CN112979815A - 一种抗he4的纳米抗体1g8及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗HE4的纳米抗体，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，本发明还提供了含有该纳米抗体可变区编码序列的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞，以及所述纳米抗体在检测血清中HE4含量中的应用。本发明提供的纳米抗体对HE4具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到2.773E‑09，具有独特的抗原决定簇识别位点，能够在HE4血清检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效果。

Description

一种抗HE4的纳米抗体1G8及其应用

技术领域

本发明公开了一种纳米抗体，属于免疫学领域。

背景技术

卵巢上皮癌(Endometrioid Ovarian Cancer，EOC)是常见的女性生殖器官恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中其发病率位居第三，然而因其发现时大多处于晚期、预后差且复发率高，其死亡率却位居首位。人附睾蛋白(HE4)是一种新的卵巢癌特异性肿瘤标志物，属于乳清酸性蛋白家族(WAP)，是由WFDC2基因编码的一种分泌型小分子糖蛋白。分子量为13kDa左右，其成熟后以25kDa糖基化形式存在，主要在卵巢上皮癌、子宫内膜癌中过量表达，并且其血清水平预测卵巢癌的灵敏度明显高于CA125，尤其是在早期，检测临界值可达150pmol/L。卢仁泉等(HE4在卵巢癌诊治中的临床应用评价，中国癌症杂志，2010年20卷9期)在早年间对EOC患者的研究中就发现HE4对EOC诊断的灵敏度为72.4％，特异度为90.1％，准确性83.6％，阳性和阴性符合率分别为80.8％和85.0％，可见HE4完全可满足EOC辅助诊断的要求。朱振宁等(HE4联合CA125在卵巢癌早期诊断中的应用价值，现代肿瘤医学，2014年22卷3期)比较研究了HE4和CA125用于卵巢癌早期诊断的差异。结果显示，在早期卵巢癌组中，HE4水平显著高于健康对照组及良性肿瘤组，具有统计学意义(P＜0.05)，而CA125水平在早期卵巢癌组和良性肿瘤组中无显著差异，而此前Moore等(Moore RG等，Serum HE4 levelsare less frequently elevated than CA125 in women with benign gynecologicdisorders，American Journal of Obstetrics&Gynecology,2012年206卷4期)也曾报道HE4是鉴别卵巢癌和良性肿瘤的最好指标。此外，朱振宁等(HE4联合CA125在卵巢癌早期诊断中的应用价值，现代肿瘤医学，2014年22卷3期)的研究中HE4的敏感性和特异性分别为85％和96％，而CA125相应仅为65％和76％，可见HE4指标的优越性。HE4不仅在卵巢癌的早期诊断具有巨大潜力，其在预后评价和疗效监测方面也有重要价值。2008年FDA批准将HE4用于EOC患者的疗效评估和复发监测。大量研究也证实了HE4在这方面的性能优势。有研究者将血清HE4水平成功用于卵巢癌病人的疗效预测，通过与CA72-4和CA125结合，可用于卵巢癌随访的复发监测。结合MDCT，HE4还可用于跟踪进展期卵巢癌患者的淋巴结转移状态。

对癌症生物标志物的敏感检测在过去几十年里引起了巨大的研究兴趣，因为它在癌症的早期诊断和治疗预后中起着重要的作用。免疫分析由于特异性和稳定性的优势，广泛应用于癌症生物标志物的敏感检测。尤其，基于抗原抗体相互作用的免疫分析方法是检测肿瘤标志物的可靠工具，并用于基础研究和临床检测。在许多研究团体的研究共同努力，目前，已开发出了多种类型的免疫分析方法：包括电泳免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、比色法免疫分析法、质谱免疫分析法、表面拉曼增强光谱免疫分析。化学发光免疫分析法的灵敏度和精确度比酶联免疫吸附法、荧光法高几个数量级，且具有方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点，可用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等相关物质的检测分析。

基于HE4在临床诊断方面所表现出的突出特性，研发出针对HE4的特异性结合抗体显得尤为重要。

1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H₂)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。

相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。

纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值及发展前景。

鉴于HE4分子量较小，常规抗体与之结合难以充分识别一些隐匿于裂隙或空腔里的抗原决定簇，如果抗体识别抗原决定簇过于单一或者位点过于接近或者重叠，都会导致特异性的抗原抗体结合反应收到影响，从而严重影响检测效率。因此研发抗HE4的纳米抗体，充分发挥纳米抗体超强的抗原识别能力成为抗体技术领域的一种新的需求。本发明的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，又能克服其固有缺陷的抗HE4的纳米抗体，即所述抗体既具有高度特异的抗原识别能力，具有高度的亲和力，并且具有独特的抗原决定簇识别位点，能够在HE4抗原的免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效率。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗HE4的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成。所述抗体具有独特的抗原决定簇识别位点。

在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成。在本发明中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体1G8。

其次，本发明还提供了一种含有上述纳米抗体的融合蛋白，所述融合蛋白还含有化学发光区功能性蛋白。

在一个优选的技术方案中，所述化学发光区功能性蛋白为碱性磷酸酶蛋白。

更为优选地，所述化学发光区功能性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

第三，本发明还提供了一种编码上述纳米抗体的核酸，所述编码序列由SEQ IDNO.5所示。

第四，本发明提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pMES4。

第五，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

最后，本发明还提供了上述纳米抗体在制备免疫法检测HE4试剂盒中的应用。

在一个优选的技术方案中，所述免疫法为双抗体夹心法，其中第一抗体为可变区序列由SEQ ID NO.6所示的纳米抗体，第二抗体为上述的纳米抗体。

本发明提供的纳米抗体1G8对HE4抗原具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到2.773E-09，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。另外，本发明提供的纳米抗体1G8在作为酶标二抗应用于双抗夹心免疫法检测HE4的方法中显示了优异的检测性能，其可以与作为捕获一抗的纳米抗体3C8配对使用，显示其与纳米抗体3C8在抗原识别表位上具有较低的重叠性，该特性得以保证本发明提供的纳米抗体于作为酶标二抗与特异性适配的捕获一抗应用于双抗夹心免疫法检测HE4的方法中。

附图说明

图1.提取的总RNA电泳鉴定图；

图2.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；

图3.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；

图4.pMES4表达载体结构示意图；

图5.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；

图6.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；

图7.纳米抗体纯化SDS-PAGE图；

图8.Biacore分析纳米抗体结合位点流程图；

图9.Biacore分析纳米抗体亲和力曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1.纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选

1.1羊驼的免疫

选取健康成年羊驼一只，将重组HE4抗原(GenBank:AAO52683.1，通过HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点构建在pCDNA3.1载体上，通过人293细胞采用常规分子生物学技术进行表达)与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。

1.2驼源淋巴细胞的分离

将采集的羊驼外周血利用骆驼外周血淋巴细胞分离液试剂盒(天津灏洋公司，货号LTS1076)说明书操作进行分离淋巴细胞，每2.5×10⁷个活细胞加入1ml RNA分离试剂，取1ml进行RNA提取，其余-80℃保存。

1.3总RNA提取

将含有淋巴细胞的1ml Tipure Isolation Reagent反复吹打，放置5分钟；加入200μl氯仿，涡旋30秒后继续放置5分钟；4℃，12000g离心15分钟，吸取水相转入新的EP管中；加入等量异丙醇，放置10分钟；4℃，12000g离心10分钟，弃上清；用1ml预冷的70％乙醇洗涤，4℃，7500g离心5分钟，弃上清并干燥5分钟；加入30μl RNase-free水溶解沉淀，调整浓度到1μg/μl进行凝胶电泳检测(图1：M为Trans 2K DNA Marker；1为提取的RNA)。

1.4反转录合成cDNA

根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT)以1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。

1.5抗体可变区基因扩增

将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：

CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG

CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl(图2：M为Trans 2K DNA Marker；1-3为第一轮PCR产物)。第二轮PCR的引物序列如下：

VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物(图3：M为Marker；1-3为第二轮PCR产物)。

1.6载体构建

将pMES4(购自Biovector，其结构示意图见图4)与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μl T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μl总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μl水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果(图5：M为Trans 5K Plus DNA Marker；1为pMES4载体未酶切质粒；2为pMES4载体双酶切后产物)。

1.7电转化及库容测定

取10μl纯化后的连接产物，加入到含有50μl大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定(图6：M为Marker；1为阴性对照；2-19为随机挑选的单克隆PCR鉴定产物)。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。引物序列如下：

MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG

GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG

1.8噬菌体扩增

取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD₆₀₀＝0.5。取出10ml菌液加入4×10¹⁰VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。

测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD₆₀₀＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。

噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100

1.9纳米抗体筛选

通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。

1.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化

挑选噬菌体ELISA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。

通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗HE4的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(Complementary Determining Regions，CDR)。

本发明筛选到的一个优选实施方案的纳米抗体被命名为“1G8”。通过DNA测序，所述纳米抗体1G8重链核酸序列为SEQ ID NO.5所示，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，其中第1-23位氨基酸序列为FR1，第24-31位氨基酸序列为CDR1，第32-48位氨基酸序列为FR2，第49-56位氨基酸序列为CDR2，第57-94位氨基酸序列为FR3，第95-111位氨基酸序列为CDR3，第112-122位氨基酸序列为FR4。

实施例2.纳米抗体1G8的制备

2.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)

将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1:1000比例接种于5ml新鲜的LB-A培养基，37℃200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。

2.2纳米抗体的诱导表达

挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1:100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD₆₀₀＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5ml的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0ml TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5ml的上清(周质提取物)。

2.3纳米抗体的纯化和鉴定

将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(图7:M为彩虹180广谱蛋白Marker；1-4为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体)。

实施例3.纳米抗体与抗原的亲和活性测定

3.1芯片抗原偶联

将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH 4.0)配制成20μg/ml的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。

3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化

采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30μl/分钟。进样条件均为120秒，30μl/分钟。再生条件均为30秒，30μl/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/ml，150μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，20μg/ml，10μg/ml，2μg/ml。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/ml分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。

3.3亲和力测试

按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60秒，30μl/min；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μl/min)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。

3.4结果分析

选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数(见表1和图9)。抗HE4纳米抗体1G8的亲和力数值为2.773E-09。

表1：纳米抗体亲和力数据

实施例4.纳米抗体的ELISA叠加数据分析

4.1抗原饱和浓度的确定

以2μg/ml的浓度包被抗原，100μl/孔，4℃包被24小时，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体、阴性对照(阴性血清1:100)、PBS空白对照，37℃孵育30分钟，洗板5遍。加入1:4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30分钟，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10分钟，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。

4.2位点叠加实验

先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数(方法同4.1)。计算两株抗体叠加率AI，AI>50％说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50％说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI＝[2×A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)×100％

A1—第一株抗体读数

A2—第二株抗体读数

A(1+2)—叠加2种抗体读数

表2：抗体抗原表位叠加实验

实验结果见表2，1G8与1A8、3C8三株纳米抗体分别针对HE4抗原不同的抗原表位，这预示着在HE4的检测应用上，该三株纳米抗体组成检测抗体对的几率大大增加，从而可以增大检测效率。

实施例5.利用Biacore分析纳米抗体结合位点

Biacore系统主要原理就是通过表面分子的浓度改变使SPR(折射率)发生偏移，在监测器上表现为RU值的变化。由于该系统的灵敏度更高，我们设计了相关实验来验证ELISA叠加的实验结果。如图8所示，首先重复进2针第一个纳米抗体A，观察RU值的变化，以确认相应的抗原结合位点的饱和并记录；之后进入第二个纳米抗体B，观察并记录RU值：如该RU值比单一的纳米抗体B的RU值相差不超过20％，即可认为两者识别不同的抗原决定簇；如相差值超过20％但低于60％，认为两者有位阻效应；若相差值超过了60％，判定两者识别了同一抗原。具体操作为首先单纯进样抗体B记录RU增加值R_B1，并对芯片再生；之后重复进两次抗体A，记录RU增加值R_A，并确认饱和后，直接进样抗体B，观察RU值的增加量R_B2；之后使用公式(R_B2-R_A)/R_B1来计算位阻率，以此判定二者是否识别同一抗原决定簇。该实施例结果见表3。可见1G8纳米抗体与1A8、3C8纳米抗体均识别不同抗原位点，该结果与ELISA叠加实验推测的结果一致。更加验证了该三株纳米抗体在HE4检测领域的应用前景。

表3：Biacore检测纳米抗体叠加实验RU值变化表

实施例6.1G8-HAP在检测标准血清中的HE4含量中的应用

以人碱性磷酸酶的结合位点序列作为化学发光区氨基酸序列，如SEQ ID NO:7所示。使之通过柔性多肽与1G8纳米抗体相融合成为带有化学发光区序列的纳米抗体1G8-HAP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。在所述核苷酸编码序列的两个末端添加有HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点，以该两个酶切位点连接到载体pCDNA3.1(+)上。无内毒素大提质粒后利用状态处于对数生长的293细胞进行转染。获得转染的细胞培养至36小时后将细胞培养液倒入50ml离心管中，12000g离心5分钟，收集上清，用0.22μm滤膜过滤，利用阴离子交换层析对培养上清进行纯化。利用实施例3相同的方法对1G8-HAP进行亲和力测试，结果1G8-HAP的亲和力数值为2.945E-9。经过筛选配对，结果见表4所示。选取FC融合纳米抗体3C8为捕获一抗(融合方法见CN106749667A中的实施例5)，其可变区序列含有如SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列所示，1G8-HAP为酶标二抗进行双抗体夹心免疫法检测血清标本中的HE4抗原，获得了优异的检测效果，具体过程如下：

使用无菌CBS稀释捕获抗体至终浓度为10μg/ml；按照每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃静置18小时；弃上清后，每孔加入300μl洗涤液，水平震动3分钟，吸弃上清；重复洗板四次。每孔加入200μl 1％BSA，于37℃静置1小时。重复洗板四次；每孔中加入50μl阳性对照、阴性对照或者待测样本；随即每孔加入50μl新鲜稀释的酶标二抗(即纳米抗体1G8-HAP，稀释至工作浓度为2μg/ml)，置于摇床上摇动3～5秒；37℃下温育1小时。重复洗板四次，每孔加入100μl AP化学发光显色液(BM Chemiluminescence ELISA Substrate)，在摇床上摇动3～5秒；室温避光孵育10分钟；选择酶标仪程序Luminescence，测定各孔的Lum值并计算质控血清HE4值。结果3C8与1G8纳米抗体对线性指数R²＞0.99。

表4：纳米抗体1G8与3C8、1A8两株纳米抗体配对检测血清中HE4含量曲线线性指数结果

捕获抗体	检测抗体	线性指数(R<sup>2</sup>)
			3C8	1G8-HAP	0.9948
1A8	1G8-HAP	0.7635

本实施例显示，1G8与3C8配对使用，优于与1A8配对使用，1G8与3C8配对检测HE4的线性指数趋近于1，取得了优异的检测效果，显示其与纳米抗体3C8在抗原识别表位上具有较低的重叠性，该特性得以保证本发明提供的纳米抗体于作为酶标二抗与特异性适配的捕获一抗应用于双抗夹心免疫法检测HE4的方法中。

序列表

<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司

<120> 一种抗HE4的纳米抗体1G8及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 1

Gly Arg Thr Leu Asp Arg Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 2

Ile Ser Met Ser Gly Thr Met Thr

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 3

Ala Ala Gly Gly Arg Arg Gly Trp Gly Arg Ala Leu Phe Ala Tyr Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 4

Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Thr Gly Gly Ser Leu

1 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Ile

20 25 30

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala

35 40 45

Ile Ser Met Ser Gly Thr Met Thr Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys Ala Ala

85 90 95

Gly Gly Arg Arg Gly Trp Gly Arg Ala Leu Phe Ala Tyr Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 366

<212> DNA

<213> Lama pacos

<400> 5

cagctgcagg agtctggggg aggcttggcg cagactgggg ggtctctgag actctcctgt 60

gtggcgtctg gacggacttt ggatcgctat gccataggct ggttccggca ggctccagga 120

aaggagcgtg agtttgtagc agctattagc atgagtggta ctatgacaga ctatacagac 180

tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaacgcca agaacacggt gtatctgcaa 240

atgaacagcc tgaaacctga cgacacggcc gtttattgct gtgcagccgg gggtcgccgg 300

ggttggggtc gagcgctatt tgcgtatgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 6

<211> 118

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 6

Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Val

1 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Arg Tyr His Met

20 25 30

Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala

35 40 45

Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Pro

85 90 95

Thr Tyr Gly Asn Tyr Trp His Pro Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 484

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala

1 5 10 15

Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala

20 25 30

Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr

35 40 45

Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly

50 55 60

Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser

65 70 75 80

Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu

100 105 110

Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu

115 120 125

Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly

130 135 140

Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr

145 150 155 160

Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala

165 170 175

Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser

180 185 190

Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe

195 200 205

Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly

210 215 220

Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys

225 230 235 240

Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala

245 250 255

Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly

260 265 270

Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu

275 280 285

Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro Arg

290 295 300

Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His

305 310 315 320

Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp

325 330 335

Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser

340 345 350

Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro

355 360 365

Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp

370 375 380

Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val

385 390 395 400

Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser

405 410 415

Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr His

420 425 430

Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu

435 440 445

Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe

450 455 460

Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala

465 470 475 480

Gly Thr Thr Asp

<210> 8

<211> 621

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Thr Gly Gly Ser Leu

1 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Ile

20 25 30

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala

35 40 45

Ile Ser Met Ser Gly Thr Met Thr Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys Ala Ala

85 90 95

Gly Gly Arg Arg Gly Trp Gly Arg Ala Leu Phe Ala Tyr Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu

130 135 140

Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala

145 150 155 160

Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe

165 170 175

Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu

180 185 190

Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met

195 200 205

Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys

210 215 220

His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val

225 230 235 240

Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn

245 250 255

Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg

260 265 270

Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val

275 280 285

Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn

290 295 300

Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys

305 310 315 320

Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile

325 330 335

Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro

340 345 350

Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys

355 360 365

Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val

370 375 380

Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr

385 390 395 400

His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His

405 410 415

Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala

420 425 430

Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu

435 440 445

Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala

450 455 460

Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln

465 470 475 480

Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser

485 490 495

His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe

500 505 510

Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu

515 520 525

Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro

530 535 540

Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser

545 550 555 560

Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val

565 570 575

Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln

580 585 590

Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr

595 600 605

Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp

610 615 620

Claims (10)

1.一种抗HE4的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ IDNO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ IDNO.4所述氨基酸序列组成。

3.一种含有权利要求1或2所述纳米抗体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还含有化学发光区功能性蛋白。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述化学发光区功能性蛋白为碱性磷酸酶蛋白。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述化学发光区功能性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

6.一种编码权利要求2所述纳米抗体序列的核酸，其特征在于，所述编码序列由SEQ IDNO.5所示。

7.一种含有权利要求6所述的核酸的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pMES4。

8.一种含有权利要求7所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

9.权利要求1-2任一所述的纳米抗体在制备免疫法检测HE4试剂盒中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫法为双抗体夹心法，其中第一抗体为可变区序列由SEQ ID NO.6所示的纳米抗体，第二抗体为权利要求1-2任一所述的纳米抗体。

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