JP2021503893A

JP2021503893A - エンドヌクレアーゼによる昆虫の性別誘導および生殖不能化

Info

Publication number: JP2021503893A
Application number: JP2020528053A
Authority: JP
Inventors: ピー．カンダルニコライ; エス．アクバリオマー
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2017-11-21
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2021-02-15
Also published as: AU2018370818A1; US20200367479A1; KR20200088446A; IL274580A; CA3083123A1; EP3713406A2; CN111587070A; BR112020010130A2; EP3713406A4; WO2019103982A3; WO2019103982A2; CL2020001320A1

Abstract

開示される高精度誘導の生殖不能化昆虫技術（ｐｇＳＩＴ）の方法には、遺伝子組換え昆虫で性別をオスに誘導する方法、および生殖不能の遺伝子組換えオス昆虫の卵の子孫を産み出す方法が含まれる。これらの方法は、メスに固有の生存能力に必要なメスに必須のゲノム配列を標的とする少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドを持つ少なくとも１つの核酸配列を第１の昆虫のゲノム内に組み込むこと、エンドヌクレアーゼを第２の昆虫に導入すること、および前記第１の昆虫と前記第２の昆虫を遺伝的に交配させて、それにより前記エンドヌクレアーゼと前記少なくとも１つの核酸配列を発現する子孫を産み出すことを含む。オスを生殖不能にするために、第２のガイドポリヌクレオチドは、オスに固有の生殖不能性に必要とされるオスの生殖不能性ゲノム配列を標的とする。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１７年１１月２１日に出願された「新規の昆虫生殖不能化技術（NOVEL STERILE INSECT TECHNIQUE）」と題する米国仮出願第６２／５８９，４０５号の優先権および利益を主張し、その全ての内容が参照により本明細書内に組み込まれる。

連邦政府より資金提供を受けた研究または開発に関する申立
本発明は、米国国立衛生研究所から申請番号：５Ｋ２２ＡＩ１１３０６０および１Ｒ２１ＡＩ１２３９３７の下で付与され、かつ米国国防総省先端技術研究局から申請番号：ＨＲ００１１-１７-２-００４７の下で付与された政府の支援を受けて実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。

生殖不能化昆虫技術（ＳＩＴ）として知られている生殖不能オスの大量産出およびその放出は、歴史的には１９３０年代中頃より、害虫個体群の防除および根絶に使用されてきた。以前からの方法では、生殖不能性はＤＮＡを損傷する薬剤の使用に頼っていたが、放出されたオスでは、全体的な適応度や交尾競争力が大幅に低下した。これらの問題を克服するために、ボルバキア系の非互換昆虫技術（ＩＩＴ）などの細菌を介する生殖不能化技術、優性致死性を保有する昆虫放出（ＲＩＤＬ）などの最新の遺伝的ＳＩＴ類似システム、メス固有のＲＩＤＬ（ｆｓＲＩＤＬ）などのメスを遺伝的に死滅させる生殖力のあるオスを放出するその他の方法、および常染色体に結合したＸ染色体の切断剤が開発されてきた。これらの第１世代の遺伝子ＳＩＴ技術は著しく進歩してきたが、ＩＩＴでは、細菌に感染したメスを放出しないことが厳格に必要とされるが、それを現場で達成するのは困難であり、微生物叢を除去することが知られているテトラサイクリンの使用はＲＩＤＬ／ｆｓＲＩＤＬのオスの適応度を損ない、またＸ染色体の切断剤は、原理的に異性配偶子性の性染色体を持つ種のみでしか増殖できず、従ってこの技術の他の種への幅広い適用には制限がある。以上より、生殖不能のオスだけが生き残る卵として展開可能なより効率的なＳＩＴ系の技術を採用することは、量を確保する点で有効なものとなる。

本開示の実施形態の側面は、高精度誘導の昆虫生殖不能化技術（ｐｇＳＩＴ）を含む方法に関する。

本開示の実施形態によっては、遺伝子組換え昆虫の性別をオスに誘導する方法は、メス固有の生存能力に必要なメスに必須のゲノム配列を標的とする少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドを有する少なくとも１つの核酸配列を第１の昆虫のゲノム内に組込むこと；エンドヌクレアーゼを、前記第１の昆虫と遺伝的に交配可能な第２の昆虫に導入すること；および前記第１の昆虫と第２の昆虫を遺伝的に交配させて、それによりエンドヌクレアーゼおよび少なくとも１つの核酸配列を発現する子孫を産み出し、この子孫からオスの昆虫の卵が成熟して成虫になることを含む。

本開示の実施形態によっては、遺伝子組換えされた生殖不能のオス昆虫卵の子孫を産み出す方法は、メス固有の生存能力に必要なメスに必須のゲノム配列を標的とする少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドを有する少なくとも１つの核酸配列を第１の昆虫のゲノム内に組み込むこと；エンドヌクレアーゼを前記第１の昆虫と遺伝的に交配可能な第２の昆虫に導入すること（前記少なくとも１つの核酸配列はさらに、オス固有の生殖不能性に必要なオス生殖不能性ゲノム配列を標的とする少なくとも１つの第２のガイドポリヌクレオチドを含む）；および第１の昆虫と第２の昆虫を遺伝的に交配させて、生殖不能の遺伝子組換えオス昆虫の卵の子孫を産み出すことを含む。

本開示の実施形態によっては、少なくとも１つの核酸配列の第１の昆虫のゲノム内への組み込みは、ゲノム内のすべての染色体コピーへのホモ接合型の組み込みを含む。実施形態によっては、少なくとも１つの核酸配列の組み込みは、胚期の第１の昆虫に少なくとも１つの核酸配列を導入することを含む。

本開示の実施形態によっては、少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの第２のガイドポリヌクレオチドはそれぞれ、少なくとも１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含む。

本開示の実施形態によっては、メスに必須のゲノム配列は、メスに固有の生存能力に必須の遺伝子、またはメスに固有の成長能力および／またはメスに固有の生存能力に必須のメスに固有のエクソンを含む。

本開示の実施形態によっては、少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれがメスに固有の生存能力に必要とされるメスに必須の同一のゲノム配列の異なる領域を標的とする２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドを含む。

本開示の実施形態によっては、少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれがメスに固有の生存能力に必要とされるメスに必須の異なるゲノム配列を標的とする２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドを含む。

本開示の実施形態によっては、メスに必須のゲノム配列は、遺伝子または遺伝子のスプライシング変異体であり、この遺伝子は、性致死遺伝子（Ｓｘｌ）、性転換遺伝子（Ｔｒａ）、両性遺伝子（Ｄｓｘ）、それらのホモログ、それらのオルソログ、それらのパラログ、またはそれらの組合わせからなる群から選択される。

本開示の実施形態によっては、少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれが、Ｓｘｌ、Ｔｒａ、またはＤｓｘ、それらのホモログ、それらのオルソログ、またはそれらのパラログから選択される異なる遺伝子を標的とする２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドを含む。

本開示の実施形態によっては、２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれが、Ｓｘｌ、Ｔｒａ、またはＤｓｘ、それらのホモログ、それらのオルソログ、またはそれらのパラログから選択される異なる遺伝子を標的とする２つの第１のガイドポリヌクレオチドを含む。

本開示の実施形態によっては、２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれが、Ｓｘｌ、またはＤｓｘ、それらのホモログ、それらのオルソログ、またはそれらのパラログから選択される異なる遺伝子を標的とする２つの第１のガイドポリヌクレオチドを含む。

本開示の実施形態によっては、オスの生殖不能性ゲノム配列は、βチューブリン８５Ｄ（βＴｕｂ）、ファジーオニオン（Ｆｚｏ）、プロタミンＡ（ＰｒｏｔＡ）、または精母細胞停止（Ｓａ）、それらのホモログ、それらのオルソログ、またはそれらのパラログから選択される遺伝子である。

本開示の実施形態によっては、第２の昆虫がオスである場合に、エンドヌクレアーゼの第２の昆虫への導入は、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子をホモ接合的に組み込むことを含み、第２の昆虫がメスである場合に、エンドヌクレアーゼの第２の昆虫への導入は、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子をホモ接合的にまたはヘテロ接合的に組み込むか、またはエンドヌクレアーゼタンパク質を第２の昆虫内に沈着させることを含む。

本開示の実施形態によっては、エンドヌクレアーゼの第２の昆虫への導入は、胚期の第２の昆虫にエンドヌクレアーゼを導入することを含む。

本開示の実施形態によっては、遺伝子組換え昆虫卵の子孫は、本開示の方法に従って産み出された最大１００％のオスの昆虫卵を含む。

本開示の実施形態によっては、遺伝子組換え昆虫卵の子孫は、本開示の方法に従って産み出された最大１００％の生殖不能のオス昆虫卵を含む。

実施形態によっては、本開示の方法に従って産み出された生殖不能の遺伝子組換えオス昆虫は、野生型のメス昆虫と交配して、孵化しない卵の割合を増加させることができる。

本開示の実施形態によっては、野生型の昆虫個体群を削減する方法は、本開示の方法に従って産み出された生殖不能の遺伝子組換えオスを野生型の昆虫個体群内に導入することを含む。

特許または出願資料は、色付きで作成された１枚以上の図面を含む。色付き図面を含むこの特許または特許出願公開の複製物は、要求に応じ必要な手数料を支払うことで、官庁から入手できる。添付の図面は、明細書とともに本開示の実施形態の例を示し、その記載内容とともに本開示の原理を説明するのに役立つ。

本開示の実施形態に従って、二元ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの２つの構成成分であるエンドヌクレアーゼＣａｓ９および（青色または緑色の標的固有の配列を有して）分離されたホモ接合系統として維持されたガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を利用するｐｇＳＩＴの概略図であり、これらの交配は、メスの生存能力に必要な遺伝子およびオスの生殖不能性に必要な遺伝子への同時発生的なノックアウトを引き起して、これによりＦ_１生殖不能オスのみの生存をもたらす。

本開示の実施形態に従って、Ｓｘｌ（緑色）タンパク質およびＴｒａ（黄色）タンパク質（灰色の線）のメスでの発現によって調節されたｓｘｌ遺伝子、ｔｒａ遺伝子、およびｄｓｘ遺伝子での性別固有の選択的スプライシングの概略図であり、主要な性別決定遺伝子であるｓｘｌ、ｔｒａ、ｄｓｘのメス固有のエクソンの破壊は、メスの成長能力を破壊する。ｐｇＳＩＴでのエクソンの標的は、黄色の×印で示されている。

本開示の実施形態に従って操作された全ての構築物の概略図を示し、機能的構築物およびハエはそれぞれ、Addgene.orgおよびBloomington Drosophila Stock Centerに寄託されている。遺伝子名およびｇＲＮＡ標的位置配列は、枠内に表示されている。ＳｐＣａｓ９のコード配列には、両端に２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、およびＣ末端にｅＧＦＰコード配列を備えた自己切断型Ｔ２Ａペプチドが隣接し、Ｃａｓ９発現を視覚的に表示するのに役立っている。

本開示の実施形態に従って操作された化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を発現する３種の新規のホモ接合型系統の蛍光立体顕微鏡画像である。厳密に生殖細胞系中または体細胞と共に生殖細胞系中でのＳｐＣａｓ９の発現を助ける３種のショウジョウバエ系統が開発された。Ｎａｎｏｓ-Ｃａｓ９（ｎｏｓ-Ｃａｓ９）、ｖａｓａ-Ｃａｓ９（ｖａｓ-Ｃａｓ９）、およびＵｂｉｑｕｉｔｉｎ-６３Ｅ（Ｕｂｉ-Ｃａｓ９）は、φＣ３１を介した組み込みを使用して、第３染色体の同じ位置に挿入された。導入遺伝子マーカーとして機能するＯｐｉｅ２-ｄｓＲｅｄ導入遺伝子、およびＳｐＣａｓ９コード配列の３’末端に付加された自己切断型Ｔ２Ａ-ｅＧＦＰ配列は、図１Ｃに示されるようにＣａｓ９発現の指標として提供された。それぞれのＣａｓ９系統でのｄｓＲｅｄおよびｅＧＦＰの発現水準を、野生型（ｗｔ）のハエと比較した。Ｃａｓ９-Ｔ２Ａ-ｅＧＦＰの発現は、ｎｏｓ-Ｃａｓ９およびｖａｓ-Ｃａｓ９のメス生殖細胞系に殆ど限定され、ｎｏｓ-Ｃａｓ９では強い発現を示した。Ｕｂｉ-Ｃａｓ９は、メスおよびオス生殖細胞系の両方でかつ体細胞内で、ｅＧＦＰによる測定でのＣａｓ９の最も強い発現を示した。

本開示の実施形態に従って操作された親昆虫による交配のＦ_１子孫での平均的な性別の発生頻度の棒グラフを示す。上側の２つの図は、ホモ接合型ｓｇＲＮＡ系統の野生型（ｗｔ）に対する双方向の対照交配からの性別の発生頻度を示し、生殖力のあるメスとオス（♀と♂）の両方が同じ比率で存在しているが、生殖不能の間性は確認されていない。生殖力のあるメスはピンク色で、生殖力のあるオスは青色で、生殖不能のメスはオレンジ色で、生殖不能のオスは灰色で示されている。下側の２つの図は、ホモ接合型のｎａｎｏｓ-Ｃａｓ９（ｎｏｓ-Ｃａｓ９）の（対照の）野生型および（実験の）４つのホモ接合型のｓｇＲＮＡ系統に対する交配からの性別の発生頻度を示している。母方または父方のＣａｓ９遺伝質に関係なく、１００％のトランスヘテロ接合型のｓｇＲＮＡ^Ｓｘｌの♀は致死的であり、１００％のトランスヘテロ接合型のｓｇＲＮＡ^ＴｒａおよびｓｇＲＮＡ^ＤｓｘＦの♀は、生殖不能の間性にオス化され、１００％のトランスヘテロ接合型のｓｇＲＮＡ^βＴｕ♂は生殖不能であった。トランスヘテロ接合体での性別の発生頻度および生殖能力を、ｎｏｓ-Ｃａｓ９ハエ（実線）またはｓｇＲＮＡハエ（破線）および野生型ハエにより、対照交配の対応する子孫の性別の発生頻度および生殖能力と比較した。それぞれの棒は、性別の平均発生頻度および一標準偏差を示す。統計的な有意性は、不等分散を仮定したｔ検定により計算され、オスの生殖不能性に関して、Ｐ値は、分割表におけるピアソンのカイ２乗検定（赤色^＊）を使用して計算された。（Ｐ＞０．００１^＊＊＊）。

本開示の実施形態に従って、ホモ接合型の一本鎖ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ）とホモ接合型のｎｏｓ-Ｃａｓ９（ｎｏｓ-Ｃａｓ９／ｎｏｓ-Ｃａｓ９）との間の交配からのＦ_１子孫の表である。

本開示の実施形態による方法を使用して、ｇＲＮＡによって標的化された遺伝子座の遺伝子型の表であり、（赤色文字の）インデル（すなわち挿入／欠失）は、トランスヘテロ接合型のハエに見出された。本開示の実施形態による方法を使用して、ｇＲＮＡによって標的化された遺伝子座の遺伝子型の表であり、（赤色文字の）インデル（すなわち挿入／欠失）は、トランスヘテロ接合型のハエに見出された。本開示の実施形態による方法を使用して、ｇＲＮＡによって標的化された遺伝子座の遺伝子型の表であり、（赤色文字の）インデル（すなわち挿入／欠失）は、トランスヘテロ接合型のハエに見出された。

本開示の実施形態にに従って、二本鎖ｇＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）とＣａｓ９ホモ接合型系統との間の交配に起因するトランスヘテロ接合型のＦ_１子孫の性別（♀（メス）、♂（オス）、および間性）の発生頻度の棒グラフを示す。それぞれβＴｕｂに結合したｓｘｌ、ｔｒａ、またはｄｓｘを標的とする３種の二本鎖ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）は、ｎａｎｏ（ｎｏｓ）、ｖａｓａ（ｖａｓ）、およびＵｂｉｑｕｉｔｉｎ-６３Ｅ（Ｕｂｉ）プロモーターによって駆動される３つのＣａｓ９系統により双方向で交配され、図１Ｃ〜図１Ｄに示されるようなそれぞれの相互交配でのメスの致死性／オス化の両方およびオスの生殖不能性の完全な浸透率を確保するのに十分であった。トランスヘテロ接合体での性別の発生頻度および生殖能力を、Ｃａｓ９ハエ（左側の棒の群、実線）またはｄｇＲＮＡｓハエ（上側の図、破線）および野生型ハエにより、対照交配の対応する子孫の性別の発生頻度および生殖能力と比較した。それぞれの棒は、性別の平均発生頻度および一標準偏差を示す。統計的な有意性は、不等分散と仮定したｔ検定により計算され、オスの生殖不能性に関して、Ｐ値は、分割表におけるピアソンのカイ２乗検定（赤色^＊）を使用して計算された。（Ｐ＞０．０１^＊＊、Ｐ＞０．００１^＊＊＊）。

本開示の実施形態に従って、ホモ接合型の二本鎖ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ／ｄｇＲＮＡ）系統とホモ接合性型のＣａｓ９（Ｃａｓ９／Ｃａｓ９）系統との間の交配からのＦ_１子孫の表である。

本開示の実施形態に従って、性別決定経路での標的化遺伝子の序列（上側）および子孫での対応するノックアウト表現型を（画像と共に）示すデータ表である。野生型の♀および♂に比較してのｄｇＲＮＡ対象のノックアウトの表現型、および間性の形態。βＴｕｂ、ｓｘｌへのノックアウトの♀は、図２Ｄ〜２Ｅに示されるように、蛹の段階で死滅する。示すように、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の間性には性櫛（sex combs）が存在し、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、ＤｓｘＦ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の間性には存在しなかった。拡大した内部の挿入図を参照。

ホモ接合型のｎｏｓ-Ｃａｓ９／ｎｏｓ-Ｃａｓ９の♀とｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}の♂の交配によって生まれたｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の卵について見積もられた孵化率（百分率）は、本開示の実施形態に従って、表２（実施例６）に示すように、野生型（ｗｔ）の卵での孵化率と統計的に差異は無かったことを表す棒グラフを示す。統計的有意性は、不等分散と仮定したｔ検定により計算された。（Ｐ＜０．０５^ＮＳ、Ｐ＞０．００１^＊＊＊）。

本開示の実施形態に従って、孵化したｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の幼虫での異なる生存率を表す棒グラフを示し、ここでは５０匹の孵化した幼虫のバッチが成体まで飼育されて、それらの性別または死滅までの成長時間が、表３（実施例６）に示されるように測定された。付加的な幼虫の死滅の大部分は、蛹への移行中に発生し、蛹での死滅率は、野生型の♀の死滅率と統計的に差がなかった。統計的有意性は、不等分散と仮定したｔ検定により計算された。（Ｐ＜０．０５^ＮＳ、Ｐ＞０．００１^＊＊＊）。

本開示の実施形態に従って、Ｃａｓ９および二本鎖ｇＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を保有するトランスヘテロ接合型ハエの表現型の特徴を示す表である。

本開示の実施形態に従って、βＴｕｂ、Ｔｒａへのノックアウトでの性櫛の剛毛数の違いを表す顕微鏡画像を示す。

本開示の実施形態に従って、野生型のメスの内部生殖器官、すなわち２つの卵巣（ｏｖ）、受精嚢（ｓｒ）、２つの貯精嚢（ｓｐ）、２つの付属腺（ａｇ）、および子宮（ｕｔ）の顕微鏡画像（上方の画像）を示し、およびｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の間性ハエ（下方の画像）は、１つの未発達の卵巣、およびオスの付属腺に似た器官を持つことを示す。

本開示の実施形態に従って、Ｄｓｘ遺伝子のオスおよびメスのスプライシング変異体の両方が、βＴｕｂ、Ｔｒａへのノックアウトの間性で発現することを示す増幅転写物のアガロースゲル画像である。ＲＴ-ＰＣＲを使用して、野生型（ｗｔ）のメス（♀）、野生型のオス（♂）およびｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の間性（βＴｕｂ^＊、Ｔｒａ^＊間性）を比較して、ｄｓｘのメス固有およびオス固有の代替スプライング変異体を評価した。メスとオスの両方に固有のｄｓｘ転写産物が、βＴｕｂ^＊、Ｔｒａ^＊の間性の中で同定された。二本鎖ＤＮＡの分子ラダー（ＭＬ）および非テンプレート対照（ＮＴＣ）が表示されている。

本開示の実施形態に従って、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、ＤｓｘＦ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋間性の間性ハエの顕微鏡画像は、単一の卵巣（ｏｖ）のみが発育したことを示していて、表示のように、この卵巣は、卵管およびオス固有の付属腺（ａｇ）に似た臓器に接続されていないことが多い。

本開示の実施形態に従って、表示のように精巣（ｔｓ）および副腎（ａｇ）を有するｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の♂ハエでのオスの内部生殖器系の顕微鏡画像を示す。

本開示の実施形態に従って、この図におよび図２Ｋ〜図２Ｌに表示のように、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の精巣（ｔｓ）には見られなかった成熟精子細胞を伴う細長い嚢胞を有する野生型ｗｔの精巣（左側画像）の顕微鏡画像を示す。

本開示の実施形態に従って、トランスヘテロ接合型のｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋（二重鎖ノックアウト）の生殖不能のオス（♂）でのβチューブリン８５Ｄ（βＴｕｂ）標的に関する配列情報の概略図であり、この図では、高精度のβＴｕｂ標的部位でのモザイク型の挿入／欠失（インデル）を示す。上側の図は、標的遺伝子の遺伝子構造に対して、ｇＲＮＡ標的部位およびＰＣＲに使用されるプライマーの位置を示している。両端からの配列の読み取りにより、生殖不能の♂にはｇＲＮＡにより標的化された部位に特異的に局在化した多様なテンプレートが推定されたが、野生型の♂には、いずれの配列にも曖昧さがない一本鎖の対立遺伝子が存在した。

本開示の実施形態に従って、トランスヘテロ接合型のｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋（二重鎖ノックアウト）の生殖不能のオス（♂）での性致死遺伝子（Ｓｘｌ）標的に関する配列情報の概略図であり、この図では、同じｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の生殖不能のオス（♂）のＳｘｌ標的部位での特定されたモザイク型インデルを示していて、図２Ｄ〜図２Ｅで観察されたトランスヘテロ接合型のメスの蛹での致死性に関連する可能性がある。上側の図は、標的遺伝子の遺伝子構造に対して、ｇＲＮＡ標的部位およびＰＣＲに使用されるプライマーの位置を示している。両端からの配列の読み取りにより、生殖不能の♂にはｇＲＮＡにより標的化された部位に特異的に局在化した多様なテンプレートが推定されたが、野生型の♂には、いずれの配列にも曖昧さがない一本鎖の対立遺伝子が存在した。

本開示の実施形態に従って、トランスヘテロ接合型のｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋二重鎖ノックアウトの生殖不能のオス（♂）および間性での性転換遺伝子（Ｔｒａ）標的に関する配列情報の概略図であり、この図では、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}二本鎖ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）によって標的化されたＴｒａ部位に位置するモザイク型の挿入／欠失（インデル）を示している。上側の図は、標的化遺伝子の遺伝子構造に対して、ｇＲＮＡ標的およびＰＣＲに使用されるプライマーの位置を示している。両端からの配列の読み取りにより、生殖不能の♂および間性にはｇＲＮＡにより標的化された部位に特異的に局在化した多様なテンプレートが推定されたが、野生型の♂には、両側の部位にいずれの配列にも曖昧さがない一本鎖の対立遺伝子が存在した。

本開示の実施形態に従って、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、ＤｓｘＦ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の生殖不能の♂および間性のトランスヘテロ接合型のｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、ＤｓｘＦ}二本鎖ｇＲＮＡでの両性遺伝子（ＤｓｘＦ）標的に関する配列情報の概略図であり、この図では、モザイク型のインデルがＤｓｘＦ部位標的に特定されることを示している。上側の図は、標的化遺伝子の遺伝子構造に対して、ｇＲＮＡ標的およびＰＣＲに使用されるプライマーの位置を示している。両端からの配列の読み取りにより、生殖不能の♂および間性にはｇＲＮＡにより標的化された部位に特異的に局在化した多様なテンプレートが推定されたが、野生型の♂には、両側の部位にいずれの配列にも曖昧さがない一本鎖の対立遺伝子が存在した。

Ｃａｓ９の母方への導入による優性効果の遺伝的な定量を表す棒グラフを示していて、この図では、ホモ接合型のｄｇＲＮＡハエとヘテロ接合型のＣａｓ９ハエとの間の相互交配によって生まれたハエの遺伝子型、性別発生頻度、および生殖能力が、図の凡例のように、ピンク色、青色、オレンジ色、または灰色の塗潰しまたは縞模様の棒によって示されている。ヘテロ接合型の父方のＣａｓ９ハエとの交配からの子孫は左側の図に示され、ヘテロ接合型の母方のＣａｓ９ハエとの交配からの子孫は、右側の図に示されている。各棒は、平均の性別発生頻度と一標準偏差を示す。統計的有意性は、不等分散を仮定したｔ検定で計算された。（Ｐ＞０．０１^＊＊、Ｐ＞０．００１^＊＊＊）。縞模様の棒は、遺伝子としてのＣａｓ９の遺伝性を示し、塗潰しの棒は、＋対立遺伝子の遺伝性を示す。

本開示の実施形態に従って、胚での遺伝子型および母体／接合子の寄与の組合わせ、ならびにそれらの浸透率を示す概略表である。

本開示の実施形態に従って、ホモ接合性型の二本鎖ｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ／ｄｇＲＮＡ）とヘテロ接合型のＣａｓ９（Ｃａｓ９／ＴＭ３、Ｓｂ）との間の交配からのＦ_１子孫の表である。

図示のように、昆虫の全発育期間中の高水準の二対立遺伝子モザイク現象（ＢＭ）の蓄積により、生物レベルで遺伝子機能が失われ、誘発された表現型の完全な浸透、すなわち致死性（致死的な二対立遺伝子モザイク現象（ＬＢＭ））（ピンク色の箱型域）、メスのオス化、またはオスの生殖不能化を保証することを示す概略表である。未切断の野生型の対立遺伝子（薄緑色の箱型域）およびＮＨＥＪによって生成された耐性対立遺伝子（黄色の箱型域）によるいくつかの細胞中の遺伝子機能の補完は、生物レベルで誘発された表現型を救済するには十分ではないので、１００％のトランスヘテロ接合型の子孫は、誘発された表現型を有する。細胞が分裂するにつれて、箱型域は、より小さくなり、より個数が増大する。

本開示の実施形態に従って、野生型のメスとの交尾を確実にするように、野生型のオスに対して競合するｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の生殖不能のオス（赤色で印付け）の交尾競争力を評価する実験装置の概略図である。交尾したメスは、次の交尾までに約２４時間の耐性があり、生殖不能のオスの交尾の成功率を、生殖力の低下（例えば、孵化しない卵の割合の増加）で評価した。

産まれた卵および孵化した卵の百分率を示す棒グラフを示し、産卵数は、図４Ｃの表に示されるように、最大の卵数（ｎ＝１９９）に対して正規化されて、それらを百分位数に変換した。１匹の生殖不能のオスの存在は、１匹の野生型のオスの排除（第２群対第１群）では説明できないメスの生殖能力（第３群と第２群）の大幅な減少をもたらした。統計的有意性を、第３群を第２群および第１群と比較して、不等分散を仮定したｔ検定で計算した（Ｐ＞０．００３^＊＊、Ｐ＞０．０００１^＊＊＊）。

本開示の実施形態に従って、表示された交配によって、野生型のオスと比較したｄｇＲＮＡ^{ｂＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋のオスでの産卵数、不孵化卵数、および孵化卵数に基いた交尾競争力の表である。

本開示の実施形態に従って、野生型のオス（青色線）および父方（赤色線）または母方（緑色線）のＣａｓ９遺伝性を有する２種のｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋の生殖不能のオスの生存曲線のグラフである。生存曲線は、３つのオス群での非母数（ノンパラメトリック）最尤推定値（ＮＰＭＬＥ）を示し、ブートストラップ推定の９５％信頼区間は明るい陰影で示され、表象非一意性は暗い陰影で示される。ｙ軸は推定生存率を示す。両方のｐｇＳＩＴのオスとも、野生型のオスよりも有意に長く生存したが（Ｐ＜２．２^-１６）、２種のｐｇＳＩＴのオスの間には統計的な有意差は見られなかった。ログランク検定でのサンの一般化理論を用いて、生存曲線の差異について検定した。

本開示の実施形態に従って、対照であるｗ-のオスと比較したｄｇＲＮＡ^{ｂＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋のオスの寿命データ（日数での寿命）の表である。

本開示の実施形態に従って、本明細書内に開示されるネッタイシマカ個体群の抑制モデルで用いられる入力パラメータの表である。表中に示される全ての引用文献の内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれている。

本開示の実施形態に従って、ボルバキア系の非互換昆虫技術（ＩＩＴ）（紫色）、優性致死遺伝子を保有する昆虫放出（ＲＩＤＬ）（水色）、およびメス固有のＲＩＤＬ（ｆｓＲＩＤＬ）（赤色）と対比して、本明細書に記載の抑制モデルを用いるネッタイシマカの蚊個体群密度へのｐｇＳＩＴ卵放出のモデル予測効果（濃い青色）を示すグラフである。放出は６か月の期間にわたって週毎に実施され、（野生型の成虫に対する）放出比率は、差込み凡例に示される通りである。モデル予測は、無作為に混合の１０，０００匹のネッタイシマカ個体群のメス成虫でのＭＧＤｒｉｖＥシミュレーションの枠組みの確率論の実行による２０００個の実現値、および図４Ｆの表に記載されているモデルパラメータを用いて計算された。図示のように、ｐｇＳＩＴの放出は、その他の全ての抑制または削減技術より優れていて、最高の特定地域内の個体群を削減できる可能性を示している。

野生型の成虫１匹あたり２００個の卵の放出比でのオスの交尾競争力および寿命短縮に対するｐｇＳＩＴモデル予測の感度を、図４Ｆの表に示されるその他の全てのパラメータを一定に保ちながら評価したグラフを示す。モデル予測を、無作為に混合の１０，０００匹のネッタイシマカ個体群の成虫メスでのＭＧＤｒｉｖＥシミュレーションの枠組みの確率論の実行による２５０個の実現値を用いて計算した。左側のグラフに示すように、本開示の実施形態に従って、野生型の成虫１匹あたり２００個の週毎の卵の放出比で、ｐｇＳＩＴ構築物による寿命短縮を１８％に一定に保つと、ＲＩＤＬのオス成虫の場合のような削減は、２５％のオスの交尾競争力で確実に達成できるが、５％では達成できない。右側のグラフに示すように、本開示の実施形態に従って、野生型の成虫１匹あたり２００個の卵の週毎の放出比で、オスの交尾競争力を７８％に一定に保つと、削減は７５％以下の寿命短縮で確実に達成できる。

本開示の実施形態に従って、（表示のように、寿命短縮およびオスの交尾競争力を同時に変更する）広い範囲でのパラメータ値を示すグラフであり、このグラフでは、特定地域内のネッタイシマカの削減が、野生型の成虫１匹あたりの週毎の卵放出比が２００個である場合に、（濃淡区画のように）確実に達成できることを示している。

野生型の成虫１匹あたり１００個の卵の放出比でのオスの交尾競争力および寿命短縮に対するｐｇＳＩＴモデル予測の感度を、図４Ｆの表に示されるその他の全てのパラメータを一定に保ちながら評価したグラフを示す。左側のグラフに示すように、本開示の実施形態に従って、野生型の成虫１匹あたり１００個の週毎の卵の放出比で、ｐｇＳＩＴ構築物による寿命短縮を１８％に一定に保つと、削減は、５０％のオスの交尾競争力により確実に達成できるが、２５％では達成できない。右側のグラフに示すように、本開示の実施形態に従って、野生型の成虫１匹あたり１００個の卵の週毎の放出比で、オスの交尾競争力を７８％に一定に保つと、削減は５０％以下の寿命短縮で確実に達成できる。

本開示の実施形態に従って、（表示のように、寿命短縮およびオスの交尾競争力を同時に変更する）広い範囲でのパラメータ値を示すグラフであり、このグラフでは、特定地域内のネッタイシマカの削減が、野生型の成虫１匹あたりの週毎の卵放出比が１００個である場合に、（濃淡区画のように）確実に達成できることを示している。

本開示の実施形態に従って、（例えばドローンによる）散布用のｐｇＳＩＴ卵を産み出す米国内（青色地点）に配置される工場を示し、これらの卵は、世界中の遠隔地点（例えば、南アメリカ、アフリカ、およびアジア（ピンク色地点））に放たれる。

生殖不能化昆虫技術（ＳＩＴ）は、野生型の個体群を削減し抑制する環境的に安全で実績のある技術である。本開示の実施形態は、本明細書内で「高精度誘導ＳＩＴ」（ｐｇＳＩＴ）法と呼ばれるＣＲＩＳＰＲベースの技術を使用して、昆虫を遺伝子組換えする方法を含む。本開示全体に詳細に開示するように、ｐｇＳＩＴ法は、昆虫における性別誘導、ならびに性別誘導および生殖不能化の同時発生を可能にする優位な遺伝技術に機構的に依存している。昆虫卵の性別誘導と生殖不能化の同時発生により、卵を自然環境に放ち、確実に生殖不能のオス成虫を発生させることができる。現場での用途では、卵を放出することで、手作業による性別判定および生殖不能化の負担がなくなり、全体的な労力が軽減され、規模の拡大が可能となる。

本開示の実施形態によるｐｇＳＩＴ技術の有効性を実証するために、複数のｐｇＳＩＴシステムを、昆虫の一例としてショウジョウバエで操作しかつ実証した。本明細書内に記載および参照される遺伝的技術および方法は、広範囲の昆虫に応用可能であることが分かっている。

本開示のオスへの性別誘導のｐｇＳＩＴ法、およびオスへの性別誘導かつ生殖不能化のｐｇＳＩＴ法は、ＣＲＩＳＰＲベース技術の高い精度および正確性を用いて、（オスとの交尾のための）メスの生存能力に必須の遺伝子を破壊し、またはメスの生存能力およびオスの生殖能力に不可欠な遺伝子を同時発生的に破壊する。本開示のｐｇＳＩＴ法は、一方がエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）を発現し、他方が破壊される１つ以上の遺伝子を標的とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドを有する核酸配列構築物を発現する２つの昆虫系統（第１の親系統および第２の親系統）を必要とする簡便な繁殖体系を活用する。これらの２つの親系統間での１回の交配により、機構的に、繁殖中に１つ以上の標的遺伝子の同期したポリヌクレオチド誘導（例えばＲＮＡ誘導）優性対立遺伝子ノックアウトまたは優性二対立遺伝子ノックアウトが起こる。

ＣＲＩＳＰＲ技術は、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）」を指し、Sternberg and Doudna, Mol. Cell 58, 568-574 (2015)に開示されるように広く研究されていて、かつ多くの研究生物でのゲノム編集用に改変されており、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。

ＣＲＩＳＰＲベース技術に関して、本明細書で使用される「ガイドポリヌクレオチド」という用語は、対応するエンドヌクレアーゼ酵素タンパク質（例えばＣａｓ９）に結合可能な「合成配列」、およびゲノム標的（例えば標的遺伝子のエクソンに見られるヌクレオチド配列）に結合可能な可変標的配列を有するポリヌクレオチドを指す。本開示の実施形態によっては、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）である。実施形態によっては、ガイドポリヌクレオチドの可変標的配列は、残りのゲノムに対して固有であり、かつプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ、Protospacer Adjacent Motif）に直接に隣接する標的内の任意の配列である。異なるエンドヌクレアーゼは異なるＰＡＭ配列を必要とするので、ＰＡＭ配列の正確な配列を変形させてもよい。本明細書で使用される「２つの異なる一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を有する一本鎖の異種構造構築物」という表現は、二本鎖ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を指す。

ＣＲＩＳＰＲベース技術のエンドヌクレアーゼ酵素タンパク質に関して、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、所定のガイドポリヌクレオチドによって特異的に誘導されてガイドポリヌクレオチドの標的配列を酵素的にノックアウトする任意の適切なエンドヌクレアーゼ酵素タンパク質またはその変異体を指す。エンドヌクレアーゼに関して本明細書で使用される「その変異体」という用語は、エンドヌクレアーゼの酵素活性を増強するために、任意の適切な宿主生物または発現系で、および／または任意の修飾を含んで発現された酵素的に機能する形態の当該エンドヌクレアーゼを指す。

本開示を通して開示される実施例は、少なくとも２つのガイドポリヌクレオチドを用いて、メスの生存能力遺伝子およびオスの生殖能力遺伝子の両方が破壊された生殖不能のオス昆虫の子孫を産み出す方法を示している。ただし当業者には分かるように、オスの性別に誘導する方法には、メスの生存能力に必須の遺伝子が標的にされ、オスの生殖不能性のための遺伝子が標的にされない本開示の方法を含んでいる。例えば、図１Ａに示すように、エンドヌクレアーゼの親昆虫（Ｃａｓ９系統と表示）は、メスに必須の遺伝子とオスの生殖不能遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡ（１つは青色、もう１つは緑色）を持つガイドＲＮＡ親昆虫（ｇＲＮＡ系統）と交配される。ただし、オスの性別に誘導する方法では、ｇＲＮＡ系統は、オスの生殖不能遺伝子を発現するようには遺伝子組換えされない。

本明細書で使用される用語「組み込むこと」、「組み込み」などの用語は、標的昆虫への異種の組換え核酸配列の導入を指す。当業者には分かっているように、昆虫の遺伝子組換えの技術は知られており、例えば、Cockburn et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 2: 68-99, (1984)に説明されていて、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で使用される組み込みは、組換え核酸配列の標的昆虫のゲノムへの組み込みを指す場合がある。標的昆虫のゲノムには、標的昆虫の少なくとも１つの染色体が含まれるが、関連する全ての染色体コピーが含まれてもよい。従って、ゲノムへの組み込みは、ヘテロ接合型であってもよく、ホモ接合型であってもよい。

本明細書で使用される「エンドヌクレアーゼを標的昆虫に導入すること」という用語は、エンドヌクレアーゼが昆虫内に存在するように、エンドヌクレアーゼの昆虫への組換え導入を指す。昆虫へのエンドヌクレアーゼの導入は、ゲノムへの組み込みは必須ではないが、ゲノムへの組み込みを含んでもよい。例えば、エンドヌクレアーゼの導入は、例えば、Lin and Potter, G3, (2016), doi:10.1534/g3. 116.034884に説明されるように、エンドヌクレアーゼを昆虫内に「沈着」させることを含み、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれている。

さらに、本開示の実施例は、最大１００％までの生殖不能のオス子孫を得る方法を含むが、１００％未満の生殖不能のオス子孫を産み出す方法もまた、本開示の範囲内に含まれる。例えば、本開示の実施形態によっては、ガイドポリヌクレオチドを発現する親昆虫系統は、ガイドポリヌクレオチド（一本鎖、二本鎖、または三本鎖以上のガイドポリヌクレオチド）に対してヘテロ接合型であってもよく、ホモ接合型であってもよい。実施形態によっては、ガイドポリヌクレオチドを発現する親昆虫系統は、ガイドポリヌクレオチドに対してホモ接合型であり、それにより全ての子孫がガイドポリヌクレオチドを受け入れることを保証できる。

図２Ａおよび図３Ａに示すように、本開示の別の態様によっては、エンドヌクレアーゼを発現する親昆虫系統がオスである場合に、オスの親はエンドヌクレアーゼに対してヘテロ接合型であってもホモ接合型であってもよく、逆にエンドヌクレアーゼを発現する親昆虫系統がメスである場合に、エンドヌクレアーゼは、メス内に沈着され、ヘテロ接合的にまたはホモ接合的に発現される。

図２Ｆに示すように、両方の親系統がそれらのそれぞれのエンドヌクレアーゼまたはガイドポリヌクレオチドに対してホモ接合型である場合に、全てまたはほぼ全ての子孫は、非メンデル型の完全な浸透率の結果として、エンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドを受け取る。従って、全ての子孫での所望の表現型（例えば、全てのオス昆虫または全ての生殖不能オス昆虫）は、一世代で産生されてもよい。本明細書で使用される「ほぼ全ての子孫」という用語は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の子孫を指す。表３に示すように、本開示の実施形態によっては、子孫の生存能力は、成体期に決定される。

本開示の実施形態によっては、オスの性別を誘導する方法は、第１の親昆虫にエンドヌクレアーゼを導入すること、第２の親昆虫のゲノム（例えば、プラスミドベクター）内に、メスに必須のゲノム配列中のヌクレオチド配列を標的とする少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチド（例えばｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）を持つ少なくとも１つの核酸配列構築物を組み込むこと、および第１の親昆虫と第２の親昆虫を交配させて、全てまたはほぼ全てのオスの子孫を産み出すことを含む。本明細書で使用される「メスに必須のゲノム配列」という用語は、メスの昆虫に固有の任意のゲノム配列または遺伝子を含む。メスに必須のゲノム配列の例として、性別決定遺伝子またはその遺伝子のメス固有のスプライシング変異体、オスには見られない遺伝子またはその遺伝子のスプライシング変異体、メスの生殖腺発達に必須の遺伝子またはその遺伝子のスプライシング変異体、および／またはオスの生存能力に必須ではない遺伝子またはその遺伝子のスプライシング変異体が挙げられる。図１Ｂに示すように、メスに必須のゲノム配列の非限定的な例として、性別決定のショウジョウバエ遺伝子Ｓｘｌ、Ｔｒａ、およびＤｓｘ中のメスに固有のエクソン、それらのホモログ、オルソログ、およびパラログが挙げられる。本明細書で使用される「ホモログ」という用語は、同じ機能を付与する別の生物に見られるある生物での同等の遺伝子を指す。本明細書で使用される「オルソログ」および「パラログ」という用語は、ホモログの類型を指す。オルソログは、異なる系統での対応する遺伝子であり、種分化から生じ、パラログは、遺伝子重複から生じる。

昆虫でのＴＲＡタンパク質またはＴＲＡ／ＴＲＡー２複合体によって媒介される調節および性特異性選択的スプライシングは知られており、PANE et al., Development 129: 3715-3725 (2002)に詳述され、その内容の全体は参照により本明細書内に組み込まれる。Ｄｓｘ遺伝子のオスおよびメスに固有のスプライング産物は知られており、Suzuki et al., Insect Biochem Mol Biol 31: 1201-1211 (2001)、Salvemini et al., BMC Evol. Biol. 11, 41 (2011)、およびScali et al., J. Exp. Biol. 208, 3701-3709 (2005)に詳述され、それら内容の全体は参照により本明細書内に組み込まれる。

本開示の実施形態によっては、オスの性別に誘導する方法は、第１の親昆虫にエンドヌクレアーゼを導入すること、およびＴｒａ遺伝子および／またはＤｓｘ遺伝子、それらのホモログ、オルソログ、またはパラログ中のメスに固有のエクソンから選択されるメスに必須のゲノム配列中のヌクレオチド配列を標的とする少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドを有する少なくとも１つの核酸配列構築物を第２の親昆虫のゲノム内に組み込み、第１の親昆虫と第２の親昆虫を交配させて、全てのまたはほぼ全てのオスの子孫を産み出すことを含む。

本開示の実施形態によっては、生殖不能のオス昆虫卵を産み出す方法は、第１の親昆虫にエンドヌクレアーゼを導入すること、メスに固有の生存能力または成長に必要なメスに必須のゲノム配列を標的とする少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチド、およびオスの生殖能力に必要なオスの生殖不能ゲノム配列を標的とする少なくとも１つの第２のガイドポリヌクレオチドを有する少なくとも１つの核酸配列構築物を第２の親昆虫のゲノム内に組み込むこと、および第１の親昆虫と第２の親昆虫を交配させて、全てのまたはほぼ全ての生殖不能のオスの子孫を産み出すことを含む。本明細書で使用する「オスの生殖不能ゲノム配列」という用語は、オス昆虫の成長またはオス昆虫の生存能力に影響を及ぼさない昆虫でのオスの生殖能力に必要な任意のオスに固有のゲノム配列を指す。昆虫でのオスの生殖能力に必要なオスに固有のゲノム配列の非限定例として、遺伝子βチューブリン８５Ｄ（βＴｕｂ）、ファジーオニオン（Ｆｚｏ）、プロタミンＡ（ＰｒｏｔＡ）、精母細胞停止（Ｓａ）、それらのホモログ、オルソログ、およびパラログが挙げられる。実施形態によっては、核酸配列構築物は、オスの生殖能力に必要な１つ以上のオスに固有のゲノム配列を標的とする１つ以上の第２のガイドポリヌクレオチドを含む。ハマダラカおよびネッタイシマカを含むβチューブリン８５Ｄの機能的保存は、Catteruccia et al., Nat. Biotechnol. 23, 1414-1417 (2005)、およびSmith et al., Insect Mol. Biol. 16, 61-71 (2007)に説明され、それら内容の全体は参照により本明細書内に組み込まれる。

当業者には分かるように、メスの生存能力およびオスの生殖能力に重要な多くの遺伝子を標的としてもよい。破壊されるメス／オスに固有の昆虫遺伝子はさらに、Akbari et al., G3 3, 1493-1509 (2013) and Papa et al., (2016) doi:10.1101/081620に詳述され、それら内容の全体が参照により本明細書内に組み込まれる。

本開示の実施形態によっては、遺伝子組換え昆虫および遺伝子組換え昆虫を産み出す方法は、双翅類、鱗翅類、または鞘翅類からの昆虫を含む。

本開示の実施形態によっては、遺伝子組換え昆虫および遺伝子組換え昆虫を産み出す方法は、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）、オクセロタツス・トリセリタツス（エーデス・トリセリタツス）（Ochlerotatus triseriatus (Aedes triseriatus)）、ステフェンスハマダラカ（Anopheles stephensi）、アルビマヌスハマダラカ（Anopheles albimanus）、ガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae）、クアドリマクラツスハマダラカ（Anopheles quadrimaculatus）、フリーボルニハマダラカ（Anopheles freeborni）、イエカ種（Culex species）、およびクリセタ・メラヌラ（Culiseta melanura）が挙げられる。

さらに、Ｃａｓ９を発現する系統は、ネッタイシマカ、ガンビエハマダラカ、およびステフェンスハマダラカを含む主にデング熱およびマラリア疾病ベクター中で発育されて、それらのそれぞれは、Li et al., (2017) doi:10.1101/156778、Hammond et al., Nat. Biotechnol. 34, 78-83 (2016)、およびGantz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-43 (2015)に説明されており、それら内容の全体は参照により本明細書内に組み込まれる。

実施形態によっては、遺伝子組換え昆虫および遺伝子組換え昆虫を産み出す方法は、チチュウカイミバエ（Ceratitis capitata）、メキシコミバエ（Anastrepha ludens）、ミカンコミバエ（Bactrocera dorsalis）、オリーブミバエ（Bactrocera oleae）、メロンバエ（Bactrocera oleae）、ナタールミバエ（Ceratitis rosa）、チェリーミバエ（Rhagoletis cerasi）、クイーンズランドミバエ（Bactrocera tyroni）、ピーチミバエ（Bactrocera zonata）、カリブ海ミバエ（Anastrepha suspensa）、ミカンコミバエ（Bactrocera dorsalis）、および西インドミバエ（Anastrepha obliqua）から選択されるミバエ、新世界ラセン虫（Cochliomyia hominivorax）、旧世界ラセン虫（Chrysomya bezziana）、オーストラリア羊クロバエ／銅緑色クロバエ（Lucilia cuprina）、ピンクガ幼虫（Pectinophora gossypiella）、ヨーロッパジプシーガ（Lymantria dispar）、ネーブルオレンジ虫（Amyelois transitella）、ピーチ枝穿孔虫（Anarsia lineatella）、イネ茎穿孔虫（Tryporyza incertulas）、ヤガ、タバコガ（Heliothinae）、マメコガネムシ（Papilla japonica）、シロコガネムシ（Graphognatus spp.）、ワタミハナゾウムシ（Anthonomous grandis）、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）、ツルコナカイガラムシ（Planococcus ficus）、アジア柑橘類キジラミ（diaphorina citri）、斑点翼ショウジョウバエ（drosophila suzukii）、青緑色シャープシューター（Homalodisca vitripennis）、ガラス翼シャープシューター（Homalodisca vitripennis）、薄褐色リンゴガ（Halyomorpha halys）、バグラダ虫（Bagrada hilaris）、褐色マーモットカメムシ（Halyomorpha halys）、Lymantria dispar asiatica、Lymantria dispar japonica、Lymantria albescens、Lymantria umbrosaおよびLymantria postalbaの群から選択されるアジアジプシーガ、アジアカミキリムシ（Anoplophora glabripennis）、ココナッツカブトムシ（Oryctes rhinoceros）、エメラルドアッシュ穿孔虫（Agrilus planipennis）、欧州ブドウツルガ（lobesia botrana）、欧州ジプシーガ（Lymantria dispar）、偽コドリンガ（Thaumatotibia leucotreta）、Solenopsis invicta BurenおよびS. richteri Forelから選択されるアカヒアリ、旧世界ガ幼虫（Helicoverpa armigera）、斑点ランタンバエ（Lycorma delicatula）、アフリカミツバチ（apis mellifera scutellata）、フルーツシュート穿孔虫（leucinodes orbonalis）、コーンルート虫（Diabrotica spp.）、ウエスタンコーンルート虫（diabrotica virgifera）、コナジラミ（bemisia tabaci）、イエバエ（Musca Domestica）、グリーンボトルバエ（Lucilia cuprina）、カイコガ（Bombyx mori）、レッドスケール（Aonidiella aurantia）、イヌ糸状虫（Dirofilaria immitis）、サザンパイン甲虫（Dendroctonus frontalis）、アボカドアザミウマ（Thysanoptera Spp.）、Oestridae spp.およびDermatobia hominisから選択されるウシバエ、ウマバエ（Tabanus sulcifrons）、ツノサシバエ（Haematobia irritans）、Cochliomyia macellaria (C. macellaria)、C. hominivorax、C. aldrichiまたはC. minimaから選択されるラセン虫バエ、ツェツェバエ(Glossina spp.)、Hypoderma bovisまたはHypoderma lineatumから選択されるワーブルバエ、斑点ランタンバエ（Lycorma delicatula）、カプラカブトムシ（Trogoderma granarium）、ミツバチダニ（Varroa destructor）、シロアリ（Coptotermes formosanus）、ヘムロックウーリーアブラムシ（Adelges tsugae）、クルミ枝カブトムシ（Pityophthorus juglandis）、ヨーロッパスズメバチ（Sirex noctilio）、ピンク斑点ガ幼虫（pectinophora scutigera）、二斑点クモダニ（Tertanychus urticae）、コナガ（plutella xylostella）、タロウ毛虫（spodoptera litura）、コクヌストモドキ（tribolium castaneum）、緑桃アブラムシ（Myzus persicae）、ワタアブラムシ（aphis gossypii）、ブラウンウンカ（nilaparvata lugens）、ビートアワヨトウ（spodotera exigua）、西洋アザミウマ（frankliniella occidentalis）、コドリンガ（cydia pomonella）、ヨツモンマメゾウムシ（callosobruchus maculatus）、エンドウマメアブラムシ（acyrthosiphon pisum）、トマト葉モグリ虫（tuta absoluta）、タマネギアザミウマ（thrips tabaci）、およびワタガ幼虫（Helicoverpa armigera）のうちの１つから選択される任意の昆虫を含む。

本開示の実施形態によっては、適切なエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連配列９（Ｃａｓ９）エンドヌクレアーゼまたはその変異体、ＣＲＩＳＰＲ関連配列１３（Ｃａｓ１３）エンドヌクレアーゼまたはその変異体、ＣＲＩＳＰＲ関連配列６（Ｃａｓ６）エンドヌクレアーゼまたはその変異体、プレボテラ属（Prevotella）およびフランシセラ属（Francisella）１からのＣＲＩＳＰＲ（Ｃｐｆ１）エンドヌクレアーゼまたはその変異体、またはミクロゲノマーツ属（Microgenomates）およびスミセラ属（Smithella）１からのＣＲＩＳＰＲ（Ｃｍｓ１）エンドヌクレアーゼまたはその変異体を含む。

本開示の実施形態によっては、適切なエンドヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、フランシセラ・ノビシダ菌Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、またはそれらの変異体を含む。変異体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）ＳｐＣａｓ９（ｘＣａｓ９）、高忠実度ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９-ＨＦ１）、高忠実度ＳａＣａｓ９、または高忠実度ＦｎＣａｓ９を含んでもよい。

本開示の他の実施形態によっては、エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩヌクレアーゼまたはその変異体と融合したＣａｓ９タンパク質またはその変異体を含むＣａｓ融合ヌクレアーゼを含む。この融合ヌクレアーゼのＣａｓ９タンパク質の変異体には、触媒として不活性なＣａｓ９（例えば、死滅Ｃａｓ９）が含まれる。

本開示の実施形態によっては、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ６、Ｃｐｆ１、Ｃｍｓ１タンパク質、またはそれらの任意の変異体であってもよい。これら変異体は、メタノコッカス・マリパルディスＣ７（Methanococcus maripaludis C7）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheria）、コリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ-３１４（Corynebacterium efficiens YS-314）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ１３０３２）（Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032)）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ１３０３２）（Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032)）、コリネバクテリウム・グルタミクムＲ（Corynebacterium glutamicum R）、コリネバクテリウム・クロッペンシュテッティ（ＤＳＭ４４３８５）（Corynebacterium kroppenstedtii (DSM 44385)）、マイコバクテリウム・アブセサス（ＡＴＣＣ１９９７７）（Mycobacterium abscessus (ATCC 19977)）、ノカルディア・ファルシニカＩＦＭ１０１５２（Nocardia farcinica IFM10152）、ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４（Rhodococcus erythropolis PR4）、ロドコッカス・ジョスティＲＨＡ１（Rhodococcus jostii RHA1）、ロドコッカス・オパクスＢ４（ｕｉｄ３６５７３）（Rhodococcus opacus B4 (uid36573)）、アシドテルムス・セルロリチクス１１Ｂ（Acidothermus cellulolyticus 11B）、アントロバクテル・クロロフェノリクスＡ６（Arthrobacter chlorophenolicus A6）、クリベラ・フラビダ（ＤＳＭ１７８３６、ｕｉｄ４３４６５）（Kribbella flavida (DSM 17836, uid43465)）、テルモモノスポラ・クルバータ（ＤＳＭ４３１８３）（Thermomonospora curvata (DSM43183)）、ビフィドバクテリウム・デンチウムＢｄ１（Bifidobacterium dentium Bd1）、ビフィドバクテリウム・ロングムＤＪＯ１０Ａ（Bifidobacterium longum DJO10A）、スラキア・ヘリオトリニレズセンス（ＤＳＭ２０４７６）（Slackia heliotrinireducens (DSM 20476)）、ペルセフォネーラ・マリーナＥＸＨ１（Persephonella marina EX H1）、バクテロイデス・フラギリスＮＣＴＣ９４３４（Bacteroides fragilis NCTC 9434）、カプノサイトファガ・オクラセア（ＤＳＭ７２７１）（Capnocytophaga ochracea (DSM 7271)）、フラボバクテリウム・サイクロフィルムＪＩＰ０２８６（Flavobacterium psychrophilum JIP02 86）、アッケマンシア・ムシニフィラ（ＡＴＣＣＢＡＡ８３５）（Akkermansia muciniphila (ATCC BAA 835)）、ロゼイフレクサス・カステンホルジイイ（ＤＳＭ１３９４１）（Roseiflexus castenholzii (DSM 13941)）、ロゼイフレクサスＲＳ１（Roseiflexus RS1）、シネコシスティスＰＣＣ６８０３（Synechocystis PCC6803）、エルスミクロビウム・ミヌツムＰｅｉ１９１（Elusimicrobium minutum Pei191）、未培養テルマイト第１族細菌系統型ＲｓＤ１７（uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs D17）、フィブロバクター・スクシノゲネスＳ８５（Fibrobacter succinogenes S85）、バチルス・セレウス（ＡＴＣＣ１０９８７）（Fibrobacter succinogenes S85）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（Lactobacillus rhamnosus GG）、ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８（Lactobacillus salivarius UCC118）、ストレプトコッカス・アガラクチア-５-Ａ９０９（Streptococcus agalactiae-5-A909）、ストレプトコッカス・アガラクチアＮＥＭ３１６（Streptococcus agalactiae NEM316）、ストレプトコッカス・アガラクチア２６０３（Streptococcus agalactiae 2603）、ストレプトコッカス・ジスアガラクチア・エクイシミリスＧＧＳ１２４（Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124）、ストレプトコッカス・エクイ・ズーエピデミクスＭＧＣＳ１０５６５（Streptococcus equi zooepidemicus MGCS10565）、ストレプトコッカス・ガロリティクスＵＣＮ３４（ｕｉｄ４６０６１）（Streptococcus gallolyticus UCN34 (uid46061)）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ・チャリス・サブストＣＨ１（Streptococcus gordonii Challis subst CH1）、ストレプトコッカス・ミュータンスＮＮ２０２５（ｕｉｄ４６３５３）（Streptococcus mutans NN2025 (uid46353)）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭ１ＧＡＳ（Streptococcus pyogenes M1 GAS）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ５００５（Streptococcus pyogenes MGAS5005）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ２０９６（Streptococcus pyogenes MGAS2096）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ９４２９（Streptococcus pyogenes MGAS9429）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０２７０（Streptococcus pyogenes MGAS10270）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ６１８０（Streptococcus pyogenes MGAS6180）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ３１５（Streptococcus pyogenes MGAS315）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＳＩ―１（Streptococcus pyogenes SSI-1）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０７５０（Streptococcus pyogenes MGAS10750）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＮＺ１３１（Streptococcus pyogenes NZ131）、ストレプトコッカス・テルモフィルスＣＮＲＺ１０６６（Streptococcus thermophiles CNRZ1066）、ストレプトコッカス・テルモフィルスＬＭＤ―９（Streptococcus thermophiles LMD-9）、ストレプトコッカス・テルモフィルスＬＭＧ１８３１１（Streptococcus thermophiles LMG 18311）、クロストリジウム・ボツリヌムＡ３ロッホ・マレー（Clostridium botulinum A3 Loch Maree）、クロストリジウム・ボツリヌムＢエクルンド１７Ｂ（Clostridium botulinum B Eklund 17B）、クロストリジウム・ボツリヌムＢａ４６５７（Clostridium botulinum Ba4 657）、クロストリジウム・ボツリヌムＦランゲランド（Clostridium botulinum F Langeland）、クロストリジウム・セルロリチクムＨ１０（Clostridium cellulolyticum H10）、フィネゴルディア・マグナ（ＡＴＣＣ２９３２８）（Finegoldia magna (ATCC 29328)）、ユウバクテリウム・レクターレ（ＡＴＣＣ３３６５６）（Eubacterium rectale (ATCC 33656)）、マイコプラズマ・ガリセプチクム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・モバイル１６３Ｋ（Mycoplasma mobile 163K）、マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）、マイコプラズマ・シノビエ５３（Mycoplasma synoviae 53）、ストレプトバシルス・モリニフオルミス（ＤＳＭ１２１１２）（Streptobacillus moniliformis (DSM 12112)）、ブラディリゾビウムＢＴＡｉ１（Bradyrhizobium BTAi1）、ニトロバクテル・ハンブルジェンシスＸ１４（Nitrobacter hamburgensis X14）、ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ１８（Rhodopseudomonas palustris BisB18）、ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ５（Rhodopseudomonas palustris BisB5）、パルビバクラム・ラバメンチボランスＤＳ―１（Parvibaculum lavamentivorans DS-1）、ディノロセオバクター・シベＤＦＬ１２（Dinoroseobacter shibae. DFL 12）、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ５ＦＡＰＥＲＪ（Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ）、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ５ＪＧＩ（Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI）、アゾスピリルムＢ５１０（ｕｉｄ４６０８５）（Azospirillum B510 (uid46085)）、ロドスピリルム・ルブルム（ＡＴＣＣ１１１７０）（Rhodospirillum rubrum (ATCC 11170)）、ディアフォロバクターＴＰＳＹ（ｕｉｄ２９９７５）（Diaphorobacter TPSY (uid29975)）、ベルミネフロバクター・エイセンニエＥＦ０１―２（Verminephrobacter eiseniae EF01-2）、ナイセリア・メニンジチデス０５３４４２（Neisseria meningitides 053442）、ナイセリア・メニンジチデスα１４（Neisseria meningitides alpha14）、ナイセリア・メニンジチデスＺ２４９１（Neisseria meningitides Z2491）、デスルフォビブリオ・サレキシジェンスＤＳＭ２６３８（Desulfovibrio salexigens DSM 2638）、カンピロバクター・ジェジュニ・ドイレイ２６９９７（Campylobacter jejuni doylei 269 97）、カンピロバクター・ジェジュニ８１１１６（Campylobacter jejuni 81116）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・ラリＲＭ２１００（Campylobacter lari RM2100）、ヘリコバクター・ヘパティクス（Helicobacter hepaticus）、ウォリネーラ・スクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、トルモナス・アウエンシスＤＳＭ９１８７（Tolumonas auensis DSM 9187）、シュードアルテロモナス・アトランチカＴ６ｃ（Pseudoalteromonas atlantica T6c）、シェワネラ・ペアレアナ（ＡＴＣＣ７００３４５）（Shewanella pealeana (ATCC 700345)）、レジオネラ・ニューモフィラ・パリス（Legionella pneumophila Paris）、アクチノバシラス・スクシノゲネス１３０Ｚ（Actinobacillus succinogenes 130Z）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、フランシセラ・ツラレンシス・ノビシダＵ１１２（Francisella tularensis novicida U112）、フランシセラ・ツラレンシス・ホラルクチカ（Francisella tularensis holarctica）、フランシセラ・ツラレンシスＦＳＣ１９８（Francisella tularensis FSC 198）、フランシセラ・ツラレンシス・ツラレンシス（Francisella tularensis tularensis）、フランシセラ・ツラレンシスＷＹ９６―３４１８（Francisella tularensis WY96-3418）、またはトレポネーマ・デンチコラ（ＡＴＣＣ３５４０５）（Treponema denticola (ATCC 35405)）に由来し、それらから発現する。

図４Ａ〜図４Ｃに示すように、本開示の実施形態によるｐｇＳＩＴ法を用いて産み出される生殖不能のオスの交尾競争力とは、これら生殖不能のオスが旨く交尾でき、かつ野生のメスとの交尾に旨く競争できることを示している。さらに、図４Ｄ〜図４Ｅに示すとおり、本開示の実施形態によるｐｇＳＩＴ法を用いて産み出される生殖不能のオスの寿命から、これらの生殖不能のオスは、対応する野生型のオスよりも長くなくとも、少なくとも同じ長さの（総日数での）寿命を持つことが分かった。初期に抑制または削減が達成されれば、幼虫への資源は豊富となり、従って放たれた未成熟な形態での消費が大きくなるほど影響は小さくなるので、これら交尾競争力および寿命が、特定地域内での削減の達成にとって主要な因子となる。孵化する幼虫は、他の方法では生殖能力のある幼虫が利用可能な資源を消費するので、卵の放出により、開始時点から急速な個体数が抑制または低減される。さらに、本開示の実施形態によるｐｇＳＩＴの生殖不能オスの卵は、野生に放たれると幼虫に孵化し、メスの致死が胚／幼虫段階で起こるにつれて、放たれた未成熟な形態により幼虫資源の最大の消費をもたらす可能性がある。

さらに、本明細書に開示されるｐｇＳＩＴ法は、放たれた生殖不能のオスの適合性および交尾競争力を著しく損なう可能性がある染色体転座、化学不妊剤、照射、抗生物質、または細菌感染には依存していない。

図４Ｆ〜図４Ｋには、本明細書の実施例５に説明されるＭＧＤｒｉｖＥシミュレーションの枠組みを使用して、ｐｇＳＩＴオス生殖不能卵の野生成虫１匹あたり２００個の週毎の模擬的な放出での特定地域のネッタイシマカの削減が確実に達成される広範囲のパラメータ値を示している。

図５に示すように、疾患ベクターおよび農業害虫を含む昆虫種の昆虫個体群を抑制または削減する方法は、本開示のｐｇＳＩＴ法を使用して産み出されたオス生殖不能卵を、目的の昆虫の抑制または削減を必要とする地域内に導入することを含む。

本開示のいくつかの実施形態は、ホモ接合型エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）系統およびｄｇＲＮＡ発現系統を別々に増殖させる育成施設の開発を含む。実施形態によっては、自動化されたワークフローは、未成熟段階で性別分類し（例えば、ｄｇＲＮＡオスよりＣａｓ９メスを選別し）、卵の成熟、交配および繁殖のための容器内に組み込むように実行される。性別分類は、機械的なサイズ分離、遺伝的性別系統を組み合わせた自動化ｃｏｐａｓ性別分類プラットフォーム（Union Biometrica社製）、または自動化ロボットによる光学的分類などの適切な方法で達成できる。性別分類の適切な方法は、Papathanos et al., Transgenic insects: techniques and applications 83-100, (October, 2014) およびGilles et al., Acta Trop. 132, S178-S187 (2014)に詳述され、その両方の内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。

実施形態によっては、生殖不能のオス卵を産み出すｐｇＳＩＴ法は、卵の段階に休眠する昆虫種に対し特に効果的である。卵の段階に休眠する昆虫には、例えば、ネッタイシマカおよびヒトスジシマカが挙げられ、これらはDiniz et al., Parasit. Vectors 10, 310 (2017)に説明され、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。この休眠は、圧倒的な量の放出に向けて大規模な卵の蓄積を可能にする。従って、図５に概略を示すように、１個所の効率的なｐｇＳＩＴ卵の産卵施設から、ｐｇＳＩＴ卵を世界中の多くの離れた現場位置に配布でき、そこではそれら卵を、容易に孵化し、飼育し、かつ放つことができ、手作業による性別分類、生殖不能化、およびそれぞれの現場への虚弱なオス成虫の放出のための多くの負担を排除または軽減し、それによって拡張性と効率を高めて、より広範で大規模な個体数の抑止能力または削減能力を達成できる。

以下の実施例は、例示目的としてのみ提示され、本出願の範囲または内容を限定するものではない。

実施例１：２元ＣＲＩＳＰＲ誘発によるメスのオス化／致死化、またはオスの生殖不能化。
ｐｇＳＩＴを設計するために、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびｓｐＣａｓ９（今後Ｃａｓ９と呼ぶ）を発現する系統を、ショウジョウバエ中に産み出した。合計で９個のホモ接合型ｓｇＲＮＡ系統を、メスの生存能力に必須の遺伝子、またはオスの生殖能力に重要な遺伝子を標的とするように育成した。メスの生存能力では、これらの遺伝子には、図１Ｂ〜図１Ｃに示すような性致死遺伝子（Ｓｘｌ、２つの個別の遺伝子導入系統；ｓｇＲＮＡ^Ｓｘｌ、ｓｇＲＮＡ^{Ｓｘｌ-Ｂ}）、性転換遺伝子（ｔｒａ、２つの個別の系統；ｓｇＲＮＡ^Ｔｒａ、ｓｇＲＮＡ^{Ｔｒａ-Ｂ}）、または両性遺伝子（ｄｓｘＦ、ｓｇＲＮＡ^ＤｓｘＦ）を含む選択的スプライシングした性別に固有の性別決定遺伝子を含み、これらの遺伝子は、Slee and Bownes, Q. Rev. Biol. 65, 175-204 (1990)、Bell et al., Cell 65, 229-239 (1991)、Boggs et al., Cell 50, 739-747 (1987)、およびBurtis and Baker, Cell 56, 997-1010 (1989)に説明され、これらの内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。オスの生殖能力を破壊するには、図１Ｃに示すようなβチューブリン８５Ｄ（βＴｕｂ、ｓｇＲＮＡ^βＴｕｂ）、ファジーオニオン（ｆｚｏ、ｓｇＲＮＡ^Ｆｚｏ）、プロタミンＡ（ＰｒｏｔＡ、ｓｇＲＮＡ^{ＰｒｏｔＡ}）、または精母細胞停止（ｓａ、ｓｇＲＮＡ^Ｓａ）などの精子形成中に活性な遺伝子を標的とし、これらの遺伝子は、Kemphues et al., Cell 21, 445-451 (1980)、Hales and Fuller, Cell 90, 121-129 (1997)、Kanippayoor et al., Spermatogenesis 3, e24376 (2013)、およびLim et al., Spermatogenesis 2, 158-166 (2012)に説明され、これら内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。堅牢なＣａｓ９発現を促進するために、２つの強力な優性生殖細胞系列特異的プロモーターの制御下にある、Sano et al., Mech. Dev. 112, 129-139 (2002)およびDoren et al., Curr. Biol. 8, 243-246 (1998)に記載されているｎａｎｏｓ（ｎｏｓ-Ｃａｓ９）またはｖａｓａ（ｖａｓ-Ｃａｓ９）を含む、３種のホモ接合型Ｃａｓ９発現系統が確立され、その両方の文献の内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。さらに、Akbari et al., BMC Cell Biol. 10, 8 (2009)に説明され、図１Ｄに示されるユビキタスプロモーターであるユビキチン６３Ｅ（Ｕｂｉ-Ｃａｓ９）（https://paperpile.com/c/cKXxhc/zEwAO）は、ほぼ全ての生命成長段階で体細胞組織と生殖細胞組織の両方に堅牢な発現を可能にすることが確立された。自己開裂型Ｔ２ＡペプチドおよびｅＧＦＰコード配列は、プロモーター駆動のＣａｓ９の下流（３’）に挿入されるとともに、図１Ｃ〜図１Ｄのに示すようにプロモーター活性の視覚的指標として機能し、これらはLi et al., (2017). doi:10.1101/156778に説明され、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。

ｓｇＲＮＡ系統の遺伝的活性を評価するために、それぞれの系統をｎｏｓ-Ｃａｓ９と交配し、得られたトランスヘテロ接合型Ｆ_１子孫を解析した。これらの交配から、ｓｇＲＮＡ^Ｓｘｌ、ｓｇＲＮＡ^Ｔｒａ、ｓｇＲＮＡ^ＤｓｘＦ、ｓｇＲＮＡ^βＴｕｂを含む９個のうちの４個のｓｇＲＮＡは予測される表現型を示したので、さらに詳細に解析した。これら４つのｓｇＲＮＡをさらに評価するために、図１Ｆに示すように、これら選択した４つの系統のそれぞれを野生型ｗｔ（１０匹の♀と１０匹の♂の間の交配の複製数、Ｎ＝２４；子孫数、ｎ＝３５１９）と、またはホモ接合型ｎｏｓ-Ｃａｓ９（Ｎ＝２８、ｎ＝３６２８）とを双方向で交配した。図１Ｅ〜図１Ｆに示すように、野生型との交配では、有意な性別比率偏差や生殖能力の低下は発生しなかった（Ｎ＝３０、ｎ＝４３７１）。図１Ｅ〜図１Ｆを引き続き参照すると、ｎｏｓ-Ｃａｓ９が母方または父方から継承されたかどうかには関係なく、ｓｇＲＮＡ^Ｓｘｌを継承する全てのＦ_１トランスヘテロ接合体は１００％がオス（Ｎ＝７、ｎ＝５４０）であり、ｓｇＲＮＡ^ＴｒａまたはｓｇＲＮＡ^ＤｓｘＦを継承するトランスヘテロ接合型のメスの１００％は、産卵できない生殖不能のオス化した間性に変換され（Ｎ＝１４、ｎ＝９４２）、またｓｇＲＮＡ^βＴｕｂのトランスヘテロ接合型のオスの１００％は生殖不能であった（Ｎ＝７、ｎ＝５１７）。これらの表現型は、標的遺伝子座で分子的に調査され、配列決定された全てのハエ（ｎ＝１６）は、図１Ｇに示すように、標的遺伝子座にモザイク型の挿入／欠失（インデル）を有していた。

実施例２：最大１００％の生殖不能のオス個体群の形成。
本開示の実施形態によっては、開示のｐｇＳＩＴ法を用いて、メスの生存性および／またはオスの生殖不能性に必須の遺伝子を破壊できる。実施形態によっては、開示のｐｇＳＩＴ法を用いて、メスの生存性およびオス生殖不能性に必須の遺伝子を同時発生的に破壊し、生き延びるＦ_１子孫の大多数または全て（最大１００％）を生殖不能なオスに遺伝的に誘導できる。この誘導された性別決定および生殖不能性を達成するために、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}、およびｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、ＤｓｘＦ}を含む多重化された二本鎖ｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）の組合わせを発現する３種のさらなるホモ接合型系統が、図１Ｃに示すように生成された。これらｐｇＳＩＴ系統の活性を遺伝的に評価するために、それぞれの系統を、野生型または（ｎｏｓ-Ｃａｓ９、ｖａｓ-Ｃａｓ９、またはＵｂｉ-Ｃａｓ９のいずれかの）ホモ接合型Ｃａｓ９と双方向で交配した。図２Ａ〜図２Ｂに示すように、野生型との交配では、有意な性別偏差または生殖能力の低下は発生しなかった（Ｎ＝３６、ｎ＝５７４７）。図２Ｂに引き続き示すように、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}とそれぞれのＣａｓ９系統との交配は、ｓｘｌの破壊による１００％のメスの致死性、加えてβＴｕｂの同時発生的な破壊による１００％のオスの生殖不能性をもたらした（Ｎ＝２４、ｎ＝２５２１）。また、それぞれのＣａｓ９系統とｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}（Ｎ＝２４、ｎ＝１６９７）またはｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、ＤｓｘＦ}（Ｎ＝２４、ｎ＝１７９１）との間の交配からの１００％のメスは、ｔｒａまたはｄｓｘのいずれかの同時発生的な破壊により、生殖不能な間性にオス化され、１００％のオス子孫は、βＴｕｂの同時発生的な破壊により生殖不能となった（Ｎ＝４８、ｎ＝４２３１）。従って、図２Ａ〜図２Ｃに示すように、本開示のｐｇＳＩＴ法は、ｄｇＲＮＡによって飽和されない非常に活性なＣａｓ９ーｇＲＮＡ複合体を提供し、再現性が良く先例のない効率により最大１００％の生殖不能のオス成虫の子孫を産み出す。

図２Ａ〜図２Ｃの交配のＦ_１子孫の表現型解析に関して、図２Ｄ〜図２Ｅに示すように、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}ノックアウトの１００％のメスは、成虫前の段階で死滅し、大多数は蛹への移行中に死滅した。間性の表現型については、生殖能力は常に損傷されていたが、図２Ｃおよび図２Ｆに示すように、解剖学的にオス化の程度が個体間で異なるように表現形態の変化が観察され、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、ＤｓｘＦ}と比較してｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}ノックアウトではよりその変化が顕著であった。例えば図２Ｆおよび図２Ｈに示すように、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}ノックアウトの間性では、剛毛数が異なる性櫛を有し、稀に複数の原始的な卵巣が生育していた。また図２Ｉに示すように、分子的にｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}ノックアウトの間性は、おそらくｄｓｘ遺伝子のオスに固有の選択的スプライシングを抑制し、かつメスに固有の選択的スプライシングを促進するのに重要であるＴｒａ遺伝子が存在しないことにより、ｄｓｘ遺伝子のメスおよびオスに固有の選択的スプライシング変異体の両方を発現し、これらは、Nagoshi et al., Cell 53, 229-236 (1988)に説明され、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。逆に、図２Ｃ、図２Ｆ、および図２Ｊに示すように、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、ＤｓｘＦ}ノックアウトの間性では、性櫛の発達は観察されず、一部の間性では、妊娠が可能となる正常な卵巣があったが、産卵は不可能であった。

オスの生殖不能表現型を解析するために、Ｆ_１生殖不能のオスでの精巣および発達中の精子細胞の解剖構造は、図１Ｃに示される精巣および精子がｄｇＲＮＡ系統により遺伝子移入されたことを蛍光標識するように、βＴｕｂ８５Ｄプロモーター（βＴｕｂ-ＧＦＰ）からの制御下でｅＧＦＰを発現する発生遺伝子導入系統を用いて視覚化された。図２Ｋに示すように、ホモ接合型のｎｏｓ-Ｃａｓ９が導入された場合に、トランスヘテロ接合型のｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；βＴｕｂ-ＧＦＰ／ｎｏｓ-Ｃａｓ９のＦ_１生殖不能のオスは、完全に発達したコイル状精巣（ｔｓ）および付属腺（ａｇ）を示した。しかしながら、これらＦ_１生殖不能のオスでの精子細胞の発達は、過去のβＴｕｂの破壊の報告に一致する表現型により完全に破壊され、この報告は、Kemphues et al., Cell 21, 445-451 (1980)に説明され、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。例えば図２Ｌに示すように、丸い嚢胞および初期精母細胞のみが、ＧＦＰにより標識された生殖不能オスの精巣（ｔｓ）内に確認されるが、図２Ｍに示すように、野生型の精巣（ｔｓ）には、ＧＦＰにより標識された細長い成熟精子細胞を伴う嚢胞が存在した。図２Ｆに示すように、ＧＦＰによる陽性精巣は、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}またはｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、ＤｓｘＦ}ノックアウトの間性（ｎ＞２０）のいずれにも確認されなかったが、図２Ｈ、図２Ｊ、および図２Ｋに示すように、推定上は対になったオス付属腺様の臓器が、間性の両方の型に存在していた。ノックアウト表現型をもたらした分子の変化を確認するために、個々のＦ_１ハエからの両方の標的遺伝子座の配列決定が実施された。図１Ｇおよび図２Ｎ〜図２Ｑに示すように、対照のハエ（ｎ＝３２）に比較して、試験したそれぞれ二本鎖ノックアウトのハエ（ｎ＝２０）は、ＰＣＲアンプリコンの両端間を貫通する配列決定を妨げる切断部位に正確にモザイク型のインデルを持っていた。

実施例３：接合子発現に起因する完全な浸透。
育成中の胚への母方のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の沈着は、これら子孫が編集成分をコードする遺伝子を遺伝的に継承していない場合でも、受け取る子孫での突然変異の非メンデル的遺伝を確実にするために十分である。この現象は、優性母性効果として知られていて、Lin and Potter, G3 (2016) doi:10.1534/g3.116.034884に説明され、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。この点について、互換性のある成分の母体沈着と組み合わせたコア成分（例えばＣａｓ９またはｄｇＲＮＡ）のうちの１つの父方の継承を、いずれが遺伝的変異を生成するのに十分であるかを決定するために調査した。図１Ｇおよび図３Ｂに示すように、ホモ接合型のＣａｓ９の父親とヘテロ接合型のｄｇＲＮＡを発現する母親との交配は、遺伝子としてｄｇＲＮＡを継承しないＦ_１子孫では、突然変異（ｎ＝１２）またはノックアウト表現型（Ｎ＝６、ｎ＝２５２）を誘発するには十分ではなかった。特定のメカニズムまたは理論に拘束されることなく、この結果は、母体沈着中にＣａｓ９が存在しない場合にはｄｇＲＮＡの半減期が短くなることが原因となる可能性がある。図３Ａおよび図３Ｃに示すように、ヘテロ接合型のＣａｓ９の父親とホモ接合型のｄｇＲＮＡを発現する母親の交配により、Ｃａｓ９遺伝子（Ｎ＝２７、ｎ＝２１９１）を継承した全てのトランスヘテロ接合型のＦ_１子孫では、オス生殖不能性の表現型およびメスの致死性／オス化の表現型がもたらされたが、ｄｇＲＮＡをコードする遺伝子のみを継承した全てのＦ_１子孫は、通常の特徴を保持していた（Ｎ＝２７、ｎ＝２６４０）。図３Ａおよび図３Ｃに引き続き示すように、ヘテロ接合型のＣａｓ９の母親とホモ接合型のｄｇＲＮＡを発現する父親との交配により、全てのトランスヘテロ接合型のＦ_１子孫（Ｎ＝３６、ｎ＝３０１９）では、オス生殖不能性の表現型およびメスの致死性／オス化の表現型がもたらされた。さらに図３Ａに示すように、Ｃａｓ９タンパク質の母方の寄与は、ｔｒａまたはｄｓｘ（Ｎ＝２４、ｎ＝７８２）を標的とする場合には、Ｃａｓ９遺伝子を継承しなかった子孫で間性の表現型を誘発するのに十分であり、優性母性効果を示した。しかしながら、図３Ａ〜図３Ｂに示すように、ｎｏｓ-Ｃａｓ９またはｖａｓ-Ｃａｓ９（Ｎ＝８、ｎ＝５５６）ではなくＵｂｉ-Ｃａｓ９（Ｎ＝４；ｎ＝０、生き延びるメスの数）のみによるＣａｓ９の母方の寄与により、プロモーターの強度が変異効率に影響を与える可能性があることを示すｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；＋／＋メスの致死性が誘発された。図１Ｇおよび図３Ｂに示すように、ｎｏｓ-Ｃａｓ９から母方に仕込まれたＣａｓ９タンパク質を継承し、かつｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}遺伝子を継承するメスの致死性表現型が欠如しているにもかかわらず、これら生き延びるメスには、Ｓｘｌ遺伝子座（ｎ＝２）にモザイク型のインデルが存在していた。同様に、図１Ｇおよび図３Ａ〜図３Ｂに示すように、ｄｇＲＮＡ遺伝子（Ｎ＝３６、ｎ＝１４９０）のみを継承し、かつ母方に仕込んだＣａｓ９タンパク質を持つ全てのオスの子孫は、表示の全てのＣａｓ９系統で生殖能力があったが、各遺伝子型のオス（ｎ＝６）にはβＴｕｂ遺伝子座にモザイク型のインデルが存在していた。本開示の実施形態によっては、図３Ｄに示されるように、遺伝子として継承されるＣａｓ９の不在下で、発育中の胚へのエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）の母体沈着を伴う父方のガイドポリヌクレオチド（ｇＲＮＡなど）の遺伝性は、検出可能な二対立遺伝子モザイク現象を誘発するのに十分である。

実施例４：ｐｇＳＩＴのオスは、性的に交尾競争をし、その生存率は低下しない。
図４Ａに示すように、メス固有の生存性と精子細胞の成熟に必要な一本鎖遺伝子の精度の高いノックアウトを有するｐｇＳＩＴオス全体の交尾適合性を評価するために、交尾競争分析を実施して、予測生存曲線を計算した。図４Ｂ〜図４Ｃに示すように、ｐｇＳＩＴで産まれたオスは、求愛、交尾、および野生型オスとの競争に成功した。図４Ｂ〜図４Ｃに引き続き示すように、卵の孵化率について、２匹の野生型オス（Ｎ＝５、Ｐ＞０．００３）での８５．１％±１３．５％、または１匹の野生型オス（Ｎ＝５、Ｐ＞０．００１）での８７．６％±７．２％に対して、１匹のｐｇＳＩＴオスと１匹の野生型オスの混在での４７．９％±１３．８％のその孵化率に見られた低下は、野生型オスに対するｐｇＳＩＴオスの７８％の交尾競争力に一致していた。図４Ｄに示すように、野生型オスと比較して、ｐｇＳＩＴオスの寿命（例えば生存期間）は損なわれなかった。さらに、Lin and Potter, G3 (2016) doi:10.1534/g3.116.034884が、母体沈着したＣａｓ９が子孫の表現型に影響を与えることが分かっていると報告しているので、２種のｐｇＳＩＴオス、すなわち一方は継承された父方のＣａｓ９を持ち、他方は母方のＣａｓ９を持つｐｇＳＩＴオスは、別々に検討された。図４Ｄ〜４Ｅに示すように、野生型オスの生存期間の中央値は、３２．３±１．３日（Ｎ＝５、ｎ＝２７５）と見積もられ、ｐｇＳＩＴオスの生存期間の中央値は、父方のＣａｓ９および母方のＣａｓ９を保有するオスでは、それぞれ５２．７±１．６（Ｎ＝５、ｎ＝２２０）および５３．７±０．９日（Ｎ＝５、ｎ＝２７５）であった。図４Ｄに示すように、これらのＣａｓ９のｐｇＳＩＴオスの両方とも、野生型オスよりも有意に長く生存したが（Ｐ＜２．２^-１６）、これら２つの型のｐｇＳＩＴオスの寿命（日数で測定した生存時間）間には有意差は認められなかった。ショウジョウバエの野生型オスについて、異なる生存期間の中央値、例えば（Tatar et al., Science 292, 107-110 (2001)が報告の）３５．５日および（Clancy et al., Science 292, 104-106 (2001) and Lin et al., Science 282, 943-946 (1998)が報告の）５７日が報告されていることを考慮すると、食物組成物や温度などの育成条件が生存時間に影響を与えることが分かっている。ｐｇＳＩＴオスの生存時間の中央値は、野生型オスで報告されるよりも長い生存期間に相当し、ｐｇＳＩＴオスは７８％の交尾競争力を示すので、本開示の方法に従って産み出された遺伝子操作によるｐｇＳＩＴオス昆虫では、生存率（例えば寿命）または交尾競争力のいずれも損なわれていない。

実施例５：蚊の個体群を抑制または削減するｐｇＳＩＴの能力は、現状の方法の能力を上回る。

本開示のｐｇＳＩＴ法と、現在利用可能な自己制御の抑制技術または削減技術（例えば、ＲＩＤＬ、ｆｓＲＩＤＬ、およびＩＩＴ）との対比を評価するために、Sanchez et al., (2018), doi:10.1101/350488に開示され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれるＭＧＤｒｉｖＥシミュレーションの枠組みを使用して、これらの技術のそれぞれについて、放出方式を模擬実験した。このシミュレーションの枠組みは、世代が重複している卵、幼虫、蛹、成虫の蚊の発育段階、幼虫の密度に応じて増大する幼虫の死滅率、およびメスがその成虫寿命の期間中に交尾するオス成虫の遺伝物質を保持する交尾構造をモデル化する。図４Ｆの表に示すように、シミュレーションの枠組みは、１万匹のメス成虫の蚊からなる無作為に混在する個体群への放出を計画しており、モデルおよび媒介パラメーターは、表に示す通りである。

図４Ｆ〜４Ｇに示すように、６か月間にわたって、ＲＩＤＬおよびＩＩＴではオス成虫の週毎の放出が模擬実験され、ｆｓＲＩＤＬおよびｐｇＳＩＴでは卵の週毎の放出が模擬実験された。成虫の放出比率は、Carvalho et al., (2015) （前出）に開示されるブラジルでのネッタイシマカＲＩＤＬ蚊の現場試験の前例に従って、１匹の野生型成虫あたり１０匹のＲＩＤＬ／ＩＩＴオス成虫とし、卵の放出比率は、メスのネッタイシマカがOtero et al., 2006（前出）に開示されるように温帯気候で１日あたり約２０個の卵を産出するとして、１匹の野生型成虫あたり２００個とした。これらの模擬実験の結果では、卵の放出システム（例えば、ｐｇＳＩＴおよびｆｓＲＩＤＬ）は、放出された卵が幼虫として急速に孵化し、かつ密度依存の幼虫の競争の結果として生殖可能な幼虫の生存率を低下させるので、最初の３週間で最も急速な個体数抑制または削減をもたらすことを示唆している。ｐｇＳＩＴ手法は、最初の月の月末から最大の抑制または削減を示し、放出期間中での最大の個体数を削減する能力を示している。これは、ｆｓＲＩＤＬのオスの交尾競争力（ケイマン諸島およびブラジルでのＲＩＤＬの現場試験に基づくと、野生型オスのおよそ５％。それぞれHarris et al., 2011およびCarvalho et al., 2015による）（前出）に比較して、ｐｇＳＩＴオスの交尾競争力（野生型オスの７８％）はより高いことにより、この高い交尾競争力は、放出された未成熟な形態による幼虫資源のより多くの消費が抑制または削減に対し影響が小さい場合には、低い個体群密度での優位な因子となる。１０：１のＲＩＤＬオス成虫の放出による個体数の抑制または削減は、密度依存性の幼虫の競争への影響の遅延により、２週間から３週間、ｆｓＲＩＤＬの卵の放出での抑制または削減より遅れるが、その抑制または削減の幅は類似している。ＩＩＴオス成虫の同量の放出は、ボルバキア感染によってオスの非互換性が誘発され、かつ抑制または削減を妨害するボルバキア感染したメスの意図しない放出の機会は、Zhang et al., 2015¹およびZhang et al., 2015²（前出）で報告されるような低濃度の照射によって低減されるために、模擬実験の手順では効果がより小さいものとなっており、放たれたＩＩＴオスの寿命は、Yamada et al., 2014 （前出）での報告のように、おおよそ半分になる。

実施例６：材料および方法

ＣＲＩＳＰＲ標的部位の設計
メスの致死性とオスの生殖不能性を付与するために、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的部位は、性決定遺伝子、すなわち性致死遺伝子（Ｓｘｌ）、性転換遺伝子（ｔｒａ）、および両性遺伝子（ｄｓｘ）のメス固有のエクソンの内部に、かつオス固有の遺伝子、すなわちβチューブリン８５Ｄ（βＴｕｂ）、ファジーオニオン（ｆｚｏ）、プロタミンＡ（ＰｒｏＡ）、および精母細胞停止（ｓａ）中に、それぞれ選択される。ＣＨＯＰＣＨＯＰｖ２（Labun et al., Nucleic Acids Res. 44, W272-6 (2016)に開示され、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる）は、ショウジョウバエゲノム（ｄｍ６）中の特定の配列からｇＲＮＡ標的部位を選択して、オフ標的切断を最小限に抑えるために使用された。選択的スプライシングにより、機能的なＳｘｌおよびＴｒａタンパク質は、ショウジョウバエのメスでのみ産出されるが、Ｄｓｘタンパク質の２つの型式であるメス（Ｄｓｘ^Ｆ）タンパク質またはオス（Ｄｓｘ^Ｍ）タンパク質は、図１Ｂに示すように、それぞれ対応する性別で生成される。βＴｕｂのｇＲＮＡ標的は、Kemphues et al., Cell 21, 445-451 (1980)（前出）で報告されるようなβＴｕｂ８５Ｄ^Ｄ（Ｂ２ｔ^Ｄ）変異対立遺伝子の近傍に選択された。ｇＲＮＡ標的部位の配列を図１Ｃに示す。

構築物の設計および組立
Gibson et al., Nat. Methods 6, 343-345 (2009)に開示され、その内容の全体が参照により組み込まれているギブソン酵素組立法を用いて、全ての構築物を作り上げた。核局在化シグナル（ＮＬＳ）隣接ＳｐＣａｓ９コード配列およびＯｐｉｅ２-ｄｓＲｅｄ形質転換マーカーを有するＳｐＣａｓ９-Ｔ２Ａ-ＧＦＰを内部に持つ前述のプラスミドを用いて、本明細書で使用されるショウジョウバエＣａｓ９構築物を作り上げた。このプラスミドは、ネッタイシマカの遺伝子組換えに用いられ、Li et al., (2017) doi:10.1101/156778に開示されるようなｐｉｇｇｙＢａｃとａｔｔＢドッキング部位（Addgene #100608）の両方を持っていた。ネッタイシマカプロモーターを、図１Ｃに図示するように、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位で切断し、かつそれをＮａｎｏｓ（ｎｏｓ）、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ-６３Ｅ（Ｕｂｉ）、またはＶａｓａ（ｖａｓ）プロモーターで置換して、プラスミドから除去した。プロモーター断片を、表１に列記のプライマー：ｎｏｓ-Ｆ、ｎｏｓ-Ｒ、Ｕｂｉ-Ｆ、Ｕｂｉ-Ｒ、ｖａｓ-Ｆ、およびｖａｓ-Ｆを用いて、ショウジョウバエのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。一本鎖ｇＲＮＡを有する構築物を生成するために、ショウジョウバエのＵ６-３プロモーター、および標的、骨格、および転写終結シグナル（ｇＲＮＡ）を有するガイドＲＮＡは、Akbari et al., Curr. Biol. 23, 671-677 (2013)に開示され、その内容の全体が参照により組み込まれているキイロショウジョウバエ転換に用いられるプラスミド内部のホワイト遺伝子とａｔｔＢドッキング部位との間の多重クローニング部位（ＭＣＳ）にクローンが作られた。このシリーズの最初のプラスミドであるＵ６-３-ｇＲＮＡ^βＴｕｂでは、ショウジョウバエのＵ６-３プロモーターが、ショウジョウバエのゲノムＤＮＡからＵ６-１ＦおよびＵ６-２Ｒプライマーにより増幅され、完全なｇＲＮＡは、Integrated DNA Technology（IDT）社によって合成された２つのultramer（登録商標）：ｇＲＮＡ-３ＦおよびｇＲＮＡ-４ＲオリゴからＰＣＲにより組み立てられた。ｇＲＮＡ転写の終止の効率を改善するために、１１個のチミンを有する終止シグナルを設計に使用した。連続するプラスミドでは、Ｕ６-３プロモーターおよびｇＲＮＡ骨格は、ｇＲＮＡ標的（Ｕ６-１ＡＦ、Ｕ６-２Ａ／Ｂ／ＣＲ、ｇＲＮＡ-３Ａ／Ｂ／ＣＦ、およびｇＲＮＡ-４ＡＲ）を構成する２０個の塩基を置換するように設計された重複する中間オリゴを使用して、Ｕ６-３-ｇＲＮＡ^βＴｕｂプラスミドから増幅され、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ部位で同一のプラスミドを消化して置換された。二本鎖ｇＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を有するプラスミドの群を組み立てるために、Ｕ６-３プロモーターおよびｇＲＮＡは、２ＸｇＲＮＡ-５Ｆおよび２ＸｇＲＮＡ-６Ｒプライマーを備えたメスの性決定遺伝子を標的とする一本鎖ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）プラスミドからの１つの断片として増幅され、ホワイト遺伝子とＵ６-３プロモーターとの間のＢａｍＨＩ部位に直線に並んだＵ６-３-ｇＲＮＡ^βＴｕｂプラスミドの内部にクローンが作られた。ｄｇＲＮＡプラスミドのそれぞれは、βＴｕｂ８５Ｄを標的とする同一のｇＲＮＡβＴｕｂ、および図１Ｃに示すように同一方向に独立して発現したＳｘｌ、ｔｒａ、またはｄｓｘＦを標的とする異なるｇＲＮＡを有していた。図１Ｃに示すように、この検討のために生成されたショウジョウバエＣａｓ９プラスミドおよびｇＲＮＡプラスミドは、Addgeneに寄託された。βＴｕｂ８５Ｄ-ＧＦＰ構築物を形成するために、βＴｕｂコード配列のすぐ上流にある４８１ｂｐ断片を、βＴｕｂ-ＦおよびβＴｕｂ-ＲプライマーによりショウジョウバエのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、ＧＦＰの上流で上述のホワイトａｔｔＢドッキング部位のプラスミド内にクローンを作成した。

プライマー配列

ハエの遺伝形態および画像
ハエは２５℃の標準的な条件で保持した。胚への注入を、Rainbow Transgenic Flies社（http://www.rainbowgene.com）で実施した。図１Ｃに示すように、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ構築物を、第３の染色体（Bloomington #9750）のＰＢａｃ｛ｙ＋-ａｔｔＰ-３Ｂ｝ＫＶ０００３３、および第２の染色体（Bloomington #9750）のＰ｛ＣａｒｙＰ｝ａｔｔＰ１にそれぞれ挿入し、βＴｕｂ-ＧＦＰ構築物を、第３染色体（Bloomington #24486）のＭ｛３ＸＰ３-ＲＦＰ．ａｔｔＰ’｝ＺＨ-８６Ｆａに挿入した。遺伝子組換えハエは、ｗ１１１８；ＣｙＯ／ｓｎａＳｃｏおよびｗ^１１１８；ＴＭ３、Ｓｂ^１／ＴＭ６Ｂ、Ｔｂ^１と平衡を保ち、かつｗ１１１８；ＣｙＯ／Ｓｐ；Ｄｒ^１／ＴＭ６Ｃ、Ｓｂ、Ｔｂ^１とも二重に平衡を保っていた。（第３の染色体の）βＴｕｂ-ＧＦＰは、それぞれが第２の染色体のｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}、ｇＲＮＡβＴｕｂ、Ｔｒａ、およびｇＲＮＡ^βＴｕｂ、Ｄｓｘ^Ｆと二重に平衡を保ち、それらにより遺伝子導入されて、トランスヘテロ接合型の平衡した系統群（ｄｇＲＮＡ／ＣｙＯ；βＴｕｂ-ＧＦＰ／ＴＭ６Ｃ、Ｓｂ、Ｔｂ）を生成した。

ｓｇＲＮＡによって引き起こされるノックアウトおよび対応する表現型の効率を試験するために、それぞれの性別の７匹のハエを交配させて、ｓｇＲＮＡの組み合わせ毎にトランスヘテロ接合型のＦ_１ｓｇＲＮＡ／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋のハエを産み出し、それらの外観形態および生殖能力を調べた。両方の導入遺伝子を、ｗ＋の眼（ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）およびｄｓＲｅｄ（Ｃａｓ９）により蛍光実体顕微鏡で確認した。ノックアウト表現型をもたらしたｓｇＲＮＡ系統を、複製交配にそれぞれ１０匹の♂ハエと１０匹の♀ハエを使用して、双方向にｎｏｓ-Ｃａｓ９ハエによるホモ接合型の系統群としてさらに試験した。ＤｇＲＮＡｓ系統を、ホモ接合型のｎｏｓ-Ｃａｓ９、ｖａｓ-Ｃａｓ９、およびＵｂｉ-Ｃａｓ９系統により双方向に試験した。さらに、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、およびＣａｓ９のホモ接合型系統をｗ-のハエと双方向で交配し、比較対照として提供した。Lin and Potter, G3 (2016) doi:10.1534/g3.116.03488に開示されるように、タンパク質として胚中に仕込まれたＣａｓ９の非メンデル型の優性母性効果を試験するために、ホモ接合型のｄｇＲＮＡハエをヘテロ接合型のＣａｓ９ハエと交配し、母方のＣａｓ９または父方のＣａｓ９のいずれかを備えたｄｇＲＮＡ／＋；＋／ＴＭ３、Ｓｂ子孫の表現型を比較した。父方のＣａｓ９との交配からのＦ１子孫は、Ｃａｓ９の優性母性効果を調べるための対照群の役割を果たした。Ｃａｓ９遺伝子がある場合とない場合に産み出されたノックアウトハエの生殖能力を試験するために、１０〜２０匹のＦ１オスおよびメスまたは間性のバッチを、対応するｗ-および／またはＣａｎｔｏｓＳ系統群からの１５〜２０匹の未交尾のメスハエおよびオスハエと交配させた。交配の３〜４日後に、ハエを新しいバイアル瓶に移し、１週間以内に２つのバイアル瓶でいずれかの生存可能な子孫の存在率を調べた。バッチ全体の生殖能力について、１つのバイアル瓶に生存可能な幼虫が確認された場合は１００％、両方のバイアル瓶に孵化した子孫がいなかった場合は０％と評価した。間性のオスと野生型のオスを含むバイアル瓶でも、産卵の有無を調べた。全ての交配を最低３回繰り返して、統計比較のための平均と標準偏差を算出し、その結果の一貫性と堅牢性を評価した。

ハエを、Leica 社製DMC2900カメラを装備したLeica 社製M165FC蛍光実体顕微鏡で採点し、検査し、かつ画像化した。ハエ成虫の画像を生成するために、様々な焦点板で採取された集積画像を、Helios Focus 6中の単一の画像に集めて、Adobe Photoshop CS6で編集した。間性のハエと生殖不能のオスの内部の解剖学的特徴を研究するために、それらの生殖器官をＰＢＳ緩衝液中で解剖し、検査し、かつ画像化した。ノックアウト表現型のばらつきを評価するために、試験する各遺伝子型について約１０〜２０匹のハエを解剖した。

Ｓｘｌ致死性の発生段階
Ｓｘｌノックアウトメスの死滅が発生する段階を特定化するために、ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋トランスヘテロ接合型のハエについて、卵の孵化率と幼虫の死滅率を定量した。卵の孵化率を定量するために、それぞれ２０〜３０匹のホモ接合型ｎｏｓ-Ｃａｓ９未交尾メスと１０〜２０匹のｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}オスの３回の複製交配を、ブドウ果汁寒天プレートを備えた胚収集容器（Genesee Scientific 59-100）内で実施した。ｗ-ハエを有する３個の胚収集容器を、比較対照として使用した。約２００個の産卵の複数のバッチを各収集容器から計数し、３６時間以上追跡して孵化しない卵の数を計数した。幼虫の死滅率を定量するために、２バッチの産まれた幼虫５０匹を、各寒天プレートから餌付きの別々のハエバイアル瓶に移し、成虫まで飼育し、その後産まれた成虫の数および性別を記録した。蛹の段階での致死率を定量するために、複数の死滅した蛹もまた、バイアル瓶毎に記録した。ｇＲＮＡ^{（βＴｕｂ．Ｓｘｌ）}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋胚の孵化率およびメスの蛹の致死率に関するデータを、それぞれ表２および表３に示す。

ｇＲＮＡ^{（βＴｕｂ．Ｓｘｌ）}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋胚の孵化率

ｇＲＮＡ^{（βＴｕｂ．Ｓｘｌ）}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋でのメス蛹の致死率

Ｄｓｘのメスおよびオスに固有のスプライシング転写物のＲＴーＰＣＲ
ｄｓｘスプライシングへのｔｒａノックアウトの効果を評価するために、ｔｒａノックアウトの間性でのｄｓｘのメスおよびオスに固有のｍＲＮＡを選別した。全てのＲＮＡを、MirVana miRNA分離キット（Ambion）の標準手順書に従って、ｗ-のオス成虫ハエ、ｗ-のメス成虫ハエ、およびｔｒａノックアウト（ｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｔｒａ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋）の間性ハエから抽出した。ＤＮＡの混入を除去するために、TURBO DNA-free^(商標)キット（Ambion）を用いて、２μｇをTURBO^(商標) Dnaseにより処理した。Ｄｓｘメスおよびオスのスプライング変異体は、手順書に従ってSuperScript（登録商標） III One-Step RT-PCRキット（Invitrogen）により増幅された。同じフォワードプライマーであるＤｓｘ-ＲＴ-１Ｆ、および２つの異なるリバースプライマーであるＤｓｘＦ-ＲＴ-２ＲおよびＤｓｘＭ-ＲＴ-３Ｒ（表１）を用いて、メスの転写産物またはオスの転写産物のいずれかを増幅した。１０μＬのＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに泳動させてＰＣＲ特異性を試験し、残りの４０μＬをQIAquick PCR精製キット（QIAGEN）を使用して精製し、あるいは二重帯をゲル表面に確認した場合に、Zymoclean^(商標)Gel DNA回収キット（Zymo Research）を用いてゲルを精製し、その後、精製したアンプリコンをSource BioScience （https://www.sourcebioscience.com）でサンガー法を用いて双方向で配列決定した。

ｇＲＮＡにより標的化した遺伝子座の遺伝子型決定
Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを保有するハエで、メスの致死性またはオス化およびオスの生殖不能性を引き起こした分子の変化を調べるために、４つの機能的ｇＲＮＡの標的部位を含む４つのゲノム遺伝子座（図１Ｃ）を増幅して、配列決定した。一本鎖のハエゲノムＤＮＡは、新たに準備した３０μＬの圧縮緩衝液（１０ｍＭかつｐＨ８．０のＴｒｉｓ-Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＣＬ、２００μｇ／ｍＬのタンパク分解酵素Ｋ）中でハエを均質化し、３７℃で３５分間培養し、かつ９５℃で２分間加熱して調製した。２μＬのゲノムＤＮＡを、LongAmp（登録商標） Taq DNA Polymerase（ＮＥＢ）を用いた４０μＬのＰＣＲ反応でのテンプレートとして使用した。以下のプライマー（表１）：βチューブリン８５Ｄ向けのβＴｕｂ-１ＡＦおよびβＴｕｂ-２ＡＲ；性致死遺伝子向けのＳｘｌ-３ＢＦおよびＳｘｌ-４ＡＲ；性転換遺伝子向けのＴｒａ-５ＦおよびＴｒａ-６Ｒ；両性遺伝子向けのＤＳＸ-７ＦとＤＳＸ-８Ｒを用いて、対応するｇＲＮＡ標的により遺伝子座を増幅した。ＰＣＲ産物は、QIAquick PCR精製キット（QIAGEN）を使用して精製し、Source BioScienceでサンガー法を用いて双方向で配列決定した。標的部位での分子変化を特徴付けるために、配列ＡＢ１ファイルを、SnapGene（登録商標） 4および／またはSequencher^(商標) 5での対応する参照配列に対して整列させた。

生殖不能のオスの競争分析
βＴｕｂノックアウト（ｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋）オスの競争力を評価するために、野生型オスの存在下でのメスとの交尾を確保する能力を評価した。ｗ-オスは、βＴｕｂノックアウトオスと同じ遺伝的背景を共有して、理想的な比較を提供する。２匹の野生型オス、１匹の野生型オス、１匹の野生型オス＋１匹のβＴｕｂノックアウトオス、または２匹のβＴｕｂノックアウトオスを、２日間酵母ペースト上で分離した１０匹のｗ-未交尾メスを有するハエバイアル瓶に入れて、暗闇中で一晩（１２時間）メスへの求愛および交尾を可能とした。オスの求愛意欲を高めるために、新たに産まれたｄｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋オスおよび野生型オスを、競争力の分析前にメスから分離し４日間時間を置いた。ショウジョウバエのメスは、生涯に複数のオスと交尾し、交尾後に貯精嚢に移された精子が存在しない場合には、Peng et al., Curr. Biol. 15, 207-213 (2005)に開示され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれるように、メスの禁欲は、交尾後の１日間は継続する。従って、交配の１２時間後に、全てのオスをバイアル瓶から取り出し、メスはブドウジュースの寒天プレートを備えた小さな胚収集容器（Genesee Scientific 59-100）内に移した。３つのバッチの卵を３６時間以内に収集し、孵化していない卵を数えた。孵化していない卵の数から見積もれる生殖能力の低下により、野生型オスの存在下でメスとの交尾の成功を得るｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋オスの能力を示していて、従ってβＴｕｂノックアウトオスの競争力の表示値を提供していた。１匹の野生型オスを用いて、１２時間内に１０匹のメスのそれぞれに授精する能力を評価し、それにより２匹の野生型オス間での真の競争力または希釈効果とは区別した。

ｐｇＳＩＴオスの寿命を予測する生存曲線
ｐｇＳＩＴ（ｇＲＮＡ^{βＴｕｂ、Ｓｘｌ}／＋；ｎｏｓ-Ｃａｓ９／＋）と野生型オスとの間の生存率の差異を比較するために、３つの実験群のオスの平均寿命を予測した。２種のｐｇＳＩＴハエは、一方は父方のＣａｓ９を保有し、他方は母方のＣａｓ９を保有する別の実験群として処理した。３つの群毎に５回の複製を実施して生存曲線を予測した。それぞれのオスを毎日収集し、１本のバイアル瓶あたりに２０匹のオスのバッチとして経時変化を追った。１回の複製ごとに、それぞれ２本または４本のバイアル瓶に４０〜７５匹のオスを保持した。死滅したハエの数を、ハエが生鮮食品の入った新しいバイアル瓶中に移された間に、３日毎に記録した。事象（例えば死滅）までの間隔打ち切り時間データを、Fay et al., J. Stat. Softw. 36, (2010)に説明され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれるＲパッケージの「間隔」で実行される各群での生存曲線の非母数最尤推定値（ＮＰＭＬＥ）を計算して、３つの実験群に対して分析した。推定手順には、３日間の観測期間により導入される不確実性を考慮する。１０，０００回の反復によるブートストラップを適用して、生存期間の中央値と標準偏差を定量した。

数学的モデル化
現在利用可能な自己制御の抑制技術または削減技術（ＲＩＤＬ、ｆｓＲＩＤＬおよびＩＩＴ放出方式）と比較して、特定地域のネッタイシマカの個体群の抑制または削減におけるｐｇＳＩＴの予測性能をモデル化するために、Sanchez et al., 2018, doi:10.1101/350488（https://marshalllab.github.io/MGDrivE/）に開示され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれているＭＧＤｒｉｖＥシミュレーションの枠組みを使用して、それぞれついて模擬実験した。この枠組みは、毎日の時間過程、世代の重複、およびオス成虫はその生涯を通して交尾し、メス成虫は産まれて直ぐ一度交尾して交尾した相手のオス成虫の遺伝物質を成虫の寿命期間保持し続けるという交尾構造を実現して、卵、幼虫、蛹、成虫の蚊の発育段階をモデル化する（オスとメスの両方の成虫をモデル化する）。若年期の発育段階での密度に依存しない死滅率は、一定であると仮定され、密度に依存する死滅がない場合の個体群の増加率と一致するように選択される。さらに密度依存の死滅は幼虫期に発生し、その形態はDeredec et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, E874-80 (2011)を参考とし、その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。ｐｇＳＩＴ、ＲＩＤＬ、ｆｓＲＩＤＬおよびＩＩＴシステムの継承パターンは、Sanchez et al., 2018, doi:10.1101/350488に説明されるＭＧＤｒｉｖＥ枠組み（https://paperpile.com/c/cKXxhc/fx0P6）の継承モジュール内に、成虫の寿命、オスの交尾競争力、および蛹変態の成功への影響とともにモデル化される。ＭＧＤｒｉｖＥ枠組みの確率的解釈は、小さい個体群規模での変量効果および個体群削減の可能性を捕捉するように実行された。平衡状態にある１万匹のメス成虫からなる無作為に混在する個体群への週毎の放出を、ネッタイシマカの生涯履歴および図４Ｆの表に列記した媒介パラメータ値により、６か月の期間にわたって模擬実験した。

統計分析
統計分析を、SAS Institute Inc.製のJMP 8.0.2で実施した。３回〜５回の生体複製を使用して、比較のための統計的手段を形成した。Ｐ値は、不等分散による２試料でのスチューデントのｔ検定で計算された。オスの生殖不能性の有意性を検定するために、分割表でのピアソンのカイ２乗検定を使用してＰ値を計算した。推定された生存曲線間の差異を検定するために、Sun, Stat. Med. 15, 1387-1395 (1996)に説明され、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれるログランク検定のサンの一般化理論を使用した。さらに古典的なボンフェローニ補正を使用して、２つのｐｇＳＩＴ群間の差異につきペアワイズ・ポストホック検定を実行した。

寄託されたデータ
注釈付きの完全なプラスミド配列およびプラスミドＤＮＡは、Addgeneへの注文で一般に入手できる。遺伝子組換えハエは、Bloomington Drosophila stock centerから注文により入手できるようになった。

本開示は、特定の実施形態例を参照して例示および説明されてきたが、当業者は、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、説明された実施形態に様々な修正および変更を加えることが可能であると分かっている。

Claims

遺伝子組換え昆虫の子孫の性別をオスに誘導する方法であって、
メスに固有の生存能力に必要なメスに必須のゲノム配列を標的とする少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの核酸配列を、第１の昆虫のゲノム内に組み込むこと、
エンドヌクレアーゼを、前記第１の昆虫と遺伝的に交配可能な第２の昆虫に導入すること、および
前記第１の昆虫と前記第２の昆虫を遺伝的に交配させて、それにより前記エンドヌクレアーゼおよび前記少なくとも１つの核酸配列を含む子孫を産み出し、前記子孫からオス昆虫の卵が成熟して成虫になることを含む、方法。
請求項１に記載の方法を含む生殖不能のオス昆虫の卵の遺伝子組換え子孫を産み出す方法であって、
前記少なくとも１つの核酸配列はさらに、オスに固有の生殖能力に必要なオスの生殖不能性ゲノム配列を標的とする少なくとも１つの第２のガイドポリヌクレオチドを含み、前記第１の昆虫と前記第２の昆虫を遺伝的に交配させることにより、生殖不能のオス昆虫の卵の子孫を産み出す、方法。
前記第１の昆虫のゲノム内への少なくとも１つの核酸配列の組み込みは、ゲノム中の全ての染色体コピーへのホモ接合型の組み込みを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記少なくとも１つの核酸配列の組み込みは、胚段階の前記第１の昆虫に前記少なくとも１つの核酸配列を導入することを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドおよび前記少なくとも１つの第２のガイドポリヌクレオチドはそれぞれ、少なくとも１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１または２に記載の方法。
前記メスに必須のゲノム配列は、メスに固有の生存能力に必須の遺伝子、またはメスに固有の成長能力および／またはメスに固有の生存能力に必須のメス固有のエクソンを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれがメスに固有の生存能力に必要とされる同一のメスに必須のゲノム配列の異なる領域を標的とする２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれがメスに固有の生存能力に必要とされる異なるメスに必須のゲノム配列を標的とする２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記メスに必須のゲノム配列は、遺伝子または遺伝子のスプライシング変異体であり、前記遺伝子は、性致死遺伝子（Ｓｘｌ）、性変換遺伝子（Ｔｒａ）、両性遺伝子（Ｄｓｘ）、それらのホモログ、それらのオルソログ、それらのパラログ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
前記少なくとも１つの第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれがＳｘｌ、Ｔｒａ、Ｄｓｘ、それらのホモログ、それらのオルソログ、およびそれらのパラログからなる群から選択される異なる遺伝子を標的とする２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれがＳｘｌ、Ｔｒａ、Ｄｓｘ、それらのホモログ、それらのオルソログ、およびそれらのパラログからなる群から選択される異なる遺伝子を標的とする２つの第１のガイドポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の方法。
前記２つ以上の第１のガイドポリヌクレオチドは、そのそれぞれがＳｘｌ、Ｄｓｘ、それらのホモログ、それらのオルソログ、およびそれらのパラログからなる群から選択される異なる遺伝子を標的とする２つの第１のガイドポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の方法。
前記オスの生殖不能性ゲノム配列は、βチューブリン８５Ｄ（βＴｕｂ）、ファジーオニオン（Ｆｚｏ）、プロタミンＡ（ＰｒｏｔＡ）、および精母細胞停止（Ｓａ）からなる群から選択される遺伝子である、請求項２記載の方法。
前記第２の昆虫がオスである場合に、前記第２の昆虫への前記エンドヌクレアーゼの前記導入は、前記エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子をホモ接合的に組み込むことを含み、前記第２の昆虫がメスである場合に、前記第２の昆虫への前記エンドヌクレアーゼの前記導入は、前記エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子をホモ接合的にまたはヘテロ接合的に組み込むこと、またはエンドヌクレアーゼタンパク質を前記第２の昆虫に沈着することを含む、請求項１または２に記載の方法。
第２の昆虫へのエンドヌクレアーゼの前記導入は、前記エンドヌクレアーゼを胚段階の前記第２の昆虫に導入することを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連配列９（Ｃａｓ９）エンドヌクレアーゼまたはその変異体、ＣＲＩＳＰＲ関連配列１３（Ｃａｓ１３）エンドヌクレアーゼまたはその変異体、ＣＲＩＳＰＲ関連配列６（Ｃａｓ６）エンドヌクレアーゼまたはその変異体、プレボテラ属（Prevotella）およびフランシセラ属（Francisella）１からのＣＲＩＳＰＲ（Ｃｐｆ１）エンドヌクレアーゼまたはその変異体、またはミクロゲノマーツ属（Microgenomates）およびスミセラ属（Smithella）１からのＣＲＩＳＰＲ（Ｃｍｓ１）エンドヌクレアーゼまたはその変異体を含む、請求項１または２に記載の方法。
前記エンドヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、フランシセラ・ノビシダ菌Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、またはそれらの変異体を含む、請求項１または２に記載の方法。
前記それらの変異体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）ＳｐＣａｓ９（ｘＣａｓ９）、高忠実度ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９‐ＨＦ１）、高忠実度ＳａＣａｓ９、または高忠実度ＦｎＣａｓ９を含む、請求項１７に記載の方法。
前記エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩヌクレアーゼまたはその変異体と融合したＣａｓ９タンパク質またはその変異体を含むＣａｓ融合ヌクレアーゼを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記その変異体は、触媒として不活性なＣａｓ９（死滅Ｃａｓ９）を含む、請求項１９に記載の方法。
前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ６、Ｃｐｆ１、ＣＭＳ１タンパク質、またはそれらの任意の変異体であり、前記任意の変異体は、メタノコッカス・マリパルディスＣ７（Methanococcus maripaludis C7）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheria）、コリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ-３１４（Corynebacterium efficiens YS-314）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ１３０３２）（Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032)）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ１３０３２）（Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032)）、コリネバクテリウム・グルタミクムＲ（Corynebacterium glutamicum R）、コリネバクテリウム・クロッペンシュテッティ（ＤＳＭ４４３８５）（Corynebacterium kroppenstedtii (DSM 44385)）、マイコバクテリウム・アブセサス（ＡＴＣＣ１９９７７）（Mycobacterium abscessus (ATCC 19977)）、ノカルディア・ファルシニカＩＦＭ１０１５２（Nocardia farcinica IFM10152）、ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４（Rhodococcus erythropolis PR4）、ロドコッカス・ジョスティＲＨＡ１（Rhodococcus jostii RHA1）、ロドコッカス・オパクスＢ４（ｕｉｄ３６５７３）（Rhodococcus opacus B4 (uid36573)）、アシドテルムス・セルロリチクス１１Ｂ（Acidothermus cellulolyticus 11B）、アントロバクテル・クロロフェノリクスＡ６（Arthrobacter chlorophenolicus A6）、クリベラ・フラビダ（ＤＳＭ１７８３６、ｕｉｄ４３４６５）（Kribbella flavida (DSM 17836, uid43465)）、テルモモノスポラ・クルバータ（ＤＳＭ４３１８３）（Thermomonospora curvata (DSM43183)）、ビフィドバクテリウム・デンチウムＢｄ１（Bifidobacterium dentium Bd1）、ビフィドバクテリウム・ロングムＤＪＯ１０Ａ（Bifidobacterium longum DJO10A）、スラキア・ヘリオトリニレズセンス（ＤＳＭ２０４７６）（Slackia heliotrinireducens (DSM 20476)）、ペルセフォネーラ・マリーナＥＸＨ１（Persephonella marina EX H1）、バクテロイデス・フラギリスＮＣＴＣ９４３４（Bacteroides fragilis NCTC 9434）、カプノサイトファガ・オクラセア（ＤＳＭ７２７１）（Capnocytophaga ochracea (DSM 7271)）、フラボバクテリウム・サイクロフィルムＪＩＰ０２８６（Flavobacterium psychrophilum JIP02 86）、アッケマンシア・ムシニフィラ（ＡＴＣＣＢＡＡ８３５）（Akkermansia muciniphila (ATCC BAA 835)）、ロゼイフレクサス・カステンホルジイイ（ＤＳＭ１３９４１）（Roseiflexus castenholzii (DSM 13941)）、ロゼイフレクサスＲＳ１（Roseiflexus RS1）、シネコシスティスＰＣＣ６８０３（Synechocystis PCC6803）、エルスミクロビウム・ミヌツムＰｅｉ１９１（Elusimicrobium minutum Pei191）、未培養テルマイト第１族細菌系統型ＲｓＤ１７（uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs D17）、フィブロバクター・スクシノゲネスＳ８５（Fibrobacter succinogenes S85）、バチルス・セレウス（ＡＴＣＣ１０９８７）（Bacillus cereus (ATCC 10987)）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（Lactobacillus rhamnosus GG）、ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８（Lactobacillus salivarius UCC118）、ストレプトコッカス・アガラクチア-５-Ａ９０９（Streptococcus agalactiae-5-A909）、ストレプトコッカス・アガラクチアＮＥＭ３１６（Streptococcus agalactiae NEM316）、ストレプトコッカス・アガラクチア２６０３（Streptococcus agalactiae 2603）、ストレプトコッカス・ジスアガラクチア・エクイシミリスＧＧＳ１２４（Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124）、ストレプトコッカス・エクイ・ズーエピデミクスＭＧＣＳ１０５６５（Streptococcus equi zooepidemicus MGCS10565）、ストレプトコッカス・ガロリティクスＵＣＮ３４（ｕｉｄ４６０６１）（Streptococcus gallolyticus UCN34 (uid46061)）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ・チャリス・サブストＣＨ１（Streptococcus gordonii Challis subst CH1）、ストレプトコッカス・ミュータンスＮＮ２０２５（ｕｉｄ４６３５３）（Streptococcus mutans NN2025 (uid46353)）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭ１ＧＡＳ（Streptococcus pyogenes M1 GAS）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ５００５（Streptococcus pyogenes MGAS5005）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ２０９６（Streptococcus pyogenes MGAS2096）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ９４２９（Streptococcus pyogenes MGAS9429）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０２７０（Streptococcus pyogenes MGAS10270）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ６１８０（Streptococcus pyogenes MGAS6180）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ３１５（Streptococcus pyogenes MGAS315）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＳＩ―１（Streptococcus pyogenes SSI-1）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０７５０（Streptococcus pyogenes MGAS10750）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＮＺ１３１（Streptococcus pyogenes NZ131）、ストレプトコッカス・テルモフィルスＣＮＲＺ１０６６（Streptococcus thermophiles CNRZ1066）、ストレプトコッカス・テルモフィルスＬＭＤ―９（Streptococcus thermophiles LMD-9）、ストレプトコッカス・テルモフィルスＬＭＧ１８３１１（Streptococcus thermophiles LMG 18311）、クロストリジウム・ボツリヌムＡ３ロッホ・マレー（Clostridium botulinum A3 Loch Maree）、クロストリジウム・ボツリヌムＢエクルンド１７Ｂ（Clostridium botulinum B Eklund 17B）、クロストリジウム・ボツリヌムＢａ４６５７（Clostridium botulinum Ba4 657）、クロストリジウム・ボツリヌムＦランゲランド（Clostridium botulinum F Langeland）、クロストリジウム・セルロリチクムＨ１０（Clostridium cellulolyticum H10）、フィネゴルディア・マグナ（ＡＴＣＣ２９３２８）（Finegoldia magna (ATCC 29328)）、ユウバクテリウム・レクターレ（ＡＴＣＣ３３６５６）（Eubacterium rectale (ATCC 33656)）、マイコプラズマ・ガリセプチクム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・モバイル１６３Ｋ（Mycoplasma mobile 163K）、マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）、マイコプラズマ・シノビエ５３（Mycoplasma synoviae 53）、ストレプトバシルス・モリニフオルミス（ＤＳＭ１２１１２）（Streptobacillus moniliformis (DSM 12112)）、ブラディリゾビウムＢＴＡｉ１（Bradyrhizobium BTAi1）、ニトロバクテル・ハンブルジェンシスＸ１４（Nitrobacter hamburgensis X14）、ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ１８（Rhodopseudomonas palustris BisB18）、ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ５（Rhodopseudomonas palustris BisB5）、パルビバクラム・ラバメンチボランスＤＳ―１（Parvibaculum lavamentivorans DS-1）、ディノロセオバクター・シベＤＦＬ１２（Dinoroseobacter shibae. DFL 12）、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ５ＦＡＰＥＲＪ（Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ）、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ５ＪＧＩ（Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI）、アゾスピリルムＢ５１０（ｕｉｄ４６０８５）（Azospirillum B510 (uid46085)）、ロドスピリルム・ルブルム（ＡＴＣＣ１１１７０）（Rhodospirillum rubrum (ATCC 11170)）、ディアフォロバクターＴＰＳＹ（ｕｉｄ２９９７５）（Diaphorobacter TPSY (uid29975)）、ベルミネフロバクター・エイセンニエＥＦ０１―２（Verminephrobacter eiseniae EF01-2）、ナイセリア・メニンジチデス０５３４４２（Neisseria meningitides 053442）、ナイセリア・メニンジチデスα１４（Neisseria meningitides alpha14）、ナイセリア・メニンジチデスＺ２４９１（Neisseria meningitides Z2491）、デスルフォビブリオ・サレキシジェンスＤＳＭ２６３８（Desulfovibrio salexigens DSM 2638）、カンピロバクター・ジェジュニ・ドイレイ２６９９７（Campylobacter jejuni doylei 269 97）、カンピロバクター・ジェジュニ８１１１６（Campylobacter jejuni 81116）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・ラリＲＭ２１００（Campylobacter lari RM2100）、ヘリコバクター・ヘパティクス（Helicobacter hepaticus）、ウォリネーラ・スクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、トルモナス・アウエンシスＤＳＭ９１８７（Tolumonas auensis DSM 9187）、シュードアルテロモナス・アトランチカＴ６ｃ（Pseudoalteromonas atlantica T6c）、シェワネラ・ペアレアナ（ＡＴＣＣ７００３４５）（Shewanella pealeana (ATCC 700345)）、レジオネラ・ニューモフィラ・パリス（Legionella pneumophila Paris）、アクチノバシラス・スクシノゲネス１３０Ｚ（Actinobacillus succinogenes 130Z）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、フランシセラ・ツラレンシス・ノビシダＵ１１２（Francisella tularensis novicida U112）、フランシセラ・ツラレンシス・ホラルクチカ（Francisella tularensis holarctica）、フランシセラ・ツラレンシスＦＳＣ１９８（Francisella tularensis FSC 198）、フランシセラ・ツラレンシス・ツラレンシス（Francisella tularensis tularensis）、フランシセラ・ツラレンシスＷＹ９６―３４１８（Francisella tularensis WY96-3418）、またはトレポネーマ・デンチコラ（ＡＴＣＣ３５４０５）（Treponema denticola (ATCC 35405)）に由来する、請求項１または２に記載の方法。
前記第１の昆虫および前記第２の昆虫は、交尾が可能な同一の昆虫または２つの異なる昆虫であり、双翅目、鱗翅目、または鞘翅目からなる群から選択される１種の目に属する、請求項１または２に記載の方法。
前記昆虫は、シマカ属、ネッタイシマカ属、ハマダラカ属、またはイエカ属からの蚊である、請求項２２に記載の方法。
前記蚊は、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）、オクセロタツス・トリセリタツス（エーデス・トリセリタツス）（Ochlerotatus triseriatus (Aedes triseriatus)）、ステフェンスハマダラカ（Anopheles stephensi）、アルビマヌスハマダラカ（Anopheles albimanus）、ガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae）、クアドリマクラツスハマダラカ（Anopheles quadrimaculatus）、フリーボルニハマダラカ（Anopheles freeborni）、イエカ種（Culex species）、およびクリセタ・メラヌラ（Culiseta melanura）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
前記昆虫は、チチュウカイミバエ（Ceratitis capitata）、メキシコミバエ（Anastrepha ludens）、ミカンコミバエ（Bactrocera dorsalis）、オリーブミバエ（Bactrocera oleae）、メロンバエ（Bactrocera oleae）、ナタールミバエ（Ceratitis rosa）、チェリーミバエ（Rhagoletis cerasi）、クイーンズランドミバエ（Bactrocera tyroni）、ピーチミバエ（Bactrocera zonata）、カリブ海ミバエ（Anastrepha suspensa）、ミカンコミバエ（Bactrocera dorsalis）、および西インドミバエ（Anastrepha obliqua）から選択されるミバエ、新世界ラセン虫（Cochliomyia hominivorax）、旧世界ラセン虫（Chrysomya bezziana）、オーストラリア羊クロバエ／銅緑色クロバエ（Lucilia cuprina）、ピンクガ幼虫（Pectinophora gossypiella）、ヨーロッパジプシーガ（Lymantria dispar）、ネーブルオレンジ虫（Amyelois transitella）、ピーチ枝穿孔虫（Anarsia lineatella）、イネ茎穿孔虫（Tryporyza incertulas）、ヤガ（the noctuid moths）、タバコガ（Heliothinae）、マメコガネムシ（Papilla japonica）、シロコガネムシ（Graphognatus spp.）、ワタミハナゾウムシ（Anthonomous grandis）、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）、ツルコナカイガラムシ（Planococcus ficus）、アジア柑橘類キジラミ（diaphorina citri）、斑点翼ショウジョウバエ（drosophila suzukii）、青緑色シャープシューター（Homalodisca vitripennis）、ガラス翼シャープシューター（Homalodisca vitripennis）、薄褐色リンゴガ（Epiphyas postvittana）、バグラダ虫（Bagrada hilaris）、褐色マーモットカメムシ（Halyomorpha halys）、Lymantria dispar asiatica、Lymantria dispar japonica、Lymantria albescens、Lymantria umbrosaおよびLymantria postalbaの群から選択されるアジアジプシーガ、アジアカミキリムシ（Anoplophora glabripennis）、ココナッツカブトムシ（Oryctes rhinoceros）、エメラルドアッシュ穿孔虫（Agrilus planipennis）、欧州ブドウツルガ（lobesia botrana）、欧州ジプシーガ（Lymantria dispar）、偽コドリンガ（Thaumatotibia leucotreta）、Solenopsis invicta BurenおよびS. richteri Forelから選択されるアカヒアリ、旧世界ガ幼虫（Helicoverpa armigera）、斑点ランタンバエ（Lycorma delicatula）、アフリカミツバチ（apis mellifera scutellata）、フルーツシュート穿孔虫（leucinodes orbonalis）、コーンルート虫（Diabrotica spp.）、ウエスタンコーンルート虫（diabrotica virgifera）、コナジラミ（bemisia tabaci）、イエバエ（Musca Domestica）、グリーンボトルバエ（Lucilia cuprina）、カイコガ（Bombyx mori）、レッドスケール（Aonidiella aurantia）、イヌ糸状虫（Dirofilaria immitis）、サザンパイン甲虫（Dendroctonus frontalis）、アボカドアザミウマ（Thysanoptera Spp.）、Oestridae spp.およびDermatobia hominisから選択されるウシバエ、ウマバエ（Tabanus sulcifrons）、ツノサシバエ（Haematobia irritans）、Cochliomyia macellaria (C. macellaria)、C. hominivorax、C. aldrichiまたはC. minimaから選択されるラセン虫バエ、ツェツェバエ(Glossina spp.)、Hypoderma bovisまたはHypoderma lineatumから選択されるワーブルバエ、斑点ランタンバエ（Lycorma delicatula）、カプラカブトムシ（Trogoderma granarium）、ミツバチダニ（Varroa destructor）、シロアリ（Coptotermes formosanus）、ヘムロックウーリーアブラムシ（Adelges tsugae）、クルミ枝カブトムシ（Pityophthorus juglandis）、ヨーロッパスズメバチ（Sirex noctilio）、ピンク斑点ガ幼虫（pectinophora scutigera）、二斑点クモダニ（Tertanychus urticae）、コナガ（plutella xylostella）、タロウ毛虫（spodoptera litura）、コクヌストモドキ（tribolium castaneum）、緑桃アブラムシ（Myzus persicae）、ワタアブラムシ（aphis gossypii）、ブラウンウンカ（nilaparvata lugens）、ビートアワヨトウ（spodotera exigua）、西洋アザミウマ（frankliniella occidentalis）、コドリンガ（cydia pomonella）、ヨツモンマメゾウムシ（callosobruchus maculatus）、エンドウマメアブラムシ（acyrthosiphon pisum）、トマト葉モグリ虫（tuta absoluta）、タマネギアザミウマ（thrips tabaci）、およびワタガ幼虫（Helicoverpa armigera）からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法により産み出される最大１００％のオス昆虫卵を含む昆虫卵の子孫。
請求項２〜２５のいずれか１項に記載の方法により産み生される最大１００％の生殖不能のオス昆虫卵を含む昆虫卵の子孫。
野生型のメス昆虫と交尾して孵化しない卵の割合を増加させることができる、請求項２〜２５のいずれか１項に記載の方法により産み出される生殖不能の遺伝子組換えオス昆虫。
前記生殖不能の遺伝子組換えオス昆虫は、その対応する野生型のオス昆虫と同等以上の長い寿命を有する、請求項２８に記載の生殖不能の遺伝子組換えオス昆虫。
請求項２〜２５のいずれか１項に記載の方法により産み生される生殖不能の遺伝子組換えオスを野生型の昆虫個体群に導入することを含む、野生型の昆虫個体群を削減する方法。