JP2016534114A - Cx3cr1標的化イメージング剤並びに疾病の診断及び処置におけるその使用 - Google Patents
Cx3cr1標的化イメージング剤並びに疾病の診断及び処置におけるその使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、CX3CR1標的化イメージング剤、並びに疾病の処置及び診断におけるその使用に関する。検出標識に連結された単一ドメインCX3CR1標的化ポリペプチド及び動脈硬化プラークのインビボでのイメージングにおけるその使用が説明される。前記CX3CR1標的化イメージング剤は、アテローム性動脈硬化症をはじめとするCX3CR1により媒介される疾病の処置及び診断に有用である。
Description
発明の分野
本発明は、CX3CR1結合ポリペプチド、並びに、アテローム性動脈硬化症をはじめとする疾病の診断及び処置のためのインビボでのイメージングにおけるその使用に関する。
本発明は、CX3CR1結合ポリペプチド、並びに、アテローム性動脈硬化症をはじめとする疾病の診断及び処置のためのインビボでのイメージングにおけるその使用に関する。
背景
心臓血管疾患は、米国及び他の先進国において主要な死因である。アテローム性動脈硬化症は進行性の動脈壁の疾病であり、脂質沈着及び慢性炎症によりプラークが発達する。大半のプラークは無症候性のままであるが、いくつかは血栓症(不安定)及び破裂が起こりやすく、その結果、心筋梗塞又は心臓発作が起こり得る。血管壁を見るために様々な画像診断法が開発されている(Verjans, 2013; J. of Cardiovasc. Trans. Res. ePub June, 2013)。光干渉断層撮影法(OCT)及び血管内超音波検査(IVUS)などのいくつかの技術がプラークの組成及び安定性に関する情報を与えることができるが、それらは侵襲的な手順を必要とする。別の技術は、プラーク中のマクロファージなどの活発に代謝している細胞によって取り込まれ、陽電子放出断層撮影法(PET)によって検出することができる基質である18F−フルオロデオキシグルコースを利用する。18F−FDG PETは、プラークの炎症をモニタリングするための臨床的有用性を示したが、それはまた多くの組織にも非選択的に取り込まれる可能性がある。動脈硬化性疾患の進行及び不安定プラークの発達を駆り立てる活発な細胞プロセス及び分子プロセスへの洞察を提供するために、新規な分子イメージングツールが必要とされる。高度な炎症を有する及び/又は破裂しがちな病変の検出を支援するツールは、リスクのある患者の同定のための及び新規療法の効力の評価のための価値ある機序を提供するだろう。
心臓血管疾患は、米国及び他の先進国において主要な死因である。アテローム性動脈硬化症は進行性の動脈壁の疾病であり、脂質沈着及び慢性炎症によりプラークが発達する。大半のプラークは無症候性のままであるが、いくつかは血栓症(不安定)及び破裂が起こりやすく、その結果、心筋梗塞又は心臓発作が起こり得る。血管壁を見るために様々な画像診断法が開発されている(Verjans, 2013; J. of Cardiovasc. Trans. Res. ePub June, 2013)。光干渉断層撮影法(OCT)及び血管内超音波検査(IVUS)などのいくつかの技術がプラークの組成及び安定性に関する情報を与えることができるが、それらは侵襲的な手順を必要とする。別の技術は、プラーク中のマクロファージなどの活発に代謝している細胞によって取り込まれ、陽電子放出断層撮影法(PET)によって検出することができる基質である18F−フルオロデオキシグルコースを利用する。18F−FDG PETは、プラークの炎症をモニタリングするための臨床的有用性を示したが、それはまた多くの組織にも非選択的に取り込まれる可能性がある。動脈硬化性疾患の進行及び不安定プラークの発達を駆り立てる活発な細胞プロセス及び分子プロセスへの洞察を提供するために、新規な分子イメージングツールが必要とされる。高度な炎症を有する及び/又は破裂しがちな病変の検出を支援するツールは、リスクのある患者の同定のための及び新規療法の効力の評価のための価値ある機序を提供するだろう。
発明の要約
本発明は、新規なCX3CR1標的化イメージング剤を提供する。別の態様では、これらのイメージング剤は、動脈硬化性疾患を診断するのに有用である。別の態様では、これらのイメージング剤は、CX3CR1アンタゴニスト治療薬による処置又は動脈硬化性疾患のための他の公知の処置によって恩恵を受けるであろうアテローム性動脈硬化症患者を選択又は層別化するのに有用である。さらなる態様では、これらのイメージング剤は、組織におけるCX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病の診断において有用である。
本発明は、新規なCX3CR1標的化イメージング剤を提供する。別の態様では、これらのイメージング剤は、動脈硬化性疾患を診断するのに有用である。別の態様では、これらのイメージング剤は、CX3CR1アンタゴニスト治療薬による処置又は動脈硬化性疾患のための他の公知の処置によって恩恵を受けるであろうアテローム性動脈硬化症患者を選択又は層別化するのに有用である。さらなる態様では、これらのイメージング剤は、組織におけるCX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病の診断において有用である。
発明の詳細な説明
本発明は、CX3CR1に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドに基づいたイメージング用トレーサーとしても知られるイメージング剤、及び診断用ツールとしてのその使用に関する。イメージング剤は、検出標識に連結されたCX3CR1標的化単一可変ドメインポリペプチドからなる。本発明のイメージング剤を含む単一可変ドメインポリペプチドは好ましくは、本明細書において以後定義されているような、ラクダに由来するVHHドメイン(又は単に「VHH」)であるが、これに限定されない。
本発明は、CX3CR1に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドに基づいたイメージング用トレーサーとしても知られるイメージング剤、及び診断用ツールとしてのその使用に関する。イメージング剤は、検出標識に連結されたCX3CR1標的化単一可変ドメインポリペプチドからなる。本発明のイメージング剤を含む単一可変ドメインポリペプチドは好ましくは、本明細書において以後定義されているような、ラクダに由来するVHHドメイン(又は単に「VHH」)であるが、これに限定されない。
CX3CR1は、Gタンパク質共役膜内在性タンパク質で、ケモカイン受容体ファミリーの一員である。それは、膜内在性タンパク質として産生される、フラクタルカインという独特なリガンドを有する。それはまた、タンパク質分解切断によって循環中へと放出され得る。ヒトにおいて活性の低下したCX3CR1変異体(V249I/T280M)は、低リスクの心臓血管疾患(冠動脈心疾患、脳血管疾患、又は末梢血管疾患)(McDermott, 2001; Circ. Res.89:401)、冠動脈疾患(血管造影による狭窄のエビデンス)(McDermott, 2003; J. Clin. Invest.111:1241)、及び頸動脈閉塞疾患(Ghilardi, 2004; Stroke 35:1276)に関連することが示された。いくつかの独立したマウス遺伝子研究は、アテローム性動脈硬化症に対するCX3CR1欠損症の有益な効果を示した。高脂肪食餌を与えられた2つの独立に由来したCX3CR1−/−apoE−/−マウス系統において、大動脈弓及び胸部大動脈における病変領域の減少、並びにプラークにおける単球/マクロファージ蓄積の減少が見られた(Combadiere, 2003; Circulation, 107:1009, Lesnik, 2003; J. Clin. Invest. 111:333)。
CX3CR1は、動脈硬化プラークの発症及び進行に関連している単球、樹状細胞及びT細胞などの細胞タイプに主に発現される。それは、循環中のヒト中間型単球(CD14+CD16+)及び非古典的な単球(CD14dimCD16+)上に高度に発現されている(Cros, 2010; Immunity 33:375)。血管内OCTによって決定される破裂したプラークのエビデンスを有する不安定狭心症患者において、循環中に増加した数のCD16+CX3CR1+単球が観察された(Ikejima, 2010; Circ. J. 74:337)。同様に、循環中の上昇したCD16+単球レベルは、不安定狭心症患者において多検出器コンピュータ断層撮影法によって測定されるような不安定プラークに相関し(Kashiwagii, 2010; Atherosclerosis 212:71)、CD14+CD16+単球レベルは独立して、待機的冠動脈造影を受けている患者における心血管イベントを予測した(Ragacev, 2012; J. Am. Coll. Cardiol. 60:1512)。免疫組織化学検査によって、CX3CR1はまた、ヒト頸動脈プラークにおいても発現されていることが示され、CX3CR1+細胞数は病変の発生と共に増加した(Stolla, 2012; PLOS One 7:e43572)。CX3CR1は、炎症レベルが上昇したプラークについてのマーカーであるようである。
免疫グロブリン単一可変(VHH)ドメインは、イメージング剤としての使用に十分に適している(De Vos, 2013; Expert Opin. Biol. Ther. 8:1149)。ある種のVHHは、ラクダ一本鎖抗体の抗原結合ドメインに由来する。血液からの急速なクリアランスをもたらすその小さなサイズ(15kDa未満)と、特異的な標的の結合を可能とするその高い親和性のために、バックグラウンドに対する良好なシグナルを用いての、患者への曝露を最小限にする短寿命の放射性同位体の使用を可能とするイメージングを、投与直後に実施することができる。VHHドメインはまた良好な物理化学的特性を有し、そして、様々な画像診断法での使用のために、血中及び標識に必要とされる条件下で安定である。CX3CR1に特異的なVHHドメインは、炎症性又は不安定性プラークを同定する価値ある非侵襲的なイメージングツールを提供し得、かつ、患者の選択、層別化、診断、予後予測、又は新規なアテローム性動脈硬化症療法についての処置の成功のモニタリングに使用され得る。それはまた、組織での上昇したCX3CR1の発現によって特徴付けられる他の疾病におけるインビボでのイメージングのために使用され得る。
特に指定又は定義されていない限り、使用される全ての用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、これは当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al,、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, 「Genes IV」, Oxford University Press, New York, (1990)、及びRoitt et al., 「Immunology」(2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)、並びに、そこに引用された一般的な背景技術について言及する。さらに、特記しない限り、具体的に詳述されていない全ての方法、工程、技術、及び操作を実施することができ、かつそれらは当業者には明らかであろうように、それ自体公知の方法で実施される。例えば、再び、標準的なハンドブック、上記に参照した一般的な背景技術、及び、そこに引用されているさらに他の参考文献も言及する。
特記しない限り、「免疫グロブリン」及び「免疫グロブリン配列」という用語は、(本明細書において、重鎖抗体又は慣用的な4本鎖抗体を指すために使用される)完全サイズの抗体、その個々の鎖、並びに、その全ての部分、ドメイン又はフラグメント(抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばそれぞれVHHドメイン又はVH/VLドメインを含むがこれらに限定されない)の両方を含む一般的な用語として使用される。さらに、本明細書において使用される「配列」という用語(例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「(単一)可変ドメイン配列」、「VHH配列」又は「タンパク質配列」のような用語における)は一般的に、脈絡からより限定された解釈が必要とされない限り、関連アミノ酸配列並びにそれをコードする核酸配列若しくはヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。
本明細書において使用される(ポリペプチド又はタンパク質の)「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分とは独立してその3次構造を保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的には、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性に関与し、かつ、多くの場合、タンパク質の残りの部分及び/又はドメインの機能を消失することなく、他のタンパク質に添加、除去、又は移行され得る。
本明細書において使用される「免疫グロブリンドメイン」という用語は、抗体鎖(例えば、慣用的な4本鎖抗体又は重鎖抗体の鎖)の球状領域、又は、このような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、保存されたジスルフィド結合によって場合により安定化された、2枚のβ−シートに並べられた2層の約7個の逆平行β鎖のサンドイッチからなる、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持することで特徴付けられる。
本明細書において使用される「免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は、当技術分野及び本明細書の下記において、「フレームワーク領域1」又は「FR1」;「フレームワーク領域2」又は「FR2」;「フレームワーク領域3」又は「FR3」;及び「フレームワーク領域4」又は「FR4」とそれぞれ称される、4つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し;これらのフレームワーク領域は、当技術分野及び本明細書の下記において、「相補性決定領域1」又は「CDR1」;「相補性決定領域2」又は「CDR2」;及び「相補性決定領域3」又は「CDR3」とそれぞれ称される、3つの「相補性決定領域」又は「CDR」によって分断されている。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下のように示すことができる:FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4。それは、抗原結合部位を有することによって抗原に対する特異性を抗体に付与する免疫グロブリン可変ドメイン(群)である。
本明細書において使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」及び「単一可変ドメイン」という用語は、さらなる免疫グロブリン可変ドメインと対を形成することなく、抗原のエピトープに特異的に結合することのできる免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味における免疫グロブリン単一可変ドメインの一例は、「ドメイン抗体」、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインVH及びVL(VHドメイン及びVLドメイン)である。免疫グロブリン単一可変ドメインの別の例は、本明細書において以後定義されているような、ラクダ由来の「VHHドメイン」(又は単に「VHH」)である。
上記の定義の観点から、慣用的な4本鎖抗体(例えば、当技術分野において公知であるIgG、IgM、IgA、IgD、又はIgE分子)又はFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、例えばジスルフィドに連結したFv若しくはscFvフラグメント、又はこのような慣用的な4本鎖抗体から導かれたディアボディ(全て当技術分野において公知である)の抗原結合ドメインは通常、免疫グロブリン単一可変ドメインと捉えられないだろう。なぜなら、これらの場合、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は通常、1つの(単一の)免疫グロブリンドメインによってではなく、それぞれの抗原のエピトープに一緒に結合する一対の(会合している)免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖及び重鎖可変ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインのVH−VL対によって起こるからである。
VHH、VHHドメイン、VHH抗体フラグメント、及びVHH抗体としても知られる「VHHドメイン」は当初、「重鎖抗体」(すなわち、「軽鎖の欠失した抗体」;C. Hamers-Casterman et al., 1993; Nature363: 446)の抗原結合免疫グロブリン(可変)ドメインとして記載されている。「VHHドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、慣用的な4本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン(本明細書において「VHドメイン」又は「VHドメイン」と称される)から、及び慣用的な4本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン(本明細書において「VLドメイン」又は「VLドメイン」と称される)から区別するために選択された。VHHドメインは、追加の抗原結合ドメインを有することなく、エピトープに特異的に結合することができる(慣用的な4本鎖抗体におけるVH又はVLドメインとは逆で、慣用的な4本鎖抗体の場合には、エピトープはVHドメインと共にVLドメインによって認識される)。VHHドメインは、単一免疫グロブリンドメインによって形成された小さく、頑強で、効率的な抗原認識単位である。
本発明の脈絡において、VHHドメイン、VHH、VHHドメイン、VHH抗体フラグメント、VHH抗体、並びに「ナノボディ(登録商標)」及び「ナノボディ(登録商標)ドメイン」(「ナノボディ」はAblynx N.V.社;ヘント;ベルギーの商標名である)という用語は同義語として使用され、かつ、免疫グロブリン単一可変ドメイン(構造:FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4を有し、第二の免疫グロブリン可変ドメインの存在を必要とすることなくエピトープに特異的に結合する)を示し、例えば国際公開公報第2009/109635号、図1に定義されているような、いわゆる「特徴的な残基」によってVHドメインから区別される。
VHHドメインのアミノ酸残基は、例えばRiechmann and Muyldermans, 1999; J. Immunol. Methods, 231: 25の図2に示されているようなラクダ由来のVHHドメインに適用されるような、Kabat et al.(「Sequence of proteins of immunological interest」、米国公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベテスダ、MD、出版番号91)によって示されるVHドメインについての一般的な番号付けに従って番号付けされる。この番号付けによると、
−FR1は、1〜30位のアミノ酸残基を含み、
−CDR1は、31〜35位のアミノ酸残基を含み、
−FR2は、36〜49位のアミノ酸を含み、
−CDR2は、50〜65位のアミノ酸残基を含み、
−FR3は、66〜94位のアミノ酸残基を含み、
−CDR3は、95〜102位のアミノ酸残基を含み、及び
−FR4は、103〜113位のアミノ酸残基を含む。
−FR1は、1〜30位のアミノ酸残基を含み、
−CDR1は、31〜35位のアミノ酸残基を含み、
−FR2は、36〜49位のアミノ酸を含み、
−CDR2は、50〜65位のアミノ酸残基を含み、
−FR3は、66〜94位のアミノ酸残基を含み、
−CDR3は、95〜102位のアミノ酸残基を含み、及び
−FR4は、103〜113位のアミノ酸残基を含む。
しかし、VHドメイン及びVHHドメインについて当技術分野において周知であるように、各CDRにおけるアミノ酸残基の総数は変更されてもよく、Kabat番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数に対応しなくてもよい(すなわち、Kabat番号付けによる1つ以上の位置は実際の配列において占有されていなくてもよいか、又は、実際の配列は、Kabat番号付けによって許容される数よりも多いアミノ酸残基を含んでいてもよい)。このことは、一般的に、Kabatによる番号付けは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応していても対応していなくてもよいことを意味する。
VHドメインのアミノ酸残基を番号付けするための代替的な方法(この方法を、VHHドメインにも同じように適用することができる)は当技術分野において公知である。しかし、本明細書、特許請求の範囲、及び図面において、Kabatによるかつ上記のようにVHHドメインに適用された番号付けが、特記しない限り行なわれるだろう。
VHHドメイン中のアミノ酸残基の総数は通常、110〜120、しばしば112〜115の範囲内である。しかし、より短い及びより長い配列も、本明細書に記載の目的に適切であり得ることが認識されるべきである。
CDR領域の決定はまた、様々な方法に従って実施され得る。KabatによるCDRの決定において、VHHのFR1は、1〜30位のアミノ酸残基を含み、VHHのCDR1は31〜35位のアミノ酸残基を含み、VHHのFR2は36〜49位のアミノ酸を含み、VHHのCDR2は50〜65位のアミノ酸残基を含み、VHHのFR3は66〜94位のアミノ酸残基を含み、VHHのCDR3は95〜102位のアミノ酸残基を含み、VHHのFR4は103〜113位のアミノ酸残基を含む。
しかし、本明細書において、CDR配列は、Kontermann及びDubel(Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010)に従って決定された。この方法によると、FR1は、1〜25位のアミノ酸残基を含み、CDR1は26〜35位のアミノ酸残基を含み、FR2は36〜49位のアミノ酸を含み、CDR2は50〜58位のアミノ酸残基を含み、FR3は59〜94位のアミノ酸残基を含み、CDR3は95〜102位のアミノ酸残基を含み、FR4は103〜113位のアミノ酸残基を含む。
VHHドメイン及びそれを含有するポリペプチドのさらなる構造的特徴及び機能的特性を以下のように要約することができる:
(軽鎖可変ドメインが存在しなくても、及び軽鎖可変ドメインと全く相互作用しなくても、抗原に機能的に結合するように自然界で「設計」された)VHHドメインは、単一の、比較的小さい、機能的な抗原結合構造単位、ドメイン、又はポリペプチドとして機能することができる。これにより、単独では一般的に、単一抗原結合タンパク質又は免疫グロブリン単一可変ドメインとして実際的な適用には適しておらず、何らかの形又は別の形で合体させて、機能的な抗原結合単位(例えば、Fabフラグメントなどの慣用的な抗体フラグメント;VLドメインに共有結合で連結されたVHドメインからなるscFvにおけるような)をもたらす必要がある、慣用的な4本鎖抗体のVHドメイン及びVLドメインからVHHドメインが区別される。
これらの独特な特性のために、単独で又はより大きなポリペプチドの一部としてのいずれかでの、VHHドメインの使用は、慣用的なVH及びVLドメイン、scFv又は慣用的な抗体フラグメント(例えばFab又はF(ab’)2フラグメント)の使用を上回る多くの有意な利点を与える:
−高い親和性及び高い選択性で抗原に結合するために、僅か1つのドメインだけが必要とされるので、2つの別々のドメインが存在することは必要なく、また、これらの2つのドメインが正しい空間的コンフォメーション及び立体配置で存在することを確保する(すなわち、scFvのように、特別に設計されたリンカーの使用を通して)必要もない;
−VHHドメインは、単一の遺伝子から発現させることができ、翻訳後折り畳み又は修飾を必要としない;
−VHHドメインは、(本明細書においてさらに考察されているように)多価及び多重特異的フォーマットへと容易に工学操作することができる;
−VHHドメインは溶解度が高く、(Ward et al., 1989; Nature, 341: 544によって記載されたマウス由来抗原結合ドメインのように)凝集する傾向を有さない;
−VHHドメインは、熱、pH、プロテアーゼ及び他の変性剤、又は条件に対して非常に安定であり、したがって、冷凍設備を使用することなく調製、保存、又は輸送され得、費用、時間、及び環境保全をもたらす;
−VHHドメインは、生産に必要とされる規模でさえ、調製が容易で比較的安価である。例えば、VHHドメイン及びそれを含有するポリペプチドは、(例えば以下にさらに記載されているような)微生物発酵を使用して生成することができ、例えば慣用的な抗体フラグメントのように、哺乳動物発現系の使用を必要としない;
−VHHドメインは、慣用的な4本鎖抗体及びその抗原結合フラグメントと比較して比較的小さく(約15kDa、すなわち慣用的なIgGより10倍小さい)、それ故、
――組織への(より)高い透過性を示し、かつ
――このような慣用的な4本鎖抗体及びその抗原結合フラグメントよりも高用量で投与することができ;
−VHHドメインは、いわゆる空洞結合特性を示し得(とりわけ、慣用的なVHドメインと比較して、その伸張したCDR3ループに因り)、それ故、慣用的な4本鎖抗体及び抗原結合フラグメントが近づけない標的及びエピトープにも近づくことができる。
−高い親和性及び高い選択性で抗原に結合するために、僅か1つのドメインだけが必要とされるので、2つの別々のドメインが存在することは必要なく、また、これらの2つのドメインが正しい空間的コンフォメーション及び立体配置で存在することを確保する(すなわち、scFvのように、特別に設計されたリンカーの使用を通して)必要もない;
−VHHドメインは、単一の遺伝子から発現させることができ、翻訳後折り畳み又は修飾を必要としない;
−VHHドメインは、(本明細書においてさらに考察されているように)多価及び多重特異的フォーマットへと容易に工学操作することができる;
−VHHドメインは溶解度が高く、(Ward et al., 1989; Nature, 341: 544によって記載されたマウス由来抗原結合ドメインのように)凝集する傾向を有さない;
−VHHドメインは、熱、pH、プロテアーゼ及び他の変性剤、又は条件に対して非常に安定であり、したがって、冷凍設備を使用することなく調製、保存、又は輸送され得、費用、時間、及び環境保全をもたらす;
−VHHドメインは、生産に必要とされる規模でさえ、調製が容易で比較的安価である。例えば、VHHドメイン及びそれを含有するポリペプチドは、(例えば以下にさらに記載されているような)微生物発酵を使用して生成することができ、例えば慣用的な抗体フラグメントのように、哺乳動物発現系の使用を必要としない;
−VHHドメインは、慣用的な4本鎖抗体及びその抗原結合フラグメントと比較して比較的小さく(約15kDa、すなわち慣用的なIgGより10倍小さい)、それ故、
――組織への(より)高い透過性を示し、かつ
――このような慣用的な4本鎖抗体及びその抗原結合フラグメントよりも高用量で投与することができ;
−VHHドメインは、いわゆる空洞結合特性を示し得(とりわけ、慣用的なVHドメインと比較して、その伸張したCDR3ループに因り)、それ故、慣用的な4本鎖抗体及び抗原結合フラグメントが近づけない標的及びエピトープにも近づくことができる。
特異的抗原又はエピトープに結合するVHHドメインを得る方法は以前に、例えば、国際公開公報第2006/040153号及び第2006/122786号に記載されている。これもまたそこに詳細に記載されているように、ラクダに由来するVHHドメインは、元来のVHH配列のアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸残基を、ヒト由来の慣用的な4本鎖抗体由来のVHドメイン中の対応する位置(群)に存在する1つ以上のアミノ酸残基によって置換することによって「ヒト化」することができる。ヒト化VHHドメインは、1つ以上の部分的又は完全なヒトフレームワーク領域配列を含有し得、さらにより特定の実施態様では、場合によりJH5などのJH配列と合体させた、DP−29、DP−47、DP−51、又はその一部に由来するヒトフレームワーク領域配列を含有し得る。
同義語として使用され得る「エピトープ」及び「抗原性決定基」という用語は、本発明の慣用的な抗体又はポリペプチドなどの抗原結合分子によって、より特定すると該分子の抗原結合部位によって認識される、ポリペプチドなどの巨大分子の一部を指す。エピトープは、免疫グロブリンに結合する最小部位を定義し、したがって、免疫グロブリンに特異的な標的を示す。
特定のエピトープ、抗原又はタンパク質(又は少なくともその一部分、そのフラグメント、又はそのエピトープ)に「結合する」又は「特異的に結合する」ことができる、「標的化」する又は「に対して標的化する」、「に対する親和性を有する」及び/又は「に対する特異性を有する」、ポリペプチド(例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は一般的には抗原結合分子若しくはそのフラグメント)は、該エピトープ、抗原、又はタンパク質に「対する」又は「対して指向される」と言われるか、あるいは、このようなエピトープ、抗原又はタンパク質に対して「結合する」分子であるか、あるいは、「抗」−エピトープ、「抗」−抗原、又は「抗」−タンパク質(例えば抗CX3CR1)と言われる。
一般的に、「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質(例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド)が結合することのできる、様々な種類の抗原又はエピトープの数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、その親和性及び/又は結合力に基づいて決定することができる。抗原と抗原結合タンパク質との解離についての平衡定数(KD)によって示される親和性は、エピトープと抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり:KDの数値が低いほど、エピトープと抗原結合分子との間の結合強度は強くなる(あるいは、親和性はまた、親和性定数(KA)として表現され得、これは1/KDである)。当業者には(例えば、本明細書のさらなる開示に基づいて)明らかであろうとおり、親和性は、それ自体公知の方法で、関心対象の具体的な抗原に依存して決定することができる。結合力は、抗原結合分子(例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド)と関連抗原との間の結合の強度の尺度である。結合力は、エピトープと、抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、及び、抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。
アミノ酸残基は、一般的に当技術分野において公知でありかつ認められているように、標準的な3文字又は1文字アミノ酸コードに従って示されるだろう。2つのアミノ酸配列を比較する場合、「アミノ酸の差異」という用語は、第二配列と比較して、基準配列の位置における指定された番号のアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指す。置換(群)の場合、このような置換(群)は好ましくは、保存的アミノ酸の置換(群)であり、これは、アミノ酸残基が、類似した化学的構造で、該ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性に対して殆ど又は全く影響を及ぼさない、別のアミノ酸残基で置換されることを意味する。このような保存的アミノ酸置換は、当技術分野において、例えば国際公開公報第98/49185号から周知であり、保存的アミノ酸置換は好ましくは、以下の群(i)〜(v)内の1つのアミノ酸が、同じ群:(i)小さな脂肪族であるか非極性であるか又は僅かに極性である残基:Ala、Ser、Thr、Pro及びGly;(ii)極性で負に荷電した残基及びその(荷電していない)アミド:Asp、Asn、Glu及びGln;(iii)極性で正に荷電した残基:His、Arg及びLys;(iv)大きな脂肪族で非極性の残基:Met、Leu、Ile、Val、及びCys;並びに(v)芳香族残基:Phe、Tyr及びTrp内の別のアミノ酸残基によって置換されている、置換である。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下の通りである:
AlaからGly又はSerへ;
ArgからLysへ;
AsnからGln又はHisへ:
AspからGluへ;
CysからSerへ;
GlnからAsnへ;
GlnからAspへ;
GlyからAla又はProへ;
HisからAsn又はGlnへ;
IleからLeu又はValへ;
LeuからIle又はValへ;
LysからArgへ、Glnへ、又はGluへ;
MetからLeuへ、Tyrへ、又はIleへ;
PheからMetへ、Leuへ、又はTyrへ;
SerからThrへ;
ThrからSerへ;
TrpからTyrへ;
TyrからTrp又はPheへ;
ValからIle又はLeuへ。
AlaからGly又はSerへ;
ArgからLysへ;
AsnからGln又はHisへ:
AspからGluへ;
CysからSerへ;
GlnからAsnへ;
GlnからAspへ;
GlyからAla又はProへ;
HisからAsn又はGlnへ;
IleからLeu又はValへ;
LeuからIle又はValへ;
LysからArgへ、Glnへ、又はGluへ;
MetからLeuへ、Tyrへ、又はIleへ;
PheからMetへ、Leuへ、又はTyrへ;
SerからThrへ;
ThrからSerへ;
TrpからTyrへ;
TyrからTrp又はPheへ;
ValからIle又はLeuへ。
例えば2つの免疫グロブリン単一可変ドメイン配列間の「配列同一率」は、これらの2つの配列間で同一であるアミノ酸の比率を示す。それは、国際公開公報第08/020079号の49頁及び50頁の段落f)に記載のように計算又は決定され得る。「配列同一率」は、同一であるか又は保存的アミノ酸置換を示すかのいずれかである、アミノ酸の比率を示す。
標的特異性
本発明のCX3CR1標的化ポリペプチドは、ヒトCX3CR1に対する特異性を有する。したがって、CX3CR1標的化ポリペプチド及び検出標識を含む本発明のイメージング剤は好ましくはヒトCX3CR1(配列番号230)に結合する。
本発明のCX3CR1標的化ポリペプチドは、ヒトCX3CR1に対する特異性を有する。したがって、CX3CR1標的化ポリペプチド及び検出標識を含む本発明のイメージング剤は好ましくはヒトCX3CR1(配列番号230)に結合する。
本明細書に記載のイメージング剤のCX3CR1標的化ポリペプチド部分は、VHHドメインから構成される。代表的なVHHドメインは、表1、2、3(それぞれファミリー101、9、及び13の代表的なポリペプチド)及び4(ファミリー101の最適化変異体の代表的なポリペプチド)に示されたCDR配列を有する。最適化変異体は、ヒト化されている、並びに/又は、安定性、効力、製造可能性、及び/若しくはヒトフレームワーク領域に対する類似性のために最適化されている。
*CDR配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering第2巻に従って決定された。表中の配列番号(SEQ)は、本出願の配列表中の配列を指す。
*CDR配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering第2巻に従って決定された。表中の配列番号(SEQ)は、本出願の配列表中の配列を指す。
*CDR配列は、Konetermann & Dubel (Eds.), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010によるAntibody Engineering第2巻に従って決定された。表中の配列番号(SEQ)は、本出願の配列表中の配列を指す。
本明細書に記載のイメージング剤のCX3CR1標的化ポリペプチド部分を含み得るVHHドメインの代表的な配列を以下の表5及び6に示す:
本明細書に記載のイメージング剤のCX3CR1標的化ポリペプチド部分を含み得る、CX3CR1に結合する二価VHHドメインの代表的な配列を以下の表7に示す。配列に見られるように、2つのVHHドメインはGly/Serリンカーによって接続されている:
イメージング剤のCX3CR1標的化部分を含む、VHHドメイン又は二価VHHドメインは、当技術分野において公知の方法によってさらに改変され、本明細書の以下に記載のとおり検出標識への連結を可能とし得る。例えば、トリカルボニル法(下記)による99mTc検出標識への連結を可能とするために、ヘキサヒスチジン又はmyc−ヘキサヒスチジンタグを、所望のVHHドメイン又は二価VHHドメインのC末端に付加し得る。このような改変された一価又は二価のVHHドメインの代表例を以下の表8に示す。
本明細書に記載のイメージング剤のCX3CR1標的化ポリペプチド成分は、当技術分野において公知の方法によって調製され得、例えば、参照により本明細書に組み入れられた米国出願番号第13/775,307号を参照されたい。このような方法は一般的に以下の工程を含む:
−本発明のポリペプチドの発現を可能とする条件下で所望のポリペプチドをコードすることのできる核酸を含む宿主細胞を培養する工程;及び
−宿主細胞によって発現されたポリペプチドを培養液から回収又は単離する工程;及び
−場合により本発明のポリペプチドをさらに精製及び/又は改変及び/又は製剤化する工程。
−本発明のポリペプチドの発現を可能とする条件下で所望のポリペプチドをコードすることのできる核酸を含む宿主細胞を培養する工程;及び
−宿主細胞によって発現されたポリペプチドを培養液から回収又は単離する工程;及び
−場合により本発明のポリペプチドをさらに精製及び/又は改変及び/又は製剤化する工程。
本発明の1つの態様では、これらのイメージング剤を、例えば動脈硬化性疾患を診断するために、アテローム性動脈硬化症の非侵襲的なイメージングに使用し得る。別の態様では、本発明のイメージング剤は、CX3CR1アンタゴニスト治療の診断に用いる用品として有用であろう。すなわち、それらは患者の層別化のために使用され得、すなわち、CX3CR1アンタゴニスト治療に好ましく応答する可能性のあるアテローム性動脈硬化症患者を予め選択するために使用され得る。イメージング剤はまた、動脈硬化病変の進行又は減退を評価することによってあらゆる治療薬を用いての処置の効果をモニタリングするために使用され得る。
本発明の別の態様では、イメージング剤は、CX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる他の疾病を診断するための非侵襲的イメージングに使用され得る。CX3CR1の上昇した発現はまた、複数の炎症性疾患状態、又は、容態、例えば、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、血管炎、例えばヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病、肺疾患、例えばCOPD、喘息、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌にも関連していることが知られている。
単一可変ドメインポリペプチド、例えばVHHドメインは、イメージング剤に使用するための好ましい特性を有する。それらは、その標的に対する高い親和性及び特異性、並びに、良好な物理化学的特性、例えば血清中での安定性を有する。それらは、糸球体濾過の腎のカットオフ値より低い分子量を有し、それ故、急速にクリアランスされ、特異的結合が起こる組織のインビボでのイメージングが可能となる。1つの実施態様では、イメージング剤を含むCX3CR1に結合する単一可変ドメインは、一価VHHドメインである。別の実施態様では、それは二価であり、リンカーペプチドによって共有結合で連結された、同一であっても異なっていてもよい、2つのVHHドメインを含む。リンカーペプチドは、天然の配列であっても非天然の配列であってもよいが、好ましくは非免疫原性である。リンカー配列の非限定的な例は、様々な長さのGly/Serリンカー、例えば(glyxsery)zリンカー、例えば(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3、及び(gly3ser2)3である。
イメージング剤としての使用のために、単一可変ドメインポリペプチドは検出標識に連結されている。様々な検出標識及び連結法が当技術分野において公知である。例えば、検出標識の非限定的な例としては、蛍光、化学発光、生物発光、リン光の標識、常磁性標識、放射性同位体、又は放射性トレーサー標識、微小気泡、又はイメージング用色素が挙げられ得る。検出標識は、所望の用途及びイメージング適用に従って選択され得る。
様々なイメージング技術が当技術分野において周知であり、かつ現在使用されている。使用され得るイメージング適用又は技術の非限定的な例としては以下が挙げられ得る:
単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)。SPECTイメージングのための検出標識に使用され得る放射性同位体の非限定的な例としては、99mTc、111In、123I、201Tl、及び133Xeが挙げられる。
陽電子放出断層撮影法(PET)。PETイメージングのための検出標識に使用され得る放射性同位体の非限定的な例としては、11C、64Cu、18F、68Ga、13N、15O、82Rb、124I、及び89Zrが挙げられる。
近赤外線蛍光イメージング(NIR又はNIRF)。NIRFのための検出標識に使用され得るイメージング用色素の非限定的な例としては、Cy5.5、Alexa680、Dylight680、Dylight800及びIRDye800CWが挙げられる。
超音波イメージング。超音波イメージングに適した検出標識の非限定的な例は微小気泡である。
磁気共鳴イメージング(MRI)。MRIイメージングに適した常磁性体の非限定的な例としては、酸化鉄又は炭素でコーティングされた鉄−コバルトナノ粒子及びガドリニウムキレートが挙げられる。
標的化抗体フラグメント、例えばCX3CR1標的化単一ドメインポリペプチドに検出標識を連結させるための方法は当技術分野において周知である。検出標識を、別の連結用分子を介して、直接的に又は間接的に、標的化ポリペプチドに連結させ得る。検出標識は、例えば、アミノ酸とのアミド結合の形成によって共有結合的に、又は、例えば連結用のキレート分子とのイオン性相互作用によって非共有結合的に接続され得る。
共有結合的な連結法の非限定的な例としては以下が挙げられる:
トリカルボニル法による99mTcの連結。99mTc−トリカルボニルをヘキサヒスチジンでタグ化された標的化ポリペプチドと反応させ、その後、精製する(例えば、V. Cortez-Retamozo, 2008; Curr Radiopharm 1:37参照)。
トリカルボニル法による99mTcの連結。99mTc−トリカルボニルをヘキサヒスチジンでタグ化された標的化ポリペプチドと反応させ、その後、精製する(例えば、V. Cortez-Retamozo, 2008; Curr Radiopharm 1:37参照)。
NHS−エステル法によるIRDye800CWの連結。IRDye800CW N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを標的化ポリペプチドと反応させ、その後、精製する(例えば、S. Oliveira, 2012; Mol. Imaging, 7:254-264参照)。
ビオチン−ストレプトアビジン橋による微小気泡の連結。標的化ポリペプチドをビオチニル化する。ビオチニル化標的化ポリペプチドをビオチン−ストレプトアビジン橋によってビオチニル化微小気泡に結合させる(例えば、S. Hernot, 2012; J. Control. Release 158:346-353参照)。
キレート連結法の非限定的な例としては以下が挙げられる:
標的化ポリペプチドをDf−Bz−NCSと反応させキレートリンカーを形成する。その後、改変された標的化ポリペプチドを68Gaを用いて放射性標識する(例えば、M.J.W.D. Vosjan, 2011; Eur J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 38:753-763参照)。
標的化ポリペプチドをS−2−(4−イソチオシアネートベンジル)−1,4,7−トリアザシクロノナン―1,4,7−トリ酢酸(p−SCN−Bn−NOTA)とコンジュゲートさせ、その後、68Gaを用いて放射標識する(例えば、C. Xavier, 2013; J. Nucl. Med., 54: 776-784参照)。
インビボでのイメージングに使用するために、本発明のイメージング剤は、(i)本発明の少なくとも1つのイメージング剤、及び(ii)少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、補助剤、及び/又は安定化剤を含む、医薬調製物として製剤化され得る。「薬学的に許容される」とは、それぞれの材料が、個体に投与された場合に、全く生物学的作用又は他の望ましくない作用を及ぼさず、かつ、それが含まれている医薬組成物(例えばイメージング剤)の他のどの成分とも有害な様式で相互作用しないことを意味する。具体例は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第18巻、Mack Publishing Company、米国(1990)などの標準的なハンドブックに見られ得る。例えば、本発明のイメージング剤は、慣用的な抗体及び抗体フラグメント及び他の薬学的に活性なタンパク質についてそれ自体公知の任意の方法で製剤化及び投与され得る。したがって、さらなる実施態様によると、本発明は、本発明の少なくとも1つのイメージング剤及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、補助剤、及び/又は安定化剤を含有する、医薬組成物又は調製物に関する。
このような製剤は、非経口投与(例えば、静脈内、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、陰茎海綿体内、又は腹腔内注射、又は静脈内注入による)に適した剤形であり得る。このような適した剤形(これは投与法に応じて、固体、半固体、又は液体であり得る)並びにその調製に使用するための方法及び担体は、当業者には明らかであろう。好ましい製剤及び投与経路は当業者には公知であり、一部には使用されるイメージング法及び調べる組織に依存するだろう。
非経口投与のための調製物は、例えば、活性成分を含み、かつ、場合によりさらなる溶解工程又は希釈工程の後の注入又は注射に適した、無菌溶液、懸濁液、分散液、乳液、又は粉末であり得る。このような調製物のために適した担体又は希釈剤としては、例えば、滅菌水及び薬学的に許容される水性緩衝液及び溶液、例えば生理的リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及びハンク溶液;水油;グリセロール;エタノール;グリコール、例えばプロピレングリコール、並びに、鉱油、動物油、及び植物油、例えばピーナッツ油、大豆油、並びにその適切な混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
インビボでのイメージングに使用するために、イメージング剤を含有する検出可能な量の組成物を被験者に投与する。検出可能な量は、イメージング剤、投与経路、イメージング法、並びに検査する被験者及び組織をはじめとする多くの因子に依存して変化し得、そしてこれは当業者によって決定され得る。
本発明は、
1)本発明のイメージング剤を被験者に投与する工程;及び
2)検査する脈管構造に結合したイメージング剤の存在を検出する工程
を含む、インビボでCX3CR1を含有する動脈硬化プラークを検出するための方法を提供し、結合したイメージング剤の存在は、動脈硬化プラークの存在を示す。
1)本発明のイメージング剤を被験者に投与する工程;及び
2)検査する脈管構造に結合したイメージング剤の存在を検出する工程
を含む、インビボでCX3CR1を含有する動脈硬化プラークを検出するための方法を提供し、結合したイメージング剤の存在は、動脈硬化プラークの存在を示す。
動脈硬化プラークを検出するためにインビボでのイメージングによって検査され得る脈管構造としては、例えば、頸動脈、冠動脈、大腿動脈、腹部動脈、及び胸部動脈が挙げられる。
本発明はまた、
1)動脈硬化プラークを含有すると疑われる組織の試料を準備する工程、
2)該組織を本発明のイメージング剤と接触させる工程;
3)結合していないイメージング剤を除去する工程;及び
4)試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、動脈硬化性疾患のエクスビボでの検出のための方法を提供し、結合したイメージング剤の存在は、動脈硬化プラークの存在を示す。
1)動脈硬化プラークを含有すると疑われる組織の試料を準備する工程、
2)該組織を本発明のイメージング剤と接触させる工程;
3)結合していないイメージング剤を除去する工程;及び
4)試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、動脈硬化性疾患のエクスビボでの検出のための方法を提供し、結合したイメージング剤の存在は、動脈硬化プラークの存在を示す。
さらなる態様では、本発明は、以下を提供する:
実施態様1:検出標識に連結されたCX3CR1標的化ポリペプチドを含むイメージング剤。
実施態様2:CX3CR1標的化ポリペプチドが免疫グロブリン単一可変ドメインである、実施態様1記載のイメージング剤。
実施態様3:CX3CR1標的化ポリペプチドがVHHドメインである、実施態様1又は2記載のイメージング剤。
実施態様4:CX3CR1標的化ポリペプチドが
−それぞれ、配列番号141、162及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、163及び187;又は
−それぞれ、配列番号141、164及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、166及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、167及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、167及び189;又は
−それぞれ、配列番号141、168及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、168及び187;又は
−それぞれ、配列番号141、169及び190;又は
−それぞれ、配列番号141、170及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、171及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、174及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、175及び187;又は
−それぞれ、配列番号142、165及び188;又は
−それぞれ、配列番号142、173及び188;又は
−それぞれ、配列番号143、164及び186;又は
−それぞれ、配列番号144、172及び187;又は
−それぞれ、配列番号145、172及び187;又は
−それぞれ、配列番号141、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、215及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、216及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、217及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、218及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、219及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、220及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、221及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号146、176及び191;又は
−それぞれ、配列番号146、177及び191;又は
−それぞれ、配列番号147、178及び192;又は
−それぞれ、配列番号147、179及び192;又は
−それぞれ、配列番号147、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号148、179及び193;又は
−それぞれ、配列番号149、179及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、180及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、181及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、183及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、185及び192;又は
−それぞれ、配列番号150、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号150、182及び194;又は
−それぞれ、配列番号151、179及び193;又は
−それぞれ、配列番号151、182及び194;又は
−それぞれ、配列番号151、184及び196;又は
−それぞれ、配列番号152、179及び195;又は
−それぞれ、配列番号153、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号154、182及び194;又は
−それぞれ、配列番号155、179及び195;又は
−それぞれ、配列番号156、181及び192;又は
−それぞれ、配列番号157、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号158、179及び192;又は
−それぞれ、配列番号159、178及び192;又は
−それぞれ、配列番号160、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号161、179及び194
から選択された、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む、実施態様1〜3のいずれか1つに記載のイメージング剤。
−それぞれ、配列番号141、162及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、163及び187;又は
−それぞれ、配列番号141、164及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、166及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、167及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、167及び189;又は
−それぞれ、配列番号141、168及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、168及び187;又は
−それぞれ、配列番号141、169及び190;又は
−それぞれ、配列番号141、170及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、171及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、174及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、175及び187;又は
−それぞれ、配列番号142、165及び188;又は
−それぞれ、配列番号142、173及び188;又は
−それぞれ、配列番号143、164及び186;又は
−それぞれ、配列番号144、172及び187;又は
−それぞれ、配列番号145、172及び187;又は
−それぞれ、配列番号141、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、215及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、216及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、217及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、218及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、219及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、220及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、221及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号146、176及び191;又は
−それぞれ、配列番号146、177及び191;又は
−それぞれ、配列番号147、178及び192;又は
−それぞれ、配列番号147、179及び192;又は
−それぞれ、配列番号147、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号148、179及び193;又は
−それぞれ、配列番号149、179及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、180及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、181及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、183及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、185及び192;又は
−それぞれ、配列番号150、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号150、182及び194;又は
−それぞれ、配列番号151、179及び193;又は
−それぞれ、配列番号151、182及び194;又は
−それぞれ、配列番号151、184及び196;又は
−それぞれ、配列番号152、179及び195;又は
−それぞれ、配列番号153、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号154、182及び194;又は
−それぞれ、配列番号155、179及び195;又は
−それぞれ、配列番号156、181及び192;又は
−それぞれ、配列番号157、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号158、179及び192;又は
−それぞれ、配列番号159、178及び192;又は
−それぞれ、配列番号160、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号161、179及び194
から選択された、CDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む、実施態様1〜3のいずれか1つに記載のイメージング剤。
実施態様5:CX3CR1標的化ポリペプチドが、
−それぞれ、配列番号141、162及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、215及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、216及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、217及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、218及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、219及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、220及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、221及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号147、178及び192;又は
−それぞれ、配列番号146、176及び191
から選択されたCDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む、実施態様1〜4のいずれか1つに記載のイメージング剤。
−それぞれ、配列番号141、162及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、215及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、216及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、217及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、218及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、219及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、220及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、221及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号147、178及び192;又は
−それぞれ、配列番号146、176及び191
から選択されたCDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む、実施態様1〜4のいずれか1つに記載のイメージング剤。
実施態様6:CX3CR1標的化ポリペプチドが、配列番号1〜140又は197〜202のいずれか1つから選択された配列を有するVHHドメインである、実施態様1〜3のいずれか1つに記載のイメージング剤。
実施態様7:CX3CR1標的化ポリペプチドが、配列番号1、11、49、53、121〜140、又は197〜202のいずれか1つから選択された配列を有するVHHドメインである、実施態様6記載のイメージング剤。
実施態様8:CX3CR1標的化ポリペプチドが二価であり、リンカーペプチドによって共有結合で連結された同一であっても異なっていてもよい2つのVHHドメインを含み、VHHドメインの配列は、配列番号203〜212、222又は223のいずれか1つ
から選択される、実施態様1又は2記載のイメージング剤。
から選択される、実施態様1又は2記載のイメージング剤。
実施態様9:二価CX3CR1標的化ポリペプチド配列が、配列番号208、222又は223のいずれか1つから選択される、実施態様1、2又は8のいずれか1つに記載のイメージング剤。
実施態様10:検出標識が、放射性同位体、イメージング用色素、常磁性体、又は微小気泡から選択される、実施態様1〜9のいずれか1つに記載のイメージング剤。
実施態様11:検出標識が放射性同位体である、実施態様1〜10のいずれか1つに記載のイメージング剤。
実施態様12:検出標識が、99mTc、111In、123I、201Tl、133Xe、11C、64Cu、18F、68Ga、13N、15O、82Rb、124I、及び89Zrから選択される、実施態様1〜11のいずれか1つに記載のイメージング剤。
実施態様13:検出標識が99mTc及び68Gaから選択される、実施態様1〜12のいずれか1つに記載のイメージング剤。
実施態様14:CX3CR1標的化ポリペプチドが、配列番号224、225、226、227又は228のいずれか1つから選択されたVHHドメインと、CX3CR1への結合に関して競合する免疫グロブリンである、実施態様1記載のイメージング剤。
実施態様15:a)実施態様1〜14のいずれか1つに記載のイメージング剤を投与する工程、
b)イメージング剤の結合を検出する工程
を含む、被験者におけるCX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をインビボで診断するための方法であって、前記イメージング剤は、非罹患組織よりも検出可能なより高いレベルで罹患組織のCX3CR1に特異的に結合し、観察された結合は該疾病の指標となる。
b)イメージング剤の結合を検出する工程
を含む、被験者におけるCX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をインビボで診断するための方法であって、前記イメージング剤は、非罹患組織よりも検出可能なより高いレベルで罹患組織のCX3CR1に特異的に結合し、観察された結合は該疾病の指標となる。
実施態様16:被験者におけるCX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をインビボで診断するための方法であって、該方法は、
a)被験者に、実施態様1〜14のいずれかに記載のイメージング剤を投与する工程;及び
b)被験者の非罹患組織と比較して、罹患組織においてより高いレベルのイメージング剤の結合を検出する工程を含む。
a)被験者に、実施態様1〜14のいずれかに記載のイメージング剤を投与する工程;及び
b)被験者の非罹患組織と比較して、罹患組織においてより高いレベルのイメージング剤の結合を検出する工程を含む。
実施態様17:前記疾病が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病、COPD、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌から選択される、実施態様15又は16記載の方法。
実施態様18:該疾病がアテローム性動脈硬化症である、実施態様15〜17のいずれか1つに記載の方法。
実施態様19:イメージング剤の結合を検出するための方法が、
a)単一光子放射型コンピュータ断層撮影法;
b)陽電子放出断層撮影法;
c)近赤外線蛍光イメージング;
d)超音波イメージング;及び
e)磁気共鳴イメージング
から選択される、実施態様15〜18のいずれか1つに記載の方法。
a)単一光子放射型コンピュータ断層撮影法;
b)陽電子放出断層撮影法;
c)近赤外線蛍光イメージング;
d)超音波イメージング;及び
e)磁気共鳴イメージング
から選択される、実施態様15〜18のいずれか1つに記載の方法。
実施態様20:イメージング剤の結合を検出するための方法が陽電子放出断層撮影法である、実施態様15〜19のいずれか1つに記載の方法。
実施態様21:被験者がヒトである、実施態様15〜20のいずれか1つに記載の方法。
実施態様22:1)被験者から疾病に罹患していることが疑われる組織を、実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤と接触させる工程;
2)結合していないイメージング剤を除去する工程;及び
3)試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、被験者におけるCX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をエクスビボで診断するための方法であって、
イメージング剤は、非罹患組織よりも検出可能なより高いレベルで罹患組織のCX3CR1に特異的に結合し、観察された結合はCX3CR1により媒介される疾病の指標となる。
2)結合していないイメージング剤を除去する工程;及び
3)試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、被験者におけるCX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をエクスビボで診断するための方法であって、
イメージング剤は、非罹患組織よりも検出可能なより高いレベルで罹患組織のCX3CR1に特異的に結合し、観察された結合はCX3CR1により媒介される疾病の指標となる。
実施態様23:1)被験者の組織試料を、実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤と接触させる工程;及び
2)試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病をエクスビボで診断するための方法。
2)試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病をエクスビボで診断するための方法。
実施態様24:a)実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤を投与する工程;
b)イメージング剤の結合を検出し、
イメージング剤が、非罹患組織よりも検出可能なより高いレベルで罹患組織のCX3CR1に特異的に結合するならば、該疾病に対して有効であることが知られている治療剤の治療有効量を用いて患者を処置する工程
を含む、CX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病を患う患者を同定及び処置するための方法。
b)イメージング剤の結合を検出し、
イメージング剤が、非罹患組織よりも検出可能なより高いレベルで罹患組織のCX3CR1に特異的に結合するならば、該疾病に対して有効であることが知られている治療剤の治療有効量を用いて患者を処置する工程
を含む、CX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病を患う患者を同定及び処置するための方法。
実施態様25:a)非罹患組織と比較して、罹患組織において、実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤のより高いレベルの結合を有するとして患者を同定する工程;
b)治療剤を患者に投与する工程
を含む、CX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病を有する患者を処置するための方法。
b)治療剤を患者に投与する工程
を含む、CX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病を有する患者を処置するための方法。
実施態様26:該疾病が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病、COPD、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌から選択される、実施態様24又は25記載の方法。
実施態様27:該疾病がアテローム性動脈硬化症である、実施態様25又は26記載の方法。
実施態様28:有効な治療剤がCX3CR1アンタゴニストである、実施態様24〜27のいずれか記載の方法。
実施態様29:a)CX3CR1標的化ポリペプチドの作製、
b)検出標識の結合、及び
c)場合によりさらなる賦形剤の混合
の工程を含む、実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤の製造法。
b)検出標識の結合、及び
c)場合によりさらなる賦形剤の混合
の工程を含む、実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤の製造法。
実施態様30:実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤の製造のための、放射性同位体、イメージング用色素、常磁性体、又は微小気泡から選択された検出標識の使用。
実施態様31:被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断用の組成物の調製のための、実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤の使用。
実施態様32:被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法に使用するための、実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤を含む組成物。
実施態様33:実施態様1〜14のいずれか記載のイメージング剤を含む、被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法に使用するためのキット。
実施態様34:被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法の使用説明書をさらに含む、実施態様33記載のキット。
実施態様35:抗CX3CR1免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ヒトCX3CR1へのヒトフラクタルカインの結合を遮断することができ、該抗CX3CR1免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号200〜202のいずれか1つに示される配列を含むVHHドメインである。
実施態様36:実施態様35記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
実施態様37:(i)実施態様35記載のポリペプチド、並びに(ii)薬学的に許容される担体、並びに場合により(iii)希釈剤、賦形剤、補助剤及び/又は安定化剤を含む、医薬組成物。
実施態様38:治療量の実施態様35記載の化合物をそれを必要とする患者に投与することを含む、CX3CR1関連疾病、疾患、又は容態の処置法。
実施態様39:該疾病、疾患、又は容態が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病、COPD、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は癌から選択される、実施態様38記載の方法。
実施態様40:該疾病、疾患、又は容態がアテローム性動脈硬化症である、実施態様39記載の方法。
実施例
実施例1:抗ヒトCX3CR1 VHHドメインの作製
ラマを、pVAX1−hCX3CR1プラスミドベクター(Invitrogen、カールズバッド、CA、米国)、ヒトCX3CR1を過剰発現しているラクダ腎臓(Caki)細胞、及び/又はBSAに結合させたCX3CR1のN末端及び第3細胞外ループから導かれた組換えペプチドを用いて標準的なプロトコールに従って免疫化した。ペプチドをNeo MPS (Polypeptidegroup、ストラスブール、フランス)に注文し、標準的なプロトコールに従ってBSAに結合させた。免疫化の期間中の様々な時点と、最後の免疫原の注射の後とに、重鎖抗体を産生するB細胞源としての役目を果たす血液試料及びリンパ節生検材料をラマから回収した。血液試料から、末梢血リンパ球(PBL)を、製造業者の説明書(Amersham Biosciences、ピスカタウェイ、NJ、米国)に従ってフィコールハイパックを使用して調製した。PBL及びリンパ節生検材料(LN)から全RNAを抽出し、これをRT−PCRのための出発物質として使用して、VHHをコードするDNAセグメントを増幅した。
実施例1:抗ヒトCX3CR1 VHHドメインの作製
ラマを、pVAX1−hCX3CR1プラスミドベクター(Invitrogen、カールズバッド、CA、米国)、ヒトCX3CR1を過剰発現しているラクダ腎臓(Caki)細胞、及び/又はBSAに結合させたCX3CR1のN末端及び第3細胞外ループから導かれた組換えペプチドを用いて標準的なプロトコールに従って免疫化した。ペプチドをNeo MPS (Polypeptidegroup、ストラスブール、フランス)に注文し、標準的なプロトコールに従ってBSAに結合させた。免疫化の期間中の様々な時点と、最後の免疫原の注射の後とに、重鎖抗体を産生するB細胞源としての役目を果たす血液試料及びリンパ節生検材料をラマから回収した。血液試料から、末梢血リンパ球(PBL)を、製造業者の説明書(Amersham Biosciences、ピスカタウェイ、NJ、米国)に従ってフィコールハイパックを使用して調製した。PBL及びリンパ節生検材料(LN)から全RNAを抽出し、これをRT−PCRのための出発物質として使用して、VHHをコードするDNAセグメントを増幅した。
免疫化されたラマ各個体から、免疫化計画の特定のサブセット由来の、すなわち1つの種類の免疫化抗原の後の試料から単離された全RNAをプールすることによってライブラリーを構築し、一部のラマについては、異なる個体からの試料を1つのライブラリーにプールした。要するに、PCRにより増幅されたVHHレパートリーを、特定の制限酵素部位を介して、VHHライブラリーのファージディスプレイを容易にするように設計されたベクターにクローニングした。ベクターはpUC119から導かれ、かつLacZプロモーター、M13ファージgIIIタンパク質コード配列、アンピシリン又はカルベニシリンに対する耐性遺伝子、マルチクローニングサイト、及びハイブリッドgIII−pelBリーダー配列(pAX050)を含有する。VHHコード配列のインフレームで、ベクターはC末端c−mycタグ及びヘキサヒスチジンタグをコードする。ファージを標準的なプロトコールに従って調製し、そして滅菌濾過した後にさらなる使用のために4℃又は−80℃で20%グリセロール中で保存した。
全てのラマから得られかつファージライブラリーとしてクローニングされたVHHレパートリーを、非常に多数の選択条件を適用して、様々な選択戦略に使用した。全てのコーティングされた固相での選択をMaxisorp96ウェルプレート(Nunc、ウィースバーデン、ドイツ)において実施した。選択は以下のように実施された:固相(リポソーム/VLP上に発現されたCX3CR1、Integral Molecular、フィラデルフィア、PA、米国)及び液相(CX3CR1を組換え発現している細胞)の選択フォーマットのためのCX3CR1抗原調製物を、複数の濃度で提示した。ファージライブラリーと共に2時間インキュベートし、その後、十分に洗浄した後、結合したファージをトリプシン(1mg/mL)を用いて15分間かけて溶出した。トリプシンがファージ溶出のために使用された場合、0.8mMのプロテアーゼ阻害剤ABSFを適用することによってプロテアーゼ活性を直ちに中和した。対照として、抗原を含まない選択を平行して実施した。
ファージ作出物を使用して大腸菌に感染させ、これをその後、今度は次の選択ラウンド(ファージレスキュー)のためのファージの調製に使用した。2回目の選択後、ファージの作出物を使用して大腸菌に感染させ、これをその後、寒天プレート(LB+カルベニシリン+ブドウ糖2%)上に個々のVHHクローンの分析のために播種した。特異的な結合物質について選択作出物をスクリーニングするために、単一のコロニーを寒天プレートから拾い上げ、96ウェル深型プレート1mL中で増殖させた。LacZで制御されたVHH発現を、ブドウ糖の非存在下でIPTG(最終1mM)を添加することによって誘導した。ペリプラズムペリプラズム抽出物(約80μLの容量)を標準的なプロトコールに従って調製した。
ペリプラズムペリプラズム抽出物を、ヒトCX3CR1/ヒトフラクタルカインFACS競合アッセイにおいてスクリーニングして、発現されたVHHが、独特なCX3CR1リガンドの受容体への結合を遮断する能力を評価した。ヒトCX3CR1をCHO細胞上に提示した。検出試薬として、1の標識度でAlexa Fluor 647(A647−フラクタルカイン)で標識されたフラクタルカイン(R&D Systems、ミネアポリス、MN、米国)を使用した。簡潔には、ペリプラズム抽出物50μlを6nMの標識されたフラクタルカイン(50μl)及び2×105個のCHO−hCX3CR1細胞に加えた。4℃で1時間インキュベートした後、細胞を3回洗浄し、その後、FACSアレイ(Becton Dickinson)で分析した。まずゲートを、散乱プロファイルから決定されたインタクトな細胞上に設定した。次に、死滅細胞を、PI染色(Sigma、セントルイス、米国)に由来するその蛍光プロファイルによってゲートアウトした。各試料についてAlexa Fluor 647標識からの蛍光プロファイルを決定し、これを遮断能の計算のために使用した。対照として、条件は、ペリプラズム抽出物に全くVHHが存在しなかった、又は、公知の非関連VHH及び試料を過剰の冷却フラクタルカインと共に含めたものとした。各試料について遮断率を、対照試料を使用して決定して、アッセイ窓を決定した。
このスクリーニングからVHHを選択し、そして配列分析により、ファミリー9、13及び101と称される3つの異なるB細胞系統に属する独特なVHHが判明した。一価VHHを二価分子としてフォーマット化することにより、作用強度及び/又は効力は高まるかどうかを決定するために、二価分子を遺伝子工学操作によって構築した。2つのVHHを、2つの構築ブロック間に35GSリンカーを用いて互いに遺伝子的に連結させた。
抗CX3CR1 VHHをさらなる特徴付けのために発現させかつ精製した。一価及び二価VHHを大腸菌TG1において、c−myc、His6でタグ化されたタンパク質として発現させた。発現を、1mM IPTGの添加によって誘導し、そして37℃で4時間継続させた。細胞培養液を回転させた後、ペレットを凍結解凍することによってペリプラズム抽出物を調製した。これらの抽出物を出発物質として使用し、VHHをIMACを介して精製し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によりSDS−PAGEを介して評価したところ95%の純度が得られた。
様々なファミリーに由来し、かつ多様な予測された電荷及びpIを有する、代表的なエピトープでタグ化された一価及び二価VHHドメインを、イメージング試薬としての評価のために選択した。これらの全てのVHHドメインが、上記に概略が示されている競合FACSアッセイにおいて受容体へのフラクタルカインの結合を遮断することが示された。BA/F3−hCX3CR1細胞、CHO−hCX3CR1細胞、又は一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞のいずれかを使用した。様々な競合設定において使用された標識リガンドの量も変化させた。ヒトCX3CR1へのヒトフラクタルカインの相互作用を遮断するVHHのIC50値を表9に示す。
ヒトCCR2、ヒトCCR5、又はマウスCX3CR1を発現しているCHO−K1親細胞又はCHO細胞上でFACS結合実験を実施することによって、hCX3CR1受容体に対する特異性を評価した。VHHを、4℃で30分間それぞれの細胞株と共にインキュベートし、その後、3回の洗浄工程を行ない、続いて、検出試薬と共にインキュベートした。検出として、マウス抗cmyc抗体(Serotec, MCA2200)、その後、PEに結合させたヤギ抗マウス抗体(Jackson 115-116-071)を使用し、各インキュベーションは4℃で30分間であり、その後、3回の洗浄工程を行なった。各細胞株について、受容体特異的抗体を用いての品質対照が含まれた。さらに、最高濃度の各VHHも、陽性対照としてhCX3CR1を発現しているCHO細胞と共にインキュベートした。マウスCX3CR1、ヒトCCR2、又はヒトCCR5への結合は全く観察できなかった。
実施例2:VHHドメインの標識
VHHドメインの放射性標識
VHHドメインを、99mTc−トリカルボニル法を使用して99mTcを用いて部位特異的にそのヘキサヒスチジンタグ上に放射性標識した。99mTcO4 −溶液(99Mo/99mTc発生溶出液;0.74〜3.7GBq;Drytec;GE Healthcare、ピスカタウェイ、NJ)をIsolinkキット(Covidien、セントルイス、MO)に加えることによって、[99mTc(H2O)3(CO)3]+(99mTc−トリカルボニル)を合成した。バイアルを100℃で20分間インキュベートした。冷却後、99mTc−トリカルボニル溶液を1M HClを用いてpH7.4へと中和した。その後、99mTc−トリカルボニル500μlをVHHドメイン50μl(一価VHHドメインについては1mg/ml、二価VHHドメインについては2mg/ml)に加え、50℃で90分間インキュベートした。遊離標識からの標識分子の分離、及びリン酸緩衝食塩水(PBS)への緩衝液の交換を、セファデックスG25使い捨てカラム(NAP-5; GE Healthcare、ピスカタウェイ、NJ)を使用してゲル濾過によって実施した。その後、標識されたVHHドメインを0.22μmのフィルター(Millipore、ベッドフォード、MA)に通し凝集物を除去した。
VHHドメインの放射性標識
VHHドメインを、99mTc−トリカルボニル法を使用して99mTcを用いて部位特異的にそのヘキサヒスチジンタグ上に放射性標識した。99mTcO4 −溶液(99Mo/99mTc発生溶出液;0.74〜3.7GBq;Drytec;GE Healthcare、ピスカタウェイ、NJ)をIsolinkキット(Covidien、セントルイス、MO)に加えることによって、[99mTc(H2O)3(CO)3]+(99mTc−トリカルボニル)を合成した。バイアルを100℃で20分間インキュベートした。冷却後、99mTc−トリカルボニル溶液を1M HClを用いてpH7.4へと中和した。その後、99mTc−トリカルボニル500μlをVHHドメイン50μl(一価VHHドメインについては1mg/ml、二価VHHドメインについては2mg/ml)に加え、50℃で90分間インキュベートした。遊離標識からの標識分子の分離、及びリン酸緩衝食塩水(PBS)への緩衝液の交換を、セファデックスG25使い捨てカラム(NAP-5; GE Healthcare、ピスカタウェイ、NJ)を使用してゲル濾過によって実施した。その後、標識されたVHHドメインを0.22μmのフィルター(Millipore、ベッドフォード、MA)に通し凝集物を除去した。
全てのVHHドメインを99mTcを用いて成功裡に標識した。放射化学純度は、移動相としてアセトンを使用して即時薄層クロマトグラフィーによって95%超であることが示された。放射化学純度はまたRP−HPLCによっても評価され、分析用C4カラム214TP53(Grace Vydac、ディアフィールド、IL)を、移動相としてH2O中0.1%トリフルオロ酢酸(溶媒A)/アセトニトリル中0.1%トリフルオロ酢酸(溶媒B)と共に使用して、89%超であることが示された。
実施例3:インビトロでの、細胞と、標識されたVHHドメインの結合
標識されたVHHドメイン分子がCX3CR1へのその結合を保持したかどうかを確認するために、CHO−hCX3CR1細胞を使用して結合研究を実施した。トランスフェクトされていないCHO細胞(CHO−WT)を対照として含めた。CHO−hCX3CR1又はCHO−WT細胞を、10%FBS、500μg/ml G418及び100μg/mlゼオシンの補充されたF12培地(CHO−hCX3CR1)、又は10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトアビジン及び2mM L−グルタミンの補充されたRPMI培地(CHO−WT)を含有する24ウェルプレート中2×105個の細胞/ウェルで播種し、37℃で一晩インキュベートした。F12培地中0.5%HSAを用いて非特異的結合を遮断した後、0.5mlのF12培地+0.5%HSA中1nMの99mTc−VHHドメインを3枚のウェルに加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。細胞を氷冷PBS+0.5%HSAで3回洗浄することによって、結合していない99mTc−VHHドメインを除去した。細胞を1M NaOHを用いて可溶化し、99mTcをガンマウェルカウンター(Cobra II Inspector 5003, Canberra-Packard)で定量した。結果を図1に示す。CHO−hCX3CR1細胞への特異的結合を、CX3CR1陰性CHO−WT細胞への結合に対して標準化した(結合/CHO−WT細胞上での結合)。統計分析のために、独立スチューデントt検定を使用した(SPSS Statistics 20)。0.05未満のP値が有意と判断された。
標識されたVHHドメイン分子がCX3CR1へのその結合を保持したかどうかを確認するために、CHO−hCX3CR1細胞を使用して結合研究を実施した。トランスフェクトされていないCHO細胞(CHO−WT)を対照として含めた。CHO−hCX3CR1又はCHO−WT細胞を、10%FBS、500μg/ml G418及び100μg/mlゼオシンの補充されたF12培地(CHO−hCX3CR1)、又は10%FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトアビジン及び2mM L−グルタミンの補充されたRPMI培地(CHO−WT)を含有する24ウェルプレート中2×105個の細胞/ウェルで播種し、37℃で一晩インキュベートした。F12培地中0.5%HSAを用いて非特異的結合を遮断した後、0.5mlのF12培地+0.5%HSA中1nMの99mTc−VHHドメインを3枚のウェルに加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。細胞を氷冷PBS+0.5%HSAで3回洗浄することによって、結合していない99mTc−VHHドメインを除去した。細胞を1M NaOHを用いて可溶化し、99mTcをガンマウェルカウンター(Cobra II Inspector 5003, Canberra-Packard)で定量した。結果を図1に示す。CHO−hCX3CR1細胞への特異的結合を、CX3CR1陰性CHO−WT細胞への結合に対して標準化した(結合/CHO−WT細胞上での結合)。統計分析のために、独立スチューデントt検定を使用した(SPSS Statistics 20)。0.05未満のP値が有意と判断された。
CX3CR1陽性CHO細胞への結合は、6つ全ての99mTc標識VHHドメインについて、トランスフェクトされていない細胞よりも有意に高く(*p≦0.001)、CX3CR1への特異的結合が、99mTcによるVHHドメインの標識で保存されたことを実証した。強力な結合及び大きな窓が、6中5個のVHHドメインで観察されたが、より弱い結合がCX3CR1BII315で見られた。
実施例4:健康なhCX3CR1 KIマウス及びC57BL/6マウスにおける標識VHHドメインの体内分布
健康な(疾病を有さない)マウスにおける標識VHHドメインの体内分布を調べるために実験を行なった。同定されたVHHドメインはマウスCX3CR1とは交差反応しなかったので、ヒトCX3CR1ノックインマウス系統(hCX3CR1KI)をTaconicArtemis(ケルン、ドイツ)で作製し、マウス疾病モデルにおけるこれらの分子の試験を可能とした。内因性マウスタンパク質の発現を破壊しつつ、対応するマウスプロモーターの制御下でヒトケモカイン受容体の発現を可能とする戦略を実施した。簡潔には、エキソン2内のマウスCX3CR1コード領域を、完全ヒトCX3CR1オープンリーディングフレームで置き換え、かつ選択マーカー及びloxP部位によってフランキングされた、標的化ベクターを構築した。標的化ベクターをマウスES細胞に導入し、そして相同的組換えを成功裡に受けたクローンを使用してキメラマウスを作製した。これらのマウスを高度に効率的なFlp欠失マウスと交雑して、選択マーカーの除去及び生殖細胞系列伝達が成し遂げられた。C57BL/6マウスを対照として使用して、非特異的な標的とは独立した結合を評価した。
健康な(疾病を有さない)マウスにおける標識VHHドメインの体内分布を調べるために実験を行なった。同定されたVHHドメインはマウスCX3CR1とは交差反応しなかったので、ヒトCX3CR1ノックインマウス系統(hCX3CR1KI)をTaconicArtemis(ケルン、ドイツ)で作製し、マウス疾病モデルにおけるこれらの分子の試験を可能とした。内因性マウスタンパク質の発現を破壊しつつ、対応するマウスプロモーターの制御下でヒトケモカイン受容体の発現を可能とする戦略を実施した。簡潔には、エキソン2内のマウスCX3CR1コード領域を、完全ヒトCX3CR1オープンリーディングフレームで置き換え、かつ選択マーカー及びloxP部位によってフランキングされた、標的化ベクターを構築した。標的化ベクターをマウスES細胞に導入し、そして相同的組換えを成功裡に受けたクローンを使用してキメラマウスを作製した。これらのマウスを高度に効率的なFlp欠失マウスと交雑して、選択マーカーの除去及び生殖細胞系列伝達が成し遂げられた。C57BL/6マウスを対照として使用して、非特異的な標的とは独立した結合を評価した。
17週令の雌C57BL/6マウス(n=35)及びhCXCR3 KIマウス(n=35)に通常の固形飼料食餌が与えられた。各VHHドメインを、99mTc−CX3CR1BII315マウス(2×n=5)を除く、6匹のC57BL/6マウス及び6匹のhCX3CR1 KIマウスにおいて評価した。99mTc−VHHドメイン溶液(53±10MBq)100μlを、尾静脈を介して静脈内注射した。注射から3時間後、麻酔した動物をうつ伏せにして動物のベッドに6匹の57Coランドマークと共に置き、順次、ピンホールSPECT及びマイクロCTにかけた。ピンホールSPECT収集は、3個から構成される1.5mmのピンホールコリメーターの装備された、デュアルヘッドガンマカメラ(e.cam180Siemens Medical Solutions、ホイートン、IL、米国)を使用して実施した。各10秒間の64回の投影を、360°回転させながら、ズーム比1で128×128のマトリクスに収集した。マイクロCTイメージングを以下の収集パラメーターを使用してSkyscan 1178(Skyscan、コンティフ、ベルギー)で実施した:50kV、615μA、及び83μm解像度。再構成後、両方のデータセットを6匹の57Coランドマークに基づいて自動的に融合させた。画像をソフトウェアAmide(http://amide.sourceforge.net)及びOsirix(Pixmeo SARL、ベルネ、スイス)を用いて分析した。SPECT画像のカラースケールをIA/cm3%に標準化することにより、動物間の直接的な目視による比較が可能となった(図2)。
イメージング後、動物を、ペントバルビタールナトリウム(CEVA、リブルヌ、フランス)の過剰投与によって安楽死させた。全ての主要な臓器及び組織を収集し、秤量し、その放射能をガンマウェルカウンターで定量した。計数をバックグラウンド及び崩壊に対して修正し、組織1gあたりに注射された放射能比(IA/g%)として表現された。統計分析をパラメトリック検定(分散分析)及びノンパラメトリック検定(マンホイットニーU検定)(SPSS Statistics 20)の両方を使用して実施した。0.05未満のP値を有意と判断した。
C57BL/6マウス及びhCX3CR1 KIマウスにおける99mTc−VHHドメインの体内分布データを表10に要約する。
データは、組織1gあたりに注射された放射能比として示される(IA/g%;*p<0.05 各VHHドメインについてC57BL/6マウス対hCX3CR1 KIマウス(分散分析及びマンホイットニーU検定(同じ結果));§分散分析ではp<0.05であるが、マンホイットニーU検定ではそうではない;†マンホイットニーU検定ではp<0.05であるが、分散分析ではそうではない)。
C57BL/6マウスでは、全てのVHHドメインが、60kDa未満の分子量を有する分子の典型的な体内分布:高度な腎からの排出と迅速な血中クリアランスを示した(表10、図2)。注射から3時間後、腎臓の数値は、200 IA/g%より高く、血液の数値は0.21〜0.92 IA/g%の範囲であった。肝臓を除く、全ての他の臓器及び組織において、数値はその時点で1 IA/g%より低かった。肝臓では、数値は、99mTc−CX3CR1BII18E06についての1.31 IA/g%から99mTc−CX3CR1BII317についての3.21 IA/g%の範囲であった。hCX3CR1 KIマウスでは、殆ど全ての臓器及び組織において、99mTc−VHHドメインCX3CR1BII315(表10)を除いて(そのより弱い細胞への結合と一致する)、99mTc−VHHドメインのより高度な取り込みが観察された。
有意であるが、これらの差異は、以下の臓器:心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、脳、大動脈、及び筋肉について小さかった。差異は脾臓、胃、腸、骨、及びリンパ節についてより顕著であったが、おそらく、マクロファージ及び樹状細胞などの、これらの臓器における組織に常在する免疫細胞への結合を反映している。最も高い特異的な標的化が、一価99mTc−CX3CR1BII66B02及び二価99mTc−CX3CR1BII318で観察された。
実施例5:高脂肪食餌を与えられたApoE−/−マウスの動脈硬化プラークに結合しているCX3CR1 VHHドメインの同定
動脈硬化性疾患を有するマウスにおけるインビボでの競合実験
動脈硬化プラークへの抗CX3CR1 VHHドメインの特異的標的化を示すために、hCX3CR1 KIマウスをApoE−/−マウス(The Jackson Laboratory、バーハーバー、メイン、米国)と交雑させて、hCX3CR1 KI ApoE−/−マウスを作製した。ApoE−/−マウスモデルは、部位特異的なプラーク形成の局在化、組織学的組成、及び公知のリスク因子(コレステロール、炎症、高血圧など)に関してヒト疾病と著しく類似している、広範囲に及ぶ動脈硬化プラーク形成を誘起する頑強な方法を提供する。
動脈硬化性疾患を有するマウスにおけるインビボでの競合実験
動脈硬化プラークへの抗CX3CR1 VHHドメインの特異的標的化を示すために、hCX3CR1 KIマウスをApoE−/−マウス(The Jackson Laboratory、バーハーバー、メイン、米国)と交雑させて、hCX3CR1 KI ApoE−/−マウスを作製した。ApoE−/−マウスモデルは、部位特異的なプラーク形成の局在化、組織学的組成、及び公知のリスク因子(コレステロール、炎症、高血圧など)に関してヒト疾病と著しく類似している、広範囲に及ぶ動脈硬化プラーク形成を誘起する頑強な方法を提供する。
4週令の雌ApoE−/−マウス及びhCX3CR1 KI ApoE−/−マウスに、1.5%コレステロールを含有する高脂肪/高コレステロール食餌を16週間与えた。各々の99mTc−VHHドメインを、6匹のApoE−/−マウス及び6匹のhCX3CR1KI ApoE−/−マウスにおいて評価した(一価99mTc−VHHドメインCX3CR1BII315を、インビトロでの細胞への結合によって観察された99mTc−標識後の機能の低下、及び疾病を有さないマウスにおける体内分布研究に基づいて除外した)。細菌酵素に対して作製された対照99mTc−VHHドメインcAbBCII10(Conrath, 2001; Antimicrob. Agents Chemother. 45: 2807)を6匹のhCX3CR1 KI ApoE−/−マウスにおいて評価した。99mTc−VHHドメイン溶液(61±16MBq)100μlを尾静脈経由で静脈内に注射した。1群のマウスには、100倍過剰の等価な標識されていないVHH分子(「遮断」とも呼ばれる)も共注射した。注射から3時間後、麻酔した動物をうつ伏せにして動物のベッドに6匹の57Coランドマークと共に置き、実施例4に記載のようにピンホールSPECT及びマイクロCTに順次かけた。イメージング後、動物を過剰な投与量のペントバルビタールナトリウムによって安楽死させ、組織及び臓器をさらなるエクスビボでの分析のために収集した。
ApoE−/−マウス及びhCX3CR1KI ApoE−/−マウス(遮断あり及び遮断なし)における99mTc−CX3CR1BII66B02及び99mTc−CX3CR1BII318の体内分布の代表的な画像を図3に示す。注射から3時間後、hCX3CR1 KIApoE−/−マウスにおける大動脈の底部及び大動脈弓にある大動脈病変において(白い矢印)、抗hCX3CR1 99mTc−VHHドメインの高いシグナルが全身SPECT/CT画像において検出された。大動脈病変及び全ての他の臓器への特異的な取り込みが競合によって抑制された。ApoE−/−マウスには特異的な蓄積は全く観察されなかった。同様に、疾病を有さないhCX3CR1マウスにも蓄積は全く観察されなかった(実施例4及び図2)。
各VHHドメインのエクスビボでの体内分布を、ApoE−/−マウス及びhCX3CR1 KI ApoE−/−マウスにおいてだけでなく、過剰な標識されていないVHHドメインの存在下のhCX3CR1 KI ApoE−/−マウスにおいても評価した。hCXCR1特異的VHHドメインの取り込みは、上記に提示したSPECT/CT画像に関連し、そしてApoE−/−マウスよりも、hCX3CR1KI ApoE−/−マウスにおいてより高く、これはCX3CR1の標的発現に一致した(表11)。VHHドメインの取り込みは、標識されていないVHHドメインとの競合によって遮断された。対照である99mTc−VHHドメインcAbBcII10は、哺乳動物細胞におけるどの標的も認識しないので、腎臓を通したクリアランスが全てのVHHドメインと同じように観察されたが、99mTc−cAbBCII10はどの他の臓器によっても取り込まれなかった。結果は主に、hCX3CR1 KIマウスにおいて得られた体内分布データに対応し、このことは、健康なマウスと動脈硬化性疾患を有するマウスとの間の抗hCX3CR1標的化VHHドメインの体内分布において大きな差がなかったことを実証する。
SPECT/CTを介した生存動物におけるアテローム性動脈硬化症の主要な部位の同定
患部と心臓の比を、心筋に近い冠動脈における動脈硬化病変を定量するための解読値として計算した。アテローム硬化性マウスにおける主要なプラーク形成部位が、大動脈根及び大動脈弓であり、これらの部位は最も高い99mTc−CX3CR1BII66B02の蓄積を伴うことが、解剖分析及びオートラジオグラフィーから明らかである。上記に考察されかつ図3に示されているように、この領域への99mTc−CX3CR1BII66B02の取り込みがSPECT/CT画像において観察される。これらのシグナルはさらに、大動脈根/大動脈弓部位での関心対象の領域(関心領域)を描き、かつ注射された放射能比/cm3(IA/cm3%)としてそれらを表現することによって定量した(表12)。
患部と心臓の比を、心筋に近い冠動脈における動脈硬化病変を定量するための解読値として計算した。アテローム硬化性マウスにおける主要なプラーク形成部位が、大動脈根及び大動脈弓であり、これらの部位は最も高い99mTc−CX3CR1BII66B02の蓄積を伴うことが、解剖分析及びオートラジオグラフィーから明らかである。上記に考察されかつ図3に示されているように、この領域への99mTc−CX3CR1BII66B02の取り込みがSPECT/CT画像において観察される。これらのシグナルはさらに、大動脈根/大動脈弓部位での関心対象の領域(関心領域)を描き、かつ注射された放射能比/cm3(IA/cm3%)としてそれらを表現することによって定量した(表12)。
標的化群(hCX3CR1KI ApoE−/−マウスにおける99mTc−CX3CR1BII66B02)と比較して、トレーサー結合が標識されていない66B02の注射によって遮断された場合には、大動脈弓シグナルは6〜8倍低く、分子標的の非存在下では2〜3倍低かった(ApoE−/−マウス)。hCX3CR1KI ApoE−/−マウスにおける対照VHHドメイン99mTc−cAbBcII10の大動脈弓シグナルは、標的化群より約4倍低かった。CT画像を使用して、関心対象の等サイズの領域(関心領域)を、大動脈弓/根上及び心臓左心室(血液プール活性の尺度としての)上に描いた。これらの関心領域におけるSPECTシグナルを計算し、注射された放射能比/体積(IA/cm3%)として表現した。これらの数値を使用して、大動脈弓と血液の比率を計算した。統計分析を、パラメトリック検定(分散分析)を使用して実施した。0.05未満のP値を有意と判断した。
大動脈弓と血液の比を、血液プールの測定値としての心臓左心室(LV)における関心領域を描くことによって計算した(表12)。アテローム硬化症マウスにおける大動脈弓と血液の比は、99mTc−CX3CR1BII66B02の取り込みが、過剰の未標識66B02の注射によって遮断された場合、又はhCX3CR1発現の非存在下において、2〜3倍低かった。動脈硬化性疾患を有さないマウスにおいて99mTc−cAbBcII10又は99mTc−CX3CR1BII66B02について類似した有意差が観察された。アテローム硬化性大動脈弓及び大動脈根への99mTc−CX3CR1BII66B02及び99mTc−CX3CR1BII318の特異的取り込みがSPECT/CT画像において明瞭に視認でき、生存動物個体における動脈硬化病変の非侵襲的イメージングの放射性トレーサーとしてのCX3CR1 VHHドメインの有用性を実証する。
大動脈セグメントのエクスビボでの分析
試験における各マウスの大動脈を注意深く切り出し、接着組織から離して洗浄し、10個のセグメントに切断した。目視による検査時に、各セグメントに0〜3のスコアを与えた(0:0%、1:1〜50%、2:51〜75%、3:76〜100%の領域が動脈硬化病変で覆われている)。他の臓器及び組織と共に全てのセグメントを収集し、秤量し、その放射能を定量した。計数をバックグラウンド及び崩壊について修正し、組織1gあたりに注射された放射能比(IA/g%)として表現した。統計分析をパラメトリック検定(分散分析)を使用して実施した。0.05未満のP値を有意と判断した。各動物について、専用の蛍光面(Typhoon FLA 7000, GE Healthcare)に全ての大動脈セグメントを一晩曝した後にオートラジオグラフ画像が得られた。画像をImageQuant(GE Healthcare Biosciences、ピッツバーグ、PA)を用いて分析した。
試験における各マウスの大動脈を注意深く切り出し、接着組織から離して洗浄し、10個のセグメントに切断した。目視による検査時に、各セグメントに0〜3のスコアを与えた(0:0%、1:1〜50%、2:51〜75%、3:76〜100%の領域が動脈硬化病変で覆われている)。他の臓器及び組織と共に全てのセグメントを収集し、秤量し、その放射能を定量した。計数をバックグラウンド及び崩壊について修正し、組織1gあたりに注射された放射能比(IA/g%)として表現した。統計分析をパラメトリック検定(分散分析)を使用して実施した。0.05未満のP値を有意と判断した。各動物について、専用の蛍光面(Typhoon FLA 7000, GE Healthcare)に全ての大動脈セグメントを一晩曝した後にオートラジオグラフ画像が得られた。画像をImageQuant(GE Healthcare Biosciences、ピッツバーグ、PA)を用いて分析した。
全大動脈の目視による検査に基づいて、動脈硬化病変は、大動脈根及び大動脈弓において最も多いことが認められた。これらのセグメントは一般的に3又は2の病変スコアを有していた。大動脈の腹部切片では、小さな個々の病変を有するセグメントと、病変を有さないセグメントとが交互に存在した。これらのセグメントはそれぞれ1及び0とスコア付けされた。大動脈セグメントのスコアは、0〜2の間で変動した。全てのマウスにおいて及び全ての条件について、セグメントへの99mTc−VHHドメインの取り込みは、hCX3CR1KI ApoE−/−マウスにおけるhCX3CR1特異的99mTc−VHHドメインについて有意に増加していた(表13)。
スコア3のセグメントにおける最も高い数値が、一価VHHドメイン99mTc−CX3CR1BII66B02及び二価VHHドメイン99mTc−CX3CR1BII318について得られ、それぞれ平均値は2.68及び2.37 IA/g%であった(表14)。過剰の未標識VHHドメインの添加は、抗hCX3CR199mTc−VHHドメインの取り込みを、対照条件(ApoE−/−マウスにおける抗hCX3CR199mTc−VHHドメイン又はhCX3CR1 KI ApoE−/−マウスにおける99mTc−cAbBCII10、図4A及び4B)の取り込みレベルまで減少させ、これにより結合特異性が確認された。図4A及び4Bにおいて、各スコアについて、左、中央及び右の棒グラフは、ApoE−/−マウス、ApoE−/−hCX3CR1 KIマウス、及び遮断されているApoE−/−hCX3CR1 KIマウスについてそれぞれ見いだされたIA/g%を示す。
病変重量の定量及び放射能の計数によって個々の大動脈セグメントへのトレーサーの取り込みを評価する他に、これらのセグメントをまた放射線感受性蛍光面に曝して、放射性シグナルの空間的分布を可視化した。ApoE−/−マウスのセグメント、又はhCX3CR1 KI ApoE−/−マウスに99mTc−cAbBcII10を有するセグメントと比較して、hCX3CR1 KI ApoE−/−マウスにおいて増加した病変の負荷を有するセグメントにおいて、99mTc−CX3CR1BII66B02の増加した取り込みが観察された。99mTc−CX3CR1BII66B02は、低い病変スコアを有するセグメント中の小さなプラークに限局的に結合することが示された(図5の白い矢印)。
Claims (30)
- 検出標識に連結されたCX3CR1標的化ポリペプチドを含む、イメージング剤。
- 前記CX3CR1標的化ポリペプチドは免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項1記載のイメージング剤。
- 前記CX3CR1標的化ポリペプチドはVHHドメインである、請求項1又は2記載のイメージング剤。
- 前記CX3CR1標的化ポリペプチドは、
−それぞれ、配列番号141、162及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、163及び187;又は
−それぞれ、配列番号141、164及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、166及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、167及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、167及び189;又は
−それぞれ、配列番号141、168及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、168及び187;又は
−それぞれ、配列番号141、169及び190;又は
−それぞれ、配列番号141、170及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、171及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、174及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、175及び187;又は
−それぞれ、配列番号142、165及び188;又は
−それぞれ、配列番号142、173及び188;又は
−それぞれ、配列番号143、164及び186;又は
−それぞれ、配列番号144、172及び187;又は
−それぞれ、配列番号145、172及び187;又は
−それぞれ、配列番号141、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、215及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、216及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、217及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、218及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、219及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、220及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、221及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号146、176及び191;又は
−それぞれ、配列番号146、177及び191;又は
−それぞれ、配列番号147、178及び192;又は
−それぞれ、配列番号147、179及び192;又は
−それぞれ、配列番号147、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号148、179及び193;又は
−それぞれ、配列番号149、179及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、180及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、181及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、183及び192;又は
−それぞれ、配列番号149、185及び192;又は
−それぞれ、配列番号150、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号150、182及び194;又は
−それぞれ、配列番号151、179及び193;又は
−それぞれ、配列番号151、182及び194;又は
−それぞれ、配列番号151、184及び196;又は
−それぞれ、配列番号152、179及び195;又は
−それぞれ、配列番号153、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号154、182及び194;又は
−それぞれ、配列番号155、179及び195;又は
−それぞれ、配列番号156、181及び192;又は
−それぞれ、配列番号157、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号158、179及び192;又は
−それぞれ、配列番号159、178及び192;又は
−それぞれ、配列番号160、179及び194;又は
−それぞれ、配列番号161、179及び194
から選択されたCDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む、請求項1〜3のいずれか記載のイメージング剤。 - 前記CX3CR1標的化ポリペプチドは、
−それぞれ、配列番号141、162及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、215及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、216及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、217及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、218及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、219及び186;又は
−それぞれ、配列番号141、220及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、221及び186;又は
−それぞれ、配列番号213、214及び186;又は
−それぞれ、配列番号147、178及び192;又は
−それぞれ、配列番号146、176及び191
から選択されたCDR1、CDR2及びCDR3の配列を含む、請求項1〜4のいずれか記載のイメージング剤。 - 前記CX3CR1標的化ポリペプチドは、配列番号1〜140又は197〜202のいずれか1つから選択された配列を有するVHHドメインである、請求項1〜3のいずれか記載のイメージング剤。
- 前記CX3CR1標的化ポリペプチドは、配列番号1、11、49、53、121〜140、又は197〜202のいずれか1つから選択された配列を有するVHHドメインである、請求項1〜3又は6のいずれか記載のイメージング剤。
- 前記CX3CR1標的化ポリペプチドは二価であり、リンカーペプチドによって共有結合で連結された2つのVHHドメインを含み、前記二価CX3CR1標的化ポリペプチドは配列番号203〜212、222又は223のいずれか1つから選択され、前記2つのVHHドメインは同一であっても異なっていてもよい、請求項1又は2記載のイメージング剤。
- 前記二価CX3CR1標的化ポリペプチドの配列は配列番号208、222又は223のいずれか1つから選択される、請求項1、2又は8のいずれか記載のイメージング剤。
- 前記検出標識は、放射性同位体、イメージング用色素、常磁性体、又は微小気泡から選択される、請求項1〜9のいずれか記載のイメージング剤。
- 前記検出標識は放射性同位体である、請求項1〜10のいずれか記載のイメージング剤。
- 前記検出標識は、99mTc、111In、123I、201Tl、133Xe、11C、64Cu、18F、68Ga、13N、15O、82Rb、124I及び89Zrから選択される、請求項1〜11のいずれか記載のイメージング剤。
- 前記検出標識は99mTc及び68Gaから選択される、請求項1〜12のいずれか記載のイメージング剤。
- 前記CX3CR1標的化ポリペプチドは、配列番号224、225、226、227又は228のいずれか1つから選択されたVHHドメインと、CX3CR1への結合について競合する免疫グロブリンである、請求項1記載のイメージング剤。
- a)請求項1〜14のいずれか記載のイメージング剤を被験者に投与する工程;及び
b)被験者の非罹患組織と比較して、罹患組織においてより高いレベルのイメージング剤の結合を検出する工程
を含む、被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病をインビボで診断するための方法。 - 前記疾病が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病、COPD、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌から選択される、請求項15記載の方法。
- 前記疾病がアテローム性動脈硬化症である、請求項15又は16記載の方法。
- 前記イメージング剤の結合を検出するための方法は、
a)単一光子放射型コンピュータ断層撮影法;
b)陽電子放出断層撮影法;
c)近赤外線蛍光イメージング;
d)超音波イメージング;及び
e)磁気共鳴イメージング
から選択される、請求項15〜17のいずれか記載の方法。 - 前記イメージング剤の結合を検出するための方法は陽電子放出断層撮影法である、請求項15〜18のいずれか記載の方法。
- 被験者がヒトである、請求項15〜19のいずれか記載の方法。
- 1)被験者の組織試料を、請求項1〜14のいずれか記載のイメージング剤と接触させる工程;及び
2)試料中の特異的に結合したイメージング剤を検出する工程
を含む、被験者におけるCX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病をエクスビボで診断するための方法。 - a)非罹患組織と比較して罹患組織において請求項1〜14のいずれか記載のイメージング剤のより高いレベルの結合を有するとして患者を同定する工程;
b)治療剤を患者に投与する工程
を含む、CX3CR1の上昇した発現によって特徴付けられる疾病を有する患者を処置するための方法。 - 前記疾病が、心臓及び脳血管の動脈硬化性疾患、末梢動脈疾患、再狭窄、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ヒト半月板形成性糸球体腎炎、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎炎、膵炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病及びウェゲナー肉芽腫症を含む血管炎、関節リウマチ、変形性関節症、同種移植片拒絶、全身性硬化症、神経変性疾患及び脱髄疾患、多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病、COPD、喘息のような肺疾患、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、及び癌から選択される、請求項22記載の方法。
- 前記疾病はアテローム性動脈硬化症である、請求項22又は23記載の方法。
- 効果的な治療剤はCX3CR1アンタゴニストである、請求項22〜24のいずれか記載の方法。
- a)CX3CR1標的化ポリペプチドの生成
b)検出標識の結合、及び
c)場合によりさらなる賦形剤の混合
の工程を含む、請求項1〜14のいずれか記載のイメージング剤の製造法。 - 請求項1〜14のいずれか記載のイメージング剤の製造のための放射性同位体、イメージング用色素、常磁性体、又は微小気泡から選択された検出標識の使用。
- 被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法に使用するための請求項1〜14のいずれか記載のイメージング剤を含む組成物。
- 請求項1〜14のいずれか記載のイメージング剤を含む、被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法に使用するためのキット。
- 被験者におけるCX3CR1の発現上昇によって特徴付けられる疾病の診断法の使用説明書をさらに含む、請求項29記載のキット。
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