CN111410692B - 一种纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用，其中，该纳米抗体的氨基酸序列包含特殊结构的互补决定区和框架区。本发明的纳米抗体，是通过噬菌体库筛选发现的具有新的氨基酸序列的抗β2微球蛋白纳米抗体，该纳米抗体及其多肽具有很高的亲和力和活性，能够特异性地识别并结合β2微球蛋白，基于该纳米抗体的吸附剂对β2微球蛋白的吸附能力极强，可应用于血液净化及β2微球蛋白检测领域，有助于促进和改善对透析相关淀粉样变等疾病的诊断和治疗。

Description

一种纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可以特异性地识别并结合β2微球蛋白的纳米抗体，以及包括由一种或多种所述纳米抗体组成的多肽。本发明还涉及编码所述氨基酸序列和多肽的核酸；涉及表达或能够表达所述氨基酸序列和多肽的宿主或宿主细胞；并且涉及所述氨基酸序列和多肽的应用，特别是在预防、治疗或诊断目的的β2微球蛋白吸附剂上的应用。
背景技术
β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2M)是存在于有核细胞表面的人类淋巴细胞抗原(HLA)的轻链部分，分子量为11.8kDa，在代谢过程中与重链分离，广泛存在于血液、尿液、脑脊液以及唾液中。正常人体内的β2微球蛋白血清质量浓度相对稳定，一般为1.5-3mg/L(参见非专利文献1)。β2微球蛋白的代谢仅依赖肾脏，在晚期肾病病人的血清中其质量浓度可以达到20-50mg/L，甚至高达100mg/L。
β2微球蛋白在体内的浓度增高并沉积会导致透析相关淀粉样变，具体临床表现为腕管综合征、淀粉样骨关节病、破坏性脊柱关节病、囊性骨损害、内脏淀粉样物质沉积，甚至引起死亡。其发病机制尚不明确，但高浓度的β2微球蛋白是引起淀粉样变的必要条件。因此，利用血液净化的方式去除过量的β2微球蛋白对于预防透析相关淀粉样变等疾病的发生具有重要意义。
针对透析相关淀粉样变的治疗方法主要有两种：一种是通过外科手术，如腕管椎板切除术和颈椎椎板切除术，切除受损组织解除疼痛；另一种是采用血液净化的方式直接吸附去除患者血液中的β2微球蛋白。
血液净化是一种干预血液组分的有效手段，可用于清除血液中的有毒或致病物质。临床常用的去除β2微球蛋白的血液净化方法有透析和全血灌流。由于透析膜的孔径限制，普通血液透析的方法对β2微球蛋白的去除量十分有限，甚至会引起患者体内β2微球蛋白水平升高(参见非专利文献2)。血液灌流是通过将患者的血液引出体外并经过装有吸附剂的血液灌流器，达到去除血液中β2微球蛋白的目的。目前，已经商品化的β2微球蛋白吸附剂均使用疏水性配基(参见非专利文献3)。这类疏水性配基吸附剂常造成血液中其他疏水性中小分子的损失，对患者具有一定程度的副作用。
以特异性抗体为配基的亲和吸附剂可以避免上述缺点，在血液灌流领域具有良好的治疗作用和应用前景。特异性抗体可以是IgG(参见非专利文献4)，然而单克隆抗体制备成本很高，仅限于实验室研究。更小的抗体片段——单链可变区(ScFv)也被用于亲和配基(参见非专利文献5)，然而ScFv暴露了表面疏水基团，存在非特异吸附增加、易凝结和黏附等缺点，也处于研究阶段，尚没有商品化的产品。
骆驼体内存在一种天然缺失轻链的功能性重链抗体(Heavy chain antibody,HCAb)，克隆该重链抗体可变区得到最小的抗原结合片段，即重链可变区(Variabledomains of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)，也称为纳米抗体。纳米抗体的最大优势在于体积小，分子量仅为15kDa，约为传统抗体(150kDa)的十分之一，也远小于单链抗体(55kDa)。更小的分子质量有利于实现纳米抗体在基质表面的高密度定向固载，提高血液净化吸附剂的吸附性能。
大连理工大学首次将基于纳米抗体的免疫吸附材料应用于血液净化领域，开发了针对肾衰患者体内β2微球蛋白的特异性血液净化吸附剂(参见专利文献1)。但其所使用的β2微球蛋白纳米抗体亲和力较低，导致对β2微球蛋白的吸附效率较低，不能满足患者实际需求。
因此本发明的β2微球蛋白吸附剂以高特异性的抗人β2微球蛋白的纳米抗体为配基，将实现纳米抗体在β2微球蛋白的血液净化治疗方面的应用。
非专利文献1：Tilman B,et.al,Massy beta2-microglobulin progress inuremic toxin research，Seminars in dialysis 200922,4,378-380
非专利文献2：Ameer G,A modalities for the removal of beta-2-microgobulin from blood,Semin Dial 2001.14:103-6.
非专利文献3：Furuyoshi S,et.al,New adsorption column(lixulle)toeliminate beta-2-microgobulin for direct hemoperfusion,Ther Apher.1998.2:13-7
非专利文献4：Mogi M,et.al,Selective removal of beta-2-microglobulinfrom human plasma by high-performance immunoaffinity chromatography,JChromatogr B Biomed Sci Appl.1989496:194-200
非专利文献5：Ameer G,A novel immunoadsorption device for removingbeta-2-microglobulin from whole blood,Kidney International,200159:1544-1550
专利文献1：CN201410342951A
发明内容
本发明是基于解决现有的技术问题而完成的，其目的在于，提供具有特定结构的氨基酸序列的纳米抗体、具有该纳米抗体的多肽、编码该纳米抗体和/或多肽的核酸以及能够表达该纳米抗体和/或多肽的宿主或宿主细胞，以及该纳米抗体和/或多肽在制备β2微球蛋白吸附剂上的应用。
本发明的第1方面，涉及一种纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列包括互补决定区CDR和框架区FR，
上述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，其中，
上述互补决定区CDR1为下述式(I)：
Ser-Gly-Xaa11-Gly-Phe-Ser-Xaa12-Xaa13-Lys-Tyr-Cys式(I)(SEQ ID No:1)，
上述互补决定区CDR2为下述式(II)：
Ile-Asn-Gly-Xaa21-Xaa22-Lys-Asp-Ile-Xaa23式(II)(SEQ ID No:2)，
上述互补决定区CDR3为下述式(III)：
Ala-Thr-Asn-Xaa31-Pro-Val-Arg-Cys-Arg-Asp-Ile-Val-Ala-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Tyr-Arg-Phe式(III)(SEQ ID No:3)，
其中，
Xaa11独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly；和/或，
Xaa12独立地选自Asn、Gln、Asp、Glu和His；和/或，
Xaa13独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly；和/或，
Xaa21独立地选自Gly、Ala、Ser、Thr和Pro；和/或，
Xaa22独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly；和/或，
Xaa23独立地选自Thr、Ser、Ala、Pro和Gly；和/或，
Xaa31独立地选自Ile、Val、Met、Leu和Cys。
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11独立地选自Ser和Thr；和/或，上述式(I)中，上述Xaa12独立地选自Asn和Gln；和/或，上述式(I)中，上述Xaa13独立地选自Ser和Thr；和/或，上述式(II)中，上述Xaa21独立地选自Gly和Ala；和/或，上述式(II)中，上述Xaa22独立地选自Ser和Thr；和/或，上述式(II)中，上述Xaa23独立地选自Thr和Ser；和/或，上述式(III)中，上述Xaa31独立地选自Ile和Val。
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11独立地选自Ser和Thr，上述Xaa12独立地选自Asn和Gln，上述Xaa13独立地选自Ser和Thr；和，上述式(II)中，上述Xaa21独立地选自Gly和Ala，上述Xaa22独立地选自Ser和Thr，上述Xaa23独立地选自Thr和Ser；和，上述式(III)中，上述Xaa31独立地选自Ile和Val。
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ser，上述Xaa12为Asn，上述Xaa13为Ser；上述式(II)中，上述Xaa21为Gly，上述Xaa22为Ser，上述Xaa23为Thr；上述式(III)中，上述Xaa31为Ile。
对于一些优选的方式，上述框架区FR包括框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4，其中，上述框架区FR1为下述式(IV)：
Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ile-Ala式(IV)(SEQ ID No:4)
上述框架区FR2为下述式(V)：
Met-Ser-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Trp-Val-Ser-Arg-Gly式(V)(SEQ ID No:5)
上述框架区FR3为下述式(VI)：
Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Phe-Ser-Gln-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Glu-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Cys式(VI)(SEQ ID No:6)
上述框架区FR4为下述式(VII)：
Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser式(VII)(SEQ ID No:7)，或者，
上述框架区FR1为下述式(VIII)：
Glu-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ile-Ala式(VIII)(SEQ ID No:8)
上述框架区FR2为下述式(IX)：
Met-Ser-Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Arg-Gly式(IX)(SEQ ID No:9)
上述框架区FR3为下述式(X)：
Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Cys式(X)(SEQ ID No:10)
上述框架区FR4为下述式(XI)：
Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser式(XI)(SEQ ID No:11)。
对于一些优选的方式，上述纳米抗体的氨基酸序列如下：
Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ile-Ala-Ser-Gly-Xaa11-Gly-Phe-Ser-Xaa12-Xaa13-Lys-Tyr-Cys-Met-Ser-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Trp-Val-Ser-Arg-Gly-Ile-Asn-Gly-Xaa21-Xaa22-Lys-Asp-Ile-Xaa23-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Phe-Ser-Gln-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Glu-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Thr-Asn-Xaa31-Pro-Val-Arg-Cys-Arg-Asp-Ile-Val-Ala-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Tyr-Arg-Phe-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser式(XII)(SEQ ID No:12)，其中，
所述Xaa11独立地选自Ser和Thr；和/或，
上述Xaa12独立地选自Asn和Gln；和/或，
上述Xaa13独立地选自Ser和Thr；和/或，
上述Xaa21独立地选自Gly和Ala；和/或，
上述Xaa22独立地选自Ser和Thr；和/或，
上述Xaa23独立地选自Thr和Ser；和/或，
上述Xaa31独立地选自Ile和Val。
作为具体的氨基酸序列的例子，可以列举如下情形的序列：
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Ser、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Thr、Xaa12为Asn、Xaa13为Ser、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Ser、Xaa21为Ala、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Ser、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Val；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Thr、Xaa12为Gln、Xaa13为Ser、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Thr、Xaa21为Ala、Xaa22为Thr、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Thr、Xaa12为Gln、Xaa13为Ser、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Thr、Xaa21为Ala、Xaa22为Thr、Xaa23为Ser、Xaa31为Ile。
本发明的第2方面，提供一种多肽，其基本上由上述1～7记载的纳米抗体组成，
可选地，上述多肽是多价多肽；
可选地，上述多价多肽是二价或三价的多肽；
可选地，上述二价或三价的多肽是特异性多肽；
可选地，上述二价多肽的氨基酸序列为SEQ ID No:14或SEQ ID No:15；
可选地，上述特异性多肽的氨基酸序列为SEQ ID No:16或SEQ ID No:17；
本发明的第3方面，提供一种核酸，其是通过编码上述记载的纳米抗体和/或上述记载的多肽而成的。
本发明的第4方面，提供一种宿主或宿主细胞，其能够表达上述的纳米抗体和/或上述的多肽。
本发明的第5方面，提供一种吸附剂，其包括载体基质和上述的纳米抗体或上述的多肽。
本发明的第6方面，提供一种上述的纳米抗体和/或上述的多肽在制备β2微球蛋白吸附剂上的应用。
本发明的第7方面，提供一种上述的纳米抗体和/或上述的多肽在免疫检测、富集和/或纯化等中的应用。
有益的效果
本发明的纳米抗体，是通过噬菌体库筛选发现的具有新的氨基酸序列的抗β2微球蛋白纳米抗体，因此该纳米抗体及其多肽具有很高的亲和力和活性，能够特异性地识别并结合β2微球蛋白，吸附剂对β2微球蛋白的吸附能力极强，可应用于血液净化及β2微球蛋白检测领域，有助于促进和改善对透析相关淀粉样变等疾病的诊断和治疗。
附图说明
图1是纯化后的纳米抗体CNb1；
图2是纯化后的二价多肽bvCNb1、hbv CNb1、bsCNb1和bfCNb1；
图3是纳米抗体CNb1动力学传感图；
图4是本发明的纳米抗体(CNb111、CNb121、CNb131、CNb112、CNb122、CNb113、CNb123)的动力学传感图；
图5是人源化纳米抗体hCNb1的动力学传感图。
具体实施方式
本发明的上述内容及其他方面将通过下文进一步描述清楚，其中：
(1)除非指明或者另外定义，使用的所有术语具有在本领域中的通用意义，为本领域技术人员所共知。例如，可以参见标准手册，如Sambrook著Molecular Cloning：ALaboratory Manual[(《分子克隆：实验手册》),第二版，卷1～3，Cold Spring HarborLaboratory Press(冷泉港实验室出版)，1989]；F.Ausubel著Current Protocols inMolecular Biology[(《现代分子生物学方法》)，Green Publishing and WileyInterscience，1987]；Roitt著Immunology[《免疫学(第六版)》)Mosby/Elisevier，2001]，以及上文所引用的综合背景技术。
(2)除非另外指明，术语“序列”用于本文时(如在类似“抗体序列”“可变区序列”“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包括相关氨基酸序列及编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更狭义的解释。
(3)除非另外指明，所有没有具体描述的方法、步骤、技术和操作为已知的并如本领域技术人员所熟知的。例如，参考仍旧参照上文所引用的综合背景技术以及其中所引用的其他参考文献。
(4)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示。
(5)术语“特异性”是指特定的抗原结合分子(如本发明的纳米抗体或多肽)可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的能力。一种抗原结合分子的特异性可以根据其亲和力和/或活性而确定。亲和力表示为抗原与抗原结合分子的解离平衡常数(KD)，是抗原与抗原结合分子之间的结合强度的测量，KD值越小，抗原和抗原结合分子之间的结合强度越强，反之，KD值越大，抗原和抗原结合分子之间的结合强度越弱。Ka表示结合常数，Ka越大，表明结合越快，Ka越小，表明结合越慢；Kd表示解离常数，Kd越大，解离越快，Kd越小，解离越慢；并且KD＝Kd/Ka。
(6)单域抗体的氨基酸残基按照Kabat等“Sequence of proteins ofimmunological interest[(免疫学目的的蛋白的序列)，US Public Health Services(美国公众健康服务)，Publication No.91]”给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，这种编号方式在Riechmann和Muyldermans的文章中用于来自骆驼科的VHH结构域。按照这种编号方式，单域抗体的FR1包括位置1～30的氨基酸残基，单域抗体的CDR1包括位置31～36的氨基酸残基，单域抗体的FR2包括位置37～49的氨基酸残基，单域抗体的CDR2包括位置50～65的氨基酸残基，单域抗体的FR3包括位置66～94的氨基酸残基，单域抗体的CDR3包括位置95～102的氨基酸残基，单域抗体的FR4包括位置103～113的氨基酸残基。在这一方面，应该注意：如在本领域内关于VH结构域和关于VHH结构域所公知的——每一个CDR中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基总数相对应(即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常按照Kabat的编号方式，实际序列中的氨基酸残基可能与实际编号方式相同或不同。也可以说，按照Kabat的编号方式不考虑CDR的氨基酸残基编号，而是按照Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点，并且反之亦然；按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点；并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置103对应FR4的起点，并且反之亦然。
(7)术语“固载量”是指单位体积亲和介质(吸附剂)所偶联的配基的总量。
本发明的纳米抗体的氨基酸序列基本上包括互补决定区CDR和框架区FR。
上述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，上述框架区FR包括框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4。
上述互补决定区CDR1为下述式(I)：
Ser-Gly-Xaa11-Gly-Phe-Ser-Xaa12-Xaa13-Lys-Tyr-Cys式(I)(SEQ ID No:1)，上述互补决定区CDR2为下述式(II)：
Ile-Asn-Gly-Xaa21-Xaa22-Lys-Asp-Ile-Xaa23式(II)(SEQ ID No:2)，
上述互补决定区CDR3为下述式(III)：
Ala-Thr-Asn-Xaa31-Pro-Val-Arg-Cys-Arg-Asp-Ile-Val-Ala-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Tyr-Arg-Phe式(III)(SEQ ID No:3)，
其中，
Xaa11独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly；和/或，
Xaa12独立地选自Asn、Gln、Asp、Glu和His；和/或，
Xaa13独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly；和/或，
Xaa21独立地选自Gly、Ala、Ser、Thr和Pro；和/或，
Xaa22独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly；和/或，
Xaa23独立地选自Thr、Ser、Ala、Pro和Gly；和/或，
Xaa31独立地选自Ile、Val、Met、Leu和Cys。
其中，氨基酸取代通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基可以被具有相似化学结构的氨基酸取代，也可以被与其不相似化学结构的氨基酸取代，只要对其多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有或基本上没有影响即可。优选为氨基酸残基可以被具有相似化学结构的氨基酸取代。
对于上述的取代方式，例如，可以列举文献WO04/037999，GB2357768A，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300中公开的情形，但并不限于此，此外，还可以列举基于WO04/037999和WO 98/49185中所引用的其他参考文献的相关信息而选择所述取代的(优选)类型和/或结合。
本发明的氨基酸取代，可列举但不限于如下这样的取代方式，即，下列组(a)～(e)内的一个氨基酸被同组内另一个氨基酸取代：(a)Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)Asp、Asn、Glu和Gln；(c)His、Lys和Arg；(d)Met、Leu、Ile、Val和Cys；(e)Phe、Tyr和Trp。
优选的氨基酸取代可列举但不限于如下方式：Ala被取代成Gly或Ser；Arg被取代成Lys；Asn被取代成Gln或His；Asp被取代成Glu；Cys被取代成Ser或Thr；Gln被取代成Asn；Glu被取代成Asp；Gly被取代成Ala或Pro；His被取代成Asn或Gln；Ile被取代成Leu或Val；Leu被取代成Ile或Val；Lys被取代成Arg、Glu或Gln；Met被取代成Leu、Tyr或Ile；Phe被取代成Met、Tyr或Leu；Ser被取代成Thr；Thr被取代成Ser；Tyr被取代成Trp；Trp被取代成Tyr。
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11独立地选自Ser和Thr；和/或，上述式(I)中，上述Xaa12独立地选自Asn和Gln；和/或，上述式(I)中，上述Xaa13独立地选自Ser和Thr；和/或，上述式(II)中，上述Xaa21独立地选自Gly和Ala；和/或，上述式(II)中，上述Xaa22独立地选自Ser和Thr；和/或，上述式(II)中，上述Xaa23独立地选自Thr和Ser；和/或，所述式(III)中，上述Xaa31独立地选自Ile和Val。
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式(II)中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式(III)中，上述Xaa31为Ile。(记为“CNb1”)
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Thr，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式(II)中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式(III)中，上述Xaa31为Ile。(记为“CNb111”)
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式(II)中，上述Xaa21为Ala，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式(III)中，上述Xaa31为Ile。(记为“CNb121”)
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式(II)中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式(III)中，上述Xaa31为Val。(记为“CNb131”)
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Thr，Xaa12为Gln，Xaa13为Ser；上述式(II)中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式(III)中，上述Xaa31为Ile。(记为“CNb112”)
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Thr；上述式(II)中，上述Xaa21为Ala，Xaa22为Thr，Xaa23为Thr；上述式(III)中，上述Xaa31为Ile。(记为“CNb122”)
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Thr，Xaa12为Gln，Xaa13为Thr；上述式(II)中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式(III)中，上述Xaa31为Ile。(记为“CNb113”)
对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式(II)中，上述Xaa21为Ala，Xaa22为Thr，Xaa23为Ser；上述式(III)中，上述Xaa31为Ile。(记为“CNb123”)
此外，对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Thr，Xaa12为Asp，Xaa13为Thr；上述式(II)中，上述Xaa21为Ala，Xaa22为Thr，Xaa23为Ala；上述式(III)中，上述Xaa31为Met。
此外，对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ala，Xaa12为Asp，Xaa13为Pro；上述式(II)中，上述Xaa21为Ala，Xaa22为Thr，Xaa23为Ala；上述式(III)中，上述Xaa31为Met。
此外，对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ala，Xaa12为Asp，Xaa13为Pro；上述式(II)中，上述Xaa21为Ala，Xaa22为Pro，Xaa23为Gly；上述式(III)中，上述Xaa31为Met。
此外，对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Pro；上述式(II)中，上述Xaa21为Pro，Xaa22为Gly，Xaa23为Gly；上述式(III)中，上述Xaa31为Cys。
此外，对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Pro；上述式(II)中，上述Xaa21为Pro，Xaa22为Gly，Xaa23为Gly；上述式(III)中，上述Xaa31为Cys。
此外，对于一些优选的方式，上述式(I)中，上述Xaa11为Gly，Xaa12为Asp，Xaa13为Pro；上述式(II)中，上述Xaa21为Thr，Xaa22为Ser，Xaa23为Ser；上述式(III)中，上述Xaa31为Leu。
上述纳米抗体的氨基酸序列和结构除了3个互补决定区(CDR1～CDR3)以外，还包括框架区。
对于框架区，其与互补决定区相比更保守。本领域技术人员会根据纳米抗体的实际用途和功能对框架区的序列结构进行合理的筛选。作为框架区的氨基酸序列，优选同源性为50％以上的氨基酸序列，进而优选同源性为70％以上的氨基酸序列，进而优选为同源性为95％以上的氨基酸序列。
作为框架区，可列举例为框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4，但可以认为不限于此。
作为上述框架区的具体例子，可列举如下：
上述框架区FR1为下述式(IV)：
Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ile-Ala式(IV)(SEQ ID No:4)
上述框架区FR2为下述式(V)：
Met-Ser-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Trp-Val-Ser-Arg-Gly式(V)(SEQ ID No:5)
上述框架区FR3为下述式(VI)：
Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Phe-Ser-Gln-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Glu-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Cys式(VI)(SEQ ID No:6)
上述框架区FR4为下述式(VII)：
Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser式(VII)(SEQ ID No:7)
除了上述框架区实例以外，还包括其他序列组成的框架区，例如，可以是上述框架区FR1～框架区FR4序列的同源性为50％以上的氨基酸序列，优选同源性为70％以上的氨基酸序列，进而优选为同源性为95％以上的氨基酸序列。
作为上述纳米抗体的氨基酸序列，可列举如下：
Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ile-Ala-Ser-Gly-Xaa11-Gly-Phe-Ser-Xaa12-Xaa13-Lys-Tyr-Cys-Met-Ser-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Trp-Val-Ser-Arg-Gly-Ile-Asn-Gly-Xaa21-Xaa22-Lys-Asp-Ile-Xaa23-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Phe-Ser-Gln-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Glu-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Thr-Asn-Xaa31-Pro-Val-Arg-Cys-Arg-Asp-Ile-Val-Ala-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Tyr-Arg-Phe-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser式(XII)(SEQ ID No:8)，其中，
上述Xaa11独立地选自Ser和Thr；和/或，
上述Xaa12独立地选自Asn和Gln；和/或，
上述Xaa13独立地选自Ser和Thr；和/或，
上述Xaa21独立地选自Gly和Ala；和/或，
上述Xaa22独立地选自Ser和Thr；和/或，
上述Xaa23独立地选自Thr和Ser；和/或，
上述Xaa31独立地选自Ile和Val。
作为该纳米抗体的氨基酸序列的具体例子如下：
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Ser、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile(SEQ ID No:18)；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Thr、Xaa12为Asn、Xaa13为Ser、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Ser、Xaa21为Ala、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Ser、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Val；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Thr、Xaa12为Gln、Xaa13为Ser、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Thr、Xaa21为Ala、Xaa22为Thr、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Thr、Xaa12为Gln、Xaa13为Thr、Xaa21为Gly、Xaa22为Ser、Xaa23为Thr、Xaa31为Ile；或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Ser、Xaa21为Ala、Xaa22为Thr、Xaa23为Ser、Xaa31为Ile，或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Thr、Xaa12为Asp、Xaa13为Thr、Xaa21为Ala、Xaa22为Thr、Xaa23为Ala、Xaa31为Met，或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ala、Xaa12为Asp、Xaa13为Pro、Xaa21为Ala、Xaa22为Thr、Xaa23为Ala、Xaa31为Met，或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ala、Xaa12为Asp、Xaa13为Pro、Xaa21为Ala、Xaa22为Pro、Xaa23为Gly、Xaa31为Met，或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Pro、Xaa21为Pro、Xaa22为Gly、Xaa23为Gly、Xaa31为Cys，或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Ser、Xaa12为Asn、Xaa13为Pro、Xaa21为Pro、Xaa22为Gly、Xaa23为Gly、Xaa31为Cys，或者，
上述式(XII)中，Xaa11为Gly、Xaa12为Asp、Xaa13为Pro、Xaa21为Thr、Xaa22为Ser、Xaa23为Ser、Xaa31为Leu，等等，但并不限于上述这些例子，只要对其多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有或者基本上没有影响即可。
此外，纳米抗体的残基总数可以在110-120个区间，优选112-115个，并且最优选113个。然而，纳米抗体的部分、片段或类似物不特别局限于它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段或类似物满足下文列出的进一步要求且还适于本文所述的目的。
作为“纳米抗体”的制备方法，在其最广泛意义上不限于具体的生物资源或具体的制备方法。例如，本发明的纳米抗体可以这样获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过将天然存在的VHH结构域“人源化”(如下文所述)或者通过表达编码所述人源化VHH结构域的核酸；(4)应用合成或半合成技术制备蛋白、多肽或者其他氨基酸序列；(5)通过应用核酸合成技术制备编码纳米抗体的核酸，然后表达这样获得的核酸；和/或(6)通过前述的任何结合。
此外，基于本发明纳米抗体的一种变型，还包括具有与天然存在的VHH结构域相对应但已被人源化的氨基酸序列的纳米抗体。人源化即用来自人类的常规4-链抗体的VH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH结构域序列的一个或多个氨基酸残基。
作为人源化的氨基酸序列的纳米抗体的具体例子，可列举SEQ ID No:13(记为“hCNb1”)，但并不限于此。
此外，本发明还涉及包含至少一个VHH结构域或至少一个基于其的蛋白或多肽。
按照本发明的一个非限制性的实施方案，上述多肽基本上由纳米抗体组成。“基本上由……组成”指本发明的多肽的氨基酸序列与纳米抗体的氨基酸序列完全相同或相对应，其中有限数目的氨基酸残基，如1～10个氨基酸残基，并且优选的1～6个氨基酸残基，如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基，加到所述纳米抗体或多肽的氨基末端(N-端)和/或羧基末端(C-端)。
上述氨基酸残基可以不改变纳米抗体的生物学特性，并且可以给所述纳米抗体加入其他官能性。例如，所述氨基酸残基可以：
a形成标签，即利于所述纳米抗体的纯化的氨基酸序列或残基，例如，使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。这种残基的一些优选的但非限定的实例是多组氨酸残基(His-tag)和谷胱甘肽残基；
b是N-端Met残基，例如，借此可以在异源宿主细胞或宿主生物体内表达；
c是C-端Cys残基，例如，借此可以与配基上的-SH反应或与Au表面反应；
d是以已知的方式可以提供有官能团和/或已经被官能化的一个或多个氨基酸残基，例如，如本领域已知，氨基酸残基如赖氨酸或半胱氨酸允许PEG基团附着。
本发明的多肽还可以包括2个或多个所述纳米抗体，也称为多价多肽。
本发明的二价多肽包括2个纳米抗体，任选地通过一个铰链序列连接，本发明的三价多肽包括3个纳米抗体，任选地通过两个铰链序列连接。
在本发明的多价多肽中，所述2个或多个纳米抗体可以是相同的或不同的。例如，本发明的多价多肽中的2个或多个纳米抗体：可以针对同一抗原，即针对所述抗原的相同表位或者针对所述抗原的2个或多个不同表位；可以针对不同抗原；或其组合。
例如，本发明的二价多肽，可以包括2个相同的纳米抗体；可以包括针对第一抗原的某一表位的第一纳米抗体和针对所述抗原同一表位或不同表位的第二纳米抗体；可以包括针对第一抗原的第一纳米抗体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米抗体。作为二价多肽的氨基酸序列的具体例子，可列举例如SEQ ID No:14(记为“bv CNb1”)，但不限于此。此外，作为人源化的二价多肽的具体例子，可列举SEQ ID No:15(记为“hbvCNb1”)，但并不限于此。
例如，本发明的三价多肽，可以包括3个相同的纳米抗体；可以包括针对同一抗原的相同的或不同的纳米抗体；可以包括针对第一抗原的相同的或不同的表位的2个相同或不同的纳米抗体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第三纳米抗体；可以包括针对第一抗原的第一纳米抗体，针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米抗体，和针对于所述第一和第二抗原不同的第三抗原的第三纳米抗体。
包含至少2个纳米抗体的本发明的多肽，其中至少1个纳米抗体针对第一抗原，并且至少1个纳米抗体针对不同于所述的第一抗原的第二纳米抗体(或针对第一抗原的不同表位的第二纳米抗体)，还叫做“多特异性”抗体。因此，双特异性抗体是包括至少1个针对第一抗原的纳米抗体和至少1个针对第二抗原的其他纳米抗体，而三特异性抗体是包括至少1个针对第一抗原的纳米抗体，至少1个针对第二抗原的其他纳米抗体，和至少1个针对第三抗原的其他纳米抗体；等等。
作为特异性多肽的氨基酸序列的具体例子，可列举双特异性多肽，其是由氨基酸序列为SEQ ID NO：18的单域抗体和另一个针对β2微球蛋白的不同表位的单域抗体(参见CN104098694)组成的，其与单域抗体相比对β2微球蛋白具有更高的亲和力，如SEQ ID No:16(记为“bs CNb1”)、SEQ ID No:17(记为“bf CNb1”)，但不限于此。
关于包含一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，可参考EP 0822985中的记载。
用于多价和多特异性多肽的铰链应该是本领域技术人员所熟知的，例如包括Gly-Ser，如在WO 99/42077中记载的(Gly4Ser)3或(Gly3Ser2)3；或天然存在的重链抗体铰链区或其部分区域。对于其他适宜的铰链，也可参考上文引用的综合背景技术。
此外，除了所述1个或多个纳米抗体之外，本发明的多肽还可以包含官能团、部分或残基，如治疗活性物质，和/或标签，如荧光素标记、同位素标记、生物素标记和酶催化标签等。
此外，本发明的纳米抗体或多肽与β2微球蛋白结合的解离平衡常数(KD)为10-5～10-12摩尔/升(M)，优选为10-7～10-12摩尔/升(M)，进而优选为10-7～10-10摩尔/升(M)，更优选为10-8～10-10摩尔/升(M)。
上述抗原与抗原结合分子之间的特异性结合可以用已知的任何适当的方法确定，其包括，斯卡查德分析(Scatchard Analysis)和/或竞争结合检测如放射性免疫分析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA)，以及本领域已知的其他新方法，如等离子共振技术(SPR)和/或生物膜干涉(BLI)技术等。
本发明的纳米抗体、多肽、及编码其的核酸，可以以已知的方式制备，本领域技术人员可有本文进一步描述而清楚。关于制备所述纳米抗体、多肽和核酸的一种特别有用的方法通常包括如下步骤：
(1)在适宜的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适宜的表达体系中，表达编码所述本发明的纳米抗体或多肽的核酸，任选地接着进行；
(2)分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米抗体或多肽。
也可以是，采用其他方法包括如下步骤：
(3)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，使本发明的宿主表达和/或生产一种本发明的纳米抗体和/或多肽；任选地接着进行；
(4)分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米抗体或多肽。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选的是双链DNA形式。例如，本发明的核酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA，即，密码子优化)。
本发明的核酸可以以本质上已知的方法制备或获得，其基于本文给出的本发明的纳米抗体或多肽的氨基酸序列的信息，和/或可以从适当的天然来源分离。例如，对天然存在的VHH结构域的核酸序列进行基因定点突变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是遗传构建体的部分，这是本领域技术人员所熟知的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，可以是载体形式，如质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和体内表达的载体(如在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即用于表达和/或生产本发明的纳米抗体或多肽。适宜的宿主或宿主细胞为本领域技术人员所熟知，例如可以是任何适当的真菌、原核或真核的细胞或细胞器或者生物体，例如：细菌菌株，其包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)菌属和枯草芽孢杆菌杆菌(Bacillus subtilis)菌属；真菌细胞，其包括但不限于木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)或其他丝状真菌；酵母细胞，其包括但不限于酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)；两栖类细胞或细胞系，例如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；来源于昆虫的细胞或细胞系，如贪夜蛾(Spodoptera)Sf9和Sf21细胞或果蝇属(Drosophila)的细胞系Schneider和Kc细胞；植物或植物细胞，如烟草(tobacco)植物；哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人、和/或其他哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞、Hela细胞和CHS细胞等；以及本质上已知的用于表达和生产抗体和抗体片段(包括但不限于单一结构域抗体和ScFv片段)的所有其他宿主或宿主细胞，为本领域技术人员所熟知。
对于生产，本发明的纳米抗体和多肽可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中，也可在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果、根或种子。
如上文提及，应用纳米抗体的一个优点在于，基于此的多肽可以在原核系统中表达和制备，并且适宜的原核表达系统、载体、宿主细胞等为本领域技术人员所熟知，如上文所引用的参考文献。然而应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表达。
优选地，在本发明中，所述纳米抗体或多肽在细菌细胞中产生，特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞中产生，如上文所述。
当在细胞中表达用来生产的本发明的纳米抗体或多肽时，本发明的纳米抗体或多肽可以在细胞内(如，细胞质或周质空间)产生，然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(即分泌表达)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括用于在哺乳动物细胞中表达的载体——pMANneo(Clonetech)、pUCTtag(ATCC37460)和pMClneo(Stratagene)；用于在细菌细胞中表达的载体——pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；用于在酵母或其他真菌细胞中的表达载体——pYES2(Invitrogen)和毕赤表达载体(Pichaexpression vector)(Invitrogen)；用于在昆虫细胞中的表达载体——pBlueBacⅡ(Invitrogen)和其他杆状病毒载体；等等。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的相应技术为本领域技术人员所熟知。
转化后，可以进行检测并选择已经成功转化本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主。转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，它们表达或者能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的氨基酸序列(如果在宿主生物体的情形中，则为在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其他世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
然后本发明的氨基酸序列可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，可以通过本质上已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的氨基酸序列融合的特异性的/可切割的氨基酸序列)和/或制备性免疫学技术(即使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)。
本发明的纳米抗体或多肽可以特异性结合所述抗原β2微球蛋白，因此本发明的一个优选但非限制性的应用为β2微球蛋白吸附剂，前述吸附剂包括载体基质和所述纳米抗体或多肽。
前述载体基质可以为多孔材料，例如，琼脂糖凝胶微球、纤维素球、磁珠、硅胶微球、活性炭或树脂微球等。
用于前述吸附剂的载体可以通过商业购买来获得，作为具体例产品，例如，琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B(GE Healthcare，US)，树脂微球Nanomicro系列(苏州纳微科技有限公司)，但并不限于这些产品。
在使用上述载体时，优选地，可以将上述载体活化。该活化方式例如可以使用但不限于如下方法：首先进行环氧活化，其次再进行二胺丙基亚胺(DADPA)活化，最后进行碘乙酸活化，等。
前述吸附剂通过将纳米抗体或多肽偶联到经过活化的载体上而得到，具体的方法没有特别限定，例如，可通过将纯化的抗体还原，得到纳米抗体或多肽溶液，然后将该纳米抗体或多肽与载体混合，并通过离心分离，最终通过对凝胶进行清洗/过滤而得到最终的吸附剂。
本发明的吸附剂可以用来特异性识别β2微球蛋白。
本发明的纳米抗体或多肽或吸附剂可用于制备去除β2微球蛋白试剂，还可用于制备去除或检测β2微球蛋白的医疗器械。此外，本发明的纳米抗体或多肽或吸附剂还可用于免疫检测、富集和/或纯化等。
实施例
以下，举出实施例来说明本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式不受如下这些实施例的限制，可在不影响本发明所要达到的技术效果的范围内做出任意选择和变更。
A.筛选特异性结合β2微球蛋白的纳米抗体
实施例1
抗β2微球蛋白纳米抗体文库的构建。
本发明使用的噬菌体展示库是以T7噬菌体为载体的免疫库，建立步骤如下：
(1)用β2微球蛋白免疫羊驼(编号为1139和462)，免疫四次后采取两只羊驼的颈静脉血，分离外周血淋巴细胞，并提取总RNA(PuerLinkTM RNA Mini Kit，LifeTechnologies：12183018A)；
(3)将总RNA反转录为cDNA，并用采用两轮巢式PCR扩增VHH基因；
其中第一轮PCR以cDNA为模版，以UP primer1和DOWN primer1分别为上游和下游引物，扩增后回收大小为650～750bp的条带，并以此为第二轮PCR的模板，上、下游引物分别为UP primer2，DOWN primer2，回收450～500bp的PCR产物；
UP primer1：5’-GGTACGTGCT GTTGAACTGT TCC-3’
DOWN primer1：5’-CTTGGTGGTCCTGGCTGCTCT-3’
UP primer2：5’-AAGCTTTTGT GGTTTTGGTG TCTTGGGTTC-3’
DOWN primer2：5’-AAGCTTGGGG TCTTCGCTGT GGTGCG-3’
(3)用EcoRI和HindIII双酶切PCR产物，并进行琼脂糖电泳，回收350～500bp的基因条带，即为VHH基因片段；
(4)用T4连接酶连接T7载体(
Figure BDA0002434962970000161
10-3Cloning Kit,Merck Millipore
Figure BDA0002434962970000162
70550-3)和VHH基因片段；
(5)将连接产物与包装蛋白混合，组成完整的T7噬菌体，将混合物进行扩增，得到噬菌体原始文库；
(6)经检测，该原始库的滴度为3.14×1010pfu/mL，多样性为1.7×106。
实施例2
纳米抗体的筛选。
首先将抗原用TBS稀释为10μg/mL，取100μL加入96孔板中，4℃孵育12h。将孔中的抗原稀释液吸出，用TBS洗板3次，拍干，加入1％无蛋白封闭液(购自生工生物工程有限公司)，300μL/孔，室温孵育2h(筛选时1％无蛋白封闭液和1％BSA交替使用)。将孔中封闭剂吸出，用TBST洗板6次，拍干，加入扩增的噬菌体，100μL/孔，室温孵育30min。用TBST洗板10次，加入T7洗脱缓冲液(1％SDS)洗脱噬菌体，室温孵育30min，并将洗脱液扩增，用于下一轮筛选。
实施例3
基因工程菌的构建
(1)经过四轮筛选之后，将筛选洗脱液进行固体扩增，挑取噬菌斑，以噬菌斑扩增液为模板，以UP primer3和DOWN primer3为上、下游引物，进行PCR扩增；
UP primer3：5’-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3’
DOWN primer3：5’-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3’；
(2)将一部分PCR产物委外测序，即得到所述纳米抗体序列信息，该序列如SEQ ID：18所示(“CNb1”)。
(3)将另一部分PCR产物用NdeI和XhoI进行双酶切，并回收酶切产物。同时用相同的方法进行酶切并回收载体，用T4连接酶连接酶切产物及载体，将连接产物转入大肠杆菌，得到表达β2微球蛋白特异性纳米抗体的基因工程菌。
实施例4
β2微球蛋白纳米抗体的制备
(1)纳米抗体的基础培养基为TB培养基，按照5％接种量接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)(终浓度0.25mM，下同)进行过夜诱导；
(2)诱导结束后，在4000rpm的条件下离心20min，获得含有纳米抗体的湿菌。
(3)向所得的湿菌中按照1：10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.40.02M PB)，使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎；
(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min，取上清；
(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过亲和层析柱(GE Healthcare，US)进行β2微球蛋白纳米抗体的分离纯化，其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose HighPerfomance；
(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳以判断纯度，选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。纯化的纳米抗体的SDS-PAGE显示在图1中。
实施例5
应用SPR技术分析纳米抗体对β2微球蛋白的结合能力。将β2M以500～800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以1～100nM范围内的7个不同浓度注射纳米抗体，在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HCl pH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD(表A-1和图3)。图3中曲线从上到下依次为纳米抗体在100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM浓度下的响应曲线，通过方程拟合计算出如表A-1所示的动力学参数，CNb1对β2微球蛋白的亲和力为5.14×10-8M。
表A-1单域抗体CNb1的动力学参数
Figure BDA0002434962970000181
B.抗β2M纳米抗体的序列优化
实施例6：序列优化策略1
通过定点突变的方法，获得保守氨基酸取代的纳米抗体序列，如SEQ ID：12所示(该将纳米抗体分别命名为“CNb111、CNb121、CNb131、CNb112、CNb122、CNb113、CNb123”)。应用SPR技术分析保守氨基酸取代的纳米抗体对β2微球蛋白的结合能力。简言之，将β2M以500-800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以1～200nM范围内的不同浓度梯度注射纳米抗体，在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HCl pH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD(表B-1和图4)
表B-1保守氨基酸取代的单域抗体的动力学参数
Figure BDA0002434962970000182
从表B-1可知，CNb111、CNb121和CNb131与CNb1相比，亲和力略有下降，主要体现在结合常数Ka略有下降，表明CNb111、CNb121和CNb131的结合力略有损失，但仍与CNb1处于同一数量级，表明具有与CNb1相当的亲和力。而CNb112和CNb123与CNb1相比，尽管亲和力略有下降，但最终取代结果的效果也很优异。
从图4可知，取代后形成的不同纳米抗体虽然亲和力区别不大，但具体的动力学参数不同，体现在结合和解离的速率不同(曲线上升和下降的速率)，最终体现在制备成吸附剂后，吸附效果略有差异。
实施例7：序列优化策略2
构建特异性结合β2微球蛋白的二价多肽
设计特异性结合β2微球蛋白的二价多肽序列的氨基酸序列，如SEQ NO 14、SEQNO16、SEQ NO 17所示。其由C-末端纳米抗体A、15氨基酸Gly/Ser接头和C-末端纳米抗体B组成。其中，纳米抗体A和纳米抗体B可以相同，也可以不同。纳米抗体A为CNb1，SEQ NO 16中的纳米抗体B来自CN104098694，SEQ NO 17中的纳米抗体B来自CN109627334A。
人工合成这些二价多肽的DNA序列，并将DNA片段连接到pET23a载体上，构建二价多肽质粒，并转化进入大肠杆菌，得到二价多肽工程菌。
随后进行二价多肽的表达与纯化：
(1)二价多肽的基础培养基为TB培养基，按照体积比为5％的接种量进行接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)(终浓度0.25mM)进行过夜诱导；
(2)诱导结束后，在4000rpm的条件下离心20min，获得含有二价多肽的湿菌。
(3)向所得的湿菌中按照1：10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.40.02M PB)，使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎；
(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min，取上清；
(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过亲和层析柱(GE Healthcare，US)进行二价多肽的分离纯化，其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose High Perfomance；
(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳判断纯度，选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。纯化的二价多肽的SDS-PAGE显示在图2中。
应用SPR技术分析二价多肽对β2微球蛋白的结合能力
将β2M以500-800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以1-50nM范围内的5个不同浓度注射纳米抗体，在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HCl pH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD。bvCNb1的ka＝56200Ms，kd＝0.0015s-1，KD＝2.67×10-9M；bsCNb1的ka＝83500Ms，kd＝0.0017s-1，KD＝2.04×10-9M；bvCNb1的ka＝225000Ms，kd＝0.0096s-1，KD＝4.26×10-8M。
由此可知，与CNb1相比，二价形式的纳米抗体(bvCNb1，bsCNb1，bfCNb1)与抗原β2M的亲和力有不同程度的提高。
实施例8：序列优化策略3
对特异性结合β2微球蛋白的纳米抗体的人源化
将纳米抗体CNb1的蛋白序列与人种系进行比对，在框架区标记出差异氨基酸，然后用定点突变的方式将二者具有差异的氨基酸替换为人源氨基酸，产生人源化的纳米抗体(hCNb1)，如SEQ NO 13所示。随后进行人源化纳米抗体的表达与纯化：
(1)人源化纳米抗体的基础培养基为TB培养基，按照5％接种量接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)进行过夜诱导；
(2)诱导结束后，在4000rpm条件下离心20min，获得含有人源化纳米抗体的湿菌。
(3)向所得的湿菌中按照1：10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.40.02M PB)，使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎；
(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min，取上清；
(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过亲和层析柱(GE Healthcare，US)进行人源化纳米抗体的分离纯化，其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose HighPerfomance；
(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳判断纯度，选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。
应用SPR技术分析人源化纳米抗体对β2微球蛋白的结合能力
将β2M以500～800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以1～100nM范围内的6个不同浓度注射纳米抗体，在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HClpH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD(表B-2和图5)。图5中曲线从上到下依次为hCNb1在100nM、50nM、25nM、12.5nM、3.125nM、0.8nM浓度下的响应曲线，经计算，得到表B-2。与CNb1相比，人源化后的纳米抗体(hCNb1)与抗原β2M的亲和性没有显著降低(CNb1的KD为5.14×10-8M)。
表B-2人源化单域抗体hCNb1的动力学参数
Figure BDA0002434962970000201
实施例8：序列优化策略4
对特异性结合β2微球蛋白的二价多肽的人源化
设计特异性结合β2微球蛋白的人源化二价多肽序列的氨基酸序列，如SEQ NO15所示。其由C-末端纳米抗体hCNb1、15氨基酸Gly/Ser接头和C-末端纳米抗体hCNb1组成。
人工合成人源化二价多肽的DNA序列，并将DNA片段连接到pET23a载体上，构建人源化二价多肽质粒，并转化进入大肠杆菌，得到人源化二价多肽工程菌。
随后进行人源化二价多肽的表达与纯化：
(1)人源化二价多肽的基础培养基为TB培养基，按照5％接种量接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)进行过夜诱导；
(2)诱导结束后，在4000rpm条件下离心20min，获得含有人源化二价多肽的湿菌。
(3)向所得的湿菌中按照1：10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.40.02M PB)，使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎；
(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min，取上清；
(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤，然后经过亲和层析柱(GE Healthcare，US)进行人源化二价多肽的分离纯化，其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose HighPerfomance；
(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳判断纯度，选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。纯化的人源化二价多肽的SDS-PAGE显示在图2中。
应用SPR技术分析人源化二价多肽对β2微球蛋白的结合能力
将β2M以500-800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上，以1-50nM范围内(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、1.5625nM)的5个不同浓度注射纳米抗体，在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HCl pH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD。bvCNb1的ka＝56200Ms，kd＝0.018s-1，KD＝3.20×10-8M。与CNb1相比，人源化二价形式的纳米抗体(hbvCNb1)与抗原β2M的亲和力有所提高。
C.β2微球蛋白吸附剂的制备
实施例9
琼脂糖凝胶的活化
取琼脂糖微球2g，加入2mol/L NaOH，1,4-丁二醇二缩水甘油醚0.8mL，按该比例混合后，反应60min以上。反应结束后，用大量去离子水洗涤凝胶后将其抽滤成湿饼。
实施例10
β2微球蛋白纳米抗体的固载
取活化后的载体材料0.5g，加入2mL纳米抗体(CNb1)溶液，37℃、250rpm反应24h。反应结束后加入3倍体积的乙醇胺(体积比6％，pH 9.0)过夜封闭，得到β2微球蛋白吸附剂。
实施例11
吸附剂的溶血性能评价
实验方法参照2015年版《中华人民共和国药典》及《医疗器械生物学评价》第十一章《与血液相互作用试验选择》
(1)健康家兔心脏采血10mL，加入1mL质量浓度为2％(20g/L)的草酸钾溶液，轻轻混匀，制备成新鲜抗凝兔血。取新鲜抗凝兔血8mL，加质量浓度为0.9％(9g/L)的氯化钠注射液10mL进行稀释，制得新鲜稀释抗凝兔血。
(2)称取吸附剂5g，加入试管内，再加入10mL生理盐水使吸附剂完全浸没，阴性对照为10mL生理盐水，阳性对照为10mL蒸馏水，均为10mL。样品、阴性对照和阳性对照各准备3管。将上述试管放入恒温水浴锅中，(37±1)℃恒温水浴30min，每支试管分别加入0.2mL稀释抗凝兔血(A液)，再继续水浴60min。
(3)倒出上述管中试样，放入离心机中，800×g离心5min。吸取上清液移入比色皿中，用分光光度计在545nm处测定吸光值。供试品组与对照组吸光度均取三管平均值。阴性对照吸光值应不大于0.03，阳性对照管的吸光度应为0.8±0.3，否则应重新进行试验。用生理盐水调零。
(4)供试品溶血率计算公式：n＝(A1-A2)×100％/(A3-A2)，其中n为溶血率(％)，A1为供试品组吸光度，A2为阴性对照组吸光度，A3为阳性对照组吸光度。
经实验验证，用规定的静态接触溶血法测得的该吸附剂溶血率几乎为0，低于5％(合格品的判定指标一般应小于5％)，符合要求。
实施例12
在非血液体系中吸附剂容量的评价
取上述实施例10合成得到的吸附剂0.1g，加入5mL含β2M的牛血清，β2M质量溶液浓度0.98mg/mL，室温下混合吸附2h，利用免疫比浊法测定吸附前后蛋白浓度变化，并计算单位吸附量[单位吸附量＝(吸附前溶液中的蛋白质量-吸附后溶液中的蛋白质量)/吸附剂体积)]。
经检测，当抗体固载量在16mg/mL时，对β2M的饱和吸附量为9.9mg/mL；当抗体固载量在18mg/mL时，对β2M的饱和吸附量为11mg/mL；当抗体固载量在25mg/mL时，对β2M的饱和吸附量为15.3mg/mL；当抗体固载量在30mg/mL时，对β2M的饱和吸附量为16.5mg/mL。
本发明的吸附剂对β2M的饱和吸附量可达到16.5mg/mL。
实施例13
吸附剂对血液中低浓度β2微球蛋白的吸附情况
取合成好的吸附剂0.1g，加入5mL含有35μg/mLβ2M的牛血清，室温下混合吸附2h，利用免疫比浊法测定吸附前后β2M浓度变化，并计算去除率。
经检测，当抗体固载量在16mg/mL时，对血液中低浓度β2M的去除率为52％；当抗体固载量在18mg/mL时，对血液中低浓度β2M的去除率为56％；当抗体固载量在25mg/mL时，当对血液中低浓度β2M的去除率为73.3％；当抗体固载量在30mg/mL时，对血液中低浓度β2M的去除率为81.2％。
综上，抗体固载量为16mg/mL以上时，可达到对血液中低浓度β2M的去除率在50％以上的效果。
产业上的可利用性
本发明的纳米抗体是通过噬菌体库的筛选发现的具有新的氨基酸序列的抗β2微球蛋白纳米抗体，该纳米抗体及其多肽具有很高的亲和力和活性，能够特异性地识别并结合β2微球蛋白，吸附剂对β2微球蛋白的吸附能力极强，可应用于血液净化及β2微球蛋白检测领域，有助于促进和改善对透析相关淀粉样变等疾病的诊断和治疗。
序列表
<110> 康元医疗科技（大连）有限公司
<120> 一种纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用
<130> LI10919007
<141> 2020-04-01
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa11独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> Xaa12独立地选自Asn、Gln、Asp、Glu和His
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa13独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 1
Ser Gly Xaa Gly Phe Ser Xaa Xaa Lys Tyr Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (4)..(4)
<223> Xaa21独立地选自Gly、Ala、Ser、Thr和Pro
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (5)..(5)
<223> Xaa22独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> Xaa23独立地选自Thr、Ser、Ala、Pro和Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (4)..(4)
<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 2
Ile Asn Gly Xaa Xaa Lys Asp Ile Xaa
1 5
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (4)..(4)
<223> Xaa31独立地选自Ile、Val、Met、Leu和Cys
<220>
<221> UNSURE
<222> (4)..(4)
<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 3
Ala Thr Asn Xaa Pro Val Arg Cys Arg Asp Ile Val Ala Lys Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Asp Gly Tyr Arg Phe
20
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala
20 25
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 5
Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Arg Gly
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 6
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 7
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 8
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala
20 25
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 9
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Arg Gly
<210> 10
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 10
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 11
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (28)..(28)
<223> Xaa11独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (32)..(32)
<223> Xaa12独立地选自Asn、Gln、Asp、Glu和His
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (33)..(33)
<223> Xaa13独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (58)..(58)
<223> Xaa21独立地选自Gly、Ala、Ser、Thr和Pro
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (59)..(59)
<223> Xaa22独立地选自Ser、Thr、Ala、Pro和Gly
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (63)..(63)
<223> Xaa23独立地选自Thr、Ser、Ala、Pro和Gly
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (105)..(105)
<223> Xaa31独立地选自Ile、Val、Met、Leu和Cys
<220>
<221> UNSURE
<222> (28)..(28)
<223> The 'Xaa' at location 28 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (32)..(32)
<223> The 'Xaa' at location 32 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (33)..(33)
<223> The 'Xaa' at location 33 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (58)..(58)
<223> The 'Xaa' at location 58 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (59)..(59)
<223> The 'Xaa' at location 59 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (63)..(63)
<223> The 'Xaa' at location 63 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (105)..(105)
<223> The 'Xaa' at location 105 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala Ser Gly Xaa Gly Phe Ser Xaa
20 25 30
Xaa Lys Tyr Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Trp Val Ser Arg Gly Ile Asn Gly Xaa Xaa Lys Asp Ile Xaa Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ser
65 70 75 80
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Xaa Pro Val Arg Cys Arg Asp Ile
100 105 110
Val Ala Lys Gly Ser Gly Ser Asp Gly Tyr Arg Phe Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 13
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Asn
20 25 30
Ser Lys Tyr Cys Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ser Arg Gly Ile Asn Gly Gly Ser Lys Asp Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75 80
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Ile Pro Val Arg Cys Arg Asp Ile
100 105 110
Val Ala Lys Gly Ser Gly Ser Asp Gly Tyr Arg Phe Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 14
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Asn
20 25 30
Ser Lys Tyr Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Trp Val Ser Arg Gly Ile Asn Gly Gly Ser Lys Asp Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ser
65 70 75 80
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Ile Pro Val Arg Cys Arg Asp Ile
100 105 110
Val Ala Lys Gly Ser Gly Ser Asp Gly Tyr Arg Phe Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala Ser
165 170 175
Gly Ser Gly Phe Ser Asn Ser Lys Tyr Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ser Arg Gly Ile Asn Gly Gly
195 200 205
Ser Lys Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Phe Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Ile Pro
245 250 255
Val Arg Cys Arg Asp Ile Val Ala Lys Gly Ser Gly Ser Asp Gly Tyr
260 265 270
Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 15
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 15
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Asn
20 25 30
Ser Lys Tyr Cys Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ser Arg Gly Ile Asn Gly Gly Ser Lys Asp Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75 80
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Ile Pro Val Arg Cys Arg Asp Ile
100 105 110
Val Ala Lys Gly Ser Gly Ser Asp Gly Tyr Arg Phe Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala Ser
165 170 175
Gly Ser Gly Phe Ser Asn Ser Lys Tyr Cys Met Ser Trp Val Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Gly Ile Asn Gly Gly
195 200 205
Ser Lys Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Ile Pro
245 250 255
Val Arg Cys Arg Asp Ile Val Ala Lys Gly Ser Gly Ser Asp Gly Tyr
260 265 270
Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 16
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Asn
20 25 30
Ser Lys Tyr Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Trp Val Ser Arg Gly Ile Asn Gly Gly Ser Lys Asp Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ser
65 70 75 80
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Ile Pro Val Arg Cys Arg Asp Ile
100 105 110
Val Ala Lys Gly Ser Gly Ser Asp Gly Tyr Arg Phe Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Gln Gln Ala Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly
165 170 175
Arg Thr Leu Val Gly Trp Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Glu Arg Asp Phe Val Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Gly Thr Thr
195 200 205
Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile
210 215 220
Ser Arg Lys Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp
225 230 235 240
Thr Val Tyr Tyr Cys Arg His Thr Arg Tyr Gly Ala His Trp Ala Ala
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 17
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Asn
20 25 30
Ser Lys Tyr Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Trp Val Ser Arg Gly Ile Asn Gly Gly Ser Lys Asp Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ser
65 70 75 80
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Ile Pro Val Arg Cys Arg Asp Ile
100 105 110
Val Ala Lys Gly Ser Gly Ser Asp Gly Tyr Arg Phe Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg
145 150 155 160
Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Ser Leu Ser Cys Thr Ala Thr Gly
165 170 175
Arg Thr Asp Asp Met Tyr Asp Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Asp Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Asp Ala Ser Thr
195 200 205
Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Pro Asn
210 215 220
Thr Gly Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Lys Lys Leu Thr Pro Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Arg Cys Ala Ala Ser Arg Asn Pro Gly Thr Met Tyr
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Arg Arg Glu Thr Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Gln Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 18
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Asn
20 25 30
Ser Lys Tyr Cys Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Trp Val Ser Arg Gly Ile Asn Gly Gly Ser Lys Asp Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Gln Asp Asn Ser
65 70 75 80
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Ile Pro Val Arg Cys Arg Asp Ile
100 105 110
Val Ala Lys Gly Ser Gly Ser Asp Gly Tyr Arg Phe Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135

Claims (8)

1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列包括互补决定区CDR和框架区FR，
所述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，其中，
所述互补决定区CDR1为下述式（I）：
Ser-Gly-Xaa11-Gly-Phe-Ser-Xaa12-Xaa13-Lys-Tyr-Cys式（I）（SEQ ID No: 1），
所述互补决定区CDR2为下述式（II）：
Ile-Asn-Gly-Xaa21-Xaa22-Lys-Asp-Ile-Xaa23式（II）（SEQ ID No: 2），
所述互补决定区CDR3为下述式（III）：
Ala-Thr-Asn-Xaa31-Pro-Val-Arg-Cys-Arg-Asp-Ile-Val-Ala-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Tyr-Arg-Phe式（III）（SEQ ID No: 3），
其中，
上述式（I）中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式（II）中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式（III）中，上述Xaa31为Ile，或，
上述式（I）中，上述Xaa11为Thr，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式（II）中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式（III）中，上述Xaa31为Ile，或，
上述式（I）中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式（II）中，上述Xaa21为Ala，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式（III）中，上述Xaa31为Ile，或，
上述式（I）中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式（II）中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式（III）中，上述Xaa31为Val，或，
上述式（I）中，上述Xaa11为Thr，Xaa12为Gln，Xaa13为Ser；上述式（II）中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式（III）中，上述Xaa31为Ile，或，
上述式（I）中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Thr；上述式（II）中，上述Xaa21为Ala，Xaa22为Thr，Xaa23为Thr；上述式（III）中，上述Xaa31为Ile，或，
上述式（I）中，上述Xaa11为Thr，Xaa12为Gln，Xaa13为Thr；上述式（II）中，上述Xaa21为Gly，Xaa22为Ser，Xaa23为Thr；上述式（III）中，上述Xaa31为Ile，或，
上述式（I）中，上述Xaa11为Ser，Xaa12为Asn，Xaa13为Ser；上述式（II）中，上述Xaa21为Ala，Xaa22为Thr，Xaa23为Ser；上述式（III）中，上述Xaa31为Ile。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述框架区FR包括框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4，或者，所述框架区FR包括与所述框架区FR1、所述框架区FR2、所述框架区FR3和所述框架区FR4的同源性为50%以上的氨基酸序列，
所述框架区FR1为下述式（IV）：
Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ile-Ala式（IV）（SEQ ID No: 4）
所述框架区FR2为下述式（V）：
Met-Ser-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Trp-Val-Ser-Arg-Gly式（V）（SEQ ID No: 5）
所述框架区FR3为下述式（VI）：
Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Phe-Ser-Gln-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Glu-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Cys式（VI）（SEQ ID No: 6）
所述框架区FR4为下述式（VII）：
Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser式（VII）（SEQ ID No: 7），
或，所述框架区FR1为下述式（VIII）：
Glu-Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ile-Ala式（VIII）（SEQ ID No: 8）
所述框架区FR2为下述式（IX）：
Met-Ser-Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Arg-Gly式（IX）（SEQ IDNo: 9）
所述框架区FR3为下述式（X）：
Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Cys式（X）（SEQ ID No: 10）
所述框架区FR4为下述式（XI）：
Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser式（XI）（SEQ ID No: 11）。
3.一种多肽，其特征在于，其由权利要求1或2记载的纳米抗体组成，
所述多肽是多价多肽；
所述多价多肽的氨基酸序列为SEQ ID No: 14或SEQ ID No: 16或SEQ ID No: 17。
4.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1或2所述的纳米抗体和/或权利要求3所述的多肽。
5.一种宿主或宿主细胞，其特征在于，其能够表达权利要求1或2所述的纳米抗体和/或权利要求3所述的多肽。
6.一种吸附剂，其特征在于，所述吸附剂包括载体基质和权利要求1或2所述的纳米抗体或权利要求3所述的多肽。
7.权利要求1或2记载的纳米抗体和/或权利要求3记载的多肽在制备β2微球蛋白吸附剂上的应用。
8.权利要求1或2记载的纳米抗体和/或权利要求3记载的多肽在β2微球蛋白的免疫检测、富集和/或纯化中的应用。
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