CN110218245A - 一种具有抑菌活性的抗菌肽atmp7及其在用于制备抗菌剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抑菌活性的抗菌肽ATMP7及其在用于制备抗菌剂中的应用。本发明提供的抗菌肽ATMP7的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的抗菌肽ATMP7分子量小、人工合成方便且成本低，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有良好的杀菌作用，在畜禽、水产饲料中应用能够显著降低畜禽水产的料肉比和提高养殖动物的生长性能和免疫机能的指标，可以广泛应用于饲料、食品、医药等行业中。

Description

一种具有抑菌活性的抗菌肽ATMP7及其在用于制备抗菌剂中 的应用

技术领域

本发明属于生物产品在养殖动物应用领域，尤其涉及一种具有抑菌活性的抗菌肽ATMP7及其在用于制备抗菌剂中的应用。

背景技术

近年来，抗生素类促生长添加剂在饲料中的长期使用所带来的耐药性、药物残留和环境污染等问题已越来越受到人们的关注，禁止在饲料中添加抗生素的呼声越来越高。天然抗菌肽具有与抗生素相同的广谱抗菌作用，作为饲料添加剂使用可达到抑菌促生长目的，且抗菌肽具有无残留、无致病细菌耐药性的特点，属于环保型饲料添加剂。因此，研究开发抗菌肽作为饲料添加剂对提高畜禽产品品质、推动绿色畜牧业的发展具有重要意义。但抗菌肽在动物体内天然含量极微，天然资源有限；并且，抗菌肽分子量小，分离纯化困难，提取步骤烦琐、得率低；而抗菌肽的人工设计与改造是获得抗菌肽的快速、有效途径，已经成为抗菌肽开发的一个重要内容。因此，获得结构简单、抗菌活性高、制备容易的抗菌肽是抗菌肽开发研究中迫切的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种具有抑菌活性的抗菌肽ATMP7及其在用于制备抗菌剂中的应用。本发明提供的抗菌肽ATMP7抗菌谱广，热稳定性强，可作为饲料添加剂中优良的替抗产品，应用于畜禽与水产养殖当中。

为实现上述目的，采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种具有抑菌活性的抗菌肽ATMP7，所述抗菌肽ATMP7的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了所述的抗菌肽ATMP7在用于制备抗菌剂中的应用。

进一步的：所述抗菌剂为应用于畜禽和水产动物的抗菌剂。

进一步的：所述畜禽为鸡、鸭、猪、鹅牛和羊。

进一步的：所述水产动物为鲫鱼、鲤鱼、罗非鱼、大菱鲆、草鱼、鲢鱼、鲈鱼、鳙鱼、青鱼、鲮鱼、大西洋鲑、石斑鱼、虹鳟、团头鲂、鳊鱼、鳗鱼、大黄鱼、黄颡鱼、鳜鱼、对虾、克氏原螯虾、青虾、海参和蟹。

进一步的：所述抗菌剂为抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的制剂。

进一步的：所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌和链球菌；所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、副溶血弧菌、黄海希瓦氏菌、气单胞菌和溶藻弧菌。

进一步的：所述抗菌肽ATMP7能够提高水产动物的增重率与特定增长率。

进一步的：所述抗菌肽ATMP7能够提高养殖动物的免疫力。

进一步的：所述抗菌肽能够提高养殖动物的日增重，降低料肉比。

本发明具有如下优点：本发明中的抗菌肽ATMP7具有分子量小、人工合成方便且成本低，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有良好的杀菌作用，在畜禽、水产饲料中应用能够显著降低养殖动物的料肉比和提高养殖动物的生长性能指标。通过本发明生产的抗菌肽ATMP7可以广泛应用于饲料、食品、医药等行业中。

附图说明

图1是所述抗菌肽ATMP7的耐热性分析。

具体实施方式

以下实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

以下具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

实施例1：抗菌肽ATMP7的制备

抗菌肽ATMP7的化学合成方法：根据SEQ ID NO：1的序列，用全自动多肽合成仪(ABI433)合成ATMP7全序列，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。纯化的抗菌肽ATMP7分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定，等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。

抗菌肽ATMP7，所述的抗菌肽ATMP7为人工设计合成的活性多肽，包含41个氨基酸残基，理论分子量和等电点分别为4474.38Da和10.38。其氨基酸序列为(SEQ ID NO：1)：

APEPRWKIFKKIEKMGRNIRDGIVKAGPAIEVLGSAKAIGK。

实施例2：抗菌肽ATMP7的抑菌活性图谱分析

采用琼脂平板扩散法测定抗菌肽ATMP7的抑菌活性，其受试微生物菌株为：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌01337、金黄色葡萄球菌10499、副溶血弧菌4#(来源广州，海大编号4#)、副溶血弧菌3#(来源黄海所，黄海所编号3#)、黄海希瓦氏菌、气单胞菌(黄海所编号20160604025-1，海大编号HQ)、溶藻弧菌(黄海所编号20140824001-7，海大编号HR)、链球菌(无锡)。

将上述受试微生物(OD600＝0.2～0.3)与55℃的LB固体培养基25mL混匀铺平板(菌悬浮液∶LB培养基＝1∶100)，待其凝固后，用灭过菌的打孔器(直径7mm)打孔，孔中滴加70μL抗菌肽ATMP7(1mg/mL)，30℃培养8～12h，然后记录孔周边的透明圈的直径，每个菌种重复测定三次，计算平均值。表1抗菌肽抑菌效果(抑菌圈直径mm)。

表1抗菌肽ATMP7的抑菌图谱分析结果

受试菌株	抑菌圈直径mm
		大肠杆菌	30.41
金黄色葡萄球菌01337	16.39
		金黄色葡萄球菌10499	15.96
副溶血弧菌3#	15.63
		副溶血弧菌4#	15.22
黄海希瓦氏菌	11.87
		气单胞菌	14.38
溶藻弧菌	14.03
		链球菌	15.51

由表1抗菌活性检测结果显示，本发明的抗菌肽ATMP7具有非常广的抑菌图谱，对于革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、链球菌等)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、副溶血弧菌，黄海希瓦氏菌，气单胞菌和溶藻弧菌等)畜禽、水产病原菌的有效抑制，在畜禽、水产动物疾病的预防方面具有较好的应用前景。

实施例3：抗菌肽ATMP7的耐热性分析

将浓度为1mg/mL的抗菌肽ATMP7溶液分别置于0℃、80℃、85℃、100℃条件下作用5min；然后按实施例2中抑菌活性分析的方法对四种不同温度下处理后的抗菌肽ATMP7溶液进行抑菌活性(按上述的琼脂平板扩散法分析抑菌活性)，受试微生物菌株为金黄色葡萄球菌01337。

由图1可知，随着温度的升高，抗菌肽ATMP7对大肠杆菌的抗菌活性逐渐降低，但经高温(80℃、85℃和100℃)的处理，抗菌肽ATMP7仍具有较好的抗菌活性。由此表明，抗菌肽ATMP7具有较好的耐热性能。

实施例4：抗菌肽ATMP7对凡纳滨对虾生长性能的影响

1.1试验设计

选取已暂养至体重为4-5g/尾凡纳滨对虾270尾，采用单因子试验设计，按体重随机分到3个处理组，采用天邦1#饲料为基础日粮，对照组CK不添加抗菌肽ATMP7，试验I组日粮中添加抗菌肽ATMP7 50mg/kg；试验II组粮中添加抗菌肽ATMP7 100mg/kg，每组6个重复，每个重复15尾。

每日投喂三餐，投喂时间为8：30、12：30、16：30，投喂量按照1h饱食进行，保证1h后缸内有少量饵料剩余。然后以缸为单位用虹吸管进行残饵收集，收集后105℃烘干至恒重后称量并记录。养殖实验为期30天。

1.2生长性能指标的测定

养殖试验30天后，将凡纳滨对虾空腹饥饿养殖24h，捞出用滤纸轻轻吸干虾体表面水分后进行称重，计算增重率、特定生长率及饲料系数。

增重率计算公式为：WGR(％)＝100×[(Wt-W0)/W0]；

特定生长率计算公式为：SGR(％·day^-1)＝100×[(1nWt-lnW0)/t]；

饲料系数计算公式为：FCR＝F/(Wt-W0)；

式中，W0为初始平均体重(g)，Wt为结束平均体重(g)，t实验天数(d)，F为摄食量(g，投喂量-残饵量)。

1.3试验结果

抗菌肽ATMP7对凡纳滨对虾生长性能的影响见表2。对实验凡纳滨对虾进行30天的饲养，结果表明，抗菌肽ATMP7可明显提高凡纳滨对虾的增重率与特定增长率，也能在一定程度上降低其饵料系数。

表2不同剂量ATMP7对凡纳滨对虾增重率、特定生长率、饵料系数影响表

实施例5：抗菌肽ATMP7对鲫鱼生长性能的影响

1.1试验设计

选取已暂养至体重为8-9g/尾鲫鱼270尾，采用单因子试验设计，按体重随机分到3个处理组，采用基础日粮：鱼粉12％，豆粕25％，菜粕20％，棉粕7％，玉米胚芽饼20％，次粉麸皮16％；对照组CK不添加抗菌肽ATMP7，试验I组日粮中添加抗菌肽ATMP7 50mg/kg；试验II组日粮中添加抗菌肽ATMP7 100mg/kg，每组6个重复，每个重复15尾。养殖实验为期45天。

1.2生长性能指标的测定

养殖试验45天后，将鲫鱼空腹饥饿养殖24h，捞出用滤纸轻轻吸干鱼体表面水分后进行称重，计算增重率、特定生长率及饲料系数。

增重率计算公式为：WGR(％)＝100×[(Wt-W0)/W0]；

特定生长率计算公式为：SGR(％·day^-1)＝100×[(1nWt-lnW0)/t]；

饲料系数计算公式为：FCR＝F/(Wt-W0)；

式中，W0为初始平均体重(g)，Wt为结束平均体重(g)，t实验天数(d)，F为摄食量(g，投喂量-残饵量)。

1.3试验结果

抗菌肽ATMP7对鲫鱼生长性能的影响见表3。对实验鲫鱼进行45天的饲养，结果表明，抗菌肽ATMP7可明显提高鲫鱼的增重率与特定增长率，也能在一定程度上降低其饵料系数。

表3不同剂量ATMP7对鲫鱼增重率、特定生长率、饵料系数影响表

实施例6：抗菌肽ATMP7对蛋鸡免疫功能的影响

1.1试验设计

将270只1日龄海兰褐蛋鸡，按照常规程序免疫后随机分成3组，分别为对照组CK(饲喂基础日粮)、试验I组(基础日粮添加抗菌肽ATMP7 75mg/kg)、试验II组(基础日粮添加抗菌肽ATMP7 150mg/kg)，每组3个平行，预饲1周后，连续7周饲喂添加相应添加剂的饲料。基础日粮组成及营养水平见表4。

表4基础日粮组成及营养水平(风干基础)

注：(1)预混料为每千克日粮提供维生素A108000IU，维生素B₁0.4mg，维生素B₂3.0mg，维生素B₆1.0mg，维生素B₁₂0.006mg，维生素D₃3000IU，维生素E20IU，维生素K₃2mg，生物素0.05mg，叶酸0.1mg，D-泛酸12mg，烟酸7.0mg，Fe80mg，Mn100mg，Zn75mg，I0.80mg，se0.35mg。

(2)代谢能为计算值，其余为实测值

1.2免疫指标测定

1.2.1免疫器官指数检测

测定分别于28、35、42日龄称重后，每个平行组随机处死2只蛋鸡，立即取出脾脏和法氏囊，用滤纸吸干血液后称重。

脾脏(法氏囊)指数/(mg/g)＝脾脏(法氏囊)重量/鸡体重。

1.2.2免疫因子的检测

杀鸡后取血，将血液静置离心后，获得血清，测IgG指标，具体按照鸡免疫球蛋白IgG ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行，试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。

1.3试验结果

1.3.1抗菌肽对海兰褐蛋鸡脾脏指数的影响

从表5可以看出，与对照组CK相比，添加抗菌肽后海兰褐蛋鸡脾脏指数有明显的提升(P＜0.05)。

表5抗菌肽对蛋鸡脾脏指数影响mg/g

1.3.2抗菌肽对海兰褐蛋鸡法氏囊指数的影响

从表6可以看出，与对照组CK相比，添加抗菌肽后海兰褐蛋鸡法氏囊指数有明显的提升(P＜0.05)。

表6抗菌肽对蛋鸡法氏囊指数影响mg/g

1.3.3抗菌肽对海兰褐蛋鸡血清IgG的影响

从表7可以看出，与对照组CK相比，添加抗菌肽后海兰褐蛋鸡血清中免疫球蛋白的含量显著提高(P＜0.05)。

表7抗菌肽对蛋鸡血清lgG的影响ng/mL

对海兰褐蛋鸡连续喂食添加抗菌肽ATMP7的饲料7周后，海兰褐蛋鸡各项免疫指标均得到不同程度的提高，因此抗菌肽ATMP7对于海兰褐蛋免疫力的提高具有一定的有益作用。

实施例7：抗菌肽ATMP7对蛋鸡生产性能的影响

1.1试验设计

试验动物为367日龄海兰褐蛋鸡24000羽，随机分为3组，每组8000只。对照组CK不添加抗菌肽ATMP7，试验I组日粮中添加抗菌肽ATMP7 75mg/kg；试验II组日粮中添加抗菌肽ATMP7 150mg/kg。试验期为30d，

1.2生长性能指标的测定

记录试验期间整体蛋重、破蛋个数、死淘率。试验场采用四层阶梯笼养，人工光照和自然光照相结合的方法每天光照16h，通风采用机械通风+自然通风，自由采食，自由饮水，按免疫程序正常接种免疫，定期消毒。饲料使用安池农牧的预混料。

表8基础日粮表

1.3试验结果

表9抗菌肽ATMP7对蛋鸡生产性能的影响

结果表明抗菌肽ATMP7可改善或维持产蛋率，降低料蛋比，减少破壳蛋等不合格蛋的数量，减少蛋鸡的死淘率。

实施例8：日粮中添加抗菌肽ATMP7对肉鸭生长性能的影响

1.1试验设计

试验选择30000羽0日龄樱桃谷肉鸭，采用单因子试验设计，随机分到3个处理组，每组10000羽，采用中慧肉鸭料为基础日粮，对照组CK不添加抗菌肽ATMP7，试验I组日粮中添加抗菌肽ATMP7 75mg/kg；试验II组日粮中添加抗菌肽ATMP7 150mg/kg。

试验鸭采用地面厚垫料饲养，按常规方式进行管理，自由采食、饮水，并观察鸭群的生长状况。养殖实验为期42天。

1.2生长性能指标的测定

记录每天耗料量，每日观察鸭群的生长、发病及死亡情况，记录死淘情况。每周早晨7：00空腹称重、计算肉鸭的平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.3试验结果

表10抗菌肽ATMP7对樱桃谷肉鸭生产性能影响

同一饲养条件下，42日龄出栏，试验组在料比、回收率、均重三个方面均呈现明显优势。其中试验组分别比对照组料肉比下降0.07与0.09，均重提高70g与100g，回收率提高1.2％与2.12％。表明抗菌肽ATMP7在肉鸭饲养过程中能有效改善肉鸭健康状态，减少死亡率，提高生产性能。

实施例9：日粮中添加抗菌肽ATMP7对断奶仔猪生长性能的影响

1.1试验设计

选取初始体重接近、体况良好的120头28d断奶的“杜×长×大”三元杂交仔猪。采用单因子试验设计，随机分成3组，每组4个重复，每个重复10头猪，分别为对照组CK(饲喂基础饲粮)、试验I组(基础饲粮添加抗菌肽ATMP7 150mg/kg)、试验II组(基础饲粮添加抗菌肽ATMP7 250mg/kg)。预试期3d，正试期28d。断奶仔猪的基础饲粮及营养水平见表11。

表11断奶仔猪基础饲粮组成及营养成分(风干基础)

1.2指标测定

分别于试验开始第1天和结束第29天的早上8：00对每栏试验猪进行空腹逐栏称重，记录耗料量，计算日增重和日采食量以及料重比。试验期间每日观察每个仔猪排粪情况，记录腹泻个体及腹泻天数，最后以重复为单位计算腹泻频率。

1.3试验结果

表12抗菌肽ATMP7保育仔猪生长性能的影响

由表12可知，试验相比对照组日增重分别提高13.04g/天与22.03g/天，采食量分别提高22.13g/天与7.37g/天。料肉比下降0.02与0.11。腹泻率下降1.08％与2.25％。表明抗菌肽ATMP7对降低仔猪腹泻率与料肉比，提高日增重与日采食量有明显作用，可明显提高仔猪生产性能。

实施例10：抗菌肽ATMP7对育肥猪生长性能的影响

1.1试验设计

选择胎次相同、70日龄左右、体重为(24.96±2.86)kg的120头杜长大猪，采用单因子试验设计，随机分成3组，每组4个重复，每个重复10头猪，分别为对照组CK(饲喂基础饲粮)、试验I组(基础饲粮添加抗菌肽ATMP7 150mg/kg)、试验II组(基础饲粮添加抗菌肽ATMP7 250mg/kg)。试验预试期7d，正试期100d。肥育猪的基础饲粮及营养水平见表13。

表13肥育猪的基础饲粮及营养水平

注：1.预混料为每千克饲粮提供铜40mg，铁100mg，锌80mg，锰40mg，碘1mg，硒0.3mg，维生素A9000IU，维生素D₃1200IU，维生素E80IU，维生素K4mg，维生素B₁6mg，维生素B₂20mg，烟酸20mg，泛酸15mg，生物素0.3mg，胆碱300mg

2.消化能与赖氨酸为计算值，其他为测量值

1.2指标测定

分别于试验开始第1天和结束第101天的早上8：00对每栏试验猪进行空腹逐栏称重，记录耗料量，计算日增重和日采食量以及料重比。

1.3试验结果

抗菌肽ATMP7对肥育猪生长性能的影响见表14。对育肥猪进行100天的饲养，结果表明，添加抗菌肽ATMP7后，育肥猪的日增重明显提高，试验I组与试验II组分别比对照组增加11.7g/天与16.1g/天。料重比显著下降，试验I组与试验II组相比对照组料肉比下降0.02与0.04，说明添加ATMP7可以大大提高育肥猪的生长性能。

表14抗菌肽ATMP7对肥育猪生长性能的影响

以上结果表明，本发明中的抗菌肽ATMP7抗菌谱广，热稳定性强，可作为饲料添加剂中优良的替抗产品，应用于畜禽与水产养殖当中。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛红樱桃生物技术有限公司

<120> 一种具有抑菌活性的抗菌肽ATMP7及其在用于制备抗菌剂中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> PRT

<213> 抗菌肽(ATMP7)

<400> 1

Ala Pro Glu Pro Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly

1 5 10 15

Arg Asn Ile Arg Asp Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Glu Val

20 25 30

Leu Gly Ser Ala Lys Ala Ile Gly Lys

35 40

Claims (10)

1.一种具有抑菌活性的抗菌肽ATMP7，其特征在于：所述抗菌肽ATMP7的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的抗菌肽ATMP7在用于制备抗菌剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗菌剂为应用于畜禽和水产动物的抗菌剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述畜禽为鸡、鸭、猪、鹅牛和羊。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述水产动物为鲫鱼、鲤鱼、罗非鱼、大菱鲆、草鱼、鲢鱼、鲈鱼、鳙鱼、青鱼、鲮鱼、大西洋鲑、石斑鱼、虹鳟、团头鲂、鳊鱼、鳗鱼、大黄鱼、黄颡鱼、鳜鱼、对虾、克氏原螯虾、青虾、海参和蟹。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗菌剂为抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的制剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌和链球菌；所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、副溶血弧菌、黄海希瓦氏菌、气单胞菌和溶藻弧菌。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗菌肽ATMP7 能够提高水产动物的增重率与特定增长率。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗菌肽ATMP7能够提高养殖动物的免疫力。

10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗菌肽能够提高养殖动物的日增重，降低料肉比。