TW201629099A

TW201629099A - 針對Fcγ受體IIB及Fcε受體的新穎抗體

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Publication number: TW201629099A
Application number: TW104126455A
Authority: TW
Inventors: 卡爾安娜; 迪恩貝格爾卡羅琳; 松德爾曼彼得; 穆勒瑪蒂娜; 里特尼可; 波爾托馬斯
Original assignee: 蘇伯利莫爾有限公司
Priority date: 2014-08-13
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2016-08-16
Also published as: CA2957850A1; IL250569B; CO2017001384A2; IL250569A0; SG11201701028SA; AU2015303142B2; EP3180358B1; EP3180358A1; CN106795223B; CL2017000360A1; WO2016023985A1; KR102424169B1; AR101555A1; BR112017002755A2; AU2015303142A1; CN106795223A; MY180940A; EA201790314A1; BR112017002755B1; JP2017529832A

Abstract

本文揭露一種識別分子，其以第一結合域與Fcε受體(FcεR)結合，以第二結合域與Fcγ受體IIB(FcγRIIB)結合，以及此種識別分子的用途。

Description

針對Fcγ受體IIB及Fcε受體的新穎抗體

抗體與抗原結合，透過阻止抗原與其內生標的結合(例如，受體或配體)或是透過誘導效應反應(effector responses)而導致抗原之移除，來中和該抗原。為了有效地移除及/或破壞對身體而言為外源的抗原，抗體應當同時展現出對其抗原的高親和力以及有效的效應功能。具有多重特異性的抗體(諸如，舉例而言，雙特異性抗體)對於調節多種抗原的互補或協同反應是有用的。

抗體效應功能係由抗體Fc區調節。效應功能可分為二類：(1)在抗體與抗原結合之後運作的效應功能(這些功能包含補體級聯反應或Fc受體(FcR)-承載細胞的參與)；以及(2)獨立於抗原結合而運作的效應功能(這些功能賦予抗體在循環中的持久性及其透過胞吞運送作用被移轉跨過細胞屏障的能力)。因為Fc受體透過與該受體的同源抗體的Fc區結合來調節抗體效應功能，Fc受體依據其對免疫球蛋白同種型的特異性而被定義為：對IgG抗體Fc受體專一的被稱為FcγR；對IgE抗體Fc受體專一的為FcεR；對IgA抗體Fc受體專一的為FcαR，等等。

已經確認出FcγR的三個子類：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)，以及FcγRIII(CD16)。FcγRIIB的特徵是在細胞質域中存在一個ITIM基序(保守序列：V/I-X-Y-X₂-V/L，Isakov(1997年)，Immunol Res.期刊，第16卷，第85-100頁)，其係由激酶Lyn與Ig-聚集體或ICs結合時，以及與ITAM-承載活化性Fcγ受體共同連接來磷酸化。磷酸化的ITIM吸引肌醇多磷酸5'-磷酸酶(inositol polyphosphate 5’-phosphatase，SHIP)的SH2-區，其依序水解磷酸肌醇傳訊者釋放為含有ITAM的FcγR-調節的酪胺酸激酶活化作用的結果，從而防止細胞內Ca²⁺的內流。FcγRIIB的交聯抑制了對FcγR連接的活化反應，從而抑制了B細胞活化作用、增殖以及抗體分泌。

Fcε受體(Fc epsilon receptors，FcεRs)被發現於肥大細胞與嗜鹼性球的表面，以及在人類的嗜酸性球、單核細胞、巨噬細胞與血小板上也被發現。有二種Fcε受體，FcεRI(第1型Fcε受體)，是一種高親和性的IgE受體，以及FcεRII(第2型Fcε受體)，亦稱為CD23，是一種低親和性的IgE受體。IgE可以向上調控這兩型Fcε受體的表現。

免疫球蛋白E(IgE)是一類抗體(或稱為免疫球蛋白(Ig)「同型」)，其已被發現只存在於哺乳動物中。IgE是由二條重鏈(ε鏈)以及二條輕鏈所組成的單體，該ε鏈含有4個類Ig的恆定區(Cε1-Cε4)。IgE在第一型過敏反應中亦扮演重要的角色(GouldH等人，(2003年)，Annu.Rev.Immunol.期刊，第21卷：第579-628頁)，其展現出不同的過敏性疾病，例如過敏性氣喘、多數類型的鼻竇炎、過敏性鼻炎、食物過敏，以及某些類型的慢性蕁麻疹與異位性皮膚炎。IgE也在過敏狀況下扮演重要的角色，例如對某些藥物的過敏反應、蜜蜂叮咬、以及用於特定去除過敏的免疫療法中的抗原製備。

IgE透過與在肥大細胞及嗜鹼性球的表面被發現的FcεRs結合來啟動IgE-介導的過敏反應。抗原與已經由在肥大細胞上的FcεRI結合的IgE結合會導致該結合的IgE與底層FcεRI的聚集的交聯作用，導致調節子的脫粒作用以及從該細胞中釋放出來。嗜鹼性球，在其表面IgE與抗原交聯時，釋放了第二型類細胞激素介白素-4(interleukin-4，IL-4)以及介白素-13(interleukin-13，IL-13)與其他發炎介質。低親和力受體(FcεRII)永遠在B細胞上表現，但其表現可藉由IL-4在巨噬細胞、嗜酸性求、血小板，以及某些T細胞的表面上被誘導。

肥大細胞與嗜鹼性球是重要的免疫調節細胞，且在需IgE的過敏反應以及在許多其他急性或慢性發炎過程中擔任中心作用細胞。這些細胞類型對IgG以及IgE都有受體。在過敏作用細胞例如肥大細胞與嗜鹼性球上對IgE高親和力受體的活化(Fc epsilon RI)經由免疫受體酪胺酸-為基礎的活化模組(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs)誘導了多重陽性訊號，其導致過敏發炎反應的快速表現。作為抗衡，IgG受體Fc γ RIIB的共同聚集經由免疫受體酪胺酸-為基礎的抑制模組(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs，ITIMs)調節了抑制訊號。

在Fc受體表現與訊號傳遞的正向與負向調節的進步已經闡明了Fc受體在免疫系統中的角色，顯示其為雙功能的，抑制及活化結構。根據這些發現，已經發展出新的治療策略，例如使用嵌合融合蛋白，其伴隨活化Fc ε RI以及Fc γ RIIB。這些新的方法利用Fc受體的雙價特性，並為調節過敏免疫反應的創新策略鋪路。這樣的嵌合融合蛋白的一個例子被揭露於PCT專利申請案公開號WO 2002/088317中。

然而，不論在先前技術中有更多這樣的嵌合融合蛋白被知悉的事實，亦可參見PCT專利申請案公開號WO 2006/028956，仍然高度需要提供改進嵌合融合蛋白，其行使至少二種功能-一為與Fcε受體結合，二為與FcγRIIB結合，從而共同聚集這二種受體。

本發明透過提供本文以下所描述的識別分子來滿足這個需求，其特徵在於申請專利範圍中，且藉由所附之實施例以及圖式來說明。

已知IgE受體與IgG受體(FcγRIIb)聚集在嗜鹼性球或肥大細胞上抑制過敏誘導的細胞去顆粒反應(Daeron(1997年)，Int.Arch.Allergy Immunol.期刊，第113卷，第138-141頁)，本案發明人提供了識別分子，其不僅交聯或共同聚集這二種受體，帶有抑制IgE介導的肥大細胞與嗜鹼性球的活化之目的，還提升了FcγRIIB的負向調節功能，帶有促進治療與嗜鹼性球及/或肥大細胞有關的疾病之目的，例如過敏性疾病。如本文以上所述，IgE的高親和力受體(Fc epsilon RI)在過敏作用細胞例如肥大細胞與嗜鹼性球上的活化，導致過敏發炎反應的快速表現。作為抗衡，IgG受體Fc γ RIIB的共同聚集經由免疫受體酪胺酸-為基礎的抑制模組(ITIMs)調節了抑制訊號。本發明因此假設，不受理論的束縛，提升/加強已知受Fc γ RIIB與Fc ε受體的共同聚集影響的Fc γ RIIB的ITIM磷酸化(參閱Zhu等人(2002年)，Nat.Med.期刊，第8卷第5期，第518-521頁)可有益於在抗衡或甚至克服Fc ε受體與IgE結合時的活化作用，其造成預成形的調節子的釋放以及稍後活化白三烯與化學激素的合成，這些都有助於例如過敏性疾病。

心中有了這樣的目標，令本案發明人吃驚的是，他們觀察到識別分子，具體而言是由本發明所提供的抗體，顯著地增加FcγRIIB的ITIM磷酸化以及，因此推測提升了已經由FcγRIIB與Fc ε受體的共同聚集所達到的抑制訊號，因此其理想地克服了由Fc ε受體與IgE結合時驅動的活化訊號。因此，識別分子，具體而言是本文所揭露的抗體提供了二個有利的功能-他們交聯了FcγRIIB與Fc ε受體，而導致ITIM磷酸化，以及因此抑制了Fc ε受體的訊號傳遞，且其提升了FcγRIIB這樣的ITIM磷酸化，透過他們與該受體的結合，該受體再一次的抑制Fc ε受體在嗜鹼性球與肥大細胞中的訊號傳遞。因此識別分子行使了雙重效果，在於本文揭露的特定抗體對於FcγRIIB介導的訊號傳遞在大量造成與肥大細胞及/或嗜鹼性球相關疾病的細胞中。利用這個在嗜鹼性球與肥大細胞中FcγRIIB抑制訊號傳遞，本發明提供識別分子，具體而言是抗體，其係與例如先前技術中已知的直接抗FcγRIIB的抗體比較，令人驚訝地在ITIM磷酸化上顯現出強出許多的效果，這是未被預期的。因為這幫助了在肥大細胞及/或嗜鹼性球中抑制的訊號傳遞，以抑制肥大細胞及嗜鹼性球的IgE-調節的活化作用，這二者在例如過敏性疾病的開始與表現中都扮演主要的角色，所以這樣較強的效果是有利的。

如圖30所示，本文所揭露之一種抗FcγRIIB受體-IgE抗體的確能夠在嗜酸性球被花粉活化之後減少活化的嗜酸性球的數目(55.1%)到達相應於未處理的嗜酸性球的含量(10.6%比較未處理的嗜酸性球的9.5%)。這顯示了這樣的抗體對涉及例如，過敏性疾病，細胞的負調節的潛力，一旦這些細胞已經被一個過敏原透過將IgE與該過敏原結合而活化，且其Fc區與Fc ε受體結合。嗜酸性球與肥大細胞及/或嗜鹼性球都與過敏性疾病有關。據此，本案發明人假設提升/加強已知受Fc γ RIIB與Fc ε受體的共同聚集影響的Fc γ RIIB的ITIM磷酸化(參閱Zhu等人(2002年)，Nat.Med.期刊，第8卷第5期，第518-521頁)可有益於在抗衡或甚至克服Fc ε受體與IgE結合時的活化作用，似乎確實可以對抗，例如過敏性疾病。

從先前技術中與FcγRIIB結合的識別分子，具體而言是如本文所公開的抗體的識別分子，多胜肽的有利性質無法被預期或預見，更別說有合理的期待可以成功地提供他們，具體而言是本文所表徵的抗體的CDR或變異重鏈及/或輕鏈。除了這種改進的特性之外，本文所描述的識別分子也有利地對人類FcγRIIB具有高特異性及/或是非阻斷的，即，其通過它們的變異區與Fc受體結合，並不會干擾免疫複合物(immune complexes，ICs)與細胞的結合或IgG聚集到細胞上。

有利的是，一個識別分子，如本文所公開的抗體，以「順式」結合到表現Fc ε受體(Fcε)與Fc γ受體IIB(FcγRIIB)的細胞上，即該識別分子在相同的細胞上結合FcεR與FcγRIIB，其中這樣的細胞表現FcεR與FcγRIIB。識別分子的此一特性可以根據實施例5中所述的嗜鹼性球活化試驗，而容易地進行測試，除了沒有抗原被加到肝素化的全血之外。簡言之，將肝素化的全血與本文所揭露的識別分子接觸。隨後，將全血與在全血中的嗜鹼性球細胞上的CD63分子結合的偵測抗體一起培養，其中該偵測抗體的特徵在於可偵測的標記，例如螢光標記，以及以例如FACS技術(螢光活化細胞分選)的方法測量表現CD63的細胞數目高於閾值。閾值水平可基於被肝素化的全血而確定，該全血不接觸該識別分子(其對應於一對照組)。如果細胞表現的CD63未達到閾值以上的水平，該識別分子優先以順式結合，而當CD63表現高於閾值水平則表示識別分子以反式與細胞結合，即識別分子在第一細胞上與FcεR結合，在第二細胞上與FcγRIIB結合，或是第一細胞上與FcγRIiB結合，在第二細胞上與FcεR結合。然而，正如所述，在本發明的上下文中，順式結合的識別分子是較佳的。

據此，本發明提供了以一第一結合域與該Fcε受體(FcεR)結合，且以一第二結合域與該Fcγ受體IIB(FcγRIIB)結合的識別分子。

本發明之識別分子被視為與身體上的自己的致病IgE抗體競爭經由其Fc部分與Fcε受體RI(FcεRI)的結合，並同時共交聯FcεRI與FcγRIIB。這種作用模式被認為防止仲介蛋白從獨立於結合的IgE的過敏原特異性的肥大細胞及/或嗜鹼性球釋放出來。這種機制已經由本案發明人描繪出特徵，例如，通過使用從異位的供體而來的表現FcεRI的嗜鹼性球(即具有傾向發展過敏免疫反應以回應過敏原的供體)。與在所附實施例中的對照組相比，以本文所公開的識別分子治療上述異位的供體的過敏原挑戰嗜鹼性球，顯示出活性顯著地減少。

在用於本文時「識別分子」是一種多胜肽，其包含一個或多個結合域，帶有與Fcε受體(FcεR)結合的第一結合域，以及與Fcγ受體IIB(FcγRIIB)結合的第二結合域。識別分子提供用於該一個或多個結合域的支架，使得該結合域可以結合/與給定目標結構/抗原/抗原決定位相互作用的。例如，這種支架可通過蛋白A提供，具體而言是其Z-結構域(親和體)、ImmE7(免疫蛋白)、BPTI/APPI(Kunitz結構域)、Ras結合蛋白AF-6(PDZ結構域)、蠍毒素(蠍毒素)、CTLA-4、Min-23(打結素)、脂質運載蛋白(Anticalin)、新抑癌素蛋白(neokarzinostatin)、纖連蛋白結構域、錨蛋白保守重複結構域，或硫氧還蛋白(Skerra，Curr.Opin.Biotechnol.期刊，第18卷，第295-304頁(2005年)；Hosse等人，Protein Sci.期刊，第15卷，第14-27頁(2006年)；Nicaise等，Protein Sci.期刊，第13卷，第1882至1891頁(2004年)；Nygren與Uhlen，Curr.Opin.Struc.Biol.期刊，第7卷，第463-469頁(1997年))。較佳的識別分子為一抗體。

本發明的識別分子的結合域可經由連接子連接。該連接子可以是胜肽連接子。該連接子可包含(或由以下組成)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個胺基酸。胜肽連接子的較佳實施例是(G₄S)_n，且n是在1至5的範圍內的間隔；(AP)₂；(AP)₄；(AP)_5-7。

「結合域」乙詞特徵與本發明的結構域有關，其能夠特異性結合/與分別在其目標分子FcεR與FcγRIIB上給定的目標抗原決定位或給定的目標位置相互作用。結合域可以衍生自一個結合域供體像是例如自抗體或從任何上述支架而來。

「結合域」乙詞在用於本文時包括一個結合域可以主動地結合一目標或可被動地被例如，一受體所結合。據此，在本發明的意義上結合域分子可以是一個受體的配體，如Fc受體。

識別分子的較佳結合域是Fab區的至少一部分。當「Fab區」用於本文包含(a)重鏈及/或輕鏈變異區或CDR及/或(a)來自重鏈及/或輕鏈變異區的框架區域。因此，較佳為(a)變異區，例如重鏈及/或輕鏈變異區，或CDR及/或(a)重鏈及/或輕鏈變異區的框架區係由如本文所述之結合域所包含。因此，一個識別分子較佳包含作為第一與第二結合域的Fab區，較佳為(a)變異區，例如重鏈及/或輕鏈變異區，或CDR及/或(a)重鏈及/或輕鏈變異區的框架區。

另一個稱為識別分子的結合域是IgG或IgE抗體的恆定區(或結構域)(Fc區)或其部分。當一Fc區的「部分」用於本文時，較佳為由其同源Fc受體例如該Fcε受體或Fcγ IIB受體所結合的長度。

因此，較佳的識別分子較佳地包含作為第一和第二結合域的IgG或IgE抗體的Fc區或其部分，其部分分別是由Fcγ IIB受體或Fcε受體所結合。

亦為較佳的是，本發明之識別分子包含作為第一結合域的Fab區，較佳為變異區例如重鏈及/或輕鏈變異區，或CDRs及/或重鏈及/或輕鏈變異區的框架區，其結合至Fc ε受體，以及作為第二結合域的IgG的Fc區或其部分，其係被Fcγ IIB受體所結合。

更為較佳的是，本發明之識別分子包含作為第一結合域的IgE的Fc區或其部分，其係被Fc ε受體結合，以及作為第二結合域的Fab區，較佳為變異區，例如一個重鏈及/或輕鏈變異區，或CDRs及/或重鏈及/或輕鏈變異區的框架區，其結合於Fcγ IIB受體。

「抗原決定位」乙詞係指一個抗原上位點，其係與一結合域特異性結合。「抗原決定位」具有抗原性，因此，該術語抗原決定位有時也在本文中稱為「抗原結構」或「抗原決定簇」。因此，結合域是「抗原交互作用位點」。該結合/交互作用還被理解為定義一個「特異性識別」。在本發明的意義上的較佳的抗原決定位分別位於所述的Fc ε受體與Fcγ IIB受體之內。較佳地，這樣的抗原決定位位於在任何這兩個Fc受體的細胞外部分。

「抗原決定位」可以由鄰近的胺基酸或非鄰近的胺基酸透過蛋白質的三級折疊而並列所形成。「線性抗原決定位」是一種抗原決定位，其中的胺基酸一級序列包含已識別的抗原決定位。線性抗原決定位通常在一個獨特的序列中包括至少3，或至少4，更通常，至少5，或至少6，或至少7，例如，約8至約10個胺基酸。

相較於線性抗原決定位，「構象抗原決定位」是一種抗原決定位，其中包含抗原決定位的胺基酸一級序列並不是識別的抗原決定位的唯一限定組成份(例如，一抗原決定位的胺基酸一級序列並不是必須由結構域識別)。通常一個構象抗原決定位包含相對於線性抗原決定位的胺基酸的數量增加。關於識別構象抗原決定位，該結合域識別該抗原的三維結構，較佳為一胜肽或蛋白或其片段。例如，當蛋白質分子折疊以形成一個三維結構，某些形成構象抗原決定位的胺基酸及/或多胜肽骨架變成並列，使抗體能夠識別的三維抗原決定位僅存在於該三維結構中。確定抗原決定位的構象的方法包括，但不限於，x射線晶體學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜和定點自旋標記與電子順磁共振(EPR)光譜。

識別分子的結合域，具體而言是本發明的抗體有利地分別與FcεR和FcγRIIB特異性結合。「(能夠)結合的」、「特異性識別」、「涉及」以及「與反應」等詞是指依照本發明，一個結合域是能夠與一個抗原決定位的一個或多個，如至少兩個、至少三個，或至少四個胺基酸特異性相互作用。

「Fcγ受體IIB」乙詞用於本文中可與「FcgRIIB」或「Fcγ受體IIB」或「Fcγ受體IIB」或「FcγRIIB」互換使用，並且包含膜的FcγRIIB以及可溶性FcγRIIB(即FcγIIB受體的胞外部分)。該術語還包括FcγRIIB的變體，例如FcγRIIB1與FcγRIIB2，其在FcγRIIB1的胞質結構域中插入與彼此不同的19個胺基酸序列。另一種變體包含FcγRIIB3，其與FcγRIIB2相同，但缺少推定的訊號胜肽切割位點的資訊。有時，FcγRIIB在本文中也稱為「CD32B」。因此，這個術語以及其他用於指稱上述的Fcγ受體IIB的術語，可與「CD32B」乙詞互換地使用。Fcγ受體IIB屬於免疫球蛋白超級家族，並在許多造血譜系中被發現。正如其名稱所表明的，Fc受體IIB識別並結合於抗體的Fc(片段，可結晶)部分，即對應於該抗體的兩條重鏈的兩個C端結構域，並且通常與作用分子和細胞相互作用的片段。較佳的FcγRIIB如SEQ ID NO.5所示。一種較佳的可溶性FcγRIIB如SEQ ID NO.12所示。

「可溶性FcγRIIB」也被稱為「sFcγRIIB」。如本文所用，「可溶性Fcγ受體IIB」乙詞及類似的術語是指Fcγ受體IIB的胞外部分。該部分可以溶解在液體中。在一般情況下，可溶形式的任何的FcγR類、同種型或等位基因可以在前面加上「s」以被識別，例如sCD32或sFcγRII指可溶的FcγRII受體。通常，相對於膜的(即，與膜結合的)的FcγR，可溶性FcγR不包含跨膜區或細胞質內的尾巴。

較佳地，所揭露的FcγRIIB為人類來源的或人類的FcγRIIB。「人類來源的」乙詞是以其最廣泛的意義進行解釋。在一般情況下，這意味著在胺基酸序列及/或結構方面，一個FcγR(或其一個區域或片段)類似或相似於人類的FcγR(即在人體中發現的蛋白質)。

可替代地，「人類來源的」的FcγRIIB可以是通過在宿主細胞中表現重組核酸而獲得的重組FcγRIIB，例如，如Sondermann與Jacob(1999年)，Biol.Chem.期刊，第380卷第6期，第717-721頁所述。簡言之，從生物體獲得並引入目標基因插入載體，如質體或病毒，然後將基因轉移到一宿主細胞中，該宿主細胞表現該重組基因並產生一個重組蛋白質產物。本領域技術人員將容易地知道，要選擇哪個宿主細胞以獲得一個FcγRIIB，該FcγRIIB是例如適合用於醫藥組合物的製備。例如，在一些具體實施例中，可得到非糖基化的FcγRIIB。本領域技術人員可以選擇一個原核宿主細胞以表現FcγRIIB，該FcγRIIB缺乏蛋白糖基化所必需的酵素機制。在一具體實施例中，該FcγRIIB可以在原核生物中表現，且隨後根據PCT專利申請公開號WO 00/32767的描述純化與重新折疊。

在另一個具體實施例中，FcγRIIB也可以在真核表現系統中產生。合適的系統包括真核細胞(例如，B細胞)以及用於生產細胞外蛋白質的專門裝置。其他可能的真核表現系統包括，但不限於，CHO或HEK細胞。因此，該可溶性FcγRIIB是重組的、可溶性和糖基化的FcγRIIB。

FcγRIIB如本文中所提還包括FcγRIIB，相較於野生型的FcγR，其為已修改或改變胺基酸序列，並且包括，例如，附加的糖基化位點或類似者。然而，FcγRIIB的非糖基化形式也是可以預見的，並是一個有用的FcγRIIBs的具體實施例。

為了本發明之目的，FcεR包括了FcεRI與FcεRII。本發明還使用的是如「FcεR」或「Fcε受體」乙詞，其全部指的是結合IgE的一恆定區或其部分的受體。所有這些術語因此可以互換使用。

本發明的識別分子的一個較佳的第一和第二結合域係衍生自一抗體，較佳地該第一及/或第二結合域是抗體的一部分，例如Fab區、重鏈及/或輕鏈變異區，或來自一抗體的重鏈及/或輕鏈變異區的CDR及/或框架。

可替代較佳的是，本發明的識別分子的結合域可以是一個恆定區(恆定結構域)，或者至少其一部分是由一個Fc受體所結合，例如Fcε受體或Fcγ受體IIB。因此，在一個較佳具體實施例中，無論是第一和第二結合域可以是一個抗體的恆定區或至少是其一部分，例如被一個Fc受體，例如Fcε受體或Fcγ受體，結合的IgG的Fc區或IgE的Fc區。據此，第一結合域較佳的可為Fcε受體結合的IgE的Fc區或其部分。第二結合域較佳可為被FcγRIII受體結合的IgG的Fc區或其部分。

或者，該第一結合域較佳地可為結合於Fcε受體的一個抗體的至少一部份，且該第二結合域可以是被FcγIIB受體結合的一個IgG恆定區的至少一部分或其部份。這種分子是有用的識別分子，並且被認為是在本文中公開的抗體，即，它具有變異區和一個恆定區，例如作為IgG的Fc區。

同樣地，該第一結合域較佳地可為由Fc ε受體結合的一個IgE恆定區的至少一部份或其部分，且該第二結合域可為結合於FcγIIB受體的一個抗體的至少一部份。這種分子是有用的識別分子，並且是在本文所公開的一個具體實施例中的抗體，即，它具有變異區和一個恆定區，如IgE的Fc區。

在某些情況下，如本文所述的識別分子的第二結合域(結合於FcγIIB受體)是Fab區的一部分，較佳地，它包含在其重鏈變異區的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，如SEQ ID NO.29、30和31所示，並在其輕鏈變異區的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，如SEQ ID NO.32、33和34所示，其中的識別分子，較佳具有如前定義的第二結合域的抗體，相較於未以該識別分子處理的Daudi細胞，其增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4~10倍。由圖7明顯可知，先前技術的抗體GB3(參見PCT專利申請案公開號WO2005/051999)和2B6(參見PCT專利申請案公開號WO2004/016750)不能增加FcγRIIB的ITIM磷酸化，而該磷酸化可被一個識別分子，較佳地為本文所揭露的一抗體，所增加，例如8A6-或作為嵌合的或人源化的8A6抗體。有無能力增加FcγRIIB的ITIM磷酸化似乎因此是依賴於CDR的，具體而言是在於存在於8A6，但分別不存在於GB3及/或2B6，的某些關鍵的胺基酸殘基。因此，只存在於8A6的CDR的胺基酸在對應於2B6或GB3的CDR的各個位置的位置可被視為是「關鍵殘基」。

針對來自2B6、GB3和8A6的CDR的關鍵殘基的視覺比較顯示，在H-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO.29所示，在H-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO.30所示，在H-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO.31所示，在L-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO.32所示，在L-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO.33所示，在L-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO.34所示，是有益的存在。

8A6、GB3和2B6的CDR的胺基酸序列之間的差異也可以同一性來表示(以%-同一性)，當使用8A6的CDR作為參考序列時，其允許在本文所揭露的一個抗體的CDR。因此，本發明的第二結合域的一種H-CDR1較佳特徵為對如SEQ ID NO.20所示的H-CDR1具有60%或更多，如70%、80%或90%的同一性。

在某些具體實施例中，本文所公開的第二結合域的H-CDR2的特徵是對如SEQ ID NO.21所示的H-CDR2具有36%或更多，如40%、50%、60%、70%、80%，或90%同一性。

在某些具體實施例中，本文所公開的第二結合域的H-CDR3的特徵是對如SEQ ID NO.22所示的H-CDR3具有50%或更多，如60%、70%、80%，或90%同一性。

在某些具體實施例中，本文所公開的第二結合域的L-CDR1的特徵是對如SEQ ID NO.23所示的L-CDR1具有64%或更多，如70%、80%，或90%同一性。

在某些具體實施例中，本文所公開的第二結合域的L-CDR2的特徵是對如SEQ ID NO.24所示的L-CDR2具有29%或更多，如30%、40%、50%、60%、70%、80%，或90%同一性。

在某些具體實施例中，本文所公開的第二結合域的L-CDR3的特徵是對如SEQ ID NO.25所示的L-CDR3具有78%或更多，如80%，或90%同一性。

據此，本發明在某些具體實施例中提供了具有第二結合域的識別分子(結合於FcγIIB受體)，在其重鏈變異區，其包含了一個H-CDR1序列，其與SEQ ID NO.20所示之H-CDR1序列具有60%或更高的同一性，一個H-CDR2序列，其與SEQ ID NO.21所示之H-CDR2序列具有36%或更高的同一性，一個H-CDR3序列，其與SEQ ID NO.22所示之H-CDR3序列具有50%或更高的同一性，一個L-CDR1序列，其與SEQ ID NO.23所示之L-CDR1序列具有64%或更高的同一性，一個L-CDR2序列，其與SEQ ID NO.24所示之L-CDR2序列具有29%或更高的同一性，和一個L-CDR3序列，其與SEQ ID NO.25所示之L-CDR3序列具有78%或更高的同一性。

在一些具體實施例中，識別分子，如抗體，在其重鏈和輕鏈變異區中仍然包含其第二結合域的CDR，如在SEQ ID NO.29、30、31所定義的(H-CDR)以及如在SEQ ID NO.32、33和34所定義的(L-CDR)「關鍵殘基」。

與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，帶有這樣的第二結合域的識別分子增加了Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。

如本文所用，「%同一性」乙詞指的是當以最佳化序列比對，例如以可得自www.clustal.org的ClustalW或X techniques或等效技術比較二個胺基酸序列時，在該序列中相應位置的相同的胺基酸殘基的百分比。例如，以CDR比對為例，如SEQ ID NO.20-25所示的每個CDR(分別來自重鏈和輕鏈變異區)分別作為一個目標重鏈或輕鏈變異區的CDR序列的參考序列，例如，SEQ ID NO.20的H-CDR1與目標H-CDR1比對。據此，兩個序列(參考序列與目標序列)被比對，兩個序列之間相同的胺基酸殘基被識別，且相同胺基酸的總數分別除以SEQ ID NO.20、21、22、23、24或25的胺基酸總數(胺基酸長度)，視H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2，或L-CDR3哪個序列被比對而定。這種劃分的結果是一個百分比值，即百分比辨識值/度。使用相同的程序來比較二個變異區的辨識程度，比照辦理。

如SEQ ID NO.14與20所示的H-CDR1序列是如SEQ ID NO.29所示的H-CDR1的示例性物種的序列。

如SEQ ID NO.15與21所示的H-CDR2序列是如SEQ ID NO.30所示的H-CDR2的示例性物種的序列。

如SEQ ID NO.16與22所示的H-CDR3序列是如SEQ ID NO.31所示的H-CDR3的示例性物種的序列。

如SEQ ID NO.17與23所示的L-CDR1序列是如SEQ ID NO.32所示的L-CDR1的示例性物種的序列。

如SEQ ID NO.18與24所示的L-CDR2序列是如SEQ ID NO.33所示的L-CDR2的示例性物種的序列。

如SEQ ID NO.19與25所示的L-CDR3序列是如SEQ ID NO.34所示的L-CDR3的示例性物種的序列。

據此，本文所提供是帶有第二結合域的識別分子(結合至FcγIIB受體)，其(a)在其重鏈變異區中包含如SEQ ID NOs.14、15與16所示的H-CDR1、H-CDR2與H-CDR3，以及在其輕鏈變異區中包含如SEQ ID NOs.17、18與19所示的L-CDR1、L-CDR2與L-CDR3；或(b)在其重鏈變異區中包含如SEQ ID NOs.20、21與22所示的H-CDR1、H-CDR2與H-CDR3，以及在其輕鏈變異區中包含如SEQ ID NOs.23、24與25所示的L-CDR1、L-CDR2與L-CDR3，其中，與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，該識別分子較佳增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。

帶有第二結合域的識別分子(結合至FcγIIB受體)在其重鏈變異區中包含如SEQ ID NOs.14、15與16所示的H-CDR1、H-CDR2與H-CDR3，以及在其輕鏈變異區中包含如SEQ ID NOs.17、18與19所示的L-CDR1、L-CDR2與L-CDR3，或是在其重鏈變異區中包含如SEQ ID NOs.20、21與22所示的H-CDR1、H-CDR2與H-CDR3，以及在其輕鏈變異區中包含如SEQ ID NOs.23、24與25所示的L-CDR1、L-CDR2與L-CDR3，乃是一個示例性的識別分子。與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，這樣的示例性識別分子較佳地增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。

在一個具體實施例中，該具有第二結合域的識別分子(結合至FcγIIB受體)包含至少(i)包含對胺基酸序列SEQ ID NO.1具有至少80%的同一性的胺基酸序列的重鏈變異區，以及(ii)包含對胺基酸序列SEQ ID NO.2具有至少65%的同一性的胺基酸序列的輕鏈變異區。

此外，該可以具有第二結合域的識別分子(結合至FcγIIB受體)包含至少以下其中一個：(i)包含對胺基酸序列SEQ ID NO.3具有至少90%的同一性的胺基酸序列的重鏈變異區，以及(ii)包含對胺基酸序列SEQ ID NO.4具有至少90%的同一性的胺基酸序列的輕鏈變異區。

與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，這樣的識別分子增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。

如上所述，示例性的識別分子是一抗體。一種較佳的抗體是結合具有第一結合域，其是Fab區的至少一部分，與Fcε受體結合，即，抗FcεR抗體，較佳的為IgG型的，並具有第二結合域，其為IgG的一個恆定區或其部分，其被Fcγ IIB受體結合到一個Fcγ IIB受體。

另一個帶有第一結合域的示例性抗體，其是對Fc ε受體的Fab區的至少一部份，並帶有第二結合域，其是對FcγIIB受體的Fab區的至少一部分，即，一雙功能或雙特異性抗FcεR抗體×抗FcγRIIB抗體。在某些具體實施例中，該抗體不與Fcγ IIA受體(FcγRIIA)結合。

還被想到是一種包含IgE的Fc區或其部分以作為第一結合域，以及IgG的Fc區或其部分以作為第二結合域的抗體。

另一個示例性的抗體是以一第一結合域結合，其係IgE的一個恆定區或其部分，則勢必被一個Fcε受體結合到一個Fcε受體，以及具有一第二結合域，其至少是一個Fab區的一部分，與FcγIIB受體結合，即，抗FcγRIIB抗體，較佳為IgG型。在某些具體實施例中，該抗體不與Fcγ受體IIA(FcγRIIA)結合。

當用於本文時「抗體」是包含一種或多種多胜肽(包含一個或多個結合域，較佳為抗原結合域)由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段實質上或部分編碼的蛋白質。「免疫球蛋白」(Ig)乙詞與「抗體」在本文中可互換使用。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恆定區基因，以及無數的免疫球蛋白變異區基因。具體而言，當在本文使用時，「抗體」典型為由每條大約25kDa的二條輕鏈(L)以及每條大約50kDa的二條重鏈(L)所組成的四聚體糖基化蛋白。兩種類型的輕鏈，稱為λ和κ，可以在抗體中找到。取決於重鏈的恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可被分為五大類：A、D、E、G，和M，其中有些可進一步分為亞類(同型)，例如，IgG1、lgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，且在本發明的某些具體實施例中IgG或IgE是較佳的。IgM抗體由5個基本的異四聚單元與一條叫做J鏈的附加多胜肽所組成，並含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包含2-5個該基本的4鏈單元，其與J鏈組合可聚合以形成多價裝配。在IgG的例子中，4鏈單元通常約為150,000道爾頓。每條輕鏈包括一個N端變異(V)區(VL)和恆定(C)區(CL)。每條重鏈包括一個N端V區(VH)，三個或四個C結構域(CHs)，和一個鉸鏈區。

恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但可表現出各種效應功能，如參與抗體依賴性細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)。如果抗體應該具有ADCC，則較佳為IgG1亞型，而IgG4亞型就不具有ADCC的能力。一個識別分子的恆定區，例如抗體，可以是如本文所述的各種亞型，較佳為IgG或IgE的亞型，更佳為IgE的亞型。

當用於本文中，「抗體」乙詞不僅是指免疫球蛋白(或完整抗體)，但也指其片段，以及包括任何多胜肽，其包含的抗原結合片段或抗原結合域，例如Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、scFv、Fd、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)，和其它如本文所述的保留抗原結合功能的抗體片段。典型地，這樣的片段將包含抗原結合域具有如本文描述的抗體的相同屬性。

「抗體」乙詞還包括，但不限於，單株抗體、單特異性的、聚或多特異性抗體，如雙特異性抗體、人源化、駱駝化、人類的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜合的、突變的、接枝的，以及在體外產生的抗體，且較佳為嵌合的或人源化的抗體。「人源化抗體」乙詞通常被定義為在其中編碼HC和LC的CDR的特異性已被轉移到一個適當的人類變異框架(「CDR移植」)的抗體。「抗體」乙詞還包括scFv、單鏈抗體、雙體或四體、結構域抗體(dAbs)，以及奈米抗體。在本發明中，「抗體」乙詞也應包含二-、三-或聚體或是具有幾個抗原結合位點的二-、三-或多功能的抗體，較佳為其中至少一個是FcγRIIB特異性結合位點。

此外，如本文所採用的「抗體」乙詞也涉及如本文描述的抗體的衍生物(包括其片段)。一抗體的「衍生物」包含經由胺基酸殘基置換、刪除或添加的引入而改動過的胺基酸序列。此外，衍生物包括已經由任何類型的分子共價附著於該抗體或蛋白質而被修飾的抗體。這種分子的實例包括醣類、聚乙二醇、羥基、乙氧基、羧基或胺基，但不限於這些。抗體的共價修飾的效果導致糖基化、聚乙二醇化、乙醯化、磷酸化、醯胺化，但不限於這些。

該抗體較佳為「分離的」抗體。在用於描述本文中所公開的抗體為「分離的」的時候，是指已被鑑定，從它的生產環境的成分分開及/或回收的抗體。較佳地，該分離的抗體不含有來自其生產環境中的所有其它成分。其生產環境的污染成分，如由重組轉染的細胞產生的，是通常會干擾該多胜肽的診斷或治療用途的材料，且可能包括酶、激素，和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在較佳的具體實施例中，將抗體純化至(1)至足以通過使用轉杯式測序儀，得到N-末端或內部胺基酸序列至少15個殘基的程度，或(2)通過SDS-PAGE在非還原性或還原性條件下，使用考馬斯藍或較佳地，使用銀染色而達到均一的程度。然而，通常，分離的抗體將通過至少一個純化步驟來製備。

如本文所用，「特異性結合」乙詞是指識別分子，較佳為抗體，或其片段或衍生物，特異性結合至FcγRIIB或其片段，且不與其它的Fc受體特異性結合。識別分子，較佳抗體，或其片段或衍生物，通過第二結合域被結合到FcγRIIB，例如，通過抗體的變異區。然而，這些識別分子，例如抗體，也可以被FcγRIIB所結合，例如，透過它們的Fc區。

一個VH和VL的配對一起形成單個抗原結合位點。最鄰近VH的這個CH域被指定為CH1。透過一個共價雙硫鍵每個L鏈被連接到一個H鏈，而兩個H鏈則視該H鏈同型而定，透過一個或更多個雙硫鍵彼此連接。VH和VL結構域由四個稱為構架區(FR1、FR2、FR3，和FR4)的相對保守序列所構成，其形成高度變異序列的三個區域(互補決定區，CDR)的支架。CDR含有大部分負責與抗原相互作用的抗體的特異性殘基。CDR被稱為CDR1、CDR2和CDR3。因此，重鏈上的CDR組份稱為H1或H-CDR1、H2或H-CDR2和H3或H-CDR3，而輕鏈上的CDR組份則稱為L1或L-CDR1、L2或L-CDR2和L3或L-CDR3。

「變異的」乙詞指的是表現出在它們的序列變異性，並且參與決定特異性和結合特定抗體的親和力的免疫球蛋白結構域的部分(即「變異區」)。變異性並非均勻分佈於抗體的整個變異區；它集中在各重鏈和輕鏈變異區的高度變異的子結構域中。這些高度變異的子結構域被稱為「互補決定區」(CDRs)，其中三個組成輕鏈變異區(L1-CDRL1、L2-CDR和L3-CDR)的結合性質，且三個組成重鏈變異區(H1-CDR、H2-CDR和H3-CDR)的結合性質。CDRs構成抗體分子的功能活性，且由含有支架或框架區的胺基酸序列所分離。有不同的分類和編號系統來確切定義的CDR邊界和長度。CDR因此可以Kabat，Chothia，接觸或任何其他邊界來定義，包括本文中所描述的編號系統。儘管不同的邊界，這些系統都具有在可變序列內構成所謂的「高度變異區」的一些程度的重疊。CDR的定義，因此根據這些系統，相對於相鄰的框架區，在長度和邊界區域有所不同。參見例如Kabat，Chothia，及/或MacCallum等人，(Kabat等人，上述引文； Chothia等人，J.MoI.Biol期刊，1987年，第196卷：第901頁；以及MacCallum等人，J.MoI.Biol期刊，1996年，第262卷：第732頁)。然而，根據所謂的Kabat系統的編號是較佳的。

一個識別分子的第二結合域(結合於FcγIIB受體)的示例性變異區，如抗體，如SEQ ID Nos.1、2、3以及4所示。

「框架區」乙詞是指抗體變異區的更發散(即高度變異)的CDR之間存在的本領域公認的部分。這樣的框架區通常稱為框架1至4(FR1、FR2、FR3，和FR4)且在三維空間中提供呈現六個CDR的支架(三個來自重鏈和三個來自輕鏈)，以形成抗原結合表面。

識別分子(結合於FcγIIB受體)，例如抗體(包括其片段和衍生物)，與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，有利於增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約1.5、2、3，或更多倍，例如約4倍或更多，大約5倍或更多，大約6倍或更多，大約7倍或更多，大約8倍或更多，大約9倍或更多，或約10倍(即，甚至幾乎10-倍)。對於比較，該抗體是，使用量在5μg/ml到50μg/ml，如10、15、20，或25μg/ml的範圍內。

從圖6、圖7和圖8所示的結果，顯而易見的是，相較於習知技術抗體GB3，無論是嵌合的8A6(ch8A6)抗體(包含大鼠變異區和人類恆定區)或人源化8A6抗體(hu8A6)顯著增加ITIM的磷酸化作用。同時考慮到在嵌合的和人源化的8A6抗體之間的CDR是幾乎相同的，而它們的框架區(FR)是不同的，這兩種抗體增加FcγRIIBs的ITIM磷酸化的效價幾乎是相同的(參見圖8)，合理的結論是，這些CDRs造成本發明公開的抗體，例如相較於習知技術抗體GB3，顯著增加ITIM磷酸化的有利特性。

本領域技術人員是容易地在一個位置，為了一個識別分子的第二結合域，將如本文所述的CDRs嫁接到合適的框架，或者，反之亦然，將框架區嫁接到一識別分子的第二結合域，例如如本文所述的具有該CDRs的抗體，使得由此產生的識別分子，如抗體，具有有利的性能，具體而言是如本文所述增加CD32B的ITIM磷酸化的特性。

如上所述，識別分子，如本文公開的抗體，相較於在PCT專利申請公開號WO 2005/051999中描述的習知技術的抗體GB3，具有增加Daudi細胞的FcγRIIB(CD32B)的ITIM磷酸化，習知技術的抗體GB3的特點為具有如WO 2005/051999的SEQ ID NO：7所示的重鏈變異區(見SEQ ID NO.26)，以及如WO 2005/051999的SEQ ID NO：5所示的輕鏈變異區(見SEQ ID NO.27)。

與未處理識別分子的Daudi細胞相較，通過識別分子，如一種抗體，增加Daudi細胞的FcγRIIB(CD32B)的ITIM磷酸化大約4倍或更多，大約5倍或更多，大約6倍或更多，大約7倍或更多，大約8倍或更多，大約9倍或更多，或約10倍(即甚至近10倍)。

Daudi細胞的CD32B(Fcγ IIB受體)的ITIM磷酸化較佳地以下列方法確定：將3x10⁵ Daudi細胞懸浮在補充有1% FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培養基中，不是保持未處理(對照組)，就是加入含有小鼠抗人類IgM(α-hIgM)以及兔抗小鼠IgG(α-mIgG)的抗體混合物在37℃、5% CO₂環境下靜置25分鐘，其中該抗體混合物包含2μg/ml α-hIgM(單株抗體，clone UHB公司)和20μg/ml α-mIgG。接著將細胞分別以一識別分子，如本文公開的抗體，或是以本文以下所定義的目標分子，例如WO 2005/051999的GB3抗體，在37℃、5% CO₂下處理20分鐘，識別分子與目標分子較佳地以相等的濃度施用，且任選地以緩衝液作為對照(w/o)。細胞在4℃下培養後收穫，溶解並進行西方墨點分析，由此磷酸化作用是由抗磷酸酪胺酸抗體(抗CD32B(磷Y292)抗體)檢測。西方墨點分析可選擇性以一抗體作為探針進行偵測，例如，ß-肌動蛋白用來作為西方墨點分析的裝載控制。周圍血單核細胞(PBMCs)或Raji細胞都可用來替代Daudi細胞。因此，在應用Daudi 細胞來確定ITIM磷酸化的所有具體實施例中，Daudi細胞可以被Raji細胞或PBMCs所替換。

磷酸酪胺酸抗體較佳地被連接至信號發生基團。信號發生基團是指一種組合物，可由光譜、光化學、生物化學，免疫化學或化學手段而被偵測。例如，有用的標記包括放射性標記，例如³²P、³⁵S、或¹²⁵I；螢光染料(例如，Cy-3、Cy-5)；發色團、電子緻密試劑；產生可偵測信號的酵素(例如，如通常用於ELISA中)；或旋轉標籤。標籤或可偵測部分具有或產生可測量的信號，例如放射性，發色或螢光信號，這可以被用於量化樣品中結合的可檢測部分的量。

信號發生基團可以是共價或非共價結合到磷酸酪胺酸抗體。信號可以依照透過一個磷酸酪胺酸抗體的信號產生基團所提供信號的方式來確定。該信號可以是任何可由，例如光譜學、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段偵測的信號。

在ITIM磷酸化中的增加，可藉由比較(i)由結合到未處理的細胞的CD32B的ITIM基序的磷酸酪胺酸抗體的信號發生基團產生的信號(「基準值」)與(ii)由結合到以一識別分子，例如，本文公開的抗體，處理的細胞的CD32B的ITIM基序的磷酸酪胺酸抗體的信號發生基團產生的信號，來決定，其中若信號(ii)高於信號(i)，一本文公開的識別分子影響CD32B的ITIM磷酸化的增加。針對這樣的比較，識別分子的用量為約5μg/ml至約50μg/ml的範圍內，如10、15、20，或25μg/ml。例如，比較在習知技術的抗體GB3或任何其它分子如結合至CD32B的抗體(統稱「目標分子」)，例如一個結合如本文所述的CD32B上的抗原決定位，及/或如本文所述非阻斷的識別分子，以判斷目標分子與識別分子的能力，以提高CD32B的ITIM磷酸化，針對目標分子與識別分子，ITIM磷酸化按上述方法確定。即，得到比較未處理細胞與目標分子的比較值以及比較未處理細胞與一識別分子的比較值。這些值可以相互比較，以確定一個識別分子是否比目標分子具有增加ITIM磷酸化至較高程度的能力，如4至10倍(包括4、5、6、7、8、9、10)。對於比較，目標分子和識別分子的用量為5μg/ml至50μg/ml的範圍內，如10、15、20，或25μg/ml。

至於本文公開的識別分子的第二結合域的重鏈變異區(結合的FcγIIB受體)，在某些具體實施例中，該重鏈變異區包含如SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列，並具有至少一個選自於由下列所組成之群組中的突變：位置1的胺基酸Q被E取代，位置11的胺基酸V被L取代，位置42的胺基酸G被K取代，位置50的胺基酸S被V取代，位置53的胺基酸Y被S取代，位置58的胺基酸K被T取代，位置61的胺基酸G被A取代，位置75的胺基酸S被T取代，位置76的胺基酸K被R取代，位置77的胺基酸N被S取代，以及位置78的胺基酸T被N取代。這種抗體的特徵為包含IgE恆定結構域作為第一結合域。

在識別分子的第二結合域是被FcγIIB受體結合的IgG的恆定區或其一部分的情況下，識別分子的特徵為包含如SEQ ID NO.6所示的胺基酸序列的重鏈恆定區及/或如SEQ ID NO.7所示的胺基酸序列的輕鏈恆定區。

在本文公開的抗體中，重鏈的恆定區包含在位置297上的一個丙胺酸殘基(N297A)，該位置係根據由Edelman等人1969年所述的EU蛋白質編號方式(對應於如圖2所示的SEQ ID NO.6呈現的序列編號)。在重鏈位置297上含有一個丙胺酸(Ala，A)殘基(N297A)的抗體在本文中以後綴「_N297A」標示，而在該位置上含有一個天冬醯胺(Asn，N)殘基的抗體為「野生型」，因此在本文中以後綴「(wt)」標示。如圖2中可以看出，人源化抗體8A6野生型的重鏈的變異區在依照EU蛋白質編號位置113上以胺基酸殘基「S」結束。該抗體的恆定區開始於位置118。其造成4個胺基酸殘基的明顯間隙是因為恆定區轉換至EU蛋白質編號系統，並不意味著任何胺基酸殘基缺失。具有在由SEQ ID NO.6所示的胺基酸序列的位置297上具有丙胺酸殘基的恆定區確實俱有減少或沒有抗體依賴性細胞毒性，這是因為該抗體的Fc部分與Fc受體結合的減少或不存在。這種N297A恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO.28所示。因此，本文中公開的識別分子可以包含如SEQ ID NO.28所示的胺基酸序列的恆定區。這種抗體在根據EU蛋白質編號的位置297上缺乏糖基化作用。因此，本文公開的抗體在其重鏈恆定區的根據EU蛋白質編號的位置297上缺少糖基化作用，而且也包含那些在其重鏈恆定區的根據EU蛋白質編號的位置297上被糖基化的抗體。

在一些具體實施例中，識別分子的恆定區(Fc-區)，如本文所公開的抗體，具有同種異型G1m17在位置214上含有胺基酸K(離胺酸)，在位置356上含有E(谷胺酸)，在位置358上含有M(甲硫胺酸)，以及在位置431上含有A(丙胺酸)，缺少C端K(離胺酸)(Beck等，2010年)。

在識別分子的第二結合域是被FcγIIB受體結合的IgG的恆定區或其一部分的情況下，該輕鏈恆定區是Km3同種異型的輕鏈恆定區，在位置153上含有胺基酸A(丙胺酸)且在位置191上含有v(纈胺酸)。

如本文所使用的，「同種異型」乙詞是指本文所公開的抗體的人類同種異型。同種異型是特定同型的恆定區序列中的等位/遺傳變異體。同種異型以等位基因的方式被繼承。因此一個物種的不同成員針對其遺傳自其父母的一個給定的同型的等位基因是彼此不同的。Km1與Km2為人類的Kappa鏈的同種異型；G1m(4)和G1m(17)是人γ-1鏈的同種異型。

在識別分子的第二結合域是被FcγIIB受體結合的IgG的恆定區或其一部分的情況下，識別分子可包含如SEQ ID NO.6所示的胺基酸序列的重鏈恆定區，以及如SEQ ID NO.7所示的胺基酸序列的輕鏈恆定區。這種識別分子的特徵在於一個第一結合域為一個IgE恆定結構域或其部分，因此被Fcε受體結合。

至於識別分子的第二結合域(結合至FcγIIB受體)的輕鏈變異區，在一些具體實施例中，它包含如SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列，並具有至少一個選自於由下列所組成之群組中的突變：位置1的胺基酸Q被N取代，位置28的胺基酸S被N取代，位置31的胺基酸S被T取代，位置33的胺基酸V被L取代，位置34的胺基酸D被A取代，位置49的胺基酸Y被F取代，位置53的胺基酸T被N取代，位置55的胺基酸Y被A取代，位置89的胺基酸L被Q取代，以及位置93的胺基酸N被Y取代。這種抗體的特徵為包含如SEQ ID NO.6所示的胺基酸序列的重鏈恆定區及/或如SEQ ID NO.7所示的胺基酸序列的輕鏈恆定區。這種識別分子的進一步特徵在於一個第一結合域為一個IgE恆定結構域或其部分，因此被Fcε受體結合。

一種識別分子(結合至FcγIIB受體)，例如抗體，包含如SEQ ID NO.1或3所示的重鏈變異區及/或如SEQ ID NO.2或4所示的輕鏈變異區。因此，識別分子可包含如SEQ ID NO.1所示的重鏈變異區以及如SEQ ID NO.2所示的輕鏈變異區，或是其包含如SEQ ID NO.3所示的重鏈變異區以及如SEQ ID NO.4所示的輕鏈變異區。

一種識別分子(結合至FcγIIB受體)，如本文所公開的抗體，特異性地結合至根據SEQ ID NO.5的人類FcγRIIB的第20-40號胺基酸的抗原決定位。

在一些具體實施例中，該識別分子特異性結合至包含在SEQ ID NO.5的模體GTHSPES的抗原決定位。此胺基酸模體已被證明是FcγRIIB的一個非常專一的抗原決定位。識別分子，如特異性結合此抗原決定位的抗體，不結合人類的FcγRIIA。識別分子，如抗體，經由其變異區與抗原決定位的結合，較佳地不干擾抗體的Fc部分與受體的結合，並且不會阻斷受體的正常生理功能。

在一些具體實施例中，識別分子(結合至FcγIIB受體)，例如抗體，在體外以至少4.9 x 10^-4s^-1的解離速率常數的親和力與人類FcγRIIb結合。一個解離速率常數(k_off)可以表面等離子體共振實驗來測量。特別是，結合到sFcγRIIB的抗體可以通過使用BIAcore T200生物傳感器(GE Healthcare/Biacore公司)以表面等離子體共振進行分析。

如本文所使用的，「親和力」乙詞是指抗體或片段或衍生物之一重鏈與一個輕鏈的變異區和它們的抗原之間的結合強度(例如FcγRIIB受體)和以體外測量。親和力確定抗原決定位和抗體的抗原結合位點之間的相互作用的強度。親和力可使用下列公式計算：KA=[AB-AG]/[AB]*[AG]=k_on/k_off

其中：KA=親和常數

[AB]=抗體上未被佔據的結合位點的莫耳濃度

[AG]=抗原上未被佔據的結合位點的莫耳濃度

[AB-AG]=抗體-抗原複合物的莫耳濃度

如本文所使用的，「結合性」乙詞是指抗體-抗原複合物的整體強度的測量，其效果取決於參數(1)抗體對抗原決定位的親合性，(2)抗原與抗體的配價，以及(3)相互作用部分的結構配置。

可以設想，一個識別分子，其較佳為抗體，可以是糖基化或去糖基化的。

在一本文公開的識別分子的第一結合域是被Fcε受體結合的IgE的恆定區或其一部分的情況下，其可以具有如SEQ ID NO：35或36所示之胺基酸序列或其部分。

一個Fc IgE區的較佳部分包含結構域Cε3及/或結構域Cε4(見圖15和SEQ ID NO.36)。這些結構域都是與IgG-Cγ2和Cγ3同源的。在IgG抗體中，鉸鏈區是負責該分子的所需的靈活性，並形成經由二硫鍵橋接的二聚體。在IgE抗體中不存在該鉸鏈區。取而代之的是，額外的結構域Cε2採用此功能。

一個Fc IgE區的其它示例性部分包含該Cε2、Cε3及/或Cε4結構域(參見圖15及SEQ ID NOs.35)。

另一個變化與在該Fcε區內N-糖基化位點的不同數量有關。幾個糖基化位點被描述為IgE分子：N265、N371、N383和N394。據設想，其中的一個或多個位置維持不變化或者被突變，使得它們不能再被糖基化。

此外，在一些具體實施例中，識別分子，如抗體，包含作為第一結合域的IgE的Fc區，並且可以在體外以至少1.2 x 10^-7Kd(M)的親和力與人類FcεRI結合。

本文還提供了編碼本文中描述的識別分子的核酸序列。如本文所用，「核酸」或「核苷酸序列」乙詞是指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)，核糖核酸(mRNA)，它們的組合或由DNA和RNA組成的雜交分子。該核酸可以是雙股或單股的，且可能在同一時間含有雙股和單股片段。最較佳的是雙股DNA分子。因此，一個核酸序列，其編碼包含核苷酸的一個公開的識別分子，該核苷酸編碼至少那些賦予了抗體的特異性結合特性的部分抗體。在一些具體實施例中，公開了如本文所述的核酸序列編碼的變異區，例如至少如本文所述的CDRs。示例性核酸序列如SEQ ID NOs.8-11所示。本領域技術人員將意識到，這些核苷酸序列可根據使用的表現方法及為此使用的系統而有所不同。

本文還提供一種核酸載體，其包含至少一種編碼本文所公開的識別分子如本文所描述的核酸序列。該載體較佳包含上述核酸序列置於啟動子的控制下。該載體可以是原核或真核表現載體，其中所述重組核酸是單獨表現或融合其它胜肽或蛋白質而表現。

本文還公開了其轉染上述載體的宿主細胞。該宿主細胞可以是任何細胞、原核細胞或真核細胞，可以用於產生抗體或至少其部分片段或衍生物。

還提供了用於生產一種識別分子的方法，包含將本文所述的宿主細胞培養於可以使其表現包含在該核酸載體的該核酸序列的環境下，以及因此回收所產生的識別分子。

本文所公開的識別分子可有利地被使用於醫藥組合物中。這樣的醫藥組合物可以應用於治療或預防與嗜鹼性球相關的疾病，較佳為過敏性疾病。

因此，還提供了治療或預防嗜鹼性球相關疾病的方法，較佳為過敏性疾病，該方法包含將一治療有效量的本文所述的識別分子投與給需要該分子的個體。

「過敏性疾病」或「過敏」是指某些疾病中，對環境抗原引起組織發炎和器官功能異常的免疫反應。過敏原可以是任何引起過敏的抗原。因此，它可以是抗原分子本身或它的來源，如花粉、動物皮屑、昆蟲毒液，或食物產品。IgE在過敏性病症中扮演核心的角色。IgE的高親和力受體(FcεRI)位於肥大細胞和嗜鹼性球上，可以作為刺激進一步釋放發炎介質而生產許多過敏性疾病的表現形式的抗原標的。

「過敏性疾病」乙詞還包括IgE調節的發炎反應。當抗原結合佔據肥大細胞上的受體FcεRI的IgE抗體時，發生「IgE調節的發炎反應」。幾分鐘之內，這樣的結合導致肥大細胞脫粒反應，釋放出一定的預製調節子。接著，脫粒細胞開始重新合成並釋放額外的調節子。其結果是一個雙相反應：對血管、平滑肌，和腺體分泌起始立即的影響(立即過敏反應)，其次是幾個小時後是所涉及的位置的細胞浸潤。IgE調節的發炎反應是異位性過敏(如花粉熱、氣喘以及異位性皮膚炎)，系統性過敏反應和過敏性蕁麻疹(麻疹)的根本機制。它通常可以發揮作用作為免疫防禦的第一道防線，因為它會導致快速的血管擴張，促進循環可溶性因子和細胞進入抗原接觸的部位。許多過敏性疾病的最具破壞性的屬性是由於化學吸引白血球的動作。

在另一個方面，本公開涉及醫藥組合物，包含作為活性成分的識別分子。該醫藥組合物可包含至少一種醫藥上可接受的載體或佐劑或賦形劑。識別分子可以提供給在醫藥上可接受的組合物，該組合物為本領域已知的或如列在一般公認用於動物，且更具體而言是用於人類的藥典中。

該組合物，如果需要的話，也可含有潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑少量。這些組合物可以採取溶液、懸浮液、乳劑、片劑、九劑、膠囊、粉劑、持續釋放製劑及其類似物的形式。該組合物可以配製為中性或鹽形式。

醫藥上可接受的鹽包括，但不限於那些與陰離子例如那些來自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生所形成的，以及那些與陽離子如那些選自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等衍生所形成的。

上述醫藥組合物可用於治療或預防或診斷任何疾病或病症，較佳為嗜鹼性球相關疾病，較佳為過敏性疾病。

投與劑量和頻率由治療有效和預防有效的術語所涵蓋。劑量和投與頻率將進一步根據每個患者的特異因素進行，取決於特定的治療或預防藥物的投與、疾病的類型、投與途徑，以及年齡、體重、反應，以及患者的過去的病史。合適方案可以由本領域技術人員進行選擇。如本文所用，「治療有效量」乙詞是指治療活性成分或試劑，其足以治療或改善疾病或病症，足以延遲疾病的發作或提供任何治療益處的治療或疾病管理的量。

針對本文包含作為識別分子的示例性的抗體，投與患者的劑量通常為0.0001mg/kg至100mg/kg的患者的體重。示例性投與劑量是約0.1至約30mg/kg、約0.1mg/kg至約25mg/kg、約0.5mg/kg至約25mg/kg、約1mg/kg至約100mg/kg、約1mg/kg至約75mg/kg、約1mg/kg至約50mg/kg、約5mg/kg至約50mg/kg、約5mg/kg至約40mg/kg、約5mg/kg至約30mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約12mg/kg、約14mg/kg、約15mg/kg、約17mg/kg、約20mg/kg，或約25mg/kg。眾所周知，人類抗體比來自其它物種的抗體在人體內具有較長的半衰期。因此，抗體或其片段或其衍生物投與的劑量和頻率，可以比來自其它物種的抗體的通常使用的劑量要少。

對一個體以一治療或預防有效量的抗體，或其片段或衍生物進行之治療，可包括單一治療，或較佳地，可包括一系列治療。在某些具體實施例中，個體可以抗體，或其片段或衍生物被治療，在上面公開的一個劑量的範圍內，每週一次為介於約1至約10週、約2至約8週，更較佳約3至約7週。最有利的形式和應用的方式可以選擇對待治療患者最好的方式。

施用抗體或其片段或衍生物的方法包括但不限於，腸胃外投與(例如，皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下)、硬膜外，和粘膜(例如，鼻內和口服途徑)。在一個特定的具體實施例中，抗體投與肌肉內、靜脈內，或皮下投與。該組合物可通過任何方便的途徑，通過上皮或粘膜皮膚內層(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)，並且可與其它生物活性劑一起投與給藥，例如，通過輸注或推注，通過吸收。投與可以是全身或局部的。此外，肺投與也可以採用，例如，通過使用吸入器或噴霧器，和具有霧化劑的製劑。

如本文所用，「處理」和「治療」等詞是指投與個體一治療有效量的醫藥組合物。「治療有效量」是指醫藥組合物或該抗體足以治療或改善疾病或病症，足以延遲疾病的發作或提供一種在疾病的治療或管理任何治療益處的量。

如本文所用，「預防」乙詞是指將試劑用於預防疾病或病症的發作。「預防有效量」定義了活性成分或藥物足以預防疾病的發作或復發的量。

如本文所用，「病症」和「疾病」等詞可互換使用，是指在一個體體內一種狀態。具體地，「自身免疫性疾病」乙詞與「自身免疫性病症」乙詞可互換使用，其是指在個體體內的一種狀態，其特徵在於，由個體的免疫反應對其自己的細胞、組織及/或器官造成細胞、組織及/或器官的損傷。

此外，所公開的抗體可用於診斷目的，以檢測、診斷或監測疾病，或病症，具體而言是自身免疫性疾病。抗體或其片段或衍生物，可用於測定在一生物樣本中FcγRIIB的含量，透過使用如本文所述或為本領域技術人員所知悉的經典的免疫組織學方法(例如，參見Jalkanen等人，1985年，J.Cell.Biol.期刊，第101卷：第976-985頁；Jalkanen等人，1987年，J.Cell.Biol.期刊，第105卷：第3087-3096頁)。其它基於抗體的方法，對於檢測蛋白質基因表現有用的方法，包括免疫分析，例如酵素聯免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。

因此，本發明還涉及一種診斷組合物，包含一識別分子，較佳為本文中公開的抗體。

總之，本發明包含至少下列具體實施例：

1.一種識別分子，其以一第一結合域與一Fcε受體(Fcε receptor，FcεR)結合，且以一第二結合域與一Fcγ受體IIB(Fc gamma receptor IIB，FcγRIIB)結合。

2.如第1項之識別分子，其係一抗體。

3.如第2項之識別分子，其中該抗體不與一Fcγ受體IIA(FcγRIIA)結合。

4.如第2或3項之識別分子，其中該抗體係一非阻斷抗體，使其經由其變異區域與該Fc受體結合而不干擾免疫複合物與細胞的結合，或聚集IgG。

5.如第4項之識別分子，其中該抗體係嵌合或人源化。

6.如前面任何一項之識別分子，其中該第一結合域包含至少一部份的IgE恆定區。

7.如前面任何一項之識別分子，其中該第二結合域包含至少一部份的Fab區。

8.如前面任何一項之識別分子，其中該第二結合域含有至少(i)一重鏈變異區，包含一具有與SEQ ID NO.1胺基酸序列至少80%同一性的胺基酸序列，以及(ii)一輕鏈變異區，包含一具有與SEQ ID NO.2胺基酸序列至少65%同一性的胺基酸序列。

9.如前面任何一項之識別分子，其中該第二結合域含有至少下列之一(i)一重鏈變異區，包含一具有與SEQ ID NO.3胺基酸序列至少90%同一性的胺基酸序列，以及(ii)一輕鏈變異區，包含一具有與SEQ ID NO.4胺基酸序列至少90%同一性的胺基酸序列。

10.如前面任何一項之識別分子，在其第二結合域中包含下列該重鏈與輕鏈變異區的CDR序列：(i)一H-CDR1序列，其與SEQ ID NO.20所示之H-CDR1序列具有60%或更高的同一性；(ii)一H-CDR2序列，其與SEQ ID NO.21所示之H-CDR2序列具有36%或更高的同一性；(iii)一H-CDR3序列，其與SEQ ID NO.22所示之H-CDR3序列具有50%或更高的同一性；(iv)一L-CDR1序列，其與SEQ ID NO.23所示之L-CDR1序列具有64%或更高的同一性；(v)一L-CDR2序列，其與SEQ ID NO.24所示之L-CDR2序列具有29%或更高的同一性；以及 (vi)一L-CDR3序列，其與SEQ ID NO.25所示之L-CDR3序列具有78%或更高的同一性；其中，與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，該識別分子增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。

11.如第10項之識別分子，包含在其重鏈變異區中如SEQ ID NOs.29、30與31所示之H-CDR1、H-CDR2與H-CDR3，以及在其輕鏈變異區中如SEQ ID NOs.32、33與34所示之L-CDR1、L-CDR2與L-CDR3，其中，與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，該識別分子增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。

12.如第10或11項之識別分子，在其重鏈與輕鏈變異區中包含下列CDR序列：(a)在其重鏈變異區中包含SEQ ID NO.14(CDR-H1)、SEQ ID NO.15(CDR-H2)與SEQ ID NO.16(CDR-H3)，以及在其輕鏈變異區中包含SEQ ID NO.17(CDR-L1)、SEQ ID NO.18(CDR-L2)與SEQ ID NO.19(CDR-L3)；或(b)在其重鏈變異區中包含SEQ ID NO.20(CDR-H1)、SEQ ID NO.21(CDR-H2)與SEQ ID NO.22(CDR-H3)，以及在其輕鏈變異區中包含SEQ ID NO.23(CDR-L1)、SEQ ID NO.24(CDR-L2)與SEQ ID NO.25(CDR-L3)。

13.如前面任何一項之識別分子，其中該重鏈變異區包含如SEQ ID NO.3所示之胺基酸序列，並具有至少一個選自於由下列所組成之群組中的突變：位置1的胺基酸Q被E取代，位置11的胺基酸V被L取代，位置42的胺基酸G被K取代，位置50的胺基酸S被V取代，位置53的胺基酸Y被S取代，位置58的胺基酸K被T取代，位置61的胺基酸G被A取代，位置75的胺基酸S被T取代，位置76的胺基酸K被R取代，位置77的胺基酸N被S取代，以及位置78的胺基酸T被N取代。

14.如前面任何一項之識別分子，其中該輕鏈變異區包含如SEQ ID NO.4所示之胺基酸序列，並具有至少一個選自於由下列所組成之群組中的突變：位置1的胺基酸Q被N取代，位置28的胺基酸S被N取代，位置31的胺基酸S被T取代，位置33的胺基酸V被L取代，位置34的胺基酸D被A取代，位置49的胺基酸Y被F取代，位置53的胺基酸T被N取代，位置55的胺基酸Y被A取代，位置89的胺基酸L被Q取代，以及位置93的胺基酸N被Y取代。

15.如前面任何一項之識別分子，其中，與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，該識別分子增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。

16.如前面任何一項之識別分子，其中該第二結合域在其重鏈變異區中具有如SEQ ID NOs.1或3所示之胺基酸序列及/或在其輕鏈變異區中具有如SEQ ID NOs.2或4所示之胺基酸序列。

17.如第6至16項中任何一項之識別分子，其中該IgE恆定區具有SEQ ID NO：35、36或其一部分的胺基酸序列。

18.如第2至17項中任何一項之識別分子，其中該抗體係糖基化的或去糖基化的。

19.如第2至18項中任何一項之識別分子，其中該抗體在體外以至少4.9 x 10^-4s^-1的解離速率常數的親和力與人類FcγRIIB結合。

20.如第2至19項中任何一項之識別分子，其中該抗體在體外以至少1.2 x 10^-7Kd(M)的親和力與人類FcεRI結合。

21.如前面任何一項之識別分子，其特異性地與含有根據SEQ ID NO.7的人類FcγRIIB的第20-40個胺基酸的抗原決定位結合。

22.一種編碼如第1至21項中任何一項之識別分子的核酸序列。

23.一種載體，包含插入該載體的至少一種如第22項之核酸序列。

24.一種轉染如第22項之核酸序列或如第23項之載體的宿主細胞。

25.一種醫藥組合物，包含作為一活性成分的一種如第1至21項中任何一項之識別分子，一種如第22項之核酸，一種如第23項之載體，或一種如第24項之宿主細胞。

26.如第25項之醫藥組合物用於治療或預防嗜鹼性球相關疾病。

27.如第26項之醫藥組合物用於治療或預防過敏症。

28.一種如第1至21項中任何一項之識別分子於治療上的應用。

29.一種如第1至21項中任何一項之識別分子用於治療或預防嗜鹼性球相關疾病。

30.如第29項之識別分子的用途，其中該嗜鹼性球相關疾病為一過敏性疾病。

圖1：根據SEQ ID No.3與4以野生型或N297A形式ch8A6_N297A的人源化8A6的表面等離子體共振分析。(根據SEQ ID NO.14和15以及chGB3_N297A)。

圖2：hu8A6_wt和hu8A6_N297A的序列，描繪在N297A形式中位置N到A的胺基酸交換。

圖3：ch8A6_N297A的非阻斷特性。Raji細胞與設定量的聚集的人類IgG以及不同量的ch8A6_N297A、chGB3_N297A或阻斷抗體2B6或研發抗體一起培養。該抗體是非阻斷型的。

圖4：從15μg/ml到0.005μg/ml的蛋白質A純化的抗體(hu8A6_VL+hu8A6_VH和ch8A6_N297A)與表現於Raji細胞上的原生FcγRIIB結合。人源化的8A6變體以高結合性與表現於Raji細胞上的FcγRIIB結合。

圖5：15μg/ml抗體(hu8A6_VH+hu8A6_VL和ch8A6_N297A)與表現於K562細胞上的原生FcγRIIA結合。該抗體不與在K-562上的FcγRIIA結合。

圖6a：在來自健康捐贈者的PBMC中，嵌合的8A6(ch8A6_N297A)增加了ITIM磷酸化。來自健康捐贈者的PBMC以Ficoll分離且隨後保持未處理或與含有抗IgM(抗-人類、小鼠)以及抗-小鼠IgG(兔)的抗體混合物共同培養25分鐘。接著將細胞以5μg/mL ch8A6_N297A或作為對照組的緩衝液(w/o)處理20分鐘。培養後收集細胞並根據實驗操作手冊裂解細胞。對裂解液進行西方墨點分析法。ß-肌動蛋白=裝載蛋白控制量。

圖6b：ITIM-磷酸化作用的控制實驗。Daudi細胞保持未處理或以用同型對照抗體、抗-人類抗IgM多株抗體(polycl.anti-hIgM)、抗人類IgM單株抗體(anti-hIgM)、anti-hIgM+5μg/mL ch8A6_N297A、來自兔的抗小鼠IgG抗體(α-mouseIgG)、α-小鼠IgG+5μg/mL ch8A6_N297A、抗hIgM和α-小鼠IgG的混合物(抗體混合物)或抗體混合物+5μg/mL ch8A6_N297A處理25分鐘。ß-肌動蛋白=裝載蛋白控制量。

圖6c：在初代PBMC細胞中，含有以及未含有BCR與Fc gamma RIIB(FcγRIIB)的交聯/束聯之下，本發明的抗體增強ITIM磷酸化。

圖7：ch8A6_N297A與來自現有技術的抗體(chGB3_N297A)的比較。人類Daudi細胞以包含抗-IgM(抗-人類、小鼠)以及抗-小鼠IgG(兔)的抗體混合物共同培養25分鐘，或保持未處理。接著將細胞以不同量的chGB3_N297A或ch8A6_N297A或作為對照組的緩衝液(w/o)處理20分鐘。培養後收集細胞並根據實驗操作手冊裂解細胞。對裂解液進行西方墨點分析法。ß-肌動蛋白=裝載蛋白控制量。

圖8：人源化變體hu8A6_N297A與ch8A6_N297A與chGB3_N297A對於在初代PBMC細胞中ITIM磷酸化的影響之比較。在以抗體混合物進行BCR與FcγRIIB的交聯反應後，以5μg/ml濃度加入不同抗體，並進行西方墨點分析以分析ITIM磷酸化。ß-肌動蛋白=裝載蛋白控制量。

圖9：磷酸化SHIP-1與FcγRIIB ITIM的免疫共沉澱。在Daudi細胞以該抗體混合物與ch8A6_N297A、阻斷抗-FcγRIIB抗體2B6或chGB3_N297A(5μg/mL)刺激後，從該細胞裂解液中沉澱出FcγRIIB，並進行西方墨點分析以分析SHIP-1的磷酸酶。抗-CD32採用泛抗CD32抗體(AF1330)=裝載蛋白控制量。

圖10：人源化的8A6變種(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)與ch8A6_N297A的比較。Daudi細胞與緩衝液(未處理)或含有抗-IgM(抗-人類、小鼠)以及抗-小鼠IgG(兔)的混合物(抗體混合物)共同培養25分鐘。隨後將細胞以0.25μg/mL的ch8A6_N297A或人源化8A6變種(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)處理20分鐘。培養後收集細胞並根據實驗操作手冊裂解細胞。對裂解液進行西方墨點分析法。ß-肌動蛋白=裝載蛋白控制量。

圖11：人源化的8A6變種(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7)與ch8A6_N297A、阻斷抗-FcγRIIB和chGB3_N297A的比較。Daudi細胞與緩衝液(未處理)或含有抗-IgM(抗-人類、小鼠)以及抗-小鼠IgG(兔)的混合物(抗體混合物)共同培養25分鐘。隨後將細胞以0.25μg/mL的ch8A6_N297A、人源化8A6變種(hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7) 、阻斷抗-FcγRIIB抗體2B6或chGB3_N297A處理20分鐘。培養後收集細胞並根據實驗操作手冊裂解細胞，並以西方墨點分析法進行分析。對裂解液進行西方墨點分析法。ß-肌動蛋白=裝載蛋白控制量。

圖12：實驗裝置為SLE-PBL小鼠模型。來自人SLE患者的PBL被轉移到免疫受損的小鼠體內。PBL細胞被移入，且小鼠隨後以對照組(PBS)或根據本發明的抗FcγRIIBch8A6_N297A抗體進行處理。

圖13：在以從患有SLE的人類捐贈者而來的PBL嫁接的小鼠內的人類IgG總含量[μg/mL]。所描述者為以對照組處理的小鼠(#2，PBS)或以ch8A6_N297A處理的小鼠(#3與#4)。

圖14：使用從患有SLE的人類捐贈者而來的PBL傳輸/嫁接SLE-PBL後第4週開始，在ch8A6_N297A處理過的小鼠中人類疾病特異性抗DNA IgG抗體的減少。所描繪的是在兩隻不同的小鼠，#3和#4(以ch8A6_N297A處理)中抗-DNA IgG抗體滴度，#2所示為PBS對照組。

圖15：由嵌合的FcγRIIB-特異性的IgG-抗體的Fab-區以及IgE-抗體的Fcε-區組成的構築體。該構築體在從IgG-為基礎的Fab與Fcε-區的轉換方面有所不同(B.帶有Cε2區，C.不帶有Cε2但有IgG鉸鏈區)和N-糖基化位點的數量。為了比較，示意圖(A)中示出了完整的IgG和一個完整的IgE分子。

圖16：用ELISA法檢測8A6-IgEs結合到SM101(sFcγRIIB)。該圖描繪了一個有代表性的ELISA。該ch8A6-IgE的變體對抗原SM101(可溶FcγRIIB)具有如嵌合抗FcγRIIB抗體相同的親和性。

圖17：以ELISA確定8A6_IgE變體結合到sFcεRIα。該圖描繪了一個有代表性的ELISA。人源化抗FcγRIIB-IgE的變體結合至sFcεRIα具有如作為相應嵌合抗FcγRIIB-IgE的版本相同的親和力。

圖18：細胞結合抗-FcγRIIB-IgE抗體到在Raji上表現的FcγRIIB。該圖描繪了一個有代表性的FACS實驗，以變種8A6_cε2-4degly和8A6_cε3-4degly進行，相較於ch8A6_N297A。8A6-IgE變體以及ch8A6_N297A對天然抗原FcγRIIB都具有相同的親和力。

圖19：8A6-IgE與SM101結合，以ELISA檢測。該圖描繪了一個有代表性的ELISA。人源化8A6-IgE變體對抗原SM101(可溶FcγRIIB)具有如嵌合抗FcγIIB受體抗體相同的親和性。

圖20：以ELISA法測定8A6-IgE變種結合至sFcεRIα。該圖描繪了一個有代表性的ELISA。人源化抗FcγRIIB-IgE的變體結合至sFcεRIα具有作為相應嵌合抗FcγRIIB-IgE的版本相同的親和力。

圖21：在Raji細胞上標記的8A6-IgE-Fluo488的結合測試。測試到螢光標記的構築體結合到Raji細胞上的FcγRIIB，且CHO細胞(FcγRIIB陰性)作為對照組。螢光在FITC通道進行評估。

圖22：ch8A6_ce2-4-degly與ch8A6_N297A結合到PBMC內的B細胞。8A6-IgE(左排)、8A6-IgE以SM101屏蔽(中排)以及8A6-IgG(右排)結合到B細胞的FACS分析。在右側標明的時間點，針對8A6-IgE結合以α-hCD19-PeCy7染色後以FACS分析以分析B細胞。在右上象限顯示的數字表示在指定的象限中的螢光強度。

圖23：檢測嗜鹼性球的門控策略。具有低SSC的CD193陽性細胞被設定門檻為嗜鹼性球。在未經處理的細胞的CD63表現處實施象限門檻，設定為0。

圖24：以不同濃度的8A6_N297A和8A6_cε2-4-degly處理嗜鹼性球的CD63表現。為了排除8A6_N297A和8A6_ce2-4-degly本身的潛在的活化效應，以8A6_N297A和8A6_ce2-4-degly整夜培養的樣本分析其沒有進一步由抗原活化的CD63的表現。

圖25：LPS控制8A6_ce2-4-degly孵化。全血以50EU/ml LPS培養24小時，分析CD63的表現。

圖26：6小時後活化控制。

圖27：8A6-IgG或8A6 IgE活化後6小時處理的樣品。

圖28：24小時後活化的控制。

圖29：8A6-IgG或8A6 IgE(8A6-cε2-cε4_去糖基化)活化24h後處理的樣品。

圖30：花粉活性測試。

實施例-產生抗-Fc-γ IIB受體抗體

實施例1. 單株抗體8A6的製備

單株抗體株8A6是經由將重組可溶性人類FcγRIIB受體免疫至Long-Evans大鼠所產生的。從大鼠脾細胞產生雜交瘤細胞株，並篩選比對FcγRllA具有更大親和力的特異性結合人類FcγRIIB抗體。其次，使用本領域中已知的技術，對上述雜交瘤產生的抗體進行了無阻斷特性的篩選，即這些抗體仍然允許IgG或ICs結合於膜結合的FcγRIIB。

將50μg的純化重組可溶性人類FcγRIIB(sFcγRIIB，SEQ ID NO.5)以腹膜內(i.p.)和皮下(s.c.)注射方式注射到LOU/C大鼠中，使用不完全弗氏佐劑添加5nmol CpG 2006(TIB MOLBIOL公司，柏林，德國)。經過六週區間，以50μg sFcγRIIB和CpG 2006進行最終促進，在融合前三天以腹膜內(i.p.)和皮下(s.c.)注射方式給予。骨髓瘤細胞株與鼠免疫脾細胞的融合係根據標準程序進行。在固相免疫分析中以sFcγRIIB或不相關的sFcγRllA(SEQ ID NO.12)蛋白塗覆於ELISA盤上以測試雜交瘤的上清液。以對抗大鼠IgG同型的HRP共軛結合的單株抗體 (TIB173抗-IgG2a、TIB174抗-IgG2b、TIB170抗-IgG1皆來自ATCC，R-2c抗-IgG2c為自製)來偵測從組織培養上清液而來的單株抗體結合至蛋白上，因此避開IgM類型的單株抗體。單株抗體8A6(大鼠IgG2a)辨識FcγRIIB，而且使用該抗原特異性ELISA測定不與FcγRllA結合。基於FACS的分析被用來篩選天然抗原結合的抗體特異性。此外，篩選無阻斷特性的抗體，即這些抗體仍然允許IgG或免疫複合物結合於膜結合FcγRIIB。

為了產生足量的抗體，以將嵌合和人源化的構築體特徵化，FreeStyle^TM CHO-S細胞被用來進行瞬時轉染。

轉染的前一天細胞以0.5 x 10⁶cells/ml濃度接種。將細胞離心後再懸浮於培養基中，以得到最終細胞濃度為20 x 10⁶cells/ml。每次轉染3ml的細胞懸浮液轉移至6孔板中。轉染用的質粒DNA以HiSpeed Plasmid Maxi套組(Qiagen公司)根據製造商的使用手冊的指示分離且在無內毒素的水中洗脫。

每一個轉染作用中，將75μg編碼輕鏈的DNA質體與75μg編碼重鏈的DNA質體加入細胞懸浮液中並輕輕混合。之後加入PEI(Polyplus公司)並輕輕混合。將細胞在37℃以及5% CO₂的環境下連續搖動(100rpm)培養3小時。以培養基充填細胞懸浮液至最終體積為15ml，以達到最終細胞濃度為4 x 10⁶cells/ml，並移轉至一125ml燒瓶中。將細胞在37℃以及5% CO₂的環境下連續搖動(100rpm)培養，6天後以離心二次(4000rpm，5分鐘)收獲該懸浮液。懸浮液以0.2μm濾膜過濾，並測定抗體效價(見下文)。

抗體-滴度測定是通過兩個不同的HPLC法來進行，反相(RP)HPLC與蛋白A-HPLC。RP-HPLC分析是用Agilent 1200系列HPLC系統進行。數據是以軟體「Chem Station for LC Systems」修訂版B.04.02來進行分析。溶劑成分為：異丙醇(HPLC等級；Roth公司)、乙腈(HPLC梯度等級；Roth公司)、H₂O(0.2μm過濾)和三氟醋酸(TFA)(針對胜肽合成；Sigma公司)中。溶劑A：H₂O、0.1%TFA；溶劑B：60%異丙醇、30%乙腈、9.9% H₂O，和0.1% TFA。使用孔隙率為300Å的Phenomenex Jupiter管柱(#525166-6)以及帶有5μm粒徑的分離材料。以線性梯度從30%至43%的溶劑B在10分鐘內流洗結合的抗體。以UV/VIS偵測器在λ=210nm處進行偵測。

蛋白A-HPLC分析則使用Agilent 1200系列HPLC系統進行。數據是以軟體「Chemstation」修訂版B.04.02分析。使用下列溶劑，溶劑A：0.05M Tris/HCl、0.1M甘胺酸、0.15M氯化鈉，pH8.0；溶劑B：0.05M Tris/HCl、0.1M甘胺酸、0.15M氯化鈉，pH 3.0。為了分析，一個Upchurch 2×20mm的分析保護管柱中裝入120μl的Applied Biosystems Poros® 20A灌注層析介質(Life technologies公司)。結合的抗體以100%溶劑B流洗。在收集純化抗體的情況下，以56mM Tris pH 8.0中和分離層。

表現的抗體以一支1ml HiTrap^TM rProtein A FF管柱(GE Healthcare公司)進行純化，經由快速蛋白液相色譜法(Äkta Explorer公司)。運行緩衝液含有10mM Tris-HCl pH 8.0，150mM氯化鈉，所述流洗緩衝液則含有100mM甘胺酸，150mM的氯化鈉，pH 2.7。流洗的抗體以60mM Tris-HCl pH 8.0中和、濃縮、無菌過濾後儲存於-80℃。

實施例2. 抗體篩選與8A6的特徵描述

雜交瘤上清液的篩選使用本領域現有技術已知的技術來進行，如ELISA-結合分析、Biacore分析法或流式細胞儀結合分析。為了測試嵌合的8A6或人源化變體的抗原特異性結合，ELISA盤(Nunc-免疫盤，F96 Maxisorp)以在PBS中的1μg/ml sFcγRIIB、sFcγRllA(SEQ ID NO.12)或sFcγRllAmut(SEQ ID NO.13)在4℃下進行整夜塗覆。經過以含有0.01% Tween的PBS洗滌3次後，以含有2% BSA的PBS(300μl/well)在室溫下進行阻隔作用2小時。洗滌3次後，加入連續稀釋的純化抗體或上清液(100μl/well)，且在室溫下培養1小時。純化的抗體以含有2% BSA 的PBS稀釋。上清液以10倍的PBS和20% BSA補充，以得到最終濃度為2% BSA的PBS。作為FcγRllA的陽性對照，使用山羊抗人類FcγRllA(R&D系統，AF1875)。以含有0.01% Tween的PBS清洗3次後，各二級抗體驢-抗山羊-HRP(F(ab')₂，Jackson-Immuno-Research公司)或山羊-抗-人類-HRP(F(ab')₂，Dianova公司)在室溫下培養1小時(100μl/well)。以含有0.01% Tween的PBS清洗孔6次。加入基質(含有0.03% H₂O₂的OPD)(100μl/well)，並以4M H₂SO₄(50μl/well)停止反應。之後以光譜儀在492nm處測定吸光度。

嵌合的8A6或人源化變體對天然抗原的特異性結合的分析，經由細胞結合在Raji(ATCC^®CCL-86^TM)和K-562細胞(ATCC^®CCL-243^TM)上進行。

細胞以離心(400g，5分鐘)成團並以FACS緩衝液(Hanks平衡鹽溶液，1%FCS，0.01% NaN₃)洗滌。在一次額外的離心步驟後，將細胞重懸浮於FACS緩衝液以獲得細胞的最終濃度為2 x 10⁶cells/ml以及將50μl的細胞懸浮液等分在96孔U底板內。以FACS緩衝液製備人源化變體和ch8A6的系列稀釋。

為了驗證FcγRllA在K-562細胞上表現，以FACS緩衝液稀釋小鼠-抗人CD32抗體(Stem Cell Technologies公司，Clone VI.3)。將50μl稀釋的抗體加入到細胞中，並在4℃下培養30分鐘。將細胞以FACS緩衝液洗滌2次。之後，將50μl山羊抗人類IgG-PE共軛結合的(F(ab')₂，Dianova公司)或山羊抗小鼠IgG-PE共軛結合的(F(ab')₂，Dianova公司)二抗以FACS-緩衝液稀釋，加入到細胞中，並在4℃下培養30分鐘。以FACS緩衝液洗滌2次後，將細胞再懸浮於300μl的FACS緩衝液，並以BD FACSCanto^TM II(軟體：BD FACSDiva^TM)進行測定。

為了確定FcγRIIB抗體是否仍允許IgG或免疫複合物結合到膜結合FcγRIIB，進行以FACS為基礎的分析。細胞離心(400g，5分鐘)後成團，並以FACS緩衝液(Hanks平衡鹽溶液，1% FCS，0.01% NaN₃)洗滌。在一次額外的離心步驟後，將細胞重懸浮於FACS緩衝液以獲得細胞的最終濃度為2 x 10⁶cells/ml。以 FACS緩衝液製備系列稀釋的抗體(ch8A6_N297A、chGB3_N297A、R&D Ab mab1875)。將25μl稀釋的抗體與25μl Alexa488-標記的凝集Beriglobin(2.5μl/well)混合於96孔U底板。聚集的人類IgG以尺寸排除色譜法在Superdex-200(16/60)管柱上自商業可購得的匯集的IgG產物(Beriglobin)中分離出來。

將50μl的細胞懸浮液加入到抗體-Beriglobin混合物中，並在4℃下培養1小時。將細胞以FACS緩衝液洗滌2次。之後，將50μl的山羊抗人類IgG-PE共軛結合的(F(ab')₂，Dianova公司)或抗大鼠-PE二級抗體以FACS緩衝液稀釋，加入到細胞中，並在4℃下培養30分鐘。以FACS緩衝液洗滌2次後，將細胞再懸浮於300μl FACS緩衝液中，並以BD FACSCanto^TM II(軟體：BD FACSDiva^TM)進行測定(圖3)。

FACS結合分析

嵌合的8A6或人源化變體對天然抗原的特異性結合的分析，經由細胞結合在Raji和K-562細胞上進行。

細胞以離心(400g，5分鐘)成團並以FACS緩衝液(Hanks平衡鹽溶液，1%FCS，0.01% NaN3)洗滌。在一次額外的離心步驟後，將細胞重懸浮於FACS緩衝液以獲得細胞的最終濃度為2 x 10⁶cells/ml以及將50μl的細胞懸浮液等分在96孔U底板內。以FACS緩衝液製備人源化變體和ch8A6的系列稀釋。

Raji和K562細胞與增加濃度的人源化抗體共同培養，且以嵌合抗體作為對照組。Raji細胞被用來測試對FcγRIIB(圖4)的結合，K562細胞則用來分析非特異性結合的FcγRIIA(圖5)。以PE共軛結合的二級抗體偵測細胞結合的抗體。所有的人源化變體對FcγRIIB的結合具有相當於ch8A6_N297A的親和力，且所有人源化變體仍以比FcγRIIA大的結合性與FcγRIIB結合。

使用Biacore T200生物傳感器(GE Healthcare公司/Biacore)以表面等離子體共振分析抗體結合到sFcγRIIB和sFcγRllA。實驗是在慕尼黑大學生物系微生物學，生物分析服務單位中進行。分析的抗體被捕捉到一系列S傳感器晶片CM5傳感器晶片上，根據製造商的標準實驗方法使用人抗體捕獲試劑盒。Hu8A6變體或ch8A6在10nM的濃度下被捕獲1分鐘。分析物sFcγRIIB以各種濃度注入3分鐘。在25℃以及連續流(10μl/min)條件下進行測定。使用Biacore T200評估軟體(版本1.0)假設1：1結合來評估數據。

實施例3. 8A6大鼠抗體的嵌合作用

抗FcγRIIB嵌合單株抗體8A6是由融合大鼠8A6 VH區到一訊號胜肽以及人類IgG1恆定區構成。此外，使用含有N297A突變的IgG1恆定區產生重鏈的去糖基化變體。為了構築8A6的輕鏈基因，將大鼠8A6 VL區也同樣融合到一個信號序列，且該序列為一人類κ恆定區接著次選殖到哺乳動物的表現載體中。

體外試驗

細胞、試劑和抗體

人類伯基特淋巴瘤細胞株Daudi和Ramos細胞株分別自DSMZ(ACC78和ACC603)購得，並將細胞置於37℃與5% CO₂下，維持在含有10% FBS(Gibco公司/Invitrogen公司)、MEM NEAA(Gibco公司/Invitrogen公司)、1mM丙酮酸鈉(Gibco公司/Invitrogen公司)和2mM L-麩醯胺酸(Gibco公司/Invitrogen公司)的RPMI 1640(Gibco公司/Invitrogen公司)中。初代人類B細胞從健康捐贈者的肝素化血液中純化而來，使用Ficoll密度梯度(Leucosep，Greiner Bio-One，Biocoll分離溶液，Biochrom公司)與負磁分離系統(非接觸式磁珠人類B細胞，Invitrogen公司)進行純化。富集的B細胞的純度以FACS分析進行研究，並透過以抗-hCD19-APC(BD Pharmingen公司#555415)，抗-hCD3-PerCP-Cy5.5(BD Biosciences公司#332771)以及抗-hCD56-PE(BD Pharmingen公司#555515)染色進行FACS分析。直接使用初代B細胞進行實驗，無需進一步培養。阻斷性抗FcγRIIB抗體2B6係根據歐洲專利EP1534335而來。

使用可溶性抗體的刺激混合物的刺激標準方法

針對BCR和FcγRIIB的同時刺激，使用2μg/ml小鼠抗-hIgM單株抗體(Southern Biotech公司#9022-01，clone UHB)以及20μg/ml兔抗-mIgG(1,2a,3)單株抗體(Epitomics公司#3020-1，clone M111-2)的抗體混合物來設置一抗體系統，其Fc部分與人類FcγRIIB受體交互反應。對照組以20μg/ml兔抗-hIgM多株抗體(antibodies online公司#ABIN117299)或含有2μg/ml抗-hIgM抗體以及同型對照mIgG2b抗體(clone MPC-11，BD Pharmingen公司#557351)的混合物進行。3x10⁵個淋巴瘤細胞株Daudi或Ramos細胞株的細胞以及初代B細胞以離心收獲，並以存在於分析培養基(RPMI 1640+1% FBS)中的不同的刺激混合物在37℃下培養20分鐘。

接著將5μg/ml的抗-FcγRIIB抗體ch8A6(0.8μl的1：10稀釋液)、2B6(1.5μl的1：10稀釋液)或chGB3_N297A(1.1μl的1：10稀釋液)加入到樣品中，且細胞進一步培養25-30分鐘。裂解的進行為單獨描述。

磷酸化模式的西方墨點分析

細胞裂解

細胞在4℃下沉澱，以冰冷的PBS清洗，並以含有磷酸酶抑製劑(PhosStop，Roche公司)、蛋白酶抑製劑(完全超小型，無EDTA，Roche公司)以及1mM PMSF(Fluka Biochemica公司)的10μL裂解緩衝液(RIPA緩衝液，Cell Signaling公司)在冰上靜置30-45分鐘。

十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳

離心後，上清液裝載有樣品緩衝液(NuPAGE LDS樣品緩衝液，NuPAGE樣本還原劑，Invitrogen公司)被加到SDS-PAGE上(NuPAGE Novex的Bis-Tris迷你凝膠，MES SDS電泳緩衝液(Invitrogen公司))。針對SDS-PAGE分析，加入LDS樣品緩衝液和還原劑，並將樣品在95℃下加熱5分鐘。樣品儲存在-20℃或直接以SDS-PAGE和西方墨點分析法直接分析。

蛋白質轉移到PVDF膜上以及檢測

接著，將蛋白轉移到PVDF膜(Roti-PVDF，Roth公司，轉移緩衝液10mM Tris，100mM甘胺酸，10%甲醇，轉印條件240mA常量，4℃下90分鐘)。以含有5% BSA的TBS-T(10mM Tris，150mM NaCl，0,1% Tween20)阻隔膜，並以抗FcγRIIB/CD32的磷酸(pY292)(Cell Epitomics公司# 2308-1，1：50000，4℃整夜)或抗phosphoSHIP(1：1000，Cell Signaling公司#3941)和抗-兔HRP(Jackson ImmunoResearch公司#111-036-045，1：50,000在TBS-T中，室溫1小時)染色。在X光片上偵測化學發光(與WesternLightning Plus開發，Perkin Elmer公司)。

剝離

針對隨後直接對抗其他磷酸化蛋白質的抗體的分析，將膜進行剝離(Re-Blot Plus，Millipore公司)10分鐘，洗滌、阻斷，並以抗β-肌動蛋白抗體(Sigma-Aldrich公司#A1978，1：50,000，以及抗小鼠IgG-HRP，Sigma-Aldrich公司#A9044)或其他信號傳導蛋白的抗體染色。

所公開的抗體顯著地增加在來自健康捐贈者的周圍血單核細胞(PBMC)中的FcγRIIB-ITIM磷酸化

從健康捐贈者而來的PBMC被分離且保持未處理或以刺激混合物(小鼠抗hIgM單株抗體和兔抗mIgG單株抗體)培養25分鐘。隨後，細胞以ch8A6或作為對照組的緩衝液處理。使用如上所述的適當的偵測抗體，將細胞裂解物以西方墨點法分析。偵測到在細胞(PBMC，B細胞)的FcγRIIB-ITIM基序的磷酸化作用有顯著的增加(圖6a)。單獨以刺激混合物刺激細胞，或是單獨以小鼠抗hIgM單株抗體、兔抗mIgG單株抗體與ch8A6結合的對照組實驗則未顯示出FcγRIIB-ITIM-磷酸化作用的增加(圖6b)。因此，公開的抗體顯現出對帶有交聯的BCR(B細胞受體)與膜結合的(內源性表現的)FcγRIIB的人類細胞的ITIM-磷酸化作用的顯著效果，且對未受刺激的細胞，即不具有交聯的BCR與膜結合的FcγRIIB，則無效果。自體免疫疾病期間，BCR和膜結合的FcγRIIB將會由自身抗原或免疫複合物(ICs)交聯。該抗體能夠透過增加FcγRIIB-ITIM-磷酸化作用而在自體免疫疾病中抑制致病性的自身反應的B細胞。然而，該抗體不需交聯的BCR也能夠增加ITIM磷酸化(圖6c)。

比較ch8A6與抗體chGB3_N297A的效果

比較ch8A6_N297A抗體與chGB3_N297A抗體對ITIM磷酸化的影響。人類Daudi細胞以一抗體混合物處理，且隨後以如上所述的ch8A6_N297A、chGB3_N297A或2B6處理。抗體chGB3_N297A，如同ch8A6_N297A一樣，是一種非阻斷性抗FcγRIIB抗體且識別一個相似的抗原決定位。

將ch8A6_N297A加入以抗體混合物處理的細胞，顯示在0.05μg/ml的濃度下就已經有FcγRIIB-ITIM磷酸化的增加。雖然chGB3_N297A濃度的增加顯示出該抑制模體的磷酸化作用的劑量依賴性刺激，令人驚訝地，該抗體選殖系無法達到可與8A6比得上得磷酸化作用程度。X光片的光密度定量以及軟體「ImageJ」計算出最大值2.8倍磷酸訊號，而相較於未處理的細胞，hu8A6_N297A導致增加9.8倍(圖7)。因此，本發明的抗體相較於chGB3_N297A抗體，清楚地令人驚訝地顯示出增加FcγRIIB-ITIM磷酸化。

比較人源化變體hu8A6、嵌合8A6_N297A和chGB3_N297A對於 在初代周圍血單核細胞(PBMC)中的ITIM磷酸化的效果

比較chGB3_N297A、ch8A6_N297A和人源化8A6抗體對於初代人類PBMC的FcγRIIB-ITIM磷酸化的影響。BCR與FcγRIIB在透過抗體混合物交聯之後，加入5μg/ml不同的抗體，並進行西方墨點法分析ITIM磷酸化。再次的，相較於現有技術的抗體，本發明之抗體令人驚訝地對FcγRIIB-ITIM磷酸化具有顯著增加的效果。

磷酸化的FcγRIIB-ITIM基序與SHIP-1的免疫共沉澱

受體的交聯之後，磷酸酶SHIP經由其SH2區結合至在該FcγRIIB-ITIM基序內的磷酸酪胺酸而被補充到膜上，接著在SHIP-1的C-端結構域內的NPXY模體上進行酪胺酸磷酸化作用。重新回到膜上以及該NPXY模體接著磷酸化對於調節SHIP-1的功能是必需的。其對於鈣流量、細胞存活、生長、細胞週期阻滯和凋亡作用是通過PI3K和Akt途徑調節的。Tyr1021位於SHIP-1內的NPXY模體之一，且其磷酸化作用對於SHIP-1的功能是重要的(Nimmerjahn，Ravetch，2008年)。

人類Daudi細胞以如[00103]段定義的抗體混合物刺激，之後在一溫和的裂解緩衝液(共沉澱裂解緩衝液)中裂解，將樣品與用於捕捉FcγRIIB的2B6一起培養。複合物結合到ProteinG耦合的鐵珠，並且以磁架分離。

1x10⁷細胞/樣品的裂解物在500μl共沉澱裂解緩衝液中製備，在冰上培養該細胞30分鐘，每10分鐘震盪混合一次。在4℃下以13,000rpm離心10分鐘將細胞碎片離心下來，將上清液轉移到新的試管中。將500μl裂解物在4℃下與10μg 2B6一起培養2-3小時。以500μl裂解緩衝液清洗2次磁性蛋白G耦合的磁珠，並將50μl的磁珠(1.5mg)加到裂解物-抗體-複合物中，在4℃下整夜培養(轉輪培養)。經由以200μl裂解緩衝液洗滌二次將複合物由磁珠流洗出來，並在25μl含還原劑的1×LDS樣品緩衝液中加熱磁珠5分鐘。在以4000 x g離心30秒後，將10μl的上清液加到SDS-PAGE上進行西方墨點法分析。

裂解物的西方墨點法分析結果顯示，在處理抗體混合物與ch8A6_N297A的細胞樣品中，磷酸化SHIP-1的含量顯著地提高。當與FcγRIIB專一的抗體2B6共同沉澱時，只有分離的SHIP-1與FcγRIIB結合共沉澱。剝離和重新染色後的膜，在處理ch8A6_N297A的樣品中，表現出增強的FcγRIIB-ITIM基序的磷酸化作用，ch8A6_N297A與磷酸化SHIP1信號相關。以α-hFcγRIIB a、b、c(人類Fc RII/CD32抗體，多株抗體，山羊IgG，R&D Systems公司，AF1330)第二次重新染色顯示，在所有樣品中沉澱的受體FcγRIIB是等量的，其作為SDS-PAGE裝載量的對照組(圖9)。

實施例4. IgG形式的ch8A6的人源化

經由將來自大鼠抗體的互補性決定區序列嫁接到人類框架上而使ch8A6被人源化。為了篩選人類框架，將V_H和V_L序列與人類Ig變異區與連接區種系節段的V_H和V_L序列進行比較，這些序列是從公開可得的資料庫取得(IMGT，V-BASE)。分別選擇VH_3_30 plus IGHJ4人類種系序列以及VK3_15 plus IGKJ2人類種系序列作為重鏈和輕鏈。

產生數個人源化重鏈和輕鏈的變體。基因編碼人源化V_H和V_L的設計序列後次選殖到一哺乳類表現載體上。直接從轉染的CHO-S細胞(Invitrogen公司)的上清液進行抗體變體的篩選程序。以嵌合抗體8A6作為人源化變體的篩選過程中的轉染對照組和標準。透過ELISA分析Hu8A6變體結合在sFcγRIIB與sFcγRllA上，且透過FACS分析Hu8A6變體結合在Raji細胞上的天然FcγRIIB(見上文)。此外，以表面等離子共振進行抗體變體的動力學特性分析。

人源化8A6變體的測試

為了測試人源化8A6變體的磷酸化作用活性，以抗體混合物刺激Daudi細胞，以0.5或5μg/ml的不同8A6變體的處理，並進行西方墨點法分析ITIM磷酸化。

人源化8A6變體與ch8A6_N297A的比較

所有受測的8A6人源化變體都能夠誘導受體的磷酸化作用，且與由來自相同純化批次的ch8A6_N297A所誘導者比較磷酸化的程度。因此，在第二輪人源化之後沒有偵測到活性的損失。雖然Biacore的數據顯示不同組合的重鏈和輕鏈具有不同的親和力，但是以西方墨點法分析則偵測不到這些差異(圖10)。

人源化8A6變體與ch8A6_N297A、阻斷型抗-FcγRIIB(2B6)和chGB3_N297A的比較

在人源化鏈組合的最終選擇後，該變體、結合重鏈V_H10與輕鏈V_L6，與ch8A6_N297A、2B6與chGB3_N297A進行比較(圖11)。

體內試驗

SLE-PBL-膜型

Rag2/gamma-c/Fcγ-/-小鼠以6Gy的劑量照射，並以腹膜內注射將在500μl PBS中的不同量的人類周圍血白血球注射到小鼠體內。

小鼠的治療是在注射細胞2週後開始，將人類SLE-病患的PBL嫁接到小鼠之後，以hIgM或hIgG的存在來驗證。小鼠以腹膜內注射200μl緩衝液(PBS)或在200μl PBS中20μg抗體(ch8A6_N297A)來治療，每週二次持續四週。每週一次對小鼠稱重並採血以獲得血清。將血清樣本冰凍於-80℃下直至進一步使用(圖12)。

酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)

以ELISA分析血清樣品中總人類IgG、IgM和抗DNA IgM和IgG的存在。

使用Bethyl人類IgM ELISA定量套組與人類IgG ELISA定量套組(Biomol公司)，根據製造商的說明書指示，對血清樣品中的總血清IgM與IgG進行量化分析。以VersaMax可調微量盤讀取儀(Molecular Devices公司)在450及650nm波長下測量吸光度(OD值)。

為了檢測抗DNA抗體，以在PBS中的10μg/mL甲基化BSA(Sigma公司)塗覆ELISA盤並置於室溫下2小時。洗滌後，以在PBS中的50μg/mL小牛胸腺 DNA(Sigma公司)塗覆該ELISA盤並置於4℃下整夜。以PBS/0.1%明膠/3% BSA/1mM EDTA在室溫下2小時進行非專一性結合的阻斷。血清以阻斷溶液以1：100的倍數稀釋，並且置於室溫下1小時。作為檢測抗體時，人類IgM定量套組(Bethyl公司)的HRP偶聯抗體以阻斷溶液稀釋至1：10,000，接著置於室溫下1小時。PBS係用於所有洗滌步驟。為了檢測，加入TMB溶液，並以6%正磷酸停止反應。

SLE PBL模式、總人類血清免疫球蛋白

在嫁接來自患有SLE的人類捐贈者的PBL的小鼠內分析總人類IgG含量[μg/mL]。PBS或抗-FcγRIIB之間的總人類IgG含量並無測得顯著差異。根據本發明之抗體並未顯著地影響總人類IgG(圖13)。

SLE PBL模式，對抗DNA抗體的影響(疾病特異性IgG)

在SLE-PBL傳輸/嫁接後四週開始，在抗-FcγRIIB小鼠中的疾病特異性人類抗-DNA IgG被觀察到有顯著的下降。本發明之抗體特異性地減少疾病相關的抗DNA抗體的數量(圖14)。

實施例5-結合至FcγIIB受體和Fcε受體的雙特異性抗體的產生

8A6-IgG與8A6-IgE構築體的命名定義：

嵌合的：

人源化的：

不同的FcγRIIB IgE抗體的生成、表現和純化的描述。

構築設計

如圖15所描述，所有構築體的共同點是，雜合抗體的Fab區相當於一個IgG分子(變異區和CL-/CH1結構域)。此外，所有的構築體都具有IgE恆定區Cε3和Cε4。這些結構域都是與IgG-Cg2及Cg3同源的。在IgG抗體中，鉸鏈區是負責該分子的所需的靈活性，並經由雙硫鍵形成二聚體。該鉸鏈區不存在於IgE抗體內。代替鉸鏈區的是額外的結構域Cε2具有此功能。該8A6-IgE抗體顯示其Fab區的高靈活性，以及來自Cg1-結構域變換到Cε-結構域的最佳切換。因此設計了變體保留IgE的IgG的鉸鏈區(參見圖15)或整個Fcε區(Cε2、Cε3、Cε4)(見圖15)。另一個變體與在該Fcε-區內的N-糖基化位點的不同量有關。IgE-Fc-區的糖基化作用對FcεRI的親和力沒有影響，但對該抗體的表現與穩定性有影響。這些構築體依照標準實驗操作方法被選殖到質體載體中。

細胞株與培養條件

根據供應商的建議培養CHO-S細胞。簡而言之，將細胞培養於Freestyle CHO-S培養基，其中添加了2mM Glutamax，且每2-3天繼代一次。細胞培養在37℃、5% CO₂、100rpm下。轉染前一天，細胞以0.5 x 10⁶cells/ml的密度分開，並進行存活力檢查(>96%)。

人類Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞和Daudi細胞培養於添加有10% FBS、MEM NEAA、1mM酮酸鈉和2mM L-麩醯胺酸的RPMI1640中，在37℃和5% CO₂條件下培養。細胞以0.2-1.0 x 10⁶cells/ml的密度，每2-3天繼代一次。

帶有FcγRIIB_IgE構築體的CHO-S細胞的轉染

在轉染當天，細胞密度為1.0-2.0 x 10⁶cells/ml。8.0 x 10⁸個細胞被稀釋在20ml CHO Freestyle培養基中(40 x 10⁶cells/ml)。加入1000μg質體-DNA(每個500μg，重鏈和輕鏈)(50μg DNA/ml轉染體積)，隨後加入2000μg PEI(00μg PEI/ml轉染體積)。細胞在37℃、5% CO₂、100rpm條件下培養3小時。在此之後，將細胞懸浮液以1：10的比例稀釋於CHO Freestyle培養基中，加入0.5mM丙戊酸，並在31℃、5% CO₂、100rpm的條件下培養10天。上清液以4000×g離心10分鐘2次後收獲。

滴度測定、純化和體積排阻色層分析

經由蛋白質A-HPLC的抗體滴度測定

以Agilent 1200系列HPLC系統進行蛋白質A-HPLC分析。數據是以軟體「Chemstation」修訂版B.04.02進行分析。使用下列溶劑，溶劑A：0.05M Tris/HCl、0.1M甘胺酸、0.15M NaCl、pH 8.0；溶劑B：0.05M Tris/HCl、0.1M甘胺酸、0.15M NaCl，pH 3.0。為了分析，一個Upchurch 2×20mm的分析保護管柱(#C-130B)中裝入120μl的Applied Biosystems Poros® 20A灌注層析介質(Life technologies公司，#4374732)。結合的抗體以100%溶劑B流洗。在收集純化抗體的情況下，以56mM Tris pH 8.0中和分離層。

8A6-IgE的純化

培養六天後，收穫細胞並以4000 x g離心10分鐘2次得到含有抗體的上清液。將抗體以一支5ml高陷阱蛋白A FF管柱(GE Healthcare公司)透過快速蛋白液相色層分析法(Äkta Explorer公司)進行純化。該抗體與蛋白質A的結合是透過其 VH3框架調節的。運行緩衝液含有10mM Tris-HCl pH 8.0，150mM氯化鈉，所述流洗緩衝液則含有100mM甘胺酸、150mM的氯化鈉，pH 2.7。流洗的抗體以60mM Tris-HCl pH 8.0中和，濃縮(Sartorius Vivaspin4)至約1.0mg/ml，以0.2μm濾膜進行無菌過濾後儲存於-80℃。

實施例6：嵌合8A6-IgE構築體的特徵分析

尺寸排阻高效液相色層分析法

為了確定純化的8A6-IgE變體的寡聚合狀態和均勻性，將樣品施加於SE-HPLC。以Agilent 1200系列HPLC系統進行SE-HPLC。數據是以軟體「Chemstation」修訂版B.04.02進行分析。以一支Superdex 200 10/300 GL管柱(GE Healthcare公司)進行分析。使用以下溶劑，5mM His、150mM NaC，pH 6.5。以0.5μg/μl的濃度加入25μg的蛋白質。

這表明，相較於標準的ch8A6_N297A，糖基化的8A6-IgE變體可具有形成更多二聚體的傾向，而去糖基化的8A6-IgE似乎有更多降解，且相較於標準ch8A6_N297A，具有較高比例的片段。

結合分析

進行數個結合分析以分析該抗體的結合親和力和特異性。針對這些結合分析，可溶性FcεRIα係按照以下標準操作方法產生的：

可溶性FcεRIα的產生

帶有sFcεRIα的CHO-S細胞的轉染

在轉染當天，細胞密度為約1.0 x 10⁶cells/ml。將500ml的細胞懸浮液轉移到二個1公升的燒瓶中。輕輕倒置Freestyle Max試劑，將312.5μl稀釋於5ml Optipro SFM中(室溫)。將312.5μg的質體DNA(pAC91，sFc RIa-H6)(SEQ ID NO：37)稀釋於5ml OptiPro SFM中並輕輕混合。稀釋的Freestyle Max試劑加入該DNA/Optipro SFM混合物中，並於室溫下靜置15分鐘。將該DNA-脂質混合物緩慢加入到細胞中，且慢慢地轉動燒瓶。轉染的細胞在37℃、5% CO₂、100rpm的條件下培養6天。上清液以4000×g離心10分鐘2次後收獲。

sFcεRIα的純化

為生產重組可溶性FcεRIα，將人類FcεRIα(pAC91)的His標籤的胞外結構域轉染到CHO-S細胞內，如所描述。經由NiNTA-純化作用(Qiagen公司，#1018244)以及一個Äkta Explorer進行從細胞上清液純化sFcεRIα。使用下列緩衝液：結合緩衝液含有50mM磷酸二氫鈉、300mM氯化鈉、10mM咪唑，pH8.0；洗脫緩衝液含有50mM磷酸二氫鈉、300mM氯化鈉、400mM咪唑，pH8.0。以從0%至100% B的線性梯度流洗結合的sFcεRIα。在濃縮sFcεRIα部分後，以10mM His，pH 6.5進行緩衝液交換。這之後，以弱陰離子交換色層分析法與DEAE Sepharose FF管柱(GE Healthcare公司，# 17-0709-10)與一個Äkta Explorer進行sFcεRIα的純化。溶劑A是由10mM His，pH 6.5組成；溶劑B含有10mM His、0.5mM NaCl，pH 6.5。以從2%至100% B的線性梯度流洗結合的sFcεRIα。濃縮的蛋白儲存在10mM His、150mM NaCl、pH6.5、-80℃下。

十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳

針對SDS-PAGE分析，1μg的純化抗體或Trenzyme材料被加到NuPAGE Bis-Tris(4-12%)凝膠。將抗體加入NuPAGE LDS樣品緩衝中或在還原條件下除樣品還原試劑外，並預熱至75℃ 10分鐘，根據製造商的建議進行。以200V的恆定功率進行SDS-PAGE分析30分鐘。隨後凝膠在水中洗滌二次，並用簡單的藍色染色溶液(Life Technologies公司)染色。在水中去除多餘的染料，並以透照器(紫外光，白光)進行凝膠的可視化。

ELISA結合分析

8A6-IgE結合至sFcγRIIB或sFcεRIα

為了測試糖基化和非糖基化形式的8A6_cε2-4/8A6_cε3-4抗體對於sFcγRIIB和sFcεRIα的結合效能，建立一個ELISA分析。對此，以SM101或sFcεRIα，1μg/ml在PBS(體積100μl)在室溫下塗覆一96孔盤1小時。以PBS、0.01% Tween®-20洗滌該96孔盤2次，並以PBS、2% BSA、250μl/well在室溫下阻隔該96孔盤2小時。洗滌步驟後，以PBS、2% BSA對抗體樣品進行適當的系列稀釋，並在室溫下塗覆於該96孔盤1小時。以PBS、0.01% Tween®-20洗滌該96孔盤3次，且加入定向到人類κ輕鏈-HRP綴合的二級偵測抗體，以PBS、2% BSA稀釋至1：8000，在室溫下反應1小時。經過三次洗滌步驟後，以OPD、0.03%過氧化氫100μl/孔偵測結合的HRP綴合的抗體。以50μl 4M H₂SO₄終止反應，並使用ELISA讀取儀(Tecan公司，Spectra FluorPlus)在492nm波長下測量吸收值。直接結合sFcγRIIB表明所有4個8A6_IgE構築體對sFcγRIIB具有與ch8A6_N297A抗體相同的親和力(圖16)，因為其共享Fab區。然而，8A6-IgE構築體結合至sFcεRIα證明，全長的IgE Fc部分(cε2-4)與較短的版本(cε3-4)的構築體之間的差異(圖17)。

8A6-IgE結合sFcγRIIB和sFcεRIα的三明治ELISA分析

三明治ELISA分析的進行顯示同時結合兩種抗原。所產生的8A6_cε2-4/8A6_cε3-4變體對兩個目標sFcγRIIB以及sFcεRIα的結合效力以此三明治ELISA分析進行測試。對此，96孔盤以可溶性FcγRIIB(SM101)、1μg/ml在PBS內(體積100μl)在室溫下塗覆1小時。以PBS、0.01% Tween®-20洗滌該96孔盤2次，並以PBS、2% BSA、250μl/well在室溫下阻隔該96孔盤2小時。洗滌步驟後，以PBS、2% BSA對抗體樣品進行適當的系列稀釋，並在室溫下塗覆於該96孔盤1小時。以PBS、0.01% Tween®-20洗滌該96孔盤3次，並與在PBS中的0.005μg/ml sFcεRIα、2% BSA一同在室溫下培養1小時。再以PBS、0.01% Tween®-20洗滌該96孔盤3次，且加入定向到人類FcεRIα CRA1的二級生物素化偵測抗體，0.5μg/ml稀釋至PBS、2% BSA，在室溫下反應1小時。以PBS、0.01% Tween®-20洗滌該 96孔盤三次後，加入以PBS稀釋1：200的HRP綴合的鏈黴親和素，在室溫下反應20分鐘。經過三次洗滌步驟後，以OPD、0.03% H₂O₂ 100μl/well偵測結合HRP綴合的鏈黴親和素。以50μl 4M H₂SO₄終止反應，並使用ELISA讀取儀在492nm波長下測量吸收值。

三明治ELISA分析證實從ELISA分析得到的結果。同樣，8A6_cε3-4構築體對FcεRIα的低親和力顯示出與同時結合FcγRIIB與抗體的Fab片段。

FACS結合分析

以FACS分析確定抗體與細胞表面表現的天然FcγRIIB的結合。使用Raji細胞，因為這種來自Burkitt淋巴瘤的B淋巴細胞株表現高含量的FcγRIIB。將Raji細胞成團後以1.0 x 10⁵cells/well密度接種在96孔圓底細胞培養盤上，在50μl FACS緩衝液(HBSS、5% FBS、0.01% NaN₃)中。待測抗體以50μl的FACS緩衝液進行適當的序列稀釋後加入Raji細胞，並在4℃下作用1小時。以200μl FACS緩衝液經過二次洗滌步驟後，細胞與以FACS緩衝液稀釋為1：200的定向到人類κ輕鏈(Fab)₂的FITC-綴合的二級抗體在4℃下作用30分鐘。經過二次洗滌步驟後，細胞團塊以150μl FACS緩衝液重新懸浮，且以帶有FACS Canto II的流式細胞儀(BD Biosciences公司)進行分析。

該分析顯示對所有8A6變體而言，相較於ch8A6_N297A，8A6變體的Fab片段保持對FcγRIIB的結合能力，不論該抗體的Fc部分是否被改變(圖18)。

Biacore

抗體構築體對FcγRIIB和FcεRIα的親和力進一步透過使用Biacore^TM T200系統以表面等離子體共振(SPR)分析。

sFcγRIIB共價固定到一個系列S傳感器晶片CM5(Biacore公司，BR-1005-30)，使用標準胺偶聯操作方法(BIAsensor surface操作手冊，Biacore公司)。抗體變體在50nM的濃度下被捕獲1分鐘。以0.1-25nM不同濃度注射分析物sFcεRIα 3分鐘，接著為7分鐘的解離步驟。該CM5晶片以含有3M氯化鎂的緩衝液再生，透過溶解該配體和SM101的相互作用，從而製備之，而可用於一個新的分析週期。測定是在25℃和連續流(10μl/min)的條件下進行。使用Biacore T200評估軟體(1.0版)，假設1：1結合來進行數據評估。

結合實驗的總結：

結果發現，所有構築體對FcγRIIB的結合親和力等於原始IgG抗體的結合親和力。相對於結合到FcεRIα，對8A6-IgE的兩種抗原的結合特徵的結果表明，被縮短的變體8A6_cε3-4/degly可能無法發揮與全長IgE構築體同樣的對Fc ε RI之高親和力。

實施例7：人源化8A6-IgE抗體的生產與特徵分析

8A6-IgE的人源化

為了ch8A6-IgE的人源化，該抗體的可變重鏈換成具有SEQ ID NO.3的人源化可變重鏈10(VH10)。可變輕鏈6(VL6；SEQ NO.4)與該人源化重鏈一起用於人源化8A6-IgE構築體的表現。

以標準選殖程序進行可變重鏈的交換。以標準選殖程序進行可變重鏈的交換。以DNA定序確認插入是正確的插入。

此外，除去重鏈序列C端的離胺酸，並且換成一個停止密碼子(AAA→TAA)。這顯著減少了電荷變體的量。它可以透過誘變PCR來實現，且以定序來驗證成功的突變。

以ELISA分析人源化8A6-IgEs的抗原結合的特徵

使用與實施例2相同的標準操作程序來進行ELISA分析。hu8A6-IgE變體的結合測試與ch8A6_N297A相比。在此，未偵測到對可溶性FcγRIIB的結合親和力的差異(圖19)。測試人源化和嵌合的8A6-IgE變體以其Fc部分與sFcεRIα的結合。相較於帶有完整Fc部分(cε2-4)的8A6-IgE變體，帶有縮短的Fc部分(cε3-4)的嵌合的和人源化的8A6-IgE變體，皆表現出對FcεRIα具有較低的親和力。然而，在嵌合的和人源化的抗體中則未偵測到差異(圖20)。

實施例8：在周圍血單核球(PBMC)上8A6-IgE的標籤和結合動力學

以去糖基化版本的全長ch8A6_cε2-4構築體進行對FcεRI的結合研究。

方法：

8A6(IgE)和(IgG)被以螢光染料NHS-Fluo488標記。

按照生產廠商的說明書，透過一支PD-10管柱，將500μg的每種抗體在PBS中脫鹽。以光度計在280nm波長下測量流洗分段的吸光度(參考：320nm)，且合併含有最高抗體量的分段。經由Vivaspin4管柱濃縮後，大約400μg的抗體可以被重新獲得。

螢光染料Fluo488重新構築於DMSO中，且在螢光發射最大值在517nm波長下測量螢光並計算濃度。

抗體和染料以1：10的莫耳比進行混合，該染料被緩慢地加入到抗體溶液，且震盪該樣品。抗體和染料量確切的計算可以在附錄中找到。該溶液在25℃下以300rpm恆定振盪下作用1小時(Eppendorf恆溫混合器)。游離的染料分子經由PD-10管柱分離而純化。合併具有最高標記蛋白量的分段，在280nm波長下(抗體)和510nm波長下(染料)測量，經由Vivaspin4管柱再次濃縮，並計算最終濃度和標記(D.O.L.)的程度。

計算最終標記的抗體：ch8A6-cε2-4-degly-T：1.35μg/μl，D.O.L.：2.2

ch8A6_cε3-4-degly-T：1μg/μl，D.O.L.：2.86

螢光染料和抗體數量的計算：

˙8A6(IgE)的分子量：約176,000Da=176,000g/mol

→350μg抗體=2nmol

˙Fluo488的分子量：約981mol/l

→在DMSO中重新懸浮未定義量

→在水中稀釋1：5,000且測量OD₅₁₇(該染料的最大發射波長)

→濃度[μg/μl]=稀釋因子x OD517 x 918/80,000=8.6nmol/μl

˙染料對抗體比例的計算：

→染料：抗體所需的莫耳比=10：1

→抗體2nmol→染料20nmol

→2.3μl染料

標記程度(D.O.L)的計算：

˙蛋白質濃度與D.O.L計算的定義

→A_max=該染料的最大發射波長下的吸收，針對Fluo488為波長517nm

→A₂₈₀=在波長280nm下的吸收(蛋白質)

→CF=修正係數；以專為每種與蛋白質結合的染料Interchim來定義；A₂₈₀(游離染料)/A_max(游離染料)

→MW：蛋白質的分子量

→ε：消光係數

˙c[蛋白質]=1,4 x(A₂₈₀-A_max x CF)

˙D.O.L.=(A_max x MW)/(c[蛋白質]x ε_染料)

以Ficoll密度梯度離心法製備周圍血單核細胞(PBMCs)

來自健康捐贈者的血沉棕黃層以HBSS進行1：1稀釋，並取30ml置於裝有15ml Biocoll分離溶液的50ml Falcon試管中。以1000xg離心20分鐘且不以剎車停止，以塑膠吸管收集白血球層。細胞以完全生長培養基清洗二次，並以Neubauer計數室計算細胞數。

在周圍血單核細胞(PBMCs)上ch8A6 cε2-4-degly-T與ch8A6 N297A的結合動力學

將在100μl完全生長培養基內的0.5x10⁶PBMCs培養於96孔培養盤內(平底)並置於37℃培養箱中，並以下列抗體稀釋液一同培養：2μg/ml ch8A6_cε2-4-degly-T cFluo488、2μg/ml ch8A6_N297A-Fluo488、2μg/ml 8A6 cε2-4-degly-T。每個時間點多準備一個額外的孔井。作為對照組，以帶有超過5倍莫耳數的SM101的預培養ch8A6_cε2-4-degly-T-Fluo488在室溫下作用30分鐘以阻斷與PBMCs上的FcγRIIB結合。以FACS分析在Raji細胞上培養後的Fc RIIB結合位點的阻斷。

10、30、60、120和240分鐘後，以及整夜培養後，將細胞以400xg離心5分鐘，以含有2.5μl α-hCD19-PeCy7、5μl α-hCD63-PerCP以及2.5μl α-hCD193-APC的100μl FACS緩衝液重新懸浮細胞，並置於圓底96孔盤在冰上靜置30分鐘。經過兩次以FACS緩衝液洗滌步驟之後，將樣品以FACS Canto II分析。

Fluo488標記的8A6-IgG和8A6-IgE結合到Raji細胞

Raji細胞以不同濃度的標記抗體培養，並將平均螢光值對抗體濃度的結果繪製成圖。抗體8A6_cε2-4-degly對其在Raji細胞表面上的受體Fc RIIB表現出較高的結合親和力。(參見圖21)以CHO細胞的分析確認此一結合的專一性，CHO細胞與相同的構築體培養，結果沒有偵測到標記抗體的表面訊號，與預期結果相同，這是因為CHO細胞缺乏FcεRI受體。這些數據證實，在整個標記過程或經由結合螢光染料NHS-Fluo488，抗體的結合未被改變。

8A6_cε2-4-degly的FcγRIIB結合位點的SM101屏蔽的控制

為了能夠檢測8A6-IgE的Fc部分與細胞的結合，透過將該抗體以SM101預先培養以分別阻斷F(ab)2區、FcγRIIB結合位點。以流式細胞儀(FACS)分析該構築體的結合能力。流式細胞儀(FACS)分析清楚地顯示，在與5倍莫耳過量的可溶性受體(SM101)預先培養後，阻斷了8A6_cε2-4-degly對其受體Fc RIIB的結合。相較於未處理的抗體，與SM101預先培養後的平均螢光值降低至11.8%。因此，被屏蔽的8A6_cε2-4-degly抗體可以用來作為PBMC培養的對照組。

在周圍血單核細胞(PBMCs)上的結合動能

以流式細胞儀(FACS)分析標記Fluo488的抗體8A6-IgE在分離的PBMCs上的結合。因此，細胞以α-hCD193-APC和α-hCD19-PeCy7染色以區分B細胞(CD19)和嗜鹼性球(CD193，低SSC)。CD63染色以分析嗜鹼性球的活化作用。

在測量過程中，嗜鹼性球上CD63的表現保持不變(未示出)。

圖22顯示B細胞上，由α-hCD19-PeCy7抗體偵測到的螢光信號。綠色數字反映針對Fluo488標記抗體，CD19陽性細胞所測量的平均螢光值。

實施例9：嗜鹼性球的活化測試(BAT)

該測定法是基於首先由Sainte-Laudy等人於1994年描述的方法(Sainte-Laudy,J等人，Analysis of membrane expression of the CD63 human basophil activation marker.Applications to allergologic diagnosis.Allerg.Immunol.期刊(巴黎)第26卷，第211-4頁)以及1996年描述的方法(Sabbah,A and Sainte-Laudy,J.,Flow Cytometry applied to the analysis of Lymphocyte and Basophil activation.ACI International期刊，第8卷，第116-9頁)，其中由過敏原或對照組所活化的嗜鹼性球由流式細胞儀偵測，以測量在該細胞表面上CD63(gp53)的增加。將過敏原和陽性對照加入肝素化全血，且CD63表面表現是由染色含抗hCD193的特異性抗體來測量，以識別嗜鹼性球以及抗hCD63以測量活性。組胺釋放可以並行地測量以作為嗜鹼性球活化和脫粒反應的第二參數。

藉由Fc RIIB及FcεRI與8A6-IgE在嗜鹼性球表面上的交聯，細胞經由FcεRI對過免原的反應減少。

獲得來自已知對花粉過敏(或帶有可測試的過敏原的其他定義的過敏)的捐贈者的50μl肝素化全血。

在這些實驗中，ch8A6_cε2-4-degly抗體被用來與下列抗體比較：ch8A6_N297A嵌合8A6(IgG抗體)、N297A突變體。

對陽性和陰性對照組，與過敏原或對照組共同培養15分鐘足以適當的活化嗜鹼性球，如檢測套組的操作手冊所述。

50μl肝素化的全血以50μl刺激原(過敏原，fMLP或抗FcεRI對照抗體)和100μl刺激緩衝液培養。以套組的操作手冊所述的方法溶解α-FcεRI和fMLP，並且使用未稀釋的溶解液。過敏原以刺激緩衝液稀釋1：5倍。在Falcon管中製備緩衝液和刺激原，且將50μl血液樣品直接加入到該溶液中而不接觸試管的管壁。加入溶解於刺激緩衝液中的20μl染色試劑或市售抗體(α-hCD63-PE和α-hCD193-Alexa647)。將樣品輕輕震盪並在水浴中，預熱至37℃，反應15分鐘。針對裂解反應，每支試管中加入2ml裂解試劑，然後震盪樣品並在室溫下黑暗中反應10分鐘。以500xg離心5分鐘後，除去上清液，將團塊再懸浮於300μl該套組的洗滌緩衝液中。在FACS Canto II流式細胞儀使用以下設定以進行FACS分析：FSC線性電壓：269

SSC線性電壓：401

FITC log電壓：447

PE log電壓：379

α-FcεRI抗體和胜肽fMLP(甲醯基-甲硫胺醯基-白胺醯基-苯丙胺酸，SEQ ID NO：38)係包含在該套組中，每個樣品使用50μl。

門控策略

圖23示出了裂解的全血的門控策略。FSC和SSC參數分別設置為線性的。可見到三個群體：淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。嗜鹼性球可以在與淋巴細胞相同的SSC水平中被測到。針對CD193表現對SSC製圖，導致偵測到兩個表現CD193的不同群體。具有低SSC的群體被認定為嗜鹼性顆粒球。將象限柵用於顯示CD193(Y軸)對CD63(X軸)表現的圖上，故在未處理的樣品中CD63的螢光幾乎為零。

使用反向門控策略，進一步分析細胞群體的特徵。

包括CD63低表現的群體以及CD63高表現的群體的門控與未門控的全血裂解液的FSC-SSC圖有重疊。低表現的群體被認為是設定在淋巴細胞族群的附近，確認該門控群體為嗜鹼性球。相較之下，高表現的群體被發現在SSC軸的最右邊界，反映出這些細胞具有高度的顆粒，並且為嗜酸性顆粒球。

陽性和陰性對照組的CD63表現

未經處理的細胞的CD63表現設定為0%或只有極少數的陽性細胞位在已被設置在嗜鹼性球上的象限柵的較低象限處。α-FcεRI抗體可再現地活化嗜鹼性粒球，到達90% CD63陽性細胞的程度，而胜肽fMLP僅適度地誘導CD63表現，其中25-30%的細胞為陽性。

為了確定抗體是否應當被測試其減少過敏反應的能力可以活化嗜鹼性球本身，投與二種不同濃度的ch8A6_N297A和ch8A6_cε2-4-degly，而未進一步活化細胞。

圖24顯示了獲得這些樣品的數據。

全血樣品以0.5或2μg/ml的8A6-IgG或8A6-IgE培養並不會活化嗜鹼性球本身，如上部圖所示。CD63的表面表現沒有改變，且在兩個獨立的實驗中檢測到小於1%的陽性細胞。

在分析中的下一個步驟，研究內毒素污染對嗜鹼性球活化的影響。由於8A6_cε2-4-degly含有來自生產過程中產生的約30EU/ml的內毒素，進行一個LPS對照以排除衍生自受污染材料的影響。因此，一個分離的血液樣品以50EU/ml LPS(在此分析中稀釋為1：4)處理，而與只有8A6_cε2-4-degly的樣品平行對照。如圖25所示，以預期在污染生產一樣濃度的LPS處理的嗜鹼性球並未導致該細胞的非特異性活化。因此，在處理8A6_cε2-4-degly後測量的效果可直接與該抗體的活性相關。

以8A6_cε2-4-degly預防性處理嗜鹼性球

全血樣品以對照組，不同濃度的8A6_N297A和8A6_cε2-4-degly處理。在不同的時間點取樣，並且測量由花粉活化嗜鹼性球的潛力。

A) 時間點0小時

將各抗體加入全血等分樣品後立刻對時間點0的第一樣品取樣，並以花粉刺激分析其被活化的潛力。這個時間點以兩個獨立的實驗量測。在這個時間點沒有看到8A6_N297A或8A6_cε2-4-degly的影響，代表大約與抗體一同培養5分鐘(時間從吸取到與樣品一同培養)。所有樣品中的嗜鹼性球可以被花粉活化至約90% CD63表現細胞。

B) 時間點2小時

在培養2小時後，偵測到嗜鹼性球活化且不喪失如同α-FcεRI活化時見到的活性(92%陽性細胞)，以及以花粉刺激未處理的細胞(93.4%)。

以濃度範圍為0.5至5μg/ml的8A6_N297A處理並不影響由花粉活化嗜鹼性球(介於91和91.6%的陽性細胞值)。在這個時間點，在已經以8A6_cε2-4-degly處理的樣品中，嗜鹼性球的活化似乎降低了(84.4至88%)，雖然未檢測到劑量依賴性。

C) 時間點6小時

經過6小時的培養，由陽性對照活化的細胞的潛力下降到約85%為花粉活化以及87%為處理α-FcεRI(圖26)，而以8A6-IgG處理者顯示出的結果可與陽性對照組媲美(85-88%)，細胞以8A6-IgE處理者呈現下降的活化傾向(76-84%)(圖27)。以0.5μg/ml 8A6_cε2-4-degly處理後，只有76.6%的嗜鹼性球可以被花粉活化。然而，未偵測到劑量依賴性，且相較於處理0.5μg/ml的樣品，高劑量呈現輕度提高CD63的表現。

D) 時間點24小時

最後的時間點，在兩個獨立的實驗中測定，結果顯示α-FcεRI處理組的活化減少至75% CD63表現(圖28和圖29)。

實施例10：花粉活化測試

由被測出對花粉過敏的健康捐贈者而來的肝素化全血樣品，分別以5μg/ml的去糖基化的8A6_ce2-4或去糖基化的8A6_ce3-4(SM301 cε2-4或cε3-4)進行整夜培養。為了分析，將50μl血液樣品混合了50μl花粉(1：5預稀釋於刺激緩衝液中)，100μl刺激緩衝液(FlowCast套組)和20μl染色溶液(3μl a-hCD193-Alexa647、3μl a-hCD63-PerCP、3μl a-hCD203c-PE、11μl刺激緩衝液)。將樣品在渦旋混合器上輕輕混合並在水浴中培養，預熱至37℃，持續15分鐘。針對裂解作用，每個試管中加入2ml PharmLyse試劑(BD Biosciences公司)，再次混合樣品並在室溫下黑暗中反應10分鐘。以500xg離心5分鐘後，除去上清液，並將團塊再懸浮於300μl FACS緩衝液中。門控被設置在高SSC，CD193陽性，但CD203c陰性的細胞，構成嗜酸性球。

除非另有說明，在說明書及申請專利範圍中所用之所有表現成分、性質如分子量、反應條件等的數量的數字，在所有情況下都被理解為以「大約」一詞所修飾。如本文所用，「約」、「大約」等詞意指在10至15%，較佳在5至10%之間。因此，除非有相反的指示，列於本說明書和所附的申請專利範圍中的該數值參數是近似值，其可能根據本發明所要尋找而得的目標性質而有所不同。最起碼，且並非試圖將均等論應用於申請專利範圍，每個數值參數應當至少按照所報告顯著數字的數目並採用一般捨入技術而構成。儘管該數值範圍和參數設定了本發明的寬廣範圍是近似值，但在具體實施例的數值是盡可能精確地被報告。然而，任何數值固有地包含某些誤差，這些是必然由在它們各自的試驗測量中發現的標準偏差所產生。

用於本發明描述內容的(特別是在以下申請專利範圍的上下文中)「一」、「一個」、「該」等詞及類似的參照詞被解釋為包括單數和複數，除非文中另有說明或上下文內容明顯矛盾。本文中值的範圍的敘述僅旨在作為單獨提及每一個單獨的值落在該範圍內的速記方法。除非本文另有指明，每個單獨的值結合到說明書中，就好像它在本文中單獨列舉一樣。本文中所描述的所有方法可以以任何合適的順序進行，除非本文另外指出或上下文明顯矛盾。本文所使用的任何和所有實例或示例性語言(例如，「如」)僅旨在更好地闡明本發明，並不構成限制本發明的範圍，除非另外聲明。說明書中的任何語言不應被解釋為實踐本發明所必需的任何未要求保護的元件。

替代元件或本文公開之本發明具體實施例的分組不應被解釋為限制。每組成員可被單獨或與該組的其他成員或本文所發現的其它元件的任何組合來被指稱及請求保護。可以預料的是，由於便利及/或專利性的原因，一個組中的一個或多個成員可以被包括在或從一組中刪除。當任何這類包括或刪除發生時，本說明書被認為包含修改後從而實現在所附申請專利範圍中使用的所有馬庫什組的書面描述的組別。

本發明某些具體實施例在本文中描述，包括發明人已知的用於實施本發明的最佳模式。當然，對於本領域的普通技術人員而言，在閱讀了前面的描述後，這些描述的具體實施例的變型將變得顯而易見。本案發明人期望本領域技術人員適當地採用這些變型，且本案發明人希望本發明也可以不同於本文之具體描述方式來實施。因此，如適用法律允許，本發明包括所有在所附申請專利範圍中所述之修飾與標的等同物。此外，在所有可能的變化中，本發明包括上述元件的任何組合，除非本文另外指出或上下文明顯矛盾。

本文所揭露之特定具體實施例可進一步地被限制於使用由所組成或實質上由所組成等語言的申請專利範圍內。當被用於請求項內，不論是作為提交或加入每個修正中，該轉折語「由組成」排除了任何未在該請求項中指定的元素、步驟，或成分。該轉折語「實質上由所組成」將一請求項的範圍限制於特定的材料或步驟以及那些不會實質上影響該基本及新穎的特徵的範圍內。因此請求保護之本發明的具體實施例係固有地或明確地被描述及用於本文中。

此外，本說明書整篇中有許多參考文獻已成為專利或印刷出版物。上述每個參考文獻以及印刷出版物係個別以參考文獻的方式整體被併入本文中。

最後，應當理解的是本發明在本文中所揭露的具體實施例係說明本發明之原理。其他可應用的修改方式係包含在本發明的範圍內。因此，以舉例的方式，但非限制，本發明的替代配置可根據本文所教示者而被應用。據此，本發明並不限於精確地被顯示及被描述者。

<110> SuppreMol GmbH

<120> 針對Fc γ受體IIB及Fc ε受體的新穎抗體

<130> SUP15095PCT

<150> EP14002825.9

<151> 2014-08-13

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 褐鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(113)

<223> VH r8A6

<400> 1

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 褐鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> VL r8A6

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(108)

<223> VL r8A6

<400> 2

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(113)

<223> VH hu8A6

<400> 3

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(108)

<223> VL hu8A6

<400> 4

<210> 5

<211> 181

<212> PRT

<213> 人類

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(181)

<223> 人類FcyRIIB

<400> 5

<210> 6

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(329)

<223> CH hu8A6_wt

<400> 6

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(106)

<223> CL hu8A6_wt

<400> 7

<210> 8

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(339)

<223> VH hu8A6

<400> 8

<210> 9

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(324)

<223> VL hu8A6

<400> 9

<210> 10

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(990)

<223> CH hu8A6_wt

<400> 10

<210> 11

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(321)

<223> CL hu8A6_wt

<400> 11

<210> 12

<211> 125

<212> PRT

<213> 人類

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(125)

<223> 人類可溶性FCyRIIA

<400> 12

<210> 13

<211> 179

<212> PRT

<213> 人類

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(179)

<223> 突變的人類可溶性FCyRIIA

<400> 13

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠抗體8A6的重鏈變異區CDR1

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠抗體8A6的重鏈變異區CDR2

<400> 15

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠抗體8A6的重鏈變異區CDR3

<400> 16

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠抗體8A6的輕鏈變異區CDR1

<400> 17

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠抗體8A6的輕鏈變異區CDR2

<400> 18

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠抗體8A6的輕鏈變異區CDR3

<400> 19

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體8A6的重鏈變異區CDR1

<400> 20

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體8A6的重鏈變異區CDR2

<400> 21

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體8A6的重鏈變異區CDR3

<400> 22

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體8A6的輕鏈變異區CDR1

<400> 23

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體8A6的輕鏈變異區CDR2

<400> 24

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體8A6的輕鏈變異區CDR3

<400> 25

<210> 26

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體的重鏈變異區GB3

<400> 26

<210> 27

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體的輕鏈變異區GB3

<400> 27

<210> 28

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 當位置1為位置118時IgG與N至A的重鏈恆定區在位置297改變

<400> 28

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈變異區的CDR1

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<400> 29

<210> 30

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈變異區的CDR2

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可為K或T

<220>

<221> misc

<222> (10)..(10)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (16)..(16)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (17)..(17)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (17)..(17)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<400> 30

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈變異區的CDR3

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<400> 31

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈變異區的CDR1

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可為S或T

<220>

<221> misc

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<400> 32

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈變異區的CDR2

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為T或N

<400> 33

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈變異區的CDR3

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<220>

<221> misc

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可為任意胺基酸

<400> 34

<210> 35

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgE恆定區

<400> 35

<210> 36

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 恆定IgE區3及4

<400> 36

<210> 37

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 可溶性Fc ε RI的質體DNA序列

<400> 37

<210> 38

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> fMLF胜肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 甲醯化

<400> 38

Claims

一種識別分子，其以一第一結合域與一Fcε受體(Fcε receptor，FcεR)結合，且以一第二結合域與一Fcγ受體IIB(Fc gamma receptor IIB，FcγRIIB)結合。
如申請專利範圍第1項之識別分子，其為抗體。
如申請專利範圍第2項之識別分子，其中該抗體不與Fcγ受體IIA(FcγRIIA)結合。
如申請專利範圍第2或3項之識別分子，其中該抗體為一非阻斷抗體，使得其經由其變異區域與該Fc受體結合而不干擾免疫複合物或聚集IgG結合至細胞。
如申請專利範圍第4項之識別分子，其中該抗體為嵌合的或人源化的。
如申請專利範圍第1項之識別分子，其中該第一結合域包含至少一部份的IgE恆定區。
如申請專利範圍第1項之識別分子，其中該第二結合域包含至少一部份的Fab區。
如申請專利範圍第1項之識別分子，其中該第二結合域含有至少(i)一重鏈變異區，包含一胺基酸序列，其與胺基酸序列SEQ ID NO.1具有至少80%同一性，以及(ii)一輕鏈變異區，包含一胺基酸序列，其與胺基酸序列SEQ ID NO.2具有至少65%同一性。
如申請專利範圍第1項之識別分子，其中該第二結合域含有至少下列之一：(i)一重鏈變異區，包含一胺基酸序列，其與胺基酸序列SEQ ID NO.3 具有至少90%同一性，以及(ii)一輕鏈變異區，包含一胺基酸序列，其與胺基酸序列SEQ ID NO.4具有至少90%同一性。
如申請專利範圍第1項之識別分子，其第二結合域包含下列重鏈與輕鏈變異區的CDR序列：(i)一H-CDR1序列，其與SEQ ID NO.20所示之H-CDR1序列具有60%或更高的同一性；(ii)一H-CDR2序列，其與SEQ ID NO.21所示之H-CDR2序列具有36%或更高的同一性；(iii)一H-CDR3序列，其與SEQ ID NO.22所示之H-CDR3序列具有50%或更高的同一性；(iv)一L-CDR1序列，其與SEQ ID NO.23所示之L-CDR1序列具有64%或更高的同一性；(v)一L-CDR2序列，其與SEQ ID NO.24所示之L-CDR2序列具有29%或更高的同一性；以及(vi)一L-CDR3序列，其與SEQ ID NO.25所示之L-CDR3序列具有78%或更高的同一性；其中，與本以該識別分子處理的Daudi細胞相較，該識別分子增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。
如申請專利範圍第10項之識別分子，包含在其重鏈變異區中如SEQ ID NOs.29、30與31所示之H-CDR1、H-CDR2與H-CDR3，以及在其輕鏈變異區中如SEQ ID NOs.32、33與34所示之L-CDR1、L-CDR2與L-CDR3，其中，與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，該識別分子增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。
如申請專利範圍第10或11項之識別分子，其重鏈與輕鏈變異區包含下列CDR序列：(a)SEQ ID NO.14(CDR-H1)、SEQ ID NO.15(CDR-H2)與SEQ ID NO.16(CDR-H3)於其重鏈變異區，以及SEQ ID NO.17(CDR-L1)、SEQ ID NO.18(CDR-L2)與SEQ ID NO.19(CDR-L3)於其輕鏈變異區；或(b)SEQ ID NO.20(CDR-H1)、SEQ ID NO.21(CDR-H2)與SEQ ID NO.22(CDR-H3)於其重鏈變異區，以及SEQ ID NO.23(CDR-L1)、SEQ ID NO.24(CDR-L2)與SEQ ID NO.25(CDR-L3)於其輕鏈變異區。
如申請專利範圍第9項之識別分子，其中該重鏈變異區包含如SEQ ID NO.3所示之胺基酸序列，並具有選自於由下列所組成之群組中的至少一突變：位置1的胺基酸Q被E取代，位置11的胺基酸V被L取代，位置42的胺基酸G被K取代，位置50的胺基酸S被V取代，位置53的胺基酸Y被S取代，位置58的胺基酸K被T取代，位置61的胺基酸G被A取代，位置75的胺基酸S被T取代，位置76的胺基酸K被R取代，位置77的胺基酸N被S取代，以及位置78的胺基酸T被N取代。
如申請專利範圍第9項之識別分子，其中該輕鏈變異區包含如SEQ ID NO.4所示之胺基酸序列，並具有選自於由下列所組成之群組中的至少一突變：位置1的胺基酸Q被N取代，位置28的胺基酸S被N取代，位置31的胺基酸S被T取代，位置33的胺基酸V被L取代，位置34的胺基酸D被A取代，位置49的胺基酸Y被F取代，位置53的胺基酸T被N取代，位置55的胺基酸Y被A取代，位置89的胺基酸L被Q取代，以及位置93的胺基酸N被Y取代。
如申請專利範圍第1項之識別分子，其中，與未處理該識別分子的Daudi細胞相較，該識別分子增加Daudi細胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化約4至10倍。
如申請專利範圍第1項之識別分子，其中該第二結合域在其重鏈變異區中具有如SEQ ID NOs.1或3所示之胺基酸序列及/或在其輕鏈變異區中具有如SEQ ID NOs.2或4所示之胺基酸序列。
如申請專利範圍第6項之識別分子，其中該IgE恆定區具有SEQ ID NO：35、36或其一部分的胺基酸序列。
如申請專利範圍第2項之識別分子，其中該抗體係糖基化的或去糖基化的。
如申請專利範圍第2項之識別分子，其中該抗體在體外以至少4.9 x 10^-4s^-1的解離速率常數的親和力與人類FcγRIIB結合。
如申請專利範圍第2項之識別分子，其中該抗體在體外以至少1.2 x 10^-7Kd(M)的親和力與人類FcεRI結合。
如申請專利範圍第1項之識別分子，其特異性地與一抗原決定位結合，該抗原決定位含有根據SEQ ID NO.7的人類FcγRIIB的第20-40個胺基酸。
一種編碼如申請專利範圍第1項之識別分子的核酸序列。
一種載體，包含插入至該載體的如申請專利範圍第22項之核酸序列。
一種宿主細胞，其轉染有如申請專利範圍第22項之核酸序列或如申請專利範圍第23項之載體。
一種醫藥組合物，包含作為一活性成分的如申請專利範圍第1項之識別分子、如申請專利範圍第22項之核酸、如申請專利範圍第23項之載體，或如申請專利範圍第24項之宿主細胞。
如申請專利範圍第25項之醫藥組合物，用於治療或預防嗜鹼性球相關疾病。
如申請專利範圍第26項之醫藥組合物用於治療或預防過敏症。
一種如申請專利範圍第1項之識別分子於治療上的應用。
一種如申請專利範圍第1項之識別分子，用於治療或預防嗜鹼性球相關疾病。
如申請專利範圍第29項之識別分子，其中該嗜鹼性球相關疾病為一過敏性疾病。