JP6617694B2 - 植物体におけるゲノムシャッフリングのためのポリペプチド及びその利用 - Google Patents
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Description
組織間移動活性のための第2のポリペプチド領域と、
を備える、ポリペプチド。
(2)前記組織間移動活性は、生殖組織若しくは器官又はその前駆組織若しくは器官を移動先とする、(1)に記載のポリペプチド。
(3)前記第2のポリペプチド領域は、フロリゲンタンパク質の前記組織間移動活性のためのポリペプチドを有している、(2)に記載のポリペプチド。
(4)前記フロリゲンタンパク質は、アブラナ科植物由来である、(3)に記載のポリペプチド。
(5)前記アブラナ科植物は、シロイヌナズナである、(4)に記載のポリペプチド。
(6)前記第1のポリペプチド領域は、多頻度制限酵素活性を有している、(1)〜(5)のいずれかに記載のポリペプチド。
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載のポリペプチドを含む、ゲノムシャッフリング剤。
(8)(1)〜(6)のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(9)(8)に記載のポリヌクレオチドを含む、ゲノムシャッフリング剤。
(10)(8)に記載のポリヌクレオチドを備える、発現ベクター。
(11)(1)〜(6)のいずれかに記載のポリペプチド又は当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する、植物体。
(12)植物体におけるゲノムシャッフリング方法であって、
請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチドを植物体に導入して、前記組織間移動活性と前記DNA二本鎖切断活性とを、前記植物体内で作用させる工程を備える、方法。
ナス科:タバコ(Nicotiana tabacum)、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ(Solaneum tuberosum)、トマト(Lycopersicon lycopersicum)、トウガラシ(Capsicum annuum)、ペチュニア(Petunia)など。
マメ科:ダイズ(Glycine max)、エンドウ(Pisum sativum L.)、ソラマメ(Vicia faba)、フジ(Wisteria floribunda)、ラッカセイ(Arachis hypogaea)、ミヤコグサ(Lotus corniculatus var. japonicus)、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)、アズキ(Vigna angularis)、アカシア(Acacia)など。
キク科:キク(Chrysanthemum morifolium)、ヒマワリ(Helianthus annuus)など。
ヤシ科:アブラヤシ(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、ココヤシ(Cocos nucifera)、ナツメヤシ(Phoenix dactylifera)、ロウヤシ(Copernicia)など。
ウルシ科:ハゼノキ(Rhus succedanea)、カシューナットノキ(Anacardium occidentale)、ウルシ(Toxicodendron vernicifluum)、マンゴー(Mangifera indica)、ピスタチオ(Pistacia vera)など。
ウリ科:カボチャ(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo)、キュウリ(Cucumis sativus)、カラスウリ(Trichosanthes cucumeroides)、ヒョウタン(Lagenaria siceraria var. gourda)など。
バラ科:アーモンド(Amygdalus communis)、バラ(Rosa)、イチゴ(Fragaria)、サクラ(Prunus)、リンゴ(Malus pumila var. domestica)など。
ナデシコ科:カーネーション(Dianthus caryophyllus)など。
ヤナギ科:ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)など。
イネ科:トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ(Hordeum vulgare)、コムギ(Triticum aestivum)、タケ(Phyllostachys)、サトウキビ(Saccharum officinarum)、ネピアグラス(Pennisetum purpureum)、エリアンサス(Erianthus ravennae)、ミスキャンタス(ススキ)(Miscanthus variegatum)、ソルガム(Sorghum)スイッチグラス(Panicum)など。
ユリ科:チューリップ(Tulipa)、ユリ(Lilium)など。
フトモモ科:ユーカリ(Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis)など。
本明細書に開示される本ポリペプチドは、組織間移動活性と、DNA二本鎖切断活性と、を備えることができる。
本ポリペプチドが有するDNA二本鎖切断活性は、DNA二本鎖切断酵素を規定するポリペプチドに基づくことができる。すなわち、公知のDNA二本鎖切断酵素を規定するポリペプチドから適宜選択し、かかるポリペプチドを、本ポリペプチドの一部に、例えば、第1のポリペプチド領域、すなわち、DNA二本鎖切断活性のためのポリペプチド領域として備えることができる。
第1のポリペプチド領域としては、DNA二本鎖切断酵素のポリペプチド又はその活性に寄与する部分ポリペプチドを適用することができる。こうしたDNA二本鎖切断酵素としては、公知のいわゆる制限酵素を用いることができる。制限酵素は、その認識部位、至適温度、アミノ酸残基数等を適宜考慮して選択することができる。
[2×(フォームIIIの線量(cpm)+フォームIIの線量(cpm))/(フォームI、II及びIIIの合計線量(cpm))]×DNA量(pmol)
本ポリペプチドは、組織間移動活性を有している。組織間移動活性は、組織間移動活性を有するタンパク質を規定するポリペプチドに基づくことができる。ここで、組織間移動活性とは、植物体のある組織から当該組織以外の他の組織に移動する活性をいう。移動元の組織からみて移動先の組織である他の組織とは、植物体における組織の分類において異なる組織又は器官である。移動元組織と移動先組織とは特に限定しないが、例えば、移動先組織、すなわち、標的組織としては、生殖組織若しくは器官又はその前駆組織若しくは器官とすることができる。かかる組織又は器官を標的とすることで、ゲノムシャッフリングを、次世代に継承させるゲノムに対して選択的に実施することができる。一方、植物体の他の組織においては、ゲノムシャッフリングが抑制され、植物体の生存や生長への影響が低減できる。
第2のポリペプチド領域としては、組織間移動活性を有するポリペプチド又はその活性に寄与する部分ポリペプチドを適用することができる。すなわち、こうした組織間移動活性を有するポリペプチドとしては、公知の組織間移動活性ポリペプチドから、目的に合った組織間移動活性を有するポリペプチドを選択することができる。
第7位〜20位(14AA)
Arabidopsis thaliana(番号63(配列番号1)、以下、同じ。):D, P, L, I, V, S, R, V, V, G, D, V, L, D
全体からみたバリエーション:D/E, P/T/S, L, I/V/S/A/L, V/1, S/G, R/G, V/I, V/I, G/T/P, D,V/I, L/I/V, D/E/N
(第2モチーフ)
第39位〜46位(8AA)
Arabidopsis thaliana:NGLDLRPS
全体からみたバリエーション:N,G/S, L/S/V, D/E, L/F/I, R/K, P/H, S
(第3モチーフ)
第51位〜88位(38AA)
Arabidopsis thaliana:KPRVEIGGEDLRNFYTLVMVDPDVPSPSNPHLREYLHW
全体からみたバリエーション:K/Q/H, P, R,V/I, E/D/V, I/V, G, G, E/D/N/T/P, D/E, L/M, R, N/T/S/I, F, Y/F, T, L, V, M, V/A, D/V, P, D,V/A, P, S, P, S, N/D/E/S, P, H/N/S/R/T, L, R/K/T, E, Y, L, H, W
(第4モチーフ)
第89位〜148位(60AA)
Arabidopsis thaliana:LVTDIPATTGTTFGNEIVCYENPSPTAGIHRVVFILFRQLGRQTVYAPGWRQNFNTREFA
全体からみたバリエーション:L, V, T, D, I, P, A/G, T/S, T, G/A/E, T/A/S/V/T, T/N/S/A/P, F, G, N/Q/H/S, E,I/V, V/M/I, C/S, Y/H, E/G, N/S, P, S/R/L/G, P, T/S/Y/N//I, A/S/V/M/I/L, G, I, H, R, V/F/L/I, V/I/C/L, F/L/M, I/V/A, L, F/L, R/Q/H, Q, L, G/R, R,Q,T,V, Y/F, A/E/T/P, PGWR, Q/P, N/Q/H, F, N/S, T, R/K, E/D/G/N, F, A/T
(第5モチーフ)
第149位〜174位(26AA)
Arabidopsis thaliana:EIYNLGLPVAAVFYNCQRESGCGGRR
全体からみたバリエーション:E/S/A, I/L/V, Y, N, L/I, G, L/S/P/Q/H, P/A, V/I, A/S, A/S/T, V/L/A, F/Y, Y/F/C, N/D, C, Q, R, E/D, S/A/T/G/N/R, G, C/S/T, G, G, R, R
本ポリペプチドは、植物体内で存在させることにより、その組織間移動活性に基づいて所定の標的組織に到達される。そして、標的組織においてそのDNA二本鎖切断活性に基づいてゲノムシャッフリングを生じさせることができる。すなわち、本ポリペプチドは、ゲノムシャッフリング剤として有用である。
本明細書によれば、本ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(以下、本ポリヌクレオチドともいう。)も提供される。本ポリヌクレオチドは、それ自体、ゲノムシャッフリング剤として有用である。本ポリヌクレオチドは、一本鎖DNA、二本鎖DNAのほか、一本鎖RNA、DNA/RNAハイブリッド、DNA/RNAキメラ等が挙げられる。結果として、本ポリペプチドのアミノ酸配列を情報としてコードできるものであればよい。本ポリヌクレオチドは、例えば、一本鎖又は二本鎖DNAの形態や一本鎖又は二本鎖RNAの形態が挙げられる。
本明細書によれば、本ヌクレオチドを備える発現ベクター(以下、本発現ベクターともいう。)が提供される。本発現ベクターは、本ポリヌクレオチドによってコードされる情報(本ポリペプチドのアミノ酸配列)を発現させることを意図するものである。本発現ベクターは、本ポリヌクレオチドを備えるとともに、本ポリペプチドを発現させるための1又は2以上の制御領域を備えることができる。制御領域としては、プロモーターのほか、ターミネーター、選抜マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、発現ベクターは、核移行シグナルをコードする領域も備えることができる。
本明細書に開示されるゲノムシャッフリング方法(以下、本シャッフリング方法ともいう。)は、本ポリペプチドを植物体に導入して、組織間移動活性とDNA二本鎖切断活性とを植物体内で作用させる工程を有することができる。本シャッフリング方法によれば、組織間移動活性によって規定される標的組織においてDNA二本鎖切断活性を発揮させることができ、標的組織におけるゲノムシャッフリングが可能となる。
第1の態様は、本ポリペプチドをコードするDNAなどの本ポリヌクレオチド又は本発現ベクターを植物体に導入して、本ポリペプチドを発現させる態様である。植物体において本ポリペプチドを発現させるために本発現ベクター等を植物体に導入するには、各種公知の方法を採用できる。例えば、本発現ベクター等をPEG法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、植物ウィルス法等の公知の植物体における形質転換方法を用いて植物体内に導入する。また、細胞や組織にアグロバクテリウムを感染させるほか、フローラルディップ法やフローラルスプレー法などで花にアグロバクテリウムを感染させるなどの各種のアグロバクテリウム法等を用いる。
第2の態様は、本ポリペプチドを植物体に塗布、噴霧、浸漬、注入、エレクトロポレーション等により直接導入する態様である。本ポリペプチドの植物体への導入方法は、特に限定しないで、適当な形態を採用できる。本ポリペプチド植物体に直接供給するには、例えば、植物体又はその一部に、本ポリペプチドが水や緩衝液などの水系媒体に溶解した状態で供給する。こうすることで、効率的に植物体内に本ポリペプチドが導入される。
次いで、植物体において本ポリペプチドの活性を作用させる態様について説明する。植物体内において本ポリペプチドの組織間移動活性及びDNA二本鎖切断活性を作用させる態様は、特に限定するものではなく、意図する組織間移動活性とDNA二本鎖切断活性とを発揮させ、好適なゲノムシャッフリングレベルが得られるように適宜設定することができる。
本ポリペプチドのDNA二本鎖切断活性及び組織間移動活性を最も有利に用いるには、本ポリペプチドを生殖組織又は器官以外の組織又は器官に導入し、その組織間移動活性に基づいて生殖組織又は器官又はその前駆体に移動させて、その場所でDNA二本鎖切断活性に基づいて次世代に継承されるゲノムをシャッフリングする態様が挙げられる。
本ポリペプチドの活性、特に、そのDNA二本鎖切断活性を概ね一定に構成的に作用させる場合、DNA二本鎖切断活性の植物体への障害を考慮すると、例えば、いくつかの態様が挙げられる。いずれも、DNA二本鎖切断活性を一定以下の強度にコントロールして構成的に作用させる態様である。
本ポリペプチドの活性、特に、そのDNA二本鎖切断活性を一時的に作用又は向上させる場合においても、いくつかの態様が挙げられる。
コンストラクトpBI 35SΩ: FT-TaqI 及び pBI HSP18.2: FT-TaqI を作製するために、まず、Arabidopsis thaliana (Col-0) のゲノムをテンプレートにして、プライマー (XhoI-HSP18.2-F:5′-actcgagtctggtggtttcaacttggg-3′(配列番号5)、 HSP18.2-SalI-BamHI-R: 5′- aggatccgtcgactgttcgttgcttttcgggag-3′)(配列番号6)でPCR増幅し、 HSP18.2 のプロモーター領域を含む DNA 断片を単離した。この DNA 断片 pBI 101N2 ベクター (Sugimoto et al.(2014) J. Exp. Bot., 65, 5385-5400) へクローニングし、pBI HSP18.2: GUS とした。
上記のベクターをシロイヌナズナの野生株 (Col-0)、あるいは1406株(Endo, M.ら、EMBO J., 25, 5579-5590)へFloral-dip 法(Clough, S.J.ら、Plant J., 16(1998), 735-743)を用いて形質転換した。なお、1406株は β-gluculonidase(GUS)遺伝子の一部が互いに重なるように二分割された遺伝子断片が direct orientation に配置された改変型GUSレポーター遺伝子がCol-0株に導入された株である。改変型GUSレポーター遺伝子はそれ自身では機能的なGUSを生産できないが、改変型GUSレポーター遺伝子内で相同組み換えが生じると正常なGUS遺伝子へと変換され、機能的なGUS を生産できるようになる。T1植物の選抜はカナマイシン(終濃度30μg/mL) と カルベニシリン (終濃度100μg/mL) を含むMS培地で行った。その後、スーパーミックスA (サカタのタネ) を使用して鉢上げした。
コントロール株(1406株)と35SΩ: FT-TaqI 株の種子を3日間、春化処理を行った。その後、スーパーミックスA (サカタのタネ) に播種し、長日条件(16時間明条件/8時間暗条件、およそ50μmol m-2 s-1の白色蛍光灯) 下の人工気象室 (22℃、湿度約60%) で生育させた。 第一花茎が10mmに達するまでに要した時間とその時の葉の枚数を測定した。結果を図3に示す。
FTタンパク質 (Wigge, P.A. (2011) FT, A Mobile Developmetal Signal in Plants. Curr. Biol., 21, R374-R378.) は葉組織で合成され、師部組織を経由して茎頂まで移動し、花芽組織の分化を誘導(開花の誘導)する。
図3(A) は播種後 24日目のコントロール株 (1406株) と1406株/ 35SΩ: FT-TaqI 株の写真である。1406株は抽苔していないのに対し、1406株/ 35SΩ: FT-TaqI 株は抽苔し花茎を伸長させていた。また、第一花茎が10mm に達した時点を開花と定義し、それまでに要した時間とその時点のロゼット葉の枚数を測定した。1406株/ 35SΩ: FT-TaqI 株はコント―ロール株 (1406株) と比較して、開花日数が7〜10日間早く、ロゼット葉の枚数も6枚程度少なかった (図3B, C)。したがって、1406株/ 35SΩ: FT-TaqI 株は生育時間と発生ステージの両面からも早期に開花していることが明らかとなった。このことから、FT-TaqI には フロリゲンタンパク質と同様の機能があり、開花を誘導できることが明らかとなった。
実施例2で作製したpBIHSP18.2:FT-TaqIを導入したCol-0をMS培地(1%Sucroseを含む)(GellanGum(終濃度0.5%))に播種し、3日間、春化処理を行った。その後、人工気象室(22℃、湿度約60%)に移し、長日条件(16時間明条件/8時間暗条件、およそ50μmolm-2s-1の白色蛍光灯)下で生育させた。20〜26日間(春化処理の期間を含む)生育させた植物体はスーパーミックスAを使用して鉢上げし、種子が結実するまで栽培した。T2植物の中から、narrow leaf(nle)変異株を単離した。これらの変異株の写真を図3に示す。
nle変異株の原因変異を特定するため、遺伝地図の作成を行った。nle変異株(バックグラウンドCol-0)と野生株(Ler)を交配させて得られた植物体からF1種子を得た。F1植物のうち、nle変異の表現型を示す株を自家交配させ得られたF2植物集団をマッピング集団とした。nle-r表現型(=野生株の表現型)を示すF2株を使用して、各染色体の任意の位置の核型を決定したところ、どの染色体上にもnle変異をマップすることができなかった。
Claims (12)
- DNA二本鎖切断活性を有する第1のポリペプチド領域と、
組織間移動活性を有する第2のポリペプチド領域と、
を備える、ポリペプチド。 - 前記組織間移動活性は、生殖組織若しくは器官又はその前駆組織若しくは器官を移動先とする、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第2のポリペプチド領域は、フロリゲンタンパク質の前記組織間移動活性を有するポリペプチドを有している、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記フロリゲンタンパク質は、アブラナ科植物由来である、請求項3に記載のポリペプチド。
- 前記アブラナ科植物は、シロイヌナズナである、請求項4に記載のポリペプチド。
- 前記第1のポリペプチド領域は、多頻度制限酵素活性を有している、請求項1〜5のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチドを含む、ゲノムシャッフリング剤。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項8に記載のポリヌクレオチドを含む、ゲノムシャッフリング剤。
- 請求項8に記載のポリヌクレオチドを備える、発現ベクター。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチド又は当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する、植物体。
- 植物体におけるゲノムシャッフリング方法であって、
請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチドを植物体に導入して、前記組織間移動活性と前記DNA二本鎖切断活性とを、前記植物体内で作用させる工程を備える、方法。
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