente é equivalente, mas o número de sementes é aumen-
Conforme explicado acima, de acordo com a presente invenção, tado, ou urn caso no quaí o tamanho por semente é aumentado e os núme- ros de sementes também é aumentado.
De acordo com a presente invenção, a produção de biomassa e/ou sementes pelas plantas é aumentada. Então, o aprimoramento na pro- dutividade pode ser obtido nos seguintes casos: um caso no qual um objeti- vo é produzir a planta inteira; e um caso no qual um objetivo é produzir al- guns tecidos da planta (por exemplo, sementes) ou componentes contidos nas plantas. Por exemplo, quando um objetivo é produzir gorduras e óleos contidos em sementes de plantas, as quantidades de gorduras e óleos que podem ser coletadas por área sob cultivo podem ser muito melhoradas. A- qui, exemplos de gorduras e óleos incluem, mas não são particularmente limitados a, gorduras e óleos derivados de plantas, tais como óleo de soja, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de coco, óleo de arroz, óleo de caroço de algodão, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de açafrão, e óleo de se- mente de colza. Adicionalmente, as gorduras e óleos assim produzidos po- dem ser amplamente usados para usos domésticos ou usos industriais e podem ser usados adicionalmente como matérias-primas para combustível biodiesel. Portanto, de acordo com a presente invenção, as gorduras e óleos acima para usos domésticos ou usos industriais, combustível biodiesel, e similares podem ser produzidas em baixo custo por fornecer glutationa às plantas que expressam o gene da proteína fosfatase 2C acima. Exemplos
A presente invenção será especificamente descrita nos seguin- tes exemplos de referência e exemplos. Entretanto, os exemplo não se des- tinam a limitar o escopo técnico da presente invenção. Exemplo de referência 1
Preparação de transformantes (.Arabidopsis thaliana) através da introdução do gene de PP2C (proteína fosfatase 2C) (At3g05640) 1. Materiais e Métodos 1-1. Materiais experimentais
Como materiais experimentais, sementes de mutantes de Arabi- dopsis thaliana (linhagens de T-DNA com marcador de ativação: linhagens VTi f f
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Weigel T-DNS, Totai de 200/2 linhagens) foram usadas. Além disso, as se- mentes foram compradas junto à Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC). Com relação às sementes usadas como materiais experimentais, pode ser feita referência a Weigel, D. et ai, 2000, Plant Physiol. 122, 1003- 1013.
1-2. Métodos
1-2-1. Seleção de mutantes resistentes a sal
Sementes das linhagens de T-DNA Weigel foram cultivadas as- septicamente em meio de ágar (1%) MS modificado contendo 125 mM ou 150 mM de NaCI [vitaminas em meio B5, 10 g/l de sacarose, e 8 g/L de ágar (para meio bacteriano; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] e, então, culti- vadas a 22°C sob 30 a 100 mmols/m2/seg de iluminação (um ciclo de 16 ho- ras na luz/8 horas no escuro). Duas a 4 semanas após a semeadura, candi- datos mutantes resistentes a sal foram selecionados. Além disso, com rela- ção ao meio MS, vide Murashige, T. et ai, 1962, Physiol. Plant. 15, 473-497. Ainda, com relação ao meio B5, vide Gamborg, O. L. et a/., 1968, Experi- mental Cell Research 50, 151-158. 1-2-2. Preparação de DNA
Um local para inserção de T-DNA no genoma da linhagem de Arabidopsis thaiiana resistente a sal assim selecionada foi determinada por um método de TAIL-PCR. Primeiro, folhas jovens foram coletadas a partir das plantas de Arabidopsis thaiiana cultivadas e, então, esmagadas sob congelamento com nitrogênio líquido. O DNA foi preparado com o uso de um kit de preparação de DNA (DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN) de acordo com os protocolos padrão incluídos com o kit.
1-2-3. Método de TAIL-PCR e previsão do sítio de inserção de T-DNA
Foi determinado que três (3) tipos de iniciadores específicos, TL1, TL2, e TL3, estariam localizados próximo da seqüência de T-DNA es- querda (borda esquerda de T-DNA) de um vetor de marcação de ativação (pSKI015: n° de Acesso no Genbank AF187951) usado nas linhagens de T- DNA de Weigel. Com o uso de um iniciador arbitrário P1 e das seguintes soluções de reação de PCR e condições de reação, o TAIL-PCR (superviso- J rtp Tt "é,
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res, Isao Shimamoto e Takuji Sasaki, Nova Edição, Plant PCR Experimental Protocols, 2000, pp. 83-89, Shujunsha, Tóquio, Japão; Liu1 Y.G. e Whttier, R. F., 1995, Genomics 25, 674-681; Liu1 Y.G. et ai., PIantJ., 8, 457^63, 1995) foi realizada, para que o DNA genômico adjacente ao T-DNA fosse amplifi- cado.
As seqüências específicas dos iniciadores TL1, TL2, TL3, e P1 são as seguintes.
TL1: 5'-TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3'(SEQ ID
N0: 24)
TL2: 5-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3'(SEQ ID N0:
25)
TL3: 5'-TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C-3'(SEQ ID N°: 26) P1: 5-NGT CGA SWG ANA WGA A-3' (SEQ ID N°: 27) Além disso, na SEQ ID N°: 25, "n" representa "a," "g," "c," ou T (locais: 1 e 11), "s" representa "g" ou "c" (local: 7), e "w" representa "a" ou Ύ (local: 8 e 13).
A composição da solução e condições de reação da 1a reação de PCR são mostradas na tabela 1 e na tabela 2, respectivamente. Tabela 1
Molde (DNA genômico) : 10 ng
tampão de PCR 10X (Takara Bio) : 2 μΙ
2,5 mM de dNTPs (Takara Bio) : 1,6 μΙ
1o iniciador específico (TL1: SEQ ID N0: 24) : 0,5 pmol
Iniciador arbitrário 1 (SEQ ID N0: 27) : 100 pmols
TaKaRa Ex Taq (Takara Bio)_: 1,0 unidade
TOTAL 20 μΙ
20 Tabela 2
N0 1: 94°C (30 segundos)/95°C (30 segundos) N0 2; 5 ciclos de 94°C (30 segundos)/65°C (30 segundos)/72°C (1 minuto) N0 3: 1 ciclo de 94°C (30 segundos)/25°C (1 minuto) aumentado para 72°C dentro de 3 minutos/72°C (3 minutos) N0 4: 94°C (15 segundos)/65°C (30 segundos)/72°C (1 minuto), 94°C {15 segundos)/68°C (30 segundos)/72°C (1 minuto), e 15 ciclos de 94°C (15 segundos)/44°C (30 segundos)/72°C (1 minuto) N0 5: 72°C (3 minutos)
A composição da solução de reação e as condições de reação
da 2a reação de PCR são mostradas na tabela 3 e tabela 4, respectivamen- te.
Tabela 3
Molde (diluição de 50 vezes do 1o produto de PCR) 1 μΙ Tampão de PCR 10X (TaKara Bio) 2μΙ 2,5 mM de dNTPs (Takara Bio) 1,5 μΙ 2o iniciador específico (TL2: SEQ ID N°: 25) 5 pmols Iniciador arbitrário 1 (SEQ ID N0: 27) 100 pmols TaKaRa Ex Taq (Takara Bio) 0,8 unidade TOTAL 20 μΙ
Tabela 4
N0 6: 94°C (15 segundos)/64°C (30 segundos)/72°C (1 minuto), 940C (15 segundos)/64°C (30 segundos)/72°C (1 minuto), e 12 ciclos de 94°C (15 segundos)/44°C (30 segundos)/72°C (1 minuto) N0 5: 72°C (5 minutos)
A composição da solução e as condições da reação da 3a rea- ção de PCR são mostradas na tabela 5 e na tabela 6, respectivamente. Tabela 5
Molde (diluição 50 vezes do 2o produto de PCR) tampão de PCR 10X (Takara Bio) 2,5 mM de dNTPs (Takara Bio) 3o iniciador específico (TL3: SEQ ID N0: 26) Iniciador arbitrário 1 (SEQ ID N0: 27) TaKaRa Ex Taq (Takara Bio) TOTAL 50 μΙ
Tabela 6
N0 7: 20 ciclos de 94°C (30 segundos)/44°C (30 segundos)/72°C (1 mi- nuto) N0 5: 72°C (3 minutos)
Subseqüentemente, o 2o e o 3o produtos de reação foram subme- tidos a eletroforese em gel de agarose e, então, a presença ou a ausência de amplificação e a especificidade dos produtos de reação foram confirmadas. Ainda, os 3o produtos de amplificação foram submetidos a uma reação de se- quenciamento usando diretamente um kit BigDye Terminator Cycle Sequen- cing Kit Ver. 3.1 (Applied Biosystems) e o iniciador específico TL3. Desta for- ma, uma seqüência de nucleotídeo foi determinada com o uso de um ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Como um resultado, informações sobre a seqüência de 498 bp foram obtidas (SEQ ID N0: 28).
O Arabidopsis Information Resource (TAIR: http: //www.arabidopsis.org/) foi submetido a uma pesquisa BLAST para a se- qüência assim obtida. Desta forma, o sítio de inserção foi observado ser o gene de [AGI (código de gene Arabidopsis Genome Initiative) código: At3g05630] do cromosso 3 de Arabidopsis thafiana. 1-2-4. Previsão dos genes ativados
Os genes ativados foram previstos a partir da seqüência de gene de fase aberta de leitura (ORF) presumida existente dentro de uma faixa de 10-Kb próxima do sítio de inserção de T-DNA (At3g05630) revelado em 1-2-3.
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: 1 μ| : 5 μΐ : 0,5 μΙ : 10 pmols : 100 pmols : 1,5 unidade / V 39 * y-í \
; 13---■ Jr-
í **
1-2-5. Obtenção dos genes previstos
Para amplificação de um fragmento contendo a região da ORF do gene PP2C (proteína fosfatase 2C) (At3g05640) que é previsto estar ati- vado em 1-2-4, os iniciadores de PCR 5640PF1 e 5640PR1 foram desenha- dos e sintetizados com base na informação de seqüência apresentada em TAIR (http://www.arabidopsis.org/home.html). Além disso, estes iniciadores foram desenhados para que um sítio de enzima de restrição (BsrG I ou SaS I) necessário para a introdução nos vetores de expressão fosse adicionado à terminação de cada iniciador. 5640PF1 (SEQ ID N°: 29):
5'-ACG CGT CGA CAT GGG ACA TTT CTC TTC CAT GTT CAA CGG-3' 5640PR1 {SEQ ID N°: 30):
5'-TGT ACA TGT ACA CTA TAG AGA TGG CGA CGA CGA TGA AGA ATG G-31
De acordo com o método descrito em 1-2-2, um DNA molde foi preparado a partir de Arabidopsis thaliana ecotipo Col-O selvagem. A DNA polimerase de alta fidelidade Phusion (New England BioLabs: NEB) foi usa- da como uma enzima e os 5640PF1 e 5640PR1 acima foram usados como iniciadores. A composição da solução e condições de reação da reação de PCR relevante são mostradas na tabela 7 e na tabela 8, respectivamente. Tabela 7
Molde (DNA genômico) : 60 ng
Tampão HF IOX(NEB) : 5 μΙ
IOmMdedNTPs(NEB) : 1,0 μΙ
Cada iniciador : 20 pmol
DNA polimerase de alta fidelidade Phusion_:1,0 unidade
TOTAL 50 μΙ
Tabela 3 N0 1: 98°C (30 segundos) N0 2: 15 ciclos de 98°C (10 segundos)/55°C (30 segundos)/72°C (30 segundos) N0 5: 72°C (IOminutos) Os produtos da amplificação por PCR foram submetidos a ele- troforese com gel de agarose a 2% (tampão TAE) e, então, os fragmentos foram corados com brometo de etídio. Um gel contendo fragmentos-alvo foi cortado com o uso de um bisturi. Os fragmentos de DNA-aivo foram eluídos e purificados com o uso de um kit de purificação de banda de gel (Amer- sham) e de DNA de PCR GFX. Adenina foi adicionada ao fragmento de DNA assim obtido com o uso de um kit de A-Addition Kit (QIAGEN). O DNA ampli- ficado ao qual a adenina foi adicionada foi ligado a um vetor de clonagem TA pCR2.1 com o uso de um kit de clonagem TOPO TA Cloning kit (invitrogen) e, então, transformado em células competentes (E coli TOP 10) incluídas com o kit. Após a transformação, as células foram cultivadas em meio LB suplementado com 50 μΙ/ml de canamicina e, então, os transformantes fo- ram selecionados. As colônias que apareceram foram submetidas à cultura líquida em meio LB suplementado com 50 μΙ/ml de canamicina. O DNA do plasmídio foi preparado a partir dos micro-organismos assim obtidos com o uso de um kit Plasmid Mini Kit (QIAGEN). O fragmento assim obtido conten- do ORF do gene de PP2C (proteína fosfatase 2C) (At3g05640) foi clonado em um vetor, seguido da determinação das seqüências de nucleotídeo e análise de seqüências. 1-2-6. Construção de vetor de expressão de planta
Um fragmento contendo a ORF do gene de PP2C (proteína fos- fatase 2C) (At3g05640) foi inserido em um vetor de expressão de planta pBI121 contendo uma seqüência ômega de vírus do mosaico do tabaco. Desta forma, um construto foi preparado. Primeiro, o vetor pCR2.1, no qual um fragmento contendo ORF
do gene de PP2C (proteína fosfatase 2C) (At3g05640) havia sido clonado em 1-2-5, foi tratado com as enzimas de restrição Sa/1 e BsrG I.
A seguir, pBI121 similares contendo uma seqüência ômega foi tratado com as enzimas de restrição Sal I e BsrG I. Os produtos digeridos com estas enzimas de restrição foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 0,8%. Um fragmento de cerca de 1600 bp contendo a ORF do gene de PP2C (proteína fosfatase 2C) (At3g05640) e pBI121 contendo a r· 41
seqüência ômega foi tracionada e purificada do gel com o uso de um kit de purificação de banda de gel (Amersham) e de DNA de PCR GFX.
Para a introdução de um fragmento contendo a ORF do gene de PP2C (proteína fosfatase 2C) (At3g05640) com o uso de um fragmento de pBI121 contendo a seqüência ômega como um vetor, o vetor e o inserto fo- ram misturados a uma razão de 1 : 10, seguido de uma reação de ligação de um dia para o outro a 16°C com o uso de uma quantidade equivalente de um kit TaKaRa Ligation kit ver. 2 (Takara Bio Inc.).
A quantidade total da solução de reação foi adicionado a 100 μΙ de células competentes (cepa DH5a de E. coli, TOYOBO), para que a trans- formação fosse realizada de acordo com os protocolos incluídos no kit. As células foram aplicadas a meio ágar LB contendo 50 pg/ml de canamicina e, então, cultivadas de um dia para o outro. As colônias que apareceram foram submetidas a cultura líquida em meio LB suplementado com 50 pg/ml de canamicina. O DNA do plasmídio foi preparado a partir dos microorganismos assim obtidos com o uso de um kit Plasmid Mini Kit (QIAGEN).
O fragmento assim obtido contendo a ORF do gene de PP2C (proteína fosfatase 2C) (At3g05640) foi subclonado em um vetor de expres- são, seguido da determinação da seqüências de nucleotídeo e análise de seqüências.
1-2-7. Introdução de gene em Arabidopsis thaliana com o uso de método de Agrobacterium
O vetor de expressão de planta construído em 1-2-6 foi introdu- zido na cepa C58C1 de Agrobacterium tumefaciens por eletroporação (Plant Molecular Biology Mannual1 Segunda Edição, B. G. Stanton e A. S. Robbert, KIuwerAcdemic Publishers 1994). Subseqüentemente, o Agrobacterium tu- mefaciens no qual o vetor de expressão de planta foi introduzido em Arabi- dopsis thaliana Col-O tipo eco selvagem por um método de infiltração descri- to por Clough et ai. (Steven J. Clough e Andrew F. Bent1 1998, The Plant Journal 16, 735-743).
Os transformantes foram selecionados com o uso de meio con- tendo canamicina. Plantas da geração T1 foram produzidas por autopolini- r ^ 42 5 ^ JL·.
zação a partir dos transformantes, para que sementes T2 fossem obtidas. 4 1-2-8. Confirmação do fenótipo do transformante
As sementes T2 produzidas em 1-2-7 foram semeadas assepti- camente e, então, as plantas resultantes foram transplantadas para vasos (cada um com um diâmetro de 50 mm) contendo solo misturado com vermi- culita. Como plantas de controle para comparação, plantas de Arabidopsis thaliarta que não haviam sido submetidas a recombinação foram transplan- tadas. Elas foram cultivadas sob condições de 22°C e 16 horas na luz/8 ho- ras no escuro, e com uma intensidade de luz na faixa de cerca de 30 a 45 pmol/m2/seg, por um total de 11 semanas após o transplante. Após o cultivo, as partes aéreas das plantas foram colocadas em bolsas de papel e secas sob condições de 22°C e umidade de 60% por duas semanas. As quantida- des totais de biomassa e sementes foram pesadas com o uso de uma ba- lança eletrônica. 1-3. Resultados
Com relação aos resultados de 1-2-8, a figura 3 mostra uma foto das partes aéreas de plantas do tipo selvagem e de plantas transformadas nas quais um fragmento contendo ORF do gene de PP2C (proteína fosfata- se 2C) (At3g05640) foi introduzido. Ainda, a figura 4 e a figura 5 mostram os resultados da medição das quantidades totais de biomassa e sementes das partes aéreas das plantas.
Conforme mostrado nas figuras 3, 4, e 5, foi revelado que no ca- so de plantas transformadas nas quais o fragmento contendo ORF do gene de PP2C (proteína fosfatase 2C) (At3g05640) havia sido introduzido, as quantidades totais de biomassa das partes aéreas foram muito maiores (cer- ca de 1,9 a 2,1 vezes) do que as quantidades do mesmo nos casos de plan- tas do tipo selvagem. Além disso, as quantidades de sementes foram muito maiores (em cerca de 1,7 a 1,8 vez) do que as mesmas nos casos de plan- tas do tipo selvagem. Exemplo de referência 2
Neste exemplo de referência, as plantas transformadas foram preparadas por introduzir um gene de frutose-1,6-bifosfato aldolase do tipo plastídio de iigação ã glutationa (daqui em diante, gene FBA1). Além disso, pode ser feita referência aos exemplos de WO 2007-091634 A1. 2. Materiais e Métodos 2-1. Materiais experimentais Um material experimenta! usado aqui foi Arabidopsis thaliana
ecotipo Col-O selvagem. As sementes de Arabidopsis foram semeadas em vasos de plástico quadrados (6,5 χ 6,5 χ 5 cm) contendo solo das três se- guintes camadas: vermiculita (Asahi Kogyo); solo de cultura KUREHA (KU- REHA solo para horticultura, KUREHA CORPORATION; e vermiculita; a par- tir do fundo, em uma proporção de 2 : 2 : 1. As plantas foram então, cultiva- das sob condições de uma temperatura de crescimento de 22°C e um dia longo (um ciclo de 16 horas na luz/8 horas no escuro). 2-2. Métodos
2-2-1. Obtenção do gene de FBA1 (At2gQ1140) O RNA total foi isolado de Arabidopsis thaliana Columbia (CoI-O)
selvagem de 4 semanas de idade. RT-PCR (quantidade de RNA molde: 5,0 pg) foi realizada com o uso de um kit Prost arfirststrand RT-PCR kit (Strata- gene), para que o cDNA fosse preparado.
Dois fragmentos de cDNA de extensão completa foram amplifi- cados por PCR com o uso dos seguintes iniciadores específico que haviam sido desenhados com base na seqüência de cDNA (SEQ ID N°: 42) do gene de FBA1 (At2g01140). Cada fragmento foi clonado por TA em um vetor pGEM-T (Prômega).
1F-1: 5'-GGATCCTATGGCGTCTGCTAG-3'(SEQ ID N0: 43) 1R-1: 5'-ATCTGCAACGGTCTCGGGAGA-3'(SEQ ID N0: 44)
1F-2: 5'-GTGTGGTCCGAGGTGTTCTTCT-3'(SEG ID N0: 45) 1R-2: 5'-GAGCTCGAGTAGGTGTAACCCTTG-3'(SEQ ID N0: 46) Os 2 fragmentos foram fundidos no sítio de Ssip I e, então, um vetor (pGEM-FBA1) contendo o cDNA de extensão completa foi construído. Para a produção das plantas transformadas, pGEM-FBAI foi tratado com as enzimas de restrição BamH I e Sac I e, então, o fragmento foi introduzido em um vetor pBI121. 2-2-2. Construção do vetor de expressão de planta
Um construto foi preparado pela inserção do fragmento contendo
0 gene de FBA1 (At2g01140) (obtido em 2-2-1) em um vetor de expressão de planta pMAT137-HM (Matsuoka K. e Nakamura K., 1991, Proc. Natl. A-
cad. Sei. U.S.A. 88, 834-838).
Primeiro, o fragmento contendo o gene de FBA1 e um termina- dor Nos: que haviam sido incorporados no vetor pBI121, foi cortado com Xba
1 e EcoR I. O resultante foi incorporado em um vetor pBluscriptll (SK+) (Stra- tagene) tratado com Xba I e EcoR i. Subseqüentemente, o fragmento con-
tendo o gene de FBA1 e o terminador de NOS foi cortado com Xba I e Kpn I e, então, incorporado em um vetor pMAT137-Hm que havia sido tratado com Xba I e Kpn I.
2-2-3. Introdução do gene em Arabidopsis thaliana com o uso do método de Agrobacterium
O vetor de expressão de planta pMAT137-Hm construído em
2-2-2 foi introduzido por eletroporação (Plant Molecular Biology Mannual1 Segunda Edição, B. G. Stanton e A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994) em uma cepa C58C1 de Agrobacterium tumefaciens. A seguir, o Agrobacterium tumefaciens no qual o vetor de expressão de planta havia sido introduzido foi introduzido pelo método de infiltração descrito por Clough et a/., (Steven J. Clough e Andrew F. Bent, 1998, The Plant Journal 16, 735- 743) em Arabidopsis thaliana ecotipo Col-O selvagem.
A seleção foi repetida com o uso de meio de ágar (meio Mura- shíge-Skoog com uma concentração de 1/2) contendo canamicina como um marcador de seleção. Na dosagem a qual todas as sementes podem crescer em meio contendo canamicina (em uma geração que retém as característi- cas de maneira estável), os níveis de expressão do transgene foram confir- mados por análise de RT-PCR, para que a produção das plantas transfor- madas fosse confirmada. Exemplo 1
No exemplo 1, os efeitos do tratamento com glutationa oxidada (GSSG) foram examinados para as plantas transformadas (mais adiante Λ'" ^0-' 45 * π. ^ ·>;.
.Λ - ^
neste documento, plantas transformadas com PP2C) preparadas no exem- plo de referência 1 pela introdução de um fragmento contendo ORF do gene de PP2C (proteína fosfatase 2C) (At3g05640); as plantas transformadas (mais adiante neste documento, plantas transformadas com FBA1) prepara- das no exemplo de referência 2 pela introdução de um gene de frutose-1,6- bifosfato aldolase do tipo plastidio de ligação à glutationa; e Arabidopsis tha- líana selvagem. 3. Materiais e Métodos 3-1. Materiais experimentais Os materiais experimentais usados aqui foram sementes da gera-
ção T3 e as seguintes gerações das plantas transformadas com PP2C prepa- radas em 1-2-7, sementes das plantas transformadas com FBA1 preparadas em 2-2-3, e sementes de Arabidopsis thaliana selvagem (ecotipo Col-O).
As sementes de cada planta foram semeadas em vasos de plás- tico quadrados (6,5 χ 6,5 χ 5 cm) contendo solo das três seguintes camadas: vermiculita (Asahi Kogyo); solo de cultura KUREHA (KUREHA solo para hor- ticultura, KUREHA CORPORATION); e vermiculita; a partir do fundo, em uma proporção de 2 : 2 : 1. As plantas foram então, cultivadas sob condições de 100 pmoI/m2/seg de intensidade de luz, uma temperatura de crescimento de 22°C e um dia longo (um ciclo de 16 horas na luz/8 horas no escuro). 3-2. Métodos
Efeitos da glutationa oxidada (GSSG) sobre o crescimento de cada planta
Cada planta (3 plantas por vaso) foi tratada 5 vezes no total com água apenas (controle) ou com uma solução de 1 mM de GSSG em interva- Ios de 1 semana desde a 1a semana após o plantio. O estado de crescimen- to de cada planta foi observado. O tratamento foi realizado por colocar 4 va- sos (6,5 χ 6,5 χ 5 cm) em um prato de pesagem e adicionar uma solução de tratamento (25 ml/vaso/tratamento) a isso. As plantas foram cultivadas por semanas após a semeadura. Após o cultivo, as partes aéreas das plantas foram colocadas em sacos de papel e secas sob condições de 22°C e umi- dade de 60% por duas semanas. As quantidades totais de biomassa e se- mentes foram pesadas com o uso de uma balança eletrônica. 46 ^ r-
'-U -
3-3. Resultados
A figura 6 mostra os resultados de 3-2 acima. Especificamente , a figura 6 mostra uma foto tirada 3 semanas após a semeadura, mostrando as partes aéreas das plantas transformadas com PP2C, as plantas transfor- madas com FBA1, e Arabidopsis thaliaria selvagem, as quais foram tratadas com uma solução de 1 mM de GSSG. Conforme mostrado na figura 6, foi revelado que no caso de plantas transformadas com PP2C, o crescimento de folhas de roseta foi mais aprimorado em comparação às plantas trans- formadas com FBA1 e Arabidopsis thaliaria selvagem. Ainda, a figura 7 mostra os resultados da medição das quantida-
des totais de biomassa das partes aéreas das plantas e a figura 8 mostra os resultados da medição das quantidades de sementes. Além disso, as quan- tidades de biomassa e as quantidades de sementes mostradas nas figuras 7 e 8 foram ambas valores médios encontrados pela medição das quantidades de biomassa de 6 vasos (cada vaso contendo 3 plantas) e, então, cálculo do valor médio. Conforme mostrado na figura 7, foi revelado que no caso de plantas transformadas com PP2C tratadas com glutationa, a quantidade total de biomassa das partes aéreas foi aprimorada em cerca de 49% em compa- ração às mesmas nos casos envolvendo tratamento apenas com água (con- trole). Também foi revelado que no caso de plantas transformadas com FBA1 tratadas com glutationa, a quantidade total de biomassa das partes aéreas foi aprimorada em cerca de 17% a 27% em comparação às mesmas nos casos envolvendo tratamento apenas com água (controle).
Portanto, conforme mostrado na figura 8, foi revelado que no ca- so de plantas transformadas com PP2C tratadas com glutationa, a quantida- de de sementes foi aprimorada em cerca de 54% a 69% em comparação às mesmas nos casos envolvendo tratamento apenas com água (controle). A- inda, foi revelado que no caso de plantas transformadas com FBA1 tratadas com glutationa, a quantidade de sementes foi aprimorada em cerca de 23% a 49% em comparação às mesmas nos casos envolvendo tratamento ape- nas com água (controle).
Conforme descrito acima, poderia ser confirmado que no caso S · 47
das piantas transformadas com PP2C, os efeitos do aumento da produção de biomassa e sementes pelo tratamento com glutationa foram ainda au- mentados em comparação às plantas transformadas com FBA1.
Claims (14)
1. Método para aumentar a produção de biomassa e/ou semen- ^ tes de planta, que compreende uma etapa de fornecer glutationa a uma planta na qual foi introduzido um gene que codifica proteína fosfatase 2C que tem 3 seqüências consenso que compreendem as seqüências de ami- noácido mostradas nas SEQ ID NosIl a 3 nesta ordem a partir da porção terminal N.
2. Método para aumentar a produção, de acordo com a reivindi- cação 1, em que a glutationa é glutationa oxidada.
3. Método para aumentar a produção, de acordo com a reivindi- cação 1, pelo qual uma solução contendo a glutationa é fornecida ao solo no qual as sementes da planta foram semeadas.
4. Método para aumentar a produção, de acordo com a reivindi- cação 1, em que o gene que codifica a proteína fosfatase 2C é pelo menos um tipo de gene selecionado do grupo que consiste em At1g03590- AtPP2C6-6, Atlg 16220, At1g79630, At5g01700T At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g16800, At3g05640, At5g27930-AtPP2C6-7, At2g20050, e At3g06270, ou um gene funcionalmente equivalente a estes.
5. Método para aumentar a produção, de acordo com a reivindi- cação 1, em que o gene que codifica a proteína fosfatase 2C codifica qual- quer uma das seguintes proteínas (a) a (c): (a) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID N0: 5; (b) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoáci- do que tem uma deleção, uma substituição, uma adição, ou uma inserção de um ou de uma pluralidade de aminoácidos com relação à seqüência de ami- noácido mostrada em SEQ ID N0: 5 e tem atividade de proteína fosfatase 2C; e (c) uma proteína que é codificada por um polinucleotídeo que hi- bridiza sob condições estringentes a um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID N0:4 e tem atividade de proteína fosfatase 2C.
6. Método para aumentar a produção, de acordo com a reivindi- cação 4, em que o gene funcionalmente equivalente é um gene da proteína fosfatase 2C de um organismo diferente de Arabidopsis thaliana.
7. Método para aumentar a produção, de acordo com a reivindi- cação 6, em que um organismo diferente de Arabidopsis thaliana é pelo me- nos um tipo de organismo selecionado do grupo que consiste em arroz (Ory- za sativa), Choupo-do-Canadá (Populus trichocarpa), uva europeia (Vitis vinifera), Medicago truncatufa (Medicago truncatula), alfafa (Medicago sati- va), Physcomitrella patens (Physcomitrella patens), barrilha (Mesembryan- themum crystallinum), Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas rei- nhardtii), milho (Zea mays), colza (Brassica rapa), tomate (Solanum Iyeoper- sicum), mimulus (Mimulus guttatus), e alga vermelha monocelular (Cyanidi- oschyzon merolae).
8. Método para produzir uma planta, que compreende uma etapa de fornecer glutationa a uma planta na qual foi introduzido um gene que co- difica proteína fosfatase 2C que tem 3 seqüências consenso que compreen- dem as seqüências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NoS:1 a 3 nesta ordem a partir da porção terminal N.
9. Método de produção, de acordo com a reivindicação 8, em que a glutationa é glutationa oxidada.
10. Método de produção, de acordo com a reivindicação 8, pelo qual uma solução contendo a glutationa é fornecida ao solo no qual as se- mentes da planta foram semeadas.
11. Método de produção, de acordo com a reivindicação 8, em que o gene que codifica a proteína fosfatase 2C é pelo menos um tipo de gene selecionado do grupo que consiste em At1g03590-AtPP2C6-6, Atlg 16220, At1g79630, At5g01700, At3g02750, At5g36250, At5g26010, At4g32950, At3g 16800, At3g05640, At5g27930-AtPP2C6-7, At2g20050, e At3g06270, ou um gene funcionalmente equivalente a estes.
12. Método de produção, de acordo com a reivindicação 8, em que o gene que codifica a proteína fosfatase 2C codifica qualquer uma das seguintes proteínas (a) a (c): (a) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID N0: 5; (b) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoáci- do que tem uma deleção, uma substituição, uma adição, ou uma inserção de um ou de uma pluralidade de aminoácidos com relação à seqüência de ami- noácido mostrada em SEQ ID N°: 5 e tem atividade de proteína fosfatase 2C;e (c) uma proteína que é codificada por um polinucleotídeo que hi- bridiza sob condições estringentes a um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID N0: 4 e tem atividade de proteína fosfatase 2C.
13. Método de produção, de acordo com a reivindicação 11, em que o gene funcionalmente equivalente é um gene da proteína fosfatase 2C de um organismo diferente de Arabidopsis thaliana.
14. Método de produção, de acordo com a reivindicação 13, em que um organismo diferente de Arabidopsis thaliana é pelo menos um tipo de organismo selecionado do grupo que consiste em arroz (Oriza sativa), choupo-do-Canadá (Populus trichocarpa), uva europeia (Vitis vinifera), Medi- cago truncatula (Medicago truncatuia), alfafa (Medicago sativa), Physeomi- trella patens (Physcomitreila patens), barrilha (Mesembryanthemum crystalli- num), Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas reinhardtií), milho (Zea mays), colza (Brassiea rapa), tomate (Solanum lyeopersieum), mimulus (Mi- mulus guttatus), e alga vermelha monocelular (Cyanidioschyzon merolae).
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