JP6397610B2 - 師部組織増産に適した植物体及びその利用 - Google Patents
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Description
(2)前記植物体の師部組織が特異的に増大されている、(1)に記載の植物体。
(3)前記プロモーターは管状要素分化抑制因子(Tracheary element differentiation inhibitory factor TDIF)受容体(TDR)プロモーターと機能的に等価なプロモーター、スクロース輸送タンパク質SUC2(Sucrose transport protein SUC2)プロモーターと機能的に等価なプロモーター、フロウエム・インターカレイテッド・ウィズ・ザイレム(Phloem intercalated with xylem PXY)プロモーターと機能的に等価なプロモーター、ドフタイプ・ジンクフィンガー・ドメインコンテイニング・プロテイン(Dof-type zinc finger domain-containing protein Dof5.6)プロモーターと機能的に等価なプロモーター、又は、ハイ・カンビアル・アクティビティ2(High cambial activity 2 HCA2)プロモーターと機能的に等価なプロモーターである(1)又は(2)に記載の植物体。
(4)前記タンパク質は、配列番号1〜3で表されるアミノ酸配列からなる3つの共通配列をN末端側からこの順で有するタンパク質又は配列番号5で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するタンパク質である、(1)〜(3)のいずれかに記載の植物体。
(5)前記植物体の師部組織量が野生株に比べて2.0倍以上増加している、(1)〜(4)のいずれかに記載の植物体。
(6)双子葉植物であることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載の植物体。
(7)アブラナ科植物であることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載の植物体。
(8)単子葉植物であることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載の植物体。
(9)イネ科植物であることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載の植物体。
(10)アオイ科植物あることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載の植物体。
(11)(1)から(10)のいずれかに記載の植物体の生産方法。
(12)(1)から(10)のいずれかに記載の植物体を育成する工程を備える、植物体の師部組織の生産方法。
(13)前記植物体の全体の重量に対する、前記師部組織の重量の割合を増加させることを特徴とする、(12)に記載の生産方法。
本明細書に開示される植物体は、植物の維管束形成層で特異的に発現する維管束形成層特異的プロモーター又は植物の師部細胞で特異的に発現する師部細胞特異的プロモーターと、前記維管束形成層特異的プロモーター又は前記師部細胞特異的プロモーターの制御下にある細胞増殖を促進するタンパク質をコードする細胞増殖促進遺伝子と、を保持することができる。
維管束形成層特異的プロモーターは、植物の維管束形成層で特異的に発現し、師部細胞特異的プロモーターは、師部細胞で特異的に発現する。維管束形成層特異的プロモーター及び師部細胞特異的プロモーターは、細胞増殖促進遺伝子の発現を制御することによって、師部組織を増大させ得る。本明細書において、特定の組織又は細胞において「特異的に発現する」とは、遺伝子が、当該組織又は細胞のみに発現することに限られず、当該組織又は細胞に比較的強く発現しそれ以外の組織に比較的弱く発現することをも含む。
(TDRプロモーター)
TDRプロモーターは、維管束形成層特異的プロモーターの1つである。TDRプロモーターは、管状要素分化抑制因子(TDIF;Tracheary element differentiation inhibitory factor)の受容体であるTDRをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターである。維管束前形成層又は維管束形成層に存在する維管束幹細胞に局在する受容体TDRは、師部組織で生産されて細胞外に分泌されたTDIFと結合して、細胞内へTDIFのシグナルを伝達し、維管束幹細胞に局在する受容体TDRに結合し維管束幹細胞から木部への分化を阻害し、維管束幹細胞の分裂を促進する。TDRプロモーターは、例えば、配列番号6で表される塩基配列を有することができ、配列番号6で表される塩基配列のDNAと機能的に同等なプロモーター活性を有する限りその一部であってもよい。配列番号6で表される塩基配列は、シロイヌナズナのTDRのプロモーターである。
(SUC2プロモーター)
SUC2プロモーターは、スクロース輸送タンパク質SUC2(Sucrose transport protein SUC2)をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターである。SUC2は、スクロースを、プロトンと共に輸送する共輸送体である。スクロースは、グルコース及びフルクトースに分解され、デンプン合成のための材料やエネルギー源として利用される。また、SUC2は、マルトース、アルブチン、サリシン、α―フェニルグルコシド、β―フェニルグルコシド、α―パラニトロフェニルグルコシド、β―パラニトロフェニルグルコシド、パラニトロフェニル―β―チオグルコシド、ビオチンを輸送し得る。師部組織のスクロースは、葉等の供給源となる組織に蓄えられ、根、花等の吸収源となる組織に輸送される。SUC2プロモーターは、例えば、配列番号7で表される塩基配列を有することができ、配列番号7で表される塩基配列のDNAと機能的に同等なプロモーター活性を有する限りその一部であってもよい。配列番号7で表される塩基配列は、シロイヌナズナのSUC2(SUT1、AtSUC2)遺伝子は、Front Plant Sci., 2012;3:22のFigure1においてtypeIに分類されたスクロース輸送タンパク質である。なお、SUC2プロモーターは、師部細胞で発現する。
細胞増殖促進遺伝子は、細胞増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子である。このような遺伝子として、プロテインフォスファターゼ2C(PP2C)遺伝子、アインテグメンタ(ANT;AINTEGUMENTA)遺伝子、ヘラクレス1(HRC1;Hercules 1)遺伝子、NAM/CUC様タンパク質1(NAC1;NAM/ CUC-like Protein 1)遺伝子、ARGOS遺伝子、DWF4遺伝子、ジベレリン20−オキシダーゼ1(GA20OX1;gibberellin 20-oxidase 1)遺伝子、サイクリン−B1−1(CYB1;1;Cyclin-B1-1)遺伝子、サイクリン−D2−1(CYD2;1;Cyclin-D2-1)遺伝子が挙げられる。またE2Fa遺伝子及び/又は二量体化パートナー(DPa;Dimerization Partner)遺伝子等が挙げられる。これらの塩基配列は、いずれも、NCBIのデータベースにおいて取得することができる。
PP2C遺伝子は、配列番号1〜3に示すアミノ酸配列からなる3つの共通配列をN末端側からこの順で有するPP2Cをコードする。なお、参考文献(TRENDS in Plant Science Vol.9 No.5May 2004 Pages 236-243)の第237頁に挙げられたFigure1.topographic cladogramにおいてグループEとして分類された遺伝子群は、配列番号1〜3に示すアミノ酸配列からなる3つの共通配列をN末端側からこの順で有するPP2Cをコードする遺伝子である。なお、参考文献によれば、シロイヌナズナにおいては、76個のPP2C遺伝子が予測されており、これら遺伝子についてT−Coffeeソフトウェア(参考文献;Notredame, C. et al. 2000 T-Coffee: a novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. J. Mol. Biol. 302, 205-247)を用いて系統樹を作成した結果が参考文献のFigure 1として開示されている。この系統樹において、グループEに分類されたPP2C遺伝子は、配列番号1〜3に示すアミノ酸配列からなる3つの共通配列をN末端側からこの順で有するPP2Cをコードしている。配列番号1〜3に示すアミノ酸配列からなる3つの共通配列は、上述した分類におけるグループEに特徴的な配列であって、他のグループとの明確な区別基準となる配列である。
GXA(M/V/F)(S/A/T)R(A/S)(F/I/V)GDXXX(K/E)XXG(V/L)(I/V)XXP(E/Q/D)(I/V/F)XXXX(I/L/V)(T/S)XX(D/N/H)X(F/Y)(L/I/V/F)(V/L/I)(L/V)A(T/S)DG(V/I/M)(W/F)(D/E)X(L/I/M)(S/T/P)(N/S)XX(V/A)XX(L/V/I/M)(I/V)であることが好ましい。このアミノ酸配列において、カッコ内の複数のアミノ酸は該位置において取りうるアミノ酸残基のバリエーションを示している。また、下記アミノ酸配列において、Xは、該位置において任意のアミノ酸残基を取りうることを意味している。
ある。参考文献(1)(「マッキー生化学」第3版 5章アミノ酸・ペプチド・タンパク質 5.1アミノ酸、監修:市川厚、監訳:福岡伸一、発行者:曽根良介、発行所:(株)化学同人、ISBN4-7598-0944 -9)でも記載されているように、アミノ酸は同様の性質(化学的性質や物理的大きさ)を持つ側鎖に従って分類される事がよく知られる。また、タンパク質の活性を保持したまま、所定のグループに分類されるアミノ酸残基間における分子進化上の置換が頻度高く起こることがよく知られる。この考えを基に、参考文献(2):Henikoff S., Henikoff J.G., Amino-acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919 (1992)中の、Fig.2でアミノ酸残基の置換変異のスコアマトリックス(BLOSUM)が提唱され、広く使用されている。参考文献(2)では、側鎖の化学的性質が似たもの同士のアミノ酸置換は、タンパク質全体に与える構造や機能変化が少なくなると言う知見に基づくものである。上記参考文献(1)及び(2)によれば、マルチプルアラインメントで考慮するアミノ酸の側鎖のグループは、化学的性質や物理的大きさなどの指標を基にして考えることができる。これは、参考文献(2)に開示されたスコアマトリックス(BLOSUM)において、スコアの0以上の値を持つアミノ酸、好ましくは1以上の値を持つアミノ酸のグループとして示される。代表的なグループとしては、下記の8つが上げられる。その他の細かいグループ分けは、該スコアの値の0以上同士のアミノ酸グループ、好ましくは1以上同士のアミノ酸グループ、さらに好ましくは2以上のアミノ酸グループであれば良い。
このグループは、上記参考文献(1)で示された中性非極性アミノ酸のうち、脂肪属性の
疎水性側鎖をもつアミノ酸のグループであり、V(Val、バリン)、L(Leu、ロイシン)、I(Il
e、イソロイシン)及びM(Met、メチオニン)から構成される。参考文献(1)による中性非極
性アミノ酸と分類されるもののうちFGACWPは以下理由で、この「脂肪族疎水性アミノ酸グループ」には含めない。G(Gly、グリシン)やA(Ala、アラニン)はメチル基以下の大きさで非極性の効果が弱いからである。C(Cys、システイン)はS-S結合に重要な役目を担う場合があり、また、酸素原子や窒素原子と水素結合を形成する特性があるからである。F(Phe、フェニルアラニン)やW(Trp、トリプトファン)は側鎖がとりわけ大きな分子量をもち、かつ、芳香族の効果が強いからである。P(Pro、プロリン)はイミノ酸効果が強く、ポリペプチドの主鎖の角度を固定してしまうからである。
このグループは、中性極性アミノ酸のうちヒドロキシメチレン基を側鎖に持つアミノ酸
のグループであり、S(Ser、セリン)とT(Thr、スレオニン)から構成される。SとTの側鎖に存在する水酸基は、糖の結合部位であるため、あるポリペプチド(タンパク質)が特定の活性を持つために重要な部位である場合が多い。
このグループは、酸性であるカルボキシル基を側鎖に持つアミノ酸のグループであり、
D(Asp、アスパラギン酸)とE(Glu、グルタミン酸)から構成される。
このグループは、塩基性アミノ酸のグループであり、K(Lys、リジン)とR(Arg、アルギニン)から構成される。これらKとRは、pHの広い範囲で正に帯電し塩基性の性質をもつ。一方、塩基性アミノ酸に分類されるH(His、ヒスチジン)はpH7においてほとんどイオン化されないので、このグループには分類されない。
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてメチレン基が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持ち、N(Asn、アスパラギン、極性基はアミド基)、D(Asp、アスパラギン酸、極性基はカルボキシル基)とH(His、ヒスチジン、極性基はイミダゾール基)から成る。
6)ジメチレン基=極性基(EKQRグループ)
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてジメチレン基以上の直鎖炭化水素が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるジメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持つ。E(Glu、グルタミン酸、極性基はカルボキシル基)、K(Lys、リジン、極性基はアミノ基)、Q(Gln、グルタミン、極性基はアミド基)、R(Arg、アルギニン、極性基はイミノ基とアミノ基)から成る。
このグループには、側鎖にベンゼン核を持つ芳香族アミノ酸であり、芳香族特有の化学的性質を特徴とする。F(Phe、フェニルアラニン)、Y(Tyr、チロシン)、W(Trp、トリプトファン)から成る。
このグループには、側鎖に環状構造を持つと同時に極性も持つアミノ酸で、H(H、ヒスチジン、環状構造と極性基は共にイミダゾール基)、Y(Tyr、チロシン、環状構造はベンゼン核で極性基は水酸基)から成る。
ANT遺伝子は、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するANTをコードする遺伝子である。ANT遺伝子の産物であるANTは、AP2ドメインの存在によって特徴付けられる。このドメインは、AP2において最初に同定され、このモチーフは、両親媒性α−へリックスを形成する能力および/またはDNAを結合する能力を有する、非常に保存されたコア領域を有する、約60〜70アミノ酸残基の領域により特徴付けられる(Jofukuら、Plant Cell 6:1211~1225(1994);Ohme-TakagiおよびShinshi、Plant Cell 7:173~182(1995))。全長ANTタンパク質は、2つのAP2ドメイン(配列番号5のアミノ酸281〜357および383〜451)およびリンカー領域(アミノ酸358〜382)を含み、そして他のAP2ドメインタンパク質に対する相同性は、この領域に限定されている。本発明のANT遺伝子は、代表的には、長さが少なくとも約30〜40ヌクレオチド〜約2500ヌクレオチド、通常は長さが約3000ヌクレオチド未満の、コード配列を含む。通常、本発明のANT遺伝子は、長さが約100〜約5000ヌクレオチド、しばしば約500〜約3000ヌクレオチドである。
上記のプロモーター及び遺伝子は、ベクターに含めることができる。該ベクターは、さらに種々の調節要素が、宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されていてもよい。こうした要素としては、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、およびエンハンサーが挙げられる。発現用ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明のベクターは、さらにT−DNA領域を有し得る。T−DNA領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
ナス科:タバコ(Nicotiana tabacum)、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ(Solaneum tuberosum)、トマト(Lycopersicon lycopersicum)、トウガラシ(Capsicum annuum)、ペチュニア(Petunia)など。
マメ科:ダイズ(Glycine max)、エンドウ(Pisum sativum)、ソラマメ(Vicia faba)、フジ(Wisteria floribunda)、ラッカセイ(Arachis. hypogaea)、ミヤコグサ(Lotus corniculatus var. japonicus)、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)、アズキ(Vigna angularis)、アカシア(Acacia)など。
キク科:キク(Chrysanthemum morifolium)、ヒマワリ(Helianthus annuus)など。
ヤシ科:アブラヤシ(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、ココヤシ(Cocos nucifera)、ナツメヤシ(Phoenix dactylifera)、ロウヤシ(Copernicia)など。
ウルシ科:ハゼノキ(Rhus succedanea)、カシューナットノキ(Anacardium occidentale)、ウルシ(Toxicodendron vernicifluum)、マンゴー(Mangifera indica)、ピスタチオ(Pistacia vera)など。
ウリ科:カボチャ(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo)、キュウリ(Cucumis sativus)、カラスウリ(Trichosanthes cucumeroides)、ヒョウタン(Lagenaria siceraria var. gourda)など。
バラ科:アーモンド(Amygdalus communis)、バラ(Rosa)、イチゴ(Fragaria)、サクラ(Prunus)、リンゴ(Malus pumila var. domestica)など。
ナデシコ科:カーネーション(Dianthus caryophyllus)など。
ヤナギ科:ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)など。
イネ科:トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ(Hordeum vulgare)、コムギ(Triticum aestivum)、タケ(Phyllostachys)、サトウキビ(Saccharum officinarum)、ネピアグラス(Pennisetum pupureum)、エリアンサス(Erianthus ravenae)、ミスキャンタス(ススキ)(Miscanthus virgatum)、ソルガム(Sorghum)スイッチグラス(Panicum)など。
ユリ科:チューリップ(Tulipa)、ユリ(Lilium)など。
フトモモ科:ユーカリ(Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis)など。
アオイ科:オクラ(Abelmoschus esculentus)、イチビ(Abutilon theophrasti)、タチアオイ(Althaea rosea)、ワタ(Gossypium spp)、ケナフ(Hibiscus cannabinus)、ジャコウアオイ(Malva moschata)、ウナズキヒメフヨウ(Malvaviscus arboreus var. mexicanus)、ヤノネボンテンカ(Pavonia hastata)、イリマ(Sida fallax)など。
イラクサ科:チョマ(Boehmeria nivea var. nipononivea)、ヤブマオ(Boehmeria japonica)、ヤナギイチゴ (D. edulis)、ランダイミズ (E. platyphyllum)など。
本明細書では、例えば、以下の方法によって、師部組織が増産されたか否かを評価することができる。まず、各植物体の丈を実測する。次いで、各植物体の茎を一定の位置(たとえば基部から20mm)で切断し、トルイジンブルー、メチレンブルー、ヘマトキシリン等の色素によって切片を染色する。染色後の切片の画像を撮影し、画像の解析等によって、師部面積を求める。横断面積当たりの師部面積を計算し、師部比率を求める。さらに、上述した植物体の丈と師部比率とから師部増産効果を求める。師部増産効果は、野生株の師部面積に対する植物体の師部面積比と、野生株の丈に対する植物体の丈比と、を用いて、以下の式で表される。
師部増産効果=(植物体の師部面積比)×(植物体の丈比)
師部増産効果を比較することによって、師部組織が増産されたか否かを評価することができる。師部増産効果が大きいほど、師部組織量が増加していることを示す。
本明細書に開示によると、植物の維管束形成層又は師部細胞で特異的に発現するプロモーターと、該プロモーターの制御下にある遺伝子であって、細胞増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子と、を保持した植物細胞を有する植物体の生産方法が提供される。プロモーター及び遺伝子の詳細については上述のとおりである。また、本明細書に開示の生産方法によれば、師部組織が増産された植物体を得ることができる。
本明細書に開示によると、植物の維管束形成層又は師部細胞で特異的に発現するプロモーターと、該プロモーターの制御下にある遺伝子であって、細胞増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子と、を保持した植物細胞を有する植物体を育成する工程を備える、師部組織の増産方法が提供される。プロモーター及び遺伝子の詳細については上述のとおりである。本明細書に開示の生産方法によれば、植物体の師部組織を適切に増産させることができる。師部組織が増産しているとは、植物体の全体の重量に対する、師部組織の重量の割合が増加していることをいう。
シロイヌナズナ(Col−0)幼葉を液体窒素凍結下で粉砕したものと、DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen社製)とを用いて、ゲノムDNAを調製した。調製したゲノムDNAを鋳型とし、PCR法によってシロイヌナズナのTDR(At5g61480)及びSUC2(At1g22710)の各プロモーター領域を増幅させた。PCR反応には、制限酵素サイト(HindIII、SalI)を付加した下記の各プライマー、即ち、TDRプロモーター増幅用プライマーとして、HindIII-TDR-F1(配列番号8)及びTDR-Sall-R1(配列番号9)を用い、SUC2プロモーター増幅用プライマーとして、HindIII-SUC2-F1(配列番号10)及びSUC2-Sall-R1(配列番号11)を用いた。
TDR-SalI-R1: ACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCGTAGCTTTTAGAAAGAA(配列番号9)
HindIII-SUC2-F1: TATGACCATGATTACGCCAAGCTTACGCAAACTAACTACAAC(配列番号10)
SUC2-SalI-R1: ACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACATTTGACAAACCAAGAAA(配列番号11)
植物発現用ベクターpBI121(CLONTECH社製)を制限酵素HindIII及びBamHI で処理した。次に、オリゴヌクレオチド(Linker-F2(配列番号12)、Linker-R2(配列番号13))を等量混合し、96℃で10min、その後室温に2時間静置した。静置後のオリゴヌクレオチド混合物と、上記制限酵素処理したpBI121と、DNA Ligation Kit <Mighty Mix>(タカラバイオ社製)と、によりライゲーション反応を行い、プロモータークローニングベクターpBI101N2を作製した。
Linker-R2:CTAGAGTCGACCTCGAGACTAGTTTAATTAAGGCGCGCCA(配列番号13)
シロイヌナズナ(Col−0)から調製したゲノムDNAを鋳型とし、PCR法によってシロイヌナズナのPP2C(At3G05640)遺伝子を増幅させ、ベクターpBI 35SΩ:PP2Cを作製した。また、シロイヌナズナ(Col−0)のcDNAを鋳型とし、PCR法によってシロイヌナズナのANT(At4G37750)遺伝子を増幅させ、ベクターpBI 35SΩ:ANTを作製した。PCR反応には、制限酵素サイト(SalI,BsrGI)を付加したPP2C増幅用プライマーとして、SalI-PP2C-F(配列番号14)、PP2C-BsrGI-R(配列番号15)を用い、ANT増幅用プライマーとして、SalI-ANT-F(配列番号16)、ANT-BsrGI-R(配列番号17)を用いた。
AATTACTATTTACAATTACAGTCGACATGGGACATTTCTCTTCCATG(配列番号14)
PP2C- BsrGI-R:
CGGGCGGCCGCTTTACTTGTACACTATAGAGATGGCGACGACG(配列番号15)
SalI-ANT-F: AATTACTATTTACAATTACAGTCGACATGAAGTCTTTTTGTGATAATGATGATAATAATCAT(配列番号16)
ANT-BsrGI-R: AGCCGGGCGGCCGCTTTACTTGTACATCAAGAATCAGCCCAAGCAGCG(配列番号17)
PP2C-SacI-R1: GAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCCTATAGAGATGGCGACGA (配列番号19)
TDR-SalI-ANT-F1: TTCTTTCTAAAAGCTACGGTCGACATGAAGTCTTTTTGTGAT (配列番号20)
ANT-SacI-R1: GAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAAGAATCAGCCCAAGC (配列番号21)
上記の場合と同様に、プラスミドDNAをテンプレートにして、下記に示した各プライマーを用いてPCR反応を行い、増幅した。SUC2:PP2C増幅用プライマーとして、SUC2-SalI-PP2C-F1(配列番号22)、及び、PP2C-SacI-R1(配列番号23)を用い、SUC2:ANT増幅用プライマーとして、SUC2-SalI-ANT-F1(配列番号24)、及び、ANT-SacI-R1(配列番号25)を用いた。次いで、上記の場合と同様に、増幅した遺伝子をクローニングし、植物発現用ベクターpBI SUC2:PP2C、及び、pBI SUC2:ANTを作製した。
PP2C-SacI-R1: GAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCCTATAGAGATGGCGACGA(配列番号23)
SUC2-SalI-ANT-F1: TTTCTTGGTTTGTCAAATGTCGACATGAAGTCTTTTTGTGAT(配列番号24)
ANT-SacI-R1: GAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAAGAATCAGCCCAAGC(配列番号25)
上記で作製したベクター(pBI 35SΩ:PP2C,pBI SUC2:PP2C,pBI TDR:PP2C,pBI 35SΩ:ANT,pBI SUC2:ANT,pBI TDR:ANT)を野生型のシロイヌナズナ(Col−0)へfloral−dip法(Clough and Bent, 1998)を用いて形質転換し、4種類の形質転換体(35SΩ:PP2C,SUC2:PP2C,TDR:PP2C,35SΩ:ANT,SUC2:ANT,TDR:ANT株)を作製した。野生型のシロイヌナズナと、上記の形質転換体と、をカナマイシン(終濃度30μg/mL)とカルベニシリン(終濃度100μg/mL)を含むMS培地で生育させ、T1植物の選抜を行った。その後、スーパーミックスA(サカタのタネ)を使用して鉢上げした。栽培室(22℃、16時間明条件(約50μmol・m-2・s-1白色蛍光灯)/8時間暗条件、湿度60%)で生育させ、T2種子を取得した。
T2種子を3日間の春化処理後、スーパーミックスAを使用して直播した。9週間生育させた各シロイヌナズナ植物体の丈を実測した。次に、第一花序茎の基部から20mm部分で切断した花序茎サンプルを5%アガロースに包埋した。その後、マイクロスライサー[DTK−1000(Dosaka)]を使用して、包埋した花序茎サンプルの中央部(第一花序茎の基部から20mm周辺に対応する)を100μmの厚さで切片作製を行った。この花序茎の横断切片を0.05%(w/v)Toluidine blueで室温、1分間染色し、洗浄後、顕微鏡で観察した。Adobe Photoshopを使用して横断切片写真の画像処理を行い、維管束組織の中の師部組織を抽出した。花序茎の直径、横断面積および師部面積をPaint.NET(http://www.paint.net/)を使用して測定した。また、師部比率を、横断面積当たりの師部面積で求めた。
配列番号8〜25:プライマー
Claims (13)
- 管状要素分化抑制因子(Tracheary element differentiation inhibitory factor TDIF)受容体(TDR)のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、管状要素分化抑制因子の受容体活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を制御するプロモーターと、
前記プロモーターよって作動可能に連結される配列番号4で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、プロテインフォスファターゼ2C活性を有するタンパク質をコードするDNA又は配列番号5で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同一の活性を有するタンパク質をコードするDNAと、
を保持する植物細胞を有する形質転換植物体であって、
前記形質転換植物体の師部組織量が野生株に比べて2.0倍以上増加している、形質転換植物体。 - 前記DNAは、配列番号4で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有し、プロテインフォスファターゼ2C活性を有するタンパク質をコードするDNAである、請求項1に記載の形質転換植物体。
(又は請求項2の削除) - 前記師部組織は前記形質転換植物体の茎の師部組織である、請求項1又は2に記載の形質転換植物体。
- スクロース輸送タンパク質SUC2(Sucrose transport protein SUC2)のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有し、スクロース輸送タンパク質活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を制御するプロモーターと、
前記プロモーターによって作動可能に連結される配列番号4で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有し、プロテインフォスファターゼ2C活性を有するタンパク質をコードする細胞増殖促進遺伝子と、
を保持する植物細胞を有する形質転換植物体であって、
前記形質転換植物体の師部組織量が野生株に比べて2.0倍以上増加している、形質転換植物体。 - 前記師部組織は、茎の師部組織である、請求項1〜4のいずれかに記載の形質転換植物体。
- 双子葉植物であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換植物体。
- アブラナ科植物であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換植物体。
- 単子葉植物であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換植物体。
- イネ科植物であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換植物体。
- アオイ科植物あることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換植物体。
- 一年草であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換植物体。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の形質転換植物体を育成する工程を備える、植物体の生産方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の形質転換植物体を育成する工程を備える、植物体の師部組織の増産方法。
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