CN108025093B - 用于在治疗癌症中使用的放射性标记的抗体片段 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于分层和治疗受试者例如患有癌症的受试者的方法、试剂盒和组合物。在一些实施例中，该方法包括放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域(VHH)或其功能性片段两者均作为筛选剂和治疗剂的用途。在一些实施例中，VHH或其功能性片段是使用作为γ‑发射体和β‑发射体两者的放射性同位素进行放射性标记的。

Description

用于在治疗癌症中使用的放射性标记的抗体片段
技术领域
本公开涉及放射性标记的抗体片段及其用于治疗受试者分层(分组，stratification)的用途。特别地，本公开涉及用于受试者分层以进行癌症治疗的放射性标记的抗体片段。
背景技术
癌症的成功治疗仍然困难，部分原因是由于不同个体中癌症的异质性。仍然需要开发用于选择可能响应于特定癌症治疗的受试者的方法，以便提高成功治疗的可能性。
发明内容
在一些方面中，本公开提供了用于选择治疗受试者的方法、试剂盒和组合物，并且随后利用筛选剂量和治疗剂量的相同放射性标记的抗体片段来治疗所选择的受试者，例如源自重链抗体的重链可变结构域(在本文中也称为VHH)。在一些实施方式中，筛选剂量被用于确定放射性标记的抗体片段能够结合受试者中的癌细胞或实体瘤，由此表明该受试者是用相同放射性标记的抗体片段以治疗剂量进行治疗的候选者。不希望受理论束缚，据信将相同的放射性标记的抗体片段用作筛选剂和治疗剂，将增加使用该筛选剂选择用于治疗的受试者对该治疗剂作出响应的可能性。
在一些方面中，本公开提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括：
基于筛选剂量的放射性标记的源自重链抗体的重链可变结构域(VHH)或其功能性片段在受试者中的检测，选择用于治疗的患有癌症的受试者，放射性标记的源自重链抗体的重链可变结构域(VHH)或其功能性片段特异性结合存在于癌细胞或实体瘤上的靶蛋白；和
向受试者给予治疗剂量的放射性标记的VHH或其功能性片段，
其中VHH或其功能性片段是使用作为γ-发射体和β-发射体两者的放射性同位素进行放射性标记的。在一些实施方式中，方法进一步包含：
在选择受试者之前，向受试者给予筛选剂量的放射性标记的VHH或其功能性片段，并且在受试者的肿瘤部位检测放射性标记的VHH或其功能性片段的存在。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，检测放射性标记的VHH或其功能性片段的存在包含对受试者进行成像。在一些实施方式中，成像是伽马照相机成像，诸如平面伽马照相机成像、单光子发射计算机断层成像或正电子发射断层成像，任选地结合非核成像技术，诸如X射线成像、计算机断层扫描和/或磁共振成像。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，放射性同位素是碘-131、镥-177、钇-90、铜-67、铼-186或铼-188。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，放射性同位素通过接头连接到VHH或其功能性片段。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，VHH或其功能性片段是使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯(iodobenzbate)([I-131]-SGMIB)或其合适的衍生物或变体以碘-131进行放射性标记的。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，筛选剂量在37MBq和370MBq之间，并且治疗剂量在370MBq和18500MBq之间。
在本文方法的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2(人类表皮生长因子受体2)。在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，如使用竞争测定所确定的，放射性标记的VHH或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000021
或单克隆抗体帕妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000022
竞争结合HER2。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段包含选自以下组的CDR组合中的一种，该组包括：
具有SEQ ID NO:l的CDR1区、具有SEQ ID NO:2的CDR2区和具有SEQ ID NO:3的CDR3区，以及
具有SEQ ID NO:4的CDR1区、具有SEQ ID NO:5的CDR2区和具有SEQ ID NO:6的CDR3区。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段与SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列的至少一个具有至少80％的氨基酸同一性。在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段与SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列的至少一个是同一的。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，筛选剂量和治疗剂量的放射性标记的VHH或其功能性片段各自独立地静脉内、腹膜内或鞘内向受试者给予。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段以一价形式存在。在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段缺乏含半胱氨酸的标记，优选GGC-标记。在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段是非寿命延长的。在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段是未标记的。
在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，癌症是实体瘤。在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，癌症是血液癌症。在本文描述的方法的任一种的一些实施方式中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、胃癌、多发性骨髓瘤或淋巴瘤。
本公开的其它方面涉及一种试剂盒，包含：
筛选剂量的放射性标记的VHH或其功能性片段，其特异性结合存在于癌细胞或实体瘤上的靶蛋白，和
治疗剂量的放射性标记的VHH或其功能性片段，
其中VHH或其功能性片段是使用作为γ-发射体和β-发射体两者的放射性同位素进行放射性标记的。
在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性同位素是碘-131、镥-177、钇-90、铜-67、铼-186或铼-188。
在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性同位素通过接头连接到VHH或其功能性片段。
在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，VHH或其功能性片段是使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]-SGMIB)或其合适的衍生物或变体以碘-131进行放射性标记的。
在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，筛选剂量在37MBq和370MBq之间，并且治疗剂量在370MBq和18500MBq之间。
在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2。在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，如使用竞争测定所确定的，放射性标记的VHH或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000031
或单克隆抗体帕妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000032
竞争结合HER2。
在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段包含选自以下组的CDR组合中的一种，该组包括：
具有SEQ ID NO:1的CDR1区、具有SEQ ID NO:2的CDR2区和具有SEQ ID NO:3的CDR3区，以及
具有SEQ ID NO:4的CDR1区、具有SEQ ID NO:5的CDR2区和具有SEQ ID NO:6的CDR3区。
在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段与SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列的至少一个具有至少80％氨基酸同一性。在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段与SEQ ID NO:7和8的氨基酸序列的至少一个是同一的。
在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，筛选剂量和治疗剂量的放射性标记的VHH或其功能性片段各自独立地配制用于静脉内、腹膜内或鞘内向受试者给予。
在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段以一价形式存在。在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段缺乏含半胱氨酸的标记，优选GGC-标记。在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段是非寿命延长的。在本文描述的试剂盒的任一种的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段是未标记的。
附图说明
图1显示了未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rsl5d的治疗效果。每周注射未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rsl5d治疗动物(每组n＝6/7)(131I-SGMIB-2Rsl5d nb)，并且在对照组中，使用赋形剂溶液(赋形剂溶液)或未标记的一价[131I]SGMIB-标记的非靶向对照VHH(131I-SGMIB-非靶向nb)。当达到20％重量减少或肿瘤体积大于1cm3时，将动物安乐死。显示了不同组中动物的存活。
图2：[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rsl5d(CAM-VHH1)在PBS中在25℃下长达144h以及在人血清中在37℃下长达168h的稳定性。在PBS中培养72小时后，在蛋白质部分中发现多于96％的活性，并且在人血清中培养24小时后为约95％的活性。
图3：[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rsl5d(CAM-VHHl)在HER2-表达和阻断的HER2-表达肿瘤细胞上的特异性结合。数据表示为平均值±SD(n＝6)。
图4：[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rsl5d(CAM-VHH1)在HER2-表达肿瘤细胞上的结合亲和力。数据表示为平均值±SD(n＝3)，产生4.74±0.4nM的KD。
图5：[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rsl5d(CAM-VHHl)在HER2-表达肿瘤细胞中的内在化曲线。数据表示为在时间点0、1、2、4、6和24h时的平均值±SD(n＝3)。
具体实施方式
在描述本发明之前，需要理解的是，本发明不限于本文公开的具体方法和实验条件；因为此种方法和条件可以改变。还需要理解的是，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方式的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限定。
另外，除非另有说明，本发明的实践采用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。此类技术对于本领域技术人员来说是公知的，并且在文献中有充分的解释。参见例如Ausubel,et al.编、Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008),包括全部增补本；MR Green和J.Sambrook著的Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版)；以及Harlow et al.Antibodies:ALaboratory Manual,第14章,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013、第2版)。
I.定义
除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。除上下文另有要求外，否则单数术语应当包括复数并且复数术语应当包括单数。除非另有说明，使用的“或”是指“和/或”。术语“包括”以及其他形式(诸如“包括”和“包含”)的使用不是限制性的。
通常，与本文的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的命名法是本领域中众所周知和常用的。除非另有说明，本文提供的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行，并如本说明书通篇引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献。如本领域通常完成或如本文，酶促反应和纯化技术根据制造商的说明进行。与本文的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学有关的命名法以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和常用的。将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
选择的术语在下文定义，可以更容易地理解本公开。
如本文所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一”、“一个”和“该”包括单数和复数的指称。
如本文所使用的术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised of)”与“包括(including)”、“包括(includes)”、“含有(containing)”或“含有(contains)”是同义词并且是包容性的或开放式的，且不排除额外的未列举的成员、要素或方法步骤。
通过端点列举的数值范围包括包含在相应范围内的所有数字和分数，以及所列举的端点。
在涉及诸如参数、量、时间持续时间等的可测量值时，本文使用的术语“约”是指涵盖指定值的+/-10％或更小的变化，优选+/-5％或更小的变化，更优选+/-1％或更小的变化，并且还更优选+/-0.1％或更小的变化，只要这些变化对于本公开是适当的。应该理解的是，修饰语“约”所指的值本身也具体地并且优选地被公开。
如本文所使用的，氨基酸残基将以其全名或根据标准三字母或单字母氨基酸代码来表示。
如本文所使用的，术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”和“氨基酸序列”可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸、和具有修饰的肽主链的多肽。
如本文所使用的，术语“核酸分子”、“多核苷酸”、“多核酸”、“核酸”可互换使用并且是指任何长度的核苷酸(为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性的或环状的。
如本文所使用的，术语“同源性”表示两个大分子之间的至少二级结构相似性，特别是来自相同或不同分类群的两个多肽或多核苷酸之间的二级结构相似性，其中所述相似性是由于共同的祖先引起的。因此，术语“同系物”表示具有所述二级和任选三级结构相似性的如此相关的大分子。在一些实施方式中，为了比较两个或更多个核苷酸序列，可以使用本领域技术人员已知的方法来计算第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性(百分比)”，例如通过将第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数量除以第一核苷酸序列中的核苷酸总数并乘以100％，或者通过使用已知的计算机算法进行序列比对，如NCBI Blast。在一些实施方式中，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，本领域技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可被描述为氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一氨基酸残基取代，并且对多肽的功能、活性或其它生物学性质具有很少或基本上没有影响。本领域技术人员清楚可能的保守氨基酸取代。如果氨基酸序列和核酸序列在其整个长度上具有100％的序列同一性，则称它们是“完全相同的”。
本文使用的术语“亲和力”是指多肽(特别是免疫球蛋白诸如抗体，或免疫球蛋白片段诸如VHH)与抗原结合的程度，以便将抗原和多肽的平衡移向由它们的结合形成的复合物的存在。因此，例如，在以相对相等浓度组合抗原和抗体(例如抗体片段)的情况下，高亲和力的抗体(例如抗体片段)将与可用的抗原结合，从而将平衡移向高浓度的所得复合物。解离常数通常用于描述蛋白质结合结构域和抗原靶标之间的亲和力。典型地，解离常数低于10-5M。在一些实施方式中，解离常数低于10-6M，更优选低于10-7M，最优选低于10-8M，诸如低于10-9M。
如本文使用的术语“特异性结合(specifically bind)”和“特异结合(specificbinding)”，通常是指多肽(特别是免疫球蛋白诸如抗体，或免疫球蛋白片段诸如VHH或其功能性片段)优先结合存在于不同抗原的均匀混合物中的特定抗原的能力。在某些实施方式中，特异性结合相互作用将辨析样品中期望的和不期望的抗原，在一些实施方式中超过约10至100倍或更多(例如超过约1000或10,000倍)。
因此，本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)对特定靶(或对其至少一部分或其片段)具有亲和力、特异性和/或特异性地针对特定靶(或其至少一部分或其片段)时，认为该氨基酸序列“特异性地结合”靶。
在一些实施方式中，当本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)结合第一目标靶抗原的亲和力比本文公开的该氨基酸序列结合第二目标靶抗原的亲和力高出至少5倍(诸如至少10倍，诸如至少100倍且优选至少1000倍)时，认为该氨基酸序列“相对于第二目标靶抗原，对第一目标靶抗原具有特异性”。因此，在某些实施方式中，当相对于第二目标靶抗原，本文公开的氨基酸序列被认为对第一目标靶抗原“具有特异性”时，其可特异地结合(如本文所定义的)第一目标靶抗原，而不特异性地结合第二目标靶抗原。
本文所公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)的“特异性”可基于亲和力和/或亲合力来确定。本文所公开的氨基酸序列的“亲和力”由本文公开的该氨基酸序列和其结合的目标靶蛋白的解离平衡常数表示。KD值越低，本文公开的氨基酸序列与其结合的目标靶蛋白之间的结合强度越强。可替换地，亲和力还可以对应于1/KD的亲和常数(KA)的方式来表达。本文所公开的氨基酸序列的结合亲和力可以技术人员已知的方式确定，这取决于具体的目标靶蛋白。本文公开的氨基酸序列“亲合力”是本文所公开的氨基酸序列与相关目标靶蛋白之间的结合强度的量度。亲合力既与目标靶蛋白上的结合位点与本文所公开的氨基酸序列上的结合位点之间的亲和力相关，还与本文所公开的氨基酸序列上存在的相关结合位点的数目相关。在一些实施方式中，本文所公开的氨基酸序列将以低于约1微摩尔(1μΜ)且优选低于约1纳摩尔(1nM)的解离常数(KD)结合目标靶蛋白[即，缔合常数(KA)为约1,000,000/摩尔(106M-1、1E6/M)或更高，并且优选约1,000,000,000/摩尔(109M-1、1E9/M)或更高]。大于约1毫摩尔的KD值通常被认为表示未结合或非特异性结合。本领域通常已知的是，KD还可以表达为复合物的解离速率常数(表示为kOff，单位为：秒-1或s-1)与其缔合速率常数(表示为kOn，单位为：摩尔-1秒-1或M-1s-1)之比。在一些实施方式中，本文所公开的氨基酸序列将以0.1和0.0001s-1之间的kOff和/或1,000和1,000,000M-1s-1之间的kOn结合目标靶蛋白。可以通过本领域技术人员已知的手段或方法(例如ELISA方法、等温滴定量热法、表面等离子体共振、荧光激活细胞分选分析等)来确定结合亲和力、kOff速率和kOn速率。
在一些实施方式中，本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH)，当已从其生产的宿主细胞和/或培养基中提取或纯化时，被认为是如本文使用的“(处于)基本分离的(形式)”。
关于氨基酸序列，特别是抗体片段，如本文所公开的VHH或其功能性片段，存在于本文公开的氨基酸序列上的术语“结合区”、“结合位点”或“相互作用位点”，在本文中应具有存在于本文所公开的氨基酸序列中的氨基酸残基的特定位点、部分、结构域或节段(stretch)的含义，其负责结合靶分子。在一些实施方式中，这些结合区基本由来自本文所公开的氨基酸序列的与靶分子接触的具体氨基酸残基组成。
如本文中可互换使用的术语“与...竞争”、“交叉阻断”、“交叉结合”和“交叉抑制”，通常是指如使用合适的体外、细胞或体内测定法测量的，本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH)可以干扰本文所公开的其它氨基酸序列与目标靶蛋白的结合。因此，在一些实施方式中，使用本文所公开的氨基酸序列的“与...竞争”、“交叉阻断”、“交叉结合”和“交叉抑制”，可以是指干扰本文所公开的另一氨基酸序列与目标靶蛋白的结合或与其竞争，由此如使用合适的体外、细胞或体内测定法所测量的，与在未使用本文所公开的“交叉阻断“氨基酸序列时本文所公开的其它氨基酸序列与目标靶蛋白的结合相比，结合被降低至少10％，但优选至少20％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高。
如果本文所公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)对两个不同的目标靶蛋白均具有特异性(如本文所定义的)时，认为氨基酸序列对这些不同的目标靶蛋白显示出“交叉反应性”。
在本文所公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)的两个以上的结合位点都针对或特异性结合目标靶的氨基酸残基的同一位点、决定簇、部分、结构域或节段的情况下，本文所公开的氨基酸序列被认为是“二价的”(在氨基酸序列上有两个结合位点的情况下)或“多价的”(在氨基酸序列上有多于两个结合位点的情况下)，诸如例如三价。
如本文所使用的，在提及抗体片段(诸如VHH或其功能性片段)时的术语“一价”表示单体形式的抗体片段。一价抗体片段只含有一个结合位点。在上下文中，抗体片段(诸如VHH或其功能性片段)的结合位点涵盖抗体片段针对或特异性结合目标靶的氨基酸残基的特定位点、决定簇、部分、结构域或节段的一个或多个“互补性决定区”或“CDR”。
如本文所使用的，在提及抗体片段(诸如VHH或其功能性片段)时的术语“未标记的”表示不含有外来多肽序列的抗体片段(例如，仅含有使用本文的放射性同位素标记的VHH序列或其片段)。示例性的外来多肽序列包括羧基末端多肽标记，例如His-标记、含半胱氨酸的标记(例如GGC-标记)和/或Myc-标记。
在提及本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH)时的术语“双特异性”意味着：a)本文所公开的氨基酸序列的两个以上结合位点针对或特异性结合相同目标靶，但不是结合靶的氨基酸残基的相同(即不同)位点、决定簇、部分、结构域或节段，本文所公开的氨基酸序列被认为是“双特异性的”(在氨基酸序列上有两个结合位点的情况下)或“多特异性的”(在氨基酸序列上具有多于两个结合位点的情况下)，或者b)本文所公开的氨基酸序列的两个以上结合位点针对或特异性结合不同的目标靶分子。在本文所公开的氨基酸序列上存在多于两个结合位点的情况下使用术语“多特异性”。
在一些实施方式中，如本文使用的“双特异性”氨基酸序列或抗体片段(诸如“双特异性”VHH)或“多特异性”氨基酸序列或抗体片段(诸如“多特异性”VHH)应具有以下含义：本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH)分别包含两个或至少两个结合位点，其中两个或更多个结合位点具有不同的结合特异性。在一些实施方式中，如果在相同的单体氨基酸序列中分别存在两个或更多个不同的结合区域，那么本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH)被认为是“双特异性的”或“多特异性的”。
本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)的“半衰期”通常可以定义为本文所公开的氨基酸序列的体内血清浓度被降低50％所需的时间。本文所公开的氨基酸序列的体内半衰期可以本领域技术人员已知的任何方式确定，诸如通过药代动力学分析。如本领域技术人员清楚了解的，半衰期可以使用诸如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)等参数来表达。体内半衰期增加通常表征为参数t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)中的一个或多个且优选全部三个的增加。
在提及本文公开的抗体片段(诸如VHH或其功能性片段)时的术语“寿命延长”，被用来表示抗体片段已被修饰以延长该抗体片段的半衰期。用于延长抗体和抗体片段半衰期的策略在本领域是公知的，并且包括例如但不限于连接(化学地或以其它方式)到延长半衰期的一个或多个基团或部分，诸如聚乙二醇(PEG)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、抗体Fc片段、或靶向血清蛋白(诸如血清白蛋白)的抗原结合抗体片段。
如本文使用的，术语“抑制”、“减少”和/或“防止”可以是指(使用)本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)特异性结合目标靶抗原，并且抑制、减少和/或防止目标靶抗原与其天然结合伴侣之间的相互作用。术语“抑制”、“减少”和/或“防止”还可以是指(使用)本文所公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)特异性结合目标靶抗原，并且抑制、减少和/或防止目标靶抗原的生物活性，如使用合适的体外、细胞或体内测定法所测量的。因此，“抑制”、“减少”和/或“防止”还可以是指(使用)本文公开的氨基酸序列特异性地结合目标靶抗原并且抑制、减少和/或防止该目标靶抗原所参与的一种或多种生物或生理机制、效应、反应、功能途径或活性。取决于目标靶抗原，可以以任何适合的方式和/或使用本领域公知的任何适合的(体外和通常是细胞或体内)测定法，来确定本文所公开的氨基酸序列作为拮抗剂的此种作用。
因此，在一些实施方式中，使用本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)的“抑制”、“减少”和/或“防止”可以是指抑制、减少和/或防止目标靶抗原与其天然结合伴侣之间的相互作用，或者抑制、减少和/或防止目标靶抗原的活性，或者抑制、减少和/或防止目标靶抗原所参与的一种或多种生物或生理机制、效应、反应、功能途径或活性，诸如例如使用合适的体外、细胞或体内测定法所测量的，与未使用本文所公开的氨基酸序列但在相同条件下的同一测定法中目标靶抗原的活性相比，活性被抑制、减少和/或防止了至少10％，但优选至少20％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多。此外，“抑制”、“减少”和/或“防止”也可以是指，与不存在本文所公开的氨基酸的相同条件相比，诱导降低目标靶抗原对一种或多种其天然结合伴侣的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性，和/或诱导降低目标靶抗原对目标靶抗原所存在的介质或环境中的一个或多个条件(诸如pH值、离子强度、存在辅因子等)的灵敏度。在本公开的上下文中，“抑制”、“减少”和/或“防止”还可以涉及变构抑制、减少和/或防止目标靶抗原的活性。
如本文所使用的，术语“增强”、“增加”和/或“激活”可以是指(使用)本文所公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)特异性地结合目标靶蛋白并且增强、增加和/或激活该目标靶蛋白与其天然结合伴侣之间的相互作用。术语“增强”、“增加”和/或“激活”也可以是指(使用)本文所公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)特异性地结合目标靶蛋白并且增强、增加和/或激活该目标靶蛋白的生物活性，如使用合适的体外、细胞或体内测定法所测量的。因此，“增强”、“增加”和/或“激活”还可以是指(使用)本文所公开的氨基酸序列特异性地结合目标靶蛋白并且增强、增加和/或激活目标靶蛋白所参与的一种或多种生物或生理机制、效应、反应、功能途径或活性。取决于目标靶蛋白，可以使用任何合适的方式和/或本领域公知的任何合适(体外且通常是细胞或体内)测定法来确定本文所公开的氨基酸序列作为激动剂的此种作用。
本文公开的氨基酸序列(特别是抗体片段，诸如VHH或其功能性片段)的抑制或拮抗活性或增强或激动活性可以是可逆的或不可逆的，但对于药物和药理学应用而言，其通常会可逆地发生。
如本文所使用的，术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、以及它们的片段，诸如Fab、F(ab)2、Fv和保留了亲本抗体的抗原结合功能的其它片段。如此，抗体可以指免疫球蛋白或糖蛋白或它们的片段或部分，或者是指包含在修饰的免疫球蛋白样构架内包含的抗原结合部分的构建体，或者是指包含在包含非免疫球蛋白样框架或支架的构建物内的抗原结合部分。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指具有同质抗体群体的抗体组合物。该术语对抗体的种类或来源没有限制，并且也不指在受到其制造方式的限制。该术语包括完整的免疫球蛋白以及保留抗体的抗原结合功能的片段等。任何哺乳动物物种的单克隆抗体均可用于本公开。但是，在实践中，因为用于制备所需的杂交细胞系或杂交瘤以产生单克隆抗体的大鼠或鼠科细胞系的可用性，抗体通常将是大鼠或鼠科来源的。
如本文所使用的，术语“多克隆抗体”是指具有异质抗体群体的抗体组合物。多克隆抗体通常源自免疫动物或选定人类的混合血清。
如本文所使用的“抗体或其功能性片段的重链可变结构域”是指：(i)天然不具有轻链的重链抗体的重链的可变结构域(在下文中也表示为VHH)，包括但不限于驼科动物或鲨鱼的重链抗体的重链可变结构域；或(ii)常规四链抗体的重链的可变结构域(在下文中也表示为VH)，包括但不限于常规四链抗体的重链的骆驼化(如本文进一步定义的)可变结构域(在下文中也表示为骆驼化的VH)或其任何功能性片段，诸如但不限于特别适合与肿瘤抗原或癌细胞上存在的抗原结合并且存在于和/或可以并入到本文公开的VHH中(可者可以基于和/或来源于本文公开的VHH的CDR序列)的氨基酸残基的一个或多个节段(即小肽)。
如下文进一步描述的，抗体的重链可变结构域的氨基酸序列和结构可以被认为(但不限于此)包含四个框架区或“FR”，它们在本领域和下文中分别被称为“框架区1”或“FR1”、称为“框架区2”或“FR2”、称为“框架区3”或“FR3”和称为“框架区4”或“FR4”，框架区被三个互补决定区或“CDR”(在本领域中分别被称为“互补性决定区1”或“CDR1”、称为“互补性决定区2”或“CDR2”和称为“互补性决定区3”或“CDR3”)中断。
如本文所使用的，在抗体背景下的术语“互补性决定区”或“CDR”指的是H(重链)或L(轻链)的可变区(也分别简写为VH和VL)，并且含有能够特异性结合抗原靶标的氨基酸序列。这些CDR区说明了抗体对特定抗原决定簇结构的基本特异性。这样的区域也被称为“高变区”。CDR代表可变区内的不连续的氨基酸节段，但是不论物种，已经发现这些关键氨基酸序列在可变重链和轻链区内的位置定位，在可变链的氨基酸序列内具有相似的定位。所有典型抗体的可变重链和轻链各自具有3个CDR区，对于各个轻(L)链和重(H)链，每个CDR区与其它区(称为L1、L2、L3、H1、H2、H3)是非连续的。
在一些实施方式中，如下文进一步描述的，抗体(包括VHH或VH)重链可变结构域中氨基酸残基的总数可以在110-130的范围内，优选112-115，最优选113。但应当注意的是，抗体的重链可变结构域的部分、片段或类似物关于它们的长度和/或大小没有特别的限制，只要此类部分、片段或类似物保留了(至少部分的)功能活性，和/或保留了这些部分、片段或类似物所来源的抗体原始重链可变结构域的(至少部分的)结合特异性即可。保留了(至少部分的)功能活性的部分、片段或类似物，和/或保留了这些部分、片段或类似物所来源的抗体原始重链可变结构域的(至少部分的)结合特异性的部分、片段或类似物，在本文中也被进一步称为重链可变结构域的“功能性片段”。
抗体(包括VHH或VH)的重链可变结构域的可变结构域的氨基酸残基根据Kabat etal.(“Sequence of proteins of immunological interest”,US Public HealthServices,NIH Bethesda,Md.,Publication No.91)所给出的重链可变结构域的一般编号进行编号，如以下引用的Riechmann和Muyldermans的文章中应用于来自驼科动物的VHH结构域(参见例如文献的图2)。根据这种编号，重链可变结构域的FR1包含位置1-30处的氨基酸残基，重链可变结构域的CDR1包含位置31-35处的氨基酸残基，重链可变结构域的FR2包含位置36-49处的氨基酸，重链可变结构域的CDR2包含位置50-65处的氨基酸残基，重链可变结构域的FR3包含位置66-94处的氨基酸残基，重链可变结构域的CDR3包含位置95-102处的氨基酸残基，并且重链可变结构域的FR4包含位置103-113处的氨基酸残基。为此，应当注意的是，如本领域众所周知的，对于VHH结构域，每个CDR中的氨基酸残基总数可以改变，并且可以不对应于由Kabat编号表示的氨基酸残基总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可能不被占用，或者实际序列可能含有比Kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常根据Kabat的编号可能会或可能不对应实际序列中氨基酸残基的实际编号。然而，通常可以说，根据Kabat的编号并且不管CDR中的氨基酸残基的数量如何，根据Kabat编号的位置1对应于FR1的起始且反之亦然，根据Kabat编号的位置36对应于FR2的起始且反之亦然，根据Kabat编号的位置66对应于FR3的起始且反之亦然，并且根据Kabat编号的位置103对应于FR4的起始且反之亦然。
用于编号重链可变结构域的氨基酸残基的可替换的方法是Chothia et al.(Nature 342,877-883(1989))描述的方法、所谓的“AbM定义“和所谓的“接触定义”。但是，在本说明书、权利要求书和附图中，除非另有说明，否则将遵循由Riechmann和Muyldermans应用于VHH结构域的根据Kabat的编号。
对于重链抗体及其可变结构域的一般描述，尤其参考作为一般背景技术提及的以下参考文献：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678,WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591,WO 99/37681,WO 00/40968,WO 00/43507,WO 00/65057,WO 01/40310,WO 01/44301,EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voorBiotechnologie(VIB)的WO 97/49805,WO 01/21817,WO 03/035694,WO 03/054016和WO03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx NV的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO01/90190；Institute of Antibodies的WO 03/025020(＝EP 1 433 793)；以及Ablynx NV的WO 04/041867,WO 04/041862,WO 04/041865,WO 04/041863,WO 04/062551和Ablynx NV的其它公开的专利申请；Hamers-Casterman et al.,Nature 1993年6月3日；363(6428):446-8；Davies和Riechmann,FEBS Lett.1994年2月21日；339(3):285-90；Muyldermans etal.,Protein Eng.1994年9月；7(9):1129-3；Davies和Riechmann,Biotechnology(NY)1995年5月；13(5):475-9；Gharoudi et al.,第九届应用生物技术论坛,Med.Fac.LandbouwUniv.Gent.1995；60/4a第I部分:2097-2100；Davies和Riechmann,Protein Eng.1996年6月；9(6):531-7；Desmyter et al.,Nat.Struct.Biol.1996年9月；3(9):803-11；Sheriffet al.,Nat Struct Biol.1996年9月；3(9):733-6；Spinelli et al.,Nat 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通常，应注意的是，本文所用的术语“重链可变结构域”在其最广义上不限于特定的生物来源或特定的制备方法。例如，如将在下面更详细地讨论的，如本文所公开的衍生自重链抗体的重链可变结构域(即VHH)可以通过以下方式获得：(1)分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)“骆驼化”(如下文的描述)来自任何动物物种(特别是哺乳动物特种，诸如来自人类)的天然存在的VH结构域，或表达编码这种骆驼化的VH结构域的核酸；(4)如Ward et al(同上文)所描述的，“骆驼化”的“结构域抗体”或“Dab”，或表达编码此种骆驼化的VH结构域的核酸；(5)使用用于制备蛋白质、多肽或其他氨基酸序列的合成或半合成技术；(6)使用用于核酸合成的技术制备编码VHH的核酸，随后表达由此获得的核酸；和/或(7)前述的任何组合。基于本文的公开，本领域技术人员将清楚用于执行前述的合适方法和技术，并且例如包括下文更详细方法和技术。
本文使用的术语“有效量”是指达到所需结果或多个结果所需的量。
如本文所使用的，术语“确定”、“测量”、“评估”、“监测”、“检测”和“测定”可以互换使用，并且包括定量确定和定性确定。
如本文所使用的，术语“治疗”包括预防和/或治疗某种疾病和/或病症，预防某种疾病和/或病症的发作，减缓或逆转某种疾病和/或病症的进展，预防或减缓与某种疾病和/或病症相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与某种疾病和/或病症相关的一种或多种症状，减少某种疾病和/或病症的严重程度和/或持续时间，和一般而言对于所治疗的受试者或患者有益的本文所公开的氨基酸序列的任何预防或治疗效果。
如本文所使用的，术语“诊断”、“预测”和/或“预后”包括诊断、预测和/或预后某种疾病和/或病症，从而预测某种疾病和/或病症的发作和/或存在，和/或预测某种疾病和/或病症的进展和/或持续时间，和/或预测患有某种疾病和/或病症的患者对治疗的反应。
如本文所使用的，术语“肿瘤特异性抗原”、“肿瘤抗原”、“存在于癌细胞或实体瘤上的靶蛋白”、“肿瘤特异性靶(蛋白质)”、“肿瘤相关抗原”在本文中可互换使用，并且包括仅存在于肿瘤细胞上而不存在于任何其他细胞上的任何蛋白质，并且还包括存在于某些肿瘤细胞上并同时存在于一些正常健康的细胞上的蛋白质。肿瘤抗原的非限制性实例包括组织分化抗原、突变蛋白抗原、致癌病毒抗原、癌-睾丸抗原和血管或基质特异性抗原。
如本文所使用的，术语“肿瘤细胞”或“癌细胞”可互换使用，并且是指存在于原发性或转移性肿瘤病变中的细胞。在一些实施方式中，肿瘤不仅由癌细胞构成，而且应该被认为是器官样结构，其中在转化细胞和非转化细胞之间存在复杂的双向相互作用。在一些实施方式中，转化细胞的恶性潜能需要来自基质的适当支持结构，其可以由成纤维细胞、脂肪细胞、血液和淋巴管组成，但也可能被广泛的免疫细胞大量渗透。在一些实施方式中，肿瘤细胞是血液肿瘤细胞。在一些实施方式中，肿瘤细胞是实体瘤细胞。
如本文中使用的，在“放射性标记的”氨基酸序列、“放射性标记的”抗体片段或“放射性标记的”VHH中的“放射性标记的”该氨基酸序列、抗体片段或VHH的放射性同位素标记，其中通过将放射性核素包括、偶联或化学连接到氨基酸序列结构来标记氨基酸序列、抗体片段或VHH。本文公开的放射性标记的抗体片段可以来自天然存在的多肽，或者它们也可以是完全人为设计的。可以被放射性标记的这种天然存在的多肽的非限制性实例包括重链抗体(hcAb)，诸如但不限于骆驼科重链抗体。
如本文所使用的，术语“放射性核素”、“放射活性核素”、“放射性同位素”或“放射活性同位素”在本文中可互换使用并指代具有不稳定核的原子，其特征在于可以将过量的可用能量传递给核内新产生的辐射粒子或经由内部转换。在这个过程中，认为放射性核素经历了放射性衰变，导致伽马射线和/或亚原子粒子例如α或β粒子的发射。这些发射构成电离辐射。放射性核素自然发生，或可以人工产生。在一些实施方式中，放射性同位素是“γ发射体”和“β发射体”两者，意味着放射性同位素发射γ射线和β粒子两者。
“癌症”或“肿瘤”是指原发性肿瘤和/或转移(无论何处)，例如但不限于实体瘤或血液癌症，或实体瘤或血液癌症的转移。在一些实施方式中，“实体瘤”是形成离散肿瘤块的肿瘤，例如肉瘤和癌。在一些实施方式中，“血液癌症”是一种血细胞癌，如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方式中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、胃癌、多发性骨髓瘤或淋巴瘤。
如本文所使用的，术语“癌细胞”是指异常分裂且生长不受控制的再生(并且在一些实施方式中无限制地)的细胞，并且其能够脱离、移动到身体的其它部分并且建议另一个位点，称为转移。
如本文所用的“病变”可以指由损伤或疾病引起的身体组织或器官的任何异常改变。在癌症术语中，病变通常指肿瘤。如本文所使用的，如在“HER-2阳性(癌症)病变”、“HER2阳性(乳腺)癌”或“HER2阳性肿瘤”中的术语“HER-2阳性”是指以HER2基因扩增或HER2蛋白过表达为特征并因此与正常健康细胞相比具有异常高水平的HER2基因和/或HER2蛋白的癌性或恶性细胞或组织。HER-2阳性乳腺癌的特征在于，其是以HER2基因扩增或HER2蛋白过表达为特征的癌性乳房细胞。在每5例乳腺癌中约1例中，癌细胞产生过量的HER2，主要是由于一个或多个基因突变导致的HER2基因扩增所引起的。在许多类型的癌症中可发生导致HER2蛋白水平升高，因此HER2蛋白水平升高不限于乳腺癌。
如本文所使用的，“HER-2阴性(癌症)病变”、“HER-2阴性(乳腺)癌”、“HER-2阴性肿瘤”、“HER-2阴性细胞”中的“HER-2阴性”可以指代癌性或恶性细胞或组织或指代正常健康细胞或组织，这两者的特征在于不存在HER2基因扩增或HER2蛋白过表达，并由此特征在于正常水平的HER2基因和/或HER2蛋白。
如本文所使用的术语“原位杂交(ISH)”指的是一种类型的杂交测定法，其使用标记的互补DNA或RNA链(即探针)以定位组织(原位)的部分或切片中的特定DNA或RNA序列，或者如果组织足够小(例如植物种子、果蝇胚胎)，在整个组织(整装ISH)中、在细胞中和在循环肿瘤细胞(CTC)中定位特定DNA或RNA序列。原位杂交是一种用于鉴定组织切片中单个细胞内特定mRNA种类的强大技术，提供生理过程和疾病发病机制的见解。特别地，原位杂交被用于揭示特定核酸序列在染色体上或组织中的位置，这是了解基因的组织、调节和功能的关键步骤。目前使用的关键技术包括：用寡核苷酸和RNA探针(放射性标记的和半抗原标记的)原位杂交到mRNA；用光学和电子显微镜进行分析；整装原位杂交；RNA和RNA加蛋白的双重检测；和荧光原位杂交以检测染色体序列。DNA ISH可以被用来确定染色体的结构。荧光DNA ISH(FISH)可以例如被用于医学诊断以评估染色体完整性。RNA ISH(RNA原位杂交)被用于测量和定位组织切片、细胞、整装(whole mount)和循环肿瘤细胞(CTC)内的RNA(mRNA、lncRNA和miRNA)。
如本文使用的术语“荧光原位杂交(FISH)”是指一种特定类型的原位杂交测定法，其被用于检测和定位染色体上特定DNA序列的存在或不存在。FISH使用的荧光探针仅结合染色体上与其显示出高度序列互补性的那些部分。荧光显微镜可以用来找出荧光探针与染色体结合的位置。FISH通常被用于查找DNA中的特定特征，以用于遗传咨询、医学和物种鉴定。FISH也可用于检测和定位细胞、循环肿瘤细胞和组织样品中的特定RNA靶(mRNA、lncRNA和miRNA)。在这种情况下，其可以帮助限定细胞和组织内基因表达的时空模式。
如本文所使用的术语“免疫组织化学(IHC)”是指通过利用抗体特异性结合生物组织切片中抗原的原理检测组织切片的细胞中的抗原(例如蛋白质)的方法。免疫组织化学染色被广泛用于诊断异常细胞，例如在癌性肿瘤中发现的细胞。IHC还被广泛用于基础研究，以了解生物标志物和差异表达的蛋白质在生物组织的不同部分中的分布和定位。
“曲妥珠单抗”(商品名称：
Figure GDA0003213008120000191
)是一种干扰HER2/neu受体的单克隆抗体。其主要用途是治疗某些乳腺癌。
“帕妥珠单抗”或“2C4”(商品名称：
Figure GDA0003213008120000192
)是一种结合HER2(更特别地是HER2的结构域II)的单克隆抗体，由此抑制HER2与其它HER受体的二聚化。其主要用途是治疗HER2-阳性乳腺癌。
本文使用的术语“原发性肿瘤”是在肿瘤进展开始并继续产生癌性肿块的解剖部位处生长的肿瘤。
本文使用的术语“转移性病变”是指已经从其原始位置扩散到身体的其它部位的恶性或癌性肿瘤。可交换使用的相关医学术语包括“晚期癌症(late-stage cancer)”、“进行性癌症(advanced cancer)”或“转移性疾病”。通常，转移性病变被认为是无法治愈的，但是通常可以通过治疗来控制癌性细胞的扩散并潜地在增加个体的预期寿命。
转移是癌症在其体内起源部位之外传播的术语。因此，转移性病变是在原发性肿瘤的原始起点之外的位置发现的癌性肿瘤。当来自原发肿瘤的细胞脱落并通过淋巴系统和血流移动到身体的远处部分时，发生转移性肿瘤。可替换地，来自原始肿瘤的细胞可以种入到邻近器官或组织处的新肿瘤中。如本文所用的“转移性疾病”是指晚期癌症并且在癌症的医学分类中，当在原始肿瘤附近的淋巴结中发现癌细胞时指处于III期，或在当癌细胞已远远超过原发性肿瘤部位移动到身体的远处部位时指处于IV期。转移性病变最常见于脑、肺、肝脏或骨骼中。患有转移性癌症的个体可能或可能不会经历任何症状，并且这些症状可能与转移细胞重新定位的区域有关。一旦体内存在转移性病变，对于大多数癌症类型，个体的癌症可能被认为是无法治愈的。这意味着用现有的治疗根除每一个存在的癌细胞是极其困难的。在这种情况下，治疗的目标就是减缓肿瘤的生长，以保持最高的生活质量，并潜在地延长个体的预期寿命。在某些情况下，采取适当的症状治疗管理，患有转移性病变的患者可以存活数年。
本文所使用的受试者内辐射的“(计算平均)有效剂量”指的是身体的所有特定组织和器官中等效剂量的组织加权和，并且表示随机健康风险，其中癌症诱导的概率和电离辐射的基因效应传递给那些身体部分。其考虑到了辐射的类型和被照射的每个器官或组织的性质。其是国际放射防护委员会(ICRP)制定的国际放射防护体系中放射防护剂量限制的核心数量。有效剂量的SI单位是西弗特(Sv)，其是一焦耳/千克(J/kg)。有效剂量代替了1991年ICRP剂量数量体系中的“有效剂量当量”。对于使用放射性药物的程序，有效剂量通常表示为每单位注射活性，即用mSv/MBq表示。个体患者的有效剂量将取决于放射性药物的注射活性(用MBq表示)和计算的平均有效剂量(用mSv/MBq表示)。
使用FDA于2004年批准的
Figure GDA0003213008120000201
软件来计算放射性药物的有效剂量。
Figure GDA0003213008120000202
个人计算机代码执行放射性药物的剂量计算和动力学建模(OLINDA/EXM代表器官级别内部剂量评估/指数建模(Organ Level INternal Dose Assessment/EXponential Modeling))。
Figure GDA0003213008120000203
从全身施用的放射性药物计算身体不同器官的放射剂量并且并对用户提供的生物动力学数据进行回归分析，以支持核医学药物的此种计算。这些计算被用于执行此种药物在核医学诊断和治疗应用中使用的风险/收益评估。该技术采用了许多用于成人、儿童、孕妇等的标准身体模型，这些模型在内部剂量群体中被广泛接受和使用。这些计算对制药行业的开发者、核医学专业人员、教育者、监管者、研究人员以及研究在向患者或研究受试者给予放射活性药物时应当递送的接受放射剂量的其它人员都是有用的。
所计算的有效剂量取决于所选择的标准身体模型和所选的排尿膀胱模型。已经使用女性成人模型和lh的排尿膀胱间隔来计算本文提供的数值。
如本文所使用的，“筛选剂量”或“生物标志物剂量”是药剂(诸如本文所描述的放射性标记的抗体片段)的剂量，其足以选择用于治疗的受试者，诸如可以结合受试者中的癌细胞或实体瘤并随后可在癌细胞或实体瘤的位置检测到的剂量，例如通过使用伽马照相机成像(诸如平面伽马照相机成像、单光子发射计算机断层成像或正电子发射断层成像)，可选地与非核成像技术(例如X射线成像、计算断层照相和和/或磁共振成像)结合，来对受试者进行成像。在一些实施方式中，筛选剂量是不具有治疗效果的剂量。在一些实施方式中，筛选剂量不同于(例如低于)本文的治疗剂量。
如本文所使用的，“治疗剂量”是药剂(诸如本文所描述的放射性标记的抗体片段)的剂量，其在需要此种治疗的受试者(例如患有癌症的受试者)中的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％中是治疗有效的。在一些实施方式中，治疗剂量高于本文的筛选剂量。
如本文所使用的，“成像受试者”是指使用能够检测如本文的放射性标记的抗体片段的装置来捕获受试者的一个或多个图像。为了增强图像(例如，通过调整一个或多个图像的对比度或亮度)，计算机程序和/或本领域技术人员可以进一步改变一个或多个图像。预期可使用能够检测如本文的放射性标记的抗体片段的任何装置，诸如伽马相机成像装置，如平面伽马相机成像、用于单光子发射计算断层照相的装置或用于正电子发射断层成像的装置，或者能够将核成像技术与非核成像技术(例如X射线成像、计算断层照相和/或磁共振成像)组合的装置。例如，此种装置可以是用于单光子发射计算机断层成像/计算断层照相(SPECT/CT)成像的装置。此种装置在本领域中是已知的并且可商购。
如本文所使用的，术语“受试者”通常是指哺乳动物，诸如人类、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、兔子、狗、猫、猪、马、山羊或绵羊。在一些实施方式中，受试者是人类受试者。在一些实施方式中，受试者是患有癌症的受试者(例如患有癌症的人类受试者)。鉴定患有癌症的受试者的方法包括检测肿瘤抗原或其他肿瘤生物标志物、基因测试、MRI、X射线、PET扫描、活组织检查及它们的组合。
如本文所使用的，术语“接头”是指将一个分子连接到另一个分子上的部分(例如，将放射性同位素连接到抗体片段如VHH或其功能性片段)。接头可以是化学接头、核苷酸接头、肽接头或它们的任何组合。
II.用于分层和治疗受试者的方法和组合物
在一个方面中，本公开提供了分层和治疗受试者的方法，例如用于选择用于治疗的受试者并且随后治疗所选择的受试者。
在一些实施方式中，方法包括：基于在受试者中对筛选剂量的放射性标记的抗体片段(例如放射性标记的VHH或其功能性片段)的检测，选择用于治疗的受试者(例如本文的患有癌症的受试者)，放射性标记的抗体片段特异性地结合存在于癌细胞或实体瘤上的靶蛋白；和向受试者给予治疗剂量的放射性标记的抗体片段。在一些实施方式中，放射性标记的抗体片段是使用作为γ-发射体和β-发射体两者的放射性同位素进行放射性标记的。作为β-发射体和γ-发射体两者的适合放射性同位素的例子包括例如碘-131、镥-177、钇-90、铜-67、铼-186和铼-188。在一些实施方式中，放射性同位素是碘-131。
在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，筛选剂量为不是治疗有效的剂量。在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，筛选剂量低于本文的治疗剂量(例如，比本文的治疗剂量低至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍或至少约1000倍，或者比本文描述的治疗剂量低至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约320、至少约340、至少约360、至少约380、至少约400、至少约450、至少约500、至少约1000、至少约5000、至少约10000、至少约13000、至少约15000、至少约18000或至少约20000MBq)。在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，筛选剂量在约10MBq和约400MBq之间、约20MBq和约400MBq之间、约30MBq和约400MBq之间、约40MBq和约400MBq之间、约50MBq和约400MBq之间、约100MBq和约400MBq之间、约200MBq和约400MBq之间、约300MBq和约400MBq之间、约10MBq和约300MBq之间、约20MBq和约300MBq之间、约30MBq和约300MBq之间、约40MBq和约300MBq之间、约50MBq和约300MBq之间、约100MBq和约300MBq之间或约200MBq和约300MBq之间。在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，筛选剂量为约37MBq和约370MBq之间。应当理解的是，本文的任何筛选剂量可以与本文的任何治疗剂量组合。
在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，治疗剂量高于本文的筛选剂量(例如，比本文的筛选剂量高至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍或至少约1000倍，或者比本文的筛选剂量高至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约320、至少约340、至少约360、至少约380、至少约400、至少约450、至少约500、至少约1000、至少约5000、至少约10000、至少约13000、至少约15000、至少约18000或至少约20000MBq)。在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，治疗剂量在约300MBq和约20000MBq之间、约400MBq和约20000MBq之间、约500MBq和约20000MBq之间、约1000MBq和约20000MBq之间、约2000MBq和约20000MBq之间、约3000MBq和约20000MBq之间、约4000MBq和约20000MBq之间、约5000MBq和约20000MBq之间、约10000MBq和约20000MBq之间、约5000MBq和约20000MBq之间、约10000MBq和约20000MBq之间、约300MBq和约10000MBq之间、约400MBq和约10000MBq之间、约500MBq和约10000MBq之间、约1000MBq和约10000MBq之间、约2000MBq和约l0000MBq之间、约3000MBq和约10000MBq之间、约4000MBq和约10000MBq之间或约5000MBq和约10000MBq之间。在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，治疗剂量为约370MBq和约18500MBq之间。
在一些实施方式中，可以利用特定筛选剂量和治疗剂量，其取决于疾病的性质(例如肿瘤或癌细胞的类型、等级和阶段等)以及受试者的类型(例如种类、体质、年龄、性别、体重等)。
在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，方法进一步包含：在选择受试者之前，向受试者给予筛选剂量，并且在受试者的肿瘤部位检测放射性标记的VHH或其功能性片段的存在。肿瘤部位可以是例如实体瘤部位(例如受试者中的一个或多个器官或组织)或血液癌症部位(例如在受试者的循环系统或其一部分中)。在一些实施方式中，给予筛选剂量和检测间隔至少1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约40分钟、至少约50分钟、至少约1小时、至少约1.5小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约2天或至少约7天。在一些实施方式中，给予筛选剂量和检测间隔约1小时至约24小时。
在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，检测放射性标记的VHH或其功能性片段的存在包含对受试者成像。在一些实施方式中，成像是伽马照相机成像，诸如平面伽马照相机成像、单光子发射计算机断层成像或正电子发射断层成像，任选地结合非核成像技术，诸如X射线成像、计算机断层成像和/或磁共振成像。在特定的实施方式中，成像是单光子发射计算断层照相结合计算断层照相(SPECT/CT)。
在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，筛选剂量和治疗剂量的给予相隔至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少1个月、至少约2个月或至少约6个月。在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，筛选剂量和治疗剂量的给予相隔在约1天和约6个月之间(例如相隔在约1天和约2个月之间、约1天和约1个月之间、或约1天和约1周之间)。
在任何一种所提供的方法的一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2。本文进一步描述了特异性结合HER2的此种放射性标记的VHH或其功能性片段。
筛选剂量和治疗剂量可以各自独立地通过任何合适的途径给予，例如系统地(systemically)、局部地(locally)或局部地(topically)施用。示例性的途径包括静脉内、腹膜内和鞘内给予。在一些实施方式中，可以利用的特定途径，其取决于疾病的性质(例如肿瘤或癌细胞的类型、等级、位置和阶段等)以及受试者的类型(例如种类、体质、年龄、性别、体重等)。
在又另一方面，提供了在本文的方法中使用的一种或多种组合物，组合物包含本文所公开的放射性标记的抗体片段(例如放射性标记的VHH或其功能性片段)和/或如本文所设想的核酸序列以及任选地至少一种可接受的载体。根据一些实施方式，组合物可以进一步包含至少一种其它化合物。在一些实施方式中，提供了一种筛选组合物和一种治疗组合物，其中筛选组合物和治疗组合物具有不同量的本文所公开的放射性标记的抗体片段(例如不同量的放射性标记的VHH或其功能性片段)。
在一些实施方式中，如本文所公开的组合物是药物组合物。
药物组合物可以用于本文的方法中(例如本文描述的分层和治疗受试者(诸如人类受试者或其它哺乳动物受试者)的方法)。
通常，对于药物用途，如本文所公开的放射性标记的抗体片段(例如放射性标记的VHH或其功能性片段)可以被配制为药物制剂或组合物，其包含至少一种如本文的放射性标记的抗体片段(例如放射性标记的VHH或其功能性片段)和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，以及任何的一种或多种其它药学活性多肽和/或化合物。例如，此种配方可适用于腹膜内、静脉内、鞘内或其他给予。
适用于注射或输注的药物剂型可以包括无菌水溶液或分散液或无菌粉末，其包含适用于临时制备无菌注射性或输注性溶液或分散液的活性成分，该活性成分任选地包封在脂质体中。在制造和储存的条件下，最终的剂型应该是无菌、流体且稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及它们的合适混合物。
在一些实施方式中，本公开以10μg和1000μg之间的VHH或其功能性片段的量提供如本文公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，特别地量为在约10μg和约100μg之间，更特别地量为在约20μg和约100μg之间，诸如量为约50μg。在一些实施方式中，本公开提供如本文的筛选剂量和治疗剂量，它们各自独立地具有在10μg和1000μg之间的量的本文的VHH或其功能性片段，特别地在约10μg和约100μg之间的量，更特别地在约20μg和约100μg之间的量，诸如约50μg的量。在一些实施方式中，本公开提供如本文的筛选剂量和治疗剂量，它们各自独立地具有在10μg和1000μg之间的量的本文的VHH或其功能性片段，特别地在约10μg和约100μg之间的量，更特别地在约20μg和约100μg之间的量，诸如约50μg的量，其中筛选剂量具有比治疗剂量更低的比活性(例如对于相同或相似量(诸如10或100μg内)的VHH或其功能性片段，放射性的量较低)。在一些实施方式中，本公开提供了在37MBq和370MBq之间的筛选量的本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中，存在于剂量中的VHH或其功能性片段的量在10μg和1000μg之间，特别是在约10μg和约100μg之间，更特别是在约20μg和约100μg之间，诸如约50μg。在一些实施方式中，本公开提供治疗剂量在370MBq和18500MBq的本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中存在于剂量中的VHH或其功能性片段的量在10μg和1000μg之间，特别是在约10μg和约100μg之间，更特别是在约20μg和约100μg之间，诸如约50μg。
筛选和/或治疗剂量可方便地以单一剂量或以在适当的时间间隔给予的分开剂量(其可再次被分剂量)存在。治疗剂量的给予方案可以包括长期(例如至少两周，和例如数月或数年)或每日治疗。在一些实施方式中，治疗剂量的给予方案可以在每天一次到每月一次之间变化，例如在每天一次和每两周一次之间变化，例如但不限于每周一次。因此，在一些实施方式中，本文公开的药物组合物可以一次或多次给予，也可以间歇地给予，例如每天一次，持续数天、数周或数月。
在一些实施方式中，本文公开的放射性标记的抗体片段(例如放射性标记的VHH或其功能性片段)可以与可用于预防和/或治疗本文疾病和病症的其它药物活性化合物或要素组合使用，由此可能或可能不获得协同效应。
在一些实施方式中，包含本文公开的VHH序列的本文公开的放射性标记的抗体片段(例如放射性标记的VHH或其功能性片段)与一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段一起施用。因此，在一些实施方式中，本文所公开的放射性标记的抗体片段的治疗剂量与具有一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段的常规免疫治疗组合。在一些实施方式中，本文所公开的放射性标记的VHH序列或其功能性片段与一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段一起用于组合疗法或组合治疗方法中，诸如但不限于与曲妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000261
和/或帕妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000262
一起的组合治疗。如果两种药物同时给予，它们可以一起配制成单一药物制剂，或者它们在即将给予之前由两种不同的药物制剂混合在一起，例如通过溶解或稀释成一个单一的输注溶液。在另一个实施方式中，两种药物分开给予，即作为两种独立的药物组合物。
除了施用所定义的组合之外，本公开还包括其它药剂的使用。例如，其可以是一种或多种另外的化学治疗剂。其也可以是用于预防、抑制或改善给定的任何其它药物的不良副作用的一种或多种药剂。例如，可以应用刺激白细胞增殖的细胞因子来改善白细胞减少症或嗜中性白细胞减少症的效应。
本文所公开的放射性标记的抗体片段(例如放射性标记的VHH或其功能性片段)的功效以及包含放射性标记的抗体片段的组合物的功效，可以使用本领域已知或本文的任何合适的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或动物模型或它们的任何组合来测试，这取决于所涉及的具体疾病或病症。技术人员将清楚合适的测定法和动物模型。
III.放射性标记的抗体片段
在一个方面中，本公开提供了特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的放射性标记的抗体片段，诸如VHH序列或其功能性片段，其用于受试者的分层和后续治疗，例如患有癌症的受试者。
本文公开的放射性标记的抗体片段可以使用本领域已知的或本文的任何方法制备，例如本文公开的放射性标记的抗体片段可以来自天然存在的多肽，或者他们可以完全人工设计。此种天然存在的多肽的非限制性例子包括重链抗体(hcAb)，诸如但不限于骆驼科动物重链抗体。
在一些实施方式中，本文公开的来源于重链抗体的重链可变结构域(即VHH)由单个多肽链组成并且未经过翻译后修饰。在一些实施方式中，本文公开的VHH或其功能性片段来源于先天性或适应性免疫系统，优选来源于先天性或适应性免疫系统的蛋白质。在一些实施方式中，本文公开的VHH包含4个构架区和3个互补决定区或它们的任何合适的片段(由此其通常会含有形成至少一个互补决定区的氨基酸残基的至少一些)。在一些实施方式中，优选在微生物重组表达系统中以高产率生产本文公开的VHH，并且随后进行分离和/或纯化。
根据特定的实施方式，本公开提供了许多特别适合与肿瘤抗原或癌细胞抗原(诸如但不限于HER2)结合的氨基酸残基的节段(stretch)。这些氨基酸残基的节段可以存在于和/或可以掺入到本文所公开的VHH中，特别是以它们形成该VHH的抗原结合位点(的一部分)的方式。由于氨基酸残基的这些节段首先产生为抗体的CDR序列(或可以基于和/或来源于此种CDR序列，如下文进一步的描述)，它们在本文中通常也会被称为‘CDR序列’(例如，分别为CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列)。但应当注意的是，本公开在其最广义上不限于氨基酸残基的这些节段在本文所公开的重链可变结构域中可能具有的特定结构作用或功能，只要氨基酸残基的这些节段允许本文所公开的可变结构域特异性地结合肿瘤抗原和/或癌细胞特异性抗原即可。因此，在一些实施方式中，本公开涉及用于癌症分层和治疗的放射性标记的VHH，VHH包含本文的CDR的组合并且特异性地针对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶蛋白。
因此，在特定但非限制性的实施方式中，本文公开的VHH包含从由本文的CDRl序列、CDR2序列和CDR3序列组成的组中选择的至少一个氨基酸序列。在一些实施方式中，本文公开的VHH可以包含至少一个抗原结合位点，其中抗原结合位点包含本文的CDRl序列、CDR2序列和CDR3序列的至少一个组合。
本文公开的并且具有这些CDR序列组合之一的任何VHH或其片段优选能够特异性地结合(如本文定义的)肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原。在一些实施方式中，在溶液中，VHH或其片段以所述可变结合域的10-8M以下的解离常数(KD)特异性地结合肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原。在特定的实施方式中，本文公开的针对HER2的VHH或其片段是这样的，其能够以低于5nM的解离常数(KD)特异性地结合HER2，诸如1至5nM，优选2至3nM。
可以以公知的任何适合方式来确定VHH与肿瘤抗原或癌细胞抗原的特异性结合，方式包括例如生物淘选、Scatchard分析和/或竞争性结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)和夹心竞争测定法以及本领域已知的它们不同的变型。
在其它特定的实施方式中，本文公开的VHH或其片段包含至少一个选自以下组的CDR序列的组合，该组包括：
具有SEQ ID NO:l的CDR1区、具有SEQ ID NO:2的CDR2区和具有SEQ ID NO:3的CDR3区，和/或
具有SEQ ID NO:4的CDR1区、具有SEQ ID NO:5的CDR2区和具有SEQ ID NO:6的CDR3区。
因此，在特定的实施方式中，本公开提供了来源于具有以下(通用)结构的重链抗体的重链可变结构域：
FRl-CDRl-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别指代框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别指代互补决定区1至3，并且如本文进一步的定义。
SEQ ID NO:7和8(参见表1)给出了已针对HER2产生的示例性重链可变结构域的氨基酸序列。
表1：VHH序列
Figure GDA0003213008120000281
在一些实施方式中，本公开提供了针对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶抗原的放射性标记的VHH或其片段，其与SEQ ID NO:7或8(参见表1)的重链可变结构域或其功能性片段中的至少一个具有至少80％、至少85％(诸如90％或95％或更高)序列同一性。在一些实施方式中，针对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶抗原的放射性标记的VHH或其片段，由与编码此种重链可变结构域或其功能性片段的核酸序列具有至少80％、至少85％(诸如90％或95％或更高)序列同一性的核酸编码。
在一些实施方式中，本文公开的重链可变结构域序列是能够结合至HER2和/或针对HER2并且与SEQ ID NO:7或8(见表1)的重链可变结构域中的至少一个具有至少90％氨基酸同一性的那些，其中为了确定氨基酸同一性的程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基。
在SEQ ID NO:7或8的这些示例性重链可变结构域中，CDR序列(见表2)通常如本文进一步的定义。
表2：CDR序列的具体组合(使用IMGT编号标识的CDR序列)
Figure GDA0003213008120000291
应当注意的是，本公开不限制本文公开的VHH或其片段(表达这些的核苷酸序列)的来源，也不限制本文公开的VHH或其片段或核苷酸序列的(或已经)产生或获得方式。因此，本文公开的VHH或其片段可以是天然存在的氨基酸序列(来自任何适合的物种)或者是合成的或半合成的氨基酸序列。在本公开的具体但非限制的方面，氨基酸序列是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何合适的物种)或者是合成的或半合成的免疫球蛋白序列，包括但不限于“人源化的”免疫球蛋白序列(如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特别是部分或完全人源化的VHH序列)，“骆驼化的”免疫球蛋白序列，以及已经通过诸如亲和力成熟(例如，从合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR嫁接、镶饰、组合来自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物进行PCR组装、以及本领域技术人员熟知的用于改造免疫球蛋白序列的类似技术等技术获得的免疫球蛋白序列；或者任何前述的任何适合组合。此外，如本文进一步描述的，本文所公开的VHH或其片段可以适当地被人源化，以便提供本公开的一种或多种进一步(部分或完全)人源化的氨基酸序列。类似地，当氨基酸序列包含合成或半合成序列(例如部分人源化的序列)时，再如本文所描述的，序列可以任选地被进一步适当地人源化，以便提供一种或多种如本文所公开的(部分或完全)人源化的氨基酸序列。
在一些实施方式中，人源化的氨基酸序列可以这样的氨基酸序列，其中存在是和/或对应于人源化取代的至少一个氨基酸残基(并且特别是存在于框架残基中的至少一个中)。另外或者可替换地，通过比较天然存在的VHH序列的框架区序列与一个或多个密切相关的人类VH序列的相应框架区序列，可以确定其它潜在有用的人源化取代，之后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)导入到VHH序列(以本身已知的任何方式，如本文进一步的描述)，并且可以测试所得的人源化VHH序列或其功能性片段对靶的亲和力、稳定性、表达的容易度和水平、和/或其它所需性质。如此，通过有限程度的试错，本领域技术人员可以确定其它合适的人源化取代(或其合适的组合)。
在一些实施方式中，当连接到如本文描述的放射性同位素时，VHH或其功能性片段能够杀死表示本文所公开的VHH或其功能性片段针对的抗原的肿瘤细胞或癌细胞，或者可以可以降低或减缓这种肿瘤细胞或癌细胞的生长和/或增殖。
在一些实施方式中，本文公开的VHH或其功能性片段是使用诸如作为β-发射体和γ-发射体两者的放射性标记进行放射性标记的。可以连接到本文公开的VHH或其功能性片段的作为β-发射体和γ-发射体两者的适合放射性同位素的例子包括例如碘-131、镥-177、钇-90、铜-67、铼-186和铼-188。在一些实施方式中，本文公开的放射性标记的VHH或其功能性片段是使用碘-131进行标记的。
在一些实施方式中，本文所公开的放射性标记的VHH结构域或其功能性片段可以通过一个或多个接头任选地连接到一个或多个其它基团、部分或残基。这些一个或多个其它基团、部分或残基可以用于结合其它目标靶。应该清楚的是，这些其它基团、残基、部分和/或结合位点可以或可以不向本文所公开的重链可变结构域提供进一步的功能，并且可以或可以不修改如本文所公开的重链可变结构域的性质。此种基团、残基、部分或结合单位也可以是例如具有生物活性的化学基团。
在一些实施方式中，这些基团、部分或残基以N-或C-末端连接到重链可变结构域，特别是C-末端连接。
在一些实施方式中，本文所公开的放射性标记的VHH结构域或其功能性片段也可以被化学修饰。例如，这种修饰可涉及将一个或多个官能团、残基或部分引入到重链可变结构域或连接到重链可变结构域上。这些基团、残基或部分可赋予重链可变结构域以一种或多种期望的性质或功能。本领域技术人员将清楚这样的官能团的实例。
例如，这些官能团向重链可变结构域的引入或连接可以导致该重链可变结构域的溶解性和/或稳定性增加，导致该重链可变结构域的毒性降低，或者导致该重链可变结构域的任何不良副作用的消除或减轻，和/或产生其它有利的性质。
在特定的实施方式中，一个或多个基团、残基、部分通过一个或多个适合的接头或间隔物连接到重链可变结构域。
在一些实施方式中，一个或多个基团、残基或部分不赋予本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段以延长的半衰期。因此，在一些实施方式中，本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段是非寿命延长的。
在一些实施方式中，一个或多个基团、残基或部分不诱导本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段的多聚化，例如二聚化。例如，含有羧基末端含半胱氨酸的标记(诸如GCC-标记)的VHH产生单体形式和二聚体形式的平衡混合物(Pruszyski et al.2013NuclMed Biol.40:52-59)。因此，在特定实施方式中，本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段缺乏诱导多聚化(例如二聚化)的标记，更特别地是含半胱氨酸的标记，甚至更特别地是GGC-标记。
在一些实施方式中，本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段不含C-端多肽标记，诸如His-标记和/或Myc-标记。在一些实施方式中，本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段是未标记的。如本文所描述的，与多肽标记的(例如His-标记的和Myc-His标记的)VHH相比，当使用不含羧基末端多肽标记的VHH时，证明肾保留得到显著降低。
虽然本文公开的特异地结合肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的放射性标记的VHH结构域通常是单体形式的(如本文进一步描述的)，但在特定的可替换的实施方式中，两个或更多个如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段可以彼此连接或可以互连。在特定实施方式中，两个或更多个VHH或其功能性片段通过一个或多个适当的接头或间隔物而相互连接。适合用于偶联本文公开的不同VHH的间隔物或接头对是本领域技术人员将是清楚的，并且通常可以是在本领域中用来连接肽和/或蛋白质的任何接头或间隔物。
一些示例性的适合接头或间隔物包括但不限于多肽接头，诸如甘氨酸接头、丝氨酸接头、混合甘氨酸/丝氨酸接头、富含甘氨酸和丝氨酸的接头、或者由大量极性多肽片段组成的接头，或同型双功能或异型双功能化学交联化合物，诸如戊二醛或任选PEG-间隔的马来酰亚胺或NHS酯。
例如，多肽接头或间隔物可以是适合的氨基酸序列，其长度在1和50个氨基酸之间，诸如在1和30个氨基酸之间，并且特别是在1和10个氨基酸残基之间。应当清楚的是，接对的长度、柔性度和/或其它性质可能会对重链可变结构域的性质产生一些影响，包括但不限于对肿瘤靶或癌细胞上的靶的亲和力、特异性或亲合力。应当清楚的是，在使用两个以上接头时，这些接头可以相同或不同。在本公开的背景和公开内容中，本领域技术人员能够确定用于偶联本文所公开的VHH或其功能性片段的最佳接头。
IV.重链可变结构域的功能性片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物
本公开还涵盖本文公开的放射性标记的VHH的片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物，和/或包含或基本组成自这些片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物的一种或多种的多肽。根据本公开的这些片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物通常是功能性的。在一些实施方式中，根据本公开的这些片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物如果它们仍能够特异性地结合肿瘤特异性抗原和/或特异性地结合癌细胞特异性抗原，则认为它们是功能性的。
例如，本公开提供了如本文所公开的VHH的多个CDR序列，其特别适用于结合肿瘤抗原或癌抗原。在一些实施方式中，CDR序列可被认为是如本文所公开的VHH的功能性片段，并且可以存在于和/或可以并入到如本文所公开的任何适合的支架蛋白或VHH中，特别是以此种方式使得它们形成适合的支架蛋白或VHH的抗原结合位点或其一部分。但应当注意的是，本公开在其最广义上不限于这些CDR序列在本文公开的支架或VHH中可能具有的特定结构作用或功能，只要这些CDR序列允许如本文所公开的这些支架或VHH特异性结合肿瘤抗原或癌抗原即可。
V.核酸序列、宿主和宿主细胞
在进一步的方面中，本公开提供了编码如本文描述的抗体片段(诸如VHH或其功能性片段)的核酸序列。这些核酸序列可以为载体的形式，或者可以被整合到基因组(例如细胞的基因组)中。如本文所公开的核酸序列可以是合成或半合成序列、已从文库(诸如表达文库)中分离出来的核苷酸序列、已通过PCR使用重叠引物制备的核苷酸序列、或已使用本领域公知的DNA合成技术制备的核苷酸序列。
如本文所公开的核酸序列可以是DNA或RNA，例如双链DNA。如本文所公开的核酸序列也可以为适合用于转化宿主细胞或宿主生物体的形式，为适合于整合到预定宿主细胞的基因组DNA中的形式，或为适合于在预定宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本公开的核酸序列可以是载体的形式，诸如例如质粒、粘粒，YAC、病毒载体或转座子。在一些实施方式中，载体可以是表达载体，例如可以提供体外表达和/或体内表达(例如在合适的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)的载体。
在又进一步的方面中，本公开提供了宿主或宿主细胞，其表达或能够表达本文所公开的一个或多个氨基酸序列。适用于表达本公开的VHH序列、多肽的宿主或宿主细胞的例子对于本领域技术人员而言是清楚的。
VI.包含VHH结构域的多肽
在进一步的方面中，本公开提供了包含本公开的至少一个VHH序列或基本上由本公开的至少一个VHH序列组成的多肽，其特异性地结合肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原。本公开的多肽可以包含本公开的至少一个VHH或其功能性片段以及任选地通过一个或多个接头连接的任选的一个或多个其它基团、部分、残基。
在一些实施方式中，本公开提供了多肽和药物组合物，其包含单体形式的VHH，即仅包含一个VHH结构域，以便尽可能地减少多肽和药物组合物的体内半衰期。
在可替换的实施方式中，本公开还提供了多肽和药物组合物，其包含两个以上相同或不同VHH结构域，由此产生二价(或多价)或双特异性或(多特异性)多肽。
如本文公开的多肽可以至少含有用于结合其它目标靶或靶蛋白的一个或多个其它基团、部分或残基。应当清楚的是，此种其它基团、残基、部分和/或结合位点可以或可以不给如本文公开的氨基酸序列(和/或其存在于其中的多肽或组合物)提供进一步的功能，并且可以改变或可以不改变如本文所公开的氨基酸序列的性质。此处基团、残基、部分或结合单位也可以是例如可以具有生物学和/或药理学活性的化学基团。在一些实施方式中，这些基团、部分或残基以N-或C-末端连接到本文所公开的氨基酸序列。
在一些实施方式中，进一步的基团、残基或部分不会赋予多肽以延长的半衰期。因此，在一些实施方式中，如本文所公开的多肽是非寿命延长的。
在一些实施方式中，进一步的基团、残基或部分不会诱导本文公开的多肽的多聚化，诸如二聚化。因此，在特定实施方式中，本文公开的多肽不具有诱导多聚化(诸如二聚化)的标记，更特别地为含半胱氨酸的标记，甚至更特别地为GGC-标记。
在一些实施方式中，本文公开的多肽不具有C-末端多肽标记，诸如His-标记和/或Myc-标记。在一些实施方式中，本文所公开的多肽是未标记的。
应当注意的是，本公开并不限制本公开的VHH序列或其功能性片段、多肽或组合物(或用于表达它们的本公开的核苷酸序列)的来源。此外，本公开也不限制产生或获得本文公开的VHH序列、多肽或核苷酸序列。因此，本文所公开的氨基酸序列可以是合成的或半合成的氨基酸序列、多肽或蛋白质。
由本公开提供的氨基酸序列、多肽和组合物可以是基本上分离的形式(如本文所定义的)，或者可替换地可以形成本文公开的多肽或组合物的一部分，其可以包含至少一种本文所公开的氨基酸序列或基本上由至少一种本文所公开的氨基酸序列组成，并且其可以任选地进一步包含一个或多个其它基团、部分或残基(全部任选地通过一个或多个适合的接头连接)。
VII.靶蛋白
在一些实施方式中，本文公开的VHH或其功能性片段是通过针对存在于实体瘤和/或癌细胞上的特定靶蛋白进行亲和力选择而获得的。通过针对特定的实体瘤抗原或癌细胞的亲和力选择获得适合的多肽，例如，可以通过与肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的结合来筛选在表面上表达VHH的细胞组、集合或文库(例如细菌噬菌体)来进行。以下列非限制性步骤提供一种示例性的方法：a)获得肿瘤特异性或癌细胞特异性蛋白质靶分子的分离溶液或混悬液，分子已知是潜在癌症药物的靶；b)针对所述蛋白质靶分子，从VHH文库中生物淘选噬菌体或其它细胞；c)分离出与肿瘤特异性或癌细胞特异性蛋白质靶分子结合的噬菌体或其它细胞；d)从个体结合噬菌体或其它细胞确定编码VHH插入物的核苷酸序列；e)使用重组蛋白质表达，根据该序列产生一定量的VHH；和f)确定所述VHH结构域对肿瘤特异性或癌细胞特异性蛋白质靶分子的亲和力；和任选地g)在生物测定中测试VHH的杀肿瘤或抗癌活性。可以使用各种方法来确定VHH与肿瘤特异性或癌细胞特异性蛋白质靶分子之间的亲和力，包括例如本领域常见的酶联免疫吸附测定法(ELISA)或表面等离子体共振(SPR)测定法，例如描述于Sambrook et al.(2001),Molecular Cloning,A Laboratory Manual.第三版.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中。在一些实施方式中，多肽与其靶分子之间结合的解离常数低于10-5M、低于10-6M、低于10-7M、低于10-8M、诸如低于10-9M、或低于0.5×10-9M、诸如低于10-10M。
在特定的实施方式中，本文公开的VHH以小于5×l0-9M的解离常数特异性地结合肿瘤抗原(例如HER2)，诸如在约1×10-9M和约5×l0-9M之间，诸如在约2×10-9M和约3×10-9M之间。
在一些实施方式中，肿瘤特异性抗原或癌细胞特异性抗原是分别在肿瘤细胞或癌细胞表面上特异性地产生或特异性地表达和/或大量表达的分子，并且在一些实施方式中，在正常健康细胞的表面上不具有或具有相对低的浓度或密度。在一些实施方式中，当这些肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原与如本文公开的放射性标记的VHH或功能性片段结合时，通过放射性毒性的机制，表达抗原的相应肿瘤或癌细胞被杀死或至少被阻止、抑制或减少生长。
合适的肿瘤特异性或癌细胞特异性靶分子容易从本领域技术人员的现有文献或专利数据库获得，并且包括但不限于在由于突变而具有异常结构的肿瘤细胞中产生的任何蛋白质，包括ras和p53基因的异常产物、组织分化抗原、突变蛋白抗原、致癌病毒抗原、癌-睾丸抗原、癌胚抗原和血管或基质特异性抗原。具体的肿瘤抗原的例子包括但不限于CTAG1B、MAGEA1、酶酪氨酸酶、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、EBV和HPV、异常结构化的细胞表面糖脂和糖蛋白以及HER2、EGFR及其变体。
在一些实施方式中，如本文公开的放射性标记的VHH或功能性片段特异性地结合HER2。在一些实施方式中，如本文公开的放射性标记的VHH或功能性片段特异性地结合HER2并且用于在本文中描述的方法中。
在某些非限制性实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2上的结合位点，如使用适当的竞争测定法所确定的，该结合位点不同于HER2的曲妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000351
结合位点，和/或该放射性标记的VHH或其功能性片段不同
Figure GDA0003213008120000352
竞争结合HER2。
在一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2上的结合位点，其不同于(即不是)HER2的结构域IV。在一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2上的结合位点，其不同于(即不是)HER2结构域IV的C-末端。
在一些实施方式中，如使用适当的竞争测定法所确定的，放射性标记的VHH或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000353
竞争结合HER2。
在一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2上的结合位点，其不同于
Figure GDA0003213008120000354
(帕妥珠单抗)在HER2上的结合位点。在一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2上的结合位点，其不同于(即不是)HER2的结构域II。
在一些实施方式中，如使用适当的竞争测定法所确定的，放射性标记的VHH或其功能性片段不与单克隆抗体帕妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000355
竞争结合HER2。
在一些实施方式中，如使用适当的竞争测定法所确定的，放射性标记的VHH或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000356
和单克隆抗体帕妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000357
竞争结合HER2。在进一步的实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2上的结合位点，其不同于曲妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000358
和帕妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000359
在HER2上的结合位点。在一些实施方式中，放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2上的结合位点，其不同于(即不是)HER2上的结构域IV(诸如HER2结构域IV的C-末端)和HER2的结构域II。
用于确定抗原-靶向(例如HER2-靶向)放射性标记的VHH或其功能性片段是否与靶向同一抗原的结合剂(诸如单克隆抗体)竞争的合适的竞争测定法，可以是例如但不限于体内竞争测定法。在体内竞争测定法中，将单独给予放射性标记的VHH或其功能性片段的测试动物中的放射性标记的VHH或其功能性片段的生物分布与在给予放射性标记的VHH或其功能性片段之前已使用结合剂进行预治疗的测试动物中的相应生物分布进行比较，其中基本相同的生物分布特性表明放射性标记的VHH或其功能性片段不与结合剂竞争结合靶抗原。
基于本文的公开内容可以理解的是，在一些实施方式中，如本文所公开的VHH或其功能性片段、多肽和组合物原则上将特异性地结合所有形式的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原。但是，在如本文公开的VHH或其功能性片段、多肽和组合物是用于兽医目的的情况下，它们通常将特异性地结合来自预定待治疗的物种的所有形式的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原，或者它们将至少与来自待治疗物种的所有形式的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原具有交叉反应性。因此，特异性地结合来自一个受试者物种的所有形式的抗原的VHH或其功能性片段、多肽和组合物，可以或可以不显示出与来自一个或多个其它受试者物种的所有形式的抗原的交叉反应性。在一些实施方式中，在开发用于人类或动物的氨基酸序列的背景下，可以开发出这样的VHH序列，其结合来自与研究和实验室检测中使用的待治疗的物种不同的另一种物种的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的形式。
在一些实施方式中，可以预期的是，本公开的VHH或其功能性片段、多肽和组合物能结合肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的许多天然存在或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分或片段。在一些实施方式中，可以预期的是，本公开的VHH或其功能性片段、多肽和组合物至少能结合肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的含有VHH或其功能性片段、多肽和组合物所结合的抗原结合位点或结构域的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分或片段。
在特定的实施方式中，在本公开提供特异性地结合HER2的VHH或其功能性片段的情况下，在本公开范围内的是，本文公开的VHH仅能够结合单体形式的HER2，或者能够结合单体形式和多聚体形式的HER2。在一些实施方式中，如本文公开的VHH或其功能性片段结合单体形式的HER2的亲和力和/或特异性，可以与本文公开的VHH结合多聚体形式的HER2的亲和力和特异性相同或不同(即更高或更低)。
在一些实施方式中，当HER2与其它蛋白质或多肽缔合(例如与其它ERBB受体，也称为异二聚体化)以形成蛋白质复合物(例如具有多个亚基)时，在本公开范围内的是，本文公开的VHH能够结合非缔合状态的HER2，或者能够结合缔合状态的HER2，或能够结合两者。
在一些实施方式中，如本领域技术人员清楚的，从生物学和/或治疗的角度来看，本文公开的VHH至少能结合最相关的HER2的那些形式(包括单体、多聚体和缔合形式)。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以使用合适的等同物对本文描述的方法进行其他合适的修改和改编，而不脱离本文公开的实施方式的范围。现在已经详细描述了某些实施方式，通过参考以下实施例将更清楚地理解这些实施方式，实施例仅仅是为了说明的目的而被包括，并不意在限制。
VIII.抗体片段和药物组合物的生产和制造
本公开进一步提供了用于制备或生产本文描述的抗体片段(诸如VHH或其功能性片段)的方法。本公开还提供了用于生产编码如本文描述的抗体片段(诸如VHH或其功能性片段)的核酸的方法，以及用生产包含如本文描述的这些抗体片段(诸如VHH或其功能性片段)的宿主细胞、产物和组合物的方法。下文描述了此类方法的一些非限制性例子。
本领域技术人员将清楚的是，用于制备如本文公开的重链可变结构域序列的一个示例性方法通常包含步骤：
(a)表达编码如本文公开的重链可变结构域序列的核苷酸序列或者含有编码重链可变结构域序列的核苷酸序列的载体或遗传构建体，和
(b)任选地分离和/或纯化重链可变结构域序列。
在本文设想的特定实施方式中，可以通过以下方法获得肿瘤特异性或癌细胞特异性的重链可变结构域序列，该方法包括生成VHH序列的随机文库和筛选该文库以获得能够特异性结合肿瘤特异性或癌细胞特异性靶蛋白的VHH序列。
在一些实施方式中，用于制备如本文公开的重链可变结构域序列的方法包括步骤：
a)提供VHH结构域的氨基酸序列的组、集合或文库；和
b)对于能够结合和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶具有亲和力的氨基酸序列，筛选所述氨基酸序列的组、集合或文库，和
c)分离能够结合和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶具有亲和力的氨基酸序列。
在此种方法中，VHH序列的组、集合或文库可以是任何适合的氨基酸序列的组、集合或文库。例如，氨基酸序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白片段序列的组、集合或文库(如本文的描述)，诸如免疫球蛋白片段序列的天然组、集合或文库；免疫球蛋白片段序列的合成或半合成的组、集合或文库；和/或已经受亲和力成熟化的免疫球蛋白片段序列的组、集合或文库。
在这种方法的特定实施方式中，VHH序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白片段序列的免疫组、集合或文库，例如来源于已经用肿瘤特异性或癌细胞特异性靶或者使用基于其或由其来源的合适抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物。在一个特定的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在上述方法的一些实施方式中，VHH序列的组、集合或文库可以展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或合适的微生物(如酵母)上，诸如以促进筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(的组、集合或文库)的合适的方法、技术和宿主生物体对于本领域技术人员是清楚的，例如基于本文的进一步公开。还可以参考Hoogenboom在Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)中的综述。
在其它实施方式中，用于产生如本文所公开的重链可变结构域序列的方法至少包含步骤：
a)提供表达VHH结构域氨基酸序列的细胞的集合或样品；
b)对于表达能够结合和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶具有亲和力的氨基酸序列的细胞，筛选细胞的集合或样品；和
c)(i)分离氨基酸序列；或(ii)从所述细胞中分离出编码所述氨基酸序列的核酸序列，随后表达氨基酸序列。
细胞的集合或样品例如可以是B-细胞的集合或样品。在一些实施方式中，在该方法中，细胞的样品可以来源于已经用肿瘤特异性或癌细胞特异性靶或者使用基于其或由其来源的合适抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物。在一个特定的实施方式中，抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在其它实施方式中，用于产生针对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶的重链可变结构域序列的方法可以至少包含步骤：
a)提供编码VHH结构域氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)对于编码能够结合和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶具有亲和力的氨基酸序列的核酸序列，筛选核酸序列的组、集合或文库；和
c)分离核酸序列，随后表达所述氨基酸序列。
在上述方法的一些实施方式中，编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库可以例如是编码免疫球蛋白片段序列的天然组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码合成或半合成免疫球蛋白片段序列的组合、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经经受亲和力成熟化的免疫球蛋白片段序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。
在一些实施方式中，在此种方法中，核酸序列的组、集合或文库编码针对肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原(如本文定义的)的VHH结构域的组、集合或文库。
在上述方法的一些实施方式中，核苷酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或合适的微生物(如酵母)上，诸如以促进筛选。用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的适合方法、技术和宿主生物体对于本领域技术人员是清楚的，例如基于本文的进一步公开。还可以参考Hoogenboom在NatureBiotechnology,23,9,1105-1116(2005)中的综述。
因此，本公开提供了VHH及其功能性片段，它们可通过任一上述方法来获得或由任一上述方法获得，或者可替换地，可通过包含上述方法之一并且还至少包含以下步骤的方法获得：确定VHH序列的核苷酸序列或氨基酸序列；和以本领域已知的方式表达或合成VHH序列，诸如通过在合适的宿主细胞或宿主生物体中表达或通过化学合成。
在一些实施方式中，用于生产如本文的抗体片段(诸如VHH和功能性片段)可以进一步包含步骤：从氨基酸序列文库中分离出对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶具有可检测的结合亲和力的至少一种VHH。
在一些实施方式中，方法可进一步包含步骤：扩增编码对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶具有可检测的结合亲和力的至少一种VHH或其功能性片段的序列。例如，可以通过再次感染宿主细菌并在生长培养基中孵育，扩增从本文方法的选择步骤中获得的展示特定氨基酸序列的噬菌体克隆。
在一些实施方式中，方法可以包括确定能够结合肿瘤特异性或癌细胞特异性靶的一个或多个氨基酸序列的序列。
当在适合的细胞或噬菌体或颗粒上展示了包含在氨基酸序列的组、集合或文库中的重链可变结构域序列的情况下，可以从细胞或噬菌体或颗粒中分离出编码氨基酸序列的核苷酸序列。这样，可以通过常规测序方法确定选定的氨基酸序列文库成员的核苷酸序列。
在进一步的特定实施方式中，用于生产如本文设想的VHH或其功能性片段的方法包括步骤：在合适的条件下在宿主生物体中表达所述核苷酸序列，从而获得所需的氨基酸序列。该步骤可以通过本领域技术人员已知的方法进行。
此外，所获得的对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶具有可检测的结合亲和力的VHH或功能性片段，任选地在它们的序列被确定之后，可以被合成为可溶性蛋白构建体。
例如，通过上述方法获得的、可获得的或选择的VHH或功能性片段可以使用本领域已知的重组或化学合成方法来合成。另外，通过上述方法获得的、可获得的或选择的氨基酸序列可以通过基因工程技术生产。因此，在一些实施方式中，用于合成通过上述方法获得的、可获得的或选择的VHH或功能性片段的方法可以包含：使用编码对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶具有可检测的结合亲和力的氨基酸序列的核酸或载体转化或感染宿主细胞。因此，可以通过重组DNA方法来制造对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶具有可检测的结合亲和力的VHH序列。使用常规程序可以容易地合成编码氨基酸序列的DNA。一旦制备，可以将DNA导入到表达载体中，然后可以将其转化或转染到宿主细胞(诸如大肠杆菌)或任何合适的表达系统中，从而获得氨基酸序列在重组宿主细胞中的表达和/或在这些重组宿主细胞所驻留的介质中的表达。
在一些实施方式中，使用适合的表达系统由表达载体生产的VHH或功能性片段可以使用例如His-标记或其它序列标记进行标记(通常在氨基酸序列的N-末端或C-末端)，以便易于纯化。
将核酸或载体转化或转染入宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的各种方式来完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物射弹。
无论位于体外还是体内，用于表达所需VHH或其功能性片段的合适宿主细胞可以是任何真核或原核细胞(例如，诸如大肠杆菌等细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖类细胞、植物细胞、鱼细胞和昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以位于转基因植物或动物中。
因此，本公开还提供了用于生产对肿瘤或癌细胞特异性抗原具有可检测的结合亲和力的VHH或其功能性片段的方法，包括：使用编码此种VHH或功能性片段序列的核酸序列或载体转化、转染或感染宿主细胞，并且在适合的条件下表达其氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开进一步提供了用于制造或生产本文公开的药物组合物的方法。
在特定的实施方式中，本公开提供了用于生产如本文公开的药物组合物的方法，其至少包含步骤：
-获得至少一种VHH或其功能性片段，其特异性地结合肿瘤或癌细胞特异性抗原，和
-将所述VHH或其功能性片段配制成药物组合物。
在这些方法的特定实施方式中，获得特异性地结合肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原的至少一种VHH或其功能性片段的步骤包括：
(a)表达编码特异性地结合肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原的VHH或其功能性片段的核苷酸序列，和任选地
(b)分离和/或纯化VHH或其功能性片段。
在这些方法的其它特定实施方式中，获得特异性地结合肿瘤特异性或癌细胞特异性蛋白质靶的至少一种VHH或其功能性片段的步骤包括：
(a)提供VHH结构域序列或VHH序列的功能性片段的组、集合或文库；
(b)对于特异性地结合和/或对肿瘤抗原具有亲和力的序列，筛选所述VHH结构域序列或其功能性片段的序列的组、集合或文库，和任选地
(c)分离特异性地结合和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原具有亲和力的VHH序列或其功能性片段的序列。
IX.抗体片段的放射性标记
在一些实施方式中，将本文所公开的抗体片段(诸如VHH或其功能性片段)连接到或偶联(诸如化学偶联)到放射性核素(在本文中也称为放射性同位素)。在一些实施方式中，放射性核素是β-发射体和γ-发射体两者。可以连接到如本文所公开的VHH或其功能性片段的作为β-发射体和γ-发射体两者的适合放射性同位素的例子，包括例如碘-131、镥-177、钇-90、铜-67、铼-186和铼-188。在一些实施方式中，使用碘-131来标记本文公开的放射性标记的VHH或其功能性片段。
有多种放射性标记策略可用于将放射性核素并入到蛋白质(例如VHH或其功能性片段)中。放射化学家的技术选择主要取决于所使用的放射性核素。碘的放射性同位素具有通过亲电取代直接或通过缀合间接整合到分子中的能力。另一方面，放射性金属可以通过与螯合剂络合而标记。许多金属放射性核素具有与螯合剂形成稳定复合物的能力，从而允许与蛋白质(诸如VHH或其功能性片段)缀合。
通常，有两种基本的蛋白质放射性碘化的方法。一种方法是使用在酪氨酸和组氨酸残基上的亲电取代的直接蛋白质标记。放射性碘在原位被氧化产生亲电体*I+。这是使用氧化剂如氯胺T、
Figure GDA0003213008120000421
和N-卤代琥珀酰亚胺等来完成的。产生的亲电体攻击富含电子的氨基酸酪氨酸的芳香环，形成σ-复合物。这种取代在酪氨酸残基上进行，这是由于使σ-复合物稳定的供电子羟基引起的。由于蛋白质的标记必须在温和条件下进行，碘与酪氨酸的连接是合适的。该方法在温和条件下进行，这对于蛋白质的标记是最佳的。但是，这只有当蛋白质含有可及的酪氨酸或组氨酸残基时才是可能的。
通过缀合的蛋白质间接碘化(诸如使用接头)是可替换的方法。在这一方法中，通过应用包含两个官能团的辅基来并入碘，以使能够同时放射性碘化和并入蛋白质。存在多种用于放射性碘化的辅基，诸如N-琥珀酰亚胺基5-[*l]碘-3-吡啶羧基([131I]SIPC)和N-琥珀酰亚胺基-3-[*I]-碘苯甲酸酯([*I]SIB)。两种活性酯都与蛋白质的氨基缀合并表现出高的体内稳定性。用于芳族基团酰化的另一个示例性辅基是N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)。
在一些实施方式中，如本文公开的放射性标记的VHH或其功能性片段是使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体以碘-131进行标记的。
本领域技术人员可容易地获得用于放射治疗的详细协议(参见例如CancerRadiotherapy:Methods and Protocols(Methods in Molecular Medicine),Huddart RAEd.,Human Press 2002)。
X.试剂盒
在一些方面中，本公开提供了试剂盒，诸如用于实施如本文描述的方法的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含筛选剂量的如本文描述的放射性标记的抗体片段(例如放射性标记的VHH或其功能性片段)以及治疗剂量的放射性标记的抗体片段。本文描述了筛选剂量和治疗剂量。在任一试剂盒的一些实施方式中，使用作为γ-发射体和β-发射体两者的放射性同位素(例如碘-131)对抗体片段进行放射性标记。本文描述了适合的放射性同位素。
在任一试剂盒的一些实施方式中，试剂盒还包含一种或多种用于注射筛选剂量和治疗剂量的装置。在一些实施方式中，筛选剂量和治疗剂量各自单独容纳在注射装置中。在一些实施方式中，注射装置是注射器。在任一试剂盒的一些实施方式中，试剂盒进一步包含用于实施如本文的方法(例如本文的分层和治疗受试者的方法)的说明书。说明书可以以任何合适的形式，例如印刷形式(例如纸张或夹层插页或标签)或电子形式(例如在光盘或USB记忆棒上)。
XI.其它示例性方面
以下提供了本公开的其它非限制性方面。
方面1：一种用于在癌症的治疗中使用的、放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域(VHH)或其功能性片段，其特异性地结合存在于癌细胞或实体瘤上的靶蛋白，
其中，基于在受试者中对筛选剂量的放射性标记的VHH或其功能性片段的检测，选择用于治疗的患有癌症的受试者，并且其中，随后向以“治疗剂量”向所选择的受试者给予放射性标记的VHH或其功能性片段，并且
其中，使用VHH或其功能性片段是使用作为γ-发射体和β-发射体两者的放射性同位素进行放射性标记的。
方面2：根据方面1的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，
其中在选择受试者之前，以筛选剂量向受试者给予放射性标记的VHH或其功能性片段，并且在受试者的肿瘤部位进行检测。
方面3：根据方面2的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性标记的VHH或其功能性片段的检测包含对受试者成像。
方面4：根据方面3的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中成像是成像是伽马照相机成像，诸如平面伽马照相机成像、单光子发射计算机断层成像或正电子发射断层成像，任选地结合非核成像技术，诸如X射线成像、计算机断层成像和/或磁共振成像。
方面5：根据方面1至4中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性同位素是碘-131、镥-177、钇-90、铜-67、铼-186或铼-188。
方面6：根据方面1至5中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性同位素通过接头连接到VHH或其功能性片段。
方面7：根据方面1至6中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中VHH或其功能性片段是使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]-SGMIB)或其合适的衍生物或变体以碘-131进行放射性标记的。
方面8：根据方面1至7中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中筛选剂量在37MBq和370MBq之间并且治疗剂量在370MBq和18500MBq之间。
方面9：根据方面1至7中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性标记的VHH或其功能性片段特异性地结合HER2。
方面10：根据方面9的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中如使用竞争测定法所确定的，放射性标记的VHH或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000441
或单克隆抗体帕妥珠单抗
Figure GDA0003213008120000442
竞争结合HER2。
方面11：根据方面9或10的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性标记的VHH或其功能性片段包含选自以下组的CDR组合中的一种，该组包括：
具有SEQ ID NO:l的CDR1区、具有SEQ ID NO:2的CDR2区和具有SEQ ID NO:3的CDR3区，和
具有SEQ ID NO:4的CDR1区、具有SEQ ID NO:5的CDR2区和具有SEQ ID NO:6的CDR3区。
方面12：根据方面9至11中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性标记的VHH或其功能性片段与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％的氨基酸同一性。
方面13：根据方面12的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性标记的VHH或其功能性片段与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列中的至少一个是相同的。
方面14：根据方面1至13中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中筛选剂量和治疗剂量的放射性标记的VHH或其功能性片段各自独立地静脉内、腹膜内或鞘内向受试者给予。
方面15：根据方面1至14中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性标记的VHH或其功能性片段以一价形式存在。
方面16：根据方面1至15中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性标记的VHH或其功能性片段不具有含半胱氨酸的标记，优选GGC-标记。
方面17：根据方面1至16中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性标记的VHH或其功能性片段是非寿命延长的。
方面18：根据方面1至17中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中放射性标记的VHH或其功能性片段是未标记的。
方面19：根据方面1至18中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中癌症是实体瘤。
方面20：根据方面1至18中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中癌症是血液癌症。
方面21：根据方面1至18中任一项的用于使用的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中癌症是乳腺癌、卵巢癌、胃癌、多发性骨髓瘤或淋巴瘤。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为进一步的限制。
实施例1：抗-HER2 VHH的碘-131放射性标记
放射化学程序
如下进行建立的VHH的放射性碘化程序：将必要量的碘化钠[I*]转移到3％(v/v)乙酸、30％(v/v)叔丁基过氧化氢和N-琥珀酰亚胺基4-[N1,N2-双(叔丁氧基羰基)胍基甲基]-3-(三甲基甲锡烷基)苯甲酸酯(全部溶于氯仿中)的混合物中。在搅拌的同时，将混合物在室温下温育50分钟。随后，使用乙酸乙酯/己烷梯度，在正相HPLC上纯化[I*]SGMIB-BisBoc。在室温下用三氟乙酸温育15分钟后进行脱保护。最后，在室温下，在硼酸盐缓冲液pH 8.5中，使脱保护的[I*]SGMIB与100μg抗-HER2 VHH序列反应20分钟。在PBS中平衡的PD-10柱上，纯化His-标记的[131I]SGMIB-二价(2Rbl7c-2Rbl7c)、His-标记的[131I]SGMIB-一价(2Rbl7c)和His-标记的[131I]SGMIB-一价(2Rsl5d)VHH。
质量控制
使用玻璃微纤维片浸渍硅胶带(Varian,Lake Forest,CA,USA)，用PBS,pH7.4运行，通过即时薄层色谱(iTLC)进行质量控制。并行地，使用聚苯乙烯二乙烯苯共聚物反相柱(PLRP-S
Figure GDA0003213008120000451
5μm,250/4mm,Agilent,Diegem,Belgium)进行分析放射性-HPLC。在以下协议中使用0.1％TFA水溶液和乙腈的混合物：流速为1ml/min，0-5分钟25％乙腈；5-7分钟25-34％乙腈；7-10分钟75-100％乙腈；10-25分钟100％乙腈。
实施例2：抗-HER2 VHH的镥-177放射性标记
1B4M-DTPA和CHX-A”-DTPA与VHH的缀合
使用3种类型的C-末端氨基酸标记生产抗-HER2 VHH 2Rsl5d、2Rbl7c和lR136b：未标记的(VHH)、His-标记(VHH-HHHHHH(SEQ ID NO:9))和Myc-His-标记(VHH-AAAEQKLISEEDLNGAA-HHHHHH(SEQ ID NO:10))。在600μl 0.05M碳酸钠缓冲液(pH 8.5)中，在室温下历经3小时，将10倍摩尔过量的双功能螯合剂1B4M-DTPA(对于177Lu)缀合到VHH中赖氨酸的游离ε-氨基。通过将混合物的pH降至pH 7.0来终止缀合反应。在0.1M乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中，在Superdex 75 10/30(GE Healthcare)上纯化VHH-螯合剂。使用ESI-Q-ToF-MS(Waters,Micromass)在正模式下评价平均缀合度。
177Lu-DTPA-VHH的制备
如前制备以177Lu标记的VHH(20)。无载体的177Lu获自ITG(Garching,Germany)，为氯化物溶液，比活性为3000GBq/mg。向含有无金属的0.1M乙酸铵缓冲液(pH 5.0)的测试小瓶中加入必要量的177Lu，以达到200μL最终体积。然后加入25-100μg VHH-DTPA(1mg/mL)并且在室温下温育30分钟。通过一次性Nap-5凝胶过滤柱(GE Healthcare)并且推过0.22μm的过滤器以纯化放射性标记的VHH溶液。以0.2M柠檬酸作为流动相，并且使用分析型放射性-HPLC或放射性-SEC，使用iTLC评估放射化学纯度。使用聚苯乙烯二乙烯苯共聚物反相柱(PLRP-S
Figure GDA0003213008120000461
5μm,250/4mm,Agilent,Diegem,Belgium)进行放射性-HPLC。此处，作为洗脱剂，以如下梯度使用0.1％TFA水溶液和ACN的混合物：流速为1ml/min，0-5分钟25％ACN；5-7分钟25-34％ACN；7-10分钟75-100％ACN；10-25分钟100％CAN。放射性-SEC在Superdex 75 5/150GL上使用PBS作为流动相在0.3mL/min的流速下进行。
实施例3：一价、非寿命延长的、未标记的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在C57bl/6小鼠中的血液清除率
材料和方法
使用六只正常雄性C57bl/6小鼠来评估血液清除率。每只动物接受静脉注射2500kBq未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d(约4μg)。在注射2、5、10、15、20、40、60和120和180分钟后用微毛细管采集血液样品。结果表示为每总血量的注射活性的百分比(％IA/TBV)。总血量估计为总体重的7％。通过使用GraphPad Prism的双相非线性回归拟合确定血液半衰期。
结果
未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d遵循双相血液曲线被清除。计算的初始快速清除阶段的半衰期约为1.93分钟。在60分钟之后，在血液中测量到低于2％IA/TBV(每总血量的注射活性的百分比)。
实施例4：一价、非寿命延长的、未标记的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在HER2+肿瘤异种移植的小鼠中的生物分布和剂量测定，以及在成年女性人类的辐射剂量估计
材料和方法
在肿瘤植入前一天，在雌性六周龄的CRL:Nu-FoxNInu无胸腺小鼠的背部植入60天连续释放的17-β-雌二醇丸粒(0.72mg,Innovative Research of America:Sarasota,FL,USA)。将处于50％基质胶(BD Biosciences,Bedford,MA,USA)中的HER2+BT474/M1人类乳腺癌细胞(10×106)皮下注射到右侧并且生长直到它们达到250-350mm3的体积。
确定了未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的生物分布特征。向动物(n＝3)注射1185kBq未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d(2.0μg)。在注射1、3、6、24、48、72、96、120、144小时后，用过剂量氟烷将小鼠安乐死，解剖，并且收集它们的器官。称量目标组织并且在γ-计数器中计数131I放射性以及注射标准(表1)。将所获得的数值(表示为％IA/g)用来计算相应的肿瘤与健康组织的比例(表2)。
此外，将未标记的一价131I-SGMIB-抗-HER2 VHH 2Rs15d的生物分布值用于剂量计算(表3)。将这些值进行时间积分以获得每克组织的停留时间。简言之，使用梯形法完成时间0到144小时之间的积分。其次，计算吸收的剂量。在吸收的剂量计算中，从互联网上发表的RADAR模型(单位密度球体(Unit Density Spheres))中获得的131I的S值。通过使用1g球体的S值(0.0000304Gy.Kg/MBq.s)来计算所有器官的剂量。这个简化的剂量测定计算是由以下事实驱动的，即131I衰变中的低能β粒子被局部吸收，而光子和其它穿透性辐射的贡献程度低，这意味着小鼠中不同器官之间的串扰(cross-talk)是可忽视的。
使用OLINDA软件，使用1h的排尿膀胱间隔，通过将未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在小鼠中不同时间点的生物分布数据外推至成年女性模型，进行成年女性人体中器官吸收的剂量的估计(表4)。计算基于时间-活性曲线，以确定在器官中分解(disintegration)的数量。使用各器官的适当加权因子计算器官剂量和有效剂量。
结果
实现了极高的肿瘤与健康组织的比率(表2)，突出显示在健康组织中的摄取非常低，因此毒性较低。使用未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d所观察到的这种程度的肿瘤与组织的比率，对于其它放射免疫生物制品，迄今为止从未被发表过。特别地，与靶向HER2的半胱氨酸-标记的VHH(称为5F7GGC)相比，这些比例显着更高(Pruszynskiet al.,2014；J.Nucl.Med.55(4):650-656)。与5F7GGC VHH相比，对于未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d，在时间点1和24小时，肿瘤与肺、肿瘤与心脏、肿瘤与肝脏、肿瘤与肾脏、肿瘤与胃、肿瘤与脾脏、肿瘤与肌肉以及肿瘤与血液的比例均显著更高。对于未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d，检测到肾脏中非常低的摄取值是尤其令人惊讶的。该肾脏摄取值甚至比为5F7GGC VHH报道的值还要低。
表1：在注射未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d之后，在自动化γ计数器中计数了21种不同目标组织的131I活性。除了使用％IA的甲状腺、肾上腺和胆囊之外，摄取值表示为％注射活性/克组织(％IA/g)。数值代表平均值(n＝3)±SD。
Figure GDA0003213008120000481
表1(续)
Figure GDA0003213008120000501
表2：计算的肿瘤与健康组织的比率。数值代表平均值(n＝3)±SD。
Figure GDA0003213008120000502
Figure GDA0003213008120000511
表2(续)
Figure GDA0003213008120000512
使用相同于Pruszynski et al.中描述的方法计算肾脏的辐射吸收剂量并且基于％IA/g组织值(表1)，获得的未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的值为835.96cGy/mCi(表3)，其小于基于来自Pruszynski et al.的剂量学数据获得的5F7GGCVHH的值的一半。同时，对于未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d，观察到肝脏、脾脏、肺、胃和血液的值也低得多。
获得的未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的值(835.96cGy/mCi)令人惊讶地低于his-标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的肾脏吸收剂量(1055cGy/mCi)。
表3：未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在雌性HER2+肿瘤异种移植小鼠中的剂量计算
Figure GDA0003213008120000521
使用OLINDA 1.0软件，由未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的生物分布数据计算成年女性的辐射剂量估计。计算基于时间-活性曲线来确定20个源器官中的分解数量。用各种器官的适当加权因子计算器官剂量、有效剂量和有效剂量当量。表4汇总了计算的器官吸收剂量。有效剂量估计为0.0273mSv/MBq。
表4：基于OLINDA计算，对成年女性人体不同器官的辐射剂量估计
Figure GDA0003213008120000522
Figure GDA0003213008120000531
实施例5：在HER2+肿瘤异种移植小鼠中，与曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗竞争，未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的生物分布
在用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或二者的组合预治疗后，在HER2+肿瘤异种移植小鼠中评价了未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的生物分布特征。曲妥珠单抗(商品名称：
Figure GDA0003213008120000532
)和帕妥珠单抗(商品名称：
Figure GDA0003213008120000533
)是干扰HER2/neu受体的单克隆抗体。他们的主要用途是治疗某些乳腺癌。
材料和方法
在肿瘤植入前一天，在雌性六周龄的CRL:Nu-FoxNInu无胸腺小鼠的背部植入60天连续释放的17-β-雌二醇丸粒(0.72mg,Innovative Research of America:Sarasota,FL,USA)。将处于50％基质胶(BD Biosciences,Bedford,MA,USA)中的HER2+BT474/M1人类乳腺癌细胞(5×106)皮下注射到右侧并且生长直到它们达到150-250mm3的体积。在给予未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的72小时之前，使用100摩尔过量的抗-HER2 mAbs进行预治疗。随后，它们接受1185kBq未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2VHH 2Rs15d(5.0μg)。注射1h后，用过量氟烷将小鼠安乐死，解剖，并且采集其器官。称量目标组织并且在γ-计数器中计数131I放射性以及注射标准。结果表示为每克组织的注射活性的百分比(％IA/g)。
结果
结果示于表5中。在仅接收未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的动物组和接收
Figure GDA0003213008120000541
和/或
Figure GDA0003213008120000542
预治疗的动物组之间，未观察到肿瘤摄取的显著差异。
因此，如所呈现的体内竞争测定法所示，未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d不与单克隆抗体
Figure GDA0003213008120000543
和
Figure GDA0003213008120000544
竞争结合HER2。
表5：在具有及不具有曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或二者的组合抗-HER2 mAbs的竞争的情况下，未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在雌性HER2+肿瘤异种移植小鼠中的生物分布数据。除了甲状腺使用％IA之外，数值表示为％注射活性/克组织(％IA/g)。数值代表平均值(n＝3)±SD。
Figure GDA0003213008120000545
Figure GDA0003213008120000551
实施例6：未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在HER2+肿瘤异种移植小鼠中的治疗功效
通过测量在HER2+肿瘤异种移植小鼠中抑制肿瘤生长的能力，评估未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的治疗功效。通过包括2个对照来评估其疗效的特异性：(1)给予未标记的一价[131I]SGMIB-标记的非靶向对照VHH和(2)给予赋形剂溶液PBS。
材料和方法
将处于50/50基质胶/细胞培养基中的5×106个HER2+BT474/M1肿瘤细胞接种在19只CRL:Nu-FoxNInu小鼠的右后腿中。通过测径器测量，肿瘤生长至50±30mm3。接下来，将动物随机分成3个治疗组，治疗组1(n＝6)：未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH2Rs15d(250±50μCi/治疗)，治疗组2(n＝6)：未标记的一价[131I]SGMIB-标记的非靶向对照VHH(250+50μCi/治疗)，和治疗组3(n＝7)：载体溶液。动物治疗五次(五周内每周一次)。每周测量肿瘤体积和动物体重。当观察到肿瘤达到1cm3或体重减轻>20％时，使动物安乐死。150天后，将结果合并在生存曲线中，之后进行统计分析(对数秩(Mantel-Cox)检验)。
结果
向携带小HER2+BT474/M1肿瘤的小鼠(50±30mm3)静脉注射未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d、未标记的一价[131I]SGMIB-标记的非靶向对照VHH或赋形剂溶液PBS。所有PBS治疗的动物(n＝7)以使用使用未标记的一价[131I]SGMIB-标记的非靶向对照VHH(n＝6)治疗的组中除1只之外，由于发展出大肿瘤(>1cm3)，在第150天实施安乐死(图1)。两个对照组之间，未观察到无事件生存率统计学显著差异。
相比之下，与两个对照动物组相比，在使用未标记的一价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d治疗的组中，肿瘤生长被显著地延迟。此外，直到第150天，治疗动物组的一半显示完全没有肿瘤负荷。总体上，与分别接收PBS(P<0.05)或未标记的一价[131I]SGMIB-标记的非靶向对照VHH(P<0.05)的对照组相比，治疗组的存活时间显著延长。换言之，当与HER2蛋白结合时，[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 2Rs15d VHH能够减慢甚至阻止肿瘤生长进展。这个发现是非常令人惊讶的，因为其表明放射性标记的、未标记的、非寿命延长的一价VHH具有治疗效果，而普遍接受的是，对于治疗效果，寿命延长和多价性是必需的。
实施例7：确定筛选剂量和治疗剂量
以筛选剂量(例如至多185MBq)向患者给予碘-131标记的VHH，以测量靶向癌症病变及其在健康组织中的保留。
为此，在给予碘-131标记的VHH后1小时至24小时之间，进行全身平面伽马照相机成像或单光子发射断层照相。如果癌症病变显示摄取了碘-131标记的VHH，则该患者符合接受碘-131标记的VHH治疗的条件。基于扫描结果，可以确定该患者的理想总治疗剂量，并且还可以确定可以给予的对健康组织没有毒性作用的最大剂量。
一旦确认了癌症病变中的摄取(基于扫描)，即可以给予第一治疗量的碘-131标记的VHH。典型的放射剂量在1110-5550MBq之间。这一剂量可以每周重复，只要能获得用于有效癌症治疗的理想总剂量即可，然而典型的治疗周期是5到6剂量。
实施例8：I期研究以评价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在健康志愿者和乳腺癌患者中的安全性、生物分布、放射剂量学和肿瘤成像潜力
进行了单中心、开放、非随机的首次人类临床试验。本研究分两部分进行：
第I部分，在健康志愿者中，以评价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的安全性、生物分布和辐射剂量学；
第II部分，在患有HER2+乳腺癌的患者中，以评价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH2Rs15d的安全性和生物分布，并且评估肿瘤摄取。
健康志愿者和患者的纳入和排除标准如下：
包括在研究中的健康志愿者已经知情同意、同意在研究期间不喝含酒精饮料或使用任何药物、血液参数在正常范围内且至少18岁。
怀孕受试者、母乳喂养受试者、职业暴露于电离辐射的受试者、具有临床重大疾病或伴随治疗的受试者(避孕除外)、先前患有甲状腺病症的受试者、在过去至少2天内接受了用于诊断或治疗目的具有长半衰期(>7h)的放射性标记的化合物的受试者、因碘化钾阻塞甲状腺而具有绝对禁忌症的受试者、肝脏异常的受试者(即ALT/AST>2倍正常值；胆红素>1.5倍正常值)、肾功能异常的受试者(即<50ml/min/1,73m2)、患有以腹泻为主要症状的近期(<1周)胃肠病症(CTCAE v4.0 3或4级)的受试者、患有任何严重活动性感染的受试者、患有任何其他危及生命的疾病或器官系统功能障碍的受试者(研究人员认为这会损害受试者安全或干扰测试放射性药物安全性的评估)、无法与研究人员可靠沟通的受试者、不太可能配合研究要求的受试者、由于既存并发疾病而导致死亡风险增加的受试者、已经参加了研究的受试者以及参加了抗-HER2 2Rs15d先前试验的受试者未包括在本研究中。
包括在本研究中的患者已经给予知情同意、同意不在研究期间饮用含酒精饮料或使用任何药物、至少18岁、并且通过免疫组织化学方法或荧光原位杂交在活检组织上诊断为患有局部、局部晚期或转移性HER2+乳腺癌。
怀孕患者、母乳喂养患者、职业暴露于电离辐射的患者、先前患有甲状腺病的患者、在过去至少2天内接受了用于诊断或治疗目的具有长半衰期(>7h)的放射性标记的化合物的患者、因碘化钾阻塞甲状腺而具有绝对禁忌症的患者、肝脏异常的患者(即ALT/AST>2倍正常值；胆红素>1.5倍正常值)、肾功能异常的患者(即<50ml/min/1,73m2)、患有以腹泻为主要症状的近期(<1周)胃肠病症(CTCAE v4.0 3或4级)的患者、患有任何严重活动性感染的患者、患有任何其他危及生命的疾病或器官系统功能障碍的患者(研究人员认为这会损害患者安全或干扰测试放射性药物安全性的评估)、无法与研究人员可靠沟通的患者、不太可能配合研究要求的患者、由于既存并发疾病而导致死亡风险增加的患者、已经参加了研究的患者以及参加了抗-HER2 2Rs15d先前试验的患者未包括在本研究中。
通过插入静脉或端口导管的静脉注射线，使用输液泵在5±3分钟内，使所有健康受试者和患者接收静脉注射放射性为111±74MBq的50±40μg[131I]SGMIB-标记的抗-HER2VHH 2Rs15d。对于健康志愿者，产品以放射性为55±18MBq的单次剂量给予；在HER2+乳腺癌患者中，产品以148±37MBq放射性的单次剂量给予。
在[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d给予前的24±6h并且一直持续到[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d给予后的48±12h之后，所有健康受试者和患者口服给予130mg碘化钾以用于甲状腺阻断，每日摄取1次。
安全性和耐受性的结果测量
通过收集和评估研究期间与受试者经历的所有不良事件有关的数据，评估[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的耐受性和安全性。
给予前，受试者接受包括生命体征(动脉血压和脉搏率)的身体检查，并且采用开放式非引导性问题，询问伴发疾病及一般身体和情感状态的变化。此外，在给予后的5±10min监测生命体征。对于健康受试者，在给予后的4.5±1h时进行第二次体检，并且对于HER2+乳腺癌患者，在给予后的3±1h时进行。
在给予之前以及之后的24±4h，采集用于血液学和临床化学分析的血液。除非能合理地假定是由于处理不当、测量误差或其他技术原因造成的，否则将任何与基线实验室值相关的临床相关变化记录为不良事件。
此外，在给予之前以及在给予后的5±3min、10±3min、20±5min、30±5min、60±15min、105±30min、225±30min、23.75±4h和71.75±4h，从健康志愿者采集血液样品以用于活性测量，以获得[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在血液中的时间-活性曲线。在自动γ计数器中，将全血和血浆样品与已知稀释度的适当标准进行计数，并且在衰减和背景活性校正之后，表示为注入活性的百分比(％IA)。使用Nadler公式和受试者的红细胞比容，根据体重和身高估计每个志愿者的血量。
在给予的60±15min、225±30min、23.75±4h和71.75±4h，从健康志愿者采样尿液以通过尺寸排阻色谱(SEC)或反相高压液相色谱(RP-HPLC)测量未代谢产物的分数。
使用在给予后的0至30±10min采集的动态扫描以及在给予后的40±10min、120±30min、240±30min、24±4和72±4h采集的平面全身扫描，评估健康志愿者的人体生物分布。
使用OLINDA/EXM软件1.0，使用不同受试者的全射扫描上的目标区域测量来量化人体剂量学。
肿瘤靶向的结果测量
基于给予后的2.5±1h和24.5±4h采集的患者的SPECT/CT扫描，将肿瘤靶向潜力视觉地评分为阳性(强、中等或低)或阴性。量化每单位体积的活性。
实施例9：[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的非临床毒理学研究
材料和方法
将[127I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d定义为[131I]SGMIB-标记的抗-HER2VHH 2Rs15d的非放射性参考材料。
对瑞士白化小鼠(Swiss Albino Mice)进行单次微量静脉给予后，评估[127I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的毒性特征。以1.4mg/kg的剂量，通过静脉途径向每种性别15只小鼠的组(G2)中给予单剂量的[127I]SGMIB-标记的抗-HER2VHH 2Rs15d配方。1.4mg/kg的剂量水平是EMEA(CPMP/ICH/286/95)的微剂量毒性指南所要求的人类中预期剂量的1000倍。
并行赋形剂对照组(G1)由15只小鼠/性别组成并且仅接受赋开剂(磷酸盐缓冲盐水)。向每只小鼠给予的剂量体积是6mL/kg体重。所评价的参数是临床体征、死亡率、体重和食物摄入量的变化、血液学和临床化学参数、器官重量和总体病理学。在第2天(10只小鼠/性别/组)和第15天(其余的5只小鼠/性别/组)处死所治疗的小鼠。
结果
在整个实验期间，未观察到的测试项目相关的死亡率或临床体征，体重、体重增加和食物消耗的变化。在血液学、临床化学、终末空腹体重、器官重量/比率和总体病理学方面不存在测试项目相关的变化。
因此，得出的结论是：以1.4±10％mg/kg体重的剂量水平，向瑞士白化小鼠单次微量静脉给予[127I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在测试条件下没有产生任何毒性。
实施例10：使用[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的非临床体外研究
材料和方法
[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在PBS和人血清中的稳定性
在25℃下将[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中温育144h。在0、1、48、72和144h取等分试样并用放射性HPLC进行分析。通过在37℃下将[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在人血清中温度168h，以分析在人血清中的稳定性。在0、3、24、48、72、96和168h取等分试样，随后使用放射性SEC进行分析。
HER2-表达肿瘤细胞的结合：特异性
为了评估[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d针对HER2-表达肿瘤细胞的特异性，进行了细胞结合研究。为了证明结合是受体特异性的，在对照实验中向HER2+细胞中加入1000倍过量的冷起始抗-HER2 VHH 2Rs15d，以使HER2受体饱和。
HER2-表达肿瘤细胞的结合：亲和力
评价了[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d在HER2-表达肿瘤细胞上的结合亲和力。此处，使用0至300nM连续稀释的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d温育HER2-表达肿瘤细胞。同时，加入100倍过量未标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d(阻断HER2-表达肿瘤细胞)，以评估非特异性结合。
HER2-表达肿瘤细胞的结合：内在化
在不同的时间点，在HER2-表达肿瘤细胞上评价[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH2Rs15的细胞保留。使用25nM的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15温育细胞并且在37℃下温育0、1、2、4、6和24小时。平行地添加100倍过量的未标记的抗-HER2 VHH1(阻断HER2表达肿瘤细胞)，以评估非特异性结合。表征了四个部分：上清液(supernatans)、细胞膜结合的、内在化的和全细胞缔合的(膜结合的+内在化的)。
结果
在25℃下，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中至少72小时，[131I]SGMIB-标记的抗-HER2VHH 2Rs15d是稳定的，完整的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d>96％(图2)。在人血清中，在24小时之后，95％的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d仍然完整，并且在168小时后逐渐降低到87％(图2)。
结合特异性实验的结果显示，[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的结合是受体介导的并且可以通过受体饱和来防止(图3)。
[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d以4.74±0.4nM的亲和力结合在HER2-表达肿瘤细胞上(图4)。
24小时后，约25％的初始结合完整[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d仍然与肿瘤细胞相互作用，其中一半结合到膜上，一半内化在细胞中(图5)。
实施例11：用于静脉给予的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的配方
[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的制造
为了制造[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d，首先合成放射性碘化剂N-琥珀酰亚胺基4-胍基甲基-3-131I-碘苯甲酸酯(131I-SGMIB)。
通过亲电子放射性碘化50微克的SGMIB锡前体(SnMe3-BisBoc-SGMIB)，随后在无水条件下脱保护并通过半制备型HPLC纯化，进行131I-SGMIB的放射性合成。收集的HPLC级分用水稀释。中间产物被捕获在tC18 Plus柱体上，用水冲洗并用酸化的乙醇洗脱。
Figure GDA0003213008120000611
在室温下，使用131I-SGMIB作为底物并且使用抗-HER2 VHH 2Rs15d(Innogenetics)作为亲核试剂，通过亲核取代进行[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH2Rs15d的合成或缀合。为了获得最佳的缀合，使用Vivaspin离心浓缩器，首先将抗-HER2VHH 2Rs15d从其PBS缓冲液(pH 7.4)中脱盐并且溶于硼酸盐缓冲液中。在缀合之后，反应混合物在Pd-10柱上纯化。
Figure GDA0003213008120000612
[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的配方
在从PD-10柱上将[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d洗提在13mL临床缓冲液(PBS缓冲液)中之后，测量放射性的量。将纯化和稀释的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH2Rs15d过滤灭菌在C类背景下的A类封闭隔离器中。对于这个填充和无菌过滤步骤，通过无菌0.2μm Sartorius过滤器将配制的产品从配制小瓶传送到分析小瓶(用于质量控制)中，随后通过第二个无菌0.2μm Sartorius过滤器从分析小瓶传送到产品小瓶。将真空泵作为原动力。最后，将产品小瓶转移到贴有标签的容器中。在过滤过程中打开沉降板(settleplate)。
在过滤过程中使用的设备是无菌针头、具有长针的无菌管、无菌0.2μm Sartorius过滤器和无菌封闭的空小瓶。使用无菌组装技术，将无菌针头连接到Sartorius过滤器上。
表6示出了配方的组成并且表7示出了详细说明。
表6：用于静脉给予的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的分比(约15ml)配方的组成。
Figure GDA0003213008120000622
表7：[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的详细说明
Figure GDA0003213008120000621
Figure GDA0003213008120000631
实施例12：使用[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 VHH 2Rs15d的体内成像和生物分布测量
向四只雌性CRL:Nu-FoxNInu小鼠植入60天缓释的雌激素丸粒，之后在它们的右后腿中接种10×106个处于50/50基质胶/细胞培养基中的HER2+肿瘤细胞。通过卡尺测量确定，复合肥到肿瘤生长到450±200mm。
随后，小鼠在尾静脉静脉内注射248±1μCi[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 2Rs15dVHH，随后在1、4和24小时后进行微SPECT/CT成像。在扫描期间，使用2％异氟烷(在1.5L/分钟的氧气流量下)麻醉动物，并且使用加热垫保持温暖。使用Vector+/CT MILabs系统进行微SPECT/CT成像。对于该实验，使用PET准直仪和94个床位(每个位置19s)的螺旋扫描模式进行成像。对于CT，仅使用一个位置的正常扫描模式。使用0.6个体素大小、2个子集和7个迭代重构所获得的SPECT数据，之后根据CT扫描对图像进行融合和校正以进行衰减。使用医学图像数据分析工具(AMIDE)和OsiriX分析图像。分析所选择的器官和组织中[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 2Rs15d VHH的摄取值并且表示为％注射活性(％IA)/cc。
注射1小时之后，在膀胱中发现了最高分数的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 2Rsl5dVHH，并且在肾脏和肿瘤中程度稍低。在4和24小时后，肾脏中的分数在24小时后显着下降到低于0.3IA/cc的值，而在肿瘤中的下降则不太明显(24小时后仍然>1％IA/cc)。24小时之后，在微SPECT/CT图像上只能看到肿瘤和膀胱(数据未示出)。甲状腺摄取值非常低，这表明该化合物具有良好的体内稳定性。在像肌肉这样的对照组织中极低的摄取值支持了其优异的结合特异性。
表8：[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 2Rs15d VHH在选择器官和组织中的摄取值，表示为％注射活性(％IA)/cc。每个数据点以平均值给出(n＝4)。
Figure GDA0003213008120000641
所获得的肿瘤与组织的比率与通过离体生物分布测量获得的比率一致(见实施例4)。
表9：由表8中描述的值计算的[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 2Rs15d的肿瘤与组织的比率。每个数据点以平均值给出(n＝4)。
Figure GDA0003213008120000642
总之，[131I]SGMIB-标记的抗-HER2 2Rs15d VHH可以以一种且相同的种形式在成像和治疗两者中使用。
序列表
<110> 布鲁塞尔自由大学(VRIJE UNIVERSITEIT BRUSSEL)
<120> 用于在治疗癌症中使用的放射性标记的抗体片段
<130> VUB-069-PCT
<150> 62/193,700
<151> 2015-07-17
<150> 16153372.4
<151> 2016-01-29
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> VHH 2Rs15d的CDR1序列（CDR1 sequence of VHH 2Rs15d）
<400> 1
Gly Tyr Ile Phe Asn Ser Cys Gly
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> VHH 2Rs15d的CDR2序列（CDR2 sequence of VHH 2Rs15d）
<400> 2
Ile Ser Gly Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> VHH 2Rs15d的CDR3序列（CDR3 sequence of VHH 2Rs15d）
<400> 3
Ala Val Cys Tyr Asn Leu Glu Thr Tyr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> VHH 2Rb17c的CDR1序列（CDR1 sequence of VHH 2Rb17c）
<400> 4
Gly Phe Ile Phe Ser Asn Asp Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> VHH 2Rb17c的CDR2序列（CDR2 sequence of VHH 2Rb17c）
<400> 5
Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> VHH 2Rb17c的CDR3序列（CDR3 sequence of VHH 2Rb17c）
<400> 6
Val Thr Gly Tyr Gly Val Thr Lys Thr Pro
1 5 10
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> VHH序列2Rs15d（VHH sequence 2Rs15d）
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Asn Ser Cys
20 25 30
Gly Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ser Pro Gly Arg Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Arg Ile Ser Gly Asp Gly Asp Thr Trp His Lys Glu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Val Lys Lys Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Val Cys Tyr Asn Leu Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> VHH序列2Rb17c（VHH sequence 2Rb17c）
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Asp
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Gly Tyr Gly Val Thr Lys Thr Pro Thr Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> His-标签（His-tag）
<400> 9
His His His His His His
1 5
<210> 10
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> DOMAIN
<223> Myc-His-标签（Myc-His-tag）
<400> 10
Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala
1 5 10 15
Ala His His His His His His
20

Claims (33)

1.一种试剂盒，包括：
筛选剂量的放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段，所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段特异性结合存在于癌细胞或实体瘤上的靶蛋白，以及
治疗剂量的所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段，
其中所述来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段是使用作为γ-发射体和β-发射体两者的放射性同位素进行放射性标记的，
其中所述来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段是使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯以碘-131进行放射性标记的，
其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段包含：
SEQ ID NO:l示出的CDR1区，
SEQ ID NO:2示出的CDR2区，和
SEQ ID NO:3示出的CDR3区。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述筛选剂量在37MBq和370MBq之间并且所述治疗剂量在370MBq和18500MBq之间。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的试剂盒，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段特异性地结合HER2。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的试剂盒，其中使用竞争测定法确定，所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗或单克隆抗体帕妥珠单抗竞争结合HER2。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的试剂盒，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的试剂盒，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段与SEQ ID NO:7的氨基酸序列是同一的。
7.根据权利要求1至2中任一项所述的试剂盒，其中所述筛选剂量的放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段和所述治疗剂量的放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段各自独立地配制用于静脉内、腹膜内或鞘内给予受试者。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的试剂盒，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段以一价形式存在。
9.根据权利要求1至2中任一项所述的试剂盒，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段不具有含半胱氨酸的标记。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述含半胱氨酸的标记是GGC-标记。
11.根据权利要求1至2中任一项所述的试剂盒，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段是非寿命延长的。
12.根据权利要求1至2中任一项所述的试剂盒，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段是未标记的。
13.放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段特异性地结合癌细胞或实体瘤上存在的靶蛋白，
其中，基于受试者中筛选剂量的所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段的检测，选择用于治疗的患有癌症的受试者，并且其中随后，以“治疗剂量”向选择的所述受试者给予所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段，并且
其中所述来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段是使用作为γ-发射体和β-发射体两者的放射性同位素进行放射性标记的，
所述来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段是使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯以碘-131进行放射性标记的，
其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段包含：
SEQ ID NO:l示出的CDR1区，
SEQ ID NO:2示出的CDR2区，和
SEQ ID NO:3示出的CDR3区。
14.根据权利要求13所述的用途，其中在选择所述受试者之前，将所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段以所述筛选剂量给予所述受试者并且在所述受试者中的肿瘤部位进行检测。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段的检测包括对所述受试者成像。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述成像是伽马照相机成像、单光子发射计算机断层成像或正电子发射断层成像。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述成像结合非核成像技术、计算机断层成像和/或磁共振成像。
18.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述筛选剂量在37MBq和370MBq之间并且所述治疗剂量在370MBq和18500MBq之间。
19.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段特异性地结合HER2。
20.根据权利要求19所述的用途，其中使用竞争测定法确定，所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗或单克隆抗体帕妥珠单抗竞争结合HER2。
21.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段与SEQ ID NO:7的氨基酸序列是同一的。
23.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述筛选剂量的放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段和所述治疗剂量的放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段各自独立地静脉内、腹膜内或鞘内给予所述受试者。
24.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段以一价形式存在。
25.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段不具有含半胱氨酸的标记。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述含半胱氨酸的标记是GGC-标记。
27.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段是非寿命延长的。
28.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域或其功能性片段是未标记的。
29.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述癌症是实体瘤。
30.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述癌症是血液癌症。
31.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、胃癌、多发性骨髓瘤或淋巴瘤。
32.根据权利要求16所述的用途，其中所述伽马照相机成像是平面伽马照相机成像。
33.根据权利要求17所述的用途，其中所述非核成像技术是X射线成像。
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