ES2400907T3 - Generación de plantas con contenido alterado de aceite - Google Patents

Abstract

Una planta transgénica que comprende un vector de transformación de plantas que comprende una secuencia denucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos 70% con respecto a la ID.SEC. nº 2, por lo que la planta transgénica tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite enrelación con plantas testigo.

Description

Generación de plantas con contenido alterado de aceite.

Antecedentes de la invención

La capacidad para manipular la composición de semillas para cultivo, particularmente el contenido y la composición de los aceites de semillas, presenta importantes aplicaciones en las industrias agrícolas, tanto en cuanto a los aceites alimenticios procesados como en cuanto a los aceites para alimentación de animales. Las semillas de cultivos agrícolas contienen una diversidad de componentes valiosos, incluyendo aceite, proteína y almidón. El procesamiento industrial permite separar algunos de estos componentes, o todos, para la venta individual en aplicaciones específicas. Por ejemplo, casi el 60% de la cosecha de soja de EE.UU. es machacada por la industria de procesamiento de soja. El procesamiento de la soja produce aceite purificado, que es vendido a precio elevado, mientras que el resto es vendido principalmente para pienso para ganado a menor precio (US Soybean Board, 2001 Soy Stats). La semilla de canola es machacada para producir aceite y la harina de canola como coproducto (Canola Council of Canada). Casi el 20% de la cosecha 1999/2000 de maíz de EE.UU. fue industrialmente refinada, principalmente para la producción de almidón, etanol y aceite (Corn Refiners Association). Por lo tanto, a menudo es deseable maximizar el contenido de aceite de las semillas. Por ejemplo, para semillas oleaginosas procesadas tales como las de soja y canola, un aumento del contenido absoluto de aceite de la semilla aumentará el precio de dichos granos. Para el maíz procesado, se puede desear aumentar o disminuir el contenido de aceite dependiendo de la utilización de otros componentes principales. La disminución de aceite puede mejorar la calidad del almidón aislado al reducirse los indeseados sabores asociados con la oxidación del aceite. Alternativamente, en la producción de etanol, donde el sabor no importa, el aumento del contenido de aceite puede aumentar el valor global. En muchos granos para pienso, tales como los de maíz y trigo, es deseable aumentar el contenido de aceite de las semillas porque el aceite tiene mayor contenido energético que otros componentes de las semillas, tales como los hidratos de carbono. El procesamiento de semillas oleaginosas, como la mayoría de los negocios de procesamiento de granos, es un negocio que requiere grandes inversiones y recursos; por ello, pequeños cambios en la distribución de los productos, de componentes de bajo valor a componente oleoso de alto valor, pueden producir sustanciales impactos económicos en las empresas procesadoras de granos.

La manipulación biotecnológica de aceites puede proporcionar una alteración de la composición y una mejora de la producción de aceite. Las alteraciones de la composición incluyen, entre otras, aceites de soja y maíz con alto contenido oleico (Patentes de EE.UU. números 6.229.033 y 6.248.939) y semillas que contienen laurato (Patente de EE.UU. nº 5.639.790). El trabajo en la alteración de la composición se ha centrado predominantemente en las semillas oleaginosas procesadas pero se ha extendido rápidamente a cultivos de semillas no oleaginosas, incluyendo el maíz. Aunque hay un considerable interés en aumentar el contenido de aceite, la única biotecnología actualmente puesta en práctica en este área es la tecnología High-Oil Corn (HOC) (DuPont, Patente de EE.UU. nº 5.704.160). En la HOC se emplean polinizadores de alto contenido de aceite desarrollados mediante cría selectiva clásica junto con hembras híbridas (de parte masculina estéril) selectas en un sistema de producción al que se hace referencia como TopCross. El sistema TopCross High Oil eleva el contenido de aceite de los granos recolectados de maíz de ~3,5% a ~7%, mejorando el contenido energético del grano.

Aunque ha sido fructífero, el sistema de producción HOC presenta limitaciones inherentes. En primer lugar, el sistema de tener un bajo porcentaje de polinizadores responsables del conjunto de semillas de un campo completo contiene riesgos inherentes, particularmente en años de sequía. En segundo lugar, los contenidos de aceite de los actuales campos de HOC han alcanzado una meseta de aproximadamente 9% de aceite. Finalmente, el maíz con alto contenido de aceite no es esencialmente un cambio bioquímico, sino más bien un mutante anatómico (tamaño de embrión aumentado) que presenta el resultado indirecto de un aumento del contenido de aceite. Por estas razones, sería especialmente valiosa una estrategia alternativa para alto contenido de aceite, particularmente una que derivara de una producción bioquímica alterada.

Los cultivos diana más obvios para el mercado del aceite procesado son la soja y la semilla de colza, y una gran recopilación de trabajo comercial (por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.952.544 y la solicitud PCT WO9411516) demuestra que Arabidopsis es un excelente modelo para el metabolismo del aceite en estos cultivos. Exploraciones bioquímicas en la composición del aceite de semillas han permitido identificar genes de Arabidopsis para muchas enzimas biosintéticas críticas y han conducido a la identificación de genes ortólogos agronómicamente importantes. Por ejemplo, exploraciones en que se usan poblaciones sometidas a mutagénesis química han permitido identificar mutantes lipídicos cuyas semillas presentan una composición de ácidos grasos alterada (B. Lemieux et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 234-240; D. W. James y H. K. Dooner, 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 241-245). Exploraciones de mutagénesis por DNA de transferencia (DNA-T) (Feldmann et al., Science 243, 1351-1354, 1989) que permitían detectar una composición de ácidos grasos alterada permitieron identificar los genes de omega-3 desaturasa (FAD3) y delta-12 desaturasa (FAD2) (Patente de EE.UU. nº 5952544; N. S. Yadav et al., 1993, Plant Physiol. 103, 467-476; Okuley et al., Plant Cell, enero de 1994, 6 (1): 147-58). En una exploración que se centraba en el contenido de aceite en vez de en la calidad del aceite, se analizaban mutantes químicamente inducidos en cuanto a semillas arrugadas o densidad de semillas alterada, a partir de lo cual se infería un contenido alterado de aceite de semillas (N. Focks y C. Benning, Plant Physiol. 118: 91-101, 1998). Otra exploración, diseñada para identificar enzimas implicadas en la producción de ácidos grasos de cadena muy larga, permitió identificar una mutación en el gen que codifica una diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) como responsable de una acumulación reducida de triacilglicerol en semillas (V. Katavic et al., Plant Physiol., mayo de 1995, 108 (1): 399-409). Se mostró además que la sobreexpresión, específica de semillas, del cDNA de DGAT estaba asociada con un contenido aumentado de aceite de semillas (Jako et al., Plant Physiol., junio de 2001, 126 (2): 861-74).

En las plantas, el etiquetado por activación se refiere a un método para generar mutaciones aleatorias mediante la inserción de una construcción de ácido nucleico heteróloga que comprende secuencias reguladoras (por ejemplo, un potenciador) en el genoma de una planta. Las secuencias reguladoras pueden actuar para potenciar la transcripción de uno o más genes nativos de la planta; en consecuencia, el etiquetado por activación es un método fructífero para generar "ganancia de función", generalmente mutantes dominantes [véanse, por ejemplo, Hayashi et al., Science (1992) 258: 1350-1353; y Weigel et al., Plant Physiology (2000) 122: 1003-1013]. La construcción insertada proporciona una etiqueta molecular para la rápida identificación de la planta nativa cuya expresión incorrecta causa el fenotipo mutante. El etiquetado por activación puede también causar fenotipos con "pérdida de función". La inserción puede dar lugar a la alteración de un gen nativo de la planta, en cuyo caso el fenotipo es generalmente recesivo.

El etiquetado por activación ha sido usado en diversas especies, incluyendo el tabaco y Arabidopsis, para identificar muchas clases diferentes de fenotipos mutantes y los genes asociados con estos fenotipos [Wilson et al., Plant Cell (1996) 8: 659-671; Schaffer et al., Cell (1998) 93: 1219-1229; Fridborg et al, Plant Cell (1999) 11: 1019-1032; Kardailsky et al., Science (1999) 286: 1962-1965; S. Christensen et al., 9th International Conference on Arabidopsis Research, Univ. of Wisconsin-Madison, 24-28 de junio de 1998, Resumen 165].

Compendio de la invención

La invención proporciona una planta transgénica como la expuesta en la Reivindicación 1 adjunta. En realizaciones preferidas, la planta transgénica es seleccionada del grupo que consiste en semilla de colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuete. La invención proporciona además un método para producir aceite, que comprende cultivar la planta transgénica y recuperar el aceite de dicha planta.

La planta transgénica de la invención se produce mediante un método que comprende introducir, en células progenitoras de la planta, un vector de transformación de plantas que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido HIO30 que comprende la secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 2 y cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde la secuencia polinucleotídica HIO30 se expresa causando un fenotipo con un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se indique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la técnica de la presente invención. Para las definiciones y términos de la técnica, los profesionales son particularmente dirigidos a Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (segunda edición), Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York, 1989, y a F. M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1993. Se ha de entender que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar.

Como se usa en esta memoria, el término "vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferencia entre células huésped diferentes. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad para incorporar fragmentos de DNA heterólogo a una célula extraña y expresarlos en ella. Se dispone comercialmente de muchos vectores de expresión procarióticos y eucarióticos. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de quienes tienen experiencia en la técnica.

Una construcción o secuencia de ácido nucleico "heteróloga" tiene una porción de la secuencia que no es nativa para la célula vegetal en que se expresa. Con respecto a una secuencia de control, "heteróloga" se refiere a una secuencia de control (es decir, un promotor o potenciador) que no actúa en la naturaleza para regular el mismo gen cuya expresión está actualmente regulando. En general, las secuencias de ácido nucleico heterólogas no son endógenas con respecto a la célula o parte del genoma en que están presentes, y han sido añadidas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación o similar. Una construcción de ácido nucleico "heteróloga" puede contener una combinación de secuencia de control/secuencia de codificación de DNA que sea igual o diferente que una combinación de secuencia de control/secuencia de codificación de DNA hallada en la planta nativa.

Como se usa en esta memoria, el término "gen" significa el segmento de DNA implicado en la producción de una cadena polipeptídica, el cual puede incluir o no regiones que precedan y sigan a la región de codificación, tales como, por ejemplo, secuencias 5' no traducidas [5'-UTR (del inglés, 5'-untranslated region)] o "líder" y secuencias 3'-UTR o "tráiler", así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones) y una secuencia reguladora no transcrita.

Como se usa en esta memoria, "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector que ha sido modificado por la introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga, o a la célula que procede de una célula así modificada. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en idéntica forma en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que, en cualquier caso, se expresan anormalmente, se infraexpresan o no se expresan en absoluto como resultado de una deliberada intervención humana.

Como se usa en esta memoria, la locución "expresión génica" se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido basándose en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto transcripción como traducción; en consecuencia, "expresión" puede referirse a una secuencia polinucleotídica o polipeptídica, o a ambas. A veces, la expresión de una secuencia polinucleotídica no conduce a la traducción en proteína. "Sobreexpresión" se refiere a una expresión aumentada de una secuencia polinucleotídica y/o polipeptídica con respecto a su expresión en una planta de tipo silvestre [u otra referencia (por ejemplo, no transgénica)] y puede tener que ver con una secuencia presente en la naturaleza o no presente en la naturaleza. "Expresión ectópica" se refiere a la expresión en un momento, en un lugar y/o con un nivel aumentado, que no tiene naturalmente lugar en la planta no alterada o de tipo silvestre. "Infraexpresión" se refiere a una expresión disminuida de una secuencia polinucleotídica y/o polipeptídica, generalmente de un gen endógeno, con respecto a su expresión en una planta de tipo silvestre. Las expresiones "expresión incorrecta" y "expresión alterada" abarcan sobreexpresión, infraexpresión y expresión ectópica.

En el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula, el término "introducida" significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico a una célula eucariótica o procariótica, donde la secuencia de ácido nucleico se puede incorporar al genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plasto o DNA mitocondrial), se puede convertir en un replicón autónomo o se puede expresar transitoriamente (por ejemplo, mRNA transfectado).

Como se usa en esta memoria, una "célula vegetal" se refiere a cualquier célula procedente de una planta, incluyendo células de tejido indiferenciado (por ejemplo, un callo) así como semillas, polen propágulos y embriones de plantas.

Como se usan en esta memoria, las expresiones "nativo" y "tipo silvestre" relativas a un rasgo o fenotipo de planta dado, se refieren a la forma en que ese rasgo o fenotipo se encuentra en la misma variedad de planta en la naturaleza.

Como se utiliza en esta memoria, el término "modificado" relativo a un rasgo de una planta se refiere a un cambio en el fenotipo de una planta transgénica con respecto al de la planta no transgénica similar. Un "fenotipo con contenido alterado de aceite" se refiere al fenotipo mensurable de una planta genéticamente modificada, donde la planta presenta un aumento o disminución estadísticamente significativo en el contenido global de aceite (es decir, el porcentaje de masa de semilla que es aceite) en comparación con el de la planta similar pero no modificada. Un fenotipo con alto contenido de aceite se refiere a un aumento en el contenido global de aceite.

Como se utiliza en esta memoria, una secuencia polinucleotídica o gen "mutante" difiere de la correspondiente secuencia polinucleotídica o gen de tipo silvestre en términos de secuencia o expresión, donde la diferencia contribuye a un fenotipo o rasgo vegetal modificado. Con respecto a una planta o línea vegetal, el término "mutante" se refiere a una planta o línea vegetal que tiene un fenotipo o rasgo vegetal modificado, donde el fenotipo o rasgo modificado está asociado con la expresión modificada de una secuencia polinucleotídica o gen de tipo silvestre.

Como se utiliza en esta memoria, el término "T1" se refiere a la generación de plantas a partir de la semilla de plantas T0. La generación T1 es el primer conjunto de plantas transformadas que puede ser seleccionado por aplicación de un agente de selección, por ejemplo, un antibiótico o un herbicida, para el que la planta transgénica contiene el correspondiente gen de resistencia. El término "T2" se refiere a la generación de plantas por autofertilización de las flores de plantas T1, previamente seleccionadas como transgénicas. Las plantas T3 se generan a partir de las plantas T2, etc. Como se usa en esta memoria, la "progenie directa" de una planta dada procede de la semilla (o, a veces, de otro tejido) de esa planta y está en la generación inmediatamente subsiguiente; por ejemplo, para un linaje dado, una planta T2 es la progenie directa de una planta T1. La "progenie indirecta" de una planta dada procede de la semilla (u otro tejido) de la progenie directa de esa planta, o de la semilla (u otro tejido) de generaciones subsiguientes de ese linaje; por ejemplo, una planta T3 es la progenie indirecta de una planta T1.

Como se usa en esta memoria, la expresión "parte vegetal" incluye cualquier órgano o tejido vegetal, incluyendo, sin limitación, semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. Se pueden obtener células vegetales a partir de cualquier órgano o tejido vegetal y de cultivos preparados a partir de los mismos. La clase de plantas que se puede utilizar en los métodos de la presente invención es, en general, tan amplia como la clase de plantas superiores sensibles a técnicas de transformación, incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas.

Como se utiliza en esta memoria, "planta transgénica" incluye una planta que comprende un polinucleótido heterólogo en su genoma. El polinucleótido heterólogo puede estar establemente integrado en el genoma o puede ser extracromosómico. Preferiblemente, el polinucleótido de la presente invención está establemente integrado en el genoma para que el polinucleótido sea hecho pasar a las generaciones sucesivas. Una célula, tejido u órgano vegetal o una planta en que se han introducido los polinucleótidos heterólogos es considerada "transformada", "transfectada" o "transgénica". También se consideran transgénicas las progenies directa e indirecta de plantas o células vegetales transformadas que también contienen el polinucleótido heterólogo.

Identificación de plantas con un fenotipo con contenido alterado de aceite

Se usó una exploración mediante etiquetado por activación en Arabidopsis para identificar la asociación entre el gen que denominamos "HIO30" (At3g52260; GI#22331747:54-938) y un fenotipo con contenido alterado de aceite (específicamente, un fenotipo con alto contenido de aceite). En resumen, y como se describe adicionalmente en los Ejemplos, se mutó un gran número de plantas de Arabidopsis con el vector pSKI015, que comprende un DNA-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, un elemento potenciador vírico, y un gen marcador seleccionable (Weigel et al., supra). Cuando el DNA-T se inserta en el genoma de plantas transformadas, el elemento potenciador puede causar la suprarregulación de genes en las inmediaciones, generalmente dentro de aproximadamente 10 kilobases (kb) de la inserción. Se expusieron plantas T1 al agente selectivo con objeto de recuperar específicamente las plantas transformadas que expresaban el marcador seleccionable y, por lo tanto, contenían inserciones de DNA-

T. Se recogieron muestras de aproximadamente 15-20 semillas T2 de plantas transformadas T1 y se extrajeron los lípidos de las semillas completas. Se llevó a cabo un análisis por cromatografía en fase gaseosa (GC; del inglés, gas chromatography) para determinar el contenido y la composición de ácidos grasos de las muestras de semillas.

Se identificó una línea de Arabidopsis que mostraba un fenotipo con alto contenido de aceite, en donde los aceites (es decir, los ácidos grasos) constituían aproximadamente el 35% de la masa de semilla. Se descubrió la asociación del gen HIO30 con el fenotipo con alto contenido de aceite mediante el análisis de la secuencia de DNA genómico que flanquea la inserción de DNA-T en la línea identificada. En consecuencia, se pueden emplear genes y/o polipéptidos HIO30 en el desarrollo de plantas genéticamente modificadas que tienen un fenotipo con contenido modificado de aceite ("un fenotipo HIO30"). Se pueden usar genes HIO30 en la generación de cultivos de semillas oleaginosas que proporcionen una producción de aceite mejorada a través del procesamiento de semillas oleaginosas, y en la generación de cultivos de granos para pienso que proporcionen una energía aumentada para la alimentación de animales. Los genes HIO30 se pueden usar además para aumentar el contenido de aceite de cultivos de aceites especiales, con objeto de aumentar la producción de ácidos grasos deseados poco habituales. Las plantas transgénicas que han sido genéticamente modificadas para que expresen HIO30 se pueden usar en la producción de aceite, en donde se cultivan las plantas transgénicas y se obtiene el aceite de partes de la planta (por ejemplo, la semilla) usando métodos estándares.

Ácidos nucleicos y polipéptidos HIO30

La secuencia de ácido nucleico (DNA genómico) HIO30 de Arabidopsis se proporciona en la ID. SEC. nº 1 y en la entrada GI#22331747:54-938 de Genbank. La correspondiente secuencia proteica se proporciona en la ID. SEC. nº 2 y en GI#22331748. Más adelante, en el Ejemplo 3, se describen ácidos nucleicos y/o proteínas que son ortólogos

o parálogos de HIO30 de Arabidopsis.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "polipéptido HIO30" se refiere a una proteína HIO30 de longitud completa o a un fragmento, derivado (variante) u ortólogo de la misma que es "funcionalmente activo", lo que significa que el fragmento, derivado u ortólogo de la proteína presenta una o más de las actividades funcionales asociadas con el polipéptido de ID. SEC. nº 2. En una realización preferida, un polipéptido HIO30 funcionalmente activo causa un fenotipo con contenido alterado de aceite cuando se expresa incorrectamente en una planta. En otra realización preferida, la expresión incorrecta del polipéptido HIO30 causa un fenotipo con alto contenido de aceite en una planta. En otra realización, un polipéptido HIO30 funcionalmente activo es capaz de rescatar la actividad HIO30 endógena incompleta (incluyendo deficiente) cuando se expresa en una planta o en células vegetales; el polipéptido de rescate puede ser de la misma especie o de una especie diferente como aquélla con actividad incompleta. En otra realización, un fragmento funcionalmente activo de un polipéptido HIO30 de longitud completa (es decir, un polipéptido nativo que tiene la secuencia de ID. SEC. nº 2 o un ortólogo del mismo presente en la naturaleza) conserva una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido HIO30 de longitud completa, tal como actividad de señalización, actividad de unión, actividad catalítica o actividad de localización celular o extracelular. Un fragmento de HIO30 comprende preferiblemente un dominio de HIO30, tal como un dominio C- o Nterminal o catalítico, entre otros, y comprende preferiblemente al menos 10, preferiblemente al menos 20, más preferiblemente al menos 25, y lo más preferiblemente al menos 50, aminoácidos contiguos de una proteína HIO30. Los dominios funcionales se pueden identificar utilizando el programa PFAM (A. Bateman et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 260-262; sitio web en pfam.wustl.edu). Un fragmento de HIO30 preferido comprende un dominio de seudouridilato sintasa (PFam00849). Las variantes funcionalmente activas de polipéptidos HIO30 de longitud completa o de fragmentos de los mismos incluyen polipéptidos con inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos que conservan una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido HIO30 de longitud completa. En ciertos casos, se generan variantes que cambian el procesamiento postraduccional de un polipéptido HIO30. Por ejemplo, en comparación con el polipéptido nativo, las variantes pueden tener unas características de transporte proteico o localización proteica alteradas o una semivida proteica alterada.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "ácido nucleico HIO30" abarca ácidos nucleicos con la secuencia proporcionada, o con una secuencia complementaria de la secuencia proporcionada en, la ID. SEC. nº 1, así como fragmentos, derivados u ortólogos funcionalmente activos de los mismos. Un ácido nucleico HIO30 de esta invención puede ser DNA, derivado de DNA genómico o cDNA, o RNA.

En una realización, un ácido nucleico HIO30 funcionalmente activo codifica, o es complementario de un ácido nucleico que codifica, un polipéptido HIO30 funcionalmente activo. Dentro de esta definición se incluye el DNA genómico que sirve como molde para un transcrito de RNA primario (es decir, un precursor de mRNA) que requiere procesamiento, tal como corte y empalme, antes de que codifique el polipéptido HIO30 funcionalmente activo. Un ácido nucleico HIO30 puede incluir otras secuencias no codificadoras, las cuales pueden ser transcritas o no; dichas secuencias incluyen, entre otras, 5'- y 3'-UTRs, señales de poliadenilación y secuencias reguladoras que controlan la expresión génica, como es sabido en la técnica. Algunos polipéptidos requieren eventos de procesamiento, tales como escisión proteolítica, modificación covalente, etc., con objeto de que lleguen a ser totalmente activos. En consecuencia, los ácidos nucleicos funcionalmente activos pueden codificar el polipéptido HIO30 maduro o el preprocesado, o una forma intermedia. Un polinucleótido HIO30 puede incluir también secuencias de codificación heterólogas, por ejemplo, secuencias que codifiquen un marcador incluido para facilitar la purificación del polipéptido fusionado, o un marcador de transformación.

En otra realización, se puede utilizar un ácido nucleico HIO30 funcionalmente activo en la generación de fenotipos HIO30 con "pérdida de función" a través de, por ejemplo, supresión antisentido, cosupresión, etc.

En una realización preferida, un ácido nucleico HIO30 utilizado en los métodos de esta invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica, o es complementaria de una secuencia que codifica, un polipéptido HIO30 que tiene una identidad secuencial de al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más con respecto a la secuencia polipeptídica presentada en la ID. SEC. nº 2.

En otra realización, un polipéptido HIO30 de la invención comprende una secuencia polipeptídica con una identidad de al menos 50% o 60% con respecto a la secuencia polipeptídica HIO30 de ID. SEC. nº 2, y puede tener una identidad secuencial de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o más con respecto a la secuencia polipeptídica HIO30 de ID. SEC. nº 2. En otra realización, un polipéptido HIO30 comprende una secuencia polipeptídica con una identidad secuencial de al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o más con respecto a un fragmento funcionalmente activo del polipéptido presentado en la ID. SEC. nº 2, tal como un dominio de seudouridilato sintasa. En aún otra realización, un polipéptido HIO30 comprende una secuencia polipeptídica con una identidad de al menos 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con respecto a la secuencia polipeptídica de ID. SEC. nº 2, en toda su longitud, y comprende un dominio de seudouridilato sintasa.

En otro aspecto, una secuencia polinucleotídica HIO30 tiene una identidad de al menos 50% a 60%, en toda su longitud, con respecto a la secuencia de ácido nucleico HIO30 presentada como ID. SEC. nº 1, o a secuencias de ácido nucleico que son complementarias de dicha secuencia HIO30, y puede comprender una identidad secuencial de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o más con respecto a la secuencia HIO30 presentada como ID. SEC. nº 1 o a un fragmento funcionalmente activo de la misma, o a secuencias complementarias.

Como se emplea en esta memoria, "porcentaje (%) de identidad secuencial" con respecto a una secuencia objetivo especificada, o una porción especificada de la misma, se define como el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos de la secuencia derivada candidata que son idénticos a los nucleótidos o aminoácidos de la secuencia objetivo (o la porción especificada de la misma) después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad secuencial, según se genera mediante el programa WU-BLAST-2.0a19 [Altschul et al., J. Mol. Biol. (1997) 215: 403-410; sitio web en blast.wustl.edu/blast/README.html) con los parámetros de búsqueda ajustados a los valores por omisión. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y son establecidos por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y de la composición de la base de datos particular frente a la cual se busca la secuencia de interés. Se determina un "% de valor de identidad" mediante el número de correspondientes nucleótidos o aminoácidos idénticos, dividido por la longitud de la secuencia para la cual se presenta el porcentaje de identidad. Se determina el "porcentaje (%) de similitud de secuencias de aminoácidos" realizando el mismo cálculo que para la determinación del % de identidad de secuencias de aminoácidos pero incluyendo en el cálculo las sustituciones de aminoácido conservativas además de los aminoácidos idénticos. Una sustitución de aminoácido conservativa es aquélla en que se sustituye un aminoácido por otro aminoácido que tiene unas propiedades similares para que la plegadura o actividad de la proteína no resulte significativamente afectada. Los aminoácidos aromáticos que pueden ser sustituidos entre sí son fenilalanina, triptófano y tirosina; los aminoácidos hidrófobos intercambiables son leucina, isoleucina, metionina y valina; los aminoácidos polares intercambiables son glutamina y asparagina; los aminoácidos básicos intercambiables son arginina, lisina e histidina; los aminoácidos ácidos intercambiables son ácido aspártico y ácido glutámico; y los aminoácidos pequeños intercambiables son alanina, serina, treonina, cisteína y glicocola.

Las moléculas de ácido nucleico derivadas de las moléculas de ácido nucleico objetivo incluyen secuencias que se hibridan selectivamente con la secuencia de ácido nucleico de ID. SEC. nº 1. El rigor de la hibridación puede ser controlado mediante la temperatura, la fuerza iónica, el pH y la presencia de agentes desnaturalizantes, tal como formamida, durante la hibridación y el lavado. Las condiciones rutinariamente utilizadas son bien conocidas [véanse, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", volumen 1, capítulo 2.10, John Wiley & Sons, Publishers (1994); y Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor (1989)]. En ciertas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la invención es capaz de hibridarse con una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 1 bajo unas condiciones de hibridación rigurosas que son: prehibridación de los filtros que contienen ácido nucleico durante un período de 8 horas a toda la noche, a 65 °C, en una disolución que comprende citrato de fuerza única (SSC; del inglés, single strength citrate) 6X (SSC 1X es NaCl 0,15 M y citrato sódico 0,015 M, pH de 7,0), disolución de Denhardt 5X, pirofosfato sódico al 0,05% y 100 μg/ml de DNA de esperma de arenque; hibridación durante 18-20 horas a 65 °C en una disolución que contiene SSC 6X, disolución de Denhardt 1X, 100 μg/ml de tRNA de levadura y pirofosfato sódico al 0,05%; y lavado de los filtros a 65 °C durante 1 hora en una disolución que contiene SSC 0,1X y dodecilsulfato sódico (SDS; del inglés, sodium dodecyl sulfate) al 0,1%. En otras realizaciones se utilizan unas condiciones de hibridación moderadamente rigurosas que son: pretratamiento de los filtros que contienen ácido nucleico durante 6 horas a 40 °C en una disolución que contiene formamida al 35%, SSC 5X, Tris-HCl 50 mM (pH de 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,1%, Ficoll al 0,1%, BSA al 1% y 500 μg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado; hibridación durante 18-20 horas a 40 °C en una disolución que contiene formamida al 35%, SSC 5X, Tris-HCl 50 mM (pH de 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100 μg/ml de DNA de esperma de salmón, y sulfato de dextrano al 10% (peso/volumen); y luego lavado dos veces durante 1 hora a 55 °C en una disolución que contiene SSC 2X y SDS al 0,1%. Alternativamente, se pueden utilizar unas condiciones de bajo rigor que comprenden: incubación durante un período de 8 horas a toda la noche, a 37 °C, en una disolución que comprende formamida al 20%, SSC 5X, fosfato sódico 50 mM (pH de 7,6), disolución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10%, y 20 μg/ml de DNA de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado; hibridación en el mismo tampón durante un periodo de 18 a 20 horas; y lavado de los filtros en SSC 1X durante 1 hora a aproximadamente 37 °C.

Como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir diversas secuencias polinucleotídicas que codifiquen un polipéptido HIO30. Por ejemplo, se pueden seleccionar codones para aumentar la velocidad a que tiene lugar la expresión del polipéptido en una especie huésped particular, de acuerdo con la óptima utilización de codones dictada por el organismo huésped particular (véase, por ejemplo, Nakamura et al., 1999, Nucleic Acids Res.

27: 292). Dichas variantes secuenciales pueden ser utilizadas en los métodos de esta invención.

En los métodos de la invención se pueden usar ortólogos del HIO30 de Arabidopsis. Los métodos para identificar los ortólogos en otra especie vegetal son conocidos en la técnica. Normalmente, los ortólogos de diferentes especies conservan la misma función a causa de la presencia de uno o más motivos proteicos y/o estructuras tridimensionales. En la evolución, cuando un evento de duplicación génica sigue a la especiación, un único gen en una especie, tal como de Arabidopsis, puede corresponder a múltiples genes (parálogos) en otra. Como se usa en esta memoria, el término "ortólogos" abarca parálogos. Cuando se dispone de datos de secuencias para una especie vegetal particular, los ortólogos son generalmente identificados mediante un análisis de homologías de secuencias, tal como un análisis por BLAST, usando normalmente secuencias proteicas señuelo. Se asignan secuencias a un posible ortólogo si la secuencia más satisfactoria del resultado del BLAST directo recupera la secuencia original en cuestión en el BLAST inverso [M. A. Huynen y P. Bork, Proc. Natl. Acad. Sci. (1998), 95: 58495856; M. A. Huynen et al., Genome Research (2000), 10: 1204-1210]. Se pueden usar programas para el alineamiento múltiple de secuencias, tal como CLUSTAL (J. D. Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 46734680), para resaltar regiones y/o restos conservados de proteínas ortólogas y generar árboles filogenéticos. En un árbol filogenético que representa múltiples secuencias homólogas de diversas especies (por ejemplo, recuperadas a través del análisis por BLAST), las secuencias ortólogas de dos especies aparecen generalmente más cerca en el árbol con respecto a todas las demás secuencias de estas dos especies. El reconocimiento de plegaduras ("threading") estructural u otro análisis de la plegadura de proteínas (por ejemplo, usando un software de ProCeryon Biosciences, Salzburgo, Austria) también permite identificar posibles ortólogos. Los métodos de hibridación de ácido nucleico pueden ser también utilizados para hallar genes ortólogos y son preferidos cuando no se dispone de datos sobre secuencias. La PCR degenerada y la exploración de bancos de cDNA o DNA genómico son métodos habituales para hallar secuencias génicas relacionadas y son bien conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook, supra; C. Dieffenbach y G. Dveksler (redactores), "PCR Primer: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). Por ejemplo, en Sambrook et al., supra, se describen métodos para generar un banco de cDNA a partir de la especie vegetal de interés y sondar el banco con sondas génicas parcialmente homólogas. Como sonda se puede usar una porción muy conservada de la secuencia de codificación de HIO30 de Arabidopsis. Los ácidos nucleicos HIO30 ortólogos se pueden hibridar con el ácido nucleico de ID. SEC. nº 1 bajo condiciones de alto, moderado o bajo rigor. Después de la multiplicación o el aislamiento de un segmento de un supuesto ortólogo, ese segmento puede ser clonado y secuenciado mediante técnicas estándares y ser utilizado como sonda para aislar un clon de cDNA o genómico completo. Alternativamente, es posible iniciar un proyecto EST para generar una base de datos sobre información de secuencias para la especie vegetal de interés. En otro planteamiento, para el aislamiento de ortólogos se usan anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos HIO30 conocidos (véase, por ejemplo, E. Harlow y D. Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, New York). Un análisis por transferencia Western permite determinar que un ortólogo de HIO30 (es decir, una proteína ortóloga) está presente en un extracto crudo de una especie vegetal particular. Cuando se observa reactividad, la secuencia que codifica el ortólogo candidato puede ser aislada al explorar bancos de expresión que representan la especie vegetal particular. Se pueden construir bancos de expresión en una diversidad de vectores comercialmente asequibles, incluyendo lambda gt11, como se describe en Sambrook et al., supra. Una vez que se ha(n) identificado el(los) ortólogo(s) candidato(s) por cualquiera de estos medios, se usan secuencias ortólogas candidatas como señuelo (la "cuestión") para el BLAST inverso frente a secuencias de Arabidopsis u otra especie en que se han identificado secuencias de ácido nucleico y/o polipéptido HIO30.

Se pueden obtener ácidos nucleicos y polipéptidos HIO30 usando cualquier método disponible. En este campo técnico son bien conocidas, por ejemplo, las técnicas para aislar secuencias de cDNA o DNA genómico de interés explorando bancos de DNA o usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction), como se describió previamente. Alternativamente, se puede sintetizar una secuencia de ácido nucleico. Se puede usar cualquier método conocido, tal como la mutagénesis dirigida al sitio (T. A. Kunkel et al., Methods Enzymol. 204: 125-39, 1991), para introducir cambios deseados en un ácido nucleico clonado.

En general, los métodos de la invención implican incorporar la forma deseada del ácido nucleico HIO30 en un vector de expresión vegetal para la transformación de células vegetales, y que el polipéptido HIO30 se exprese en la planta huésped.

Una molécula de ácido nucleico HIO30 aislada no está en la forma ni el ambiente en que se encuentra en la naturaleza, y es identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia normalmente en la fuente natural del ácido nucleico HIO30. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico HIO30 aislada incluye moléculas de ácido nucleico HIO30 contenidas en células que expresan normalmente HIO30, donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una posición cromosómica distinta a la de las células naturales.

Generación de plantas genéticamente modificadas con un fenotipo con contenido alterado de aceite

Se pueden usar ácidos nucleicos y polipéptidos HIO30 en la generación de plantas genéticamente modificadas que tengan un fenotipo con contenido modificado de aceite. Como se emplea en esta memoria, un " fenotipo con contenido modificado de aceite" se puede referir a un contenido modificado de aceite en cualquier parte de la planta; el contenido modificado de aceite se observa a menudo en las semillas. En una realización preferida, la expresión alterada del gen HIO30 en una planta se usa para generar plantas con un fenotipo con alto contenido de aceite.

Los métodos descritos en la presente memoria son generalmente aplicables a todas las plantas. Aunque el etiquetado por activación y la identificación génica se llevan a cabo en Arabidopsis, el gen HIO30 (o un ortólogo, variante o fragmento del mismo) se puede expresar en cualquier tipo de planta. En una realización preferida, la invención se dirige a plantas productoras de aceite, que producen y almacenan triacilglicerol en órganos específicos, principalmente en las semillas. Dichas especies incluyen soja (Glycine max), semilla de colza y canola (incluyendo Brassica napus y B. campestris), girasol (Helianthus annus), algodón (Gossypium hirsutum), maíz (Zea mays), cacao (Theobroma cacao), cártamo (Carthamus tinctorius), palma de aceite (Elaeis guineensis), palma de coco (Cocos nucifera), lino (Linum usitatissimum), ricino (Ricinus communis) y cacahuete (Arachis hypogaea). La invención también se puede dirigir a plantas portadoras de frutos y vegetales, plantas productoras de granos, plantas productoras de nueces, especies de Brassica de ciclo rápido, alfalfa (Medicago sativa), tabaco (Nicotiana), gramíneas (familia Poaceae), otros cultivos de plantas forrajeras, y especies silvestres que pueden ser una fuente de ácidos grasos únicos.

El técnico experto reconocerá que en este campo técnico existe una gran variedad de técnicas de transformación y que continuamente se llega a disponer de nuevas técnicas. Dentro del alcance de la presente invención se puede emplear cualquier técnica que sea adecuada para la planta huésped diana. Por ejemplo, las construcciones se pueden introducir en una diversidad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, como una cadena de DNA, en un plásmido o en un cromosoma artificial. La introducción de las construcciones en las células vegetales diana puede ser llevada a cabo mediante una diversidad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, microinyección, bombardeo de microproyectiles, coprecipitación de fosfato cálcico-DNA y transformación mediada por liposomas con un ácido nucleico heterólogo. La transformación de la planta es preferiblemente permanente, es decir, por integración de las introducidas construcciones de expresión en el genoma de la planta huésped, para que las construcciones introducidas sean hechas pasar a las sucesivas generaciones de la planta. Dependiendo del uso previsto, una construcción de ácido nucleico heteróloga que comprende un polinucleótido HIO30 puede codificar la proteína entera o una porción biológicamente activa de la misma.

En una realización, se pueden usar sistemas vector binarios basados en Ti para transferir polinucleótidos. Los vectores binarios estándares de Agrobacterium son conocidos por quienes tienen experiencia en la técnica, y muchos son comercialmente asequibles (por ejemplo, pBI121, Clontech Laboratories, Palo Alto, California).

El procedimiento óptimo para la transformación de plantas con vectores de Agrobacterium variará con el tipo de planta que se vaya a transformar. Los métodos ejemplares para transformación mediada por Agrobacterium incluyen la transformación de explantes de tejido de hipocótilo, punta de brote, tallo u hoja, procedente de plantones y/o plántulas estériles. Dichas plantas transformadas se pueden reproducir sexualmente o mediante cultivo celular o tisular. Se ha descrito previamente la transformación con Agrobacterium para un gran número de tipos diferentes de plantas, y en la bibliografía científica se pueden encontrar métodos para dicha transformación. Son particularmente relevantes los métodos para transformar cultivos comercialmente importantes, tales como los de semilla de colza [De Block et al., Plant Physiol. (1989) 91: 694-701], girasol [Everett et al., Bio/Technology (1987) 5: 1201] y soja [Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 7500-7504; Kline et al., Nature (1987) 327: 70].

Se puede regular la expresión (incluyendo transcripción y traducción) de HIO30 con respecto al nivel de expresión, el(los) tipo(s) de tejido donde tiene lugar la expresión, y/o la fase de desarrollo de la expresión. Se dispone de diversas secuencias reguladoras heterólogas (por ejemplo, promotores y potenciadores) para controlar la expresión de un ácido nucleico HIO30. Estas incluyen promotores constitutivos, inducibles y regulables, así como promotores y potenciadores que controlan la expresión de un modo tisular o temporalmente específico. Los promotores constitutivos ejemplares incluyen el promotor E4 de frambuesa (Patentes de EE.UU. números 5.783.393 y 5.783.394), el promotor 35S de CaMV (J. D. Jones et al., Transgenic Res. 1: 285-297, 1992), el promotor de CsVMV

(B. Verdaguer et al., Plant Mol. Biol. 37: 1055-1067, 1998) y el promotor de actina del melón (solicitud PCT publicada WO0056863). Los promotores tisularmente específicos ejemplares incluyen los promotores E4 y E8 del tomate (Patente de EE.UU. nº 5.859.330) y el promotor del gen 2AII del tomate (M. J. J. Van Haaren et al., Plant Mol. Biol.

21: 625-640, 1993).

En una realización preferida, la expresión de HIO30 está bajo el control de secuencias reguladoras de genes cuya expresión está asociada con el desarrollo precoz de semillas y/o embriones. Los genes de legumbres cuyos promotores están asociados con el desarrollo precoz de semillas y embriones incluyen legumina de V. faba (Baumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225: 121-8; Baumlein et al., 1992, Plant J. 2: 233-9), usp de V. faba (Fiedler et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 669-79), convicilina de guisante (Bown et al., 1988, Biochem. J. 251: 717-26), lectina de guisante (dePater et al., 1993, Plant Cell 5: 877-86), beta-faseolina de P. vulgaris (Bustos et al., 1991, EMBO J.

10: 1469-79), DLEC2 y PHS (beta) de P. vulgaris (Bobb et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 641-7) y betaconglicinina de soja, proteína 7S de almacenamiento (Chamberland et al., 1992, Plant Mol. Biol. 19: 937-49). Los genes de cereales cuyos promotores están asociados con el desarrollo precoz de semillas y embriones incluyen glutelina de arroz ("GluA-3," Yoshihara y Takaiwa, 1996, Plant Cell. Physiol. 37: 107-11; "GluB-1," Takaiwa et al., 1996, Plant Mol. Biol. 30: 1207-21; Washida et al., 1999, Plant Mol. Biol. 40: 1-12; "Gt3," Leisy et al., 1990, Plant Mol. Biol. 14: 41-50), prolamina de arroz (Zhou y Fan, 1993, Transgenic Res. 2: 141-6), prolamina de trigo (Hammond-Kosack et al., 1993, EMBO J. 12: 545-54), zeína de maíz (Z4, Matzke et al., 1990, Plant Mol. Biol. 14: 323-32) y hordeínas B de cebada (Entwistle et al., 1991, Plant Mol. Biol. 17: 1217-31). Otros genes cuyos promotores están asociados con el desarrollo precoz de semillas y embriones incluyen GLO7A de palma de aceite (globulina 7S, Morcillo et al., 2001, Physiol. Plant 112: 233-243), napina de Brassica napus, proteína 2S de almacenamiento, y el gen napA (Josefsson et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 12.196-201; Stalberg et al., 1993, Plant Mol. Biol. 1993, 23: 671-83; Ellerstrom et al, 1996, Plant Mol. Biol. 32: 1019-27), oleosina de Brassica napus (Keddie et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 327-40), oleosina de Arabidopsis (Plant et al., 1994, Plant Mol. Biol. 25: 193-205), FAE1 de Arabidopsis (Rossak et al., 2001, Plant Mol. Biol. 46: 717-25), conA de Canavalia gladiata (Yamamoto et al., 1995, Plant Mol. Biol. 27: 729-41) y estrictosidina sintasa de Catharanthus roseus (Str; Ouwerkerk y Memelink, 1999, Mol. Gen. Genet. 261: 635-43). En otra realización preferida, se usan secuencias reguladoras de genes expresados durante la biosíntesis de aceite (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.952.544). Son promotores alternativos los de genes de proteínas de almacenamiento de plantas (Bevan et al., 1993, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 342: 209-15).

Se pueden llevar a cabo pruebas moleculares y genéticas estándares para analizar adicionalmente la asociación entre un gen y un fenotipo observado. A continuación se describen técnicas ejemplares.

1. Análisis de DNA/RNA

Se pueden determinar los patrones de expresión génica específicos de la fase y el tejido en líneas mutantes frente a líneas de tipo silvestre mediante, por ejemplo, hibridación in situ. Se puede llevar a cabo el análisis del estado de metilación del gen, especialmente de las regiones reguladoras flanqueadoras. Otras técnicas adecuadas incluyen sobreexpresión, expresión ectópica, expresión en otra especie vegetal e inactivación ("knock-out") génica [genética inversa, inactivación dirigida, silenciamiento génico víricamente inducido (VIGS; del inglés, viral induced gene silencing; véase D. Baulcombe, Arch. Virol., Supl. 15: 189-201, 1999)].

En una aplicación preferida, se utiliza la perfiladura de la expresión, generalmente mediante el análisis con micromatrices, para medir simultáneamente diferencias o cambios inducidos en la expresión de muchos genes diferentes. Las técnicas para el análisis con micromatrices son bien conocidas en este campo técnico [M. Schena et al., Science (1995) 270: 467-470; D. Baldwin et al., Curr. Opin. Plant Biol. 2 (2): 96-103, 1999; F. Dangond, Physiol. Genomics (2000) 2: 53-58; N. L. van Hal et al., J. Biotechnol. (2000) 78: 271-280; T. Richmond y S. Somerville, Curr. Opin. Plant Biol. (2000) 3: 108-116]. Se puede llevar a cabo la perfiladura de la expresión de líneas etiquetadas individuales. Dicho análisis permite identificar otros genes que son coordinadamente regulados como consecuencia de la sobreexpresión del gen de interés, lo que puede ayudar a colocar un gen desconocido en una ruta particular.

2. Análisis de productos génicos

El análisis de productos génicos puede incluir expresión de proteínas recombinantes, producción de antisueros, inmunolocalización, ensayos bioquímicos en cuanto a actividad catalítica u otra actividad, análisis del estado de fosforilación, y análisis de la interacción con otras proteínas por medio de ensayos de dos híbridos en levadura.

3. Análisis de rutas

El análisis de rutas puede incluir situar un gen o producto génico dentro de una ruta bioquímica, metabólica o de señalización particular basándose en su fenotipo de expresión incorrecta o mediante su homología secuencial con genes relacionados. Alternativamente, el análisis puede comprender cruces genéticos con líneas de tipo silvestre y otras líneas mutantes (creándose mutantes dobles) para ordenar el gen en una ruta, o determinar el efecto de una mutación sobre la expresión de genes "informadores" aguas abajo en una ruta.

Generación de plantas mutadas con un fenotipo con contenido alterado de aceite

La invención proporciona además un método para identificar plantas que tienen mutaciones en el HIO30 endógeno que confieren un contenido alterado de aceite, y generar una progenie de estas plantas con contenido alterado de aceite que no esté genéticamente modificada. En un método, llamado "TILLING" (detección de lesiones locales inducidas, en genomas; del inglés, targeting induced local lesions in genomes), se inducen mutaciones en la semilla de una planta de interés, por ejemplo, usando un tratamiento con EMS. Las plantas resultantes son cultivadas y autofertilizadas, y se usa la progenie para preparar muestras de DNA. Se usa una PCR específica de HIO30 para identificar si una planta mutada presenta una mutación de HIO30. Las plantas que presentan mutaciones de HIO30 pueden ser luego examinadas en cuanto a un contenido alterado de aceite, o, alternativamente, se pueden examinar las plantas en cuanto a un contenido alterado de aceite y usar luego la PCR específica de HIO30 para determinar si una planta que tiene un contenido alterado de aceite tiene un gen HIO30 mutado. El TILLING permite identificar mutaciones que pueden alterar la expresión de genes específicos o la actividad de proteínas codificadas por estos genes [véanse Colbert et al., (2001), Plant Physiol. 126: 480-484; y McCallum et al. (2000), Nature Biotechnology 18: 455-457].

En otro método, se puede usar un planteamiento de gen candidato/locus de rasgo cuantitativo (QTL; del inglés, quantitative trait locus) en un programa de cría asistido por marcadores para identificar, en el gen HIO30 o en ortólogos de HIO30, alelos o mutaciones que puedan conferir un contenido alterado de aceite (véanse Bert et al., Theor. Appl. Genet., junio de 2003, 107 (1): 181-9; y Lionneton et al., Genome, diciembre de 2002, 45 (6): 1203-15). De este modo, en un aspecto más de la invención, se usa un ácido nucleico HIO30 para determinar si una planta que tiene un contenido alterado de aceite presenta una mutación en el HIO30 endógeno o tiene un alelo particular que causa el contenido alterado de aceite.

Ejemplos

Ejemplo 1

Generación de plantas con un fenotipo HIO30 por transformación con una construcción de etiquetado por activación

Se generaron mutantes usando el vector de etiquetado "ACTTAG" por activación, pSKI015 (GI#6537289; D. Weigel et al., supra). Se usaron métodos estándares para la generación de plantas transgénicas de Arabidopsis, que fueron esencialmente como los descritos en la solicitud PCT publicada WO0183697. En resumen, se transformaron plantas de Arabidopsis T0 (Col-0) con Agrobacterium que portaba el vector pSKI015, que comprende DNA-T procedente del plásmido Ti de Agrobacterium, un gen marcador seleccionable de resistencia a herbicidas, y el elemento potenciador 35S de CaMV 4X. Se seleccionaron plantas transgénicas de la generación T1 basándose en la resistencia a herbicidas. Se recogió la semilla T2 de plantas T1 y se guardó en una colección indexada, y se accedió a una porción de la semilla T2 para la exploración.

La determinación cuantitativa del contenido de ácidos grasos de la semilla se llevó a cabo usando los métodos siguientes. Una parte alícuota de 15 a 20 semillas T2 de cada línea examinada, que contenía generalmente inserción homocigótica, tipo silvestre homocigótico y genotipos heterocigóticos en una relación estándar 1:1:2, fue concentrada en una ultramicrobalanza UMT-2 (Mettler-Toledo Co., Ohio, EE.UU.) y fue luego transferida a un vial de vidrio para extracción. Se transesterificaron las semillas completas en 500 μl de H2SO4 al 2,5% en MeOH durante 3 horas a 80 °C, siguiendo el método de Browse et al. (Biochem. J. 235: 25-31, 1986) con modificaciones. Se incluyó una cantidad conocida de ácido heptadecanoico en la mezcla de reacción como patrón interno. Se añadieron 750 μl de agua y 400 μl de hexano a cada vial, que fue luego sacudido enérgicamente, y se dejó que se separaran las fases. Los viales de reacción se cargaron directamente en un cromatógrafo de gases para el análisis y se tomaron muestras de la fase superior de hexano mediante el automuestreador. Se usó cromatografía en fase gaseosa con detección mediante ionización por llama para separar y cuantificar los ésteres metílicos de los ácidos grasos. Se usaron cromatógrafos de gases Agilent 6890 Plus para la separación, con columnas Agilent Innowax (30 m x 0,25 mm de diámetro interno; 250 μm de espesor de película). El gas portador fue hidrógeno a un caudal constante de 2,5 ml/minuto. Se inyectó 1 μl de muestra en modo "sin división" (temperatura de entrada de 220 °C, caudal de purga de 15 ml/min en 1 minuto). Se programó el horno con una temperatura inicial de 105 °C y un tiempo inicial de 0,5 minutos, seguidos de una rampa de 60 °C por minuto hasta 175 °C y una rampa de 40 °C/minuto hasta 260 °C, con un tiempo de espera final de 2 minutos. La detección fue mediante ionización por llama (temperatura de 275 °C, caudal de combustible de 30,0 ml/min, caudal de agente oxidante de 400,0 ml/min). El control del instrumento y la recogida y el análisis de datos fueron mediante el Millenium Chromatography Management System (versión 3.2,

Waters Corporation, Milford, Massachusetts, EE.UU.). La integración y la cuantificación se llevaron a cabo automáticamente, pero posteriormente, antes de la inclusión de los resultados derivados en el estudio, todos los análisis se examinaron manualmente para verificar una correcta identificación de picos y una aceptable relación de señal a ruido.

Se reconoció que la línea ACTTAG denominada W000086431 tenía un fenotipo con alto contenido de aceite. Específicamente, el aceite constituía el 34,8% de la masa de semilla (peso/peso), en comparación con un contenido medio de aceite de 28,7% de otras líneas ACTTAG cultivadas y analizadas en las mismas condiciones (es decir, las líneas de referencia). Se llevó a cabo un nuevo análisis de la misma semilla por triplicado. El aceite constituía el 32,1% de la masa de semilla, lo que confirmaba un aumento del contenido de aceite con respecto a la referencia.

La línea W000086431 tiene tres loci de DNA-T. Un locus no estaba ligado al fenotipo, y se identificaron dos loci íntimamente ligados que se cosegregaban con el fenotipo con alto contenido de aceite. Los individuos T2 homocigóticos para los loci de alto contenido de aceite producían una semilla con un contenido de aceite del 115,4% de la referencia, los individuos T2 hemicigóticos para los loci producían una semilla con un contenido de aceite del 118,4% de la referencia. Los individuos T2 que carecían del locus HIO30 tenían contenidos de aceite del 105% de la referencia. Puesto que los homocigotos y los hemicigotos para los loci con alto contenido de aceite presentan un aumento similar en el contenido de aceite, se determinó que el fenotipo de W000068431 con alto contenido de aceite es dominante.

Ejemplo 2

Caracterización de la inserción de DNA-T en plantas que presentan el fenotipo con contenido alterado de aceite

Se llevaron a cabo análisis moleculares estándares, esencialmente como se describe en la solicitud PCT de patente WO0183697, para determinar el sitio de la inserción de DNA-T asociada con el fenotipo con contenido alterado de aceite. En resumen, se extrajo DNA genómico de las plantas que presentaban el fenotipo con contenido alterado de aceite. Una PCR confirmó, usando cebadores específicos para el vector pSKI015, la presencia del potenciador 35S en plantas de la línea W000086431, y un análisis por transferencia Southern permitió verificar la integración genómica del DNA-T ACTTAG.

Se usaron rescate plasmídico y/o PCR inversa para recuperar el DNA genómico que flanqueaba la inserción de DNA-T, el cual fue luego sometido a un análisis de secuencia usando una búsqueda BLASTN básica y/o una búsqueda en la base de datos de The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (disponible en el sitio web arabidopsis.org). Se recogieron semillas de 18 familias T3 descendientes del mutante. Se determinó el contenido de aceite de las semillas de estas familias del modo descrito en el Ejemplo 1. Se determinaron los genotipos de estas familias con respecto a una inserción de DNA-T mediante una PCR específica para DNA-T, usando cebadores que son específicos para una de las correspondientes regiones genómicas. El contenido medio de aceite de las familias T3 que contenían el inserto de DNA-T en los loci 2 y 3 era mayor que el de las familias que carecían del inserto en los correspondientes loci. Por lo tanto, se concluyó que el locus 2 y/o 3 está ligado al fenotipo con alto contenido de aceite. Por contraste, el contenido medio de aceite de las familias T3 que contenían el inserto de DNA-T en el locus 1 era menor/aproximadamente igual que el de las familias que carecían del inserto en el locus correspondiente, y se concluyó que el locus 1 no está ligado al fenotipo con alto contenido de aceite.

El análisis de secuencias reveló que el codón de inicio de la secuencia de nucleótidos presentada como ID. SEC. nº 1, que fue denominada HIO30, estaba aproximadamente a 5,6 kb 5' del borde cadena arriba del inserto de DNA-T en el locus 3.

Ejemplo 3

Análisis de la secuencia HIO30 de Arabidopsis

Se llevaron a cabo análisis de secuencias con BLAST (Altschul et al., 1997, J. Mol. Biol. 215: 403-410), PFAM (Bateman et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 260-262), PSORT (K. Nakai y P. Horton, 1999, Trends Biochem. Sci.

24: 34-6) y/o CLUSTAL (J. D. Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680).

El BLASTN de la ID. SEC. nº 1 frente a secuencias de GenBank identificó 6 ESTs de Arabidopsis procedentes de clones de cDNA derivados de la misma región genómica que At3g52260. Parece que este gen se presenta como una sola copia en Arabidopsis.

El BLASTN también identificó ESTs adicionales de otras especies vegetales. Se identificaron las siguientes tres ESTs de patata (Solanum tuberosum) como ortólogos candidatos (las calificaciones de BLAST están entre paréntesis): GI#s 13614224 (1054 4.2e-41), 18257466 (1031 4.8e-40) y 14266906 (1140 7.2e-50). Se clasificaron otras ESTs de plantas por especie y luego se ensamblaron en el menor número de cóntigos, representados por las ID. SEC. números 3-6 y descritos adicionalmente más adelante. En la mayoría de los casos, los cóntigos de EST representan regiones de codificación parciales. No obstante, la secuencia de cDNA completa del ortólogo puede ser determinada por alguien experto en técnicas de biología molecular.

La ID. SEC. nº 3 es de tomate (Lycopersicon esculentum), y es un cóntigo de las secuencias siguientes: GI#s 5894121, 9503437, 5894459 y 5889410. Presenta un 56% de identidad con la ID. SEC. nº 1.

La ID. SEC. nº 4 es de soja (Glycine max), y es un cóntigo de las GI#s 6913831 y 5760781. Presenta un 66% de identidad con la ID. SEC. nº 1.

La ID. SEC. nº 5 es de maíz (Zea mays), y es un cóntigo de las GI#s 21215230, 5268759 y 22521540. Presenta un 57% de identidad con la ID. SEC. nº 1.

La ID. SEC. nº 6 es de trigo (Triticum aestivum), y es un cóntigo de las GI#s 19955658 y 9364987. Presenta un 62% de identidad con la ID. SEC. nº 1.

El análisis con BLASTP devolvió entradas redundantes para el producto del gen At3g52260. Los únicos otros resultados devueltos fueron numerosos productos de genes bacterianos correspondientes a seudouridilato sintasa de RNA 23S. No se devolvieron otras secuencias de plantas.

El análisis con PFam detectó un dominio de seudouridilato sintasa de RNA (PF00849). De acuerdo con esta predicción funcional, PSORT2 predice que el producto del gen At3g52260 es citoplásmico (44%). El gen puede tener una función reguladora en la expresión de genes implicados en el metabolismo de ácidos grasos o en rutas relacionadas.

Ejemplo 4

Confirmación de la asociación fenotipo/genotipo

Un análisis por RT-PCR mostró que el gen HIO30 estaba sobreexpresado en plantas de la línea que presenta el fenotipo HIO30. Específicamente, se extrajo RNA de hojas en roseta y/o silicuas de plantas que presentan el fenotipo HIO30, recogidas en una diversidad de fases de desarrollo y reunidas. La RT-PCR se llevó a cabo usando cebadores específicos para la secuencia presentada como ID. SEC. nº 1, para otros genes pronosticados en las inmediaciones de la inserción de DNA-T, y para un gen de actina constitutivamente expresado (testigo positivo). Los resultados mostraron que las plantas que presentaban el fenotipo HIO30 sobreexpresaban el mRNA del gen HIO30, lo que indica que la expresión potenciada del gen HIO30 se correlaciona con el fenotipo HIO30.

El patrón de herencia dominante del fenotipo HIO30 se confirma por medio de un análisis genético. En general, el análisis genético implica la producción y el análisis de híbridos F1. Típicamente, se llevan a cabo cruces F1 recogiendo polen de plantas T2, que se usa para polinizar plantas de tipo silvestre. Dichos cruces se llevan a cabo tomando aproximadamente 4 flores de cada planta individual seleccionada y usando la flor T2 como dador de polen masculino, y flores de las plantas de tipo silvestre como hembras. Se realizan 4-5 cruces para un individuo de interés. Las semillas obtenidas de cruces del mismo individuo son reunidas, plantadas y cultivadas hasta la madurez como híbridos F1.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110><120>

Agrinomics LLC GENERACIÓN DE PLANTAS CON CONTENIDO ALTERADO DE ACEITE.

<130>

AG03-076C-PC

5

<150><151> 60/434.763

<160>

6

<170>

PatentIn versión 3.2

10

<210><211><212><213> 1 5034 DNA Arabidopsis thaliana

<400>

1

5

<210><211><212><213> 2 1677 PRT Arabidopsis thaliana

15

<400> 2

5

<210><211><212><213> 3 1012 DNA Lycopersicon esculentum

<400>

3

10

<210><211><212><213> 4 737 DNA Glycine max

<400>

4

5

<210><211><212><213> 5 1308 DNA Zea mays

<220> <221><222><223>

característica_miscelánea (661)..(665) n es a, c, g, o t

10

<220> <221><222><223> característica_miscelánea (1186)..(1186) n es a, c, g, o t

<400>

5

5

<210><211><212><213> 6 566 DNA Triticum aestivum

<400>

6

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una planta transgénica que comprende un vector de transformación de plantas que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos 70% con respecto a la ID. SEC. nº 2, por lo que la planta transgénica tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite en relación con plantas testigo.

2. 2.

   Una planta transgénica que comprende una secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos 70% con respecto a la ID. SEC. nº 2, por lo que la planta transgénica tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite en relación con plantas testigo.

3. 3.

   La planta transgénica de la Reivindicación 1 ó 2, en donde dicho polipéptido tiene una identidad secuencial de al menos 80% con respecto a la ID. SEC. nº 2.

4. 4.

   La planta transgénica de la Reivindicación 3, en donde dicho polipéptido tiene una identidad secuencial de al menos 90% con respecto a la ID. SEC. nº 2.

5. 5.

   La planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 2.

6. 6.

   La planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, que es seleccionada del grupo que consiste en semilla de colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuete.

7. 7.

   Un tejido u órgano transgénico de la planta de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5.

8. 8.

   Un tejido u órgano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 7, que es una semilla.

9. 9.

   Un método para producir aceite, que comprende cultivar la planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5 y recuperar aceite de dicha planta.

10. 10.

    Un método para producir una planta que tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite, método que comprende:

    a) introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación de plantas que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos 70% con respecto a la ID. SEC. nº 2, y

    b) cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde dicha secuencia polinucleotídica se expresa y dicha planta transgénica presenta un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite en relación con plantas testigo.

11. 11.

    El método de la Reivindicación 10, en donde dicho polipéptido tiene una identidad secuencial de al menos 80% con respecto a la ID. SEC. nº 2.

12. 12.

    El método de la Reivindicación 10 u 11, en donde dicho polipéptido tiene una identidad secuencial de al menos 90% con respecto a la ID. SEC. nº 2.

13. 13.

    El método de cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 12, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 2.

14. 14.

    El método de cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 13, en donde dicha planta es seleccionada del grupo que consiste en semilla de colza, soja, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino y cacahuete.

15. 15.

    Un método para generar una planta que tiene un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite, en el que se emplea la metodología TILLING, que comprende:

    inducir mutaciones en la semilla de la planta;

    cultivar plantas a partir de la semilla mutada; e

    identificar una planta que tiene una mutación en la secuencia génica ID. SEC. nº 1 que da lugar a un porcentaje aumentado de masa de semilla que es aceite en comparación con las plantas que carecen de la mutación.

16. 16.

    El método de la Reivindicación 15, en donde las mutaciones se inducen mediante tratamiento con EMS.

17. 17.

    El método de la Reivindicación 15, en donde la identificación de la planta que tiene una mutación en la secuencia génica ID. SEC. nº 1 comprende:

    autofertilizar las plantas cultivadas a partir de la semilla mutada, para obtener una progenie; aislar DNA de las plantas de la progenie; utilizar una PCR para identificar mutantes en la secuencia ID. SEC. nº 1; y examinar el contenido de aceite de las plantas que tienen mutaciones en la secuencia ID. SEC. nº 1.