ES2346647T3 - Secuencias de promotores asociados a semillas. - Google Patents

Abstract

Molécula de ácido nucleico de doble cadena aislada que comprende un promotor bidireccional, que comprende en la dirección 3' a 5' en una primera cadena (a) una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:7 o la SEQ ID Nº: 10, y (b) una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:8 o la SEQ ID Nº:11, en la que dicho promotor bidireccional, cuando se une operablemente a una primera secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección antisentido y una segunda secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección sentido, dirige la expresión de dichas secuencias a niveles más altos en semillas que en otras células y tejidos.

Description

Secuencias de promotores asociados a semillas.

Antecedentes de la invención

El campo de la invención es el de promotores asociados a semillas de plantas.

Existe un interés considerable en la identificación y aislamiento de elementos regulatorios que controlan la expresión génica en las semillas de plantas; tales promotores asociados a semillas y específicos de semilla pueden utilizarse en la generación de plantas transgénicas con las características de semilla deseadas. Por ejemplo, resultan útiles elementos regulatorios específicos de semilla para manipular el metabolismo de lípidos, especialmente la síntesis de ácidos grasos en la semilla, y para mejorar las características agronómicas como la resistencia a los herbicidas y pesticidas y la tolerancia a la sequía.

Los genes de proteínas de almacenamiento de la semilla se encuentran entre los genes de plantas más estrechamente regulados. La expresión de proteínas de almacenamiento de la semilla es altamente específica para semillas, y las transcripciones correspondientes se acumulan a niveles elevados en la fase media a tardía del desarrollo de la semilla. Se han clonado muchos genes de proteínas de almacenamiento de semilla a partir de especies de plantas diversas, y se han analizado en detalle sus promotores (véase, p. ej., Thomas, 1993, Plant Cell 5:1401-1410). Los elementos promotores, que constituyen las regiones reguladoras aguas arriba 5', se han definido funcionalmente por su capacidad de conferir una expresión específica de semilla del gen reporter de la beta-glucuronidasa bacteriana (GUS) en plantas transgénicas (p. ej., Bogue et al. 1990, Mol Gen Genet 222:49-57; Bustos et al. 1989, Plant Cell 1:839-853). El análisis de la deleción de estos promotores ha permitido a los investigadores definir unas regiones dentro de cada promotor que resultan críticas para su regulación global (Bustos et al. 1991, EMBO J 10:1469-1479; Chung, 1995, Ph.D. Dissertation, Texas A&M University; Nunberg et al 1994, Plant Cell 6:473-486).

En algunos casos, se han mapeado los elementos reguladores cis y se han clonado los factores de transactivación que confieren funcionalidad. Se han descubierto elementos en cis que regulan la expresión de proteínas de almacenamiento de semilla en genes de una variedad de especies de plantas que incluyen el arroz, girasol, judías verdes y semillas de soja. Se han identificado las secuencias conservadas de nucleótidos que se encuentran comúnmente en las regiones reguladoras específicas de semilla e incluyen la caja legumina (leg-box) que comprende un elemento básico de CATGCATG, también denominado elemento de repetición RY.

El promotor napin (del gen napA que codifica la proteína de almacenamiento 2S de Brassica napus) se utiliza ampliamente para controlar la expresión de los genes biosintéticos de lípidos en plantas transgénicas (Josefsson et al., 1987, J Biol Chem 262:12196-201; Stalberg et al., 1993, Plant Mol Biol 23:671-83; Ellerstrom et al., 1996, Plant Mol Biol 32:1019-27). El promotor oleosina de Brassica napus dirige la expresión del gen reporter en el embrión y endosperma (Keddie et al., 1994, Plant Mol Biol 24:327-40). En Arabidopsis, el promotor FAE1 se ha utilizado para controlar la expresión del reporter GUS al desarrollar embriones, donde la actividad se detectó tan pronto como 4-5 días después de la fertilización (Rossak et al., 2001, Plant Mol Biol 46:717-25). El promotor de la legumina (LeB4; Baumlein et al., 1991, Mol Gen Genet 225:121-8; Baumlein et al., 1992, Plant J 2:233-9) de la legumbre Vicia faba también se ha caracterizado funcionalmente y ha demostrado promover la expresión específica de semilla de genes heterólogos. La caracterización de los promotores específicos de semilla se reviso en Goossens et al., 1999 (Plant Pyhsiol 120:1095-1104).

La gran mayoría de promotores de plantas nativos son unidireccionales, con un promotor aguas arriba (5') que dirige sólo un gen que es 3' respecto al promotor. Existen promotores bidireccionales en algunos procariotas y virus, y se han identificado promotores bidireccionales que son activos en plantas a partir de patógenos de plantas virales (geminivirus; Frey et al., 2001, Virus Genes 22:231-42) y bacterianos (Agrobacterium; Schmulling et al., 1989, Plant Cell 1:665-70; Leung et al., 1991, Mol Gen Genet 230:463-74). Se ha propuesto una estrategia para desarrollar promotores bidireccionales, básicamente añadiendo una región promotora mínima al extremo aguas arriba de un promotor unidireccional (Xie et al., 2001, Nat Biotechnol 19:677-9). Además, se ha caracterizado un promotor bidireccional de Brassica napus en el que la región reguladora controla la expresión específica de semilla en una dirección mientras en la orientación opuesta, el promotor dirige la expresión en una variedad de tejidos que incluyen las hojas y las raíces (Keddie et al., 1994, Plant Mol Biol 1994 24:327-40; Sadanandom et al., 1996, Plant J 10:235-42). Sin embargo, no se han descrito promotores de plantas que controlen la expresión asociada a semilla en ambas orientaciones.

Las globulinas y las albúminas son proteínas de almacenamiento de semilla comunes en las plantas dicotiledóneas (dicots). Estas proteínas pueden distinguirse una de otra en base a la solubilidad diferencial; las albúminas son solubles en agua, mientras que las globulinas son solubles en soluciones salinas. En muchas dicots, incluyendo los cítricos y la almendra (Prunus amygdalus), las globulinas 12S son las proteínas de almacenamiento de semilla más prevalentes. Las globulinas 12S son proteínas multiméricas compuestas por subunidades de dímero. Cada dímero contiene una subunidad alfa de 30-40 kDa y una subunidad beta de 20 kDa. Las subunidades de dímero se derivan de un polipéptido precursor simple que experimenta varias modificaciones post-traduccionales, que incluyen el clivaje de un péptido señal seguido del clivaje de la pre-proteína en las subunidades alfa y beta.

\newpage

Se han aislado de la almendra dos clones de cADN de longitud completa que codifican proteínas de almacenamiento de semilla de la globulina 12S de la prunina (Pru1 y Pru2) (Prunus amygdalus cv Texas; Garcia-Mas et al., 1995, Plant Mol Biol 27:205-10). Cada transcripción codifica una pre-proteína que se procesa para crear las subunidades alfa y beta que comprenden la proteína de almacenamiento de semilla madura de \sim60 KDa. A nivel de aminoácido, la Pru1 y Pru2 son idénticas en un 63% a la Pru2 que contiene dos separaciones en la región que corresponde a la subunidad alfa. Las dos transcripciones de prunina son específicas de semilla y se encuentran entre los más abundantes en las semillas inmaduras. Aparentemente las principales proteínas de almacenamiento en la almendra son globulinas tipo legumina que consisten en dos pares de polipéptidos, cada par codificado por un único gen (Garcia-Mas
et al., 1995).

Resumen de la invención

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un constructo de ácido nucleico según se define en la reivindicación 1. La invención abarca un promotor bidireccional (PRU) que tiene una actividad de promotores asociados a semilla que comprende en la dirección 3' a 5', las siguientes regiones: (a) una secuencia del promotor mínimo que contiene una caja TATA, y (b) una secuencia que confiere la especificidad de semilla que contiene un motivo con similitud al consenso caja legumina CATGCATG. En algunas formas de realización el promotor PRU comprende adicionalmente (c) un motivo de secuencia aguas arriba que se predice que funciona como elemento potenciador. El promotor PRU es bidireccional, teniendo una cadena complementaria que también comprende unas regiones (a) y (b), y opcionalmente (c). En una forma de realización de la invención, el promotor PRU bidireccional se utiliza en un vector de expresión de doble cadena de la planta que comprende, en la orientación 5' a 3', una primera secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección antisentido, el promotor PRU, y una segunda secuencia de codificación heteróloga en dirección sentido, en la que el promotor PRU dirige la expresión asociada a semilla de la primera y de la segunda secuencia de codificación de una proteína heteróloga. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión en plantas según se define en la reivindicación 9. De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una célula de planta transgénica según la reivindicación 12. De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una planta transgénica, método según se define en la reivindicación 16. De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona una planta transgénica según se define en la reivindicación 17. De acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona una parte de una planta según se define en la reivindicación 21.

Descripción de la figura

Las figuras 1A y 1B muestran un alineamiento de la secuencia completa del nucleótido del promotor ChPRU (cadena superior en la Fig. 1; SEQ ID Nº:1) con su complemento inverso (cadena inferior; SEQ ID Nº:6). Las siguientes características se indican en texto en cursiva y en negrita para cada secuencia: (1) caja TATA putativa, (2) motivo con similitud al consenso caja legumina CATGCATG, y (3) un motivo de secuencia aguas arriba común a ambas orientaciones del promotor ChPRU. Cada una de estas características está asociada a regiones de alta identidad entre la secuencia del promotor ChPRU y su complemento inverso, indicado mediante subrayado, y se predice que funcionan como (1) secuencias del promotor mínimo, (2) secuencias que confieren la especificidad de semilla, y (3) elementos potenciadores.

Descripción detallada de la invención

Se describen secuencias aisladas de ácidos nucleicos correspondientes a promotores bidireccionales que dirigen la expresión específica de semilla en la semilla de una planta. Se describen genes quiméricos, constructos de ADN, y vectores de transformación de plantas que son útiles para la expresión de genes heterólogos y para la generación de tejido de plantas transgénicas con las características deseadas.

Secuencias promotoras PRU

Identificamos los ortólogos putativos de la cereza (Prunus avium) del gen de la prunina de la almendra (Prunus amygdalus), y recuperamos la secuencia del promotor asociado, que hemos denominado "promotor chPRU". Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia del promotor" se refiere a una secuencia de una molécula de ADN que dirige la transcripción de un gen aguas abajo al que está unida operablemente. La expresión "unido operablemente" en relación con un vector o constructo de ADN recombinante significa que los componentes del nucleótido del vector o constructo de ADN recombinante se encuentran en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Más concretamente, en el contexto de un promotor, "unido operablemente" significa que la transcripción o traducción de la secuencia del nucleótido heterólogo está bajo la influencia de la secuencia del promotor. Por ejemplo, un promotor está unido operablemente a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia. Las secuencias unidas operablemente suelen ser, aunque no siempre, contiguas (por ejemplo, los potenciadores no suelen ser contiguos a las secuencias cuya expresión afectan).

Se descubrió que el promotor aislado dirigía la expresión de genes asociados a semilla de alto nivel cuando se unía operablemente a las secuencias de codificación heterólogas. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "promotor PRU aislado" y "promotor chPRU" se refieren a un ácido nucleico que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID Nº:1 o el complemento inverso de la misma, la SEQ ID Nº:6. La expresión también abarca fragmentos y derivados de las mismas que conservan la actividad de promotores asociados a semilla según se analiza en mayor detalle más adelante. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "promotor asociado a semilla" se refiere a un promotor que dirige la síntesis de ARN a niveles más altos en las semillas que en otras células y tejidos. Un promotor "específico de semilla" es un promotor asociado a semilla que dirige la síntesis de ARN básicamente sólo en la semilla. Pero, bajo determinadas condiciones y utilizando unos métodos de detección concretos, pueden detectarse niveles muy bajos de expresión en tejido diferente de la semilla a partir de un promotor específico de semilla.

Hemos descubierto que el promotor chPRU es bidireccional porque dirige la expresión de genes que lo flanquean a cada lado, lo que hemos denominado ChPru1 y ChPru2. La secuencia proporcionada en la SEQ ID Nº:1 se encuentra en la misma orientación 5' a 3' como la orientación sentido del gen que tiene la mayor homología con la Pro2 de la almendra, lo que hemos denominado chPru2. Su complemento inverso (SEQ ID Nº:6) se encuentra en la misma orientación 5' a 3' que el gen que hemos denominado chPru1. Un experto en la materia entenderá que una molécula de ácido nucleico de doble cadena (p. ej. ADN) que comprende una secuencia específica comprende intrínsecamente el complemento inverso de esa secuencia. Sin embargo, puesto que las secuencias en una u otra orientación pueden ser importantes para utilidades concretas, puesto que puede haber ocasiones en las que se utilicen moléculas de ácido nucleico de una sola cadena, y puesto que el promotor PRU aislado funciona de manera bidireccional, se detallan específicamente las secuencias en ambas orientaciones.

En una forma de realización preferente, el promotor PRU de la presente invención es bidireccional, y comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID Nº:1. En otra forma de realización preferente, el promotor PRU de la presente invención comprende el complemento inverso de la secuencia proporcionada en la SEQ ID Nº:1, como se proporciona en la SEQ ID Nº:6. Las secuencias del promotor PRU también pueden definirse como secuencias situadas naturalmente aguas arriba del codón de inicio de la traducción de un gen chPru1 o chPru2 en el genoma de la cereza, secuencias que son capaces de dirigir la expresión asociada a semilla de chPru1 o chPru2. Los genes chPru1 y chPru2 pueden identificarse por fragmentos de sus secuencias de codificación, que se describen en la presente memoria como SEQ ID Nº:2 (chPru1) y SEQ ID Nº:3 (chPru2). El codón de inicio predicho de chPru1 se encuentra en los nucleótidos 1-3 de la SEQ ID Nº:2. Existen dos codones de inicio potenciales predichos para chPru2, y éstos se sitúan en los nucleótidos 1-3 de la SEQ ID Nº:3 y en los nucleótidos 7-9 de la SEQ ID Nº:3 (el marco de lectura de la proteína no se vería afectado por qué codón de inicio se utiliza).

Aunque toda la secuencia de un promotor PRU aislado es suficiente para la actividad de promotores asociados a semilla, también serán suficientes secuencias menores o alteradas. De esta manera, se incluyen en el alcance de los promotores PRU para su uso en la presente invención los derivados (que incluyen fragmentos y variantes) de los promotores PRU aislados, derivados que son promotores según se define en la reivindicación 1 y son capaces de dirigir la expresión asociada a semilla de genes heterólogos a los que los promotores se unen operablemente; tales derivados se denominan "funcionalmente activos".

Los derivados incluyen inserciones, deleciones (que incluyen truncamientos 5' y/o 3') y sustituciones de uno o más nucleótidos. Tales derivados pueden ser naturales (p. ej., secuencias polimórficas) o pueden ser sintéticos (incluyendo las variantes de las secuencias descritas que resulten de la mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio) y pueden obtenerse utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia. Los métodos mediante los que puede determinarse empíricamente si una secuencia derivada candidata es lo suficientemente homóloga al promotor PRU aislado para dirigir la expresión de genes asociados a semilla son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria.

Se espera que los fragmentos de las secuencias del promotor chPRU descritas que conservan la actividad de promotores asociados a semilla comprendan mínimamente un dominio del promotor mínimo y un dominio que confiera especificidad de semilla. Estas regiones están contenidas en los nucleótidos 1.055-1.212 de la SEQ ID Nº:1, y los nucleótidos 1.043-1.198 de la SEQ ID Nº:6. De esta manera, en una forma de realización de la invención, el promotor chPRU derivado es unidireccional y comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre los nucleótidos 1.055-1.212 de la SEQ ID Nº:1, y los nucleótidos 1.043-1.198 de la SEQ ID Nº:6. Preferentemente, el promotor chPRU derivado comprende adicionalmente un dominio potenciador putativo, y así comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre los nucleótidos 854-1.212 de la SEQ ID Nº:1, y los nucleótidos 827-1.198 de la SEQ
ID Nº:6.

Se puede hacer referencia a la figura 1 para orientarse en la fabricación de la secuencia chPRU derivada que comparte menos del 100% de la identidad con las SEQ ID N^{os} 1 y 6, y fragmentos de las mismas. En general, se espera que las regiones que comparten una gran identidad con una alineación de la SEQ ID Nº:1 (cadena superior) y su complemento inverso (cadena inferior; SEQ ID Nº:6) contribuyan a la función promotora asociada a semilla y deberían conservarse por lo general en las secuencias derivadas del promotor chPRU. Estas regiones están subrayadas en la Figura 1. Se espera que las regiones de menor identidad resulten innecesarias para la función del promotor asociado a semilla, y puedan por tanto variar sustancialmente en las secuencias derivadas correspondientes, p. ej., que puedan variar en longitud (es decir, que puedan servir como regiones espaciadoras de longitud variable) y/o puedan variar en la identidad de secuencia. Las secuencias dentro de la SEQ ID Nº:1 que se predice que funcionan como (1) secuencia del promotor mínimo, (2) secuencia que confiere la especificidad de semilla, y (3) elemento potenciador, como se muestra en la Figura 1, se exponen en las SEQ ID N^{os}: 7-9, respectivamente. Y, las secuencias dentro de la SEQ ID Nº:6 que se predice que funcionan como (1) secuencia del promotor mínimo, (2) secuencia que confiere la especificidad de semilla, y (3) elemento potenciador, se exponen en las SEQ ID N^{os}: 10-12,
respectivamente.

Las SEQ ID N^{os} 7 y 10, que se corresponden con las regiones del promotor mínimo predichas del promotor chPRU, comparten aproximadamente el 85% de identidad de secuencia entre sí. De esta manera, una secuencia chPRU derivada comprende una región del promotor mínimo que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº: 7 ó 10, y preferentemente por lo menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 7 ó 10. Tal como se utiliza en la presente memoria, "porcentaje (%) de la identidad de secuencia" con respecto a una secuencia sujeto especificada, o una parte especificada de la misma, se define como el porcentaje de nucleótidos en la secuencia derivada candidata idénticos a los nucleótidos de la secuencia sujeto (o parte especificada de la misma), después de alinear las secuencias e introducir las separaciones, en caso de ser necesario para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, según se genera mediante el programa WU-BLAST-2.0a19 (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1997) 215:403-410; http://blast.wustl.edu/blast/README.html) con unos parámetros de búsqueda establecidos a valores por defecto. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia concreta y la composición de la base de datos concreta contra la que se está buscando la secuencia de interés. Un % de valor de identidad se determina mediante el número de nucleótidos idénticos coincidentes divido por la longitud de la secuencia para la que se está describiendo el porcentaje
de identidad.

Las SEQ ID N^{os} 8 y 11, que se corresponden con las regiones que confieren la especificidad de semilla del promotor chPRU, comparten aproximadamente un 87% de identidad de secuencia entre sí. De esta manera, una secuencia chPRU derivada, además de la región del promotor mínimo anteriormente descrita, comprende adicionalmente una secuencia que confiere la especificidad de semilla que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº: 8 ó 11, y preferentemente por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:
8 ó 11.

Como se ha indicado anteriormente, se espera que una región del promotor mínimo y la región que confiere la especificidad de semilla sean suficientes para la actividad de promotores asociados a semilla. De esta manera, en una forma de realización de la invención, un promotor chPRU derivado comprende de la dirección 5' a 3' una secuencia que confiere la especificidad de semilla, y una secuencia del promotor mínimo. En unas formas de realización preferentes, el promotor chPRU derivado comprende adicionalmente un elemento potenciador putativo que se encuentra aguas arriba (es decir, 5') de la región que confiere la especificidad de semilla. Las SEQ ID N^{os} 9 y 12, se corresponden con las regiones potenciadoras predichas del promotor chPRU, y comparten aproximadamente un 80% de identidad de secuencia entre sí. De esta manera, una secuencia chPRU derivada comprende preferentemente una región potenciadora putativa que comparte por lo menos un 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº: 9 ó 12, y preferentemente por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº: 7 ó 10.

Las secuencias derivadas pueden identificarse por su capacidad de hibridación con un promotor PRU aislado bajo condiciones de hibridación rigurosas. El rigor de hibridación puede controlarse mediante temperatura, fuerza iónica, pH, y la presencia de agentes desnaturalizantes como la formamida durante la hibridación y el lavado. Las condiciones utilizadas rutinariamente se presentan en textos de procedimientos fácilmente accesibles (p. ej., Current Protocol in Molecular Biology, Vol. 1, Cap. 2.10, John Wiley & Hijos, Publishers (1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)). En algunas formas de realización, una molécula de ácido nucleico de la invención es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico que contenga la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº:1 o el complemento de la misma bajo condiciones de hibridación rigurosas que comprenden: la prehibridación de filtros que contienen el ácido nucleico durante 8 horas hasta toda la noche a 65ºC en una solución que comprende 6X de citrato salino estándar (SSC) (1X SSC es 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de Na; pH 7,0), 5X solución de Denhardt, pirofosfato de sodio al 0,05% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de arenque; hibridación durante 18-20 horas a 65ºC en una solución que contenía 6X SSC, 1X solución de Denhardt, 100 \mug/ml de tARN de levadura y pirofosfato de sodio al 0,05%; y lavado de filtros a 65ºC durante 1 h en una solución que contenía 0,2X SSC y SDS al 0,1% (dodecil sulfato de sodio). En otras formas de realización, se utilizan condiciones de hibridación moderadamente rigurosas que comprenden: pretratamiento de filtros que contienen ácido nucleico durante 6 h a 40ºC en una solución que contiene formamida al 35%, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, PVP al 0,1%, Ficoll al 0,1%, BSA al 1%, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado; hibridación durante 18-20 h a 40ºC en una solución que contiene formamida al 35%, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100 \mug/ml ADN de esperma de salmón, y sulfato de dextran al 10%(peso/vol); seguido de lavar dos veces durante 1 hora a 55ºC en una solución que contiene 2X SSC y SDS al 0,1%. De manera alternativa, pueden utilizarse condiciones poco rigurosas que comprenden: incubación durante 8 horas hasta toda la noche a 37ºC en una solución que comprende formamida al 20%, 5 x SSC, 50 mM fosfato de sodio (pH 7,6), 5X solución de Denhardt, sulfato de dextran al 10%, y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado; hibridación en el mismo tampón durante 18 a 20 horas; y lavado de filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37ºC durante
1 hora.

Además de los promotores chPRU y derivados anteriormente descritos, la presente invención se dirige a otras secuencias de promotores que se corresponden con el mismo gen, es decir, un ortólogo, en otras especies de plantas. Hemos mostrado que, además de la almendra y la cereza, el albaricoque (Prunus armeniaca), el melocotón (Prunus persica), y la ciruela (Prunus domestica) también expresan la globulina 12S como proteína de almacenamiento de semilla principal. Por consiguiente, un promotor PRU de la invención puede aislarse a partir de una de estas especies. En base a las secuencias de codificación Pru1 y Pru2 de la almendra (Garcia-Mas et al., 1995, supra) y los métodos descritos en la presente memoria, sería de rutina para la persona experta en la materia aislar promotores PRU a partir de estas especies. En un ejemplo, se construye una biblioteca adaptada a PCR de ADN genómico a partir de las especies de interés (véase, p. ej., "PromoterFinder^{TM} Construction Kit," CLONTECHniques, julio 1996). Los cebadores oligonucleótidos se diseñan para la secuencia 5' del cADN de Pru1 de almendra y se utilizan para amplificar una región genómica aguas arriba de la región homóloga de las especies de interés. Secuencias de oligonucleótidos de ejemplo utilizadas para amplificar la secuencia de la prunina de cereza se proporcionan en las SEQ ID N^{os}: 4 y 5. Se utiliza el análisis de secuencias para confirmar que la secuencia de promotor aislada contiene una región de homología a la secuencia del gen de la prunina conocida.

Genes quiméricos

La invención se refiere a unos genes quiméricos (casetes de expresión) que comprenden unas secuencias de nucleótidos del promotor PRU aislado, o un derivado funcionalmente activo del mismo, unido operablemente a, y que controla la expresión de un gen heterólogo. Las expresiones "gen quimérico" y "casete de expresión" se refieren a una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína que comprende unas secuencias que son heterólogas una respecto a la otra (es decir, no se dan conjuntamente de forma natural). Un gen quimérico de la presente invención comprende una secuencia del promotor PRU que es heteróloga con respecto a las secuencias que codifican la proteína. De esta manera, un gen quimérico puede comprender una secuencia que codifica una proteína que sea nativa de una planta, pero heteróloga con respecto al promotor unido operablemente. De esta manera, el gen heterólogo puede ser cualquier gen diferente de chPRU1 o chPRU2. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "gen" significa un segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica, que puede incluir o no regiones que preceden y siguen a la región de codificación, p. ej. secuencias 5' no traducidas (5'UTR) o "líder" y secuencias 3'UTR o "remolque", así como secuencias de intervención (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones). El término "gen" puede utilizarse como sinónimo de las expresiones "secuencia de codificación de un ácido nucleico heterólogo" o la expresión "secuencia de codificación de una proteína".

Un casete de expresión incluye por lo general, en la dirección de transcripción 5' a 3', una región de inicio de la transcripción y la traducción que comprende un promotor sujeto y una secuencia de codificación de proteínas para un gen heterólogo (también denominado "gen de interés"). En una forma de realización preferente, el casete de expresión incluye adicionalmente, 3' respecto a la secuencia de codificación de la proteína, una región de terminación de la transcripción y la traducción funcional en las plantas. La región de terminación, que por lo general incluye un sitio de poliadenilación, puede ser nativa del gen de interés o puede derivarse de otra fuente (véase, p. ej.: Guerineau et al. 1991, Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Sanfacon et al. 1991, Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. 1990, Plant Cell 2:1261-1272; Joshi et al. 1987, Nucleic Acid Res. 15:9627-9639). Regiones de terminación convenientes están disponibles en el plásmido Ti de A. tumefaciens, como regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. En caso necesario, se incluyen en los constructos quiméricos elementos reguladores adicionales de genes diferentes de chPRU1 o chPRU2 suficientes para expresar una cantidad efectiva de polipéptido codificado por el gen heterólogo.

Las técnicas estándares para la construcción de tales genes quiméricos son bien conocidas por las personas capacitadas en la técnica (p, ej., Sambrook et al. Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) e incluyen la ligación de ADN, así como la síntesis química o enzimática.

Constructos de inhibición genética

Los promotores PRU de la invención pueden utilizarse en constructos quiméricos diseñados para inhibir específicamente la expresión de un gen endógeno en la semilla transformada. Métodos de ejemplo para practicar este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a la supresión antisentido (Smith, et al., 1988; van der Krol et al., 1988); cosupresión (Napoli, et al., 1990); ribozimas (publicación PCT WO 97/10328); y combinaciones de sentido y antisentido (Waterhouse, et al., 1998). Los métodos para la supresión de secuencias endógenas en una célula huésped emplean por lo general la trascripción o la trascripción y traducción de por lo menos una parte de la secuencia a suprimir. Tales secuencias pueden ser homólogas de las regiones de codificación así como las de no codificación de la secuencia endógena. La inhibición antisentido puede utilizar toda la secuencia de cADN (Sheehy et al., 1988), una secuencia parcial de cADN que incluya fragmentos de la secuencia de codificación 5', (Cannon et al., 1990), o secuencias de no codificación 3' (Ch'ng et al., 1989). Las técnicas de cosupresión pueden utilizar toda la secuencia de cADN (Napoli et al. 1990, The Plant Cell 2:270-289; van der Krol et al., 1990, Plant Mol Biol 14:457-466), o una secuencia de cADN parcial (Smith et al., (1990). Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "constructos y genes quiméricos de la invención" abarca tales constructos destinados específicamente a inhibir la expresión de un
gen endógeno.

Vectores

Los constructos y genes quiméricos de la invención se encuentran contenidos por lo general dentro de vectores de plantas (también denominados "vectores de expresión en plantas" y "vectores de transformación en plantas") que facilitan su introducción y uso en plantas y células de plantas. Un vector de expresión en plantas contiene todos los elementos para expresar un gen en una planta (es decir, un casete de expresión), y un vector de transformación de plantas también suele contener elementos que permiten que el casete de expresión se integre en el genoma de la planta.

Además del gen quimérico o del constructo de inhibición genética que comprende un promotor PRU, los vectores de la presente invención pueden comprender otras secuencias funcionales. Secuencias de ejemplo incluyen genes marcadores seleccionables que permiten la selección de las células de plantas transformadas haciendo a las células resistentes a una cantidad de agente que resultaría tóxico para las células de plantas no transformadas. Genes marcadores seleccionables de ejemplo incluyen el gen de resistencia neomicina fosfotransferasa (nptll), higromicina fosfotransferasa (hpt), nitrilasa específica para bromoxinil (bxn), enzima fosfinotricin acetiltransferasa (BAR) y el gen de resistencia espectinomicina (spt), en el que el agente selectivo es kanamicina, higromicina, geneticina, el herbicida glufosinato de amonio ("Basta") o espectinomicina, respectivamente. Los vectores pueden contener secuencias adicionales que permiten la selección y propagación en un huésped secundario, como un origen de replicación y una secuencia marcadora seleccionable. Huéspedes secundarios típicos incluyen bacterias y levadura. En una forma de realización, el huésped secundario es Escherichia coli, el origen de replicación es de tipo colE1, y el marcador seleccionable es un gen que codifica la resistencia a la ampicilina. Los vectores de la invención pueden comprender adicionalmente secuencias que faciliten la integración de genes quiméricos en los cromosomas de las plantas, como regiones del plásmido Ti de Agrobacterium tumifaciens. Los sistemas de vectores basados en Ti binarios que pueden utilizarse para transferir polinucleótidos son conocidos por los expertos en la materia, y muchos están comercialmente disponibles (p. ej., pBI121 Clontech Laboratories, Palo Alto, CA).

Dependiendo del vector, toda la secuencia del ácido nucleico del vector de expresión o parte de la misma puede transferirse al genoma de la célula de la planta en la que se introduce. Por ejemplo, para vectores binarios que comprenden unas regiones de borde izquierdo y derecho del plásmido Ti de Agrobacterium, la secuencia de ácido nucleico insertada entre las secuencias de borde izquierdo y derecho suele transferirse al genoma de la célula de una planta, mientras que la secuencia de esqueleto del vector no suele transferirse. De esta manera, cuando se dice que una célula de una planta transgénica comprende un vector de expresión en planta en su genoma, se entenderá que sólo puede comprender la parte del vector que se transfiere normalmente al genoma de la planta.

Una característica importante de la presente invención es la bidireccionalidad del ADN del promotor PRU aislado. Hemos observado que el ADN del promotor aislado es funcional en ambas orientaciones; por consiguiente, la invención proporciona unos vectores en los que el promotor PRU controla simultáneamente la expresión específica de semilla de dos genes heterólogos distintos, así como unos métodos para controlar simultáneamente la expresión específica de semilla de dos genes heterólogos. Tales vectores comprenden por lo general, en dirección 5' a 3', un primer gen heterólogo en dirección antisentido, un promotor PRU bidireccional, un segundo gen heterólogo en dirección sentido. Cada gen heterólogo puede asociarse con secuencias de terminación de la traducción en la orientación y posición apropiada. Un constructo de inhibición genética puede sustituir uno de los genes heterólogos.

La invención proporciona el primer ejemplo de un promotor bidireccional que controla una expresión asociada a semilla similar en cada orientación. La bidireccionalidad del promotor PRU aislado proporciona ventajas específicas para la ingeniería genética de las plantas. Primero, la característica facilita la introducción de múltiples genes en plantas, lo que es a menudo necesario para la ingeniería metabólica y la acumulación de características. El uso del promotor bidireccional puede además evitar el silenciamiento de genes, que puede ser inducido por el uso repetido de un único promotor en una célula.

Los vectores descritos en la presente memoria pueden formar parte de un kit de transformación de plantas.

Plantas transgénicas y células de plantas

Los constructos y genes quiméricos de la invención pueden transferirse a células de plantas mediante cualquier serie de metodologías de transformación de plantas. El experto en la materia reconocerá que existen en la técnica una amplia variedad de técnicas de transformación, y que nuevas técnicas están disponibles continuamente. Puede emplearse cualquier técnica adecuada para la planta huésped diana dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, los constructos pueden introducirse en una variedad de formas que incluyen, pero no se limitan a una cadena de ADN, en un plásmido, o en un cromosoma artificial. La introducción de los constructos en las células de la planta diana puede llevarse a cabo mediante una variedad de técnicas, que incluyen, pero no se limitan a la transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, microinyección, bombardeo de microproyectiles, co-precipitación de ADN-fosfato de calcio o transformación mediada por liposomas de un ácido nucleico heterólogo. La transformación de la planta es preferentemente permanente, es decir, por integración de los constructos de expresión introducidos en el genoma de la planta huésped, de manera que se hagan pasar los constructos introducidos por las sucesivas generaciones de plantas.

En una forma de realización, los genes quiméricos se introducen en las plantas por medio de un plásmido Ti sin ADN-T portado por Agrobacterium tumefaciens, seguido de un co-cultivo de células de A. tumefaciens con células de plantas. En tales casos, los vectores para su uso en la invención contienen un gen marcador seleccionable para determinar si el suceso de transformación ha tenido éxito, las regiones de borde T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, un gen heterólogo de interés, y otros elementos como se deseaba.

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El procedimiento óptimo para la transformación de plantas con vectores Agrobacterium variará con el tipo de planta que se está transformando. Métodos de ejemplo para la transformación mediada por Agrobacterium incluyen la transformación de explantes de hipocotilo, punta apical, tejido de la hoja o tallo, derivado de plántulas y/o plantas de semillero estériles. Tales plantas transformadas pueden reproducirse sexualmente, o mediante cultivo tisular o celular. La transformación por Agrobacterium se ha descrito anteriormente para un gran número de tipos diferentes de plantas y métodos para tal transformación pueden encontrarse en la literatura científica. Resultan de particular relevancia los métodos para transformar las cosechas comercialmente importantes, como la semilla de colza (De Block et al., 1989, Plant Physiol 91:694-701), girasol (Everett et al., 1987, Bio/Technology 5:1201), y semillas de soja (Christou et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:7500-7504; Kline et al., 1987, Nature 327:70). También son relevantes los métodos para la transformación de las especies con prunina, que incluyen la almendra (Miguel et al. 1999, Plant Cell Reports 18:387-93), cereza (Brasileiro et al. 1991, Plant Mol Biol 17:441-52; Dolgov et al. 1998, Acta Hort. [ISHS] 484:577-580), albaricoque y ciruela (Camara Machado et al. 1994, Euphytica 77:129-134; Ravelonandro et al. 1998, Acta Virol 42:270-2), y melocotón (Scorza et al. 1989, Acta Hort. (ISHS) 254:47-47).

La invención proporciona plantas transgénicas o la progenie de estas plantas que contiene constructos y genes quiméricos de la invención. Las células de las plantas se transforman con los genes quiméricos mediante cualquier método de transformación de plantas. La célula de la planta progenitora transformada, habitualmente en forma de un cultivo de callo, disco de hoja, explante o toda la planta (p. ej., a través del método de infiltración al vacío de Bechtold et al. 1993, CR Acad Sci 316:1194-1199) se regenera en una planta transgénica completa mediante métodos bien conocidos para una persona capacitada en la técnica (p. ej., Horsh et al., 1985). Tal como se utiliza en la presente memoria una "célula progenitora transformada" se refiere a una célula transformada que dará lugar directamente o indirectamente a la planta transgénica. Cuando el gen quimérico se porta en un vector que contiene un gen marcador seleccionable que se ha utilizado, las células progenitoras pueden cultivarse en un medio que contenga el agente de selección apropiado para identificar y células de plantas que comprenden el gen quimérico. Puesto que la progenie de plantas transformadas hereda los genes quiméricos, pueden utilizarse las semillas o cortes de las plantas transformadas para mantener la línea transgénica.

La presencia del constructo o gen quimérico en las plantas transformadas o células de plantas puede detectarse utilizando PCR, transferencia de Southern, u otros métodos conocidos para la detección de las secuencias específicas de ADN. La expresión del gen heterólogo o la inhibición de un gen endógeno pueden evaluarse utilizando la transferencia Northern, RT-PCR, u otros métodos conocidos de detección de la síntesis de las especies de nARN específicas. Si hay disponibles anticuerpos para el polipéptido codificado por el gen heterólogo, pueden utilizarse el análisis de Western y la localización inmunohistoquímica para evaluar la producción y localización del polipéptido. La expresión de un gen heterólogo o inhibición de un gen endógeno también puede evaluarse midiendo la actividad del producto del gen, por ejemplo utilizando las técnicas bioquímicas descritas en la presente memoria.

Los métodos descritos en la presente memoria son aplicables generalmente a todas las plantas. Se contemplan tanto las plantas monocotiledóneas como las dicotiledóneas (monocots y dicots). En las plantas cultivadas dicot, el embrión constituye casi toda la semilla, mientras que en los cultivos monocot, el embrión es una pequeña parte de toda la semilla. El grueso de la semilla monocot está comprendido por endosperma, un tejido triploide que sirve de fuente energética para el embrión en germinación. En las monocots, se espera que el promotor PRU dirija la expresión en el embrión y por tanto resulte útil para la manipulación de las características de los embriones, como el contenido en aceite y la calidad del aceite, así como la expresión de las proteínas de almacenamiento embrionarias.

En una aplicación preferente la invención se refiere a frutales y plantas de nuez del género Prunus, incluyendo la almendra, el albaricoque, la cereza, el melocotón, y la ciruela. En otra forma de realización preferente, la invención se refiere a plantas productoras de aceite, que producen y almacenan triacilglicerol en órganos específicos, fundamentalmente en las semillas. Tales especies incluyen la semilla de soja (Glycine max), semilla de colza y canola (incluyendo Brassica napus, B. campestris), girasol (Helianthus annus), algodón (Gossypium hirsutum), maíz (Zea mays), cacao (Theobroma cacao), cártamo (Carthamus tinctorius), palma de aceite (Elaeis guineensis), palma de coco (Cocos nucifera), lino (Linum usitatissimum), ricino (Ricinus communis) y cacahuete (Arachis hypogaea). La invención también puede referirse a plantas de vegetales y frutas, plantas productoras de granos, plantas productoras de nueces, especies de Brassica de ciclo rápido, alfalfa (Medicago sativa), tabaco (Nicotiana), césped (familia Poaceae), otros cultivos de forraje, y especies silvestres que pueden ser una fuente de ácidos grasos únicos. La invención se refiere adicionalmente a especies de plantas modelo, incluyendo la Arabidopsis thaliana.

Los genes quiméricos, vectores, y plantas transformadas y células de plantas descritas en la presente memoria resultan útiles para someter a ensayo derivados del promotor PRU aislado para la actividad asociada a semilla y para evaluar la actividad de un promotor sujeto en una especie de planta específica. Para este uso, el gen heterólogo codifica preferentemente una proteína cuya expresión se detecta fácilmente. Por ejemplo, los genes reporter, ejemplificados por la cloranfenicol acetil transferasa y la beta-glucuronidasa (GUS; véase, p. ej., Jefferson et al. 1987, EMBO J 6:3901-3907), se utilizan comúnmente para evaluar la competencia de transcripción y de traducción de las construcciones quiméricas. Otros genes adecuados incluyen GFP (proteína verde fluorescente; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):8115; Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 216:397-414) y genes que codifican la producción de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449). Hay ensayos estándares disponibles para detectar con sensibilidad la actividad del gen reporter en un organismo transgénico.

Características asociadas a las semillas

Los vectores, y constructos y genes quiméricos de la presente invención resultan útiles para la manipulación genética de plantas y para la producción de plantas con las características deseadas, particularmente características asociadas a semilla. Las plantas transgénicas, células de plantas transgénicas y semilla transgénica de la invención también pueden resultar una fuente útil de material expresado de manera recombinante.

Son de interés diversas características asociadas a las semillas. En una forma de realización de la invención, se utiliza un promotor PRU para modificar la cantidad y/o composición de los carbohidratos, lípidos (especialmente ácidos grasos), y/o aminoácidos en la semilla. Por consiguiente, los genes heterólogos de interés incluyen aquellos implicados en el metabolismo de los aceites, almidón, carbohidratos y nutrientes, así como aquellos que afectan al tamaño del kernel, carga de sucrosa, y similares. En una aplicación específica de la invención, se espera que el gen de la albúmina 2S de la nuez de brasil (Muntz et al., Nahrung 1998 Aug;42(3-4):125-7) se exprese en la semilla para alterar la composición de aminoácidos. En otras aplicaciones, los genes del metabolismo lipídico se expresan para alterar el contenido y/o la composición de los aceites de semilla. Genes del metabolismo lipídico de ejemplo incluyen las desaturasas (véase, p. ej., U.S. Pat. N^{os}. 5.552.306 y 5.614.393), proteínas portadoras de acilo (ACPs), tioesterasas, acetil transacilasas, acetil-coA carboxilasas, ketoacil-sintasas, malonil transacilasas, y elongasas. Tales genes del metabolismo lipídico se han aislado y caracterizado a partir de una serie de bacterias diferentes y especies de plantas. Genes específicos cuya expresión alterada en la semilla han demostrado causar fenotipos lipídicos modificados incluyen diacilglicerol aciltransferasa (Jako et al., 2001, Plant Physiol 2001, 126:861-74), desaturasa ACP modificada (Cahoon and Shanklin, 2000, Proc Natl Acad Sci U S A 97:12350-5), fitoeno sintasa (Shewmaker et al., 1999, Plant J 20:401-412), acetil-coenzima A carboxilasa (Roesler et al., 1997, Plant Physiol 113:75-81), beta-Ketoacil-CoA sintasa (Lassner et al., 1996, Plant Cell 1996, 8:281-92), sn-2 aciltransferasa (Zou et al., 1997, Plant Cell 9:909-23), acil-ACP tioesterasas e hidroxilasa de glicerolípidos.

Genes adicionales de interés codifican características importantes para la agronomía, como la resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades, resistencia a los herbicidas, y características del grano. La invención también permite la expresión asociada a semilla de proteínas farmacéuticamente o industrialmente importantes.

Un aspecto importante de la invención es la capacidad de limitar la expresión de un gen heterólogo bajo el control de un promotor PRU de la semilla de una planta transgénica. Alterar las rutas metabólicas primarias que controlan la producción de carbohidratos, lípidos, y/o aminoácidos puede tener consecuencias perjudiciales en el rendimiento o comportamiento de las plantas si estos cambios metabólicos se dan en todos los tejidos de la planta. Por ejemplo, la eliminación global de la producción de ácidos grasos poliinsaturados tiene como resultado plantas que ya no son fotoautotróficas (McConn and Browse 1998, Plan J 15:521-30); sin embargo, cuando tales alteraciones de los ácidos grasos se confinan a la semilla, no han afectado a la productividad de la planta (Mazur et al. 1999, Science 285:372-5). Para otras aplicaciones, una característica deseada puede depender de la toxicidad localizada del producto del gen. Por ejemplo, la expresión de genes deletéreos o tóxicos puede utilizarse para crear variedades de plantas
sin semilla.

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Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de un fragmento del promotor de la globulina de cereza

El género Prunus está representado por una serie de nueces y frutas comercialmente importantes, incluyendo la almendra, el albaricoque, la cereza, el melocotón y la ciruela. En base a la proximidad taxonómica, se tenía la hipótesis de que los genes que codificaban las proteínas de almacenamiento de semilla principales mostrarían una conservación de la secuencia en las especies de Prunus. Se utilizaron las regiones conservadas de las secuencias Pru1 y Pru2 de la almendra para amplificar los genes de las proteínas de almacenamiento de semilla principales a partir del ADN genómico de la cereza.

Se construyó una biblioteca genómica accesible a PCR a partir de ADN extraído de hojas de cerezo (Prunus avium). Se diseñaron cebadores oligonucleótidos complementarios a la secuencia 5' del clon cADN de la prunina Pru1 (entrada GenBank X78119, gi|460805) a partir de la almendra (pru1 PFa, SEQ ID Nº:4; pru1 PFb, SEQ ID Nº:5) y se utilizaron para amplificar un fragmento genómico de la secuencia aguas arriba de un conjunto de bibliotecas de "promoter finder" (PF) de cereza (Prunus avium). La amplificación dio como resultado un fragmento de 1,2 Kb presente en todas las bibliotecas "promoter finder", lo que proporcionó un resultado interesante puesto que los productos de cada biblioteca por separado se determinan por la posición de un único sitio de restricción.

El producto de amplificación de 1,2 Kb de la biblioteca Dral se clonó en el vector de clonación pCR2.1 y se secuenció. El análisis de la secuencia de nucleótidos confirmó que una región del fragmento de 1,2 Kb es efectivamente homólogo, pero no idéntico, a la Pru1 de almendra. Una búsqueda BLASTN reveló que las 100 bases en el extremo 3' del fragmento compartían una homología significativa con el mARN de P. amygdalus (HS=201, P(N)=3,3e-13), y a ninguna otra secuencia en GenBank.

Además, la secuencia del cebador complementaria a Pru1 se detectó tanto en el extremo 5' como en el 3' del clon, lo que explicaría el resultado inusual de la amplificación del ADN genómico. Los resultados indicaban que existen dos genes similares a la Prunina homólogos en el genoma de la cereza que están en orientaciones opuestas y separadas por una secuencia aguas arriba de 1,2 Kb. Se da un único sitio EcoRI en el centro de la secuencia. También puede deducirse, debido a la ausencia de cualquier otro producto de amplificación de las bibliotecas PF, que estos pueden ser sólo dos copias de genes parecidos a Prunina en el genoma de la cereza.

La secuencia completa del fragmento de 1,2 Kb se determinó y se presenta como la SEQ ID Nº:1. El gen en la orientación con la mayor homología (es decir, de secuencias de codificación) con la Pru1 de almendra se ha denominado chPru1, y el gen el la orientación opuesta se denominó chPru2. La secuencia de la SEQ ID Nº:1 se flanqueó con los sitios de las enzimas de restricción Ncol (CCATGG), que se desarrollaron alrededor de los sitios de inicio de la traducción predichos de ChPru1 y ChPru2. En la orientación hacia adelante, se identificaron una caja TATA y un motivo con homología con una caja legumina, que se ha demostrado que dirige la expresión específica de semilla de las globulinas, en los nucleótidos 1.169-1.175 y en los nucleótidos 1.092-1.098, respectivamente. En la orientación inversa, se identificaron una caja TATA y un motivo tipo caja legumina en los complementos inversos de los nucleótidos 95-100 y los nucleótidos 170-176, respectivamente, de la SEQ ID Nº:1. La alineación de las secuencias aguas arriba chPru1 y chPru2 (es decir, SEQ ID Nº:1 y el complemento inverso de la misma, SEQ ID Nº:6), como se representa en la Figura 1, muestra regiones de conservación entre dos promotores alrededor de la caja TATA putativa, el motivo tipo caja legumina, y un motivo conservado de aproximadamente -350 desde el inicio de traducción (nucleótidos 885-911 en la orientación hacia delante y el complemento inverso de los nucleótidos 372-438 en la
orientación inversa).

La búsqueda de homología de la secuencia de nucleótidos utilizando la secuencia completa aguas arriba de chPru (blastn contra all.na) reveló cierta similitud entre la chPru2 5'UTR y las regiones flanqueadoras 5' de los genes de legumina del guisante, como se muestra en la Tabla 1. La región de similitud comienza en la posición 1.028 en el promotor PRU de la orientación hacia delante (es decir, como se presenta en la SEQ ID Nº:1), que se encuentra en los alrededores del motivo tipo caja legumina, y se extiende a través de la posición 1.235, que se encuentra en el 5'UTR predicho del gen chPru2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Ejemplo 2 Identificación de proteínas de almacenamiento de semilla en el albaricoque, el melocotón, la ciruela, el melón y el tomate

Se inició un estudio de las proteínas de almacenamiento de semilla para identificar otras especies de vegetales y frutas que tuvieran la globulina 12S como proteína de almacenamiento de semilla principal. Se aislaron embriones de semillas de albaricoque, melocotón, ciruela, melón y tomate. Se separaron las albúminas y las globulinas en base a la solubilidad diferencial, se separaron por SDS-PAGE, y se tiñeron con azul de Coomassie. Se confirmó la presencia de globulinas 12S en las semillas de albaricoque, melocotón, y ciruela (embriones). Se encontraron presentes dobletes del polipéptido principal aproximadamente en 20 kDa y 36-38 kDa en las proteínas extraídas de estos embriones. Estos resultados confirmaron la presencia de globulinas como proteína de almacenamiento de semilla principal en el género Prunus. Por el contrario, las proteínas de almacenamiento de semilla principales del tomate y el melón se encontraron presentes como polipéptidos abundantes de aproximadamente 32 y 45 kDa. Los polipéptidos del melón y el tomate son solubles en sal, lo que sugiere que son globulinas pero de una masa molecular diferentes a las pruninas. Estos experimentos sugieren que el promotor PRU será activo en plantas del género Prunus.

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Ejemplo 3 Caracterización de los promotores chPRU en Arabidopsis

Hemos evaluado la fuerza y la especificidad de los promotores chPRU aislados en Arabidopsis, una planta de semilla oleaginosa dicot. El sistema de evaluación utilizaba genes quiméricos que comprendían el cADN de FAD2, que codifica una desaturasa de ácidos grasos, bajo el control de promotores chPRU. Una mutación de pérdida de la función en el FAD2 endógeno ("fad2-1") afecta a la composición de los ácidos grasos tanto en las semillas como en las hojas de las plantas afectadas (Okuley et al. 1994, Plant Cell 6:147-158). Sometimos a ensayo la capacidad de los genes quiméricos de complementar los defectos lipídicos en las plantas transgénicas fad2-1. Comparamos la composición del aceite de semilla y de hoja en las plantas mutantes fad2-1 con la de las plantas mutantes transformadas con cADN de FAD2 bajo el control de un promotor PRU o un promotor constitutivo fuerte.

Constructos. Se crearon constructos reporter para someter a ensayo la actividad y la especificidad de tejido del promotor ChPru bidireccional candidato en cada orientación. Se insertó el promotor ChPru en ambas orientaciones en un constructo vector binario de manera que dirigiese la expresión del gen FAD2 en una orientación y el gen uid que codifica GUS en la otra orientación. La secuencia de codificación GUS se encontraba bajo control de una secuencia de terminación 3' Nos de Agrobacterium ("NosT;" Depicker et al., 1983, J Mol Appl Genet
1:561-573).

La región de codificación de FAD2 y el 3'UTR se amplificaron mediante PCR a partir de un clon de cADN utilizando una polimerasa de alta fidelidad, y se desarrolló un sitio Ncol alrededor del codón de inicio ATG. A continuación se secuenció y se subclonó completamente la región de codificación de FAD2 aguas arriba de un gen GUS. Se amplificó mediante PCR el promotor chPRU de la reacción Cherry Genome Walker Primary PCR, y los sitios Ncol añadidos alrededor de los codones de inicio en cada extremo. Este fragmento de promotor se clonó en un vector intermedio y se secuenció completamente, a continuación se subclonó en ambas orientaciones en el sitio Ncol único entre las regiones de codificación de FAD2 y GUS. Se aislaron casetes FAD2/chPRU/Gus/NosT que comprendían chPRU en ambas orientaciones y se clonaron en un vector de expresión en planta modificada. Se clonó un casete de selección de planta de resistencia a la kanamicina, que comprendía el gen nptll (Beck et al., 1982, Gene 19:327-36) bajo control del promotor CsVMV constitutivo fuerte (Verdaguer et al., 1996, Plant Mol Biol 31:1129-39) y la secuencia de terminación del gen 7 de Agrobacterium ("G7"), en ambos constructos en un sitio de restricción único adyacente a la región del borde derecho (RB) de T-ADN (Velten and Schell, 1985, Nucleic Acids Res 13:6981-98). pAG4021 contiene la secuencia de codificación de FAD2 bajo el control de trascripción del promotor chPRU en la orientación chPru1 (complemento inverso de la secuencia presentada en SEQ ID Nº:1), mientras que pAG4022 contiene el FAD2 bajo el control del promotor en la orientación chPru2.

Además, se generó un constructo de expresión de FAD2 constitutivo como control positivo. pAG4708 contiene la región de codificación de FAD2 bajo el control del promotor CsVMV y NosT. PAG4708 también contiene un casete de selección compuesto por el gen nptll bajo el control del promotor constitutivo RE4 (Pat. U.S. Nº 6.054.635) y la secuencia de terminación G7, clonada en un sitio adyacente al borde izquierdo (LB) de T-ADN. Los constructos de expresión en planta utilizaron el vector binario pPZP200 (Hajdukiewicz et al., 1994, Plant Mol Biol 25:
989-94).

Primero se transformaron los constructos de expresión en planta en la cepa de Agrobacterium GV3101 (plásmido helper pMP90RK) y posteriormente se introdujeron en el mutante fad2-1, Arabidopsis thaliana, mediante un protocolo in planta modificado (de Bechtold et al., 1993, supra). Se seleccionaron los transformantes en 0,5 XMS suplementado con 100 \mug/ml de kanamicina.

Análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME). Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos a partir de hojas y semillas de líneas transformantes que portaban las tres líneas de controles y constructos anteriormente descritos (tanto Col-0 tipo salvaje como mutante fad2). Se llevó a cabo la determinación cuantitativa de la composición de ácidos grasos en semilla y hoja como sigue. Las semillas completas o las hojas cortadas se trans-esterificaron en 500 ul H_{2}SO_{4} al 2,5% en MeOH durante 3 horas a 80 grados C, seguido del método de Browse et al. (Biochem J 235:25-31, 1986) con modificaciones. Se incluyó una cantidad conocida de ácido heptadecanoico en la reacción como estándar interno. Se añadieron a cada vial 750 ul de agua y 400 ul de hexano, que se agitaron a continuación enérgicamente y se dejó que se separaran en fases. Se cargaron los viales de reacción directamente sobre GC para el análisis, y se muestreó la fase de hexano superior mediante el automuestreador. Se utilizó la cromatografía de gases con detección por Ionización de Llama para separar y cuantificar los ésteres metílicos de ácidos grasos. Se utilizó un Agilent 6890 Plus de GC para la separación con columnas Agilent Innowax (30 m x 0,25 mm ID, grosor de película
250 um).

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El gas portador fue hidrógeno a un flujo constante de 2,5 ml/minuto. Se inyectó 1 ul de muestra sin división de flujo (temperatura de la entrada 220ºC, flujo de purga 15 ml/min a 1 minuto). Se programó el horno para una temperatura inicial de 105ºC, tiempo inicial 0,5 minutos, seguido de una rampa de 60ºC por minuto hasta 175ºC, una rampa de 40ºC/minuto hasta 260ºC con un tiempo de retención final de 2 minutos. La detección se hizo mediante ionización por llama (temperatura de 275ºC, flujo de combustible 30,0 ml/min, oxidante 400,0 ml/min). El control de instrumentos y el análisis y la recogida de datos se hicieron utilizando el Sistema de Gestión de Cromatografía Millennium (Versión 3.2, Waters Corporation, Milford, MA). La integración y cuantificación se llevaron a cabo automáticamente mediante el software Millennium.

Análisis Estadístico. Los análisis estadísticos descriptivos se llevaron a cabo utilizando Microsoft Excel 97(Microsoft Inc) SR-2 y el Analysis Tool Pak incluido.

Resultados. El producto del gen FAD2 produce ácidos grasos 18:2 (linoleato) a partir de 18:1 tanto en hojas como en semillas. El linoleato puede convertirse además en 18:3 (linolenato) mediante otras enzimas desaturasas en las hojas. De esta manera, en las hojas, la comparación de 18:1 y la suma de poliinsaturados de 18 carbonos (es decir, 18:2+18:3) proporcionó un buen indicio de la mutación fad2 y del grado de complementación por el cADN de tipo salvaje introducido. Los resultados del análisis FAME de las hojas se resumen en la Tabla 2. Para cada transformante o línea de control sometida a ensayo, se analizaron las hojas simples de cada una de las 24 plantas T1. Los contenidos medios de ácidos grasos 18:1 y 18:2+18:3 como porcentaje de los ácidos grasos totales se muestran con la desviación estándar entre paréntesis.

TABLA 2 Composición de Ácidos Grasos en Hoja

3

El mutante fad2-1 de control presentó el alto nivel esperado de ácidos grasos 18:1 (\sim18% de los ácidos grasos totales, en comparación con sólo \sim3% del total en el tipo salvaje). El contenido medio de 18:1 de los transformantes CsVMV-FAD2 (pAG4708) fue del 8%, lo que representaba un grado de complementación desde casi completo, a no observable. Cinco de los 22 transformantes tuvieron un contenido de ácidos grasos totales de 18:1 del 3% o menos - la cantidad máxima de 18:1 observada en cualquiera de los individuos de tipo salvaje - lo que indicaba que el 22% de los transformantes presentaban una complementación completa de la mutación fad2-1. Anticipamos que el grado de expresión transgénica en los transformantes independientes variaría ampliamente por una variedad de razones, y así éstos resultados estuvieron en conformidad con nuestras expectativas. El contenido de 18:1 en las hojas de los transformantes que portaban FAD2 bajo el control del promotor chPRU en ambas orientaciones resultó algo reducido en comparación con el mutante fad2-1, lo que reflejaba el pequeño número de transformantes que tenían un grado modesto de complementación en las hojas. Nunca se observó complementación completa en las hojas que comprendían el promotor chPRU en ambas orientaciones. El promotor PRU en ambas orientaciones resulta claramente menos efectivo que el promotor CsVMV para complementar el fenotipo en las hojas.

Los resultados de los análisis de los ácidos grasos en semilla se resumen en la Tabla 3. Se cosecharon las semillas T2 a partir de los mismos individuos T1 analizados para la composición grasa de la hoja (Tabla 2). Se muestran los contenidos medios de los ácidos grasos 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, y 20:1 como porcentaje de los ácidos grasos totales. También se muestra el contenido total de los monoinsaturados (18:1 + 20:1). El error estándar fue inferior al 5% del valor descrito en todos los casos.

TABLA 3 Composición de Ácidos Grasos en Semilla

4

La gran cantidad de ácidos grasos 18:1 y 20:1 en el mutante fad2-1 en comparación con el tipo salvaje Col-0 es un resultado de la pérdida de la mutación de la función. Resulta evidente de inmediato a partir de los datos que el promotor CsVMV tenía un rendimiento mucho menos eficaz en las semillas. El contenido total de monoinsaturados del 62,42% en los transformantes pAG4708 es el más cercano al valor del mutante fad2-1 de 78,3%. La expresión conducida por chPRU en ambas orientaciones produjo unas reducciones mayores de monoinsaturados totales que el promotor CsVMV.

Cuando se analizaron las líneas de plantas individuales, los transformantes chPRU representaron un grado de complementación de complementación intermedia a completa. Lo que es más importante, cuando se considera la frecuencia de "complementación completa", o la restauración completa de la composición de tipo salvaje en la planta mutante transformada, el PRU superó claramente al promotor CsVMV. La Tabla 4 muestra el porcentaje de transformantes que presentaron complementación completa del fenotipo fad2-1 en hojas y semillas cuando los promotores CsVMV y chPRU condujeron la expresión de FAD2.

TABLA 4 Transformantes que presentan una complementación completa del fenotipo fad2-1 en hojas y semillas

5

La efectividad diferencial de la expresión conducida por chPRU en las semillas (complementación alta) versus hojas (ausencia de complementación), y la complementación con éxito de los promotores del fenotipo de semilla de los mutantes fad2-1 (especialmente en comparación con el promotor CsVMV) sostiene directamente la utilidad de los promotores PRU para controlar la expresión de los genes dirigidos a semilla en una variedad de plantas dicot, incluyendo las semillas oleaginosas.

Ensayos GUS: Utilizando las mismas líneas transgénicas Pru ensayadas bioquímicamente, se llevaron a cabo ensayos de genes reporter en silicuas por etapas para 1) confirmar la actividad de desarrollo del promotor chPru, y 2) confirmar que el promotor dirige la expresión de los genes heterólogos simultáneamente en ambas orientaciones.

Clasificación por fases de Silicuas de Arabidopsis: Se seleccionaron tres eventos Pru2-1 y tres eventos Pru1-2 que mostraban un alto grado de complementación fad2-1 para los ensayos de enzimas GUS. Se seleccionaron semillas T2 en kanamicina y se trasplantaron a suelo 36 plantas de semillero por evento.

Tras la floración, las silicuas individuales se marcaron con lazos de hilos de colores. Se continuó con el marcado durante un total de catorce días, utilizando un marcador de color diferente para cada cubo de dos días sucesivo (0-1 DAF por 12-13 DAF).

Se cosecharon las silicuas al final del período de marcado de catorce días. Se agruparon de acuerdo con el evento y el cubo. Se homogenizaron las silicuas para extraer la proteína, y se mezclaron los extractos con un tampón de ensayo que contenía el sustrato fluorogénico 4-metilumbelliferil B-D-glucuronida (MUG). Se midió la intensidad de fluorescencia a intervalos de una hora en el curso de tres horas. Se normalizó la actividad GUS a una concentración total de proteína para determinar la actividad reporter GUS estándar.

Resultados: Se midió la actividad GUS durante el desarrollo de las silicuas. Se compararon tres eventos diferentes cada uno de chPru1::GUS y chPru2::GUS a cuatro eventos de CsVMV::GUS y a Col-0. Se observó lo siguiente:

\bullet

Los sucesos que mostraban un nivel alto de expresión de FAD2 también mostraban niveles relativamente altos de expresión de GUS en comparación con la actividad del promotor CsVMV.

\bullet

Los ensayos de actividad GUS confirmaron que el promotor CsVMV está activo a lo largo de todo el desarrollo de la silicua a un nivel relativamente constante en cualquier evento simple.

\bullet

El promotor chPru es relativamente inactivo durante las etapas tempranas del desarrollo de la silicua (de 0 a 3 DAF).

\bullet

Picos de actividad del promotor chPru alrededor de 10 a 11 DAF.

\bullet

La actividad máxima del promotor chPru es igual a la actividad máxima del promotor CsVMV.

\bullet

Aparentemente el promotor chPru1 se vuelve activo ligeramente antes que el promotor Pru2 (6 DAF vs. 8 DAF).

<110> Exelixis Plant Sciences, Inc.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> SECUENCIAS DE PROMOTORES ASOCIADOS A SEMILLAS

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> EP03-008C-PC

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/400.170

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-08-01

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.2

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 1255

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<212> ADN

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<213> Prunus avium

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip1cm

6

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<210> 2

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<211> 239

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<212> ADN

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<213> Prunus avium

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> característica_misc

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<222> (211)..(211)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (221)..(221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (224)..(224)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (227)..(229)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (232)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

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<222> (238)..(238)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Prunus avium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (154)..(155)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (157)..(161)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

8

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<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Prunus avium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm

9

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<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

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<212> ADN

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<213> Prunus avium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

10

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<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1255

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Prunus avium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Prunus avium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Prunus avium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Prunus avium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Prunus avium

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacaaatacc agcgcccacc gctcgttgct tcaccatctc aaa

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Prunus avium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Prunus avium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

16

Claims (27)

1. Molécula de ácido nucleico de doble cadena aislada que comprende un promotor bidireccional, que comprende en la dirección 3' a 5' en una primera cadena

(a)

una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:7 o la SEQ ID Nº: 10, y

(b)

una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:8 o la SEQ ID Nº:11,

en la que dicho promotor bidireccional, cuando se une operablemente a una primera secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección antisentido y una segunda secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección sentido, dirige la expresión de dichas secuencias a niveles más altos en semillas que en otras células y tejidos.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1 en la que el promotor comprende adicionalmente (c) una secuencia que comparte por lo menos un 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:9 o la SEQ ID Nº:12.

3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1 en la que el promotor comprende los nucleótidos 1.055-1.212 de la SEQ ID Nº:1.

4. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3 en la que el promotor comprende los nucleótidos 854-1.212 de la SEQ ID Nº:1.

5. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 4 en la que el promotor comprende la SEQ ID Nº:1.

6. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1 en la que el promotor comprende los nucleótidos 1.043-1.198 de la SEQ ID Nº:6.

7. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 6 en la que el promotor comprende los nucleótidos 827-1.198 de la SEQ ID Nº:6.

8. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7 en la que el promotor comprende la SEQ ID
Nº:6.

9. Vector de expresión en plantas que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1.

10. Vector de expresión en plantas según la reivindicación 9, en la que el promotor se une operablemente a una secuencia de codificación de una proteína heteróloga.

11. Vector de expresión en plantas según la reivindicación 9 que comprende, en la orientación 5' a 3', una primera secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección antisentido, definiéndose el promotor bidireccional según la reivindicación 1, y una segunda secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección sentido, en la que el vector es de doble cadena, y en la que el promotor bidireccional dirige la expresión en las secuencias de codificación de los ácidos nucleicos heterólogos primero y segundo a niveles más altos en semillas que en otras células y tejidos.

12. Célula de planta transgénica que comprende el vector de expresión en plantas según la reivindicación 9 en su genoma.

13. Célula de planta según la reivindicación 12, que es de una planta que pertenece al género Prunus.

14. Célula de planta según la reivindicación 13, que es de una planta seleccionada de entre el grupo que consiste en cereza, almendra, melocotón, albaricoque, y ciruela.

15. Célula de planta según la reivindicación 12, que es de Arabidopsis.

16. Método para producir una planta transgénica que muestra la expresión en una secuencia de codificación de una proteína heteróloga a niveles más altos en semillas que en otras células y tejidos, que comprende:

a)

transformar las células progenitoras de la planta con el vector de expresión en plantas según la reivindicación 10, y

\newpage

b)

cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica que muestra la expresión en la secuencia de codificación de una proteína heteróloga a niveles más altos en semillas que en otras células y tejidos.

\vskip1.000000\baselineskip

17. Planta transgénica que comprende el vector de expresión en plantas según la reivindicación 10.

18. Planta según la reivindicación 17, que pertenece al genero Prunus.

19. Planta según la reivindicación 18, seleccionada de entre el grupo que consiste en cereza, almendra, melocotón, albaricoque, y ciruela.

20. Planta según la reivindicación 17, que es Arabidopsis.

21. Parte de una planta obtenida de una planta según la reivindicación 17, en la que la parte de la planta comprende el vector de expresión en plantas según la reivindicación 10.

22. Parte de una planta según la reivindicación 21, que es una semilla.

23. Molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

en la que el promotor de semilla bidireccional es de melocotón, albaricoque, ciruela o cereza, y,

en la que el promotor tiene una secuencia del promotor que se sitúa naturalmente aguas arriba de un codón de inicio de la traducción de un gen que codifica una proteína de almacenamiento de semilla globulina 12S, y

en la que el promotor dirige la expresión en una secuencia de codificación de ácidos nucleicos heterólogos a los que se une operablemente a niveles más altos en semillas que en otras células y tejidos.

24. Molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

en la que la secuencia del promotor es un promotor que se sitúa naturalmente aguas arriba de un codón de inicio de la traducción de un gen chPru1 o chPru2 en el genoma de cereza, en la que el gen chPru1 comprende la secuencia presentada como SEQ ID Nº:2, y en la que el gen chPru2 comprende la secuencia presentada como SEQ ID Nº:3.

25. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 que se hibrida bajo condiciones muy rigurosas a la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ ID Nº:1, o el complemento de la misma.

26. Planta transgénica según la reivindicación 17, en la que la secuencia de codificación de una proteína heteróloga es un gen del metabolismo lipídico.

27. Planta transgénica según la reivindicación 26, en la que la secuencia de codificación de una proteína heteróloga codifica FAD2.