CN110511938B

CN110511938B - 一种短须裂腹鱼热应激蛋白hsp70基因、检测方法及其应用

Info

Publication number: CN110511938B
Application number: CN201910839020.0A
Authority: CN
Inventors: 王崇; 梁银铨
Original assignee: Institute Of Water Engineering Ecology Chinese Academy Of Sciences
Current assignee: Institute Of Water Engineering Ecology Chinese Academy Of Sciences
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2039-09-05
Also published as: CN110511938A

Abstract

本发明公开了短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因的组织表达量的检测方法。首先从短须裂腹鱼的肝脏提取总RNA，反转录得到cDNA第一条链，采用RACE扩增法进行HSP70基因5'‑和3'‑序列的克隆，并利用软件对克隆得到的HSP70cDNA部分序列、5'‑和3'‑序列进行拼接。序列含有2348个碱基，开放阅读框(ORF)1950个碱基，编码649个氨基酸。采用荧光实时定量PCR技术检测肝、肾、脾组织中Hsp70的表达量。通过周期性饥饿‑投喂对短须裂腹鱼幼鱼肝、肾、脾组织HSP70基因表达影响研究，得出肾脏可以作为研究饥饿应激的靶器官。为研究短须裂腹鱼Hsp70表达调控机理奠定基础。

Description

一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用。

背景技术

热应激蛋白作为分子伴侣，是进化上高度保守、功能上至关重要的蛋白，广泛存在于从低等原核生物到高等哺乳动物的整个生物界。HSP70是HSPs家族中的重要成员之一，它在正常情况呈低水平的本底表达，在应激条件下(温度、渗透压、炎症、微生物感染、重金属、饥饿和缺氧等)可诱导上调表达，它作为分子伴侣参与蛋白质合成、折叠、装配和运输，可以修复和降解部分变性或已损坏的蛋白，从而增强机体的抗应激能力。HSP70作为生物体抗逆的重要分子，其表达水平的高低可以作为评价机体应激程度和应激能力的重要指标。

短须裂腹鱼(Schizothorax wangchiachii)隶属于鲤形目、鲤科、裂腹鱼亚科、裂腹鱼属，主要分布于金沙江、乌江和雅砻江；因过度捕捞、环境污染、水电开发等原因，野生短须裂腹鱼资源越来越少，目前已经开展人工养殖。

但是，目前，有关于短须裂腹鱼的热应激蛋白HSP70基因还没有相关的报道，其序列也未知，阻碍了对短须裂腹鱼应激能力检测的研究的发展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用。

本发明是这样实现的，一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因，所述热应激蛋白HSP70基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.13。

进一步，所述热应激蛋白HSP70基因编码的蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.14。

一种如上所述的短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因的全序列检测方法，包括以下步骤：

步骤1：提取短须裂腹鱼RNA；

步骤2：以步骤1中提取的RNA为模板，合成cDNA；

步骤3：根据已知的HSP70基因的保守区序列设计引物，以步骤2中获取的cDNA为模板，克隆HSP70的中间部分序列；

步骤4：获取目标基因5’端序列；

步骤5：获取目标基因3’端序列；

步骤6：将步骤3、步骤4和步骤5获得的序列进行全长拼接，获得完整的短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因的全序列。

进一步，步骤3中根据已知的HSP70基因的保守区序列设计引物的序列见SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2。

进一步，步骤4和步骤5中分别采用5′RACE试剂盒和3′RACE试剂盒获取目标序列。

一种如上所述的短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因在短须裂腹鱼应激能力检测中的应用。

进一步，检测方法包括针对所述短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因设计的引物序列，分别见SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明从短须裂腹鱼的肝脏提取总RNA，反转录得到cDNA第一条链，采用RACE扩增法进行HSP70基因5'-和3'-序列的克隆，利用软件对克隆得到的HSP70cDNA部分序列、5'-和3'-序列进行拼接成为HSP70 cDNA全长序列。2348个碱基，开放阅读框(ORF)1950个碱基，编码649个氨基酸。采用荧光实时定量PCR技术检测肝、肾、脾组织中Hsp70的表达量。为研究短须裂腹鱼Hsp70表达调控机理奠定基础。

目前，短须裂腹鱼的热应激蛋白HSP70基因的检测方法和组织表达的检测方法还没有相关的报道，本发明则可填补这一技术空白，对于深入研究其应激调节中的生物学功能提供理论依据。

附图说明

图1是获取中间片段产物的电泳结果；

图2是获取5’端序列产物的电泳结果；

图3是获取3’端序列产物的电泳结果；

图4是HSP70基因全长序列及氨基酸结果图；

图5是短须裂腹鱼不同组织中HSP70基因mRNA水平的相对表达量；

图6是实施例3中肝脏中HSP70基因mRNA水平的相对表达量；

图7是实施例3中脾中HSP70基因mRNA水平的相对表达量；

图8是实施例3中肾中HSP70基因mRNA水平的相对表达量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用，具体如下各实施例所示。

实施例1目标基因克隆

步骤1：提取RNA

1)短须裂腹鱼经过MS-222麻醉后解剖，快速分离肝胰脏组织置于冻存管，于液氮中速冻后转移-80℃保存备用。从液氮中取出肝脏组织约80mg，置于预冷的研钵中，趁液氮尚未挥发光时，将组织磨成粉末，并迅速加入1mL Trizol。匀浆后，Trizol/组织混合物室温放置5min，以便样本被Trizol充分裂解。

2)每1mL Trizol裂解的样本加入200μL氯仿即三氯甲烷。

3)盖严管盖，上下剧烈摇晃15秒。

4)室温放置3min。

5)在4℃下12000g离心15min。

6)离心后，管中液体将分层，转移最上层的无色液体(约总体积50％左右)至一个新的无RNA酶的EP管中。注意：千万不能吸到下层的液体及悬浮在中间的白色沉淀物。吸取的时候，将EP管倾斜成45°角。

7)向新的上层液体中加500μL 100％异丙醇。

8)室温放置10min。

9)在4℃下12000g离心10min。

10)小心吸去上清，加入75％乙醇，75％乙醇要用DEPC水配置。

11)上、下颠倒八次，7500g，4℃离心5min。

12)除去乙醇后，开盖室温放置5-10min，即得到纯化的RNA。

13)DEPC水溶解后，琼脂糖电泳检测分子的完整情况，分光光度法检测其浓度。

步骤2：cDNA的合成

该步骤使用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒完成，具体如下：

1)在无RNA酶的PCR管中加入1μg的总RNA，和1μL的100μM的oligo(dT)引物，并用DEPC处理过的灭菌水加至体积12μL。

2)将上述混合液于65℃处理5分钟，然后在冰上立即冷却1分钟。

3)然后再在反应液中依次加入4μL 5X reaction buffer、1μL RiboLock RNaseInhibitor(20μ/μL)、2μL 10mM dNTP mix、1μL RevertAid M-MuLV ReverseTranscriptase(200μ/μL)。

4)将其轻轻混匀，并短暂离心。

5)在PCR仪上42℃孵育1个小时。

6)70℃孵育5分钟结束反应。

步骤3：中间片段调取

根据已知的鱼类的HSP70基因的保守区序列设计引物即HSP70F:CTGGGCACCACCTACTCCTGTG，见SEQ ID NO.1和HSP70R:GTACAGCTTKGTSATGATKGGGTT，见SEQID NO.2。以步骤2中获得的cDNA为模板，进行PCR反应，克隆HSP70的部分序列。

PCR体系(50μL)：15μL PCR-Grade Water，25.0μL 2X Ex taq Buffer(takara)，1.0μL dNTP Mix(10mM)，1.0μL Ex taq(takara)，5μL cDNA，1.5μL primer F(10X)，1.5μLprimer R(10X)。

PCR程序：94℃变性4min后，94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环，72℃10min。

PCR电泳结果如图1所示，其中Marker为DL2000。PCR产物送至三方公司测序，结果见SEQ ID NO.3。

步骤4：获取5’端序列

该步骤采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends,Version 2.0试剂盒获得目标基因的5’端序列。具体过程如下：

1)设计引物

A202-1(GSP-1):GCTTGGCATCAAAGAC，见SEQ ID NO.4；

A202-2(GSP-2):TCATGGCGACCTGGTTTT，见SEQ ID NO.5；

A202-3(GSP-3):GCAGCATCTCCAATCAATCT，见SEQ ID NO.6。

2)以步骤1中获取的总RNA为模板，使用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSP-1对总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成。并使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理。具体如下：

在0.5mL离心管中加入以反应液：

将混合物在70℃下孵育10分钟使RNA变性。在冰上冷却1分钟。通过简单离心收集试管内容物，按如下顺序添加：

反应液1和2总体积24μL。轻轻拌匀，瞬时离心收集反应。42℃孵育1分钟；加入1μLof SUPERSCRIPT II RT，混合后42℃孵育50分钟；70℃孵育15分钟结束反应；反应在37℃离心10至20秒；加1μL RNase混合完全后，37℃孵化为30分钟；瞬时离心收集反应，并置于冰上。

3)使用DNA纯化试剂盒:GLASSMAX DNA isolation spin cartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化。

4)使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上多聚C。

在每根试管中加入以下成分，混合均匀。

在94℃下孵育3分钟，在冰上冷却1分钟。瞬时离心收集试管内的物质并置于冰上。加入1μL TdT，混合后37℃孵育10分钟。在65℃下加热10分钟使TdT失活。瞬时离心收集反应物置于冰上。

5)使用引物GSP-2和试剂盒里面带的桥连铆钉引物AAP对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增。

在0.5mL离心管中加入以下反应液，置于冰上。

之后加入0.5μL Taq DNA聚合酶(5units/μL)后混匀。直接将冰管转移到热循环器中，预平衡至初始变性温度94℃。PCR反应程序为：94℃预变性1min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，循环结束后72℃，再延伸5min，4℃保存。

6)使用引物GSP-3和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增。

取5μL步骤5)的PCR反应产物加入495μL TE buffer[10mM Tris-HCl,(pH 8.0),1mM EDTA]。

把下面的反应液加入到0.5mL离心管中。

加入0.5μL Taq DNA聚合酶(5units/μL)后混匀.

PCR反应程序为：94℃变性2min，1个循环；94℃变性2min；55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃10min，1个循环，4℃保存。电泳结果见图2，其中，Marker为DL2000。将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，送三方测序，结果见SEQ IDNO.7。

步骤5：获取3’端序列

该步骤采用Clontech公司的SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒获得目标基因的3’端序列。

1)设计引物

3’792-1：AGGGTGAGCGTGCAATGACCAAGGA，见SEQ ID NO.8；

3’792-2：TCGTGGTGTTCCCCAGATTGAGGTC，见SEQ ID NO.9。

2)以总RNA为模板，使用逆转录酶试剂盒SMARTScribe^TMReverse Transcriptase和引物3’CDS primer A(5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGACTAC(T)30V N–3')对总RNA进行逆转录合成cDNA。

在0.5mL的离心管中加入下面的反应液，混匀后离心。

在反应液中继续加入下面的成分。

混合均匀，瞬时离心。72℃孵育3min,然后42℃冷却2min，最后14000rpm离心10min。室温下，混匀下面的试剂：

将上述两种反应液混匀，离心。42℃孵育90min。70℃加热10min终止反应。

3)使用引物3’792-1和UPM(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'，见SEQ ID NO.10；5'-：CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGR-3'，见SEQ ID NO.11)，以上面合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，实验方案同步骤4。

4)将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物3’792-2和UPM进行第二轮PCR扩增，实验方案同步骤4。将第二轮PCR产物进行电泳，结果见图3，其中Marker为DL2000。并对目的条带进行切胶回收纯化。回收产物送三方公司测序，结果见SEQ ID NO.12。

步骤6：全长拼接及ORF预测

利用软件对所克隆的短须裂腹鱼HSP70基因中间部分序列、3'RACE和5'RACE序列进行分析并拼接成为HSP70基因全长序列，见图4，其中灰色为家族签名序列；单层方框内为核定位序列；双层方框内为终止信号序列；单下划线为多聚尾巴；双下划线为细胞质特征基序；糖基化位点为NKSI，NVSA；靠近C末端四肽序列为GCMP。DNA序列见SEQ ID NO.13，氨基酸序列见SEQ ID NO.14。

实施例2HSP70基因在短须裂腹鱼肝脏、肾脏、脾组织中的表达量

步骤1：提取肝脏、肾脏、脾组织中的总RNA，反转录为cDNA，方法同实施例1。

步骤2：根据短须裂腹鱼Hsp70基因的全长序列，使用Primer 5.0软件设计荧光实时定量PCR特异性引物，引物序列如下：

HSP70F’：CATGAACCCCACCAACACAG，见SEQ ID NO.15；

HSP70R’：TCACCCTTGTAATCAACCTGGA，见SEQ ID NO.16。

短须裂腹鱼内参基因序列：

ACTIN-F:CCTGTTCCAGCCATCCTTCT，见SEQ ID NO.17；

ACTIN-R:CAGCAATGCCAGGGTACATG，见SEQ ID NO.18。

步骤3：使用CFX Connect^TM荧光定量PCR仪和Power

Green PCR Master Mix试剂盒进行RT-PCR，参照试剂盒说明书。

PCR反应体系：总反应体系为20μL，内含cDNA模板1μL，上下游引物各0.5μL(浓度为10μmol/L)，SYBR Green PCR Master Mix 10μL和ddH₂O 8μL。PCR反应条件为95℃3min；95℃10s，45个循环；55℃20s，72℃30s；75.0℃5s，共40个循环，65～95℃进行熔解曲线分析。每个组织都做3个重复以减少误差。

步骤4：采用2^–⊿⊿CT法(K.J.Livak,T.D.Schmittgen,Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the2^-ΔΔCt method,2001)计算肝脏、肾脏、脾组织中HSP70基因在mRNA水平的相对表达量，用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，Duncan多重比较检验不同组织间差异显著性，P<0.05表示差异显著。

检测结果见图4，结果说明本发明针对克隆出的HSP70基因的全序列开发的检测体系能够顺利检测短须裂腹鱼不同组织中HSP70基因mRNA水平的相对表达量。

实施例3周期性饥饿-投喂对短须裂腹鱼幼鱼肝脏、肾脏、脾组织HSP70基因表达影响研究实验设计：本发明设计1个对照组，三个饥饿处理组，每个处理三个重复，实验周期为8周。饥饿处理与投喂时间如下：

S0：对照组，实验期间每天饱食投喂，持续8周；

S1：每周第一天饥饿1天，饱食投喂6天，重复8周；

S2：每周第一、二天连续饥饿2天，饱食投喂5天，重复8周；

S3：每周第一、二、三天连续饥饿3天，饱食投喂4天，重复8周。

实验结束后检测各个处理组肝脏、肾脏、脾组织HSP70表达量，检测方法同实施例2。

结果如图6-8所示：周期性饥饿-投喂这种投喂方法不会影响HSP70在肝脏、脾脏中的表达量，会显著影响HSP70在肾组织中表达量，表明肾脏可以作为研究饥饿应激的靶器官，为深入研究饥饿诱导的应激提供基础数据依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 水利部中国科学院水工程生态研究所

<120> 一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因、检测方法及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(HSP70F)

<400> 1

ctgggcacca cctactcctg tg 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(HSP70R)

<400> 2

gtacagcttk gtsatgatkg ggtt 24

<210> 3

<211> 1415

<212> DNA

<213> 中间序列(WH061200290HSPF2R2HSP70-Fzidai_Pw_A11)

<400> 3

atcatcgcta atgaccaagg aaacaggacc actccaagct atgtagcttt cacagacagt 60

gagagattga ttggagatgc tgcaaaaaac caggtcgcca tgaaccccac caacacagtc 120

tttgatgcca agcgtctgat tggccgcagg tttgatgacg gcgttgttca gtctgatatg 180

aagcactggc cttttaatgt catcaatgac aatacccgtc ccaaggtcca ggttgattac 240

aagggtgaga ccaagagttt ctaccctgaa gagatttcct ccatggttct caccaagatg 300

aaggaaattg ctgaggccta cctgggaaag actgtttcca acgcggtcgt cacagtgcct 360

gcctacttca acgattctca gcgacaggct accaaggatg ctggaaccat ctctggcttg 420

aatgttctgc gtatcatcaa tgaaccaact gctgctgcta ttgcttacgg tctggacaaa 480

aaggttggtg ctgagaggaa tgtcctcatc tttgatcttg gtggtggcac tttcgatgtg 540

tctatcctca ccattgagga tggcatcttc gaggtaaaat ctactgctgg agacactcac 600

ttgggtggag aagactttga caaccgcatg gtgaaccact ttatcacaga gttcaagcgg 660

aagcacaaga aggacatcag cgacaacaag agagccgttc gccgtctccg caccgcctgc 720

gagagggcca agcgtaccct atcctccagc actcaggcca gtattgagat cgactccctc 780

tatgagggta tcgatttcta tacctccatc accagggccc gttttgagga gctcaacgct 840

gacctcttcc gtggcacctt ggacccagtc gaaaagtcac ttcgtgacgc caagatggac 900

aaggctcaga tccatgatat tgtcctggtt ggtggctcca ctcgcattcc caaaatccag 960

aagctgctcc aagactactt caacggcaag gagcttaata agagcatcaa ccctgatgag 1020

gctgtggcct atggagcagc cgttcaggct gccatcctct ctggtgacaa gtctgagaac 1080

gttcaggact tgctgctgct agatgtcact cctctgtccc ttggaattga gacagctggt 1140

ggagtcatga ctgtcctcat caagcgtaat accactatcc caaccaaaca gactcagact 1200

ttcaccacct attccgacaa ccagccaggt gtgctcattc aggtctatga gggtgagcgt 1260

gcaatgacca aggataacaa cttgctgggc aagtttgagc ttactggaat cccccctgca 1320

cctcgtggtg ttccccagat tgaggtcacc tttgacattg atgccaatgg catcatgaat 1380

gtttcagctg ttgataaaag cactggcaag gagaa 1415

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(GSP-1)

<400> 4

gcttggcatc aaagac 16

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(GSP-2)

<400> 5

tcatggcgac ctggtttt 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(GSP-3)

<400> 6

gcagcatctc caatcaatct 20

<210> 7

<211> 382

<212> DNA

<213> 5’端序列(5’)

<400> 7

ccacgcgtcg actagtacgg gggggggggc ggtttactaa cattcgctct tgtccgactg 60

tgttaggctg ccttttttcc aggctcattt gctttactcc cgagtcgagc gggcgggctg 120

catgctctct tctaactaag caaggcgagg cagtttgtcg ccattccagc tttccaaccg 180

gcatcttcac tcatctcggt tatttccagc ttgcgacaat gtccaaggga ccagctgttg 240

gtattgatct cgggaccacc tactcctgtg taggtgtttt ccaacatgga aaagttgaaa 300

tcatcgctaa tgaccaagga aacaggacca ctccaagcta tgtagctttc acagacagtg 360

agagattgat tggagatgct gc 382

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(3’792-1)

<400> 8

agggtgagcg tgcaatgacc aagga 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(3’792-2)

<400> 9

tcgtggtgtt ccccagattg aggtc 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(UPM-F)

<400> 10

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(UPM-R)

<400> 11

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtaacaacgc agagr 45

<210> 12

<211> 863

<212> DNA

<213> 3'端序列( 3')

<400> 12

tcgtggtgtt ccccagattg aggtcacctt tgacattgat gccaatggca tcatgaatgt 60

ttcagctgtt gataagagca ctggcaagga gaacaaaacc accatcacta acgataaggg 120

tcgtctcagc aaggaggaca ttgagcgcat ggtgcaggag gcagagaagt acaagagtga 180

ggatgatgtg cagcgcgaca aggtgtctgc caagaacggt ctggaatcct attctttcaa 240

catgaagtca actgttgagg atgagaaact aaagggcaag atcagtgatg aggacaagca 300

gaagatcctt gacaagtgca atgaagtcat cagttggctt gacaagaacc agactgctga 360

gaaggaagag tttgagcacc agcagaagga gctggagaag gtatgtaacc ccatcatcac 420

caagctgtac cagggtgctg gaggcatgcc aggtggaatg cctgatggta tgcccggcgg 480

cttcccagga gccggctctg ctccaggagg tggatcctct ggcccaacca ttgaggaggt 540

cgactaagca attccaaagc cactgcgcta cctccatagc aatgattact gttgccctct 600

gtagttggac tcctctaaaa ttgttcttac ggtctgtctt aagttttgga tgacttcaac 660

ttgcagagag attgttgcaa ttaaaaaaaa aaaaggggga ttaagggatc acagggaaca 720

gattttctac ctagattgca caacctattt atcggcttgt gaaatgtgag tttcataagc 780

cttttccaac tgcctcaatg cctcaagtaa atgaataaaa tggtgactta ttccctaaaa 840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 863

<210> 13

<211> 2348

<212> DNA

<213> Hsp70 基因全长序列(Hsp70 )

<400> 13

taagcaaggc gaggcagttt gtcgccattc cagctttcca accggcatct tcactcatct 60

cggttatttc cagcttgcga caatgtccaa gggaccagct gttggtattg atctcgggac 120

cacctactcc tgtgtaggtg ttttccaaca tggaaaagtt gaaatcatcg ctaatgacca 180

aggaaacagg accactccaa gctatgtagc tttcacagac agtgagagat tgattggaga 240

tgctgcaaaa aaccaggtcg ccatgaaccc caccaacaca gtctttgatg ccaagcgtct 300

gattggccgc aggtttgatg acggcgttgt tcagtctgat atgaagcact ggccttttaa 360

tgtcatcaat gacaataccc gtcccaaggt ccaggttgat tacaagggtg agaccaagag 420

tttctaccct gaagagattt cctccatggt tctcaccaag atgaaggaaa ttgctgaggc 480

ctacctggga aagactgttt ccaacgcggt cgtcacagtg cctgcctact tcaacgattc 540

tcagcgacag gctaccaagg atgctggaac catctctggc ttgaatgttc tgcgtatcat 600

caatgaacca actgctgctg ctattgctta cggtctggac aaaaaggttg gtgctgagag 660

gaatgtcctc atctttgatc ttggtggtgg cactttcgat gtgtctatcc tcaccattga 720

ggatggcatc ttcgaggtaa aatctactgc tggagacact cacttgggtg gagaagactt 780

tgacaaccgc atggtgaacc actttatcac agagttcaag cggaagcaca agaaggacat 840

cagcgacaac aagagagccg ttcgccgtct ccgcaccgcc tgcgagaggg ccaagcgtac 900

cctatcctcc agcactcagg ccagtattga gatcgactcc ctctatgagg gtatcgattt 960

ctatacctcc atcaccaggg cccgttttga ggagctcaac gctgacctct tccgtggcac 1020

cttggaccca gtcgaaaagt cacttcgtga cgccaagatg gacaaggctc agatccatga 1080

tattgtcctg gttggtggct ccactcgcat tcccaaaatc cagaagctgc tccaagacta 1140

cttcaacggc aaggagctta ataagagcat caaccctgat gaggctgtgg cctatggagc 1200

agccgttcag gctgccatcc tctctggtga caagtctgag aacgttcagg acttgctgct 1260

gctagatgtc actcctctgt cccttggaat tgagacagct ggtggagtca tgactgtcct 1320

catcaagcgt aataccacta tcccaaccaa acagactcag actttcacca cctattccga 1380

caaccagcca ggtgtgctca ttcaggtcta tgagggtgag cgtgcaatga ccaaggataa 1440

caacttgctg ggcaagtttg agcttactgg aatcccccct gcacctcgtg gtgttcccca 1500

gattgaggtc acctttgaca ttgatgccaa tggcatcatg aatgtttcag ctgttgataa 1560

gagcactggc aaggagaaca aaaccaccat cactaacgat aagggtcgtc tcagcaagga 1620

ggacattgag cgcatggtgc aggaggcaga gaagtacaag agtgaggatg atgtgcagcg 1680

cgacaaggtg tctgccaaga acggtctgga atcctattct ttcaacatga agtcaactgt 1740

tgaggatgag aaactaaagg gcaagatcag tgatgaggac aagcagaaga tccttgacaa 1800

gtgcaatgaa gtcatcagtt ggcttgacaa gaaccagact gctgagaagg aagagtttga 1860

gcaccagcag aaggagctgg agaaggtatg taaccccatc atcaccaagc tgtaccaggg 1920

tgctggaggc atgccaggtg gaatgcctga tggtatgccc ggcggcttcc caggagccgg 1980

ctctgctcca ggaggtggat cctctggccc aaccattgag gaggtcgact aagcaattcc 2040

aaagccactg cgctacctcc atagcaatga ttactgttgc cctctgtagt tggactcctc 2100

taaaattgtt cttacggtct gtcttaagtt ttggatgact tcaacttgca gagagattgt 2160

tgcaattaaa aaaaaaaaag ggggattaag ggatcacagg gaacagattt tctacctaga 2220

ttgcacaacc tatttatcgg cttgtgaaat gtgagtttca taagcctttt ccaactgcct 2280

caatgcctca agtaaatgaa taaaatggtg acttattccc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340

aaaaaaaa 2348

<210> 14

<211> 649

<212> PRT

<213> Hsp70 氨基酸序列(Hsp70 )

<400> 14

Met Ser Lys Gly Pro Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser

1 5 10 15

Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp

20 25 30

Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Ser Glu

35 40 45

Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Met Asn Pro Thr

50 55 60

Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Asp Asp

65 70 75 80

Gly Val Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe Asn Val Ile Asn

85 90 95

Asp Asn Thr Arg Pro Lys Val Gln Val Asp Tyr Lys Gly Glu Thr Lys

100 105 110

Ser Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys

115 120 125

Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Lys Thr Val Ser Asn Ala Val Val

130 135 140

Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp

145 150 155 160

Ala Gly Thr Ile Ser Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro

165 170 175

Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Lys Val Gly Ala Glu

180 185 190

Arg Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser

195 200 205

Ile Leu Thr Ile Glu Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ser Thr Ala Gly

210 215 220

Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Met Val Asn His

225 230 235 240

Phe Ile Thr Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile Ser Asp Asn

245 250 255

Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg

260 265 270

Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Ile Glu Ile Asp Ser Leu Tyr

275 280 285

Glu Gly Ile Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu

290 295 300

Leu Asn Ala Asp Leu Phe Arg Gly Thr Leu Asp Pro Val Glu Lys Ser

305 310 315 320

Leu Arg Asp Ala Lys Met Asp Lys Ala Gln Ile His Asp Ile Val Leu

325 330 335

Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Ile Gln Lys Leu Leu Gln Asp

340 345 350

Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala

355 360 365

Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Ser Gly Asp Lys

370 375 380

Ser Glu Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser

385 390 395 400

Leu Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Val Leu Ile Lys Arg

405 410 415

Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr Tyr Ser

420 425 430

Asp Asn Gln Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu Arg Ala

435 440 445

Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe Glu Leu Thr Gly Ile

450 455 460

Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile

465 470 475 480

Asp Ala Asn Gly Ile Met Asn Val Ser Ala Val Asp Lys Ser Thr Gly

485 490 495

Lys Glu Asn Lys Thr Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Lys

500 505 510

Glu Asp Ile Glu Arg Met Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Ser Glu

515 520 525

Asp Asp Val Gln Arg Asp Lys Val Ser Ala Lys Asn Gly Leu Glu Ser

530 535 540

Tyr Ser Phe Asn Met Lys Ser Thr Val Glu Asp Glu Lys Leu Lys Gly

545 550 555 560

Lys Ile Ser Asp Glu Asp Lys Gln Lys Ile Leu Asp Lys Cys Asn Glu

565 570 575

Val Ile Ser Trp Leu Asp Lys Asn Gln Thr Ala Glu Lys Glu Glu Phe

580 585 590

Glu His Gln Gln Lys Glu Leu Glu Lys Val Cys Asn Pro Ile Ile Thr

595 600 605

Lys Leu Tyr Gln Gly Ala Gly Gly Met Pro Gly Gly Met Pro Asp Gly

610 615 620

Met Pro Gly Gly Phe Pro Gly Ala Gly Ser Ala Pro Gly Gly Gly Ser

625 630 635 640

Ser Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val Asp

645

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(HSP70F’)

<400> 15

catgaacccc accaacacag 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(HSP70R’)

<400> 16

tcacccttgt aatcaacctg ga 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ACTIN-F)

<400> 17

cctgttccag ccatccttct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ACTIN-R)

<400> 18

cagcaatgcc agggtacatg 20

Claims

1.一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因在非诊断目的的短须裂腹鱼饥饿应激能力检测中的应用

所述热应激蛋白HSP70基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.13，氨基酸序列见SEQ IDNO.14；

所述的短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因的全序列检测方法，包括以下步骤：

步骤1：提取短须裂腹鱼RNA；

步骤2：以步骤1中提取的RNA为模板，合成cDNA；

步骤3：根据已知的HSP70基因的保守区序列设计引物，以步骤2中获取的cDNA为模板，克隆HSP70 的中间部分序列；步骤3中根据已知的HSP70基因的保守区序列设计引物的序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

步骤4：获取目标基因5’端序列；

步骤5：获取目标基因3’端序列；步骤4和步骤5中分别采用5´ RACE试剂盒和3´ RACE试剂盒获取目标序列；

2.根据权利要求1所述的一种短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因在非诊断目的的短须裂腹鱼饥饿应激能力检测中的应用，其特征在于：检测方法包括针对所述短须裂腹鱼热应激蛋白HSP70基因设计的引物序列，分别见SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。