HU215255B - Eljárás plazmidok és jellemzőikben és terméshozamukban módosított transzgén növények előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás plazmidők, amelyek az őldható cűkrőkmetabőlizműsát módősító prőteint – példáűl egy szervetlenpirőfőszfátőt – kódőló DNS-szekvenciát tartalmaznak, valamint az ezeet a plazmidőkat tartalmazó növényi sejtek, amelyek jellemzőikben ésterméshőzaműkban módősítőtt transzgén növények előállítására. Anövényeket jellemzőikben őlyan gének bevitelével és expressziójávamódősítják, amelyek a növényen beavatkőznak a növényen belülicűkőrmetabőlizműsba vagy cűkőrelősztásba. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás plazmidok és jellemzőikben és terméshozamukban módosított növények előállítására.

Egy haszonnövény vagy egy dísznövény növekedése, fejlődése és terméshozama attól az energiától függ, amelyet a növény a fotoszintézis során a szén-dioxid szénhidrátokban való rögzítésével nyer. A fotoszintézis helye elsősorban a levél, valamint kisebb mértékben a szár szövetei, míg a többi növényi szerv, azaz a gyökerek, magvak és gumók nem járulnak hozzá lényegesen a fotoasszimilátumok képződéséhez, hanem inkább növekedésük attól függ, hogy a fotoszintetikusán aktív szervek mennyire látják el őket. Ez azt jelenti, hogy fotoszintetikusán nyert energia áramlik a fotoszintetikusán aktív szövetek felől a növény fotoszintetikusán inaktív részei felé.

A fotoszintetikusán aktív szövetekre mint forrásra hivatkozunk. Ezek a meghatározás szerint a megkötött szén-dioxid nettó exportőrei. A növény fotoszintetikusán inaktív részeire mint „nyelő”-re hivatkozunk. Ezek a meghatározás szerint nettó importőrei a fotoszintetikusán megkötött szén-dioxidnak.

Feltételezhető, hogy mind a fotoszintézis termékeinek hatékony alkalmazása, mind ezek eloszlása számos szempontból erős befolyással van a növényre. A növények viselkedése említhető egy példaként. Az újonnan fejlődő szervek, például a nagyon fiatal levelek vagy más régiók, azaz a gyökerek és magvak teljesen a források fotoszintetikus kapacitásától függenek. Ez azt jelenti, hogy az ilyen szervek fejlődése a forrásokban keletkező fotoasszimilátumoknak a növényen belüli eloszlásától függ. Az új levelek keletkezésének vagy gyökerek kialakulásának lehetősége drasztikus hatással lehet a növény viselkedésére, azaz például a növény méretére, a csomóközi távolságra, a levelek méretére és alakjára, egy levél megjelenésére, valamint a kialakuló gyökérzet nagyságára és alakjára. Emellett feltételezhető, hogy a fotoasszimilátumok eloszlása nagyon fontos a növény terméshozamában. Azaz a búza teljes fotoszintetikus kapacitása nem változott meg lényegesen az utóbbi néhány évtizedben, míg a búzanövények emberek számára begyűjthető termése megnőtt. Ez nagymértékben annak tulajdonítható, hogy a versengő nyelők közötti arányt megváltoztatták oly módon, hogy azok a nyelők, amelyek a termés, azaz a magvak szempontjából fontosak, lényegesen több fotoasszimilátumot vesznek fel mint a növény többi, a termés szempontjából kevésbé fontos részei, például a szár. Ebben az esetben ez azáltal vált lehetségessé, hogy csökkentették a szár hosszát, hogy a búzában egy, az emberek számára kedvezőbb nyelő-forrás arányt kapjanak. Ez aláhúzza annak fontosságát, hogy magasabb rendű növényekben mind a viselkedés mind a termés szempontjából fontos az elsődleges forrásokban keletkező fotoasszimilátumok eloszlása.

A viselkedésbeli módosítások, szárazságtűrés és/vagy fagytűrés, valamint a növény terméshozamának módosítása lényeges fejlődést jelent az ismert növényeknél.

A kétszikű és egyszikű növények genetikai módosítását szolgáló biotechnológiai eljárások ismertek [Gasser and Fraley, Science, 244, 1293-1299 (1989)].

Az nem ismert, hogy milyen biokémiai mechanizmus szabályozza a nyelő-forrás arányt.

A találmány tárgya eljárás olyan növények előállítására, amelyek megjelenésükben módosultak, azaz méretükben, a levél alakjában, a csomóköz méretében, a sejtfal szerkezetében, a mag, a gumó és a gyökér képződésében és főleg a begyűjthető terméshozamban.

A találmány szerinti növény a cukor metabolizmusát vagy a cukor eloszlását módosító fehéijét kódoló DNS-t tartalmaz. A DNS-szekvencia expresszálódik a keletkező transzgenikus növényben, amely ahhoz vezet például, hogy ezekben a transzgenikus növényekben megnő azoknak a fotoasszimilátumoknak az aránya, amelyek a forráslevelekben oldható cukrok formájában vannak jelen.

A találmány céljára olyan plazmidokat állítunk elő, amelyek az oldható cukrok metabolizmusát módosító fehérjét kódoló DNS-szekvenciát kódolnak, és ezeket a plazmidokat bejuttatjuk növényi sejtekbe, majd a növényeket teljes növényekké regeneráljuk. A DNS-szekvencia által kódolt termék előnyösen megváltoztatja a foszfát/pirofoszfát metabolizmust, a DNS-szekvencia elsősorban egy olyan DNS-szekvencia, amely egy szervetlen pirofoszfatáz gént kódol.

A legtöbb növényben a fotoasszimilátumok cukrok formájában oszlanak meg, előnyösen szacharóz formájában. Mivel a szénhidrátoknak a forrásból a nyelőkbe való transzportjának a legfontosabb formája a szacharóz, ezért egy fonás erősségének, azaz a nyelőbe való hatékony továbbításának a meghatározásában egy másik fontos meghatározó az oldható cukrok (különböző mono-, di-, és triszacharidok, például fruktóz, glükóz és szacharóz) hozzáférhetősége a levelekben. Például a forráslevelekben a szacharóz viszonylag magas koncentrációja egy megnövekedett betáplálást jelent a nyelőkbe, és ennek következtében a fotoasszimilátumoknak egy megnövekedett arányát a begyűjtött szervekben. Ez eredményezheti a terméshozam megnövekedését.

A forráslevelekben az oldható cukrok és keményítők közötti arányt meghatározó jelentőségűnek tételezik fel a szénhidrátoknak a növényen belül a nyelő- és forrásrészek közötti megoszlásában. Ha a nyelőket hatékonyan látják el a szacharózzal a forráslevelek, ez jelentkezhet a növény megjelenésének megváltozásában, de főleg a terméshozam megnövekedésében, amit a legtöbb esetben a nyelő raktára, azaz a mag, gumó és gyökér határoz meg.

A szacharóz bioszintézisben egy fontos szabályozási pont a fruktóz-1,6-difoszfát (Fru-1,6-P2) konverziója fruktóz-6-foszfáttá (Fru-6-Ρ). az ebben a lépésben résztvevő enzimek egyike a pirofoszfát-fruktóz-6foszfát-l-foszfotranszferáz (PFP). Ez az enzim képes egyrészt konvertálni a Fru-l,6-P2-t Fru-6-P-tá, szervezetlen pirofoszfát felszabadulásával egyidejűleg, másrészt képes a Fru-6-P-t foszforilezni Fru-1,6-P2tá, szervetlen pirofoszfát felhasználásával. A PFP által katalizált reakció irányát a szervetlen pirofoszfát és a szervetlen foszfát viszonylagos mennyisége szabályozza.

HU 215 255 Β

A szervetlen pirofoszfát folyamatos eltávolítása egy szervetlen pirofoszfatázzal egy egyensúlyi eltolódást eredményezhet a Fru-6-Ρ irányába, és ennek következtében megnő az oldható cukrok, például a hexózok és/vagy szacharóz képződése. A fotoaszszimilátumok eloszlásában bekövetkezett változás, ami annak következtében áll be, hogy egy szervetlen pirofoszfatázzal eltávolítjuk a pirofoszfátot, eltolást okozhat a reakcióban is, amelyet UDP-glükóz-pirofoszforiláz katalizál:

glükóz-1-foszfát + UTP—> UDP-glükóz + PPi az UDP glükóz irányába. Az UDP glükóz így megnövekedett mennyisége a növény egyéb tulajdonságainak módosulásához is vezet, például a megvastagodott sejtfalakhoz. Ezt befolyásolja a sejtfal-bioszintézis prekurzorainak megnövekedett mennyisége. A sejtfalak megvastagodása megnöveli a növények szárazságtűrő képességét, ami a légzés csökkent sebessége révén valósul meg.

Nagyszámú klónozóvektor, amely egy Escherichia coli replikációs rendszert és egy olyan genetikai bélyeget tartalmaz, ami lehetővé teszi a transzformált sejtek szelekcióját, elérhető azzal a céllal, hogy a növényekbe bejuttatandó idegen géneket előállítsuk. A vektor lehet például pBR322, pUC sorozatba tartozó, Ml 3 sorozatba tartozó, pACYC184 stb. A szekvenciát egy megfelelő restrikciós helynél lehet beépíteni a vektorba. A keletkező plazmidot használjuk Escherichia coli transzformálására. Az Escherichia coli sejteket megfelelő táptalajon növesztjük, majd kinyerjük őket és feltárjuk. A plazmidot kinyerjük. A szekvenciaelemzést, a restrikciós elemzést, elektroforéziseket és más biokémiai-molekuláris biológiai módszereket általában analitikai módszerként hajtjuk végre. Mindegyik manipuláció után a használt DNS-szekvenciát elhasíthatjuk és a következő DNS-szekvenciához kapcsolhatjuk. Mindegyik plazmidszekvenciát klónozhatjuk ugyanabban vagy egy más plazmidokban. Attól függően, hogy milyen módszerrel juttatjuk be a kiválasztott géneket a növénybe, eltérő DNS-szekvenciákra lehet szükség. Ha például a Ti vagy Ri plazmidot használjuk a növényi sejt transzformálására, akkor a Ti vagy Ri plazmid T-DNS-ének legalább ajobb kaiját, de gyakran mind a jobb mind a bal karját határoló régió gyanánt hozzá kell kapcsolnunk a beillesztendő génekhez.

A T-DNS alkalmazását növényi sejtek transzformálására intenzíven vizsgálták és kielégítően leírták [EP 120516; Hoekema, In: TheBinary Plánt Vector System Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rév. Plánt Sci., 4, 1-46; An et al., EMBO J., 4, 277-287 (1985].

Ha a beépített DNS egyszer integrálódott a genomba, akkor ott viszonylag stabil, és általában nem lép ki onnan. Normális esetben tartalmaz egy olyan szelekciós markert, amely a transzformált növényi sejteknek rezisztenciát biztosít egy biocid hatású anyag vagy egy antibiotikum ellen, ami lehet kanamicin, G418, bleomicin, higromicin vagy kloramfenikol többek között. Az alkalmazott marker lehetővé teszi, hogy a transzformált sejteket szelektáljuk, és ne azokat, amelyek a beépített DNS-t nem tartalmazzák.

Újabban úgy találták, hogy ha egy plazmid olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely egy vagy több gén szabályozórégiójához íuzionáltatható, képes megvalósítani a gén expresszióját egy növényi sejtben vagy egy növényben. A szabályozórégió tartalmazza egy promoter gén promoter régióját, majd ugyanennek vagy másik génnek a terminációs jelét.

Lehetséges olyan promotert alkalmazni, például a karfiol-mozaikvírus (CaMV) promoterét, amely konstitutív expressziót hoz létre, és emellett egy növényi terminációs jelet alkalmazni. Más lehetséges promoterek olyan promoterek, amelyek specifikusan csak fotoszintetikusán aktív sejtekben lejátszódó expresszi ót kódolnak [például az ST-Lsl promoter, Stockhaus et al., EMBO J., 8, 2445-2451], ami akkor jelenthet különleges előnyt, ha a levelekben lejátszódó szacharóz metabolizmusban kell változást elemi; egy forrásspecifikus promoter, amely csak a nyelőszervek feltöltése idején aktív (azaz speciális fejlődési szakaszban); egy gyökérspecifikus promoter, ha specifikus expresszió előnyös a gyökerekben, mivel vastagabb sejtfalra van szükség; egy tárolásnyelő-specifikus promoter (amely például csak a burgonya gumóiban, a cukorrépa karógyökerében, paradicsomszerű gyümölcsökben aktív, ilyen például az I-es osztályba tartozó patatin promoter), ha az elérendő változás specifikusan előnyös a nyelőszövet számára.

Egy növényi terminációs jel lehet az oktopin szintetáz gén poli-A oldatának 3’ vége.

Nagyszámú különböző technika ismert arra, hogy DNS-t juttassunk be növényi gazdasejtekbe. Ezek közé a technikák közé tartozik a T-DNS-sel való transzformáció, tanszformáló ágensként Agrobacterium tumefacienst vagy Agrobacterium rhizogenest alkalmazva, a fúzió, injekció vagy elektroporáció, valamint más lehetséges módszerek. Ha agrobaktériumokat alkalmazunk a transzformációra, akkor a beépítendő DNS-t speciális plazmidokba kell beépíteni, nevezetesen vagy egy közvetítő vektorba vagy egy bináris vektorba. A közvetítő vektorok homológ rekombinációval integrálódhatnak a Ti vagy Ri plazmidba, a T-DNS-ben lévő homológ szekvenciák következtében. A Ti vagy Ri vektor tartalmazza még a T-DNS transzferéhez szükséges vir régiót. A közvetítő vektorok önmagukban nem képesek replikálódni az agrobaktériumokban. Az intermedier vektort egy segítő plazmiddal (konjugáció) lehet átvinni Agrobacterium tumefaciensbe. A bináris vektorok képesek önmagukban replikálódni mind Escherichia coliban, mind agrobaktériumokban. Tartalmaznak egy szelekciós-marker-gént és egy linkért vagy polilinkert, amelyet a T-DNS jobb- és baloldali kaija határol. Ezek közvetlenül transzformálhatok agrobaktériumokba [Holsters et al., Mól. Gén. Génét., 163, 181-187 (1987)]. A gazdasejtként használt agrobaktériumnak egy vir régiót hordozó plamidot kell tartalmaznia A vir régió a T-DNS-nek a növényi sejtbe való átviteléhez szükséges. Emellett más T-DNS-t is tartalmazhat. Az így transzformált baktériumot használjuk növényi sejtek transzformálására. A növényi explantumokat előnyösen tenyészthetjük Agrobacte3

HU 215 255 Β rium tumefecienssel vagy Agrobacterium rhizogenessel, hogy a DNS-t átvigyük a növényi sejtbe. Teljes növények regenerálhatok a fertőzött növényi anyagból (például levéldarabokból, szárrészekből, gyökerekből, de protoplasztokból vagy szuszpenziósan tenyésztett sejtekből) megfelelő táptalajban, amely a szelekcióhoz antibiotikumokat vagy biocid hatású anyagokat tartalmaz. Az így kapott növényeket le lehet vizsgálni, hogy bennük van-e a beépített DNS. Nem támasztanak különleges igényeket azokkal a plazmidokkal szemben az injektálás és elektroporáció esetében. Normális píazmidok, például pUC-származékok alkalmazása is lehetséges.

A transzformált sejtek a növények belsejében nőnek a szokásos módon. A növényeket a szokásos módon nevelhetjük, majd olyan növényekkel keresztezhetjük, amelyek azonos vagy eltérő transzformált genetikai tulajdonságokkal rendelkeznek. A keletkező hibrid egyedek a megfelelő fenotipikus tulajdonságokkal rendelkeznek.

Rövidítések és szakkifejezések

Rövidítések bp, kb = bázispárok, kilobázisok

DNS = dezoxiribonukleinsav, a genetikai információ hordozója

HEPES = N-2-hidroxietil-piperazin-N’-2-etánszulfonsav SDS =Nátrium-dodecil-szulfát TRIS = TRIS- (2-aminoetil)-amin EDTA = etiléndiamin-tetraecetsav U = egység (enzimegység)

Az alábbi plazmidokat helyeztük letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)-nél, Braunschweig, Német Szövetségi Köztársaság, 1990. augusztus 20-án és 1991. október 10-én. A letéti számok az alábbiak.

p35S-omega-ppáz (DSM 6141) 1990. augusztus 20. L-700:ppa (DSM 6733) 1991. október 10.

Az ábrák leírása

1. ábra

Itt láthatjuk a 4.0 kb méretű p35S-omega-ppáz plazmid szerkezetét. A plazmid a következő fragmenteket tartalmazza:

A = A fragment (529 bp): a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét tartalmazza. Ez a fragment tartalmazza a CaMV 6 909-7 437-es nukleotidjait.

Β = B fragment (73 bp): 61 nukleotidot tartalmaz, amelynek a szekvenciája az alábbi:

TTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAAC

AAACAACATTACAATTACTATTTACAATTA.

A fenti szekvenciában a GGTACC szekvenciájú Asp 718 linker a fenti szekvencia 5’ végén helyezkedik el, a CCATGG szekvenciájú Ncol linker szekvencia pedig a 3’ végén helyezkedik el.

C = C fragment (554 bp): az Escherichia coliból származó szervetlen pirofoszfatáz (ppa) fehétjekódoló régióját tartalmazza (a Lahti és munkatársai szerinti szekvenciából a +39 és + 565 sorszámú nukleotidok közötti szekvenciát tartalmazza).

D = D fragment (192 bp): a pTiACH5 Ti plazmid TDNS-e 3-as génjének poliadenilezési jelét tartalmazza.)

A példában ismertetett hasítási helyek is láthatók.

2. ábra

Itt láthatjuk a pirofoszfatáz gén által kódolt RNS kimutatását transzgenikus burgonya- és dohánynövényekben, Northern blot-elemzést alkalmazva.

1-19-es pozíciók: Ap35S-omega-ppáz plazmiddal transzformált és regenerált burgonyanövények leveleiből nyert összRNS-minták

20-28-as pozíciók: Ap35S-omega-ppáz plazmiddal transzformált és regenerált dohánynövények leveleiből nyert összeRNS-minták.

A pozíció: Transzformálatlan burgonyanövényből nyert minta.

B pozíció: Transzformálatlan dohánynövényből nyert minta

A fekete pontok a pirofoszfatáz által kódolt RNS-t jelentik.

3. ábra

Itt látható az új pirofoszfatáz-aktivitás előfordulása p35S-omega-ppáz plazmiddal transzformált transzgenikus burgonya- és dohánynövények leveleiből készült fehérjekivonatokban, SDS-gélen.

1-7-es pozíciók: Transzformált burgonyanövények leveleiből származó fehérjekivonat

8-9-es pozíciók: Transzformált dohánynövények leveleiből származó fehéijekivonat

A pozíció: Transzformálatlan dohánynövények leveleiből származó fehérjekivonat

B és C pozíciók: Transzformálatlan burgonyanövények leveleiből származó fehéijekivonat

X és Y pozíciók: E. coli fehéijekivonat

4. ábra

Itt látható a glükóztartalom, fruktóztartalom, szacharóztartalom és keményítőtartalom összehasonlítása mmol/m² értékben egy 35S-omega-ppáz gént expresszáló dohánynövényben (;;;), valamint transzformálatlan dohánynövényben ((), különböző korú levelekben.

Az ábrán 1 = nagyon fiatal levelek

2-4 = érett levelek 5-6 = öreg levelek

5. ábra

Itt látható a 35S-omega-ppáz gén expressziójának hatása transzgenikus burgonyanövényekben (1-12-es pozíciók), a transzformált növények leveleiben lévő szacharóz/keményítő arányra.

C = transzformálatlan burgonyanövény

6. ábra

Itt látható az 5.0 kb méretű L700:ppa plazmid szerkezete.

A plazmid a következő fragmenteket tartalmazza:

A = A fragment (1585 bp): az ST-LS1 gén promoterét tartalmazza. A fragment az ST-LS1 gén +1 - +1585 pozíciójú nukleotidjait tartalmazza.

Β = B fragment (528 bp): a szervetlen pirofoszfatáz (ppa) fehérjekódoló régióját tartalmazza. A fragment a +39 - +565 pozíciójú nukleotidokat tartalmazza.

HU 215 255 Β

D = C fragment (192 bp): a pTiACH5 Ti plazmid

3-as génje poliadenilezési jelét tartalmazza, a 11 749-11 939 pozíciójú nukleotidokat.

A példákban leírt hasítási helyek is láthatók.

Abból a célból, hogy a találmány alapját képező példákat jobban megértsük, az ilyen vizsgálatokhoz szükséges összes eljárást, amelyek önmagukban ismertek, az alábbiakban listázzuk:

1. Klónozási eljárás

A pUC18 vektort [Yanisch-Perron et al., Gene, 33,

103-119 (1985)] használtuk a klónozáshoz.

A növények transzformálásához a génkonstrukciókat a BIN19 bináris vektorba klónoztuk [Bevan, Nucl. Acids Rés., 12, 8711-8720(1984)].

2. Baktériumtörzsek

A pUC-vektorokhoz az Eseherichia coli BMH71-18 [Messing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 24, 6342-6346 (1977)] vagy TB1 törzset használjuk. A TB1 egy rekombináció-negatív, tetraciklin-rezisztens származéka a JM101 törzsnek [Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119 (1985)]. A TB1 törzs genotípusa (Bárt Barrel személyes közlése alapján: F (traD36, proAB, lacl, lacZ Ml5, (lac, pro), SupE, thiS, recA, Srl::TnlO (Tc^R).

A növények transzformálását az Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzzsel végeztük [Bevan, M., Nucl. Acids Rés. 12, 8711-8721 (1984); ez egy BIBszármazék].

3. Az agrobacetrium tumefaciens transzformálása

A BIN19 származékok esetében a DNS beépítését az agrobaktériumba közvetlen transzformációval végezzük, Holster és munkatársai által kifejlesztett módszerrel [Mól. Gén. Génét., 163, 181-187 (1987)]. A transzformáit agrobaktériumok plazmid DNS-ét Doly és Bimbóim módszerével izoláljuk [Nucl. Acids. Rés., 7, 1513-1523 (1979)], majd a megfelelő restrikciós enzimmel végzett emésztés után gélelektroforézissel választjuk el

4. Növényi transzformáció

A) Dohány

Az Agrobacterium 10 ml-es, éjszakán át szelekciós körülmények között növesztett tenyészetét lecentrifugáljuk, a felülúszót elöntjük, majd a baktériumokat az eredetivel azonos térfogatú antibiotikummentes táptalajban szuszpendáljuk. Egy steril Petri-csészébe olyan steril növényekből származó levélkorongokat (körülbelül 1 cm²), amelyekből a központi eret eltávolítottuk, baktériumszuszpenzióba merítjük. A levélkorongokat ezután szorosan elrendezve 2% szacharózzal és 0,8% Bacto Agárral kiegészített MS táptalajt [Murashige and Skoog, Physiologia Plantaum, 15, 473-497 (1962)] tartalmazó Petri-csészébe tesszük. Kétnapos, sötétben és 25 °C-on végzett inkubálás után 100 mg/1 kanamicint, 500 mg/1 claforant, 1 mg/ml benzilamino-purint (BAP), 0,2 mg/1 naftilecetsavat (NAA) és 0,8% agart tartalmazó MS táptalajra tesszük át a korongokat. A növekvő hajtásokat hormonmentes, 250 mg/1 claforant tartalmazó MS táptalajra visszük át.

B) Burgonya darab steril burgonyatenyészetből származó, szikével felsértett kis levelet viszünk 10 ml, 2% szacharózt tartalmazó MS táptalajba, amely 30-50 μΐ, éjszakán át szelekciós körülmények között növesztett Agrobacterium tumefaciens tenyészetet tartalmaz. 3-5 perces enyhe rázatás után a Petri-csészéket 25 °Con, sötétben inkubáljuk. 2 nap elteltével a leveleket MS táptalajra terítjük ki, amely 1,6% glükózt, 2 mg/ml zeatin ribózt, 0,02 mg/ml naftilecetsavat, 0,02 mg/1 gibberellinsavat, 500 mg/1 claforant, 50 mg/1 kanamicint és 0,8% Bacto Agart tartalmaz. Miután egy hétig 25 °C-on inkubáltuk 3000 lux megvilágítás mellett, a táptalaj claforankoncentrációját felére csökkentjük. A további tenyésztést Rocha-Sosa és munkatársai leírása szerint végezzük [Plánt Mól. Bioi., 5, 69-76 (1985)].

A DNS elemzése céljából alkalmas restrikciós enzimekkel végzett hasítás után 10-20 pg DNS-t vizsgálunk Southern blottal, azt nézzük, hogy a vizsgálandó DNS-szekvenciák beépültek-e.

Az elemzés céljára az össz-RNS 50 pg-os részeit vizsgáljuk Northern blottal, hogy jelen van-e benne a keresett transzkriptum.

7. Fehéijeextrakció

Az összfehérje növényi szövetből való extraháláshoz a szövetdarabokat fehérjeextrakciós pufferben homogenizáljuk [összetétele: 25 mmol nátrium-foszfát, pH=7,0, 2 mmol nátrium-hidrogén-szulfit, 2 mmol fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) és 0,1 v% oldhatatlan polivinil-pirrolidon (PVP)].

Miután cellulózon átszűrtük, a sejttörmeléket lecentrifugáljuk (20 perc, 100000/perc fordulatszám), és a fehérje koncentrációját a felülúszóban Bradford módszerével határozzuk meg [Anal. Biochem., 72, 248-254(1976)].

8. A szervetlen pirofoszfátaktivitás kimutatása [módosítva Baykov és munkatársai által, Analytical Biochemistry, 171, 271-276 (1988)].

Az összefehérjét a 7. pontban leírtak szerint extraháljuk a növényekből, és módosítatlan SDS-puffert (125 mmol TRIS-HC1 pH=6,8,10% 2-merkapto-etanol, 20% glikol, 0,004% brómfenolkék) adunk hozzák, majd az egészet 10%-os SDS-poliakrilamid gélre visszük. Az elegyeket denaturáljuk, de nem forralással, az SDS-gélen való elválasztás előtt. Az elektroforetikus elválasztás után a géleket röviden öblítjük vízben, majd 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk pirofoszfát pufferben (0,05 mól TRIS-HC1 pH=9,0; 0,03 mmol szervetlen pirofoszfát (Na₂P₂O₇); 5 mmol MgCl₂). 17 tf% festőport adunk (140 mg ammónium-molibdát, 11,5 mg malachitzöld 10 ml kénsavban) ezután az oldathoz. A türkizkék csapadék képződése pirofoszfatáz-aktivitásra utal.

9. A szacharóz, glükóz, fruktóz és keményítő meghatározása

a) Extrakció

Kis levélkorongokat (10 mm átmérőjű) folyékony nitrogénben lefagyasztunk, majd 30 percig 80 °C-on extraháljuk 0,5 ml pufferben (összetétele: 80 tf% etanol, 10 mmol HEPES pH=7,5) vízfürdőt alkalmazva. Az oldható komponenseket tartalmazó felülúszót elöntjük, és térfogatát meghatározzuk. A felülúszót használjuk az oldható cukrok meghatározására.

HU 215 255 Β

A megmaradó oldhatatlan anyagot vízzel öblítjük, majd egy dörzscsészében finoman megőröljük. Az extraktumot ezután 1 óra hosszat 95 °C-on tartjuk 0,2 mól kálium-hidroxid oldatban, 70 μΐ 1 normál ecetsawal semlegesítjük, majd lecentrifügáljuk. A kapott keményítőoldat alikvot részeit használjuk a keményítő meghatározására.

b) Az oldható glükóz, fruktóz és szacharóz mennyiségi meghatározása

Az oldható glükóz, fruktóz és szacharóz mennyiségi meghatározását az alábbi elegyben végezzük:

100,0 mmol imidazol-HCl, pH=6,9 1,5 mmol MgCl₂ 0,5 mmol NADP+

1,3 mmol ATP

10-50 μί minta

1,0 U élesztőből származó glükóz-6-foszfát-dehidogenáz

Az elegyet öt percig inkubáljuk. A cukrok meghatározását ezután fotometriásan végezzük, miután egymás után hozzáadtunk az elegyhez

1,0 U élesztőből származó hexokinázt (a glükóz meghatározására);

1,0 U élesztőből származó foszforoglükózizomerázt (a szacharóz meghatározására);

20,0 U élesztőből származó invertázt (a szacharóz meghatározására).

c) Keményitőmeghatározás

Az a) pontban etanolos extrakcióval előállított keményítőoldathoz 55 °C-on hidrolitikus enzimeket adunk, majd az egészet tizenkét óra hosszat inkubáljuk az alábbi elegyben:

50,0 mmol nátrium-acetát pH=4,8 1,4 U amiloglükozidáz Aspergillus nigerből 2,0 U cc-amiláz sertéshasnyálmirigyből

Az inkubálás után az oldhatatlan alkotórészeket 4 perces centrifugálással eltávolítjuk (16000 g). A felülúszóban ezután a keletkező glükózt enzimatikusan határozzuk meg, a b) pontban leírtak szerint.

1. példa

A p35S-omega-ppáz plazmid előállítása és a plazmid bejuttatása a növény genomjába

Egy Escherichia coli KI2 törzsből származó DNSszekvenciát, amely szervetlen pirofoszfatázt kódol, ellátjuk a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promo téré vei, ami konstitutív expressziót biztosít, majd a dohány-mozaikvírusból származó, transzlációs erősítőként szolgáló szekvenciával, végül pedig egy növényi terminációs jellel. A növényi terminációs jel az oktopin szintetáz gén 3’ vége poli-A oldalát tartalmazza. A szervetlen pirofoszfatáz gén transzlációs iniciációs ATG kodonjának szomszédságát kontrollált mutagenezisnek vetjük alá, hogy eukarióta sejtekben maximális expressziót kapjunk. A p35S-omega-ppáz plazmid tartalmazza a négy, A, B, C és D fragmentet, amelyeket a pUC18 polilinkerének hasítási helyeire klóónozunk (1. ábra).

Az A fragment (529 bp) tartalmazza a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét. Ez a fragment tartalmazza a CaMV 6909-7437-es nukleotidjait [Franck et al., Cell, 21, 285-294], Egy EcoRI-KpnI fragment formájában izoláljuk a pDH51 plazmidból [Pietrzak et al., Nucleic Acids Research, 14, 5857-5868], majd a pUC18 plazmid polilinkerének EcoRI-KpnI hasítási helyére klónozzuk.

A B fragment tartalmazza az alábbi szekvenciájú, 61 tagú oligonukleotidot:

TTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAAC AAACAACATTACAATTACTATTTACAATTA amely homológ annak az U dohánymozaik-vírusból származó DNS-szegmentnek egy részével, amely transzlációs erősítő szekvenciaként szolgál [Gallie et al., Nucleic Acids Research, 15, 3257-3273]. Azt a szegmentet, amelyet DNS-szintézissel állítunk elő, az 5’ végén Asp 718 linkerszekvenciával látjuk el, amelynek a szekvenciája az alábbi:

GGTTACC majd a 3’ végén egy Ncol linkerrel, amelynek a szekvenciája:

CCATGG.

A B fragmentet a pUC18 plazmid polilinkerének Kpnl és Smal hasítási helyére klónozzuk.

A C fragment tartalmazza az Escherichia coli eredetű szervetlen pirofoszfatázt (ppa) kódoló régiót, amely a Lahti szerinti szekvencia [J. Bacteriology, 170, 5901-5907] +39 - +565 közötti nukleotidjait tartalmazza.

A C fragmentet a B fragment Ncol hasítási helye és a pUC18 polilinker Sáli helye közé klónozzuk.

A D fragment (192 bp) tartalmazza a pTiACH5 Ti plazmid [Gielen et al., EMBO J., 3, 835-846] T-DNSe 3-as génjének poliadenilezési szignálját, az 11 749-11 939 számú nukleotidokat, amelyeket egy PvuII-HindlII fragment formájában izolálunk a pAGV40 plazmidból [Herrera-Estrella et al., Natúré, 303, 209-213 (1983)], majd miután a PvuII hasítási helyhez hozzáadtunk egy Sphl linkért, a pUC18 polilinkerének SphI-HindlII hasítási helyére klónozzuk.

A p35S-omega-ppáz plazmid mérete 4,0 körülbelül

A p35S-omega-ppáz plazmidot bináris vektorokba építjük, majd ezután dohány- és burgonyanövényekbe visszük be, az agrobaktériumrendszer alkalmazásával. A transzformált sejtekből érintetlen és termékeny növényeket regeneráltunk.

A transzformált növények Southern blottal végzett elemzése jelezte, hogy a transzgenikus növényekben jelen van az érintetlen kimérapirofoszfatáz gén.

Abból a célból, hogy a pirofoszfatáz gén által kódolt RNS-t kimutassuk a transzgenikus burgonyában és dohányban, 30 pg össz-RNS-t izolálunk a transzformáit és regenerált burgonya- és dohánynövények leveleiből, valamint a transzformálatlan dohányból és burgonyából. Az RNS-t Northern-blot elemzéssel vizsgáltuk. A regenerált növények elemzése (burgonya: 1, 2, 8, 11, 12, 15 és 13-as pozíció; dohány: 21-26-os pozíció) azt jelezte, ahogy a szövetekben van olyan RNS, amely specifikusan hidridizál a szervetlen pirofoszfatáz kódoló szekvenciájával, és ez

HU 215 255 Β nincs meg a transzformálatlan növényekben (burgonya: A pozíció, dohány: B pozíció) (2. ábra).

A p35S-omega-ppáz plazmiddal transzformált transzgenikus burgonya- és dohánynövények leveleiből készült fehérjekivonatokban levő új pirofoszfatáz-aktivitás kimutatását a 8. pontban ismertetett módon részlegesen denaturált gélben végezzük.

Azoknak a transzformált növényeknek a fehérjekivonata, amelyek a szervetlen pirofoszfatáz kódoló szekvenciájával specifikusan hidridizálódó RNS-t tartalmaznak, szervetlen pirofoszfatáz-aktivitást mutat (burgonya: 1-7 pozíciók, dohány: 8-9 pozíciók), ami nincs jelen a transzformálatlan növényekben (A-C pozíciók) (3. ábra).

Olyan transzgenikus dohány- és burgonyanövények állíthatók így elő, amelyek új szervetlen pirofoszfatázaktivitást tartalmaznak, amely az ezekbe a növényekbe beépített Escherichia coli génből származnak (3. ábra).

A regenerált dohány- és burgonyanövények számos különbséget mutattak a fenotipikus és biokémiai paraméterek szempontjából.

a) Transzgenikus dohánynövények

Azok a transzgenikus dohánynövények, amelyek magas szinten expresszálják a pirofoszfatáz gént, sokkal kisebb méretre nőnek meg, míg azok a növényeknél, amelyekben a pirofoszfatáz gén expressziója közepes szintű, csak enyhe a méretcsökkenés. A tömörödés nem a levelek számának köszönhető, hanem a csomóközi távolság csökkenésének.

A pirofoszfatázt expresszáló dohánynövények fiatal levelei nem mutatnak semmi jellegzetes fenotipikus eltérést a transzformálatlan kontrollnövényekhez viszonyítva. A pirofoszfatázt expresszáló öregebb levelek azonban jelentősen megvastagodtak. Azokban a növényekben, amelyekben a pirofoszfatáz nagyon erősen expresszálódik, az öregebb levelek elszíntelenedése figyelhető meg. Az említett fenotipikus különbségek mellett a pirofoszfatázt expresszáló dohánynövényekben jelentős eltérés van a különböző korú levelek szénhidrát-összetételében (4. ábra). Például az oldható cukrok mennyisége, főleg a glükózé, fruktózé és szacharózé észlelhetően megnőtt az összes levélben, a transzformálatlan növények leveleivel összehasonlítva, a növekedés mértéke az idősebb levelekben 20-50-szeres. Ugyanakkor, legalábbis az idősebb levelekben, megnövekedett a keletkezett keményítő mennyisége, de az a növekedés nem érte el az oldható cukrok mennyiségének megnövekedését, de végeredményben egyrészt jelentős növekedés volt észlelhető a keményítő és az oldható cukrok összemennyiségében a pirofoszfatáz expressziójának következtében, másrészt viszont jelentős eltolódás észlelhető a fotoasszimilátumok között a keményítő és az oldható cukrok közül az utóbbiak javára.

b) Transzgenikus burgonyanövények

A pirofoszfatáz gént expresszáló burgonyanövények első lényeges fenotipikus módosulásként lényegesen kisebb méretre nőnek. A kompaktságot a növény megnövekedett elágazása kíséri, az axiális hajtások megnövekedett képződése miatt. Az nyilvánvaló, hogy ez a kompakt növekedés számos előnnyel rendelkezik a széllel szembeni stabilitás és a szélre való érzékenység szempontjából.

A pirofoszfatáz gént expresszáló burgonyanövények szintén drasztikus változásokat mutatnak a levél szénhidrát-összetétele szempontjából (5. ábra). A burgonyanövényekben például megnövekedik a szacharóz: keményítő arány. Az ebben az arányban mért növekedés mértéke akár hússzoros is lehet. A dohánynövényektől eltérően a transzgenikus burgonyanövények nem mutatnak jelentős növekedést a hexózok (glükóz és fruktóz) mennyiségében.

A szervetlen foszfátot kódoló gén transzgenikus burgonyanövényekben való expressziójának eredményeképpen lehetséges volt módosítást elérni a szacharóz-/keményítő arányban, és ennek megfelelően módosítani a forrás levél kapacitását.

A pirofoszfatáz gént bármely más forrásból klónozhatjuk és hasonló kísérletekben alkalmazhatjuk. Emellett a pirofoszfatáz primer szekvenciája módosítható, hogy ezzel jobb expressziós szintet éljünk el, és/vagy a ppázt átirányítsuk más szubcelluláris szervekbe (kloroplaszt, mitokondrium, vakuolum, extracelluláris tér), vagy más promotert alkalmazhatunk, hogy csak specifikus expressziót biztosítsunk ezzel, azaz például csak fotoszintetikusán aktív sejtekben, magvakban, gumókban, karógyökerekben, gyümölcsökben, szárban stb., vagy speciális környezeti körülmények, azaz szárazság, forróság, hideg, magas sótartalom körülményei között.

2. példa

Az L700:ppa plazmid előállítása és a plazmid beépítése a növényi genomba

Egy Escherichia coli K12-ből származó DNS-szekvenciát izolálunk, és az ST-LS1 gén promoterével [Stockhaus et al., EMBO J., 8, 2445-2451 (1989)] látjuk el, amely specifikus expressziót biztosít fotoszintetikusán aktív sejtekben, majd egy növényi terminációs jelet adunk hozzá. A növényi terminációs jel az oktopin szintetáz gén poli-A oldalának 3’ végét tartalmazza. Az L700:ppa plazmid három fragmentet tartalmaz (A, B, és

C), amelyeket a pUC18 polilinkerének hasítási helyére klónozzuk (6. ábra).

Az A fragment (1585 bp) tartalmazza az STLS1 gén promoterét. Ebben a fragmentben találhatók az ST-LS1 gén +1 - +1 585 sorszámú nukleotidjai [Eckes et al., Mól. Gén. Genetics, 205, 14-22], Egy EcoRI-MboII fragment formájában izoláljuk, majd a pUC18 plazmid polilinkerének EcoRI-Smal hasítási helyére klónozzuk, miután az MboII hasítási helyet T4—DNS polimerázzal feltöltöttük.

A B fragment tartalmazza az Escherichia coli eredetű szervetlen pirofoszfatázt, amely a Lahti és munkatársai szerinti számozás [J. Bacteriology, 170, 5901-5907] a +39 - +565-ÖS nukleotidokból áll. Ezt a p35S-omegappáz plazmidból (1. ábra) egy Ncol-Sall fragment formájában izoláljuk. A B fragmentet a pUC18 polilinkerének BamHI és Sáli hasítási helyére klónozzuk, miután az Ncol és BamHI végeket feltöltöttük.

HU 215 255 Β

A C fragment (192 bp) tartalmazza a pTiACH5 Ti plazmid] Gielen et al., EMBO J., 3, 835-846] T-DNS-e 3-as génjének poliadenilezési jelét, a 11 749-11 939-es nukleotidokat, amelyet egy PvuII-HindlII fragment formájában izolálunk a pAGV plazmidból [Herrera-Estrella et al., Natúré, 303, 209-213 (1983)], és miután a PvuII hasítási helyhez hozzáadtunk egy Sphl linkért, a pUC18 plazmid polilinkerének SphI-HindlII hasítási helyére klónozzuk.

Az L700:ppa plazmid mérete 5,0 kb.

Az L700:ppa plazmidot bináris vektorokba illesztjük, majd az agrobaktériumrendszer alkalmazásával dohány- illetve burgonyanövényekbe juttatjuk be. A transzformált sejtekből teljes és termékeny növényeket regenerálunk.

A transzformált növények Southern biot, RNS biot és zimogram analízise jelzi a transzgenikus növényekben a pirofoszfatáz gén jelenlétét és expresszióját, de csak a levélszövetben, azaz a fotoszintetikusán aktív sejtekben.

Az Escherichia coli pirofoszfatáz specifikus expressziója fotoszintetikusán aktív sejtekben (levél), a forrásszervek (gyökerek, gumók) megnövekedett szacharózellátásához vezet, és ezáltal megnövekedett terméshozamhoz.

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely szervetlen pirofoszfatáz gént kódoló DNS-szekvenciát növényi sejtben vagy növényben a szervetlen pirofoszfatázt kódoló gén kifejezését biztosító egy vagy több szabályozórégióhoz kapcsolunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi promotert és növényi terminációs jelet tartalmazó szabályozórégiót alkalmazunk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coliból származó, szervetlen pirofoszfatázt kódoló DNS-szekvenciát alkalmazunk.
4. 4. Eljárás növényi sejt vagy növény előállítására, azzal jellemezve, hogy szervetlen pirofoszfatázt kódoló DNS-szekvenciát építünk be a növényi genomba.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi genomba szervetlen pirofoszfatáz gént kódoló DNS-szekvenciát építünk be.
6. 6. Eljárás növény oldhatócukor-metabolizmusának módosítására, azzal jellemezve, hogy a növény tenyésztulajdonságait, terméshozamát, szárazságtűrő képességét, só- és/vagy fagytűrő képességét változtatjuk meg, a genomba szervetlen pirofoszfatáz gént kódoló DNS-szekvencia beépítésével.