CN117209606A

CN117209606A - 纳米抗体及其应用

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Publication number: CN117209606A
Application number: CN202310986252.5A
Authority: CN
Inventors: 王雨萌; 黄春东; 李景煜; 陈复; 朱世昱
Original assignee: Crown Medical Tech Dalian Co ltd
Current assignee: Crown Medical Tech Dalian Co ltd
Priority date: 2023-08-07
Filing date: 2023-08-07
Publication date: 2023-12-12
Anticipated expiration: 2043-08-07
Also published as: CN117209606B

Abstract

本发明涉及纳米抗体及其应用，其中，该纳米抗体的氨基酸序列包含特殊结构的互补决定区和框架区。本发明的纳米抗体，是通过全合成人源化纳米抗体文库筛选发现的具有新的氨基酸序列的抗CD45纳米抗体，该纳米抗体能够特异性地识别并结合CD45，进而实现白细胞的捕获。本发明还涉及使用该纳米抗体制备的白细胞吸附剂，以及基于该吸附剂的稀有细胞分离和富集方法。本发明的稀有细胞分离方法，实现了白细胞的高效吸附，简单快捷地实现了稀有细胞的浓缩与分离。

Description

纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可以特异性地识别并结合白细胞CD45的纳米抗体。本发明还涉及所述纳米抗体在稀有细胞的分离、富集、检测中的应用。

发明背景

稀有细胞存在于人或动物的血液、组织液、淋巴液或尿液等生物样本中，其数量极为稀少但在临床上具有重要指导意义。例如循环上皮细胞是存在于血液中的一种稀有细胞，从病变的上皮组织脱落，其中，从良性病变组织脱落的为良性上皮细胞，从恶性病变组织脱落的为循环肿瘤细胞(CTC)。其数目及其稀少，每10mL血液可能仅含几个到几十个CTC，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞(Zhe XN,Cher ML,Bonfil RD,Am.J.CancerRes.2011,1,740-751)，给CTC的检测带来极大挑战。此外，由于CTC存在异质性，导致不同癌症病人之间，甚至同一个病人体内的肿瘤细胞之间具有很大的差异。因此，实现高效、高纯度、多表型的循环肿瘤细胞分离、富集面临巨大的挑战。

目前，对于稀有细胞的分离富集大致可分为三类：

一是物理分离法，利用稀有细胞与血细胞的尺寸差异进行分离。红细胞明显小于上皮来源的细胞，而白细胞虽然平均尺寸小于上皮细胞，但是数量巨大的白细胞其尺寸分布很宽，且CTC异质性较大，因此部分白细胞与CTC的尺寸存在重叠。通过这一方法分离的CTC中往往混入大量白细胞，获得样本的纯度很低，难以进行后续的分析。同时，由于肿瘤细胞的异质性，存在着一些尺寸较小的CTC漏选从而造成损失。

二是靶向捕获法，主要通过稀有细胞上特异性标志物(如上皮来源的CTC表面标志物EpCAM，EGFR，HER2等)的抗体或配体来富集和捕获稀有细胞。该方法还可以与物理分离法结合，在微流控通道上修饰抗体来进一步提高捕获效率。

三是阴性富集法，这一方法主要是为解决正选难以富集到的稀有细胞，其富集策略是将血液中已知的血细胞分步去除，从而剩下的细胞悬液中包含了我们所需要的全部稀有细胞。基本的方法是首先通过密度梯度离心去除血液中的红细胞及部分白细胞，再用修饰了CD45抗体的免疫微球孵育(CD45是白细胞表面共同抗原)，然后通过施加磁场或密度分离截留表面结合了CD45微球的白细胞，同时收集剩余的细胞悬液，其中包含了所需要的稀有细胞，最后通过离心浓缩这一稀有细胞悬液并进行后续分析。阴性富集法的优点是可以实现多表型的稀有细胞富集，最大程度的降低漏选率。但存在操作步骤多、抗CD45抗体成本高、多次离心造成细胞损伤等缺点，之前的研究表明这一方法的回收率较低，成本很高，因此一直不是主流的稀有细胞富集方法。

由上述，现有稀有细胞的分离富集方法中，物理分离法存在白细胞数量巨大且尺寸分布很宽导致富集和分离难度大，靶向捕获法存在一些稀有细胞特异性捕获效率不高，阴性富集法操作复杂且成本高，损失细胞的缺陷，使得现有方法在白细胞精准分离上仍存在缺陷。

发明内容

为了解决白细胞精准分离的问题，提高抗体对白细胞的吸附能力，在第一方面，根据本申请一些实施例的纳米抗体，所述纳米抗体的互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3序列：

(I)：(1)所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，(2)所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；以及(3)所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；或

(II)：如(I)的(1)、(2)、(3)所述氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或

(III)：与(I)的(1)所述氨基酸序列具有62.5％以上同源性的氨基酸序列，与(I)的(2)所述氨基酸序列具有37.5％以上同源性的氨基酸序列，与(I)的(3)所述氨基酸序列具有42.86％以上同源性的氨基酸序列。

根据本申请一些实施例的纳米抗体，其中：(II)的如(I)的(1)、(2)、(3)所述氨基酸序列经取代一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，包括

(II-1)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；或

(II-2)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；或

(II-3)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；或

(II-4)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，CDR3的氨基酸序列如是SEQ ID NO:23所示；或

(II-5)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或

(II-6)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或

(II-7)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；或

(II-8)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。

根据本申请一些实施例的纳米抗体，其中：(III)的与(I)的(1)所述氨基酸序列具有62.5％以上同源性的氨基酸序列，与(I)的(2)所述氨基酸序列具有37.5％以上同源性的氨基酸序列，与(I)的(3)所述氨基酸序列具有42.86％以上同源性的氨基酸序列，包括

(III-1)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；或

(III-2)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；或

(III-3)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；或

(III-4)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:14所示，CDR3的氨基酸序列如是SEQ ID NO:23所示；或

(III-5)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或

(III-6)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:16所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或

(III-7)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；或

(III-8)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:18所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。

根据本申请一些实施例的纳米抗体，(IV)所述纳米抗体的框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4序列，其中：(1)所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，(2)所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，(3)所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，(4)所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；或

(V)与如(IV)的(1)、(2)、(3)、(4)所述的氨基酸序列具有50％以上同源性的氨基酸序列。

根据本申请一些实施例的纳米抗体，所述纳米抗体具有

(VI)如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；或

(VII)如(VI)所述氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或

(VIII)与如(VI)所述的氨基酸序列具有89.43％以上同源性的氨基酸序列。

根据本申请一些实施例的纳米抗体，其中，(VII)或(VIII)的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示：或如SEQ ID NO:34所示；或如SEQ ID NO:35所示；或如SEQ ID NO:36所示；或如SEQ ID NO:37所示；或如SEQ ID NO:38所示；或如SEQ ID NO:39所示；或如SEQID NO:40所示；或如SEQ ID NO:41所示。

在第二方面，根据本申请一些实施例的多肽，包括任一项所述纳米抗体。

根据本申请一些实施例的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:41所示。

在第三方面，根据本申请一些实施例的编码任一项所述纳米抗体的核酸分子。

在第四方面，根据本申请一些实施例的表达载体，包括任一项所述的核酸分子。

在第五方面，根据本申请一些实施例的转化或转染所述任一项表达载体的宿主细胞。

在第六方面，根据本申请一些实施例的结合物或偶联物，包括经化学标记或生物标记的任一项所述的纳米抗体。

在第七方面，根据本申请一些实施例的吸附剂，包括任一项所述的纳米抗体、任一项所述多肽、任一项所述的核酸分子、任一项所述的表达载体、任一项所述的宿主细胞、任一项所述的结合物和/或任一项所述的偶联物，以及载体。其中，可以理解的是包括任一项所述的纳米抗体、任一项所述多肽、任一项所述的核酸分子、任一项所述的表达载体、任一项所述的宿主细胞、任一项所述的结合物、任一项所述的偶联物中的一种以上，即包括其中一种或者任意组合。

在第八方面，根据本申请一些实施例的试剂盒，包括任一项所述的纳米抗体、任一项所述多肽、任一项所述的核酸分子、任一项所述的表达载体、任一项所述的宿主细胞、任一项所述的结合物和/或任一项所述的偶联物，以及检测中可接受的助剂。其中，可以理解的是包括任一项所述的纳米抗体、任一项所述多肽、任一项所述的核酸分子、任一项所述的表达载体、任一项所述的宿主细胞、任一项所述的结合物、任一项所述的偶联物中的一种以上，即包括其中一种或者任意组合。

在第九方面，根据本申请一些实施例的种设备，用于吸附并分离白细胞，包括任一项所述的纳米抗体、任一项所述多肽、任一项所述的核酸分子、任一项所述的表达载体、任一项所述的宿主细胞、任一项所述的结合物、任一项所述的偶联物、任一项所述的吸附剂何/或任一项所述的试剂盒。其中，可以理解的是包括任一项所述的纳米抗体、任一项所述多肽、任一项所述的核酸分子、任一项所述的表达载体、任一项所述的宿主细胞、任一项所述的结合物、任一项所述的偶联物、任一项所述的吸附剂、任一项所述的试剂盒中的一种以上，即包括其中一种或者任意组合。

在第十方面，根据本申请一些实施例的一种稀有细胞富集方法，包括使用吸附剂吸附白细胞；通过细胞分离液使稀有细胞与吸附白细胞的吸附剂分离，使所述稀有细胞富集；其中，所述吸附剂为任一项所述的吸附剂。

在第十一方面，根据本申请一些实施例的稀有细胞检测方法，使用任一项所述富集方法使所述稀有细胞富集，使用检测试剂检测稀有细胞。

在第十二方面，根据本申请一些实施例的任一项所述的纳米抗体；或任一项所述多肽；或任一项所述的核酸分子；或任一项所述的表达载体；或任一项所述的宿主细胞；或任一项所述的结合物；或任一项所述的偶联物；或任一项所述的吸附剂；或任一项所述的试剂盒在特异性吸附CD45或白细胞中的应用。

在第十三方面，根据本申请一些实施例的任一项所述的纳米抗体；或任一项所述多肽；或任一项所述的核酸分子；或任一项所述的表达载体；或任一项所述的宿主细胞；或任一项所述的结合物；或任一项所述的偶联物；或任一项所述的吸附剂；或任一项所述的试剂盒在免疫检测中的应用。

在第十四方面，根据本申请一些实施例的任一项所述的纳米抗体；或任一项所述多肽；或任一项所述的核酸分子；或任一项所述的表达载体；或任一项所述的宿主细胞；或任一项所述的结合物；或任一项所述的偶联物；或任一项所述的吸附剂；或任一项所述的试剂盒在血液净化中的应用。

在第十五方面，根据本申请一些实施例的任一项所述的纳米抗体；或任一项所述多肽；或任一项所述的核酸分子；或任一项所述的表达载体；或任一项所述的宿主细胞；或任一项所述的结合物；或任一项所述的偶联物；或任一项所述的吸附剂；或任一项所述的试剂盒在富集和/或纯化细胞中的应用。

在第十六方面，根据本申请一些实施例的任一项所述的纳米抗体；或任一项所述多肽；或任一项所述的核酸分子；或任一项所述的表达载体；或任一项所述的宿主细胞；或任一项所述的结合物；或任一项所述的偶联物；或任一项所述的吸附剂；或任一项所述的试剂盒在制备检测肿瘤疾病的制剂中的用途。

在第十七方面，根据本申请一些实施例的任一项所述的纳米抗体；或任一项所述多肽；或任一项所述的核酸分子；或任一项所述的表达载体；或任一项所述的宿主细胞；或任一项所述的结合物；或任一项所述的偶联物；或任一项所述的吸附剂；或任一项所述的试剂盒在检测肿瘤疾病的设备中的用途。

有益的效果：本发明的纳米抗体，是通过全合成人源化纳米抗体文库筛选发现的具有新的氨基酸序列的抗CD45的纳米抗体，因此该纳米抗体及其多肽具有很高的亲和力和活性，能够特异性地识别并结合CD45。应用所述纳米抗体制备的吸附剂对白细胞的吸附能力极强，可应用于生物样品中白细胞的吸附与去除，进一步应用于稀有细胞的检测与富集，实现高效、高纯度、多表型的循环肿瘤细胞分离与富集。

附图说明

图1是纳米抗体CD0～CD8的SDS-PAGE电泳表达条带；

图2是纳米抗体CD0～CD8的动力学传感图；

图3是琼脂糖吸附剂的吸附流程图；

图4是花粉芯片对CTCs的捕获图。

具体实施方式

本发明的上述内容及其他方面将通过下文进一步描述清楚，其中：

(1)除非指明或者另外定义，使用的所有术语具有在本领域中的通用意义，为本领域技术人员所共知。

(2)除非另外指明，术语“序列”用于本文时(如在类似“抗体序列”“可变区序列”“V_HH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包括相关氨基酸序列及编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更狭义的解释。

(3)除非另外指明，所有没有具体描述的方法、步骤、技术和操作为已知的并如本领域技术人员所熟知的。例如，参照所引用的综合背景技术以及其他参考文献。

(4)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示。

(5)术语“特异性”是指特定的抗原结合分子(如本发明的纳米抗体或多肽)可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的能力。一种抗原结合分子的特异性可以根据其亲和力和/或活性而确定。亲和力表示为抗原与抗原结合分子的解离平衡常数(K_D)，是抗原与抗原结合分子之间的结合强度的测量，K_D值越小，抗原和抗原结合分子之间的结合强度越强，反之，K_D值越大，抗原和抗原结合分子之间的结合强度越弱。K_a表示结合常数，K_a越大，表明结合越快，K_a越小，表明结合越慢；K_d表示解离常数，K_d越大，解离越快，K_d越小，解离越慢；并且K_D＝K_d/K_a。

(6)术语“固载量”是指单位体积亲和介质(吸附剂)所偶联的配基的总量。

本发明的纳米抗体的氨基酸序列基本上包括互补决定区CDR和框架区FR。

上述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，上述框架区FR包括框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4。其中，可选地，上述框架区序列是来源于VHH序列、人源化VHH序列或被驼源化的常规VH序列。优选地，所述框架区FR序列为：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:28，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:29，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:30，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:31。

SEQ ID NO:28：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG

SEQ ID NO:29：GWFRQAPGKGLEAVAAI

SEQ ID NO:30：YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

SEQ ID NO:31：YWGQGTLVTVSS

此外，纳米抗体的残基总数可以在110-120个区间，优选112-115个，并且最优选113个。然而，纳米抗体的部分、片段或类似物不特别局限于它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段或类似物满足下文列出的进一步要求且还适于本文所述的目的。

作为“纳米抗体”的制备方法，不限于具体的生物资源或具体的制备方法。例如，本发明的纳米抗体可以这样获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的V_HH结构域；(2)通过表达编码天然存在的V_HH结构域的核苷酸序列；(3)通过将天然存在的V_HH结构域“人源化”(如下文所述)或者通过表达编码所述人源化V_HH结构域的核酸；(4)应用合成或半合成技术制备蛋白、多肽或者其他氨基酸序列；(5)通过应用核酸合成技术制备编码纳米抗体的核酸，然后表达这样获得的核酸；和/或(6)通过前述的任何结合。

此外，本发明还涉及包含至少一个V_HH结构域或至少一个基于其的蛋白或多肽。

按照本发明的一个非限制性的实施方案，上述多肽基本上由纳米抗体组成。“基本上由……组成”指本发明的多肽的氨基酸序列与纳米抗体的氨基酸序列完全相同或相对应，其中有限数目的氨基酸残基，如1～10个氨基酸残基，并且优选的1～6个氨基酸残基，如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基，加到所述纳米抗体或多肽的氨基末端(N-端)和/或羧基末端(C-端)。

上述氨基酸残基可以不改变纳米抗体的生物学特性，并且可以给所述纳米抗体加入其他官能性。例如，所述氨基酸残基可以：

a是纯化标签，即利于所述纳米抗体的纯化的氨基酸序列或残基，例如，使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。这种残基的一些优选的但非限定的实例是多组His-tag(His₆或His₈)、GST-tag、MBP-tag、Myc-tag、Strep-tag、Flag-tag、HA-tag、V5-tag、S-tag、E-tag；

b是可溶标签，即利于增加纳米抗体可溶性的标签，例如SUMO-tag；

c是N-端氨基酸残基，例如，Met、Ala、Gln或MetAlaGln、AlaGln，借此可以在异源宿主细胞或宿主生物体内表达；

d是C-端Cys残基，例如，借此可以与配基上的-SH反应或与Au表面反应；

e是铰链，以提供纳米抗体与其他基团的链接或间隔，例如，GlySer的组合、IgG铰链、IgA铰链，或其他人工合成的铰链；

f是以已知的方式可以提供有官能团和/或已经被官能化的一个或多个氨基酸残基，例如，如本领域已知，氨基酸残基如赖氨酸或半胱氨酸允许聚乙二醇(PEG)基团附着。

本发明的多肽还可以包括2个或多个所述纳米抗体，也称为多价多肽，如二价、三价、四价的多肽。

此外，除了所述1个或多个纳米抗体之外，本发明的多肽还可以包含官能团、部分或残基，如治疗活性物质，和/或标签，如荧光素标记、同位素标记、生物素标记和酶催化标签等，和/或铰链，和/或保护氨基酸，和/或用于固载或纯化的氨基酸。

此外，本发明的纳米抗体或多肽与CD45结合的解离平衡常数(K_D)为10^-9～10^-11摩尔/升(M)。

上述抗原与抗原结合分子之间的特异性结合可以用已知的任何适当的方法确定，其包括，斯卡查德分析(Sercatchard Analysis)和/或竞争结合检测如放射性免疫分析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA)，以及本领域已知的其他新方法，如等离子共振技术(SPR)和/或生物膜干涉(BLI)技术等。

本发明目的在于提供具有特定结构的氨基酸序列的纳米抗体、具有该纳米抗体的多肽、编码该纳米抗体和/或多肽的核酸、表达载体以及能够表达该纳米抗体和/或多肽的宿主或宿主细胞、包含该纳米抗体的结合物、偶联物、吸附剂、试剂盒和设备，以及该纳米抗体和/或多肽在制备白细胞吸附剂和阴性富集稀有细胞中的应用。

本发明的纳米抗体、多肽、及编码其的核酸，可以以已知的方式制备，本领域技术人员可有本文进一步描述而清楚。关于制备所述纳米抗体、多肽和核酸的一种特别有用的方法通常包括如下步骤：

(1)在适宜的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适宜的表达体系中，表达编码所述本发明的纳米抗体或多肽的核酸，任选地接着进行；

(2)分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米抗体或多肽。

也可以是，采用其他方法，包括如下步骤：

(3)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，使本发明的宿主表达和/或生产一种本发明的纳米抗体和/或多肽；任选地接着进行；

(4)分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米抗体或多肽。

本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选的是双链DNA形式。例如，本发明的核酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA，即，密码子优化)。

本发明的纳米抗体或多肽可以特异性结合所述抗原CD45，因此本发明的一个优选但非限制性的应用为CD45吸附剂，前述吸附剂包括载体基质和所述纳米抗体或多肽。

前述载体基质可以为多孔材料，例如，琼脂糖凝胶微球、纤维素球、磁珠、硅胶微球、活性炭或树脂微球等。

用于前述吸附剂的载体可以通过商业购买来获得，作为具体例产品，例如，琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B(GE Healthcare，US)，树脂微球Nanomicro系列(苏州纳微科技有限公司)，但并不限于这些产品。

在使用上述载体时，优选地，可以将上述载体活化。该活化方式例如可以使用但不限于如下方法：首先进行环氧活化，其次再进行二胺丙基亚胺(DADPA)活化，最后进行碘乙酸活化，等。

前述吸附剂通过将纳米抗体或多肽偶联到经过活化的载体上而得到，具体的方法没有特别限定，例如，可通过将纯化的纳米抗体或多肽溶液与载体混合，并通过离心分离，最终通过对凝胶进行清洗/过滤而得到最终的吸附剂。

本发明的吸附剂可以用来特异性吸附CD45，或进一步吸附白细胞。

本发明的纳米抗体或多肽或吸附剂可用于吸附白细胞，进一步富集和分析生物样本中的稀有细胞，还可用于制备CD45的纯化试剂和检测试剂。

实施例

以下，举出实施例来说明本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式不受如下这些实施例的限制，可在不影响本发明所要达到的技术效果的范围内做出任意选择和变更。

A.纳米抗体文库建立

实施例1全合成人源化纳米抗体文库构建。

(1)基于公开的的全人源化VHH构架构建该抗体文库，其CDR中具有合成多样性的一段氨基酸序列。VHH合成框架如附图1所示。

(2)委外合成CDR区的ssDNA序列和引物，其核酸序列分别为：

>CDR1

5’-TTAGAACCAGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCGGGCGGTAGCCTGAGATTATCTTGTGCGGCGAGCGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTTGGTTTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGACTGGAGGCCGTAGCG-3’

>CDR2

5’-GCAGTAGTAAACTGCGGTGTCCTCGGCGCGCAGGGAGTTCATTTGCAGGTATAAGGTGTTCTTGCTGTTGTCACGGCTAATGGTGAAACGACCTTTAACACTATCTGCGTAGTANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATTGCCGCTACGGCCTCCAGTCCTTTGCCCG-3’

>CDR3

5’-GTGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGAAACAGTGACCAGAGTACCTTGACCCCAGTANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGCGCAGTAGTAAACTGCGGTGTCCTC-3’

>F-1

5’-TTAGAACCAGCCATGGCCC-3’

>R-1

5’-GCAGTAGTAAACTGCGGTG-3’

>R-2

5’-GTGCTGGCCGGCCTGGCCAC-3’

(3)第一轮重叠延伸PCR

PCR反应体系：

组份	体积
		ssDNA CDR1	1pmol
ssDNA CDR2	1pmol
		F-1引物	1μL
R-1引物	1μL
		dNTP	2μL
10×Taq buffer	5μL
		Taq酶	0.5μL
ddH2O	补足25μL

PCR反应程序：

琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，切胶回收目的片段(306bp)，用于第二轮重叠延伸PCR。

(4)第二轮重叠延伸PCR

PCR反应体系：

组份	体积
		第一轮PCR产物	1pmol
ssDNA CDR3	1pmol
		F-1引物	1μL
R-2引物	1μL
		dNTP	2μL
10×Taq buffer	5μL
		Taq酶	0.5μL
ddH2O	补足25μL

PCR反应程序：

琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，切胶回收目的片段(407bp)，用于噬菌粒构建。

实施例2 pMES4-VHH重组质粒的构建。

前期合成引物在F-1和R-2引物的5'端分别引入了NcoI和SfiI核酸内切酶碱基序列，因此合成的PCR产物前后具有NcoI和SfiI酶切位点。

(1)用NcoI和SfiI内切酶对VHH和pMES4噬菌粒载体分别进行双酶切。酶切体系为200μL，酶切条件为50℃，酶切12h。

(2)酶切结束之后，将VHH片段酶切体系做乙醇沉淀处理，pMES4噬菌粒载体酶切体系做胶回收处理。

(3)连接反应。连接体系为：

VHH片段	15ng
		pMES4载体片	50ng
T4连接酶	1μL
		10×T4buffer	2μL
ddH2O	补足20μL

共做20管连接体系，16℃连接12h左右。

(4)将所有的连接反应都做连接失活处理，即将离心管放置65℃恒温加热器中加热20min，这将有利于之后的酶切反应。最后做乙醇沉淀处理，拿到pMES4-VHH的连接产物。

实施例3电转化建立纳米抗体库。

(1)每个电转化体系取1μL连接产物电转50μL XL-Blue感受态，加入1mL LB培养基。

(2)混合所有电转化产物，37℃摇床180rpm孵育1小时。

(3)培养后，取10μL转化产物进行梯度稀释后涂2×YT固体平板(含50μg/mL Amp，2％葡萄糖)，37℃倒置培养过夜，第二天计算库容量(库容量＝克隆数×稀释倍数)。

(4)其余产物全部涂到数个15cm 2×YT-KG固体平板(含50μg/mL Amp，2％葡萄糖)，37℃倒置培养过夜。

(5)刮取菌苔，以含15％甘油的LB培养基重悬，测定OD600，分装后-80℃冰箱储存，此为原始纳米抗体库。

B.抗CD45纳米抗体筛选

实施例4噬菌体文库救援。

(1)接种1mL原始纳米抗体库溶液到含有100mL 2×YT液体培养基(含50μg/mLAmp，2％葡萄糖)的摇瓶中，37℃摇床220rpm振荡培养至OD600＝0.7-0.8。

(2)加入20倍量的VCSM13辅助噬菌体，将摇瓶先在37℃温箱中放置30min，随后在37℃摇床80rpm振荡培养1h。

(3)培养结束之后，将溶液分装到50mL离心管中，4℃，5000rpm离心20min，弃上清，把沉淀重悬在500mL 2×YT液体培养基(含25μg/mL Kan，50μg/mLAmp)的摇瓶中，37℃摇床220rpm振荡培养过夜。

(4)4℃，5000g离心20min，收集上清，向上清中加入1/5体积的5×PEG/Nacl溶液，离心管插在冰上冰浴1h以沉淀噬菌体。

(5)4℃，5000g离心40min，弃上清，沉淀用10mL PBS重悬，4℃冰箱储存。

(6)测定噬菌体滴度。取10μL待测噬菌体样品，以PBS进行10倍连续梯度稀释。从每个稀释梯度的噬菌体取10μL，加入100μL对数生长期的XL-Blue细胞(OD600＝0.7-0.8)，37℃静置孵育30min。涂2×YT固体平板(含50μg/mLAmp，2％葡萄糖)，37℃倒置培养过夜，第二天计算滴度(滴度＝克隆数×稀释倍数)。

实施例5纳米抗体筛选。

(1)在高吸附96孔板中，选一孔为筛选孔，加100μL待分析抗原(5μg/mL in PBS)，4℃孵育过夜。洗板5次(250μL PBST，下同)。

(2)筛选孔中加300μL封闭剂(3％脱脂奶粉)。室温静置孵育2h。洗板5次。

(3)取10¹²的噬菌体文库，PBS稀释到100μL，加入筛选孔中。室温水平摇床孵育2h。洗板5次。

(4)筛选孔中加100μL 1％SDS，轻柔吹打数次，立即稀释到1mLPBS中以避免噬菌体失活。

(5)取10μL上述溶液按上述步骤测定滴度。

(6)取10mL对数生长期的XL-Blue细胞(OD600＝0.7-0.8)在50mL无菌离心管中，加入上一步所洗脱的噬菌体，37℃静置孵育30min。

(7)添加10mL 2×YT液体培养基(含100μg/mLAmp，4％葡萄糖)，摇床37℃170rpm培养2h。

(8)加入10倍VCSM13辅助噬菌体，37℃静置孵育30min，让噬菌体感染细胞。

(9)3000g，5000rpm，离心20min，弃上清，把沉淀重悬在500mL2×YT液体培养基(含25μg/mL Kan，50μg/mLAmp)的摇瓶中，37℃摇床220rpm振荡培养过夜。

(10)4℃，5000g离心20min，收集上清，向上清中加入1/5体积的5×PEG/Nacl溶液，离心管插在冰上冰浴1h以沉淀噬菌体。

(11)4℃，5000g离心40min，弃上清，沉淀用10mLPBS重悬，4℃冰箱储存。测定噬菌体滴度。

(12)所扩增的噬菌体可用于下一轮纳米抗体筛选直至获得理想克隆用于后续实验。

实施例6单克隆测序、表达制备及亲和力测定。

(1)从实施例5的滴度测定平板上挑取单克隆，委托上海生工进行测序，测序引物为：MP57:5’-TTA TGCTTCCGGCTCGTATG-3’。

(2)将氨基酸不同的单克隆进行PCR扩增，构建表达菌株。

将PCR产物用NcoI和SfiI进行双酶切，并回收酶切产物。同时用相同的方法进行酶切并回收载体，用T4连接酶连接酶切产物及载体，将连接产物转入大肠杆菌，得到表达抗CD45特异性纳米抗体的基因工程菌。

(3)纳米抗体的表达与纯化。

纳米抗体的基础培养基为TB培养基，按照5％接种量接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)(终浓度0.25mM，下同)进行过夜诱导；诱导结束后，在4000rpm的条件下离心20min，获得含有纳米抗体的湿菌。诱导表达后的SDS-PAGE电泳条带如图1所示。

向所得的湿菌中按照1：10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.4，0.02M PB)，使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎；在4℃、10000rpm的条件下离心20min，取上清；将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过亲和层析柱(GE Healthcare，US)进行纳米抗体的分离纯化，其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose High Perfomance。

(4)纯化的纳米抗体的亲和力测定。

将CD45以500～800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以1～100nM范围内的7个不同浓度注射纳米抗体，在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HClpH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数K_a、K_d和K_D。通过方程拟合计算出其动力学参数，得到亲和力最高的序列，记为CD0(SEQ ID NO:32)。CD0(SEQ IDNO:32)的动力学参数为K_a＝1.689×10⁵Ms，K_d＝7.425×10^-51/s，K_D＝7.425×10^-10M。

实施例7亲和力成熟。

基于CD0(SEQ ID NO:32)，在其3个CDR区引入随机密码子，构建新的全合成纳米抗体文库，进行再次筛选，具体方法同上述实施例1-6。

CDR1：

SEQ ID NO:1：GSYSEYAM；SEQ ID NO:2：GSFSEYAM；

SEQ ID NO:3：GSFSSYAM；SEQ ID NO:4：GTFSSYAM；

SEQ ID NO:5：GTFSDYGM；SEQ ID NO:6：GTFSEYAM；

SEQ ID NO:7：GSFSEYAM；:SEQ ID NO:8：RTFSSYGM；

SEQ ID NO:9：GTFSDYGM。

CDR2：

SEQ ID NO:10：NWTGNSV；SEQ ID NO:11：NWTGDSM；

SEQ ID NO:12：SHTGQSV；SEQ ID NO:13：SWNGNSI；

SEQ ID NO:14：NWTGNPI；SEQ ID NO:15：NWQGNSV；

SEQ ID NO:16：TWQGNSV；SEQ ID NO:17：SWSGRST；

SEQ ID NO:18：SWSGNSV。

CDR3：

SEQ ID NO:19：AQSTWDKNDRSEYE；SEQ ID NO:20：ANSTWDKNERSEYE；

SEQ ID NO:21：LNSTWNNNEPSEYE；SEQ ID NO:22：LQTTWNNNEPSEVD；

SEQ ID NO:23：LSTTWKNNDRTEVD；SEQ ID NO:24：ASTNWKNQDPTEYE；

SEQ ID NO:25：AQSNWKNQDPTEYE；SEQ ID NO:26：ASSTWNNNDPTEYD；

SEQ ID NO:27：ASSTWNNNDPTEYE。

获得克隆CD1～CD8，亲和力和动力学参数如表1和图2中所示。图1中曲线从上到下依次为纳米抗体在100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM浓度下的响应曲线。图1上排从左到右依次为CD0、CD1、CD2，中排从左到右依次为CD3、CD4、CD5，下派从左到右依次为CD6、CD7、CD8。

表1抗CD45纳米抗体的动力学参数

SEQ ID NO:32

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-GSYSEYAM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-NWTGNSV-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-AQSTWDKNDRSEYE-YWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:33

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-GSFSEYAM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-NWTGDSM-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-ANSTWDKNERSEYE-YWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:34

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-GSFSSYAM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-SHTGQSV-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-LNSTWNNNEPSEYE-YWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:35

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-GTFSSYAM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-SWNGNSI-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-LQTTWNNNEPSEVD-YWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:36

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-GTFSDYGM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-NWTGNPI-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-LSTTWKNNDRTEVD-YWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:37

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-GTFSEYAM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-NWQGNSV-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-ASTNWKNQDPTEYE-YWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:38

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-GSFSEYAM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-TWQGNSV-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-AQSNWKNQDPTEYE-YWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:39

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-RTFSSYGM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-SWSGRST-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-ASSTWNNNDPTEYD-YWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:40

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-GTFSDYGM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-SWSGNSV-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-ASSTWNNNDPTEYE-YWGQGTLVTVSS

实施例8纳米抗体改造。

可以通过基因工程改造、翻译后修饰以及蛋白质工程等技术，在纳米抗体或多价纳米抗体的N-端、C-端分别或同时增加一个或多个氨基酸标签(如组氨酸标签、生物素连接酶标签、HA标签、sumo标签、GST标签、巯基标签、聚赖氨酸标签、凝血酶标签、肠激酶标签等)，必要时可以在氨基酸标签上增加氨基酸接头，以实现纳米抗体高效表达、修饰、纯化、功能化等目的，而不影响纳米抗体的抗原结合能力。

本实施例中，为了实现纳米抗体定向固载，设计纳米抗体CD4(SEQ ID No:36)C-端加入一个Cys，如CD9(SEQ ID No:41)所示，所以CD9既可以仍算作纳米抗体，也可以算作“包含纳米抗体的多肽”。

SEQ ID No:41

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-GTFSDYGM-GWFRQAPGKGLEAVAAI-NWTGNPI-YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA-LSTTWKNNDRTEVD-YWGQGTLVTVSSC

人工合成上述纳米抗体的DNA序列，并将DNA片段连接到pET23a载体上，构建质粒，并转化进入大肠杆菌，得到改造后的纳米抗体工程菌。随后进行改造纳米抗体的表达与纯化：

(1)基础培养基为TB培养基，按照5％接种量接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)进行过夜诱导；

(2)诱导结束后，在4000rpm条件下离心20min，获得含有目的序列的湿菌。

(3)向所得的湿菌中按照1：10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mMNaCl,pH7.40.02M PB)，使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎；

(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min，取上清；

(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过亲和层析柱(GE Healthcare，US)进行分离纯化，其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose High Perfomance；

(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳判断纯度，选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。

应用SPR技术分析改造纳米抗体对AAV的结合能力。

将CD45以500-800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以1-50nM范围内(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、1.5625nM)的5个不同浓度注射纳米抗体，在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HClpH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD。结果表明，与原序列A4-017相比，改造后的纳米抗体与抗原CD45的亲和力基本维持不变。

C.吸附剂制备及效果评价

本发明的吸附剂为偶联了上述纳米抗体的微球，利用抗体对白细胞表面的CD45的特异性吸附作用，达到吸附白细胞的目的。

上述微球材质、尺寸不限，只要能提供可供纳米抗体偶联的表面即可。本发明中举例硅球、树脂球和琼脂糖微球，但不限于此。

实施例9硅球吸附剂制备。

(1)微球活化

分别取0.5g硅球(9μm与4μm)，将其置于105℃烘箱干燥处理6h。将干燥后的硅球投入10mL含有5％三乙氧基缩水甘油醚硅烷的乙醇溶液中，并向其中加入0.15mL的三乙胺促进反应。37℃反应24h后用大量纯化水清洗。最后用20mL纯水分散，4℃保存在纯水中待用。待微球完全沉淀后，取少量上清，然后将微球充分混匀，取1mL含有微球的混合液，分别测定两者中环氧的含量。结果显示上清中几乎没有环氧，而微球上由明显环氧出现，浓度理论计算约0.8-0.9mmol/g。

(2)纳米抗体偶联

将0.5g上述微球与CD4(SEQ ID No:36)37℃孵育24h，其中孵育时的溶液条件为0.6mol/L硫酸钠，在0.1mol/L碳酸氢钠，pH 9.5。反应结束后，用大量纯化水对微球进行清洗，清洗结束后，将其用5mL生理盐水重悬。取适量微球进行BCA检测微球上蛋白偶联量。将微球离心去上请，用5mL含有1％BSA以及4mmol半胱氨酸的封闭液对微球上剩余环氧进行室温封闭3h摇床摇匀，其中，优选封闭液的成分为0.6mol/L硫酸钠，在0.1mol/L碳酸氢钠，pH9.5。用纯化水进行清洗，并最终用生理盐水配制浓度约0.1g/mL的微球悬液。硅球吸附剂的抗体偶连量：7.5mg/g。记为吸附剂A。

实施例10树脂球吸附剂制备。

(1)微球活化

取100mL 6％的树脂微球(PMMA)，用十倍体积(1L)的纯化水清洗微球。将多余的水除去，树脂微球抽滤成湿饼备用。在树脂微球中加入100mL 0.6mol/L氢氧化钠溶液，搅拌混合均匀。缓慢加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚100mL。室温下(20～25℃)，搅拌反应8～10h。反应结束后，使用大量纯化水清洗微球。

(2)纳米抗体偶联

将0.5g上述微球与CD4(SEQ ID No:36)37℃孵育24h，其中孵育时的溶液条件为0.6mol/L硫酸钠，在0.1mol/L碳酸氢钠，pH 9.5。反应结束后，用大量纯化水对微球进行清洗，清洗结束后，将其用5mL生理盐水重悬。取适量微球进行BCA检测微球上蛋白偶联量。用纯化水进行清洗，并最终用生理盐水配制浓度约0.1g/mL的微球悬液。树脂球吸附剂的抗体偶连量：4.3mg/g，记为吸附剂B。

实施例11琼脂糖吸附剂制备。

a.双环氧法

(1)微球活化

取100mL 6％的琼脂糖凝胶微球，用十倍体积(1L)的纯化水清洗微球。将多余的水除去，琼脂糖凝胶微球抽滤成湿饼备用。在琼脂糖凝胶微球中加入100mL含有100mg硼氢化钠的0.6mol/L氢氧化钠溶液，搅拌混合均匀。缓慢加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚100mL。室温下(20～25℃)，搅拌反应8～10h。应结束后，使用大量纯化水清洗微球。

(2)纳米抗体偶联

将CD4(SEQ ID No:36)溶解于含有0.5mol/L硫酸钠的0.1mol/L磷酸钠溶液中，pH7.5。纳米抗体浓度3～5mg/mL。取10mL环氧活化琼脂糖凝胶微球，加入纳米抗体溶液，纳米抗体终浓度为10～20mg/mL微球。室温下(20～25℃)搅拌反应24～48h。反应结束后，使用大量纯化水清洗微球。使用BCA方法检测琼脂糖凝胶微球上纳米抗体的偶联量为11.2mg/g。记为吸附剂C。

b.环氧氯丙烷法

(1)微球活化

取100mL 6％的琼脂糖凝胶微球，用十倍体积(1L)的纯化水清洗微球。将多余的水除去，琼脂糖凝胶微球抽滤成湿饼备用。在琼脂糖凝胶微球中依次加入150mL含有100mg硼氢化钠的2mol/L氢氧化钠溶液，300mL二甲基亚砜搅拌混合均匀。加入环氧氯丙烷20mL。室温下(20～25℃)，搅拌反应8～10h。反应结束后，依次使用30％、70％、100％、70％、30％的丙酮水溶液对微球进行清洗，然后使用大量纯化水清洗微球。

(2)纳米抗体偶联

将CD4(SEQ ID No:36)溶解于含有0.5mol/L硫酸钠的0.1mol/L磷酸钠溶液中，pH7.5。纳米抗体浓度3～5mg/mL。取10mL环氧活化琼脂糖凝胶微球，加入纳米抗体溶液，纳米抗体终浓度为10～20mg/mL微球。室温下(20～25℃)搅拌反应24～48h。反应结束后，使用大量纯化水清洗微球。使用BCA方法检测琼脂糖凝胶微球上纳米抗体的偶联量为7.4mg/g。记为吸附剂D。

c.碘乙酸法

(1)微球活化

首先进行环氧活化。取100mL 6％的琼脂糖凝胶微球，用十倍体积(1L)的纯化水清洗微球。将多余的水除去，琼脂糖凝胶微球抽滤成湿饼备用。在琼脂糖凝胶微球中依次加入150mL含有100mg硼氢化钠的2mol/L氢氧化钠溶液，300mL二甲基亚砜搅拌混合均匀。加入环氧氯丙烷20mL。室温下(20～25℃)，搅拌反应8～10h。反应结束后，过滤掉多余的反应液，依次使用30％、70％、100％、70％、30％的丙酮水溶液对微球进行清洗，然后使用大量纯化水清洗微球。再进行氨基活化。取环氧活化琼脂糖凝胶微球50mL，加入50mL的0.1mol/L碳酸钠溶液，搅拌混合均匀。加入10mL的1,6-二氨基己烷(DAH)；30℃，250rpm，反应24h；反应结束后，过滤掉多余的反应液，依次用1mol/L的NaCl溶液、大量纯化水清洗微球。最后进行碘乙酸活化。在100mL的0.1mol/L MES缓冲液中溶解12g碘乙酸(0.645M)，调节pH至4.7，避光，防止碘乙酸降解。将10mL氨基活化凝胶微球加入至碘乙酸溶液中，搅拌。一边搅拌，一边慢慢加入10g EDC至溶解。室温下搅拌反应12h，注意避光反应。反应结束后，过滤掉多余的反应液，依次用1mol/L的NaCl溶液、大量纯化水清洗微球。

(2)纳米抗体偶联

用水清洗10mL的碘乙酸活化的琼脂糖，然后将琼脂糖置于偶联缓冲液中，注意避光。偶联缓冲液：50mM Tris，0.15MNaCl，10mM EDTA，pH 8.5。将CD9(SEQ ID No:41)溶解于10mL偶联缓冲液中，浓度为5～10mg/mL微球。将配基溶液加入至碘乙酸琼脂糖中，混合均匀。室温下搅拌反应1h，或4℃下搅拌反应2～4h。反应结束后，过滤掉多余的反应液，依次用偶联缓冲液、大量纯化水清洗微球。使用BCA方法检测琼脂糖凝胶微球上纳米抗体的偶联量为8.2mg/mL。记为吸附剂E。

实施例11吸附剂特异性去除白细胞

本发明的吸附剂吸附过程如图3所示。

(1)吸附剂去除白细胞

1.将人外周血淋巴细胞分离液放置4℃冰箱中充分预冷；

2.取人白细胞系(Jauket)细胞，使用血细胞计数板进行计数，并用PBS调整其密度至4×10⁶个/mL，并记录该密度为初始细胞密度(C₀)；

3.取0.1mL白细胞悬液，分别将其与0.1mL浓度为0.1g/mL吸附剂(A、B、C、D、E)充分混合，室温孵育5min；

4.使用巴氏吸管充分重悬并吸取上述混合溶液，小心地平铺在0.5mL人外周血淋巴细胞分离液液面上方，期间需保持两液面清晰，室温静置5min；

5.小心吸取人外周血淋巴细胞分离液上方界面层细胞到洁净管中，为避免细胞损失，吸取液体体积可大于初始投入量，同时记录回收体积(V)；

6.对回收的白细胞再次进行计数，并记录该密度为回收细胞密度(C₁)；

7.计算回收率和白细胞去除率。

细胞回收率按照下述公式进行计算：

细胞回收率＝(C₁×V)÷(C₀×0.1)×100％

差减法计算白细胞去除率。最终白细胞去除率为：硅球吸附剂A的白细胞去除率为97.78％；树脂球吸附剂B的白细胞去除率为96.35％；琼脂糖吸附剂C的白细胞去除率为96.09％；琼脂糖吸附剂D的白细胞去除率为97.08％；琼脂糖吸附剂E的白细胞去除率为97.98％。

可以看出，使用本发明的纳米抗体所制备的吸附剂，对白细胞的去除效果均可达到96％以上。

(2)吸附剂对癌细胞的吸附效果评价

1.将人外周血淋巴细胞分离液放置4℃冰箱中充分预冷；

2.取MCF-7细胞，使用血细胞计数板进行计数，并用PBS调整其密度至4×10⁶个/mL，并记录该密度为初始细胞密度(C₀)；

3.取0.1mL MCF-7细胞，分别将其与0.1mL浓度为0.1g/mL吸附剂(A、B、C、D、E)充分混合，室温孵育5min；

7.计算回收率和白细胞去除率。

细胞回收率计算方法如本实施例中所述，差减法计算癌细胞去除率。

最终癌细胞去除率为：硅球吸附剂A的癌细胞去除率为1.75％；树脂球吸附剂B的白细胞去除率为2.00％；琼脂糖吸附剂C的白细胞去除率为2.55％；琼脂糖吸附剂D的白细胞去除率为1.80％；琼脂糖吸附剂E的白细胞去除率为1.65％。

可以看出，使用本发明的纳米抗体所制备的吸附剂，对同等数目下的癌细胞的去除效果均低于3％，但对白细胞的去除率可以达到96％以上，说明本发明制备的吸附剂特异性吸附白细胞而几乎不造成癌细胞的损失，可用于生物样品中白细胞的去除。

实施例12混合样品中吸附剂的效果评价

1.将人外周血淋巴细胞分离液放置4℃冰箱中充分预冷；

2.取MCF-7细胞，使用血细胞计数板进行计数，并用PBS调整其密度至4×10⁶个/mL，并记录该密度为初始细胞密度(C₁₀)，取Jauket细胞，使用血细胞计数板进行计数，并用PBS调整其密度至4×10⁶个/mL，并记录该密度为初始细胞密度(C₂₀)；

3.取0.05mLJauket细胞悬液，与0.05mLMCF-7细胞悬液，以及0.1mL浓度为0.1g/mL修饰有抗白细胞抗体的琼脂糖微球充分混合，室温孵育5min；

6.对回收的细胞再次进行计数，并记录该密度为回收细胞密度(C_t)；

7.再将回收获得的细胞滴加到表面固载由聚赖氨酸的玻璃片上，静置30min；

8.吸去细胞上液体；

9.使用0.5mL4％的多聚甲醛固定液进行固定，室温30min；

10.吸去多聚甲醛固定液，并用PBS清洗，清洗3次；

11.加入0.1mL0.1％的Trion-100，室温孵育10min，然后用1mLPBS进行清洗，清洗3次；

12.加入0.25mL修饰有FITC的广谱性抗人角蛋白抗体，室温孵育1h；

13.吸去抗体，用1mLPBS进行清洗，清洗3次；

14.用0.5mLDAPI工作液进行染色，室温15min，吸弃DAPI工作液，用PBS清洗后在荧光显微镜下依次在白场中以及荧光场中观察，记录细胞总数(N)以及被染上荧光细胞数(n)；

15.计算回收率。其中，白细胞和癌细胞回收率分别按照下述公式进行计算：

白细胞回收率＝(C_t×V×(1-n/N))÷(C₂₀×0.05)×100％

MCF7细胞回收率＝(C_t×V×n/N)÷(C₁₀×0.05)×100％

经计算可知，使用琼脂糖吸附剂E可以实现在混合样本中回收97.21％的MCF-7细胞，同时白细胞的回收率为1.22％。即，在同等数目的混合样本中，本发明的吸附剂对白细胞去除率为98.78％，而癌细胞的去除率仅为2.79％。这与在单一细胞中实验结果类似，说明本发明的吸附剂不受癌细胞干扰，特异性吸附白细胞。

实施例13血液样品中吸附剂的效果评价1

1.用抗凝血采集管收集4mL志愿者外周血样本，于4℃环境保存；

2.加入12mL红细胞裂解液并充分混匀，置于冰上孵育15min，期间缓慢颠倒采集管；

3.将采集管放置于离心机中，4℃，450×g，离心10min；

4.弃去上清液，并用4mLPBS对其进行重悬，同时使用血细胞计数板进行计数，并记录该密度为初始细胞密度(C₂₀)，然后离心(4℃，450×g，10min)弃去上清于4℃环境保存备用；

5.取MCF-7细胞，使用血细胞计数板进行计数，并用PBS调整其密度至4×10⁶个/mL，并记录该密度为初始细胞密度(C₁₀)

6.使用4mLMCF-7细胞悬液对备用细胞进行重悬，并再次离心(4℃，450×g，10min)；

7.使用12mL含有浓度为0.1g/mL修饰有抗白细胞抗体的琼脂糖微球充分混合，室温孵育5min；

8.将人外周血淋巴细胞分离液放置4℃冰箱中充分预冷；

9.使用巴氏吸管充分重悬并吸取上述混合溶液，小心地平铺在12mL人外周血淋巴细胞分离液液面上方，期间需保持两液面清晰，室温静置5min；

10.小心吸取人外周血淋巴细胞分离液上方界面层细胞到洁净管中，为避免细胞损失，吸取液体体积可大于初始投入量，同时记录回收体积(V)；

11.对回收的细胞再次进行计数，并记录该密度为回收细胞密度(C_t)；

12.再将回收获得的细胞滴加到表面固载由聚赖氨酸的玻璃片上，静置30min；

13.吸去细胞上液体；

14.使用0.5mL4％的多聚甲醛固定液进行固定，室温30min；

15.吸去多聚甲醛固定液，并用PBS清洗，清洗3次；

16.加入0.1mL0.1％的Trion-100，室温孵育10min，然后用1mLPBS进行清洗，清洗3次；

17.加入0.25mL修饰有FITC的广谱性抗人角蛋白抗体，室温孵育1h；

18.吸去抗体，用1mLPBS进行清洗，清洗3次；

19.用0.5mLDAPI工作液进行染色，室温15min，吸弃DAPI工作液，用PBS清洗后在荧光显微镜下依次在白场中以及荧光场中观察，记录细胞总数(N)以及被染上荧光细胞数(n)；

20.计算回收率。其中，白细胞和癌细胞回收率分别按照下述公式进行计算：

白细胞回收率＝(C_t×V×(1-n/N))÷(C₂₀×4)×100％

MCF7细胞回收率＝(C_t×V×n/N)÷(C₁₀×4)×100％

经计算可知，使用琼脂糖吸附剂E可以实现在血液样本中回收97.56％的MCF-7细胞，同时白细胞的回收率为1.31％。即，混入大量癌细胞的血液样本中，本发明的吸附剂对白细胞去除率为98.69％，而癌细胞的去除率仅为2.44％。这与上述实验结果一致，说明本发明的吸附剂不受血液中其他成分干扰，特异性吸附白细胞。

实施例14血液样品中吸附剂的效果评价2

(1)红细胞裂解

优选地，可以在血液样品处理过程中，加入红细胞裂解液进行红细胞裂解，避免大量红细胞对吸附剂的干扰。其他实验过程与实施例13相同，计算方法也相同。可以观察到排除了红细胞的干扰，血液样品的处理过程中更容易观察到清晰的吸附剂下沉现象和液面分层现象。

最后计算该方法使用琼脂糖吸附剂E可以实现在血液样本中回收98.95％的MCF-7细胞，同时白细胞的回收率为1.08％。即，混入大量癌细胞的血液样本中，本发明的吸附剂对白细胞去除率为98.92％，而癌细胞的去除率仅为1.05％。这与上述实验结果一致，说明本发明的吸附剂不受血液中其他成分干扰，特异性吸附白细胞。

(2)离心

优选地，还可以在加入细胞分离液后，进行离心操作，缩短微球沉降时间。4℃，450×g，离心1min的沉降效果即可与自然沉降5分钟效果相同。

实施例15稀有细胞检测，可以理解的是可以使用流式细胞仪、抗体芯片等对分离出来的稀有细胞进行检测，在本实施例中使用花粉芯片检测CTCs

(1)花粉芯片的制备过程同发明专利(专利号ZL201910284121.6)中所述。

(2)将实施例13中收集到的CTCs与血液混合物(已经过吸附剂去除白细胞)滴加于花粉芯片上，按照发明专利(专利号ZL201910284121.6)所述流程进行操作，具体步骤简述如下：

将去除白细胞的剩余液体反复颠倒摇匀；用1％的BSA溶液浸泡细胞捕获芯片1h；吸去芯片上的BSA溶液，并用PBS清洗一次。

将去除白细胞的剩余液体滴加到芯片上，并将其于37℃培养90min；吸去芯片上方的液体；用约0.5mL 4％多聚甲醛室温固定15min。

吸去多聚甲醛，用PBS进行清洗；吸去PBS，加入0.5mL浓度为1％的BSA，在室温孵育1h；吸去BSA，加入0.3mL 0.1％Triton X-100室温孵育10min；吸去Triton X-100，用PBS清洗1次。

加入0.25mL抗CK的一抗，37℃孵育1.5h；用PBS对芯片进行一次清洗；加入0.25mL二抗，37℃孵育1.5h；用PBS对芯片进行一次清洗，并于4℃保存。

用0.5mL DAPI染色，室温孵育10min；吸去DAPI，并用PBS对芯片进行一次清洗；加入0.5mL PBS进行观察。

通过目镜观察芯片上符合癌细胞染色特征的细胞(DAPI蓝色+，CK绿色+)，并对其进行计数，统计芯片上癌细胞数目。

花粉芯片上的癌细胞结果如图4所示。

显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的互补决定区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3序列：

(I)：(1)所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，(2)所述CDR2的氨基酸序列如SEQID NO:10所示；以及(3)所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；或

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，其中：(II)的如(I)的(1)、(2)、(3)所述氨基酸序列经取代一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，包括

3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，其中：(III)的与(I)的(1)所述氨基酸序列具有62.5％以上同源性的氨基酸序列，与(I)的(2)所述氨基酸序列具有37.5％以上同源性的氨基酸序列，与(I)的(3)所述氨基酸序列具有42.86％以上同源性的氨基酸序列，包括

(III-1)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；或

(III-2)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；或

(III-3)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；或

(III-4)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，CDR3的氨基酸序列如是SEQ ID NO:23所示；或

(III-5)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或

(III-6)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或

(III-7)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；或

(III-8)：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。

4.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，其中：

(IV)所述纳米抗体的框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4序列，其中：(1)所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，(2)所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，(3)所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，(4)所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；或

5.根据权利要求1-4任一项所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有

(VI)如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；或

6.根据权利要求5所述的纳米抗体，其特征在于，其中，(VII)或(VIII)的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示：或

如SEQ ID NO:34所示；或

如SEQ ID NO:35所示；或

如SEQ ID NO:36所示；或

如SEQ ID NO:37所示；或

如SEQ ID NO:38所示；或

如SEQ ID NO:39所示；或

如SEQ ID NO:40所示；或

如SEQ ID NO:41所示。

7.一种多肽，其特征在于，包括权利要求1～6中任一项所述纳米抗体。

8.根据权利要求7所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:41所示。

9.一种编码权利要求1～6中任一项所述纳米抗体的核酸分子。

10.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求9所述的核酸分子。

11.一种转化或转染权利要求10所述的表达载体的宿主细胞。

12.一种结合物或偶联物，其特征在于，包括经化学标记或生物标记的权利要求1～6中任一项所述的纳米抗体。

13.一种吸附剂，其特征在于，包括权利要求1～6中任一项所述的纳米抗体、权利要求7～8中任一项所述多肽、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求12所述的结合物和/或权利要求12所述的偶联物，以及载体。

14.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～6中任一项所述的纳米抗体、权利要求7～8中任一项所述多肽、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求12所述的结合物和/或权利要求12所述的偶联物，以及检测中可接受的助剂。

15.一种设备，其特征在于，用于吸附并分离白细胞，包括权利要求1～6中任一项所述的纳米抗体、权利要求7～8中任一项所述多肽、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求12所述的结合物、权利要求12所述的偶联物、权利要求13所述的吸附剂和/或权利要求14所述的试剂盒。

16.一种稀有细胞富集方法，包括

使用吸附剂吸附白细胞；

通过细胞分离液使稀有细胞与吸附白细胞的吸附剂分离，使所述稀有细胞富集；

其中，所述吸附剂为权利要求13所述的吸附剂。

17.一种稀有细胞检测方法，其特征在于，使用权利要求16所述方法使所述稀有细胞富集，使用检测试剂检测稀有细胞。

18.权利要求1～6中任一项所述的纳米抗体；或

权利要求7～8中任一项所述多肽；或

权利要求9所述的核酸分子；或

权利要求10所述的表达载体；或

权利要求11所述的宿主细胞；或

权利要求12所述的结合物；或

权利要求12所述的偶联物；或

权利要求13所述的吸附剂；或

权利要求14所述的试剂盒

在特异性吸附CD45或白细胞中的应用；或

在免疫检测中的应用；或

在血液净化中的应用；或

在富集和/或纯化细胞中的应用；或

在制备检测肿瘤疾病的制剂中的用途；或

在检测肿瘤疾病的设备中的用途。