CN112778416A

CN112778416A - 一种纳米抗体、涉及该纳米抗体的多肽及其应用

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Publication number: CN112778416A
Application number: CN202011618770.4A
Authority: CN
Inventors: 王玉凤
Original assignee: Kangyuan Medical Technology Dalian Co ltd
Current assignee: Kangyuan Medical Technology Dalian Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112778416B

Abstract

本发明涉及纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用，其中，该纳米抗体的氨基酸序列包含特殊结构的互补决定区和框架区。本发明的纳米抗体，通过噬菌体库筛选发现的具有新的氨基酸序列的抗IL‑6纳米抗体，该纳米抗体及其多肽具有很高的亲和力和活性，能够特异性地识别并结合IL‑6，基于该纳米抗体的吸附剂对IL‑6的吸附能力极强，可应用于血液净化及IL‑6检测领域，有助于IL‑6相关疾病的诊断和治疗。

Description

一种纳米抗体、涉及该纳米抗体的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可以特异性地识别并结合IL-6的纳米抗体，以及包括由一种或两种以上所述纳米抗体组成的多肽。此外，本发明还涉及编码所述氨基酸序列和多肽的核酸；涉及表达或能够表达所述氨基酸序列和多肽的宿主或宿主细胞；并且涉及所述氨基酸序列和多肽的应用，特别是在预防、治疗或诊断目的的IL-6吸附剂上的应用。

背景技术

白介素-6(Interleukin-6，IL-6)是趋化因子家族的一种细胞因子，主要由单核巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生，含有183个氨基酸残基，可通过旁分泌、自分泌和内分泌三种方式与白介素6受体(IL-6R)相结合发挥作用。二者结合后激活相关信号通路诱导辅助性T细胞(Th细胞)表达产成C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT) 以及大量细胞因子例如IL-1b、IL-10和TNF-α等，与炎症性疾病及感染程度直接相关。因此IL-6在全身性炎症反应过程扮演重要的角色。

与多种感染性和免疫介导相关的细胞因子循环水平的升高，通常被称为细胞因子风暴，此时体液中多种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等细胞因子迅速大量产生。感染者一旦出现细胞因子风暴，病情将急剧恶化，进行性全身性炎症导致血管张力丧失，表现为血压下降、血管扩张性休克和进行性器官衰竭。此时，呼吸系统的衰竭表现最突出，但也会影响心脏、中枢神经系统以及肾脏，出现心肌损伤、心力衰竭等。

目前已有多项研究表明，细胞因子风暴与COVID-19患者病情严重程度密切相关。IL-6血清浓度的升高与呼吸系统衰竭、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和临床结果的恶化有关。高循环浓度的IL-6与游离的IL-6受体结合，激活下游信号通路发挥作用，主要包括三种形式：顺式信号、反式信号和反式递呈。无论哪种形式，最终都会激活相关信号通路，从而引起全身系统性的反应，导致细胞因子风暴。

正常人血清中IL-6浓度＜20pg/mL(一般＜6pg/mL)，急性肾损伤病人血清中IL-6浓度升高至100pg/mL以上，慢性肾病病人体内氧化应激反应增强使血清中IL-6浓度升高至300pg/mL以上，而在细胞因子风暴时，病人血清中IL-6浓度可达到1000pg/mL以上，在更为严重的感染性休克患者中其浓度甚至可达到660ng/mL。

因此阻断IL-6是治疗IL-6介导的炎症反应的理想方案。临床上用于风湿性疾病的药物 “托珠单抗”(tocilizumab，商品名Actemra)是一种抗IL-6受体的单克隆抗体，可以阻断IL-6通路，该药物还被FDA批准用于治疗CAR-T细胞疗法引起的细胞因子风暴。国家卫健委发布了《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，首次提出在重型、危重型病例的治疗中试用“托珠单抗”进行免疫治疗，适应证为“双肺广泛病变者及重型患者，且实验室检测IL-6水平升高者”。Ablynx公司也发明了一种抗IL-6R的药物用于治疗IL-6R 相关疾病(专利CN 102388069 B)。

发明内容

本发明是基于解决现有的技术问题而完成的，开发了一种针对IL-6的特异性血液净化吸附剂，以高特异性的抗IL-6的纳米抗体为配基，清除血液中的IL-6，将实现纳米抗体在IL-6的血液净化治疗方面的应用。为此，本发明的目的在于，提供具有特定结构该纳米抗体和/或多肽的宿主或宿主细胞、包括该纳米抗体或多肽的吸附剂，以及该纳米抗体和/或多肽在制备IL-6吸附剂上的应用。

本发明的第1方面，涉及一种纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列包括互补决定区CDR和框架区FR，

上述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，其中，

上述互补决定区CDR1选自SEQ ID NO:1所示的CDR1或SEQ ID NO:4所示的CDR1，

上述互补决定区CDR2选自SEQ ID NO:2所示的CDR2或SEQ ID NO:5所示的CDR2，

上述互补决定区CDR3选自SEQ ID NO:3所示的CDR3或SEQ ID NO:6所示的CDR3。

作为一些优选的方式，上述框架区FR包括框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4，其中，

上述框架区FR1选自SEQ ID NO:7所示的FR1或SEQ ID NO:11所示的FR1；

上述框架区FR2选自SEQ ID NO:8所示的FR2或SEQ ID NO:12所示的FR2；

上述框架区FR3选自SEQ ID NO:9所示的FR3或SEQ ID NO:13所示的FR3；

上述框架区FR4选自SEQ ID NO:10所示的FR4或SEQ ID NO:14所示的FR4。

作为一些具体的方式，例如，

上述纳米抗体为：

上述互补决定区CDR1选自SEQ ID NO:1所示的CDR1，上述互补决定区CDR2选自SEQ ID NO:2所示的CDR2，上述互补决定区CDR3选自SEQ ID NO:3所示的CDR3，并且，上述框架区FR1选自SEQ ID NO:7所示的FR1，上述框架区FR2选自SEQ ID NO:8所示的 FR2，上述框架区FR3选自SEQ ID NO:9所示的FR3，上述框架区FR4选自SEQ ID NO:10 所示的FR4；或者，

上述互补决定区CDR1选自SEQ ID NO:4所示的CDR1，上述互补决定区CDR2选自SEQ ID NO:5所示的CDR2，上述互补决定区CDR3选自SEQ ID NO:6所示的CDR3，并且，上述框架区FR1选自SEQ ID NO:11所示的FR1，上述框架区FR2选自SEQ ID NO:12所示的 FR2，上述框架区FR3选自SEQ ID NO:13所示的FR3，上述框架区FR4选自SEQ ID NO:14 所示的FR4；或者，

上述互补决定区CDR1选自SEQ ID NO:1所示的CDR1，上述互补决定区CDR2选自SEQ ID NO:2所示的CDR2，上述互补决定区CDR3选自SEQ ID NO:3所示的CDR3，并且，上述框架区FR1选自SEQ ID NO:11所示的FR1，上述框架区FR2选自SEQ ID NO:12所示的 FR2，上述框架区FR3选自SEQ ID NO:13所示的FR3，上述框架区FR4选自SEQ ID NO:14 所示的FR4；或者，

上述互补决定区CDR1选自SEQ ID NO:4所示的CDR1，上述互补决定区CDR2选自SEQ ID NO:5所示的CDR2，上述互补决定区CDR3选自SEQ ID NO:6所示的CDR3，并且，上述框架区FR1选自SEQ ID NO:7所示的FR1，上述框架区FR2选自SEQ ID NO:8所示的 FR2，上述框架区FR3选自SEQ ID NO:9所示的FR3，上述框架区FR4选自SEQ ID NO:10 所示的FR4，但并不限于上述这些例子。

作为一些具体的优选的方式，例如，上述纳米抗体的氨基酸序列为：SEQ ID NO：15，或，SEQ ID NO：16，但并不限于此。

但本发明的纳米抗体的氨基酸序列并不限于上述这些具体的序列，可在允许的范围内进行改变，例如，由于FR区在整个纳米抗体的氨基酸序列中相对保守，因此，只要CDR区为特定的氨基酸排列(例如上述CDR1、CDR2、CDR3、CDR4)，则FR区可以做适当的变更。

按照本发明非限定但是优选的实施方案，本发明的纳米抗体与IL-6结合，具有10^-10～10^-12摩尔/升(M)的亲和常数(K_D)，进一步可以为10^-11～10^-12摩尔/升(M)的亲和常数(K_D)。

本发明还涉及上述纳米抗体的人源化的变体，该变体是通过将本发明的纳米抗体改造成相应的人源抗体而成的。例如，作为一个优选的例子，人源化取代的氨基酸序列为SEQ ID NO：21，或，SEQ ID NO：22。

本发明的第2方面，提供一种多肽，其包括上述记载的纳米抗体，

可选地，上述多肽是多价多肽；

可选地，上述多价多肽是二价或三价的多肽；

可选地，上述二价或三价的多肽是特异性多肽；

可选地，上述二价多肽的氨基酸序列为SEQ ID No:17或SEQ ID No:18；

可选地，上述特异性多肽的氨基酸序列为SEQ ID No:19或SEQ ID No:20；

本发明的第3方面，提供一种核酸，其是通过编码上述记载的纳米抗体和/或上述记载的多肽而成的。

本发明的第4方面，提供一种宿主或宿主细胞，其能够表达上述的纳米抗体和/或上述的多肽。

本发明的第5方面，提供一种吸附剂，该吸附剂包括载体基质和上述纳米抗体或多肽。

本发明的第6方面，提供一种上述的纳米抗体和/或上述的多肽在制备IL-6吸附剂上的应用。

本发明的第7方面，提供一种上述的纳米抗体和/或上述的多肽在免疫检测、富集和/ 或纯化等中的应用。

有益的效果

本发明的纳米抗体，是具有全新的氨基酸序列的抗IL-6纳米抗体，该纳米抗体及其多肽具有很高的亲和力和活性，能够特异性地识别并结合IL-6，并且吸附剂对IL-6的吸附能力极强，可应用于血液净化及IL-6检测领域，有助于IL-6相关疾病的诊断和治疗。

附图说明

图1是纯化后的纳米抗体CNb20-1和hCNb20-1的SDS-PAGE电泳图；

图2是纯化后的纳米抗体CNb20-2和hCNb20-2的SDS-PAGE电泳图；

图3是纳米抗体CNb20-1动力学传感图；

图4是纳米抗体CNb20-2动力学传感图；

图5是纯化后的二价多肽bvCNb20-1的SDS-PAGE电泳图；

图6是纯化后的人源化二价纳米抗体hCNb20-1；

图7是人源化纳米抗体hbvCNb20-1的动力学传感图。

具体实施方式

本发明的上述内容及其他方面将通过下文进一步描述清楚，其中：

(1)除非指明或者另外定义，使用的所有术语具有在本领域中的通用意义，为本领域技术人员所共知。例如，可以参见标准手册，如Sambrook著Molecular Cloning：ALaboratory Manual[(《分子克隆：实验手册》),第二版，卷1～3，Cold Spring HarborLaboratory Press(冷泉港实验室出版)，1989]；F.Ausubel著Current Protocols inMolecular Biology[(《现代分子生物学方法》)，Green Publishing and WileyInterscience，1987]；Roitt著 Immunology[《免疫学(第六版)》)Mosby/Elisevier，2001]，以及上文所引用的综合背景技术。

(2)除非另外指明，术语“序列”用于本文时(如在类似“抗体序列”“可变区序列”“V_HH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包括相关氨基酸序列及编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更狭义的解释。

(3)除非另外指明，所有没有具体描述的方法、步骤、技术和操作为已知的并如本领域技术人员所熟知的。例如，参考仍旧参照上文所引用的综合背景技术以及其中所引用的其他参考文献。

(4)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示。

(5)术语“特异性”是指特定的抗原结合分子(如本发明的纳米抗体或多肽)可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的能力。一种抗原结合分子的特异性可以根据其亲和力和/或活性而确定。亲和力表示为抗原与抗原结合分子的亲和常数(K_D)，是抗原与抗原结合分子之间的结合强度的测量，K_D值越小，抗原和抗原结合分子之间的结合强度越强，反之，K_D值越大，抗原和抗原结合分子之间的结合强度越弱。K_a表示结合常数， K_a越大，表明结合越快，K_a越小，表明结合越慢；K_d表示解离常数，K_d越大，解离越快， K_d越小，解离越慢；并且K_D＝K_d/K_a。

(6)纳米抗体的氨基酸残基按照Kabat等“Sequence of proteins ofimmunological interest[(免疫学目的的蛋白的序列)，US Public Health Services(美国公众健康服务)，Publication No.91]”给出的关于V_H结构域的通用编号方式进行编号，这种编号方式在 Riechmann和Muyldermans的文章中用于来自骆驼科的V_HH结构域。按照这种编号方式，纳米抗体的FR1包括位置1～30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括位置31～36的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包括位置37～49的氨基酸残基，纳米抗体的CDR2包括位置50～65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括位置66～94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包括位置 95～102的氨基酸残基，纳米抗体的FR4包括位置103～113的氨基酸残基。在这一方面，应该注意：如在本领域内关于V_H结构域和关于V_HH结构域所公知的——每一个CDR中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基总数相对应 (即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常按照Kabat的编号方式，实际序列中的氨基酸残基可能与实际编号方式相同或不同。也可以说，按照Kabat的编号方式不考虑CDR的氨基酸残基编号，而是按照Kabat编号方式的位置1对应 FR1的起点，并且反之亦然；按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点；并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置103对应FR4的起点，并且反之亦然。

(7)术语“固载量”是指单位体积亲和介质(吸附剂)所偶联的配基的总量。

本发明的纳米抗体的氨基酸序列基本上包括互补决定区CDR和框架区FR。

上述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，上述框架区FR包括框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4。

对于框架区，其与互补决定区相比更保守。本领域技术人员会根据纳米抗体的实际用途和功能对框架区的序列结构进行合理的筛选。作为框架区的氨基酸序列，优选同源性为50％以上的氨基酸序列，进而优选同源性为70％以上的氨基酸序列，进而优选为同源性为95％以上的氨基酸序列。

作为框架区，可列举例为框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4，但可以认为不限于此。只要对其多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有或者基本上没有影响即可。

此外，纳米抗体的残基总数可以在110-120个区间，优选112-115个，并且最优选113 个。然而，纳米抗体的部分、片段或类似物不特别局限于它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段或类似物满足下文列出的进一步要求且还适于本文所述的目的。

作为“纳米抗体”的制备方法，在其最广泛意义上不限于具体的生物资源或具体的制备方法。例如，本发明的纳米抗体可以这样获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的V_HH结构域；(2)通过表达编码天然存在的V_HH结构域的核苷酸序列；(3)通过将天然存在的V_HH结构域“人源化”(如下文所述)或者通过表达编码所述人源化V_HH结构域的核酸；(4)应用合成或半合成技术制备蛋白、多肽或者其他氨基酸序列；(5)通过应用核酸合成技术制备编码纳米抗体的核酸，然后表达这样获得的核酸；和/或(6)通过前述的任何结合。

此外，基于本发明纳米抗体的一种变型，还包括具有与天然存在的V_HH结构域相对应但已被人源化的氨基酸序列的纳米抗体。人源化即用来自人类的常规4-链抗体的V_H结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的V_HH结构域序列的一个或多个氨基酸残基。

作为人源化的氨基酸序列的纳米抗体的具体例子，可列举SEQ ID No:21(记为“hCNb20-1”)，但并不限于此。

此外，本发明还涉及包含至少一个V_HH结构域或至少一个基于其的蛋白或多肽。

按照本发明的一个非限制性的实施方案，上述多肽包括纳米抗体。本发明的多肽的氨基酸序列与纳米抗体的氨基酸序列完全相同或相对应，其中有限数目的氨基酸残基，如1～10个氨基酸残基，并且优选的1～6个氨基酸残基，如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基，加到所述纳米抗体或多肽的氨基末端(N-端)和/或羧基末端(C-端)。

上述氨基酸残基可以不改变纳米抗体的生物学特性，并且可以给所述纳米抗体加入其他官能性。例如，所述氨基酸残基可以：

a形成标签，即利于所述纳米抗体的纯化的氨基酸序列或残基，例如，使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。这种残基的一些优选的但非限定的实例是多组氨酸残基(His-tag)和谷胱甘肽残基；

b是N-端Met残基，例如，借此可以在异源宿主细胞或宿主生物体内表达；

c是C-端Cys残基，例如，借此可以与配基上的-SH反应或与Au表面反应；

d是以已知的方式可以提供有官能团和/或已经被官能化的一个或多个氨基酸残基，例如，如本领域已知，氨基酸残基如赖氨酸或半胱氨酸允许PEG基团附着。

本发明的多肽还可以包括2个或2个以上的所述纳米抗体，也称为多价多肽。

本发明的二价多肽包括2个纳米抗体，任选地通过一个铰链序列连接。

在本发明的多价多肽中，所述2个或2个以上纳米抗体可以是相同的或不同的。例如，本发明的多价多肽中的2个或2个以上纳米抗体：可以针对同一抗原，即针对所述抗原的相同表位或者针对所述抗原的2个或多个不同表位；可以针对不同抗原；或其组合，但并不限于此。

例如，本发明的二价多肽，可以包括2个相同的纳米抗体；可以包括针对第一抗原的某一表位的第一纳米抗体和针对所述抗原同一表位或不同表位的第二纳米抗体；可以包括针对第一抗原的第一纳米抗体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米抗体，但并不限于此。作为二价多肽的氨基酸序列的具体例子，可列举例如SEQ ID No:17(记为“bv CNb20-1”)，但不限于此。此外，作为人源化的二价多肽的具体例子，可列举SEQ IDNo:23(记为“hbvCNb20-1”)，但并不限于此。

例如，本发明的三价多肽，可以包括3个相同的纳米抗体；可以包括针对同一抗原的相同的或不同的纳米抗体；可以包括针对第一抗原的相同的或不同的表位的2个相同或不同的纳米抗体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第三纳米抗体；可以包括针对第一抗原的第一纳米抗体，针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米抗体，和针对于所述第一和第二抗原不同的第三抗原的第三纳米抗体，但并不限于此。

包含至少2个纳米抗体的本发明的多肽，其中至少1个纳米抗体针对第一抗原，并且至少1个纳米抗体针对不同于所述的第一抗原的第二纳米抗体(或针对第一抗原的不同表位的第二纳米抗体)，还可称为“多特异性”抗体。因此，双特异性抗体是包括至少1个针对第一抗原的纳米抗体和至少1个针对第二抗原的其他纳米抗体，而三特异性抗体是包括至少1个针对第一抗原的纳米抗体，至少1个针对第二抗原的其他纳米抗体，和至少1个针对第三抗原的其他纳米抗体；等等。

作为特异性多肽的氨基酸序列的具体例子，可列举双特异性多肽，其是由氨基酸序列为SEQ ID NO：15的纳米抗体和氨基酸序列为SEQ ID NO：16的纳米抗体组成的，其与单价纳米抗体相比对IL-6具有更高的亲和力，如SEQ ID No：19(记为“bsCNb20-1”)、 SEQID No:20(记为“bsCNb20-2”)，但不限于此。

关于包含一个或多个V_HH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，可参考EP 0822985中的记载。

用于多价和多特异性多肽的铰链应该是本领域技术人员所熟知的，例如包括Gly-Ser，如在WO 99/42077中记载的(Gly₄Ser)₃或(Gly₃Ser₂)₃；或天然存在的重链抗体铰链区或其部分区域。对于其他适宜的铰链，也可参考上文引用的综合背景技术。

此外，除了所述1个或多个纳米抗体之外，本发明的多肽还可以包含官能团、部分或残基，如治疗活性物质，和/或标签，如荧光素标记、同位素标记、生物素标记和酶催化标签等。

此外，本发明的纳米抗体或多肽与IL-6结合的亲和常数(K_D)为10^-10～10^-12摩尔/升(M)。

上述抗原与抗原结合分子之间的特异性结合可以用已知的任何适当的方法确定，其包括，斯卡查德分析(Scatchard Analysis)和/或竞争结合检测如放射性免疫分析(RIA) 和酶联免疫分析(ELISA)，以及本领域已知的其他新方法，如等离子共振技术(SPR)和/或生物膜干涉(BLI)技术等。

本发明的纳米抗体、多肽、及编码其的核酸，可以以已知的方式制备，本领域技术人员可有本文进一步描述而清楚。关于制备所述纳米抗体、多肽和核酸的一种特别有用的方法通常包括如下步骤：

(1)在适宜的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适宜的表达体系中，表达编码所述本发明的纳米抗体或多肽的核酸，任选地接着进行；

(2)分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米抗体或多肽。

也可以是，采用其他方法包括如下步骤：

(3)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，使本发明的宿主表达和/或生产一种本发明的纳米抗体和/或多肽；任选地接着进行；

(4)分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米抗体或多肽。

本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选的是双链DNA形式。例如，本发明的核酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA，即，密码子优化)。

本发明的核酸可以以本质上已知的方法制备或获得，其基于本文给出的本发明的纳米抗体或多肽的氨基酸序列的信息，和/或可以从适当的天然来源分离。例如，对天然存在的V_HH结构域的核酸序列进行基因定点突变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。

本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是遗传构建体的部分，这是本领域技术人员所熟知的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，可以是载体形式，如质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和体内表达的载体(如在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。

本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即用于表达和/或生产本发明的纳米抗体或多肽。适宜的宿主或宿主细胞为本领域技术人员所熟知，例如可以是任何适当的真菌、原核或真核的细胞或细胞器或者生物体，例如：细菌菌株，其包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)菌属和枯草芽孢杆菌杆菌(Bacillus subtilis)菌属；真菌细胞，其包括但不限于木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus) 或其他丝状真菌；酵母细胞，其包括但不限于酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属 (Pichia)；两栖类细胞或细胞系，例如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；来源于昆虫的细胞或细胞系，如贪夜蛾(Spodoptera)Sf9和Sf21细胞或果蝇属(Drosophila)的细胞系 Schneider和Kc细胞；植物或植物细胞，如烟草(tobacco)植物；哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人、和/或其他哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞、Hela细胞和CHS细胞等；以及本质上已知的用于表达和生产抗体和抗体片段(包括但不限于单一结构域抗体和ScFv片段)的所有其他宿主或宿主细胞，为本领域技术人员所熟知。

对于生产，本发明的纳米抗体和多肽可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中，也可在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果、根或种子。

如上文提及，应用纳米抗体的一个优点在于，基于此的多肽可以在原核系统中表达和制备，并且适宜的原核表达系统、载体、宿主细胞等为本领域技术人员所熟知，如上文所引用的参考文献。然而应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表达。

优选地，在本发明中，所述纳米抗体或多肽在细菌细胞中产生，特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞中产生，如上文所述。

当在细胞中表达用来生产的本发明的纳米抗体或多肽时，本发明的纳米抗体或多肽可以在细胞内(如，细胞质或周质空间)产生，然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(即分泌表达)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。

与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括用于在哺乳动物细胞中表达的载体——pMANneo(Clonetech)、pUCTtag(ATCC37460)和pMClneo(Stratagene)；用于在细菌细胞中表达的载体——pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；用于在酵母或其他真菌细胞中的表达载体——pYES2(Invitrogen)和毕赤表达载体(Picha expression vector)(Invitrogen)；用于在昆虫细胞中的表达载体——pBlueBacⅡ(Invitrogen) 和其他杆状病毒载体；等等。

用于转化本发明的宿主或宿主细胞的技术可以从本领域技术人员通常选择的技术中来选择。

转化后，可以进行检测并选择已经成功转化本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主。转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。

优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，它们表达或者能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的氨基酸序列(如果在宿主生物体的情形中，则为在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其他世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。

然后本发明的氨基酸序列可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，可以通过本质上已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的氨基酸序列融合的特异性的/可切割的氨基酸序列)和/或制备性免疫学技术(即使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)，但并不限于此。

本发明的纳米抗体或多肽可以特异性结合所述抗原IL-6，因此本发明的一个优选但非限制性的应用为IL-6吸附剂，前述吸附剂包括载体基质和所述纳米抗体或多肽。

前述载体基质可以为多孔材料，例如，琼脂糖凝胶微球、纤维素球、磁珠、硅胶微球、活性炭或树脂微球等，但并不限于此。

用于前述吸附剂的载体可以通过商业购买来获得，作为具体例产品，例如，琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B(GE Healthcare，US)，树脂微球Nanomicro系列(苏州纳微科技有限公司)，但并不限于这些产品。

在使用上述载体时，优选地，可以将上述载体活化。该活化方式例如可以使用但不限于如下方法：首先进行环氧活化，其次再进行二胺丙基亚胺(DADPA)活化，最后进行碘乙酸活化，等。

前述吸附剂例如通过将纳米抗体或多肽偶联到经过活化的载体上而得到，具体的方法没有特别限定，例如，可通过将纯化的抗体还原，得到纳米抗体或多肽溶液，然后将该纳米抗体或多肽与载体混合，并通过离心分离，最终通过对凝胶进行清洗/过滤而得到最终的吸附剂。

本发明的吸附剂可以用来特异性识别IL-6。

本发明的纳米抗体或多肽或吸附剂可用于制备去除IL-6试剂，还可用于制备去除或检测IL-6的医疗器械。此外，本发明的纳米抗体或多肽或吸附剂还可用于免疫检测、富集和/或纯化等。

实施例

以下，举出实施例来说明本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式不受如下这些实施例的限制，可在不影响本发明所要达到的技术效果的范围内做出任意选择和变更。

A.筛选特异性结合IL-6的纳米抗体

实施例1

抗IL-6纳米抗体文库的构建。

本发明使用的噬菌体展示库是以M13噬菌体为载体的免疫库，建立步骤如下：

1)用IL-6免疫羊驼，免疫四次后采取两只羊驼的颈静脉血，分离外周血淋巴细胞，并提取总RNA(PuerLinkTM RNA Mini Kit，Life Technologies：12183018A)；

2)将总RNA反转录为cDNA，并用采用两轮巢式PCR进行扩增VHH基因；

其中第一轮PCR以cDNA为模版，以UP primer1和DOWN primer1分别为上游和下游引物，扩增后回收大小为650～750bp的条带，并以此为第二轮PCR的模板，上、下游引物分别为UP primer2，DOWN primer2，回收450～500bp的PCR产物；

UP primer1:5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’

DOWN primer1:5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’

UP primer2:5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3’

DOWN primer2：5’-CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3’

3)用PstI和Eco91I双酶切PCR产物，并进行琼脂糖电泳，回收350-500bp的基因条带，即为VHH基因片段；

4)用T4连接酶连接pMES4载体(已PstI和Eco91I双酶切)和VHH基因片段；

5)用电转化仪(MicroPulser，Bio-rad)将连接产物转化展示宿主细胞TG1(TG1Electroporation Competent Cell，北京华越洋，WG 1220)，将转化产物培养，收集菌体，得到原始电转化文库；

6)用辅助噬菌体(M13KO7，New England Biolabs，N0315S)侵染电转化文库，培养后从上清中收集噬菌体，得到噬菌体展示纳米抗体文库。

7)经检测，原始电转化文库的库容为7×10^9pfu，噬菌体展示纳米抗体文库的库容为2×10¹¹pfu/mL。

实施例2

纳米抗体的筛选。

首先，将抗原用TBS稀释为10μg/mL，取100μL加入96孔板中，4℃孵育12h。将孔中的抗原稀释液吸出，用TBS洗板3次，拍干，加入1％无蛋白封闭液(购自生工生物工程有限公司)，300μL/孔，室温孵育2h(筛选时1％无蛋白封闭液和1％BSA交替使用)。将孔中封闭剂吸出，用TBST洗板6次，拍干，加入扩增的噬菌体，100μL/孔，室温孵育 30min。用TBST洗板10次，加入T7洗脱缓冲液(1％SDS)洗脱噬菌体，室温孵育30min，并将洗脱液扩增，用于下一轮筛选。

实施例3

基因工程菌的构建

(1)经过四轮筛选之后，将筛选洗脱液进行固体扩增，挑取噬菌斑，以噬菌斑扩增液为模板，以UP primer3和DOWN primer3为上、下游引物，进行PCR扩增；

UP primer3：5’-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3’

DOWN primer3：5’-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3’；

(2)将一部分PCR产物委外测序，即得到所述纳米抗体序列信息，该序列如SEQ ID：18所示(“CNb1”)。

(3)将另一部分PCR产物用NdeI和XhoI进行双酶切，并回收酶切产物。同时用相同的方法进行酶切并回收载体，用T4连接酶连接酶切产物及载体，将连接产物转入大肠杆菌，得到表达IL-6特异性纳米抗体的基因工程菌。

实施例4

对特异性结合IL-6的纳米抗体的人源化

将纳米抗体CNb20-1和CNb20-2的蛋白序列与人种系进行比对，在框架区标记出差异氨基酸，然后用定点突变的方式将二者具有差异的氨基酸替换为人源氨基酸，产生人源化的纳米抗体(hCNb20-1和hCNb20-2)，如SEQ NO 21和SEQ NO 22所示。随后进行人源化纳米抗体的表达与纯化：

实施例5

IL-6纳米抗体的制备

(1)纳米抗体的基础培养基为TB培养基，按照5％接种量接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)(终浓度0.25mM，下同)进行过夜诱导；

(2)诱导结束后，在4000rpm的条件下离心20min，获得含有纳米抗体的湿菌。

(3)向所得的湿菌中按照1：10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.40.02M PB)，使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎；

(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min，取上清；

(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过亲和层析柱(GE Healthcare，US) 进行IL-6纳米抗体的分离纯化，其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose High Perfomance；

(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳以判断纯度，选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。纯化的纳米抗体的SDS-PAGE电泳图分别显示在图1(CNb20-1和hCNb20-1)和图2(CNb20-2和hCNb20-2)中。

实施例6

应用SPR技术分析纳米抗体CNb20-1和CNb20-2对IL-6的结合能力。将IL-6以 500～800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以1～100nM范围内的7个不同浓度注射纳米抗体，在所有实验中流速为30μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HCl pH2.0。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数K_a、K_d和K_D(表A-1和图3、图4)。图3是纳米抗体CNb20-1动力学传感图，图4是纳米抗体CNb20-2动力学传感图。图3、图4 中曲线从上到下依次为纳米抗体在12.5nM、6.25nM、3.13nM、1.56nM、0.313nM、0.156nM 浓度下的响应曲线，通过方程拟合计算出如表A-1所示的动力学参数，CNb20-1对IL-6的亲和力为1.11×10^-11M，CNb20-2对IL-6的亲和力为4.23×10^-11M。

表A-1纳米抗体CNb20-1和CNb20-2的动力学参数

B.抗IL-6纳米抗体的序列优化

实施例7：二价纳米抗体的制备

构建特异性结合IL-6的二价多肽

设计特异性结合IL-6的二价多肽序列的氨基酸序列，如SEQ NO 17和SEQ NO 18所示。其由C-末端纳米抗体A、15氨基酸Gly/Ser接头和C-末端纳米抗体B组成。其中，纳米抗体 A和纳米抗体B可以相同，也可以不同。

人工合成这些二价多肽的DNA序列，并将DNA片段连接到pET23a载体上，构建二价多肽质粒，并转化进入大肠杆菌，得到二价多肽工程菌。

随后进行二价多肽的表达与纯化：

(1)二价多肽的基础培养基为TB培养基，按照体积比为5％的接种量进行接种，37℃ 培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)(终浓度0.25mM)进行过夜诱导；

(2)诱导结束后，在4000rpm的条件下离心20min，获得含有二价多肽的湿菌。

(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min，取上清；

(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过亲和层析柱(GE Healthcare，US) 进行二价多肽的分离纯化，其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose High Perfomance；

(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳判断纯度，选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。纯化后的二价多肽的SDS-PAGE电泳图显示在图5中。

应用SPR技术分析二价多肽对IL-6的结合能力

将IL-6以500-800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以0.01-10nM范围内的5个不同浓度注射纳米抗体，在所有实验中流速为30μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HClpH2.0。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数K_a、K_d和K_D，如表 A-2所示。

表A-2二价多肽的动力学参数

由此可知，与CNb20-2相比，二价形式的纳米抗体与抗原IL-6的亲和力有不同程度的改善。

实施例8

应用SPR技术分析人源化纳米抗体对IL-6的结合能力

将IL-6以500～800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以0.01～10nM范围内的5 个不同浓度注射纳米抗体，在所有实验中流速为30μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HCl pH2.0。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数K_a、K_d和K_D。经计算，人源化后的纳米抗体(hCNb20-1的K_D为9.95×10^-11M)与抗原IL-6的亲和性相比没有显著降低(CNb20-1的K_D为1.11×10^-11M)。

实施例9

对特异性结合IL-6的二价多肽的人源化

设计特异性结合IL-6的人源化二价多肽序列的氨基酸序列，如SEQ NO 23所示。其由 C-末端纳米抗体hCNb20-1、15氨基酸Gly/Ser接头和C-末端纳米抗体hCNb20-1组成。

人工合成人源化二价多肽的DNA序列，并将DNA片段连接到pET23a载体上，构建人源化二价多肽质粒，并转化进入大肠杆菌，得到人源化二价多肽工程菌。

随后进行人源化二价多肽的表达与纯化：

(1)人源化二价多肽的基础培养基为TB培养基，按照5％接种量接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)进行过夜诱导；

(2)诱导结束后，在4000rpm条件下离心20min，获得含有人源化二价多肽的湿菌。

(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min，取上清；

(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过亲和层析柱(GE Healthcare，US) 进行人源化二价多肽的分离纯化，其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose HighPerfomance；

(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳判断纯度，选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。纯化后的人源化二价多肽hCNb20-1如图 6所示。

应用SPR技术分析人源化二价多肽对IL-6的结合能力

测试条件与实施例7中所述实验条件相同，使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数K_a、K_d和K_D。图7为人源化纳米抗体hbvCNb20-1的动力学传感图，该图中曲线从上到下依次为hbvCNb20-1在0.01nM、1nM、2nM、5nM、10nM浓度下的响应曲线，hbvCNb20-1的K_a＝2.28×10⁶Ms，K_d＝1.84×10^-4s^-1，K_D＝8.07×10^-11M。与 hCNb20-1(hCNb20-1的K_D为9.95×10^-11M)相比，人源化二价形式的纳米抗体 (hbvCNb20-1)与抗原IL-6的亲和力有所提高。

实施例10

纳米抗体表达量的比较

所述纳米抗体的制备如实施例5、实施例7和实施例9所示，纳米抗体的基础培养基为 TB培养基，按照5％接种量接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)(终浓度0.25mM)进行过夜诱导；诱导结束后，在4000rpm的条件下离心20min，获得含有纳米抗体的湿菌。菌体离心、破碎后进行纯化，每升培养液中最终收获的纯蛋白为最终表达量。几种纳米抗体的表达量如表B-1所示。

表B-1纳米抗体表达量

C.IL-6吸附剂的制备

实施例11

琼脂糖凝胶的活化

取琼脂糖凝胶微球若干，用纯化水充分洗涤，将乙醇等物质清洗干净，除去多余的水分，抽滤成湿饼后备用。称取清洗后的琼脂糖凝胶微球10mL，加入15mL氢氧化钠溶液和8mL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚，搅拌反应60min以上。活化反应结束后，用大量纯化水洗涤固体材料，直至清洗干净，除去多余的水分，抽滤成湿饼后备用。

实施例12

IL-6纳米抗体的固载

取环氧活化后的琼脂糖凝胶微球10mL，加入30mL的纳米抗体(CNb20-1)溶液， 37℃，150rpm搅拌反应24h以上。反应结束后，用大量纯化水洗涤固体材料，直至清洗干净，完成IL-6吸附剂的制备。差量法计算纳米抗体固载量为4.5mg/mL胶。

实施例13

吸附剂的溶血性能评价

使用10ml柠檬酸钠采血管进行健康家兔耳缘静脉采血，制备成新鲜抗凝兔血。取新鲜抗凝兔血8mL，加0.9％的氯化钠注射液10mL进行稀释，制得新鲜稀释抗凝兔血，在冰上放置，备用。

将实施例10制备的吸附剂放入离心管中，按0.2g/mL的比例，加入氯化钠注射液10mL。空白对照为未接触材料的氯化钠注射液。阳性对照为未接触材料的蒸馏水。每组平行操作3管。将上述试管放入至恒温水浴锅中，37±1℃恒温水浴30min后，每支试管分别加入0.2mL稀释的新鲜抗凝兔血，轻轻混匀，再继续水浴60min。倒出上述管中血水，放入离心机中，800g离心5min。取上清液放入对应标记的离心管中，在冰上放置，备用。

吸取上清液移入比色皿中，用分光光度计在545nm处测定吸光值。用生理盐水调零。

溶血率计算公式：

P＝(A1-A2)/(A3-A2)*100％

式中：P—溶血率(％)；

A1—供试品组吸光度；

A2—阴性对照组吸光度；

A3—阳性对照组吸光度。

用规定的静态接触溶血法测得的该吸附剂溶血率为0.5％，合格品的判定指标一般应小于5％。

实施例14

吸附剂对血液中IL-6的吸附情况

IL-6吸附剂对血清中IL-6的去除效果评价

将IL-6溶于370mL牛血清中，检测血清中IL-6的初始浓度为257pg/mL。

取2g吸附剂，装于层析柱中，组成一个简易吸附柱。用软管依次连接蠕动泵、压力表、吸附柱，调节泵流速为40mL/min左右，使血清溶液在管路中循环。实验结束后，检测血清中IL-6的浓度为14.9pg/mL，计算该吸附剂对IL-6的去除率为94.2％。

产业上的可利用性

本发明的纳米抗体是通过噬菌体库的筛选发现的具有新的氨基酸序列的抗IL-6纳米抗体，该纳米抗体及其多肽具有很高的亲和力和活性，能够特异性地识别并结合IL-6，吸附剂对IL-6的吸附能力极强，可应用于血液净化及IL-6检测领域，有助于IL-6相关疾病的诊断和治疗。

序列表

<110> 康元医疗科技（大连）有限公司

<120> 一种纳米抗体、涉及该纳米抗体的多肽及其应用

<130> LI10920238

<141> 2020-12-30

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 1

Ser Ser Gly Ile Leu Glu Ile Phe Asn Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 2

Ile Met Gly Ser Pro Tyr Gly Ser Thr Glu

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 3

His Ser Ala Gly Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 4

Ser Gly Arg Phe Thr Gly Gly Ser Pro

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 5

Ile Met Gly Arg Gly Gly Ser Asn Thr

1 5

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 6

Ala Glu Ala Glu Arg Val Ser Gly Leu Leu Leu Glu Val Val Ala Glu

1 5 10 15

Pro Arg Gly Asp Asp Tyr

20

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

20

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 8

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Arg

<210> 9

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 9

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Glu Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 10

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Ala Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

20

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 12

Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Asp

<210> 13

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 13

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 14

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Gly Ile Leu Glu Ile Phe

20 25 30

Asn Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp

35 40 45

Val Ala Arg Ile Met Gly Ser Pro Tyr Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Thr

85 90 95

Tyr Tyr Cys His Ser Ala Gly Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Ala Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Phe Thr Gly Gly Ser

20 25 30

Pro Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Asp Ile Met Gly Arg Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Ala Glu Arg Val Ser Gly Leu Leu Leu Glu Val Val Ala Glu

100 105 110

Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 17

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Gly Ile Leu Glu Ile Phe

20 25 30

Asn Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp

35 40 45

Val Ala Arg Ile Met Gly Ser Pro Tyr Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Thr

85 90 95

Tyr Tyr Cys His Ser Ala Gly Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Ser Gly Ile Leu Glu Ile Phe Asn Ala Met Ala Trp Phe Arg

165 170 175

Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala Arg Ile Met Gly Ser

180 185 190

Pro Tyr Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

195 200 205

Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp

210 215 220

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys His Ser Ala Gly

225 230 235 240

Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

245 250 255

Val Ser Ser

<210> 18

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Ala Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Phe Thr Gly Gly Ser

20 25 30

Pro Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Asp Ile Met Gly Arg Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Ala Glu Arg Val Ser Gly Leu Leu Leu Glu Val Val Ala Glu

100 105 110

Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Ala Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

145 150 155 160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Phe Thr Gly Gly Ser

165 170 175

Pro Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val

180 185 190

Ala Asp Ile Met Gly Arg Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Asp Ser Val

195 200 205

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

210 215 220

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Glu Ala Glu Arg Val Ser Gly Leu Leu Leu Glu Val Val Ala Glu

245 250 255

Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

260 265 270

Ser

<210> 19

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Gly Ile Leu Glu Ile Phe

20 25 30

Asn Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp

35 40 45

Val Ala Arg Ile Met Gly Ser Pro Tyr Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Thr

85 90 95

Tyr Tyr Cys His Ser Ala Gly Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Ala Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Arg Phe Thr Gly Gly Ser Pro Met Gly Trp Tyr Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val Ala Asp Ile Met Gly Arg Gly

180 185 190

Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys

210 215 220

Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Ala Glu Arg Val Ser

225 230 235 240

Gly Leu Leu Leu Glu Val Val Ala Glu Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

260 265

<210> 20

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Ala Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Phe Thr Gly Gly Ser

20 25 30

Pro Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Asp Ile Met Gly Arg Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Ala Glu Arg Val Ser Gly Leu Leu Leu Glu Val Val Ala Glu

100 105 110

Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

145 150 155 160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Gly Ile Leu Glu Ile Phe

165 170 175

Asn Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp

180 185 190

Val Ala Arg Ile Met Gly Ser Pro Tyr Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys His Ser Ala Gly Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

260 265

<210> 21

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Gly Ile Leu Glu Ile Phe

20 25 30

Asn Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp

35 40 45

Val Ser Ala Ile Met Gly Ser Pro Tyr Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr

85 90 95

Tyr Tyr Cys His Ser Ala Gly Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Ala Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Phe Thr Gly Gly Ser

20 25 30

Pro Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ser Ala Asp Ile Met Gly Arg Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Glu Ala Glu Arg Val Ser Gly Leu Leu Leu Glu Val Val Ala

100 105 110

Glu Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 23

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列(1)

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Gly Ile Leu Glu Ile Phe

20 25 30

Asn Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp

35 40 45

Val Ser Ala Ile Met Gly Ser Pro Tyr Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr

85 90 95

Tyr Tyr Cys His Ser Ala Gly Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Ser Gly Ile Leu Glu Ile Phe Asn Ala Met Ser Trp Phe Arg

165 170 175

Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ser Ala Ile Met Gly Ser

180 185 190

Pro Tyr Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

195 200 205

Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp

210 215 220

Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys His Ser Ala Gly

225 230 235 240

Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

245 250 255

Val Ser Ser

Claims

1.一种抗IL-6的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列包括互补决定区CDR和框架区FR，

所述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3；其中，所述互补决定区CDR的序列分别为：

所述CDR1选自SEQ ID NO:1所示的CDR1或SEQ ID NO:4所示的CDR1，

所述CDR2选自SEQ ID NO:2所示的CDR2或SEQ ID NO:5所示的CDR2，

所述CDR3选自SEQ ID NO:3所示的CDR3或SEQ ID NO:6所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述框架区FR包括框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4的氨基酸序列，所述框架区FR的序列分别为：

所述FR1选自SEQ ID NO:7所示的FR1或SEQ ID NO:11所示的FR1，

所述FR2选自SEQ ID NO:8所示的FR2或SEQ ID NO:12所示的FR2，

所述FR3选自SEQ ID NO:9所示的FR3或SEQ ID NO:13所示的FR3，

所述FR4选自SEQ ID NO:10所示的FR4或SEQ ID NO:14所示的FR4。

3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列为具有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的片段是人源化的。

5.一种多肽，其特征在于，其包含权利要求1～3所述的纳米抗体，

可选地，所述多肽是多价多肽；

可选地，所述多价多肽是二价或三价的多肽；

可选地，所述二价或三价的多肽是特异性多肽；

可选地，所述二价多肽的氨基酸序列为SEQ ID No:17或SEQ ID No:18；所述特异性多肽的氨基酸序列为SEQ ID No:19或SEQ ID No:20。

6.一种核酸，其特征在于，其是通过编码权利要求1～3所述记载的纳米抗体和/或权利要求5所述的多肽而成的。

7.一种宿主或宿主细胞，其特征在于，其能够表达权利要求1～3所述的纳米抗体和/或权利要求6所述的核酸。

8.一种吸附剂，其特征在于，所述吸附剂包括载体基质和权利要求1～3所述纳米抗体或权利要求5所述的多肽。

9.一种权利要求1～3记载的纳米抗体和/或权利要求5记载的多肽在制备IL-6吸附剂上的应用。

10.一种权利要求1～3记载的纳米抗体和/或权利要求5记载的多肽在免疫检测、富集和/或纯化等中的应用。