PL238020B1 - Kompozycja przeciwciał monoklonalnych przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5 i jej zastosowanie, hybrydomy produkujące rzeczone przeciwciała, sposób diagnozowania infekcji wirusami grypy serotypu H5 oraz zestawy diagnostyczne - Google Patents
Kompozycja przeciwciał monoklonalnych przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5 i jej zastosowanie, hybrydomy produkujące rzeczone przeciwciała, sposób diagnozowania infekcji wirusami grypy serotypu H5 oraz zestawy diagnostyczne Download PDFInfo
- Publication number
- PL238020B1 PL238020B1 PL418671A PL41867116A PL238020B1 PL 238020 B1 PL238020 B1 PL 238020B1 PL 418671 A PL418671 A PL 418671A PL 41867116 A PL41867116 A PL 41867116A PL 238020 B1 PL238020 B1 PL 238020B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- rha
- antibodies
- serotype
- proteins
- protein
- Prior art date
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims description 109
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 33
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 86
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 title description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 322
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 322
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 322
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 244
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 210
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 112
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 92
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 54
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 54
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 54
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 54
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 44
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 40
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 39
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 22
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 21
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 21
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 20
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 claims description 6
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 claims description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 371
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 369
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 368
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 138
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 135
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 103
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 80
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 74
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 64
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 62
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 61
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 61
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 53
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 52
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 45
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 35
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 28
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 27
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 25
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 25
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 23
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 22
- 241000272813 Anser indicus Species 0.000 description 21
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 21
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 21
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 21
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 20
- 241001316595 Acris Species 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 19
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 19
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 19
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 18
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 17
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 15
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 13
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 13
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 13
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 12
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 12
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 12
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 10
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 9
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 9
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 9
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 9
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 9
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 7
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 6
- 241000287531 Psittacidae Species 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 108010029566 avian influenza A virus hemagglutinin Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 6
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 5
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 241001293109 Anas carolinensis Species 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine Natural products O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000272168 Laridae Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 4
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 3
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000163862 Influenza A virus (A/American green-winged teal/California/HKWF609/2007(H5N2)) Species 0.000 description 2
- 241000374785 Influenza A virus (A/Bar-headed Goose/Qinghai/60/05(H5N1)) Species 0.000 description 2
- 241000880468 Influenza A virus (A/Hong Kong/156/97(H5N1)) Species 0.000 description 2
- 241000099448 Influenza A virus (A/chicken/Italy/22A/1998(H5N9)) Species 0.000 description 2
- 241000099449 Influenza A virus (A/duck/Italy/775/2004(H5N3)) Species 0.000 description 2
- 241000053691 Influenza A virus (A/turkey/Italy/1980(H5N2)) Species 0.000 description 2
- 101100290051 Malus domestica MALD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 239000013584 assay control Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000001492 haemagglutinating effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241001493160 California encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000664503 Influenza A virus (A/goose/Guiyang/337/2006(H5N1)) Species 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288147 Meleagris gallopavo Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101150085390 RPM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 iodoacetamide modified cysteine Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000246 remedial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja przeciwciał monoklonalnych przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5 i jej zastosowanie w diagnostyce i immunoterapii zakażeń wywołanych przez wirusy grypy serotypu H5 u ludzi i zwierząt. Wynalazek dostarcza również hybrydomy produkujące rzeczone przeciwciała oraz zestawy diagnostyczne zawierające kompozycję rzeczonych przeciwciał do wykrywania i oznaczania wirusów grypy serotypu H5 oraz przeciwciał przeciwko wirusom grypy serotypu H5 w próbkach biologicznych. Wynalazek zapewnia również sposób diagnozowania infekcji wirusami grypy serotypu H5.
Tło wynalazku
Wirusy grypy serotypu H5
Wirusy grypy (IV) należą do rodziny Orthomyxoviridae, w której aktualnie wyróżnia się sześć rodzajów (ICTV 2014). Największe znaczenie epidemiologiczne mają IV z rodzaju Influenzavirus A. Wirus grypy typu A otoczony jest płaszczem lipidowo-białkowym, zawiera genom w postaci jednoniciowego kwasu rybonukleinowego (RNA) o polamości ujemnej, który podzielony jest na osiem segmentów i koduje 10 białek.
Szczepy IV typu A są klasyfikowane w odniesieniu do serotypu glikoprotein powierzchniowych: hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA). Dotychczas zidentyfikowano 18 serotypów HA i 11 serotypów NA (Szewczyk B i wsp. 2014). Białka HA i NA odgrywają ważną rolę w cyklu replikacyjnym wirusa. HA wiążąc się z resztami kwasu sialowego receptorów komórek gospodarza umożliwia internalizację IV przez endocytozę, a następnie pośredniczy w fuzji otoczki wirusowej z błoną komórkową, co prowadzi do uwolnienia materiału genetycznego wirusa do cytoplazmy i inicjuje proces jego replikacji (Skehel JJ i Wiley DC 2000). NA katalizuje reakcję cięcia wiązań glikozydowych z kwasem sialowym, co warunkuje uwalnianie wirusa z zaatakowanych komórek a przez to jego rozprzestrzenianie (Lamb RA i Choppin PW 1983).
Glikoproteiny powierzchniowe IV ulegają stopniowym zmianom wskutek błędów polimerazy RNA i presji selekcyjnej układu odpornościowego gospodarza. Zjawisko to, określane jako przesunięcie antygenowe, prowadzi do ucieczki wirusa spod kontroli układu odpornościowego i zwykle powoduje ograniczone zachorowania, rzadko epidemie. Większe i szybsze zmiany antygenów wirusa, określane jako skok antygenowy, powstają wskutek reasortacji genetycznej i mogą prowadzić do pandemii. Zmienność powoduje, że IV stanowią prawdziwe wyzwanie dla diagnostyki, prewencji i leczenia grypy.
U ptaków występują wirusy grypy (AIV), będące kombinacją 16 serotypów HA i 9 serotypów NA. W populacji człowieka krążą głównie 2 serotypy IV typu A: H1N1 i H3N2. Wirusy grypy przejawiają specyficzność wobec gospodarza tak, że AIV zwykle nie zakażają ludzi. Wśród licznych wirusów Al. dominują szczepy niskopatogenne (LP), wywołujące infekcje o łagodnym przebiegu. Wirusy grypy serotypów H5 i H7, zwykle niepatogenne u swoich naturalnych gospodarzy, jakimi są dzikie ptaki, w szczególności ptaki wodne, mogą stać się wysokopatogennymi (HP) po przeniesieniu do podatnej na zakażenie populacji ptactwa domowego i za ich pośrednictwem stanowić zagrożenie dla zdrowia i życia ludzi. Tak było w przypadku szczepu HPAIV H5N1.
Od czasu wybuchu choroby w 1996 na farmie gęsi i zakażeń ludzi w 1997 roku w Chinach (Xu X i wsp. 1999), obserwowane jest rozprzestrzenianie się wirusów HPAI H5N1 (Verhagen JH i wsp. 2015). Pojawiające się ogniska choroby wśród ptaków, przyjmujące często rozmiar epizoocji, powodują dużą śmiertelność zwierząt i zmuszają do wybijania ptactwa domowego. W dalszym ciągu odnotowywane są przypadki śmiertelnych zakażeń ludzi wirusami H5N1. Nadal istnieje ryzyko reasortacji krążących AIV H5N1 z wirusami ssaków prowadzącej do powstania nowych szczepów zdolnych do bezpośredniej transmisji pomiędzy ludźmi.
Podczas krążenia i rozprzestrzeniania się wirusów H5N1, geny HA różnicowały się tworząc wiele linii genetycznych, określanych jako kłady (Verhagen JH i wsp. 2015). Od 2009 roku odnotowano pojawienie się reasortantów HPAIV serotypu H5: H5N2, H5N5, H5N6 i H5N8. Od czasu identyfikacji w 2014, obserwuje się szybkie rozprzestrzenianie wirusów HPAI H5N8 w populacji ptaków domowych. W wyniku reasortacji z udziałem HPAIV H5N8, powstał nowy wirus HPAI H5N2, zidentyfikowany w ogniskach choroby na farmach kurcząt i indyków w Kanadzie pod koniec 2014 roku (Ip HS i wsp. 2015). W Stanach Zjednoczonych HPAIV H5N2 spowodował w 2015 roku wysoką śmiertelność drobiu (Hvistendahl M 2015).
Hemaglutynina H5 - docelowy antygen dla przeciwciał monoklonalych
HA jest syntetyzowana jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy, określany jako prekursor HA - HA0, zawierający sekwencję sygnałową, podjednostkę HA1 i HA2 rozdzielone przez miejsce cięcia
PL 238 020 B1 dla enzymów proteolitycznych. Przecięcie HA0 jest konieczne dla aktywacji HA warunkującej infekcyjność IV a podatność białka na trawienie przez enzymy proteolityczne jest jednym z czynników determinujących patogenność wirusów (Steinhauer DA 1999). W białkach HA H5 miejsce cięcia zawiera liczne aminokwasy zasadowe, co sprawia, że białko jest podatne na trawienie przez proteazy aktywne w większości tkanek a zakażenie IV serotypu H5 ma charakter systemiczny.
Badania struktury białek HA różnych serotypów, w tym H5, wykazały, że odmienne antygenowo hemaglutyniny są strukturalnie podobne i wykazują jednakową sub-domenową organizację (Ha Y i wsp. 2002, Wilson IA i wsp. 1981). Białko zbudowane jest z domeny globularnej utworzonej przez podjednostkę HA1 oraz domeny trzonka utworzonej głównie przez podjednostkę HA2 oraz sekwencje aminokwasowe z N- i C-końca podjednostki HA1. Domena globularna HA zawiera subdomenę wiążącą receptor - RBD (ang. antigen binding domain), przez którą wirus wiąże się z komórką gospodarza, natomiast w fuzji błony wirusowej i endosomalnej pośredniczy domena trzonka. Podjednostka HA2 w domenie trzonka jest odpowiedzialna za tworzenie i stabilizację homotrimeru HA i jego zakotwiczenie w otoczce lipidowej wirusa, gdzie białko tworzy charakterystyczne struktury.
HA jest najbardziej zmiennym antygenem IV. Dotyczy to w szczególności domeny globularnej. Podatna na mutacje domena białka zawiera epitopy dla przeciwciał neutralizujących o zwykle ograniczonym zakresie specyficzności w obrębie serotypu. W przypadku HPAIV H5N1, obserwowana jest słaba reaktywność krzyżowa tych przeciwciał wobec odległych antygenowo wirusów należących do różnych kładów. Przeciwciała skierowane wobec domeny globularnej neutralizują infekcyjność wirusów głównie przez interferencję z ich wiązaniem do receptorów komórek gospodarza. Aktywność przeciwciał neutralizuących, które wiążą się w RBD, jest obserwowana in vitro jako hamowanie aktywności hemaglutynacyjnej IV.
W przeciwieństwie do podjednostki HA1 budującej domenę globularną, podjednostka HA2, tworząca zasadniczą część regionu trzonka, jest relatywnie dobrze konserwowana i zawiera epitopy dla przeciwciał neutralizujących o szerokim zakresie specyficzności wobec wirusów różnych serotypów. Przeciwciała skierowane wobec domeny trzonka neutralizują infekcyjność wirusów przez blokowanie fuzji błon.
Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych w immunoprofilaktyce i immunoterapii
Aktualnie kontrola infekcji wywołanych przez HPAIV polega na użyciu leków przeciwwirusowych oraz aktywnej lub pasywnej immunizacji. Ze względu na obserwowany wśród IV rozwój oporności na leki i niekorzystne skutki uboczne lekoterapii, preferowane są immunoprofilaktyka i immunoterapia. Działania prewencyjne polegają przede wszystkim na wykonywaniu szczepień profilaktycznych. Tradycyjne metody otrzymywania szczepionek są długotrwałe i nie mogłyby dostarczyć wystarczającej ilości dawek w wypadku zagrożenia pandemią. Immunizacji przy użyciu tych szczepionek towarzyszą często niepożądane działania uboczne. Alternatywą dla szczepionek konwencjonalnych są szczepionki DNA oraz szczepionki podjednostkowe oparte na rekombinowanych białkach HA. Białka HA H5 wytwarzane są przede wszystkim w komórkach eukariotycznych, ale także w komórkach bakterii. Głównym wyzwaniem prac nad otrzymaniem podjednostkowych szczepionek przeciwko grypie jest otrzymanie antygenu o cechach natywnej HA. Szczególne znaczenie dla jakości HA szczepionkowej ma prawidłowość struktury podjednostki HA1, gdzie zlokalizowane są konformacyjne epitopy dla przeciwciał neutralizujących oraz oligomeryzacja białka.
Przeciwciała monoklonalne (Mab) przeciwko HA mogą być stosowane w trakcie opracowywania szczepionek przeciwko grypie oraz na różnych etapach ich produkcji i wdrażania. Pierwszym wskaźnikiem przydatności białek HA do produkcji szczepionek są wyniki badań antygenowości z użyciem dobrze scharakteryzownych przeciwciał (Chiu FF i wsp. 2009). Szczególnie przydatne w tym zakresie są Mab rozpoznające konformacyjne, neutalizujące epitopy HA. Mab mogą być również wykorzystane w badaniach poziomu oligomeryzacji białek HA, obok testów aglutynacji erytrocytów i wiązania fetuiny. Przy wykorzystaniu Mab w chromatografii powinowactwa lub immunoprecypitacji można wyizolować lub oczyścić białka HA H5. Wyizolowane lub oczyszczone w ten sposób antygeny mogą być wykorzystane jako składniki prototypowych szczepionek przeciwko IV serotypu H5, przeznaczonych do wstępnej oceny zdolności wywołania ochronnej odpowiedzi odpornościowej u zwierząt. Mab mogą być stosowane także w kontroli stabilności szczepionkowej HA H5, przechowywanej osobno lub w kompozycjach immunnogennych. Najważniejszym zastosowaniem Mab serotypowo-specyficznych związanym z aktywną immunizacją jest ich użycie w tzw. testach DIVA (ang. differentiation of infected front vaccinated animals). Zapewnienie możliwości odróżnienia zwierząt zakażonych od szczepionych jest podstawowym warunkiem wykonywania szczepień przeciwko grypie ptaków (Suarez DL 2005).
PL 238 020 B1
Innym sposobem zapobiegania infekcjom przez IV, ale przede wszystkim leczenia grypy jest użycie Mab do pasywnej immunizacji. Są to głównie humanizowane przeciwciała albo preferencyjnie przeciwciała wytwarzane de novo jako ludzkie Mab. Przewidywalnie, przeciwciała neutralizujące skierowane przeciwko zmiennej i podatnej na mutacje podjednostce HA1 hemaglutyniny H5 mogą okazać się nieskuteczne wobec heterologicznych szczepów wirusa lub szczepów przesuniętych antygenowo. W tym kontekście istotne znaczenie ma otrzymanie neutralizujących Mab przeciwko epitopom podjednostki HA1 HA, które są konserwowane wśród IV H5N1 (Cao Z i wsp. 2012, Du L i wsp. 2013, Oh HL i wsp. 2010, Wu R i wsp. 2014). W ostatnich latach wzrasta liczba doniesień o otrzymaniu Mab rozpoznających konserwowane epitopy w podjednostce HA2 regionu trzonka HA, które wykazują heteroserotypową aktywność neutralizującą (Corti D i wsp. 2011, Ekiert DC i wsp. 2009, Okuno Y i wsp. 1993, Sui J i wsp. 2009).
Stan techniki
Niedoskonałości dotychczas stosowanych metod diagnostycznych z wykorzystaniem przeciwciał
Badania w zakresie ewolucji, rozprzestrzeniania się oraz pojawiania nowych szczepów wirusów HPAI serotypu H5 wymagają zastososowania specyficznych i wiarygodnych metod do wczesnej detekcji, typowania IV oraz identyfikacji szczepów (Petrie M i wsp. 2006). Potrzebne są również testy do rozpoznawania infekcji wywoływanych przez AIV serotypu H5 u ludzi, które mogłyby być użyte również do monitorowania rozwoju infekcji wirusowej i/lub oceny skuteczności zastosowanego schematu leczenia. Obiektywną trudnością a jednocześnie wyzwaniem dla diagnostyki jest zmienność IV. Podatność wirusów na mutacje powinna być brana pod uwagę już na etapie przygotowywania reagentów i opracowywania testów diagnostycznych.
W diagnostyce grypy stosowane są różne konwencjonalne metody i techniki. Powszechnie akceptowaną metodą jest łańcuchowa reakcja polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR).
Diagnostyka oparta na PCR wymaga ekstrakcji RNA, użycia specjalistycznego sprzętu, może być wykonana jedynie przez wykwalifikowany personel i jest kosztowna. W rozpoznaniu zakażeń IV stosowane są także testy serologiczne: immunodyfuzja w żelu agarozowym (AGID), test zahamowania hem aglutynacji (HI) oraz test mikroneutralizacji (MN).
Test AGID jest referencyjnym testem przesiewowym do wykrywania przeciwciał przeciwko IV w surowicach domowych i dzikich zwierząt. Wyniki tego testu nie są wiarygodne w przypadku niektórych grup zwierząt, takich jak ptaki wodne, które nie produkują wytrącających się przeciwciał. Ponadto test jest podatny na błędną interpretację ze względu na subiektywność odczytu wyników. Test HI, rekomendowany jako test referencyjny w serodiagnostyce zwierząt, stanowi tzw, złoty standard w oznaczeniach serotypowej specyficzności przeciwiał przeciwko IV. Istotnym ograniczeniem testu jest to, że wykazuje maksymalną czułość w wypadku użycia homologicznego IV a użycie odległego antygenowo szczepu wirusa może prowadzić do uzykania fałszywie negatywnych wyników. Test HI wymaga użycia preparatu erytrocytów, który przygotowany jest każdorazowo z krwi zwierząt SPF. Dodatkowo, przy zastosowaniu erytrocytów innych niż kurze, niezbędne jest użycie odczynników usuwających z surowicy inhibitory niespecyficznego hamowania hemaglutynacji. Test HI nie jest optymalny w przypadku analizy dużej ilości prób surowicy, gdyż jego wykonanie nie może być zautomatyzowane, jest czasochłonne i pracochłonne. Zahamowanie hemaglutynacji oceniane jest wizualnie, przez co wynik testu ma charakter subiektywny.
Test MN, zalecany w przypadku zakażeń HPAIV H5N1 u ludzi, nie może być zastosowany w rutynowej diagnostyce. Wymaga użycia żywych wirusów, dlatego też jest wykonywany w laboratoriach o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa przez wykwalifikowany personel. Reasumując, test MN i inne konwencjonalne metody diagnostyczne mają znaczne ograniczenia.
Wczesna diagnostyka grypy wykorzystuje różne metody i techniki immunologiczne do wykrywania wirusów grypy. Należą do nich testy oparte na metodzie ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay), immunochromatografii oraz testy z użyciem immunoczujników. Tego typu testy są łatwe do przeprowadzenia i umożliwiają przebadanie dużej ilości prób w stosunkowo krótkim czasie.
Yang M i wsp. (2009) opracowali test oparty na metodzie typu „sandwich” ELISA z wykorzystaniem 2 różnych klonów przeciwciał. Jeden z nich stanowił przeciwciało wyłapujące a drugi przeciwciało wykrywające. W porównaniu do testów z użyciem Mab i przeciwciał poliklonalnych (Pab), testy z użyciem 2 klonów Mab są z reguły bardziej specyficzne i łatwiejsze do standaryzacji. Przeciwciała, wytworzone metodą hybrydom przy użyciu IV H5N1 jako immunogenu, rozpoznawały epitopy konformacyjne HA, konserwowane wśród wirusów serotypu H5. Przeciwciała nie miały aktywności HI. Test
PL 238 020 B1 nie wykazywał reakcji krzyżowych z badanymi IV serotypów innych niż H5, ale jeden z testowanych szczepów IV H5N2 był wykrywany ze znacznie obniżoną czułością.
Miyagawa E i wsp. (2011) otrzymali metodą hybrydom, przy użyciu IV H5N1 jako immunogenu, 3 klony przeciwciał, które rozpoznawały różne epitopy konformacyjne w regionie podjednostki HA1 HA, zidentyfikowanym jako mniej podatny na mutacje. Przeciwciała nie wykazywały aktywności neutralizującej. Opracowano 3 warianty testu immunochromatograficznego z wykorzystaniem wszystkich otrzymanych klonów. Testy wykrywały specyficznie szczepy IV: H5N1 i H5N3. Nie stwierdzono reaktywności z IV typu A serotypów innych niż H5 ani z IV typu B. Jednakże żaden z wariantów testu nie wykrywał badanego szczepu IV H5N2.
Elektrochemiczne bioczujniki do detekcji IV są przedmiotem ostanio opublikowanej pracy przeglądowej (Grabowska I i wsp. 2014). Jarocka U i wsp. (2014) opracowali immunoczujnik do detekcji peptydów pochodzących z HA wirusowej przy użyciu fragmentu Fab’ przeciwciała monoklonalnego. Immunoczujnik wykrywał rekombinowane białka hemaglutyniny oparte na podjednostce HA1 i ektodomenie HA z sekwencjami antygenu HPAIV H5N1. Natomiast obserwowano różnice oddziaływań zależne od długości i sekwencj i białka HA.
Oprócz diagnostyki grypy opartej na wykrywaniu wirusów, immunologiczne metody i techniki stosowane są do wykrywania specyficznych przeciwciał. Metody te mają szczególne znaczenie dla oceny potencjalnego kontaktu zwierząt i ludzi z IV. Wśród testów do wykrywania przeciwciał znalazły zastosowanie pośrednie testy ELISA (iELISA) oraz testy ELISA w formacie blokującym (bELISA) lub kompetycyjnym (cELISA).
Testy iELISA przeznaczone są do badań ludzi lub określonych gatunków zwierząt. Wymagają użycia antygenu o wysokim stopniu czystości oraz gatunkowo-specyficznych przeciwciał wtórnych, które nie zawsze są dostępne. Największą wadą testów iELISA jest ich niska specyficzność wobec testowanego serotypu IV, wynikająca z reakcji krzyżowych przeciwciał wyindukowanych przez zakażenia wirusami różnych serotypów. W przypadku osób dorosłych, specyficzność przykładowego testu iELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko AIV H5N1 wynosiła zaledwie 62%, przy czułości na poziomie 80% (Rowe T i wsp. 1999).
W testach bELISA/cELISA kluczowymi reagentami są Mab lub ich funkcjonalne odpowiedniki. W przeciwieństwie do testów iELISA, testy bELISA/cELISA mogą być użyte do wykrywania przeciwciał antygenowo-specyficznych w surowicach różnego pochodzenia. W diagnostyce grypy powszechnie stosowane są testy bELISA/cELISA oparte na użyciu Mab przeciwko nukleoproteinie (NP), która jest białkiem silnie konserwowanym wśród IV typu A. Testy do wykrywania przeciwciał przeciwko NP, stosowane jako alternatywa testów AGID, mają charakter przesiewowy. W odróżnieniu od nich, testy bELIA/cELISA z użyciem serotypowo-specyficznych Mab przeciwko HA umożliwiają identyfikację serotypu wirusa infekcyjnego a w konsekwencji odróżnienie infekcji wywołanych przez HPIV i LPIV.
Yang M i wsp. (2009) otrzymali metodą hybrydom, przy użyciu IV H5N1 jako immunogenu, klon przeciwciał, które rozpoznawały konformacyjny epitop w podjednostce HA1 HA i nie miały aktywności HI. Z użyciem otrzymanych Mab opracowano test cELISA i oceniono jego skuteczność w badaniach surowic kurcząt. Nie stwierdzono reakcji krzyżowych z antysurowicami przeciwko IV serotypów innych niż H5. Test wykiywał przeciwciała przeciwko IV serotypu H5, ale ocena testu została przeprowadzona z zastosowaniem wąskiego zakresu anty H5-pozytywnych surowic.
Prabakaran M i wsp. (2009) otrzymali metodą hybrydom, przy użyciu rekombinowanego białka HA z bakteryjnego systemu ekspresji jako immunogenu, klon przeciwciał rozpoznających liniowy epitop w podjednostce HA1 HA. Sekwencja epitopu dla otrzymanych Mab została zidentyfikowana. Epitop okazał się silnie konserwowany wśród izolatów IV H5N1 pobranych od ludzi (100%) oraz ptaków (96,9%) i słabo konserwowany w HA wirusów H5 o serotypie NA innym niż N1 (54,3%). Przeciwciała nie wykazywały aktywności neutralizującej. Z użyciem otrzymanych Mab opracowano test bELISA i oceniono jego skuteczność w badaniach surowic kurcząt oraz ludzi. Nie stwierdzono reakcji krzyżowych z antysurowicami przeciwko IV serotypów innych niż H5. Test wykrywał przeciwciała przeciwko HA wirusów H5N1 o zróżnicowanym pochodzeniu, natomiast nie zapewniał wykrywalności IV serotypu H5 innych niż H5N1.
Dlugolenski D i wsp. (2010) otrzymali metodą hybrydom, przy użyciu białka HA H5 z ssaczego systemu ekspresji jako immunogenu, klon przeciwciał reaktywnych z LPIV: H5N1, H5N2 i H5N3, nie wykazujących aktywności HI. Przy użyciu otrzymanych Mab opracowano test cELISA i przeprowadzono analizy surowic kurcząt, indyków i kaczek. Nie stwierdzono reakcji krzyżowych z antysurowicami przeciwko IV serotypów innych niż H5. Przeciwciała przeciwko HA H5 były wykrywane u różnych ga
PL 238 020 B1 tunków zwierząt z różną specyficznością i czułością. Poziomy specyficzności i czułości diagnostycznej testu, wyznaczone dla surowic kurcząt, były niskie i wynosiły, odpowiednio: 63% i 66%.
Postel A i wsp. (2011) do konstrukcji testu bELISA wykorzystali Mab (ClonDiag), rozpoznające liniowe epitopy podjednostki HA2 w regionie trzonka HA H5, silnie konserwowane wśród różnych szczepów IV, w tym HP i LP, serotypu H5: H5N1, H5N2, H5N3, H5N6, H5N9. Badania przeprowadzone na surowicach różnych grup ptaków wykazały wysoki poziom specyficzności (91,5%) i czułości (98,1%) diagnostycznej testu oraz jego zdolność do wykrywania przeciwciał wyindukowanych u kurcząt przez przesunięty antygenowo wariant HPAIV H5N1. Jednakże w teście obserwowano znaczną reaktywność krzyżową antysurowic specyficznych wobec serotypu H2 oraz w mniejszym stopniu antysurowic specyficznych wobec serotypów: H1 i H6. Przewidywalnie, test mógłby wykrywać nowe warianty IV serotypu H5, jednocześnie nie zapewniając wyraźnego odróżnienia antysurowic przeciwko HA H5 i przeciwko HA serotypów: H2, H1 i H6.
Lebarbenchon C i wsp. (2013) oceniali przydatność testu FLUAc H5 (IDVet) do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 u ptaków wodnych. Stwierdzono, że test może dostarczać wartościowych danych dotyczących kontaktu badanej grupy ptaków z IV serotypu H5 po wprowadzeniu modyfikacji do protokołu producenta. Postel A i wsp. (2011) analizowali próby surowicy kurcząt zaszczepionych odległym antygenowo HPAIV H5N1 przy użyciu testu FLUAc H5 (IDVet). Otrzymano dużą liczbę fałszywie negatywnych wyników (7/9 badanych prób). Wskazuje to na ograniczoną zdolność testu do wykrywania nowych szczepów HPAIV H5N1.
Stelzer-Braid S i wsp. (2008) oceniali diagnostyczną wartość testu „ELISA H5-HA antibody kit” (Dialab) o deklarowanej przez producenta specyficzności na poziomie 100% i czułości na poziomie 98%. Wykazano, że test jest wiarygodny w wypadku, gdy surowice pacjentów zawierały wysokie poziomy przeciwciał przeciwko HA H5. Wykazano również, że przeciwciała przeciwko sezonowym IV: H3N2 i H1N1 mogą reagować krzyżowo z antygenem HA H5, dając fałszywie pozytywne wyniki w ocenianym teście.
Cel wynalazku
W związku z zagrożeniem zdrowia i życia zwierząt oraz ludzi, HPAIV serotypu H5 są przedmiotem nadzoru epidemiologicznego i rozwijane są różne strategie profilaktyki i terapii zakażeń wywoływanych przez te wirusy. Działania zaradcze koncentrują się wokół HA H5 determinującej wysoką patogenność wirusa, która jest jednocześnie głównym celem przeciwciał neutralizujących jego infekcyjność. Przeciwciała monoklonalne oraz pochodzące od nich białka wiążące antygen odgrywają istotną rolę w tych działaniach jako skuteczne reagenty diagnostyczne i czynniki terapeutyczne. Zmienność antygenów powoduje, że wirusy grypy stanowią prawdziwe wyzwanie dla diagnostyki, prewencji i leczenia grypy.
Przedstawione powyżej rozwiązania istniejące w obecnym stanie techniki wskazują, że niezależnie od metody i techniki testu immunologicznego, podstawowym warunkiem postawienia prawidłowej diagnozy jest zastosowanie Mab lub ich funkcjonalnych odpowiedników, które są specyficzne wobec HA serotypu H5 i nie reagują krzyżowo z HA innych serotypów. Tylko szeroki zakres specyficzności przeciwciał wobec HA H5 może zapewnić identyfikację serotypu szczepów infekcyjnych różnego pochodzenia. Pożądane jest, żeby Mab rozpoznawały natywne formy antygenów HA H5. Wang SF i wsp. (2009) otrzymali klony przeciwciał reagujące wyłącznie ze zdenaturowanym białkiem HA H5. Użyteczność takich Mab jest ograniczona do wąskiego zakresu metod immunologicznych.
Epitopy dla wartościowych diagnostycznie Mab powinny być zlokalizowane w podjednostce HA1, która determinuje serotyp wirusa. Zastosowanie diagnostyczne Mab przeciwko podjednostce HA1 hemaglutyniny H5, które są aktywne w testach HI czy MN, staje się problematyczne, gdy epitopy dla tych przeciwciał nie są konserwowane. Takie Mab i testy z ich użyciem mogą utracić zdolność do wykrywania infekcji wywołanych przez IV serotypu H5 w wypadku mutacji epitopów dla tych przeciwciał pod wpływem presji immunologicznej. To z kolei spowoduje, że test nie będzie wykrywał nowych, zmutowanych szczepów wirusa. Z drugiej strony, w testach z użyciem Mab rozpoznających konserwowane epitopy w regionie trzonka HA, pewien poziom reaktywności między serotypami jest nieunikniony (Postel A i wsp. 2011). Optymalnie dla efektu diagnostycznego jest więc użycie Mab lub ich funkcjonalnych odpowiedników swoistych wobec epitopów podjednostki HA1 HA, które są konserwowane wśród wirusów serotypu H5. Równie ważna jest dostępność różnych klonów Mab o pożądanych właściwościach tak, aby można było zapewnić wykrywalność aktualnie krążących i nowych IV serotypu H5.
PL 238 020 B1
Celem wynalazku jest więc dostarczenie narzędzi do skutecznej immunoprofilaktyki i immunoterapii infekcji wywołanych przez wirusy grypy spełniających powyższe kryteria. Celem wynalazku jest dostarczenie zestawu klonów przeciwciał, które będą spełniać przedstawione wyżej wymagania dla Mab o wysokiej wartości diagnostycznej. Nieoczekiwanie cel ten zrealizowano w niniejszym wynalazku i uzyskano rozwiązanie dla istniejących w stanie techniki problemów.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja przeciwciał monoklonalnch przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5 wiążących się z epitopami antygenów H5, lub ich fragmentów Fab, zawierająca:
(i) G-1-31-22 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-1-31-22 zdepono- waną w DSMZ pod numerem DSM ACC3292, (ii) G-2-14-10 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-2-14-10 zdepono- waną w DSMZ pod numerem DSM ACC3293, (iii) G-5-32-5 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-5-32-5 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3294, (iv) G-6-42-42 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-6-42-42 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3295, (v) G-7-24-17 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-7-24-17 zdepono- waną w DSMZ pod numerem DSM ACC3296, oraz (vi) G-7-27-18 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-7-27-18 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3297.
Korzystnie, hemaglutynina pochodzi z wirusa grypy serotypu H5 w tym H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna lub diagnostyczna zawierająca kompozycję przeciwciał zdefiniowanych powyżej oraz odpowiedni nośnik lub znacznik.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja przeciwciał określonych powyżej do zastosowania w diagnozowaniu lub leczeniu zakażeń wywołanych przez wirusa grypy serotypu H5.
Kolejnym przedmiotem wynalazku są linie komórkowe mysich hybrydom wybrane z grupy obejmującej:
(i) G-1-31-22 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3292, (ii) G-2-14-10 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3293, (iii) G-5-32-5 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3294, (iv) G-6-42-42 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3295, (v) G-7-24-17 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3296 i (vi) G-7-27-18 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3297.
Innym przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania infekcji wirusami grypy serotypu H5 in vitro, obejmujący kontaktowanie próbki biologicznej z kompozycją przeciwciał monoklonalnych zdefiniowaną powyżej i detekcję wiązania się rzeczonych przeciwciał z wirusem grypy serotypu H5 lub białkiem hemaglutyniny H5.
Następnym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do wykrywania infekcji wirusami grypy serotypu H5 zawierający kompozycję przeciwciał monoklonalnych jak zdefiniowano powyżej, oraz reagenty do wykrywania przeciwciał lub ich fragmentów związanych z wirusem grypy serotypu H5 lub białkiem hemaglutyniny H5.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do wykrywania, oznaczania ilościowego lub półilościowego wirusów grypy serotypu H5 w próbkach biologicznych, zawierający kompozycję przeciwciał monoklonalnych jak zdefiniowano powyżej oraz narzędzia i reagenty powszechnie stosowane w testach immunologicznych.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do wykrywania, oznaczania ilościowego lub półilościowego przeciwciał przeciwko wirusom grypy serotypu H5 w próbkach biologicznych zawierający kompozycję przeciwciał monoklonalnch jak zdefiniowano powyżej oraz narzędzia i reagenty powszechnie stosowane w testach immunologicznych.
Korzystnie, w zestawie przeciwciała są w formie nieizolowanej lub są wyizolowane i oczyszczone.
Korzystnie, zestaw wykorzystywany jest w testach wybranych z grupy obejmującej: test immunoenzymatyczny, korzystnie bELISA H5, immunofluorescencyjny, immunochemiluminescencyjny, radioimmunologiczny, immunochromatograficzny, immunodyfuzyjny, immunoprecypitacyjny, test z użyciem immunoczujników, które mogą być stosowane jako tzw. testy DIVA do odróżniania zakażonych zwierząt od zwierząt szczepionych.
PL 238 020 B1
Korzystnie, zestaw jest wykorzystywany do odróżniania zakażonych zwierząt od zwierząt szczepionych jako tzw. test DIVA.
Wynalazek dostarcza nowe przeciwciała monoklonalne przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18. Przeciwciała są określane analogicznie jak linie komórkowe mysich hybrydom, które je produkują. Zgodnie z tym przeciwciała: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 są produkowane przez linie komórkowe mysich hybrydom, odpowiednio: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18. Wszystkie otrzymane klony są mysimi przeciwciałami izotypu IgG1. Nie nakłada to jednak ograniczeń na izotyp przeciwciał będących przedmiotem wynalazku. Izotyp przeciwciał może być zmieniony przy użyciu technik inżynierii genetycznej, znanych w stanie techniki. Mab G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 specyficznie wiążą się z IV serotypu H5 i białkami HA serotypu H5.
Specyficzność Mab była badana przy użyciu antygenów HA H5 o zróżnicowanych właściwościach. Wśród nich były rekombinowane białka oparte na ektodomenie HA (rHA) z ssaczego, bakulowirusowego i bakteryjnego systemu ekspresji, białka oparte na podjednostce HA1 HA (rHA1), otrzymane w komórkach ssaczych oraz AIV serotypu H5. Większość antygenów HA H5 (13/14) wykazywała cechy natywnego białka. Konformacyjne antygeny zawierały sekwencje HA dwunastu szczepów AIV serotypu H5, z których niektóre wyizolowano od zakażonych ludzi. W tej liczbie były wirusy H5N3 (1 szczep), H5N9 (1 szczep), H5N2 (2 szczepy) oraz wirusy H5N1 (8 szczepów), klasyfikowane do pięciu kladów: 0, 1,2.2, 4 i EA-nonGsGD.
Otrzymane klony Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 rozpoznawały wszystkie konformacyjne, glikozylowane antygeny HA H5: białka rHA (6/6) i rHA1 (3/3) z eukariotycznego systemu ekspresji oraz AIV serotypu H5 (4/4). W zastosowanych warunkach oznaczenia, dla niektórych klonów (4/7) wykazano również znaczną reaktywność z nieglikozylowanym bakteryjnym białkiem HA H5. Żaden z otrzymanych klonów Mab nie wiązał się z niekonformacyjnym białkiem rHA. Wyprodukowane Mab wiązały się z antygenami HA H5 zarówno przed jak i po oczyszczeniu z medium hodowlanego.
Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 rozpoznawały i wiązały się z konformacyjnymi epitopami podjednostki HA1 antygenów HA H5 o zróżnicowanej sekwencji aminokwasowej podjednostki HA1. Homologia podjednostki HA1 konformacyjnych antygenów HA względem podjednostki HA1 immunogenu, użytego w procedurze otrzymywania tych Mab, mierzona identycznością aminokwasów, wynosiła od 99% do 88%. Szczególnie szeroki zakres specyficzności otrzymanych przeciwciał wskazuje, że epitopy dla otrzymanych klonów przeciwciał są silnie konserwowane wśród wirusów serotypu H5.
Analiza profili immunoreaktywności oraz map petydowych fragmentów Fab przeciwciał wykazały zgodnie, że Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 są różnymi klonami. Otrzymane Mab rozpoznają różne epitopy specyficzne dla serotypu H5 hemaglutyniny, dlatego też mogą wiązać się z jedną cząsteczką monomeru białka HA H5.
Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 nie mają zdolności hamowania aktywności hemaglutynacyjnej IV serotypu H5, w szczególności AIV: H5N2 i H5N3. Zatem epitopy dla przeciwciał wg wynalazku nie są niezbędne dla wiązania IV z receptorami komórek gospodarza a przez to nie ulegają mutacjom pod wpływem przeciwciał typu HI, o których wiadomo, że hamują infekcję wirusową. Przewidywalnie, zdolność otrzymanych Mab do rozpoznawania IV serotypu H5 może być zachowana nawet w przypadku zmian antygenu HA w warunkach presji immunologicznej. Potwierdzeniem niezmienności epitopów rozpoznawanych przez przeciwciała wg wynalazku jest szeroki zakres ich specyficzności wobec antygenów HA H5.
Selekcję negatywną otrzymanych klonów przeciwciał wykonano stosując dwadzieścia jeden szczepów AIV, które reprezentowały serotypy HA inne niż H5. Żaden klon przeciwciał z grupy obejmującej Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 nie wiązał się z IV serotypów: H1-H4 i H6-H16.
W podsumowaniu można stwierdzić, że wśród sześciu otrzymanych klonów Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18, każdy rozpoznaje odmienny, konformacyjny epitop podjednostki HA1 HA, wykazuje szeroki zakres specyficzności wobec HA serotypu H5 i jednocześnie nie reaguje krzyżowo z HA serotypów: H1-H4 i H6-H16. Korzystnie, epitopy dla tych przeciwciał są prawdopodobnie silnie konserwowane wśród IV serotypu H5 i nie ulegają zmianom pod wpływem przeciwciał typu HI hamujących infekcję wirusową.
PL 238 020 B1
Cząsteczki wiążące antygeny HA H5 mogą przybierać różne formy. Cząsteczkami wiążącymi wg wynalazku są Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18, będące nienaruszonymi cząsteczkami immunoglobulin mysich izotypu IgG1, które zawierają fragmenty regionu stałego zdolne do krystalizacji (Fc) i regiony wiążące antygen (Fab). Takie kompletne formy cząsteczek wiążących HA H5 zbudowane są z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H), z których każdy zawiera domeny stałe i zmienne (Vl,Vh). W rozpoznawaniu specyficznego epitopu i tworzeniu kompleksów antygen-przeciwciało biorą udział regiony determinujące dopasowanie - CDR (ang. complementarity determining regions), występujące w obrębie zmiennych części ciężkiego i lekkiego łańcucha.
Przedmiotem wynalazku są także fragmenty, warianty i immunokoniugaty Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18, które zachowują zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu wyjściowych klonów przeciwciał. Funkcjonalna odpowiedniość różnych form cząsteczek wiążących wyraża się tym, że współzawodniczą z nienaruszonymi immunoglobulinami o miejsce wiązanie z antygenami HA H5.
Fragmenty przeciwciał wiążące HA H5, obejmują, lecz nie są ograniczone do: Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv, Vh, Vl. Fragmentami przeciwciał wg wynalazku mogą być także multi walencyjne lub multispecyficzne struktury utworzone przez fragmenty przeciwciał, np. wymienione wyżej. Korzystnie, fragmentami wiążącymi HA H5 mogą być jednołańcuchowe cząsteczki przeciwciał - scFv (ang. single-chain variable fragment), składające się z domen Vl i Vh związanych ze sobą przez łącznik peptydowy. Cząsteczki scFv mogą wchodzić w skład m.in. multimerów lub miniprzeciwciał o pożądanym poziomie walencyjności i zakresie specyficzności. Funkcjonalne fragmenty przeciwciał są preferowane wtedy, gdy mogą być wytwarzane z większą wydajnością, zwłaszcza metodami inżynieri genetycznej i/lub gdy ich użycie w niektórych zastosowaniach jest korzystniejsze niż całych cząsteczek przeciwciał.
Funkcjonalne warianty Mab wg wynalazku i ich części mogą być otrzymane przez modyfikacje wyjściowych cząsteczek wiążących polegające na zmianie sekwencji i/lub tworzeniu pochodnych. Zmiany tego typu, wprowadzone intencjonalnie, mają na celu poprawienie właściwości cząsteczek wiążących antygeny HA H5, takich jak powinowactwo czy awidność.
Każda forma cząsteczki wiążącej antygeny HA H5 może być częścią immunokoniugatu, który zawiera przynajmniej jeden znacznik ułatwiający jego oczyszczanie albo detekcję przy użyciu znanych technik pomiarowych. Immunokoniugaty zawierające wykrywalny analitycznie znacznik mogą być użyte w testach diagnostycznych.
Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 zostały otrzymane z zastosowaniem konwencjonalnej technologii hybrydom. Niniejszy wynalazek związany jest z liniami komórkowymi mysich hybrydom produkującymi Mab wg wynalazku, oznaczonymi: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18. Hybrydomy wydzielające przeciwciała mogą być hodowane na dużą skalę in vitro przy użyciu odpowiednich pożywek lub in vivo w jamie otrzewnowej myszy, Mab wydzielone przez hybrydomy mogą być użyte bez oczyszczania, lecz korzystnie po usunięciu składników medium hodowlanego lub płynu wysiękowego, które mogą zakłócać lub uniemożliwiać ich użycie w niektórych zastosowaniach. Jeśli jest to potrzebne, Mab mogą być oczyszczone przy wykorzystaniu rozmaitych metod chromatograficznych, takich jak HPLC czy chromatografia powinowactwa z użyciem białka A lub G. Metody oczyszczania przeciwciał, w tym Mab, są dobrze znane w stanie techniki.
W przykładowym rozwiązaniu klony Mab wg wynalazku hodowano in vitro, stosując pożywkę RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) z dodatkiem FBS, glutaminy, pirogronianu sodu i antybiotyków. Przeciwciała oczyszczono z nadsączy hodowli hybrydom metodą chromatografii powinowactwa przy użyciu „HiTrap Protein G HP” (GE Healthcare).
Produkcja przeciwciał nie jest jedynym zastosowaniem hybrydom: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5- 32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18. Hybrydomy wg wynalazku stanowią również źródło mRNA do syntezy cząsteczek cDNA kodujących otrzymane przeciwciała lub ich fragmenty, które mogą być następnie sklonowane i wykorzystane do ekspresji cząsteczek wiążących antygeny HA H5 w układach heterologicznych. Do przygotowania sekwencji DNA kodujących przeciwciała, ich warianty sekwencyjne lub fragmenty mogą być użyte standardowe techniki biologii molekularnej.
Produkcja rekombinowanych białek w komórkach gospodarza, takich jak bakterie (np. E. coli), drożdże, komórki roślin wyższych i zwierząt może być prowadzona zgodnie z metodami dobrze znanymi w stanie techniki. Bakteryjne i inne mikrobiologiczne systemy mogą być użyte do ekspresji frag
PL 238 020 B1 mentów, takich jak Fab, F(ab’)2 a szczególnie Fv i scFv. Eukariotyczne systemy np. ssacze mogą być wykorzystane do produkcji większych cząsteczek wiążących HA H5, włącznie z całymi cząsteczkami przeciwciał. Procedura produkcji cząsteczek wiążących wg wynalazku metodami rekombinowanego DNA standardowo obejmowałaby: hodowlę rekombinowanych komórek gospodarza w warunkach zapewniających wysoki poziom ekspresji, izolowanie produktu z ekstraktu komórkowego lub korzystnie z medium hodowlanego oraz jego oczyszczenie.
Funkcjonalne fragmenty przeciwciał mogą być również wytwarzane in vitro przez proteolityczne trawienie nienaruszonych immunoglobulin w nieobecności lub obecności czynnika redukującego, zgodnie z protokołami znanymi w stanie techniki, W przykładowym rozwiązaniu, fragmenty Fab przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 otrzymano przez trawienie immunoglobulin ficyną, wykorzystując komercyjny zestaw „Pierce™ Mouse IgG1 Fab and F(ab’)2 Micro Preparation Kit” (Pierce/Thermo Scientific).
Immunokoniugaty mogą być wytwarzane przez chemiczne sprzęganie cząsteczek wiążących antygen ze znacznikami. Techniki sprzęgania znaczników z cząsteczkami wiążącymi antygen są dobrze znane w stanie techniki. Alternatywnie, immunokoniugaty mogą być produkowane jako białka fuzyjne zawierające cząsteczki wiążące wg wynalazku i odpowiedni znacznik.
Cząsteczki wiążące antygeny HA H5 mają szczególne zastosowanie w metodach rozpoznawania infekcji wywoływanych przez IV serotypu H5 u zwierząt i ludzi, stanowiąc użyteczne narzędzie w testach diagnostycznych. W pacjentów z rozpoznaną infekcją, testy diagnostyczne zawierające cząsteczki wiążące wg wynalazku mogą być użyte także do monitorowania rozwoju infekcji wirusowej i/lub oceny skuteczności zastosowanego schematu leczenia.
Diagnostyka infekcji IV oparta na metodach immunologicznych polega na wykrywaniu cząstek wirusowych albo przeciwciał przeciwko antygenom wirusa. Stosownie do tego, w diagnostyce grypy wykorzystywane są dwa typy testów immunologicznych. Cząsteczki wiążące antygeny HA H5 mogą być użyte w obu typach testów diagnostycznych. Z uwagi na szeroki zakres specyficzności wobec HA H5, użycie cząsteczek wiążących wg wynalazku w diagnostyce może zapewnić identyfikację szczepu infekcyjnego. Test do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 z użyciem cząsteczek wiążących wg wynalazku może być także wykorzystany jako tzw. test DIVA przeznaczony do odróżniania zakażonych zwierząt od zwierząt szczepionych.
Cząsteczki wiążące wg wynalazku mogą być użyte w metodach immunologicznych, realizowanych in vivo, in situ lub in vitro, polegających na lokalizacji i/lub oznaczeniu ilościowym lub półilościowym IV serotypu H5 w organizmie, tkankach lub komórkach albo też w odpowiednich próbach biologicznych. W innym urzeczywistnieniu wynalazku, cząsteczki wiążące antygeny HA H5 mogą być stosowane w metodach wykrywania, oznaczania ilościowego lub półilościowego przeciwciał przeciwko IV, w szczególności serotypu H5, w próbach biologicznych, takich jak surowica lub osocze krwi. W metodach tych Mab lub ich funkcjonalne odpowiedniki współzawodniczą z przeciwciałami obecnymi w próbie z o miejsce wiązania z antygenem.
Cząsteczki wiążące antygeny HA H5 wg wynalazku mogą być użyte w testach immunologicznych na różne sposoby. Przykładowo, mogą być użyte w nieizolowanej formie albo po izolacji i oczyszczeniu. W celu uzyskania pożądanego efektu diagnostycznego, cząsteczki wiążące antygeny HA H5 rozpoznające określony epitop antygenu mogą być stosowane osobno albo razem z cząsteczką lub cząsteczkami, które rozpoznają inne epitopy antygenu. Cząsteczki wiążące antygeny HA H5 mogą się wiązać z antygenem w roztworze lub zawiesinie. Alternatywnie, cząsteczki te mogą być im mobilizowane na podłożach stałych i reagować z antygenem zawartym w fazie płynnej.
Cząsteczki wiążące antygeny HA H5 wg wynalazku mogą być użyte w testach immunologicznych jako białka niewyznakowane i/lub w postaci koniugatów zawierających analitycznie wykrywalny znacznik. Znakowanie cząsteczek wiążących HA H5 wg wynalazku może ułatawiać ich użycie w diagnostyce i rozszerzać zakres zastosowań. W stanie techniki opisane są rozmaite znaczniki, wykrywalne przy użyciu dostępnych urządzeń pomiarowych, podobnie jak metody sprzęgania cząsteczek wiążących antygen z tymi znacznikami. Immunokoniugaty cząsteczek wiążących HA H5 będą zawierały znaczniki odpowiednie dla specyficznych technik detekcji, analizy i/lub użytych metod czy technik testów immunologicznych, w których znajdą zastosowanie.
Cząsteczki wiążące antygeny HA H5 wg wynalazku mogą być użyte w większości z dobrze znanych technik i metod testów immunologicznych. Przykłady obejmują testy: immunoenzymatyczny np. ELISA, immunofluorescencyjny, immunochemiluminescencyjny, radioimmunologiczny, immunochromatograficzny, immunodyfuzyjny, immunoprecypitacyjny, oparty na użyciu immunoczujników.
PL 238 020 B1
Cząsteczki wiążące antygeny HA H5 mogą być także stosowane do barwienia immunohistochemicznego czy sortowania komórek barwionych fluorescencyjnie przy użyciu cytometru przepływowego. Podane powyżej przykłady nie nakładają jednak ograniczeń na technikę czy metodę testu, w jakim cząsteczki wiążące antygeny HA H5 mogą być stosowane. Z uwagi na to, że cząsteczki wiążące wg wynalazku rozpoznają epitopy konformacyjne, nie mogą być stosowane w testach typu Western blot, gdzie wykorzystywane są cząsteczki rozpoznające liniowe epitopy antygenów.
Korzystnie, testem do wykrywania albo oznaczania ilościowego lub półilościowego IV serotypu H5 z użyciem cząsteczek wiążących antygeny HA H5 wg wynalazku jest test typu „sandwich” ELISA. Korzystnie, testem do wykrywania albo oznaczania ilościowego lub półilościowego przeciwciał przeciwko IV serotypu H5 z użyciem cząsteczek wiążących wg wynalazku są testy ELISA w formacie blokującym (bELISA) lub kompetycyjnym (cELISA). W przypadku wczesnej diagnostyki, preferowane jest użycie cząsteczek wiążących wg wynalazku np. w testach immunochromatograficznych czy immunoczujnikach do szybkiego i prostego technicznie wykrywania IV serotypu H5.
W celu wykazania możliwości zastosowania cząsteczek wiążących wg wynalazku w diagnostyce, opracowano i zoptymalizowano test bELISA H5 (IBA) do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 wirusów grypy w surowicach kurcząt. W teście bELISA H5 wykorzystano jeden z klonów przeciwciał wg wynalazku tj. Mab G-7-27-18 jako kluczowe przeciwciało wykrywające testu diagnostycznego. Do opłaszczenia płytek mikrotitracyjnych wykorzystano białko HA H5, wyprodukowane w bakulowirusowym systemie ekspresji (OET). Oznaczenia przeprowadzano w obecności prób kontrolnych. Kontrolę maksymalnego wiązania Mab 7-27-18 z antygenem HA H5 (kontrola Mab) uzyskano wykonując analizę w nieobecności surowicy. Jako kontrolę negatywną zastosowano normalną surowicę kurcząt (Abcam), natomiast jako silną i słabą kontrolę pozytywną antysurowice kurcząt szczepionych inaktywowanymi AIV serotypu H5 (x-OvO), Poziom hamowania wiązania Mab 7-27-18 z antygenem przez surowice, wyrażony w procentach, obliczano wg wzoru: % hamowania = 100 - [(A450 próby/A450 kontroli Mab) x 100].
Przeprowadzono wstępną ocenę wartości diagnostycznej testu bELISA H5 przy użyciu prób, uprzednio sklasyfikowanych jako anty H5 pozytywne lub negatywne na podstawie wyników testu HI. W procedurach walidacji testów do diagnostyki zakażeń IV, test HI traktowany jest jako tzw. złoty standard.
Wartość „cut-off” wyznaczono w oparciu o wyniki oznaczeń anty H5-negatywnych prób surowicy (średnia wartość % hamowania + 2x SD).
Uzyskane wyniki wskazują, że test bELISA H5 pozwala na odróżnienie kurcząt szczepionych antygenami HA H5 od kurcząt anty H5-negatywnych. Co ważne, antysurowice przeciwko AIV serotypów H1-H4 i H6-H16 nie dają reakcji krzyżowych w opracowanym teście. Przypuszczalnie test bELISA H5 umożliwiłby także jednoznaczną diagnostykę zwierząt zakażonych IV serotypu H5, takimi jak HPAIV H5N1. W przypadku szczepień przeciwko HPAIV przy użyciu białek HA H5, test bELISA H5 razem z testem do wykrywania przeciwciał przeciwko innym antygenom AIV np. neuraminidazie mógłby znaleźć zastosowanie jako tzw. test DIVA przeznaczony do odróżniania zakażonych zwierząt od zwierząt szczepionych.
Charakterystykę testu bELISA H5 poszerzono o wstępne wyznaczenie kluczowych parametrów walidacyjnych testu diagnostycznego. Uzyskane wyniki wykazały, że test bELISA H5 charakteryzuje zadowalająca powtarzalność (RSD: 7,1% - 10,0%) oraz wysokie wskaźniki specyficzności analitycznej (Asp: 100%), a także specyficzności i czułości diagnostycznej (Dsp: 97,6%; Dse 1: 98,0%; Dse 2: 99,1 %).
Wynalazek obejmuje zestawy diagnostyczne przeznaczone do rozpoznania infekcji wirusowej u zwierząt i ludzi, w szczególności wywołanej przez IV serotypu H5. Zestawy diagnostyczne wg wynalazku umożliwiają wykrywanie IV i przeciwciał przeciwko nim skierowanych, jednocześnie identyfikując serotyp wirusa infekcyjnego.
Zestawy diagnostyczne wg wynalazku mogą być produkowane na wiele sposobów. Poza cząsteczkami wiążącymi wg wynalazku, które są kluczowe i charakterystyczne dla rozpoznania zakażeń IV serotypu H5, zestaw może zawierać komercyjnie dostępne składniki każdego innego immunologicznego testu diagnostycznego. Zestaw diagnostyczny wg wynalazku zawiera przynajmniej jeden rodzaj cząsteczek wiążących wg wynalazku. Mogą to być Mab, wybrane z grupy obejmującej przeciwciała: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18, ale także ich fragmenty, warianty lub immunokoniugaty.
Zestaw diagnostyczny do wykrywania IV serotypu H5 wg wynalazku może zawierać dwa różne klony przeciwciał z grupy obejmującej Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18, ale także ich fragmenty, warianty lub immunokoniugaty. Przykładowo, test
PL 238 020 B1 może być przeprowadzony metodą ELISA typu „sandwich”. Jeden klon przeciwciał jest wykorzystywany do opłaszczania płytek mikrotitracyjnych, natomiast drugi klon sprzężony z enzymem służy do detekcji kompleksu antygen-przeciwciało przez reakcję znakującego enzymu z substratem dającą wykrywalny produkt.
Zestaw diagnostyczny do wykrywania przeciwciał przeciwko IV serotypu H5 wg wynalazku, może zawierać jeden klon przeciwciał z grupy obejmującej Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18 albo jego fragmenty, warianty lub immunokoniugaty. Możliwe jest także użycie dowolnej kompozycji cząsteczek wiążących HA H5 wg wynalazku. Przykładowo, oznaczenie może być przeprowadzone metodą ELISA w formacie blokującym (bELISA) lub kompetycyjnym (cELISA). W testach bELISA/cELISA cząsteczka lub cząsteczki wiążące antygeny HA H5 są znakowane w sposób bezpośredni (immunokoniugaty) lub pośredni (np. przy użyciu wyznakowanych przeciwciał wtórnych), co zapewnia wykrywalność kompleksu antygen-przeciwciało.
Zestawy diagnostyczne wg wynalazku zawierają narzędzia i reagenty powszechnie stosowane w testach immunologicznych, W przypadku, gdy cząsteczki wiążące antygeny HA H5 są składnikami zestawów diagnostycznych opartych na metodzie ELISA, takie zestawy zawierają dodatkowo:
- płytki opłaszczone Mab wg wynalazku (ELISA typu „sandwich”) lub antygenem HA H5 (bELISA, cELISA), w których niespecyficzne miejsca wiązania są wysycone przy użyciu odpowiedniej substancji blokującej,
- bufory przeznaczone do płukania płytek, rozcieńczania badanych prób i reagentów, - substrat enzymu oraz roztwór hamujący reakcję enzymatyczną.
W skład każdego zestawu diagnostycznego z użyciem cząsteczek wiążących antygeny HA H5 wchodzą także próby konrolne: kontrola pozytywna (PC) i negatywna (NC), które zawierają cząstki wirusowe lub przeciwciała związane z infekcją IV serotypu H5 (PC) albo ich nie zawierają (NC). Reagenty zestawu diagnostycznego są dostarczone w osobnych, oznakowanych pojemnikach. Do zestawów diagnostycznych dołączona jest także instrukcja przeprowadzenia testu.
W przykładowym rozwiązaniu zestaw diagnostyczny wg wynalazku - bELISA H5 (IBA) do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 wirusów grypy w surowicy kurcząt zawiera:
- płytki MediSorp (NUNC) opłaszczone rekombinowanym białkiem HA H5 (OET) i zablokowane przy użyciu „Protein-Free T20 (PBS) Blocking Buffer” (Pierce/Thermo Scientific),
- stężony rozwór przeciwciał wg wynalazku (Mab 7-27-18) w „Antibody Stabilizer PBS” (Candor Bioscience),
- stężony rozwór wyznakowanych HRP przeciwciał przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficznych wobec łańcucha γ (Sigma-Aldrich) w „HRP-Protector” (Candor Bioscience),
- kontrolę pozytywną, PC (anty-H5 pozytywna surowica kurcząt),
- kontrolę negatywną, NC (normalna surowica kurcząt),
- bufor inkubacyjny (BSA/PBS + Proclin 300),
- bufory do przygotowania rozcieńczeń roboczych przeciwciał wg wynalazku i przeciwciał wtórnych, odpowiednio: „Antibody Stabilizer PBS” i „HRP-Protector” (Candor Bioscience),
- stężony bufor do płukania płytek (PBST + Proclin 300),
- MB (Sigma-Aldrich),
- 0,5 M H2SO4,
Inne zastosowania cząsteczek wiążących antygeny HA H5 wg wynalazku obejmują ich wykorzystanie w badaniach epidemiologicznych do wczesnej detekcji i typowania IV oraz mapowania epitopów H5-specyficznych w antygenach HA.
Cząsteczki wiążące wg wynalazku są skierowane przeciwko różnym konformacyjnym epitopom podjednostki HA1, które są prawdopodobnie konserwowane w białkach HA H5. Uzasadnia to ich użycie do wczesnej detekcji i typowania IV oraz do molekularnej identyfikacji i charakterystyki antygenów HA H5 (mapowanie epitopów). Tego typu badania dostarczają ważnych danych epidemiologicznych na temat ewolucji, rozprzestrzeniania się IV, w szczególności serotypu H5, oraz pojawiania nowych szczepów. W powyższych zastosowaniach mogą być użyte Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-2-17 i G-7-27-18, ale także ich fragmenty, warianty i immunokoniugaty.
Inne zastosowania cząsteczek wiążących antygeny HA H5 wg wynalazku obejmują także ich wykorzystanie do monitorowania jakości antygenów HA H5.
Cząsteczki wiążące wg wynalazku mogą być użyte do monitorowania jakości antygenów HA H5, przeznaczonych do użycia jako antygeny szczepionkowe lub reagenty w testach diagnostycznych.
PL 238 020 B1
W szczególności cząsteczki wiążące wg wynalazku mogą być użyte do sprawdzenia, czy antygen HA zawiera epitopy specyficzne dla serotypu H5 w prawidłowej konformacji. Ponadto cząsteczki wiążące wg wynalazku można wykorzystać w badaniach stopnia oligomeryzacji białek HA H5. Przykładowo, takie badanie może być przeprowadzone przy użyciu testu typu „sandwich” ELISA, w którym jeden określony klon przeciwciał, jego wariant lub fragment jest wykorzystywany w dwóch postaciach tj. jako białko niewyznakowane i jako immunokoniugat zawierający analitycznie wykrywalny znacznik. W tego typu teście, antygen jest wyłapywany przez nie wy znakowaną cząsteczkę wiążącą wg wynalazku zaadsorbowaną na płytce mikrotitracyjnej. Utworzony kompleks antygen-przeciwciało jest wykrywany przez immunokoniugat pod warunkiem, że antygen zawiera więcej niż jeden epitop rozpoznawany przez cząsteczkę wiążącą tj. w wypadku, gdy występuje w formie dimeru, trimeru lub oligomeru. Stopień oligomeryzacji jest ważnym elementem oceny właściwości białek HA, szczególnie tych, które przeznaczone są do produkcji szczepionek przeciwko grypie.
Monitorowanie jakości białek HA H5, stanowiących antygeny szczepionkowe lub reagenty w testach diagnostycznych, może być przeprowadzone przy użyciu Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18, ale także ich fragmentów, wariantów lub immunokoniugatów.
Głównym wyzwaniem prac nad otrzymaniem podjednostkowych szczepionek przeciwko grypie, opartych na użyciu HA, wyprodukowanej metodami inżynierii genetycznej, jest otrzymanie białka przypominającego antygen wirusowy. Szczególne znaczenie dla jakości HA szczepionkowej ma prawidłowość struktury podjednostki HA1, gdzie zlokalizowane są konformacyjne epitopy dla przeciwciał neutralizujących. Pierwszym wskaźnikiem przydatności białek HA do produkcji szczepionek są wyniki badań antygenowości z użyciem dobrze scharakteryzownych przeciwciał. Nowe Mab rozpoznają wyłącznie konformacyjne epitopy podjednostki HA1, prawdopodobnie konserwowane w białkach HA H5. W związku z tym mogą być użyte z powodzeniem w badaniach właściwości antygenów do produkcji szczepionek przeciwko IV serotypu H5, niezależnie od źródłowej sekwencji antygenów szczepionkowych. Przewidywane jest również wykorzystanie wytworzonych przeciwciał do kontroli stabilności szczepionkowej HA H5, przechowywanej osobno lub w kompozycjach immunnogennych.
Innym możliwym zastosowaniem otrzymanych Mab jest ich użycie do monitorowania jakości białek HA H5 przeznaczonych do stosowania lub już stosowanych jako reagenty w testach diagnostycznych. Nowe Mab wykazują szeroki zakres specyficzności wobec HA H5, dlatego mogą być użyte do sprawdzania jakości reagentów, szczególnie w tych testach diagnostycznych, których celem jest identyfikacja serotypu szczepu infekcyjnego.
W przykładowym rozwiązaniu białko HA H5 z bakteryjnego systemu ekspresji analizowano przed i po denaturacji w warunkach redukujących przy użyciu Mab: G-6-42-42 i G-7-27-18 z zastosowaniem metody ELISA. Badania te wykazały, że białko HA traci prawidłową konformację pod wpływem czynników denaturujących i redukujących. Uzyskane wyniki potwierdzają przydatność otrzymanych przeciwciał do badań właściwości zarówno nowo wytworzonych białek HA H5 jak i do detekcji zmian tych białek w trakcie przechowywania.
Jeszcze inne zastosowanie cząsteczek wiążących antygeny HA H5 wg wynalazku polega na ich wykorzystaniu do izolowania lub oczyszczania białek HA.
Cząsteczki wiążące wg wynalazku mogą być użyte do izolowania lub oczyszczanie antygenów HA H5. W tym celu można zastosować standardowe techniki, takie jak: chromatografia powinowactwa, czy immunoprecypitacja. Wyizolowane lub oczyszczone w ten sposób antygeny HA mogą być wykorzystane jako reagenty w testach diagnostycznych albo jako składniki prototypowych szczepionek przeciwko IV serotypu H5, przeznaczonych do wstępnej oceny zdolności wywoływania ochronnej odpowiedzi odpornościowej u zwierząt.
Wynalazek ujawnia metodę wytwarzania Mab przeciwko HA wirusów grypy, wykazujących szeroki zakres specyficzności wobec HA jednego określonego serotypu i nie reagujących krzyżowo z HA innych serotypów. Korzystnie, epitopy dla pożądanych Mab, wytworzonych zgodnie z procedurą wg wynalazku, są silnie konserwowane w obrębie serotypu. Istotą procedury wg wynalazku jest użycie rekombinowanego białka o cechach natywnej HA jako immunogenu, zastosowanie zróżnicowanej grupy antygenów HA do selekcji przeciwciał w kierunku serotypowej specyficzności oraz wykorzystanie unikalnych metod różnicowania klonów. Jedna z tych metod oparta jest na profilach immunoreaktywności a druga na mapach peptydowych fragmentów Fab wyselekcjonowanych Mab.
Zgodnie z metodą wg wynalazku, Mab mogą być wytworzone metodą hybrydom, po raz pierwszy opisaną przez Kohlera i Milsteina (1975). Metoda obejmuje: immunizację myszy białkiem HA, izolację limfocytów ze śledzion zaszczepionych zwierząt, fuzję splenocytów z komórkami szpiczaka
PL 238 020 B1 mysiego oraz hodowlę, klonowanie i selekcję hybrydom. W większości opisanych procedur otrzymywania Mab przeciwko HA stosowano IV do immunizacji. Tym, co wyróżnia procedurę wg wynalazku jest użycie rekombinowanego białka zachowującego cechy wirusowej HA jako immunogenu. Korzystnie, pierwsza dawka antygenu podawana jest w postaci emulsji z CFA, przygotowanej przy przy użyciu dwóch strzykawek połączonych igłą do emulsyfikacji.
Zgodnie ze standardową procedurą, otrzymane przeciwciała są selekcjonowane w kierunku pożądanej funkcji i/lub specyficzności, stosując metody znane w stanie techniki. Selekcja w kierunku zdolności przeciwciał do ochrony przed infekcją IV prowadzona jest przy użyciu testu HI i/lub MN. Wybrane w ten sposób przeciwciała skierowane są wobec tych epitopów HA, które w naturalnym procesie namnażania wirusa znajdują się pod silną presją immunologiczną. Powoduje to, że docelowe epitopy mogą ulec zmianom, co w konsekwencji prowadzi do ograniczenia zakresu specyficzności otrzymanych Mab. Identyfikacja przeciwciał o pożądanej specyficzności realizowana jest przy użyciu tetów immunologicznych, takich jak test ELISA, w których jako antygeny najczęściej stosowane są wirusy grypy. Liczba zastosowanych szczepów wirusa bywa często ograniczona, przez co selekcja uwzględnia jedynie wąski zakres zmienności białka HA.
Tym, co wyróżnia procedurę wg wynalazku jest to, że w badaniach przesiewowych przeciwciał stosowane są odmienne formy antygenu HA o korzystnie zróżnicowanych właściwościach mających spodziewany wpływ na sposób prezentacji epitopów dla pożądanych Mab. Korzystnie, białka HA, wykorzystywane w badaniach immunoreaktywności powinny wykazywać właściwości wirusowego antygenu. Uzasadnione jest również rozszerzenie panelu antygenów o białka pozbawione cech natywnej HA, gdyż umożliwi to odróżnienie przeciwciał rozpoznających epitopy konformacyjne i liniowe antygenu. Zgodnie z procedurą wg wynalazku, panel antygenów HA określonego serotypu, przeznaczonych do analiz immunoreaktywności, charakteryzuje duże zróżnicowanie homologii względem immunogenu, zastosowanego w procedurze otrzymywania Mab. Warunkiem niezbędnym dla selekcji serotypowo-specyficznych przeciwciał jest wykonanie selekcji negatywnej z użyciem antygenów HA pozostałych piętnastu serotypów.
Podsumowując, zastosowana strategia selekcji Mab zwiększa prawdopodobieństwo identyfikacji tych hybrydom, które produkują pożądane serotypowo-specyficzne przeciwciała o szerokim zakresie specyficzności. Dodatkowo, zastosowanie testu wykrywającego funkcjonalne właściwości przeciwciał pozwoli ustalić, czy epitopy dla tych przeciwciał mogą być pod wpływem presji immunologicznej podczas namnażania wirusa.
W końcowym etapie procedury ważne jest stwierdzenie, na ile otrzymane klony przeciwciał różnią się od siebie. Informacji może dostarczyć porównanie sekwencji kodujących regiony determinujące dopasowanie poszczególnych klonów przeciwciał. Uzyskanie tego typu danych jest pracochłonne i długotrwałe, gdyż wymaga nie tylko sekwencjonowania genów kodujących CDR, ale także weryfikacji sekwencji przez klonowanie i ekspresję. Inny sposób różnicowania wyselekcjonowanych Mab opiera się na badaniach ich współzawodnictwa o miejsce wiązania z antygenem. W tego typu testach obniżenie wiązania jednego klonu przeciwciał przez drugi klon jest interpretowane jako wskazujące, że przeciwciała wiążą sie z tym samym epitopem albo z epitopami, które zachodzą na siebie lub są blisko siebie położone w cząsteczce antygenu.
W ujawnionej procedurze otrzymywania Mab serotypowo-specyficznych, różnicowanie klonów oparte jest na profilach immunoreaktywności i mapach peptydowych fragmentów Fab wytworzonych przeciwciał. Zastosowane metody różnicowania nie są tak pracochłonne jak ustalanie se kwencji części zmiennych przeciwciał i dają jednoznaczne wyniki w przeciwieństwie do metod opartych na kompetycji przeciwciał.
Tak więc wynalazek dostarcza sześć różnych klonów Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6- 42-42, G-7-24-17 i G-7-27-18, z których każdy rozpoznaje odmienny, konformacyjny epitop podjednostki HA1 HA, wykazuje szeroki zakres specyficzności wobec HA serotypu H5 i jednocześnie nie reaguje krzyżowo z HA serotypów: H1-H4 i H6-H16. Korzystnie, epitopy dla tych przeciwciał są prawdopodobnie silnie konserwowane wśród IV serotypu H5 i nie ulegają zmianom pod wpływem przeciwciał typu HI.
Przeciwciała wg wynalazku otrzymano metodą hybrydom przy użyciu rekombinowanego białka HA H5 o cechach natywnej HA jako immunogenu. Pierwsze szczepienie myszy wykonano stosując emulsję białka HA H5 z CFA, przygotowaną przy przy użyciu dwóch strzykawek połączonych igłą do emulsyfikacji. Badania przesiewowe Mab w kierunku serotypowej specyficzności zostały przeprowadzone metodą ELISA przy użyciu różnych form antygenów HA H5 o zróżnicowanej homologii
PL 238 020 B1 względem immunogenu (selekcja pozytywna) i IV serotypów innych niż H5 (selekcja negatywna). W wyniku selekcji do dalszych badań wybrano Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18. Przeprowadzono testy HI, które wykazały, że wyselekcjonowane przeciwciała nie mają aktywności hamowania hemaglutynacji..
Na podstawie badań reaktywności z antygenami HA H5 stworzono profile immunoreaktywności wytworzonych Mab. W wyniku trawienia ficyną otrzymano fragmenty Fc i Fab immunoglobulin a następnie w wyniku trypsynolizy uzyskano mapy paptydowe fragmentów Fab i Fc poszczególnych klonów. Główne znaczenie dla identyfikacji otrzymanych klonów przeciwciał miała analiza porównawcza map peptydowych ich zmiennych części, odpowiedzialnych za wiązanie antygenu, czyli fragmentów Fab. Obie zastosowane metody różnicowania przeciwciał dały zgodne wyniki. Wykazano, że Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-7-24-17 i G-7-27-18 są różnymi klonami, natomiast Mab G-6-42-42 i G-6-42-71 reprezentują jeden klon przeciwciał, odmienny od pozostałych pięciu klonów.
Opis figur
Fig. 1 przedstawia widmo masowe białka rHA - A/H5N1/Qinghai z (*) ssaczego systemu ekspresji. Białko (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) wyprodukowano w oparciu o sekwencję HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/I2/05(H5N1) AIV (ITC). Widmo masowe wykonano przy użyciu spektrometru mas MALDI TOF/TOF (4800 Plus, AB SCIEX).
Fig. 2 przedstawia wyniki badań antygenowości białka rHA - A/H5N1/Qinghai z (*) ssaczego systemu ekspresji. Białko (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) wyprodukowano w oparciu o sekwencję HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) AIV (ITC). Badania przeprowadzono metodą ELISA na płytkach MediSorp, MaxiSorp (NUNC) oraz Ni-NTA (Qiagen). W testach użyto komercyjnie dostępne Mab przeciwko HA H5 (USBiological, ABR /Thermo Scientific, Acris Antibodies) oraz Pab przeciwko podjednostce HA1 (Pab 1) i HA2 (Pab 2) antygenu (ITC).
Fig. 3 przedstawia wyniki badań poziomu oligomeryzacji rekombinowanych białek HA H5 o sekwencjach różnych szczepów IV serotypu H5. Białka, oparte na ektodomenie (rHA) lub podjednostce HA1 (rHA1) antygenu, wyprodukowano w (*) ssaczym (ITC) lub (**) bakulowirusowym (OET) systemie ekspresji. Badanie przeprowadz ono metodą ELISA typu „sandwich”, stosując niewyznakowane i wyznakowane HRP komercyjne przeciwciała przeciwko HA H5 (Acris Antibodies).
Fig. 4 przedstawia widmo masowe białka rHA - A/H5N1/Poland z (**) bakulowirusowego systemu ekspresji. Białko (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) wyprodukowano w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV (OET, seria 2). Widmo masowe wykonano przy użyciu spektrometru mas MALD1 TOF/TOF (4800 Plus, AB SCIEX).
Fig. 5 przedstawia wyniki badań antygenowości białka rHA - A/H5N1/Poland z (**) bakulowirusowego systemu ekspresji. Białko (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) wyprodukowano w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV (OET, seria 2). Badania przeprowadzono metodą ELISA na płytkach MediSorp, MaxiSorp (NUNC) oraz Ni-NTA (Qiagen). W testach użyto komercyjnie dostępne Mab przeciwko HA H5 (USBiological, ABR/Thermo Scientific, Acris Antibodies) oraz Pab przeciwko podjednostce HA1 (Pab 1) i HA2 (Pab 2) antygenu (ITC).
Fig. 6 przedstawia wyniki badań antygenowości rekombinowanych białek o sekwencjach HA różnych szczepów IV serotypu H5. Białka HA H5, oparte na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA) antygenu, wyprodukowano w ssaczym systemie ekspresji (ITC). Badania przeprowadzono metodą ELISA na płytkach Ni-NTA (Qiagen). W testach użyto komercyjnie dostępne Mab przeciwko HA H5 (USBiological, ABR/Thermo Scientific, Acris Antibodies) oraz Pab przeciwko podjednostce HA1 (Pab 1) i HA2 (Pab 2) antygenu (ITC).
Fig. 7a-g przedstawiają widma masowe wytworzonych Mab: (a) G-1-31-22, (b) G-2-14-10, (c) G-5-32-5, (d) G-6-42-42, (e) G-6-42-71, (f) G-7-24-17, (g) G-7-27-18. Widma masowe wykonano przy użyciu spektrometru mas MALDI TOF/TOF (4800 Plus, AB SCIEX).
Fig. 8 przedstawia krzywe miareczkowania Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 na białku rHA - A/H5N1/Qinghai z (*) ssaczego systemu ekspresji. Białko (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) wyprodukowano w oparciu o sekwencję HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) AIV (ITC). Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA na płytkach MediSorp (NUNC) opłaszczonych antygenem w stężeniu 1 qg/ml.
Fig. 9 przedstawia krzywe miareczkowania Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 na białku rHA - A/H5N1/Poland z (**) bakulowirusowego
PL 238 020 B1 systemu ekspresji. Białko (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) wyprodukowano w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV (OET, seria 8). Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA na płytkach MediSorp (NUNC) opłaszczonych antygenem w stężeniu 1 μg/mL
Fig. 10 przedstawia krzywe miareczkowania Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 na białku rHA - A/H5N1/Poland z (***) bakteryjnego systemu ekspresji. Białko (17-522 aa, ARRRKKR) wyprodukowano w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV (IBA). Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA na płytkach PolySorp, MediSorp, MaxiSorp i MultiSorp (NUNC) opłaszczonych preparatem rHA o czystości ~80%, który zawierał zrenaturowaną hemaglutyninę w stężeniu ~1 μg/ml. Wyniki przedstawiono jako średnie wartości A450 ± SD uzyskane na poszczególnych rodzajach płytek polistyrenowych.
Fig. 11 przedstawia wyniki badań reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6- 42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z białkami HA H5 o sekwencjach różnych szczepów IV. Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA stosując rekombinowane antygeny oparte na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny (zestawienie B) w stężeniach 1 μg/ml do opłaszczenia płytek Ni-NTA (Qiagen). Białko rHA - A/H5N1/Poland wyprodukowano w (**) bakulowirusowym systemie ekspresji (OET, seria 8). Pozostałe białka rHA i rHA1 pochodziły z (*) ssaczego systemu ekspresji (ITC). Oczyszczone przeciwciała były badane w stężeniach z liniowego zakresu krzywych miareczkowania na rHA - A/H5N1/Vietnam, przy których poziomy sygnału (A450) wynosiły ~2,5. Wyniki przedstawiono jako wartości A450.
Fig. 12 przedstawia poziom reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z białkami HA H5 o sekwencjach różnych szczepów IV w stosunku do reaktywności wobec immunogenu. Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA stosując rekombinowane antygeny oparte na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny (zestawienie B) w stężeniach 1 μg/ml do opłaszczenia płytek Ni-NTA (Qiagen). Białko rHA - A/H5N1/Poland wyprodukowano w (**) bakulo wirusowym systemie ekspresji (OET, seria 8). Pozostałe białka rHA i rHA1 pochodziły z (*) ssaczego systemu ekspresji (ITC). Oczyszczone przeciwciała były badane w stężeniach z liniowego zakresu krzywych miareczkowania na rHA - A/H5N1/Vietnam, przy których poziomy sygnału (A450) wynosiły -2,5. Wartości sygnałów (A450) uzyskane w badaniach reaktywności wytworzonych przeciwciał z rekombinowanymi białkami HA H5 przedstawiono jako % wartości A450 odczytanych w testach z użyciem rHA - A/H5N1/Qinghai (reaktywność względna wobec rekombinowanych białek HA H5).
Fig. 13 przedstawia wyniki badań reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z LPAIV serotypu H5. Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA opłaszczając płytki MaxiSorp (NUNC) wirusami: H5N3, H5N1, H5N9 i H5N2, rozcieńczonymi do 4000 HAU/ml na podstawie wartości specyfikowanej przez producenta. Wirusy grypy (x-OvO) pochodziły z IZSVe. Oczyszczone przeciwciała były badane w stężenu 20 μg/ml. Wyniki przedstawiono jako wartości A450.
Fig. 14 przedstawia poziom reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-2417 i G-7-27-18 z LPAIV: H5N1, H5N9 i H5N2 w stosunku do reaktywności wobec AIV H5N3. Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA opłaszczając płytki MaxiSorp (NUNC) wirusami: H5N3, H5N1, H5N9 i H5N2, rozcieńczonymi do 4000 HAU/ml na podstawie wartości specyfikowanej przez producenta. Wirusy grypy (x-OvO) pochodziły z IZSVe. Oczyszczone przeciwciała były badane w stężenu 20 μg/ml. Wartości sygnałów (A450) uzyskane w badaniach reaktywności wytworzonych przeciwciał z AIV: H5N1, H5N9 i H5N2 przedstawiono jako % wartości A450 odczytanych w testach z użyciem AIV H5N3 (reaktywność względna wobec AIV serotypu H5).
Fig. 15 przedstawia profile reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z rekombinowanymi białkami HA i wirusem ptasiej grypy o najwyższej homologii z immunogenem wśród stosowanych, odpowiednio, białek rHA i AIV serotypu H5. Antygen: 17-530 aa (ARRRKKR, 6x His) z sekwencją HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) AIV wyprodukowano w (*) ssaczym systemie ekspresji (ITC). Białka HA: 17-530 aa (ARRRKKR, 6x His) i 17-522 aa (ARRRKKR) wyprodukowano, odpowiednio, w (**) bakulowirusowym (OET, seria 8) i (***) bakteryjnym systemie ekspresji (IBA) w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) ATV. Wirus
PL 238 020 B1 grypy H5N3 (x-OvO) pochodził z IZSVe. Do opłaszczania białkami rHA (1 μg/ml) stosowano płytki (NUNC): MediSorp (rHA*, rHA**), PolySorp, MediSorp, MaxiSorp i MultiSorp (rHA***) a do opłaszczania wirusem H5N3 (4000 HAU/ml) płytki MaxiSorp. Wyniki przedstawiono jako wartości sygnałów (A450) uzyskane przy użyciu otrzymanych Mab w stężeniach: 62,5-15,625 ng/ml (rHA*, rHA**), 8000250 ng/ml (rHA***) i 20 μg/ml (AIV H5N3).
Fig. 16 przedstawia profile względnych reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z białkami o sekwencjach HA H5 różnych szczepów IV. Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA stosując rekombinowane antygeny oparte na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny (zestawienie B) w stężeniach 1 μg/ml do opłaszczenia płytek Ni-NTA (Qiagen). Białko rHA - A/H5N1/Poland wyprodukowano w (**) bakulowirusowym systemie ekspresji (OET, seria 8). Pozostałe białka rHA i rHA1 pochodziły z (*) ssaczego systemu ekspresji (ITC). Oczyszczone przeciwciała były badane w stężeniach z liniowego zakresu krzywych miareczkowania na rHA - A/H5N1/Vietnam, dla których poziomy sygnału (A450) wynosiły ~2,5. Reaktywność względna otrzymanych Mab wobec rekombinowanych białek HA H5 oznacza poziom reaktywności wyrażony jako % wartości A450 odczytanych w testach z użyciem rHA* - A/H5N1/Qinghai.
Fig. 17 przedstawia profile względnych reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z AIV: H5N1, H5N9 i H5N2. Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA opłaszczając płytki MaxiSorp (NUNC) wirusami: H5N3, H5N1, H5N9 i H5N2, rozcieńczonymi do 4000 HAU/ml. Wirusy grypy serotypu H5 (x-OvO) pochodziły z IZSVe. Oczyszczone przeciwciała były badane w stężenu 20 pg/ml. Reaktywność względna otrzymanych Mab wobec wirusów Al serotypu H5 oznacza poziom reaktywności wyrażony jako % wartości A450 odczytanych w testach z użyciem AIV H5N3.
Fig. 18 przedstawia krzywe miareczkowania Mab: G-6-42-42 i G-6-42-71 na (+) konformacyjnym i (-) zdenaturownym białku rHA - A/H5N1/Poland z (***) bakteryjnego systemu ekspresji. Białko (17-522 aa, ARRRKKR) wyprodukowano w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV (IBA). Oczyszczone i zrenaturowane białko HA H5 poddano denaturacji w warunkach redukujących. Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA na płytkach PolySorp, MediSorp, MaxiSorp i MultiSorp (NUNC) opłaszczonych preparatem rHA o czystości ~80%, który zawierał hemaglutyninę w stężeniu ~1 μg/ml.
Fig. 19 przedstawia krzywe miareczkowania Mab G-7-27-18 na (+) konformacyjnym i (-) zdenaturownym białku rHA - A/H5N1/Poiand z (***) bakteryjnego systemu ekspresji. Białko (17-522 aa, ARRRKKR) wyprodukowano w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV (IBA). Oczyszczone i zrenaturowane białko HA H5 poddano denaturacji w warunkach redukujących. Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA na płytkach PolySorp, MediSorp, MaxiSorp i MultiSorp (NUNC) opłaszczonych preparatem rHA o czystości ~80%, który zawierał hemaglutyninę w stężeniu ~1 μg/ml.
Fig. 20 przedstawia wyniki oznaczeń surowic kurcząt przy użyciu blokującego testu ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 (bELISA H5), który opracowano i zoptymalizowano w IBA. W teście bELISA H5 (IBA) wykorzystano Mab G-7-27-18. Analizowane próby były uprzednio klasyfikowane jako anty H5 pozytywne lub negatywne na podstawie wyników testu HI. Wartość „cut-off’ wyznaczono w oparciu o wyniki oznaczeń anty H5-negatywnych prób surowicy (średnia wartość % hamowania + 2xSD). Dane z oznaczeń kontroli negatywnej, surowic antyHl(H2-H16)-pozytywnych przedstawiono jako średnia wartość % hamowania z określonej liczby niezależnych oznaczeń (n) poszczególnych prób. Wyniki pozostałych analiz przedstawiono jako średnia wartość % hamowania z określonej liczby prób (n) w poszczególnych grupach surowic. Na Figurze wyróżniono wyniki oznaczeń kontroli negatywnej oraz silnej i słabej kontroli pozytywnej.
Przykład realizacji wynalazku przedstawiono poniżej. Przedstawione przykłady nie zawężają ochrony przedmiotowego zgłoszenia.
P r z y k ł a d 1
Procedura wytwarzania Mab przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5
Przeciwciała monoklonalne otrzymano klasyczną metodą hybrydom, opracowaną na modelu mysim, stosując immunizację in vivo. W metodzie tej zwierzęta są kilkakrotnie szczepione antygenem. Splenocyty wyizolowane ze śledzion zaszczepionych zwierząt poddawane są fuzji z komórkami szpiczaka w obecności 50% PEG i 5% DMSO. Hodowla komórek w medium różnicującym HAT powoduje,
PL 238 020 B1 że splenocyty i komórki szpiczaka, które nie uległy fuzji giną, natomiast przeżywają tylko hybrydomy. Podczas klonowania pojedyncze hybrydomy są izolowane a nadsącz z hodowli hybrydom powstałych z pojedynczej hybrydomy jest sprawdzany na obecność przeciwciał określonej klasy (izotypowanie) swoistych wobec immunogenu. Klony hybrydom mogą być hodowane w warunkach in vitro lub w raku wysiękowym.
W pierwszym etapie procedury wytwarzania Mab przeprowadzono imm unizację myszy. Jako immunogen zastosowano oczyszczone białko HA H5 (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His), wytworzone w ssaczym systemie ekspresji w oparciu o sekwencję HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) AIV przez firmę Immune Technology Corporation (ITC). Białko rHA A/H5N1/Qinghai zostało uprzednio poddane analizie przy użyciu spektrometrii mas, testów ELISA do badań antygenowości i oligomeryzacji białek HA oraz testu hemaglutynacji. Sposób przeprowadzenia testów i ich wyniki przedstawiono w przykładzie 2. W przykładzie 2 opisano również właściwości immunogenu rHA - A/H5N1/Qinghai wskazujące na jego przydatność w procedurze otrzymywania Mab przeciwko HA H5. Zgodnie ze standarową metodą, otrzymanie Mab antygenowo-specyficznych obejmowało: immunizację myszy, fuzję splenocytów z komórkami szpiczaka mysiego oraz hodowlę, klonowanie i selekcję hybrydom.
Immunizacja myszy
Pięć myszy, 6-cio tygodniowe samice Balb/c, zaszczepiono podskórnie rHA (10 μg/mysz) w dwóch miejscach na karku z kompletnym adjuwantem Freunda (CFA). Emulsję antygenu z CFA, w stosunku 1:1 (obj./obj.), przygotowano przy użyciu dwóch 1-ml strzykawek połączonych igłą do emulsyfikacji (Popper & Sons). Immunologicznie korzystne konsekwencje zastosowania metody 2 strzykawek do przygotowania szczepionki w postaci emulsji i przewaga tej metody nad innymi technikami emulsyfikacji opisano w literaturze (Koh YT i wsp. 2006). Szczepienie wykonano w anestezji. Kolejne dwie dawki antygenu, po 10 μg każda, podano dootrzewnowo w postaci roztworu w PBS. Drugie szczepienie wykonano 2 tygodnie po podaniu I dawki, natomiast trzecie szczepienie wykonano 3 tygodnie po podaniu II dawki. Czwarte szczepienie wykonano 17 dni po podaniu III dawki przez dożylne podanie rHA (10 μg/mysz) w PBS.
Kontrola miana przeciwciał przeciwko HA H5 w osoczu
Jedenaście dni po podaniu III dawki, a dziewięć dni przed fuzją, od wszystkich immunizowanych myszy pobrano krew z zatoki oczodołowej przy użyciu heparynizowanych kapilar. Osocze, uzyskane po odwirowaniu krwi, porcjowano i zamrożono w -20°C. W celu oznaczenia miana przeciwciał przeciwko HA H5, próby osocza analizowano testami ELISA z użyciem białka HA, które było wykorzystane do szczepienia zwierząt (rHA - A/H5N1/Qinghai). W testach stosowano również rHA - A/H5N1/Poland o sekwencji HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV, wyprodukowane przez Oxford Expression Technologies (OET) w bakulowirusowym systemie ekspresji. Białko, charakteryzujące się wysoką homologią z immunogenem, opisano szczegółowo w przykładzie 3. Do wywołania płytek stosowano przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ. Zastosowanie wysoce specyficznych wtórnych przeciwciał w przeprowadzonych testach umożliwiło oznaczenie H5-specyficznych przeciwciał wyłącznie klasy IgG a przez to właściwą ocenę odpowiedzi zwierząt na szczepienie.
Testy ELISA wykonano przy użyciu płytek mikrotitracyjnych (NUNC). Białko rHA A/H5N1/Qinghai (ITC), rozcieńczone w PBS do stężenia 5 μg/ml, nakładano na płytki MaxiSorp, natomiast białko rHA - A/H5N1/Poland (OET, seria 1), rozcieńczone w PBS do stężenia 7 μg/ml, na płytki MediSorp. Płytki z antygenami inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C. Niespecyficzne miejsca wiązania na płytkach blokowano przy użyciu 10% FBS/PBS. Próby osocza immunizowanych myszy testowano jako serie 2-krotnych rozcieńczeń w PBS. Kontrolę negatywną stanowiły próby osocza myszy nieszczepionych. Bufor do rozcieńczania prób stanowił kontrolę niespecyficznego wiązania przeciwciał wtórnych (próba BLK). Próby badane i kontrolne inkubowano na opłaszczonych płytkach w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Płytki wywoływano przez 1 -godzinną inkubację w 37°C z wyznakowanymi HRP przeciwciałami przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficznymi wobec łańcucha γ (Sigma-Aldrich). Wtórne przeciwciała rozcieńczono 1:1000 w 2% BSA/PBS. TMB (Sigma-Aldrich) stosowano jako substrat peroksydazy chrzanowej. Reakcję hamowano 0,5 M roztworem H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm. Miano przeciwciał klasy IgG przeciwko HA H5 zdefiniowano jako rozcieńczenie osocza, przy którym poziom absorpcji (A450) osiąga wartość ~1,0.
PL 238 020 B1
Otrzymanie, hodowla i klonowanie hybrydom
Immunizowane myszy zabijano przez przemieszczenie szyjne 3 dni po dożylnym podaniu ostatniej dawki wzmacniającej. Śledziony pobrano jałowo i izolowano splenocyty. Po zebraniu komórek i odwirowaniu (10 min, 1000 rpm, 5°C), osad zawieszano w kompletnym RPMI-1640, liczono komórki i oceniano ich żywotność w kamerze Thoma w obecności błękitu trypanowego. Komórki szpiczaka mysiego linii SP2/0 (ATCC) hodowano w pożywce HT do osiągnięcia logarytmicznego wzrostu, odwirowano przy 1000 rpm, zawieszano w RPMI-1640 i liczono komórki żywe.
Do fuzji przeznaczono splenocyty wyizolowane ze śledziony myszy o najwyższym mianie przeciwciał klasy IgG przeciwko HA H5 w osoczu. Zawieszone w RPMI-1640 komórki śledzionowe i szpiczaka zmieszano w stosunku 2:1. Po odwirowaniu i dokładnym usunięciu supernatantu, dodawano w ciągu 1 min około 1 ml roztworu: 50% PEG 1500, 5% DMSO w PBS bez jonów wapnia i magnezu o temperaturze 37°C, delikatnie mieszając osad. Fuzję przerywano dodając ogrzaną pożywkę RPMI1640 z dodatkiem antybiotyków (streptomycyna - 50 μg/ml, penicylina - 50 U/ml) - pierwsze 4 ml powoli, kroplami, następne 16 ml szybko. Zawiesinę komórek wirowano 10 min przy 1000 rpm w 5°C. Osad zawieszono w medium HAT i rozlano na 8 płytek 96-dołkowych zawierających warstwę mysich makrofagów otrzewnowych. Po tygodniu inkubacji w 37°C w atmosferze 5% CO2, hodowle komórek dokarmiano medium HAT, a w następnym tygodniu HT.
Klonowanie hybrydom przeprowadzono przez kolejne rozcieńczenia. Przygotowywano zawiesiny komórkowe zawierające, odpowiednio: 10 i 5 komórek w ml. Każdą z nich rozlewano po 100 pt//dołek na 96-dołkowe płytki z warstwą makrofagów. Obserwowano i zaznaczano dołki, gdzie są klony powstałe z 1 komórki.
Po fuzji, hybrydomy hodowano w pożywce RPMI-1640 z dodatkiem 20% FBS, zawierającej 2 mM glutaminę, 2 mM pirogronian sodu, antybiotyki (streptomycyna - 50 μg/ml, penicylina - 50 U/ml) oraz zależnie od potrzeb 100 μM hipoksantynę, 2,5 μM aminopterynę i 16 μM tymidynę (pożywka różnicująca HAT) lub 100 μM hipoksantynę i 16 μM tymidynę (pożywka HT), Podczas rozklonowywania stosowano pożywkę RPMI-1640 z dodatkiem 20% FBS, zawierającej 2 mM glutaminę, 2 mM pirogronian sodu i antybiotyki (streptomycyna - 50 μg/ml, penicylina - 50 U/ml). Dalszą hodowlę hybrydom prowadzono w medium o składzie jak w pożywce do rożki ono wania, z wyjątkiem stężenia FBS (10%). Do zamrażania uzyskanych klonów w ciekłym azocie używano kompletne medium RPMI-1640 zawierające 30% FBS i 10% DMSO. Ilość i żywotność komórek określano stosując roztwór błękitu trypanu w soli fizjologicznej. Do izolacji makrofagów otrzewnowych używano roztworu soli Hanksa bez wapnia i magnezu. Wszystkie stosowane odczynniki były testowane firmowo pod kątem braku toksyczności dla hodowli komórkowych i pochodziły z firmy Sigma-Aldrich lub Gibco.
Selekcja hybrydom
Nadsącze z hodowli hybrydom analizowano na obecność przeciwciał specyficznych wobec HA H5. Oznaczenia wykonywano metodą ELISA. Wstępną selekcję hybrydom wykonywano przy użyciu rHA - A/H5N1/Qinghai (ITC) oraz rHA - A/H5N1/Poland (OET) o sekwencji bardzo zbliżonej do sekwencji immunogenu. Dalszą selekcję hybrydom przeprowadzono przez oznaczenie specyficzności wytworzonych przeciwciał wobec rekombinowanych białek HA H5 opartych na ektodomenie (rHA) lub podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny o zróżnicowanej homologii względem immunogenu, które wyprodukowano w ssaczym systemie ekspresji (ITC). W testach ELISA, przeprowadzonych dla nadsączy z hodowli nie rozklonowanych hybrydom, użyto białka o sekwencji HA sześciu szczepów AIV serotypu H5. Po rozklonowaniu, selekcję Mab przeprowadzono przy użyciu rHA lub rHA1 opartych na sekwencji HA dziewięciu szczepów AIV serotypu H5. Do pozytywnej selekcji rozklonowanych hybrydom zastosowano również IV: H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9 (x-OvO). Na każdym etapie proceduiy wykonywano izotypowanie przeciwciał.
Wybrane w wyniku selekcji klony Mab o najwyższej wartości diagnostycznej oczyszczono z nadsączy hybrydom metodą chromatografii powinowactwa. Przeciwciała scharakteryzowano przy użyciu spektrometrii mas, testów ELISA z rekombinowanymi białkami HA H5 (rHA, rHA1) oraz IV serotypu H5. Przeprowadzono również testy z użyciem IV serotypów innych niż H5 tj. H1-H4 i H6-H16. Dla oceny zdolności wytworzonych Mab do hamowania hemaglutynacji przeprowadzono testy HI.
Antygeny oraz testy użyte do selekcji hybrydom produkujących przeciwciała przeciwko HA H5, a także sposób przeprowadzenia izotypowania przeciwciał zostały szczegółowo opisane w przykładzie 3. Natomiast antygeny oraz testy użyte do dalszej selekcji przeciwciał w kierunku serotypowej specyficzności i produkujących je hybrydom przedstawiono w przykładzie 4. Wyniki selekcji Mab na poszczególnych etapach procedury opisano w przykładzie 5. Właściwości wyselekcjonowanych Mab opisano w przykładach: 6-10.
PL 238 020 B1
P r z y k ł a d 2
Właściwości immunogenu
Dostępne komercyjnie Mab przeciwko HA H5 otrzymywane są zwykle metodą hybrydom przy użyciu IV do szczepienia zwierząt (ABR/Thermo Scientific, Acris Antibodies, USBiological). W produkcji Mab znalazły również zastosowanie rekombinowane białka HA (USBiological). Warunkiem wytworzenia przeciwciał o wysokiej wartości aplikacyjnej w prewencji, terapii i diagnostyce zakażeń IV jest użycie antygenu o właściwościach wirusowej HA. W przypadku produkcji Mab z przeznaczeniem do ich użycia w diagnostyce grypy pożądane jest, aby antygen zawierał przede wszystkim dobrze zachowane epitopy specyficzne dla serotypu. W związku z tym kluczowe znaczenie w procedurze otrzymywania Mab specyficznych wobec serotypu HA H5 metodą hybrydom było użycie immunogenu, spełniającego przedstawione wyżej wymagania.
Przed rozpoczęciem procedury wytwarzania Mab przeciwko HA H5 zebrano informacje o dostępnych komercyjnie antygenach HA H5. Wybrano produkty firmy Immune Technology Corporation, która specjalizuje się w produkcji antygenów wirusowych i przeciwciał antywirusowych dla diagnostyki, monitoringu i terapii wirusowych chorób zakaźnych. W ITC dostępne są rekombinowane białka HA H5 kilkunastu szczepów wirusa H5N1, jak również HA innych serotypów niż H5. Antygeny otrzymywane są w ssaczym systemie ekspresji. Przydatność oczyszczonych rekombinowanych białek HA H5 do selekcji przeciwciał i produkujących je hybrydom została sprawdzona przy użyciu testów ELISA do badań antygenowości i oligomeryzacji, co opisano w przykładzie 4. W niniejszym przykładzie przedstawiono wyniki badań właściwości rekombinowanego białka HA H5, które zostało użyte jako immnunogen.
Do produkcji Mab przeciwko HA H5 metodą hybrydom wybrano rekombinowane białko o sekwencji HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) AIV (ITC). Białko, eksprymowane w komórkach ssaczych bez sekwencji sygnałowej, domeny transbłonowej i cytoplazmatycznej, a także regionu cięcia (ARRRKKR), stanowiło fragment HA (17-530 aa), zawierający podjednostkę HA1, część podjednostki HA2 oraz ogon histydynowy - 6x His na C-końcu. Ze względu na eukariotyczne pochodzenie, otrzymany antygen był glikoproteiną, podobnie jak nat ywna HA. Zgodnie ze specyfikacją, białko HA o masie cząsteczkowej ~75 kDA (SDS-PAGE), oczyszczone do przynajmniej 95%, występuje w większości w formie trimerów/oligomerów. W celu oceny możliwości użycia w procedurze otrzymywania Mab przeciwko HA H5, białko, opisywane dalej jako rHA - A/H5N1/Qinghai, poddano analizie przy użyciu spektrometrii mas, testów ELISA do badań antygenowości i oligomeryzcji białek HA oraz testu hemaglutynacji.
Widmo masowe rHA - A/H5N1/Qinghai
Widmo masowe rHA - A/H5N1/Qinghai wykonano przy użyciu spektrometru mas MALDI TOF/TOF (4800 Plus, AB SCIEX). Przed wykonaniem widm masowych, próby oczyszczono przy użyciu ZipTip®C4 (Millipore) zgodnie z procedurami zawartymi w instrukcji producenta: „User Guide for Reversed-Phase ZipTip”. Matrycę stanowił kwas a-cyjano-4-hydroksycynamonowy firmy Fluka o stężeniu 5 mg/ml rozpuszczony w 0,1% kwasie trifluorooctowym zawierającym 50% acetonitrylu. Pomiaru widm masowych dokonano w trybie liniowym (MS Linear Positive Ion) w zakresie od 20 - 100 kDa. Do kalibracji zewnętrznej wykorzystano wzorzec ProMix3 (LaserBio Labs). Metodę akwizycji danych ustalono w programie do obsługi aparatu MALDI TOF/TOF - 4000 Series Explorer. Widma masowe rHA - A/H5N1/Qinghai zostały przetworzone przy użyciu filtru Gaussiana oraz procedur detekcji sygnałów za pomocą programu Data Explorer Software (V4,9).
Na Fig. 1 przedstawiono widmo masowe rHA - A/H5N1/Qinghai. Sygnały o masach cząsteczkowych 76 kDa i 38 kDa pochodzą od badanego białka HA i odpowiadają kolejno jednokrotnie i dwukrotnie zjonizowanym próbom. Masa cząsteczkowa rHA - A/H5N1/Qinghai, wyznaczona przy użyciu spektrometru mas MALDI TOF/TOF (MS), wynosi 76 kDa i jest wyższa o ~18 kDa od masy obliczonej na podstawie składu aminokwasowego w programie GPMAW 8.2 (Lighthouse) ze względu na glikozylację.
Antygenowość rHA - A/H5N1/Qinghai
Badania antygenowości rHA - A/H5N1/Qinghai przeprowadzono stosując komercyjnie dostępne Mab i Pab przeciwko HA H5 wirusa grypy. W oparciu o specyfikacje sporządzono zestawienie użytych przeciwciał, zamieszczone poniżej.
PL 238 020 Β1
Zestawienie A Wykaz przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych użytych w badaniachantygenowości białek HA.
| Nazwa | Pochodzenie Nr kat. | Immunogen | Typ Izotyp | Zastosowanie | |
| Przeciwciała monoklonalne | Mab) przeciwko HA H5 | ||||
| Rozpoznają HA H5 w teście HI, reagują z wirusami grypy H5N1, H5N2 i H5N9, nie reagują krzyżowo z HA innych serotypów (H1, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14 i H15). | |||||
| Mab 1 | Influenza A Hemagglutinin H5 (Avian H5N1) | USBiological, 17649-41B | Oczyszczony wirus ptasiej grypy typu A (H5N1) | Mab lgG2a* | HI, iELISA DB |
| Specyficzne dla HA H5 wirusa gry serotypów, reagują z wirusami gr\ | py A [szczep AA/ietnam/1203/04 (H5N1)], nie reagują krzyżowo z HA innych py H5N1, przedstawicielami różnych kładów i subkladów. | ||||
| Mab 2 | Influenza A, Avian, H5N1 AA/ietnam/1203/04 Hemagglutinin (Bird Elu) | USBiological, 17649-42C | HA wirusa grypy AA/ietnam/1203/04(H5N1) | Mab lgG2a‘ | HI, VN, ELISA, IP, IHC, WB |
| Rozpoznają HA H5 w teście HI. | |||||
| Mab 3 | Influenza A Hemagglutinin H5 (Avian H5N1) | USBiological 17649-42 D | Oczyszczony wirus ptasiej grypy typu A (H5N1) | Mab lgG2a‘ | HI ELISA |
| Wykrywają antygen H5 w próbach wirusów grypy A. | |||||
| Mab 4 | Anti-lnfluenza A H5 Antigen Monoclonal Antibody | ABR/Thermo Scientific MA1-81927 | Oczyszczony wirus ptasiej grypy typu A (H5N1) | Mab lgG2a* | ELISA |
| Reagują z HA H5 w teście HI, reagują z wirusami g innych serotypów (H1, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9 | rypy H5N1, H5N2 i H5N9, nie reagują krzyżowo z HA H10, H11, H12, H13, H14 i H15). | ||||
| Mab 5 | Monoclonal Antibody to Influenza A (Hemagglutinin H5) H5N1 - Purified | Acris Antibodies AM00942PU-N | Oczyszczony wirus ptasiej grypy typu A (H5N1) | Mab lgG2a* | HI, iELISA, DB |
| Mab 6 | Monoclonal Antibody to Influenza A (Hemagglutinin H5) H5N1 - Purified | Acris Antibodies AM00944PU-N | Oczyszczony wirus ptasiej grypy typu a (hsni) | Mab lgG2a* | HI, iELISA, DB |
| Mab 7 | Monoclonal Antibody to Influenza A (Hemagglufinin H5) H5N1 - Purified | Acris Antibodies AM00945PU-N | Oczyszczony wirus ptasiej grypy typu A(H5N1) | Mab lgG2a‘ | HI, iELISA, DB |
| Mab 8 | Monoclonal Antibody to Influenza A (Hemagglutinin H5) H5N1 - Purified | Acris Antibodies AM00941PU-N | Oczyszczony wirus ptasiej grypy typu A (H5N1) | Mab lgG2a* | HI, iELISA, DB |
| Przeciwciała poliklonalne (Pab) przeciwko HA H5 | |||||
| Reagują z HA H5 ludzkich i ptasich wirusów grypy H5N1. Reaktywność krzyżowa wobec innych HA nie była testowana. | |||||
| Pab 1 | Anti-HA (H5N1) (Bar headed goose/Qinghai/ 1A/05) | ITC IT-003-005G | Hemaglutynina wirusa grypy A (H5N 1)(1-345 aa) (A/Bar-headed Goose/Qinghai/ 12/05(H5N1)) | Pab królicze igG* | WB etc. |
| Reagują z HA i podjednostką HA2 (H5N1). Reaktywność krzyżowa przeciwko innym serotypom nie była testowana. | |||||
| Pab 2 | Anti-HA2 (H5N1) | ITC IT-003-010 | Białko HA2 (H5N1) (347-523 aa) (A/VietNam/1203/2004(H5N1)) | Pab królicze IgG* | WB etc. |
| ‘oczyszczone, Hl-test zahamowania hemaglutynacji, iELISA - pośredni test ELISA (immunoenzymatyczny test fazy stałej), DB - dot biot, VN - test neutralizacji wirusa, IP - immunoprecypitacja, IHC - immunohistochemia, WB - Western biot, ITC - Immune Technology Corporation |
Przeciwciała monoklonalne pochodziły z firm: USBiological (3 klony), ABR/Thermo Scientific (1 klon) i Acris Antibodies (4 klony). Mab otrzymano stosując jako immunogeny oczyszczone AIV H5N1 (7 klonów) lub rekombinowane białko z sekwencją HA szczepu AA/ietnam/1203/04(H5N1) (1 klon). Zgodnie ze specyfikacjami, przeciwciała opisane jako Mab 1 i Mab 5-8 rozpoznają HA H5 w teście HI, wiążą się z IV: H5N1, H5N2 i H5N9 i nie reagują z HA serotypów H1-H4 i H6-H15. Specyficzność pozostałych klonów Mab jest opisywana jako zdolność rozpoznawania HA H5 w próbach wirusowych (Mab 4) lub w teście HI (Mab 3). Według informacji producenta, przeciwciała, oznaczone
PL 238 020 B1 jako Mab 2, są specyficzne wobec HA szczepu A/Vietnam/1203/04 (H5N1), reagują z IV H5N1 różnych kładów i podkładów i nie reagują krzyżowo z HA serotypów innych niż H5. Specyfikacje dla wszystkich użytych Mab wskazują, że przeciwciała rozpoznają epitopy konformacyjne.
W oznaczeniach immunoreaktywności użyto również przeciwciała poliklonalne przeciwko podjednostce HA1 i HA2 hemaglutyniny H5. Przeciwciała, opisane dalej jako Pab 1 i Pab 2, uzyskano stosując jako immunogeny, odpowiednio, białko HA1 (I-345 aa) szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) i fragment podjednostki HA2 (347-523 aa) szczepu A/VietNam/1203/2004(H5N1) (ITC). Zgodnie ze specyfikacjami, Pab 1 i Pab 2 mogą być użyte w oznaczeniach typu Western blot. Można się spodziewać, że Pab przeciwko HA będą rozpoznawały zarówno epitopy konformacyjne jak i liniowe białka.
Badania reaktywności immunogenu: rHA - A/H5N1/Qinghai z przeciwciałami komercyjnymi przeprowadzono metodą ELISA przy użyciu płytek polistyrenowych: PolySorp, MaxiSorp, MediSorp i MultiSorp (NUNC) oraz płytek Ni-NTA (Qiagen). Płytki polistyrenowe opłaszczono rHA w PBS w stężeniu 5 μg/ml w ciągu nocy w 2-8°C. Niespecyficzne miejsca wiązania na płytkach blokowano przy użyciu 10% FBS/PBS. Na płytkę Ni-NTA nakładano białko HA rozcieńczone w 1% BSA/PBS do stężenia 1 μg/ml. W celu kontroli poziomu niespecyficznego wiązania przeciwciał, część dołków płytki napełniano 1% BSA/PBS i inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C równolegle z dołkami zawierającymi antygen. Ze względu na to, że płytki Ni-NTA firmy Qiagen są preblokowane, testowanie odbywało się bez etapu blokowania. Związany na płytkach antygen był badany przy użyciu Mab i Pab przeciwko HA H5, wymienionych w zestawieniu A. Przeciwciała, rozcieńczone do stężenia 1 μg/ml w 2% BSA/PBS, inkubowano na opłaszczonych płytkach w ciągu nocy w 2-8°C. Do wykrywania Mab związanych z antygenem stosowano wyznakowane HRP Pab przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec całej cząsteczki (Sigma-Aldrich). Do wykrywania Pab związanych z antygenem stosowano wyznakowane HRP Mab przeciwko króliczym przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ (Sigma-Aldrich). Wtórne przeciwciała rozcieńczono 1:1000 przy użyciu 1% BSA/PBST i inkubowano na płytkach w ciągu 30 min. (płytki polistyrenowe) albo 45 min. (płytki Ni-NTA) w temperaturze pokojowej. TMB (SigmaAldrich) stosowano jako substrat HRP. Reakcję hamowano 0,5 M (płytki polistyrenowe) lub 1,25 M (płytki Ni-NTA) roztworem H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Wyniki badań antygenowości rHA - A/H5N1/Qinghai, wykonanych na płytkach MediSorp, MaxiSorp i Ni-NTA przy użyciu komercyjnych przeciwciał przeciwko HA H5, przedstawiono na Fig. 2. Białko HA było rozpoznawane przez wszystkie użyte przeciwciała, co prowadzi do wniosku, że antygen zawiera dobrze zachowane epitopy konformacyjne podjednostki HA1 hemaglutyniny H5 oraz fragment podjednostki HA2. Ponadto uzyskane wyniki wskazują, że w podjednostce HA1 rHA - A/H5N1/Qinghai znajdują się prawidłowo ukształtowane epitopy rozpoznawane przez przeciwciała HI, wskazując na potencjał białka do indukcji przeciwciał hamujących hemaglutynację.
Oligomeryzacja rHA - A/H5N1/Qinghai
Test na obecność form oligomerycznych w preparacie rHA - A/H5N1/Qinghai wykonano metodą ELISA, typu „sandwich”, przy użyciu tego samego klonu Mab (B513M), opisanego jako Mab 8 (Acris Antibodies), do opłaszczania i wywoływania płytek mikrotitracyjnych. Przeciwciała wykrywające zostały wyznakowane HRP w ramach usługi serwisowej (Acris Antibodies).
W celu wykonania testu, płytki MaxiSorp (NUNC) opłaszczono Mab 8 (Acris Antibodies, Nr. kat. AM0094IPU-N) w PBS (1 μg/ml) w ciągu nocy w 2-8°C. Niespecyficzne miejsca wiązania na płytce blokowano stosując 2% BSA/PBS. Następnie na płytkę nakładano próby białka rHA - A/H5N1/Qinghai, przygotowane jako seria 2-krotnych rozcieńczeń w zakresie 10 μg/ml - 0,009 ng/ml przy użyciu 2% BSA/PBS oraz próby BLK (2% BSA/PBS) do kontroli poziomu niespecyficznego wiązania. Płytki inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C. Do wykrywania oligomerycznych form białka HA stosowano Mab 8, wyznakowane HRP (Acris Antibodies, Nr. kat. AM00941HR-Cus). Przeciwciała rozcieńczono 1:500 w 2% BSA/PBS i inkubowano na płytce w ciągu 1h w 37°C. TMB (Sigma-Aldrich) stosowano jako substrat HRP. Reakcję hamowano przy użyciu 0,5 M roztworu H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Wyniki badań rHA - A/H5N1/Qinghai na obecność oligomerów przedstawiono na Fig. 3. Przeprowadzony test wykazał, że białko zawiera formy oligomeryczne i jest to zgodne ze specyfikacją.
Aktywność hemaglutynacji rHA - A/H5N1/Qinghai
Białko rHA - A/H5N1/Qinghai, w którym wykryto formy oligomeryczne przy użyciu testu ELISA, poddano dodatkowo badaniom na obecność funkcjonalnych oligomerów, stosując test hemaglutynacji. Test wykorzystuje zdolność wirusowego białka do aglutynacji erytrocytów przez wiązanie się z ich receptorami powierzchniowymi. Ocena zdolności do aglutynacji erytrocytów jest powszechnie stosowana w badaniach jakości antygenów szczepionkowych.
PL 238 020 B1
W teście HA zastosowano świeży preparat erytrocytów pobranych z krwi kurcząt SPF, uzyskany ze sterylnej hodowli w Zakładzie Chorób Drobiu (ZChD) Państwowego Instytutu Weterynaryjnego Państwowego Instytutu Badawczego (PIWet-PIB) w Puławach (Polska). Jako kontrolę pozytywną użyto LPAIV A/turk/It/80(H5N2) (x-OvO), certyfikowany przez Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe) w Legnaro (Włochy). Test uwzględniał kontrolę krwinek (wewnętrzna kontrola dla oznaczenia), która nie zawierała antygenu wirusowego. Oznaczenie wykonano na 96-pozycyjnych płytkach o V-kształtnych dnach studzienek (CellStar/Greiner bio-one).
Dla oceny aktywności hemaglutynacyjnej rHA - A/H5N1/Qinghai, do każdej studzienki płytki dodano 50 gl PBS-Dulbecco (Sigma-Aldrich) a następnie odpowiednią ilość antygenu i buforu do 100 gl objętości końcowej. W ten sposób uzyskano próby zawierające rHA w ilościach od 0,1 gg do 10 gg. Kontrolę pozytywną wykonano przez kolejne rozcieńczenia zawiesiny zawierającej 4 jednostki hemaglutynacji (HAU) LPAIV H5N2 w PBS-Dulbecco. Do studzienek przeznaczonych do kontoli krwinek dodano wyłącznie bufor (PBS-Dulbecco). Następnie do każdej studzienki dodano po 50 gl 1% zawiesiny krwinek w PBS-Dulbecco i całość delikatnie wymieszano przez pipetowanie. Płytkę inkubowano w ciągu 45 min. w temperaturze pokojowej, po czym odczytywano wynik. Zgodnie z zasadą testu, efekt hemaglutynacji oceniany był wzrokiem przez porównanie z próbami do kontroli krwinek. W przeciwieństwie erytrocytów kontrolnych, aglutynowane erytrocyty nie opadają na dno studzienek tylko tworzą jednolitą zawiesinę.
Test hemaglutynacji wykonany z użyciem erytrocytów kurcząt wykazał, że rHA A/H5N1/Qinghai ma zdolność hemaglutynacji, podobnie jak LPAIV H5N2. Efekt hemaglutynacji obserwowano w całym badanym zakresie stężeń antygenu, także w próbach zawierających 0,1 pg białka. Uzyskane wyniki wskazują, że rHA - A/H5N1/Qinghai tworzy funkcjonalne oligomery, co jest pożądaną cechą HA szczepionkowej. Dotyczy to także białek HA stosowanych jako immunogeny w procedurze otrzymywania Mab metodą hybrydom.
Podsumowanie
Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że białko rHA - A/H5N 1/Qinghai ma cechy natywnego antygenu: zachowuje epitopy konformacyjne rozpoznawane przez przeciwciała przeciwko HA H5, w tym także przeciwciała HI, tworzy struktury oligomeryczne oraz ma zdolność do wiązania się z receptorami powierzchniowymi komórek i aglutynacji erytrocytów. Prowadzi to do wniosku, że białko rHA - A/H5N1/Qinghai jest wartościowym immunogenem, co uzasadnia jego użycie w procedurze otrzymywania Mab przeciwko HA H5 metodą hybrydom.
P r z y k ł a d 3
Oznaczenia specyficzności i izotypu
Kolejnym po użyciu wartościowego immunogenu warunkiem wytworzenia Mab o wysokiej wartości diagnostycznej jest zastosowanie odpowiedniej procedury selekcji przeciwciał serotypowo-specyficznych. W tym celu opracowano testy z użyciem białek HA zachowujących konformację właściwą dla natywnego antygenu. Do wstępnej selekcji hybrydom produkujących przeciwciała przeciwko HA H5 wytypowano dwa antygeny. Jednym z nich było białko rHA - A/H5N1/Qinghai, przeznaczone do szczepienia zwierząt. Właściwości białka rHA - A/H5N1/Qinghai, wskazujące na jego przydatność jako immunogenu, ale także jako antygenu do selekcji Mab opisano szczegółowo w przykładzie 2. Drugim antygenem było białko 17-530 aa (ARRRKKR, 6x His) o sekwencji HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV, wytworzone w bakulowirusowym systemie ekspresji (OET). Podobnie jak rHA - A/H5N1/Qinghai, rekombinowane białko HA z bakulowirusowego systemu ekspresji, opisywane dalej jako rHA - A/H5N1 /Poland, było białkiem glikozylowanym.
Sekwencja aminokwasowa białka rHA - A/H5N1/Poland była bardzo zbliżona do sekwencji immunogenu. Przy użyciu programu BLAST wykazano, że homologia hemaglutynin szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) i A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) mierzona identycznością aminokwasów w sekwencji wynosi 99%, przy czym jedna zamiana konserwatywna aminokwasów występuje w sekwencji sygnałowej, natomiast pozostałe trzy zamiany mają charakter semikonserwatywny i występują w podjednostce HA1 i HA2 białka. Przydatność rHA - A/H5N1/Poland do sprawdzania specyficzności przeciwciał wobec HA H5 została oceniona przez wykonanie badań antygenowości i stopnia oligomeryzacji białka oraz jego zdolności do hemaglutynacji.
Właściwości rHA - A/H5N1/Poland
Białko rHA - A/H5N1/Poland (OET) analizowano przy użyciu spektrometru mas MALDI TOF/TOF (4800 Plus, AB SCIEX) w sposób opisany w przykładzie 2 dla białka rHA - A/H5N1/Qinghai. Wyznaczona masa cząsteczkowa antygenu (OET, serie 2-8) wynosiła 64 kDa (Fig. 4) i była wyższa o ~6 kDa od masy obliczonej na podstawie składu aminokwasowego w programie GPMAW 8.2
PL 238 020 B1 (Lighthouse) ze względu na glikozylację. Różnica między masą wyznaczoną doświadczalnie i teoretycznie dla rHA - A/H5N1/Poland była mniejsza niż w przypadku rHA - A/H5N1/Qinghai (~6 kDA vs ~18 kDa), co wskazuje na różnice poziomu glikozylacji białka rHA produkowanego w bakulowirusowym i ssaczym systemie ekspresji.
W badaniach antygenowości rHA - A/H5N1/Poland zastosowano panel dostępnych komercyjnie Mab i Pab przeciwko HA H5 (zestawienie A), które opisano w przykładzie 2. Badania przeprowadzono metodą ELISA przy użyciu płytek polistyrenowych o różnej hydro filo wości (NUNC) oraz płytek Ni- NTA (Qiagen) w sposób identyczny jak badania antygenowości rHA - A/H5N1/Qinghai (przykład 2). Na Fig. 5 przedstawiono wyniki badań antygenowości rHA - A/H5N1/Poland (OET, seria 2) przeprowadzonych przy użyciu płytek MediSorp, MaxiSorp i Ni-NTA. Reaktywność Mab 2, Pab 1 i Pab 2 z białkiem rHA - A/H5N1/Poland związanym na płytce Ni-NTA była znacznie niższa niż z rHA - A/H5N1/Qinghai (Fig. 2), co było prawdopodobnie efektem różnic w wiązaniu i/lub prezentacji antygenów na płytce. Biorąc pod uwagę reaktywność Mab i Pab z antygenem HA z bakulowirusowego systemu ekspresji związanym z różnymi rodzajami płytek (Fig. 5) można stwierdzić, że białko zawiera dobrze zachowane epitopy konformacyjne podjednostki HA1, w tym epitopy rozpoznawane przez przeciwciała typu HI. Badania reaktywności z przeciwciałami wykonywano dla każdej stosowanej serii antygenu. Wyniki tych badań za każdym razem wskazywały na prawidłową konformację podjednostki HA1 antygenu rHA - A/H5N1/Poland.
Stopień oligomeryzacji rHA - A/H5N1/Poland (OET, serie: 5, 8) badano metodą ELISA, typu „sandwich”, stosując niewyznakowane i wyznakowane HRP komercyjne przeciwciała przeciwko HA H5, opisane w zestawieniu A jako Mab 8 (Acris Antibodies, Nr. kat.: AM00941PU-N, AM00941HR-Cus). Rekombinowane białka HA testowano jako serie 2-krotnych rozcieńczeń w zakresie 10 pg/ml 0,009 ng/ml. Sposób przeprowadzenia testu opisano w przykładzie 2. Wyniki testu, przedstawione na Fig. 3, wskazują, że białko rHA - A/H5N1/Poland zawiera znacznie mniej form oligomerycznych niż antygen rHA - A/H5N1/Qinghai. Ponadto zaobserwowano różnice stopnia oligomeryzacji białka z bakulowirusowego systemu ekspresji pomiędzy seriami.
Białko rHA - A/H5N1/Poland (OET, seria 5) poddano również badaniom mających na celu ocenę jego zdolności do aglutynacji erytrocytów. Białko HA, otrzymane w bakulowirusowym systemie ekspresji, testowano równolegle z rHA z ssaczego systemu ekspresji (rHA - A/H5N1/Qinghai). Sposób przeprowadzanie testu hemaglutynacji opisano w przykładzie 2. Badanie, wykonane z użyciem erytrocytów kurcząt, wykazało, że rHA - A/H5N1/Poland ma zdolność hemaglutynacji. Efekt pełnej hemaglutynacji obserwowano w próbach zawierających od 10 pg do 2,5 pg antygenu. Częściową hemaglutynację uzyskano w próbach zawierających 1 pg antygenu. Do aglutynacji erytrocytów wymagane było znacznie wyższe stężenie białka rHA - A/H5N1 /Poland niż rHA - A/H5N1/Qinghai (przykład 2), co jest zgodne z wynikami testu ELISA do badania stopnia oligomeryzacji białek HA (Fig. 3). Wyniki testu hemaglutynacji wskazują, że białko rHA - A/H5N1/Poland występuje częściowo w postaci oligomerów odpowiedzialnych za aglutynację erytrocytów. Zawartość funkcjonalnych oligomerów w antygenie rHA - A/H5N1/Poland jest jednak znacznie niższa niż w antygenie rHA - A/H5N1 /Qinghai (przykład 2).
W podsumowaniu można stwierdzić, że białko rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji zachowuje epitopy konformacyjne rozpoznawane przez przeciwciała przeciwko HA H5, w tym przeciwciała HI. W porównaniu do rHA - A/H5N1/Qinghai, białko to charakteryzuje niższy poziom glikozylacji i niewielki stopień oligomeryzacji, która jest istotną cechą wirusowej HA. Prawidłowość konformacji podjednostki HA1 antygenu z bakulowirusowego systemu ekspresji uzasadnia jego użycie do sprawdzania specyficzności wytworzonych przeciwciał wobec HA H5 równolegle z antygenem z ssaczego systemu ekspresji. Inny sposób prezentacji epitopów podjednostki HA1 w rHA - A/H5N1/Poland niż w rHA - A/H5N1/Qinghai uznano za korzystny dla efektywności selekcji Mab przeciwko HA.
Testy ELISA do oznaczania specyficzności wytworzonych Mab
Specyficzność wytworzonych przeciwciał oznaczano metodą ELISA. W tym celu opracowano testy z użyciem uprzednio scharakteryzowanych białek: rHA - A/H5N1/Qinghai i rHA A/H5N1/Poland. Optymalizacja testów polegała przede wszystkim na wyborze rodzaju płytki do wiązania poszczególnych antygenów. Dostępność istotnych epitopów konformacyjnych w białku związanym z płytką, oceniana przy użyciu komercyjnie dostępnych Mab i Pab przeciwko HA H5 (zestawienie A), była podstawowym kryterium wyboru płytki do testu. Na etapie optymalizacji testów stosowano wszystkie oferowane przez firmę NUNC rodzaje powierzchni do immobilizacji białek (PolySorp, MediSorp, MaxiSorp, MultiSorp) jak również płytki Ni-NTA (Qiagen). Adsorpcja antygenów na płytkach polistyrenowych zachodzi przez różne fragmenty białka
PL 238 020 B1 i jest w znacznym stopniu przypadkowa, natomiast immobilizacja antygenu na płytkach Ni-NTA zachodzi w sposób ukierunkowany. Testy mające na celu optymalizację oznaczeń specyficzności przeciwciał były przeprowadzone w warunkach jakie zastosowano w badaniach antygenowości rHA - A/H5N1/Qinghai (przykład 2) i rHA - A/H5N1/Poland (przykład 3).
Stosując płytki polistyrenowe o różnej hydrofilowości wykazano, że użycie płytek MediSorp i MaxiSorp do wiązania antygenów, zwłaszcza rHA - A/H5N1/Poland zapewnia wyższą czułość oznaczania przeciwciał niż użycie pozostałych rodzajów płytek polistyrenowych (danych nie pokazano). Wykazano ponadto, że reaktywność komercyjnych przeciwciał z białkiem rHA - A/H5N1/Qinghai jest najwyższa po związaniu na płytce Ni-NTA (Fig. 2) a z białkiem rHA - A/H5N1/Poland po związaniu na płytce MediSorp (Fig. 5). Różnice prezentacji antygenów, zależne od rodzaju zastosowanej płytki, zostały ujawnione przy zastosowaniu przede wszystkim Pab 1 i Pab 2 w przypadku rHA z ssaczego systemu ekspresji oraz Mab 2 w przypadku rHA z bakulowirusowego systemu ekspresji. W testach ELISA do oznaczania specyficzności wytworzonych Mab zastosowano przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ. Użycie wysoce specyficznych wtórnych przeciwciał w opracowanych testach ograniczyło selekcję wytworzonych przeciwciał przeciwko HA H5 do H5-specyficznych przeciwciał klasy IgG, które wśród przeciwciał różnych izotypów są najbardziej przydatne w testach diagnostycznych z uwagi na zwykle wysokie powinowactwo wobec antygenu.
Ostatecznie, oznaczenie specyficzności przeciwciał przeprowadzono metodą ELISA przy użyciu płytek Ni-NTA (Qiagen) do opłaszczenia rHA H5 z ssaczego systemu ekspresji oraz płytek MediSorp (NUNC) do opłaszczenia rHA H5 z bakulowirusowego systemu ekspesji. Na płytki Ni-NTA nakładano białko rHA - A/H5N1 /Qinghai rozcieńczone w 1% BSA/PBS do stężenia 1 μg/ml. Płytki MediSorp były opłaszczane białkiem rHA - A/H5N1/Poland w PBS w stężeniu 6,2 μg/ml lub 5 μg/ml. W celu kontroli poziomu niespecyficznego wiązania przeciwciał, część dołków napełniano 1% BSA/PBS (płytki Ni- NTA) lub PBS (płytki MediSorp) i inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C równolegle z dołkami zawierającymi antygeny. Ze względu na to, że paski Ni-NTA firmy Qiagen są preblokowane, testowanie odbywało się bez etapu blokowania. Niespecyficzne miejsca wiązania na płytkach MediSorp blokowano przy użyciu 10% FBS/PBS. Nadsącze hodowli nie rozklonowanych hybrydom analizowano w rozcieńczeniu 1:20 (płytki NiNTA opłaszczone rHA - A/H5N1/Qinghai) lub 1:10 (płytki MediSorp opłaszczone rHA - A/H5N1/Poland). Po rozklonowaniu hybrydom, nadsącze hodowli analizowano bez rozcieńczania. Jako kontrole pozytywne stosowano komercyjne przeciwciała przeciwko HA H5 (Mab 8, zestawienie A) rozcieńczone do stężenia 0,01 μg/ml w PBS. Bufor RPMI stanowił kontrolę poziomu niespecyficznego wiązania przeciwciał wtórnych (próba BLK). Płytki z badanymi i kontrolnymi próbami inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C. Do wykrywania Mab związanych z antygenem stosowano przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ, wyznakowane HRP (Sigma-Aldrich). Wtórne przeciwciała rozcieńczano 1:1000 przy użyciu 2% BSA/PBS i inkubowano na płytkach w ciągu 1 h w 37°C. TMB (Sigma-Aldrich) stosowano jako substrat HRP. Reakcję hamowano 1,25 M (paski Ni-NTA) lub 0,5 M (płytki Medi-Sorp) roztworem H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Izotypowanie wytworzonych przeciwciał
Klasy i podklasy otrzymanych Mab oznaczano przy użyciu zestawu do izotypowania: “Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents” - ISO-2 (Sigma-Aldrich). Płytki MaxiSorp (NUNC) były opłaszczane przeciwciałami przeciwko mysim przeciwciałom różnych klas i podklas (TgGl, IgG2a, lgG2b, IgG3, IgA, IgM), rozcieńczonymi 1:1000 w PBS, przy czym inkubację prowadzono w ciągu 1 h w 37°C albo w ciągu nocy w 2-8°C. Na opłaszczonych płytkach inkubowano nie rozcieńczone lub rozcieńczone próby, pobrane z nadsączy z hodowli hybrydom (1 h, 37PC). Próbę kontrolną stanowił bufor PBS lub RPMI (próba BLK). Do wykrywania przeciwciał związanych przez przeciwciała izotypowo- specyficzne stosowano wyznakowane HRP, rozcieńczone w 1% BSA/PBST, przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG (Sigma-Aldrich); specyficzne wobec całej cząsteczki (1:1000) lub fragmentu Fab (1:50000). Płytki z rozcieńczonymi przeciwciałami inkubowano w ciągu 30 min, w temperaturze pokojowej. TMB (SigmaAldrich) stosowano jako substrat HRP. Reakcję hamowano 0,5 M roztworem H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm. Opisana procedura jest zmodyfikowaną wersją instrukcji producenta zestawu ISO-2. Wprowadzone zmiany dotyczyły warunków inkubacji prób na płytce oraz przeciwciał i substratu, użytych do wywoływania płytek.
P r z y k ł a d 4
Analiza serotypowej specyficzności
Opracowanie testów immunologicznych, które mogą być wykorzystane do wykrywania zakażenia zwierząt i ludzi IV serotypu H5, w tym AIV H5N1, wymaga użycia Mab o szerokim zakresie specy
PL 238 020 Β1 ficzności wobec HA H5. W związku z tym przeciwciała specyficzne wobec HA o sekwencji aminokwasowej identycznej lub bardzo zbliżonej do sekwencji immunogenu były dalej selekcjonowane w kierunku serotypowej specyficzności. W tym celu opracowano testy z użyciem różnych form antygenów HA H5 (selekcja pozytywna) i HA innych serotypów niż H5 (selekcja negatywna). Do pozytywnej selekcji wykorzystano rekombinowane białka HA H5 oparte na ektodomenie (rHA) lub podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny o zróżnicowanej homologii względem immunogenu oraz AIV serotypu H5 (H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9). Selekcję negatywną wykonano przy użyciu AIV piętnastu serotypów innych niż H5 (H1-H4 i H6-H16).
Rekombinowane białka HA H5
Antygeny użyte w badaniach serotypowej specyficzności, opisywane jako białka HA oparte na ektodomenie, odpowiadały HA H5, z której usunięto sekwencję sygnałową, domenę transbłonową i cytoplazmatyczną. W panelu białek HA znalazły się również fragmenty antygenu odpowiadające podjednostce HA1, która charakteryzuje się większą zmiennością sekwencji niż podjednostka HA2 i zawiera epitopy serotypowo-specyficzne. Użycie antygenów, opisywanych jako białka HA oparte na podjednostce HA1, zwiększało prawdopodobieństwo znalezienia wśród selekcjonowanych przeciwciał klonów specyficznych wobec HA serotypu H5. Rekombinowane białka HA oparte na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA1) antygenu wyprodukowano w ssaczym systemie ekspresji (ITC). Kryterium wyboru białek do badań serotypowej specyficzności wytworzonych przeciwciał było zróżnicowanie homologii względem immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai). Badania specyficzności przeciwciał wobec HA H5 o zróżnicowanej homologii prowadzono równolegle z badaniami specyficzności wobec antygenów o sekwencji aminokwasowej identycznej lub zbliżonej do sekwencji immunogenu, które wytworzono w ssaczym (rHA - A/H5N1/Qinghai) i bakulowirusowym (rHA - A/H5N1/Poland) systemie ekspresji. Łącznie do analizy serotypowej specyficzności zastosowano rekombinowane białka o sekwencjach HA dziewięciu szczepów IV serotypu H5, w tym H5N1 (8 szczepów) i H5N2 (1 szczep). Informacje dotyczące antygenów stosowanych w badaniach specyficzności wytworzonych przeciwciał, w tym specyficzności serotypowej, przedstawiono poniżej w zestawieniu.
Zestawienie B Rekombinowane białka hemaglutyniny użyte w analizie serotypowej specyficzności wytworzonych przeciwciał.
| Antygen | Szczep wirusa grypy serotypu H5 Hemaglutynina Genbank Accession No. (EpiFluDatabase Accession No.) | Fragment HA system ekspresji | Pochodzenie |
| Rekombinowane białka oparte | na ektodomenie hemaglutyniny (rHA) | ||
| rHA - A/H5N1/Qinghai | A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05 (H5N1) ABE68927 | 17-530 aa, ARRRKKR, 6x His ssaczy | ITC |
| rHA - A/H5N1/India | A/chicken/lndia/NI V33487/2006(H5N 1) ABQ45850 | 17-530 aa, ARRRKKR, 6x His ssaczy | ITC |
| rHA - A/H5N1/Vietnam | A/Vietnam/1203/2004(H5Nl) AAW80717 | 18-530 aa, ARRRKKR, 6x His ssaczy | ITC |
| rHA - A/H5N1/Guiyang | A/goose/Guiyang/337/2006(H5Nl) ABJ96698 | 17-530 aa, ARRRKKR, 6x His ssaczy | ITC |
| rHA - A/H5N1/Ck/Vietnam | A/chicken/Vietnam/NCVD-016/08(H5N 1) ACO07033 | 18-534 aa, 6x His ssaczy | ITC |
| rHA - A/H5N2/Califomia | A/American green-winged teal/ Califomia/ HKWF609/2007(H5N2) ACF47563 | 19-506 aa, 6x His ssaczy | ITC |
| rHA - A/H5N1/Poland | A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N 1) (EPI156789) | 17-530 aa, ARRRKKR, 6x His bakulowirusowy | OET |
| Rekombinowane białka oparte | na podjednostce HA1 hemaglutyniny (rHAl) | ||
| rHAl - A/H5N1/Vietnam | A/Vietnam/120372004(H5N 1) AAW80717 | 1-345 aa, 6x His ssaczy | ITC |
| rHAl -Λ/Η5Ν1/ΗΚ/156 | A/Hong Kong/156/97(1I5N1) AAC32088 | 18-346 aa, 6x His ssaczy | ITC |
| rHAl - A/H5N1/HK/483 | A/Hong Kong/483/97(H5Nl) AAC32099 | 17-346 aa, 6xHis ssaczy | ITC |
| ITC - Immune Technology Corporation (USA) OET - Oxford Expression Technologies (Wielka Brytania) |
PL 238 020 B1
Białka HA z ssaczego systemu ekspresji oparte na ektodomenie (rHA) stanowiły fragmenty antygenu, zawierające podjednostkę HA1 i część podjednostki HA2 eksprymowane bez sekwencji sygnałowej (17-530 aa, 18-530 aa, 18-534 aa, 19-506 aa). W czterech spośród sześciu antygenów HA usunięto region cięcia (ARRRKKR) i białka te, zgodnie ze specyfikacją, występowały w większości w formie trimerów/oligomerów. Rekombinowane białka HA oparte na podjednostce HA1 (rHA1) były eksprymowane w komórkach ssaczych z (1-345 aa) lub bez (18-346 aa, 17-346 aa) sekwencji sygnałowej. Konformacja białek rHA1 nie była specyfikowana. Wszystkie rekombinowane białka HA zawierały ogon histydynowy - 6x His. Czystość antygenów wynosiła przynajmniej 95%. W elektroforegramach oczyszczonych antygenów białka rHA i rHA1 z ssaczego systemu ekspresji występują jako pojedyncze prążki o masach cząsteczkowych, odpowiednio: ~75 kDa i ~50 kDa.
Przydatność antygenów rHA i rHA1, wymienionych w zestawieniu B, do testowania serotypowej specyficzności wytworzonych przeciwciał została oceniona przez wykonanie badań antygenowości i stopnia oligomeryzacji. Sposób sprawdzania antygenowości rHA - A/H5N1/Qinghai i rHA A/H5N1/Poland przedstawiono w przykładach, odpowiednio: 2 i 3. Podobnie jak w przypadku rHA A/H5N1/Qinghai i rHA - A/H5N1/Poland, badania antygenowości rHA i rHA1 przeprowadzono stosując komercyjnie dostępne przeciwciała przeciwko HA H5. W panelu przeciwciał znalazły się Mab rozpoznające natywne białka HA, Mab wykazujące właściwości przeciwciał serotypowo-specyficznych oraz Mab aktywne w teście HI. Komercyjne Mab i Pab, użyte do charakterystyki białek HA, wymieniono w zestawieniu A i opisano szczegółowo w przykładzie 2.
Badania antygenowości białek rHA o sekwencjach szczepów: A/H5N1/India, A/H5N1/Vietnam, A/H5N1/Guiyang, A/H5N1/Ck/Vietnam, A/H5N2/California oraz białek rHA1 o sekwencjach szczepów: A/H5N1/Vietnam, A/H5N1/HK/156 i A/H5N1/HK/483 przeprowadzono metodą ELISA przy użyciu płytek Ni-NTA (Qiagen). Na płytki nałożono białka HA rozcieńczone w 1% BSA/PBS do stężenia 1 μg/ml. W celu kontroli poziomu niespecyficznego wiązania przeciwciał, część dołków płytki napełniono 1% BSA/PBS i inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C, równolegle z dołkami zawierającymi antygeny. W badaniach antygenowości siedmiu z ośmiu wymienionych wyżej rekombinowanych białek HA H5 stosowano wszystkie Mab i Pab przeciwko HA H5, zamieszczone w zestawieniu A. Przeciwciała, rozcieńczone do stężenia 1 pg/ml w 2% BSA/PBS, inkubowano na opłaszczonych płytkach w ciągu nocy w 2-8°C. Do wywołania płytek stosowano wyznakowane HRP Pab przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec całej cząsteczki, (Sigma-Aldrich) lub wyznakowane HRP przeciwciała monoklonalne przeciwko króliczym przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ (SigmaAldrich). Wtórne przeciwciała rozcieńczono 1:1000 przy użyciu 1% BSA/PBST i inkubowano na płytkach w ciągu 45 min. w temperaturze pokojowej. Badania antygenowości rHA1 - A/H5N1/HK/156 przeprowadzono przy użyciu przeciwciał opisanych jako Mab 8, rozcieńczonych do stężenia 0,1 μg/ml w 2% BSA/PBS. Mab związane z antygenem wykrywano stosując wyznakowane HRP Pab przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec całej cząsteczki (Sigma-Aldrich), które rozcieńczono 1:1000 w 2% BSA/PBS i inkubowano na płytce w ciągu 60 min. w 37°C. TMB (Sigma-Aldrich) stosowano jako substrat peroksydazy chrzanowej. Reakcję hamowano przy użyciu 1,25 M roztworu H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm. Test ELISA nie był optymalizowany dla poszczególnych antygenów i przeciwciał.
Wyniki badań immunoreaktywności białek rHA o sekwencjach szczepów: A/H5N1/India, A/H5N1/Vietnam, A/H5N1/Guiyang, A/H5N1/Ck/Vietnam, A/H5N2/California oraz białek rHA1 A/H5N1/Vietnam i rHA1 - A/H5N1/HK/483 zostały przedstawione na Fig. 6, Białka rHA i rHA1 zamieszczono w kolejności zmniejszającej się homologii wobec immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai). Identyczność aminokwasów w sekwencji podjednostki HA1 antygenów rHA wynosiła od 99% do 88% a antygenów rHA1 95% i 94%. Jak widać na Fig. 6, wśród siedmiu rekombinowanych białek HA, sześć antygenów tworzyło wykrywalne kompleksy immunologiczne z przeciwciałami monoklonalnymi. Poszczególne białka były rozpoznawane przez określoną ilość klonów komercyjnych Mab z podobnym lub zróżnicowanym powinowactwem. Białko rHA - A/H5N1/India było rozpoznawane przez wszystkie przeciwciała monoklonalne (8/8) z wysokim powinowactwem, podobnie jak rHA - A/H5N1/Qinghai Fig. 2. Białka: rHA - A/H5N1/Vietnam i rHA - A/H5N2/California były rozpoznawane z wysokim powinowactwem przez sześć, białko rHA1 - A/H5N1/Vietnam przez pięć a białka rHA - A/H5N1/Guiyang i rHA1 - A/H5N1/HK/483 przez cztery z ośmiu użytych komercyjnych przeciwciał monoklonalnych. Do białek rHA - A/H5N1/Guiyang i rHA1 - A/H5N1/HK/483 wiązały się z obniżonym powinowactwem również przeciwciała oznaczone jako Mab 3. Opisane wyżej antygeny oparte na ektodomenie HA H5 (rHA) były wykrywane przez przeciwciała poliklonalne. Obserwowane zróżnicowanie profili antygeno
PL 238 020 B1 wości białek HA mogło mieć związek ze zmiennością podjednostki HA1 i różnym zakresem specyficzności użytych komercyjnych przeciwciał monoklonalnych. Dodatkowo, odmienna prezentacja antygenów rHA i rHA1 oraz niższa czułość testu z użyciem białek rHA1 niż rHA mogły mieć wpływ na wyniki uzyskane dla białek opartych na ektodomenie i podjednostce HA1.
Badania antygenowości białka rHA1 - A/H5N1/HK/156 przy użyciu Mab 8 o szerokim zakresie specyficzności wobec HA H5 (Fig. 6) wykazały, że białko jest rozpoznawane przez te przeciwciała z wysokim powinowactwem (danych nie pokazano). Z kolei badania antygenowości białka rHA - A/H5N1/Ck/Vietnam przy użyciu wszystkich Mab i Pab przeciwko HA H5, wymienionych w zestawieniu A, wykazały że białko jest rozpoznawane wyłącznie przez przeciwciała poliklonalne: Pab 1 i Pab 2 (Fig. 6). Żadne z ośmiu przeciwciał monoklonalnych nie wiązało się z tym antygenem. Biorąc pod uwagę profil specyficzności przeciwciał monoklonalnych użytych w badaniach można stwierdzić, że rHA - A/H5N1/Ck/Vietnam, w przeciwieństwie do innych rekombinowanych białek HA, nie ma prawidłowej konformacji. Wyniki badań antygenowości rHA - A/H5N1/Qinghai i rHA - A/H5N1/Poland, wskazujące na to, że zachowują cechy konformacji natywnej HA, opisano w przykładach, odpowiednio: 2 i 3.
Wyniki badań antygenowości rekombinowanych białek HA, przedstawione na Fig. 2, 5 i 6 wskazują, że dziewięć z dziesięciu rekombinowanych białek HA (zestawienie B) o zróżnicowanej homologii względem immunogenu, w tym antygeny oparte na ektodomenie (6 białek) i na podjednostce HA1 (3 białka) hemaglutyniny, mają cechy struktury wirusowej HA. Przeprowadzone badania uzasadniają wykorzystanie wszystkich przetestowanych białek HA w procedurze selekcji wytworzonych przeciwciał. Użycie białek opartych na podjednostce HA1 umożliwiło selekcję Mab przeciwko konformacyjnym epitopom podjednostki HA1, natomiast użycie rHA - A/H5N1/Ck/Vietnam odróżnienie przeciwciał rozpoznających epitopy konformacyjne i niekonformacyjne HA H5.
Badania na obecność form oligomerycznych w antygenach rHA i rHA1 przeprowadzono metodą ELISA typu „sandwich” w sposób identyczny jak w badaniach oligomeryzacji białek rHA A/H5N1/Qinghai i rHA - A/H5N1/Poland. Warunki przeprowadzenia testu opisano w przykładzie 2. Wyniki uzyskane dla dziesięciu rekombinowanych białek HA H5, wymienionych w zestawieniu B, przedstawiono na Fig. 3. Stopień oligomeryzacji białek rHA - A/H5N1/lndia i rHA - A/H5N1/Vietnam był porównywalny do tego, jaki obserwowano dla rHA - A/H5N1 /Qinghai. Nieznacznie niższy stopień oligomeryzacji wykazano dla białka rHA - A/H5N2/California. Antygen rHA - A/H5N1/Guiyang zawierał znacznie mniej form oligomerycznych niż pozostałe białka rHA z ssaczego systemu ekspresji, ale więcej niż obie serie rHA - A/H5N[/Poland z bakulowirusowego systemu ekpresji, W niekonformacyjnym antygenie rHA - A/H5N1/Ck/Vietnam nie wykryto form oligomerycznych, co potwierdza wyniki badań antygenowości tego białka z przeciwciałami, oznaczonymi jako Mab 8 (Fig. 6), które znalazły zastosowanie w teście do badania stopnia oligomeryzacji. Test ELISA do oznaczania stopnia oligomeryzacji białek HA potwierdził, że antygeny rHA1 występują w formie monomerów. Nieznaczny stopień oligomeryzacji stwierdzono tylko dla białka rHA1 - A/H5N1/Vietnam, które w przeciwieństwie do białek: rHA1 - A/H5N1/HK/156 i rHA1 - A/H5N1/HK/483, zawierało sekwencję sygnałową.
Wirusy grypy serotypów H1-H16
W analizie serotypowej specyficzności wytworzonych przeciwciał stosowano AIV. Wirusy (x-OvO) posiadały certyfikaty IZSVe. Wykaz stosowanych AIV zamieszono poniżej w zestawieniu.
PL 238 020 Β1
Zestawienie C Wirusy ptasiej grypy użyte w badaniach serotypowej specyficzności wytworzonych przeciwciał.
| Hemaglutynina serotyp | Wirusy ptasiej grypy serotyp | Szczep | Pochodzenie |
| HI | H1N1 | A/duck/It/1447/05(HlNl) | x-OvO |
| H2 | H2N3 | A/duck/Germ/1215/73(H2N3) | x-OvO |
| H3 | H3N8 | A/pass/It/6000/V00(H3N8) A/psitt/It/2873/00(H3N8) | x-OvO x-OvO |
| H4 | H4N8 | A/cockatoo/Eng/72(H4N8) | x-OvO |
| H5 | H5N1 | A/mallard/IV3401/05(H5Nl) | x-OvO |
| H5N2 | A/turk/It/80(H5N2) | x-OvO | |
| H5N3 | A/duck/IV775/04(H5N3) | x-OvO | |
| H5N9 | A/ck/It/22A/98(H5N9) | x-OvO | |
| H6 | H6N2 | A/turkey/Canada/65 (H6N2) | x-OvO |
| H7 | H7N1 | A/ck/IV1067/V99(H7Nl) | x-OvO |
| H7N3 | A/ty/It/9289/V02(H7N3) | x-OvO | |
| H7N4 | A/mallard/It/4810-79/04(H7N4) | x-0v0 | |
| H7N7 | A/macaw/626/80(H7N7) | x-OvO | |
| H8 | H8N4 | A/turk/Ont/6118/68(H8N4) | x-OvO |
| H9 | H9N2 | A/ty/Wis/66(H9N2) | x-OvO |
| H9N7 | A/turk/Scotland/l/70(H9N7) | x-OvO | |
| H10 | H10N1 | A/ostrich/SA/01(H10Nl) | x-OvO |
| Hll | H11N6 | A/duck/Eng/56(HllN6) | x-OvO |
| Η11Ν9 | A/duck/Memphis/546/174(Hl 1N9) | x-OvO | |
| H12 | H12N5 | A/duck/Alberta/60/76(H 12N5) | x-OvO |
| H13 | H13N6 | A/gull/Maryland/704/77(H 13N6) | x-OvO |
| H14 | H14N5 | A/mallard/Gurjev/263/82(H14N5) | x-OvO |
| H15 | H15N9 | A/shearwater/2576/79(H15N9) | x-OvO |
| H16 | H16N3 | A/gull/Denmark/6 8110/02(H 16N3) | x-OvO |
x-OvO Limited (Wielka Brytania), Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Yenezie (IZSVe, Włochy)
W analizie serotypowej specyficzności przeciwciał wykorzystano dwadzieścia pięć szczepów AIV, w tym cztery serotypu H5, a pozostałe serotypów: H1, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 i H16.
Homologia antygenów HA H5
W analizie serotypowej specyficzności wytworzonych przeciwciał użyto hemaglutyniny lub ich fragmenty o sekwencjach trzynastu szczepów IV serotypu H5 (zestawienia: B i C). W tej liczbie były wirusy H5N3 (1 szczep), H5N9 (1 szczep), H5N2 (2 szczepy) a przede wszystkim wirusy H5N1 (9 szczepów), należące do sześciu różnych kładów, wymienionych w poniższym zestawieniu.
Zestawienie D Klasyfikacja wirusów grypy H5N1, z których pochodziły sekwencje antygenów HA H5.
| Szczep wirusa grypy serotypu H5 | Hemaglutynina Genbank Accession No. (EpiFluDatabase Accession No.) | Kład IV H5N1 |
| A/Hong Kong/156/97(H5Nl) | AAC32088 | 0 |
| A/Hong Kong/483/97(H5Nl) | AAC32099 | 0 |
| A/Vietnam/1203/2004(H5Nl) | AAW80717 | 1 |
| A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) | ABE68927 | 2.2 |
| A/chicken/India/NIV33487/2006(H5Nl) | ABQ45850 | 2.2 |
| A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5Nl) | (EPI156789) | 2.2 |
| A/goose/Guiyang/33 7/2006(H5N I) | ABJ96698 | 4 |
| A/chicken/Vietnam/NC VD-016/08(H5N 1) | ACO07033 | 7 |
| A/mallard/Italy/3401/2005(H5Nl) | ABG57086.1 | EA-nonGsGD |
EA-nonGsGD - wirus serotypu H5 bardziej podobny do niskopatogennych wirusów pochodzenia euroazjatyckiego
PL 238 020 Β1
Homologia hemaglutynin, z których pochodziły sekwencje antygenów HA H5, została wyznaczona względem fragmentów: 1-567 aa (białko pełnej długości) i 17-338 aa (podjednostka HA1) HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/60/05(H5N1), będącej źródłem sekwencji immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai). Analizę sekwencji wykonano w programie BLAST. Względne homologie hemaglutynin pełnej długości przedstawiono w zestawieniu E, natomiast podjednostki HA1 białek w zestawieniu F. Hemaglutyniny różnych szczepów IV zamieszczono w kolejności zmniejszającego się wskaźnika Max Score.
Zestawienie E Homologia pełnej długości hemaglutynin, z których pochodziły sekwencje antygenów HA
| Sequences producing significant alignments: | |||||
| Description | Max score | Total score | Query cover | E value | Ident Accessionx |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/Bar-headed Goose/Qinghai/60/05(H5N1))] | 1186 | 1186 | 100% | 0.0 | 100% ABE68927.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/chicken/India/NIV3 3487/06(H5N 1))] | 1181 | 1181 | 99% | 0.0 | 99% ABO45850.I |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/swan/Poland/305-135 V0 8/2006(H5Nl))] | 1177 | 1177 | 99% | 0.0 | 99% (EPI156789) |
| hemagglutinin HA [Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5Nl))] | 1150 | 1150 | 99% | 0.0 | 97% AAW80717.1 |
| hemagglutinin subtype H5 [Influenza A virus (A/Hong Kong/156/97(H5N1))] | 1142 | 1142 | 99% | 0.0 | 96% AAC32088.1 |
| hemagglutinin subtype H5 [Influenza A virus (A/Hong Kong/483/1997(H5Nl))j | 1135 | 1135 | 99% | 0.0 | 95% AAC32099.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/duck/Italy/775/2004(H5N3))] | 1112 | 1112 | 99% | 0.0 | 93% ABS89310.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/ goose/Guiyang/33 7/2006(H5N 1))] | 1100 | 1100 | 98% | 0.0 | 94% ABJ96698.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/chicken/Italy/22A/1998(H5N9))] | 1089 | 1089 | 99% | 0.0 | 91% ABR37720.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/American green-winged teal/California/HKWF609/2007(H5N2))] | 1082 | 1082 | 99% | 0.0 | 89% ACF47563.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/turkey/Italy/1980(H5N2))j | 1067 | 1067 | 98% | 0.0 | 91% ACS93985.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/chicken/Vietnam/NCVD016/2008(H5Nl))] | 1066 | 1066 | 99% | 0.0 | 91% ACO07033.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/mallard/Italy/3401/2005(H5Nl'))] | 1058 | 1073 | 96% | 0.0 | 93% ABG57086.1 |
| xGenbank (EpiFluDatabase) Accession No. |
PL 238 020 Β1
Zestawienie F Homologia sekwencji, które tworzą podjednostkę HA1 antygenów HA H5, względem podjednostki HA1 hemaglutyniny szczepu A/H5N1/Qinghai, wyznaczona w programie BLAST.
| Sequences producing | significant alignments: | ||||
| Description | Max score | Total score | Query TJ x E value Ident cover | Accessionx | |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/Bar-headed Goose/Qinghai/60/05(H5N1))[ | 679 | 696 | 100% 0.0 | 100% | ABE68927.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/chicken/India/NIV33487/06(H5Nl))] | 677 | 694 | 100% 0.0 | 99% | ABO45850.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5Nl))] | 677 | 693 | 100% 0.0 | 99% | (EPI156789) |
| hemagglutinin HA [Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5Nl))] | 654 | 685 | 100% 0.0 | 95% | AAW80717.1 |
| hemagglutinin subtype H5 [Influenza A virus (A/Hong Kong/156/97(H5N1))] | 652 | 668 | 100% 0.0 | 95% | AAC32088.1 |
| hemagglutinin subtype H5 [Influenza A virus (A/Hong Kong/483/1997(H5Nl))] | 646 | 664 | 100% 0.0 | 94% | A AC3 2099.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/duck/Italy/775/2004(H5N3))] | 636 | 652 | 100% 0.0 | 93% | ABS89310.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/goose/Guiyang/337/2006(H5N 1))[ | 635 | 650 | 100% 0.0 | 93% | ABJ96698.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/mallard/Italy/3401/2005(H5Nl))l | 633 | 649 | 100% 0.0 | 93% | ABG57086.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/chicken/Italy/22A/1998(H5N9))[ | 619 | 636 | 100% 0.0 | 90% | ABR37720.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/American greenwinged teal/California/HKWF609/2007(H5N2))[ | 616 | 633 | 100% 0.0 | 88% | ACF47563.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/turkey/Italy/1980(H5N2))j | 615 | 631 | 100% 0.0 | 90% | ACS93985.1 |
| hemagglutinin [Influenza A virus (A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 8(H5N 1))] | 605 | 623 | 100% 0.0 | 89% | ACO07033.1 |
| xGenbank (EpiFluDatabase) Accession No. |
Badania homologii pełnej długości hemaglutynin dwunastu szczepów IV serotypu H5 względem HA szczepu A/H5N1/Qinghai wykazały znaczną zmienność białek (zestawienie E), z których pochodziły sekwencje antygenów HA użytych w analizie serotypowej-specyficzności wytworzonych przeciwciał. Ze względu na to, że epitopy serotypowo-specyficzne występują w podjednostce HA1 HA, szczególne znaczenie dla skutecznej selekcji pożądanych w diagnostyce przeciwciał monoklonalnych ma wysoka zmienność sekwencji tworzących tę podjednostkę w antygenach HA, wykazana w badaniach homologii (zestawienie F). W panelu białek HA znalazły się antygeny zawierające podjednostkę HA1 o bardzo wysokiej i stosunkowo niskiej homologii względem podjednostki HA1 HA szczepu A/H5N1 /Oinghai. Dla białek najbardziej podobnych do immunogenu tj. rHA - A/H5N1/lndia i rHA - A/H5N1/Poland wskaźniki homologii podjednostki HA1: Max Score, Total Score, Identities osiągnęły wartości, odpowiednio: 677, 694 i 693 oraz 99%. Te same wskaźniki dla podjednostki HA1 antygenów: A/H5N9/Ck/ltaly AIV, rHA - A/H5N2/California, A/H5N2/Tk/ltaly AIV i rHA- A/H5N1/CkA/ietnam osiągnęły wartości, odpowiednio: 619-605, 636-623 i 88-90%.
Testy ELISA do oznaczania serotypowej specyficzności wytworzonych Mab
Klony specyficzne wobec HA o sekwencji aminokwasowej identycznej lub bardzo zbliżonej do sekwencji immunogenu tj. wobec rHA - A/H5N1/Qinghai i rHA - A/H5N1/Poland były analizowane przy użyciu uprzednio scharakteryzowanych białek rHA i rHA1 o zróżnicowanej homologii względem immunogenu, które wytworzono w ssaczym systemie ekspresji (ITC). Ze względu na obecność ogonów histydynowych w rekombinowanych antygenach, w testach ELISA zastosowano płytki Ni-NTA. Ukierunkowany sposób wiązania antygenów na płytkach Ni-NTA zapewnia dostępność różnych epitopów antygenu, korzystnie dla wykrywalności przeciwciał. Oznaczenia specyficzności przeciwciał wobec AIV przeprowadzono metodą ELISA przy użyciu płytek MaxiSorp (NUNC). Pierwsze analizy nadsączy na obecność przeciwciał przeciwko AIV serotypu H5 (x-OvO) wykonano dopiero po rozklonowaniu hybrydom (przykład 5). Pełną charakterystykę specyficzności przeciwciał wobec AIV serotypów:
PL 238 020 B1
H1, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 i H16 (x-OvO), przeprowadzono tylko dla wybranych i oczyszczonych klonów Mab (przykład 7). Podobnie jak w testach do badania specyficzności przeciwciał wobec HA H5 (przykład 3), w testach do badania ich serotypowej specyficzności przy użyciu białek rHA, rHAI i różnych szczepów AIV stosowano wysoce specyficzne antymysie przeciwciała jako przeciwciała wykrywające. W ten sposób ograniczono selekcję wytworzonych przeciwciał do serotypowo-specyficznych przeciwciał pożądanej klasy tj. IgG.
Testy ELISA z użyciem rekombinowanych białek HA
W celu przeprowadzenia testu ELISA z użyciem rekombinowanych białek HA, białka rHA i rHA1, w tym rHA-A/H5N1/Qinghai (ITC), rozcieńczano w 1% BSA/PBS, a następnie nakładano na płytki Ni-NTA (Qiagen). Część dołków płytki napełniano 1% BSA/PBS i inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C równolegle z dołkami zawierającymi antygeny. Nadsącze nie rozklonowanych hybrydom analizowano bez rozcieńczania na płytkach opłaszczonych rHA i rHA1 w stężeniu 1 gg/ml. Po rozklonowaniu hybrydom, nadsącze z hodowli analizowano bez rozcieńczania i/lub po rozcieńczeniu w PBS na płytkach opłaszczonych rHA i rHA1 w stężeniach, odpowiednio: 1 i 5 gg/ml. Próby, przeznaczone do badań reaktywności z rHA o sekwencjach szczepów: A/H5N1/Qinghai, A/H5N1/India, A/H5N1/Vietnam i A/H5N1/Guiyang, rozcieńczano 1:3000 albo 1:3000 i 1:5000. Na płytkach opłaszczonych rHA - A/H5N2/California nadsącze były analizowane bez rozcieńczania albo dodatkowo w rozcieńczeniach 1:1500 i 1:3000. Próby nadsączy przeznaczone do badań reaktywności z pozostałymi antygenami HA nie były rozcieńczane. W celu kontroli poziomu niespecyficznego wiązania przeciwciał, próby przygotowane z nadsączy hodowli hybrydom badano dodatkowo w nieopłaszczonych dołkach płytki. Oznaczenie wykonywano w obecności prób kontrolnych. Komercyjne przeciwciała przeciwko HA H5 (Mab 8, zestawienie A) stanowiły kontrolę pozytywną, natomiast bufor RPMI kontrolę negatywną (próba BLK). Płytki z badanymi i kontrolnymi próbami inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C. Do wykrywania Mab związanych z antygenem stosowano wyznakowane HRP przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ (Sigma-Aldrich). Wtórne przeciwciała rozcieńczano 1:1000 w buforach: 1% BSA/PBST lub 2% BSA/PBS i inkubowano na płytkach w ciągu 45 min. w temperaturze pokojowej albo w ciągu 60 min. w 37°C. TMB (Sigma-Aldrich) stosowano jako substrat HRP. Reakcję hamowano przy użyciu 1,25 M roztworu H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Wyniki badań reaktywności komercyjnych Mab i Pab na płytkach Ni-NTA opłaszczonych rHA i rHA1 z sekwencją HA szczepu A/H5N1/Vietnam w stężeniu 1 gg/ml (Fig. 6) oraz w stężeniach 0,25-4 gg/ml (danych nie pokazano) wykazały, że wykrywalność przeciwciał przeciwko podjednostce HA1 jest niższa przy zastosowaniu rHA1 niż rHA do opłaszczania płytek i zależy od stężenia przeciwciał oraz ich powinowactwa do antygenu. Pozytywny sygnał dla prób nadsączy z hodowli hybrydom testowanych na rHA i rHA1 wskazuje jednoznacznie, że Mab są specyficzne wobec podjednostki HA1, natomiast pozytywny sygnał dla rHA i brak sygnału dla rHA1 niekoniecznie oznacza, że Mab są skierowane przeciwko podjednostce HA2 antygenu. Przez podwyższenie stężenia rHA1 do opłaszczania płytek Ni-NTA z 1 gg/ml do 5 gg/ml, zwiększono czułość testu do badania serotypowej-specyficzności (danych nie pokazano). Test o zwiększonej czułości zastosowano w analizach prób nadsączy z hodowli hybrydom po ich rozklonowaniu.
Testy ELISA z użyciem wirusów grypy serotypów H1-16
W celu wykonania testów ELISA, preparaty AIV (x-OvO) rozcieńczano w PBS do 4000 HAU/ml na podstawie wartości specyfikowanej przez producenta, po czym nakładano na płytki MaxiSorp (NUNC). Płytki z dołkami zawierającymi antygeny wirusowe inkubowano w ciągu nocy w 28°C równolegle z dołkami napełnionymi PBS. Efektywność opłaszczenia poszczególnymi wirusami mogła być spodziewanie różna ze względu na obserwowane różnice składu preparatów. Po inkubacji, płytki blokowano przy użyciu 2% BSA/PBS. Nadsącze z hodowli hybrydom a nalizowano bez rozcieńczania na płytkach opłaszczonych AIV serotypu H5 (selekcja pozytywna). Oczyszczone klony Mab rozcieńczano do 20 gg/ml w 2% BSA/PBS i analizowano na płytkach opłaszczonych AIV serotypu H5 (selekcja pozytywna) oraz serotypów H1 -H4 i H5-H16 (selekcja negatywna). W celu potwierdzenia poprawności wykonania testu z IV serotypów innych niż H5, część każdej płytki do selekcji negatywnej była opłaszczana wirusami H5N3 i H5N9. Kontrolę poziomu niespecyficznego wiązania przeciwciał stanowiły próby zawierające Mab oraz próby BLK (bufor RPM1 i/lub 2% BSA/PBS) nakładane w dołki płytki, odpowiednio, nieopłaszczone i opłaszczone antygenami. Kontrolę stanowiły komercyjne przeciwciała przeciwko HA H5 (Mab 8, zestawienie A) rozcieńczone do stężeń: 0,05, 0,01, 0,005 i 0,001 gg/ml w 2% BSA/PBS podczas testowania nadsączy z hodowli i do 20 gg/ml podczas testowania oczyszczonych Mab. Płytki z wytworzonymi Mab oraz próbami kon
PL 238 020 B1 trolnymi inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C. Do wykrywania Mab związanych z antygenami stosowano przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ, wyznakowane HRP (Sigma-Aldrich). Wtórne przeciwciała rozcieńczano 1:1000 w 2% BSA/PBS i inkubowano na płytkach w ciągu 1 h w 37°C. TMB (Sigma-Aldrich) stosowano jako substrat HRP. Reakcję hamowano przy użyciu 0,5 M roztworu H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Podsumowanie
Badania przesiewowe przeciwciał monoklonalnych w kierunku serotypowej specyficzności zostały przeprowadzone metodą ELISA przy użyciu uprzednio scharakteryzowanych antygenów HA H5 (selekcja pozytywna) i IV serotypów innych niż H5 (selekcja negatywna). Do pozytywnej selekcji wykorzystano rekombinowane białka HA H5 oparte na ektodomenie (rHA) lub podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny, opisane w zestawieniu B. Rekombinowane antygeny różniły się sekwencją aminokwasową jak również właściwościami. Poszczególne białka rHA i rHA1 wykazywały charakterystyczne profile rozpoznawania przez komercyjne przeciwciała przeciwko HA (Fig. 2, 5, 6). Z dziesięciu rekombinowanych białek, dla których wykonano badania antygenowości, dziewięć antygenów, w tym sześć białek rHA i trzy białka rHA1, miało cechy struktury wirusowej HA. Antygeny rHA1 występowały w formie monomerów, natomiast antygeny rHA występowały przynajmniej częściowo w formie oligomerów (Fig. 3), co upodabnia je do trimerycznej HA występującej w otoczce IV. Zawartość form oligomerycznych w antygenach rHA była zróżnicowana. Istotnie różny poziom oligomeryzacji, a także glikozylacji wykazywały białka HA H5 (17-530 aa, ARRRKKR, 6 x His) o bardzo podobnej sekwencji aminokwasowej: rHA - A/H5N1/Qinghai z ssaczego i rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji (przykłady: 2, 3). Do selekcji pozytywnej wytworzonych przeciwciał wykorzystano również cztery certyfikowane szczepy AIV serotypu H5: H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9 (zestawienie C). Tak więc badania przesiewowe przeciwciał wykonano przy użyciu różnych form antygenu HA H5 o korzystnie zróżnicowanych właściwościach mających spodziewany wpływ na sposób prezentacji epitopów dla pożądanych w diagnostyce przeciwciał monoklonalnych. Użycie konformacyjnych białek rHA1 umożliwiło identyfikację Mab wiążących się z podjednostką HA1 hemaglutyniny, natomiast użycie białka, które nie wykazuje antygenowości natywnej HA (rHA - A/H5N1/Ck/Vietnam), odróżnienie przeciwciał rozpoznających epitopy konformacyjne i liniowe HA H5.
W analizie serotypowej specyficzności wytworzonych przeciwciał użyto hemaglutyniny lub ich fragmenty o cechach natywnego antygenu, które zawierały sekwencje HA dwunastu szczepów IV serotypu H5 (zestawienia: B i C), W tej liczbie były wirusy H5N3 (1 szczep), H5N9 (1 szczep), H5N2 (2 szczepy) oraz wirusy H5N1 (8 szczepów), klasyfikowane do pięciu kładów: 0, 1, 2.2, 4 i EA-nonGsGD (zestawienie D). Homologia podjednostki HA1 konformacyjnych antygenów HA względem podjednostki HA1 immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai), mierzona jako procentowy udział identycznych aminokwasów w sekwencji, wynosiła od 99% do 88% (zestawienie F). Można było przypuszczać, że zastosowanie odmiennych form antygenów HA H5 o zróżnicowanej homologii umożliwi ocenę serotypowej specyficzności nowo wytworzonych klonów Mab, tak jak badania reaktywności komercyjnych przeciwciał z rekombinowanymi białkami HA H5 ujawniły zakres specyficzności poszczególnych klonów wobec hemaglutynin H5 (Fig. 2, 5, 6). Selekcję negatywną wykonano stosując dwadzieścia jeden szczepów AIV, które reprezentowały serotypy HA inne niż H5. Wirusy AI: H1-H4 i H6-H16 (zestawienie C), podobnie jak AIV serotypu H5, były certyfikowane.
Podsumowując, zastosowana strategia selekcji Mab zapewniała duże prawdopodobieństwo identyfikacji klonów przeciwciał rozpoznających różne epitopy specyficzne dla HA H5, które reagowałyby z IV serotypu H5, należącymi do różnych kładów i podkładów i jednocześnie nie reagowałyby krzyżowo z wirusami serotypów innych niż H5.
P r z y k ł a d 5
Wyniki selekcji wytworzonych przeciwciał
W efekcie zastosowania procedury otrzymywania Mab z użyciem rHA - A/H5N1/Qinghai do szczepienia myszy, opisanej w przykładzie 1, uzyskano 440 hybrydom, w tym 58, które produkowały przeciwciała przeciwko HA H5. Oznaczenie specyficzności przeprowadzono metodą ELISA przy użyciu dwóch antygenów: rHA - A/H5N1/Qinghai z ssaczego systemu ekspresji (ITC) i rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji (OET). Warunki wykonania testu opisano w przykładzie 3. Nadsącze z hodowli hybrydom, które zawierały przeciwciała rozpoznające rHA - A/H5N1/Qinghai, poddano dalszej analizie z użyciem rekombinowanych białek HA opartych na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny, które wyprodukowano w komórkach ssaczych (ITC). Oznaczenie wykonano w sposób opisany w przykładzie 4. Wyniki badań
PL 238 020 Β1 wskazujące na prawidłowość konformacji użytych białek HA przedstawiono w przykładach: 2, 3 i 4. Antygeny zawierały sekwencje HA pięciu szczepów wirusa H5N1 i jednego szczepu wirusa H5N2. Sekwencje antygenów analizowano w programie BLAST przez porównanie z sekwencją HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/60/05(H5N1). Homologia pełnej długości sekwencji źródłowych dla antygenów HA, wyrażona jako procentowy udział identycznych aminokwasów, wynosiła od 99% do 89%, natomiast sekwencji tworzących podjednostkę HA1 od 99% do 88%. Wyniki oznaczeń serotypowej specyficzności otrzymanych przeciwciał przedstawiono w Tabeli 1, zamieszonej poniżej.
Bardziej szczegółowo, Tabela 1 przedstawia wyniki badań immunoreaktywności przeciwciał produkowanych przez nie rozklonowane hybrydomy. Próby pobrane z nadsączy hybrydom badano metodą ELISA stosując rekombinowane białka oparte na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny. Białko rHA - A/H5N1/Poland wyprodukowano w bakulowirusowym systemie ekspresji (OET, seria 1). Pozostałe białka: rHA i rHA1 pochodziły z ssaczego systemu ekspresji (ITC). Do opłaszczania antygenami HA stosowano płytki MediSorp (rHA A/H5N1/Poland) firmy NUNC oraz płytki Ni-NTA (rHA, rHA1 z ssaczego sytemu ekspresji) firmy Oiagen. Homologię hemaglutynin, z których pochodziły sekwencje antygenów HA H5, wyznaczono względem fragmentów 1-567 aa (białko pełnej długości) i 17-338 aa (podjednostka HA1) HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/60/05(H5N1), będącej źródłem sekwencji immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai). Porównanie sekwencji wykonano w programie BLAST i wyrażono jako procentowy udział identycznych aminokwasów.
Tabela 1
| Antygeny HA sekwencja źródłowa (szczep IV, kład AIVH5N1) | Homologia HA Ident [%] | 58 hybrydom przed rozklonowaniem | ||||||||||
| HA 1- 567 aa | HA1 17338 aa | 25 | 3 | 3 | 9 | 4 | 7 | 3 | 2 | 1 | 1 | |
| Białka oparte na ektodomen | e hemaglutyniny z ssaczeg | o sytemu ekspresji (rHA) | ||||||||||
| rHA - A/H5N1/Qinghai A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05 kład 2.2 | 100 | 100 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | 4- |
| rHA-A/H5N1/lndia A/chicken/lndia/NIV33487/2006 kiad 2.2 | 99 | 99 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | 4- |
| rHA - A/H5N1/Vietnam A/Vietnam/1203/2004 kład 1 | 97 | 95 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | 4- |
| rHA - A/H5N1/Guiyang A/goose/Guiyang/337/2006 kład 4 | 94 | 93 | + | + | - | + | + | 4- | - | - | - | |
| rHA - A/H5N2/California A/American green-winged teal/ California/HKWF609/2007 | 89 | 88 | + | - | + | + | + | - | - | + | - | - |
| Białko oparte na ektodomenie hemaglutyniny z ba | kulowirusowego sytemu ekspresji (rl- | A) | ||||||||||
| rHA - A/H5N1/Pola nd A/swan/Poland/305-135V08/2006 kład 2.2 | 99 | 99 | + | + | + | + | + | - | + | + | ||
| Białko oparte na podjednostce HA1 hemaglutyniny z ssaczego sytemu ekspresji (rHA1 | ||||||||||||
| rHA1 - A/H5N Wietnam A/Vietnam/1203/2004 kład 1 | - | 95 | + | + | + | - | - | - | - | - | - | |
| 6 hybrydom wybrano do rozklonowania |
PL 238 020 B1
Przeciwciała produkowane przez większość nie rozklonowanych hybrydom (31/58) rozpoznawały rekombinowane białka wytworzone w ssaczym i bakulowirusowym systemie ekspresji, w tym zarówno antygeny rHA jak i białko rHA1 - A/H5N1/Vietnam. W przypadku kilku hybrydom (6/31) stwierdzono, że produkują przeciwciała, które nie wykrywają białek o sekwencjach hemaglutynin o najniższej homologii z immunogenem tj. rHA - A/H5N2/California albo rHA - A/H5N1/Guiyang. Badania nadsączy z hodowli pozostałych pierwotnych hybrydom (27/58) nie wykazały obecności przeciwciał rozpoznających rHA1 A/H5N1/Vietnam. Pozytywny sygnał z rHA - A/H5N1/Vietnam i brak sygnału z rHA1 - A/H5N1/Vietnam, obserwowane w badaniach wszystkich nadsączy z hodowli tej grupy hybrydom, nie musi oznaczać, że Mab są skierowane przeciwko podjednostce HA2 antygenu. Uzasadnienie dla takiej interpretacji wyników przedstawiono w przykładzie 4. Wśród 27 hybrydom, dla których nie wykazano produkcji przeciwciał przeciwko rHA1 - A/H5N1/Vietnam, 13 wytwarzało przeciwciała, które rozpoznawały wszystkie użyte białka rHA z ssaczego systemu ekspresji, natomiast przeciwciała wytworzone przez pozostałe 14 hybrydom nie wykazywały reaktywności wobec rHA - A/H5N2/California i/lub rHA - A/H5N1/Guiyang o najniższej homologii z immunogenem. W nadsączach z hodowli niektórych hybrydom (8/27) nie wykryto przeciwciał rozpoznających antygen rHA z bakulowirusowego systemu ekspresji o sekwencji HA szczepu A/H5N1/Poland, mimo wysokiej homologii z immunogenem.
Biorąc pod uwagę to, że serotypowo-specyficzne epitopy zlokalizowane są w podjednostce HA1 HA a reaktywność z antygenami o zróżnicowanej homologii wskazuje na zakres specyficzności wytworzonych przeciwciał, najbardziej obiecującym materiałem do dalszych badań przesiewowych była grupa 25 pierwotnych hybrydom, które produkowały przeciwciała rozpoznające wszystkie antygeny użyte w teście serotypowej specyficzności, Z tej grupy do rozklonowania wybrano sześć hybrydom: G-1-31, G-2-14, G-5-32, G-6-42, G-7-24 i G-7-27. Profile immunoreaktywności uzyskane w badaniach nadsączy z hodowli wybranych hybrydom zamieszczono poniżej w Tabeli 2. Wyniki przedstawiono jako wartości sygnałów (A 450) uzyskane w testach ELISA przy użyciu rekombinowanych białek HA.
Bardziej szczegółowo, Tabela 2 przedstawia wyniki badań immunoreaktywności przeciwciał produkowanych przez hybrydomy wytypowane do rozklonowania. Badania przeprowadzono metodą ELISA stosując rekombinowane białka oparte na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny. Białko rHA - A/H5N1/Po!and wyprodukowano w bakulowirusowym systemie ekspresji (OET, seria 1). Pozostałe białka: rHA i rHA1 pochodziły z ssaczego systemu ekspresji (ITC). Do opłaszczania antygenami HA stosowano płytki MediSorp (rHA - A/H5N1/Poland) firmy NUNC oraz płytki Ni-NTA (rHA, rHA1 z ssaczego sytemu ekspresji) firmy Qiagen. Wyniki przedstawiono jako wartości sygnałów (A4So), uzyskane w badaniach nadsączy z hodowli hybrydom. Homologię hemaglutynin, z których pochodziły sekwencje antygenów HA H5, wyznaczono względem fragmentów 1-567 aa (białko pełnej długości) i 17-338 aa (podjednostka HA1) HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/60/05(H5N1), będącej źródłem sekwencji immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai). Porównanie sekwencji wykonano w programie BLAST i wyrażono jako procentowy udział identycznych aminokwasów.
PL 238 020 Β1
Tabela 2
| Antygeny HA sekwencja źródłowa (szczep IV, kład AIV H5N1) | Homologia HA Ident [%] | Hybrydomy wybrane do rozklonowania (nr) | ||||||
| HA 1- 567 aa | HA1 17338 aa | G-1- -31 | G-2- -14 | G-5- -32 | G—6- -42 | G-7- -24 | G-7- -27 | |
| Białka oparte na ektodomenie hemaglutyniny z ssaczego syf | emu ekspresji (rHA) | |||||||
| rHA-A/H5N1/Qinghai A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05 kład 2.2 | 100 | 100 | >4,0 | >4,0 | > 4,0 | >4,0 | >4,0 | >4,0 |
| rHA - A/H5N1/India A/chicken/lndia/NIV33487/2006 kład 2.2 | 99 | 99 | >4,0 | > 4,0 | >4,0 | >4,0 | > 4,0 | > 4,0 |
| rHA - A/H5N Wietnam AA/ietnam/1203/2004 kład 1 | 97 | 95 | > 4,0 | >4,0 | > 4,0 | > 4,0 | > 4,0 | >4,0 |
| rHA - A/H5N1/Guiyang A/goose/Guiyang/337/2006 kład 4 | 94 | 93 | >4,0 | > 4,0 | >4,0 | >4,0 | >4,0 | >4,0 |
| rHA - A/H5N2/California A/American green-winged teal/ California/ HKWF609/2007 | 89 | 88 | > 4,0 | >4,0 | >4,0 | > 4,0 | > 4,0 | 3,784 |
| Białko oparte na ektodomenie hemaglutyniny z baku | owirusowego sytemu e | <spres|i (rHA) | ||||||
| rHA - A/H5N1/Poland A/swan/Poland/305-135V08/2006 kład 2.2 | 99 | 99 | 3,143 | 2,594 | 3,220 | 3,343 | 3,104 | 3,335 |
| Białko oparte na podjednostce I- | A1 hemaglutyniny z ssaczego sytemu ekspresji (rHA1) | |||||||
| rHA1 - A/H5N Wietnam AA/ietnam/1203/2004 kład 1 | - I 95 I l | 1,532 | 1,244 | 1,861 | 3,638 | 1,670 | 1,975 |
W badaniach serotypowej specyficzności przeciwciał wyprodukowanych przez wybrane hybrydomy przy użyciu antygenów rHA z ssaczego systemu ekspresji i rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji, uzyskano poziomy sygnałów (A450), odpowiednio, bardzo wysokie (A450 > 4) i wysokie (~2,6 —3,3). Stosując w badaniach rHA1 - A/H5N1/Vietnam odczytano wartości A450 niższe niż w przypadku użycia rHA1 - A/H5N1/Vietnam (~1,2 —3,6 > 4), co potwierdza wcześniejsze obserwacje o niższej czułości wykrywania przeciwciał przeciwko podjednostce HA1 HA przy użyciu krótkich fragmentów białka (1-345 aa) w zastosowanych warunkach oznaczenia.
Po rozklonowaniu wybranych hybrydom: G-1-31, G-2-14, G-5-32, G-6-42, G-7-24 i G-7-27 otrzymano 64 klony, produkujące przeciwciała przeciwko HA H5. Oznaczenie specyficzności otrzymanych Mab wobec rHA - A/H5N1/Qinghai i rHA - A/H5N1/Poland oraz ich izotypowanie wykonano metodą ELISA w sposób opisany w przykładzie 3. Nadsącze z hodowli hybrydom poddano dalszej analizie na obecność przeciwciał serotypowo-specyficznych. W porównaniu do badań przeprowadzonych na nadsączach z hodowli nie rozklonowanych hybrydom, badania serotypowej specyficzności przeciwciał produkowanych przez rozklonowane hybryd omy wykonano przy użyciu panelu antygenów HA, który poszerzono o dwa rekombinowane białka z ssaczego systemu ekspresji oparte na podjednostce HA1: rHA1 - A/H5N1/HK/156 i rHA1 - A/H5N1/HK/483 (ITC) oraz AIV: H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9 (x-OvO). Wyniki badań antygenowości wskazujące na prawidłowość konformacji użytych antygenów rHA1 przedstawiono na Fig. 6 i opisano w przykładzie 4. Wirusy Al wymieniono w zestawieniu C i opisano w przykładzie 4. Sekwencje antygenów rHA1 A/H5N1/HK/156 i rHA1 - A/H5N1/HK/483, zawierały, odpowiednio: 95% i94% identycznych aminokwasów jak podjednostka HA1 immunogenu, natomiast sekwencje tworzące podjednostkę HA1 hemaglutynin w cząstkach wirusowych 93-90%. Do panelu antygenów dołączono również antygen rHA - A/H5N1/Ck/Vietnam, który w badaniach antygenowości i oligomeryzacji rekombinowanych białek, opisanych w przykładzie 4 nie wykazywał cech struktury natywnej HA (Fig. 6). Oznaczenia
PL 238 020 B1 serotypowej specyficzności otrzymanych Mab przeprowadzono metodą ELISA w warunkach opisanych w przykładzie 4. Wyniki analizy serotypowej specyficzności otrzymanych klonów Mab przedstawiono w Tabeli 3, zamieszonej poniżej.
Bardziej szczegółowo, Tabela 3 przedstawia wyniki badań immunoreaktywności przeciwciał produkowanych przez rozklonowane hybrydomy. Badania przeprowadzono metodą ELISA stosując rekombinowane białka oparte na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny oraz AIV serotypu H5. Białko rHA - A/H5N1/Poland wyprodukowano w bakulowirusowym systemie ekspresji (OET). Pozostałe białka: rHA i rHA1 wyprodukowano w ssaczym systemu ekspresji (ITC). Wirusy grypy serotypu H5 (x-OvO) pochodziły z IZSVe. Do opłaszczania antygenami HA stosowano płytki MediSorp (rHA - A/H5N1/Poland, seria 3), MaxiSorp (AIV) firmy NUNC oraz płytki Ni-NTA (rHA, rHA1 z ssaczego sytemu ekspresji) firmy Qiagen. Homologię hemaglutynin, z których pochodziły sekwencje antygenów HA H5, wyznaczono względem fragmentów 1 -567 aa (białko pełnej długości) i 17-338 aa (podjednostka HA1) HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/60/05(H5N1), będącej źródłem sekwencji immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai). Porównanie sekwencji wykonano w programie BLAST i wyrażono jako procentowy udział identycznych aminokwasów.
PL 238 020 Β1
Tabela 3
| Antygeny HA Rekombinowane białko HA sekwencja źródłowa (szczep IV, kład AIV H5N1) Wirus grypy (serotyp, szczep IV, kład AIV H5N1) | Homologia HA Ident [%] | Hybrydomy przed rozklonowaniem (nr) | ||||||
| G-1 -31 | G-2 -14 | G-5 -32 | G-6 i G-7 -42 । -24 | G-7 -27 | ||||
| HA 1- 567 aa | HA1 17338 aa | 64 hybrydomy po rozkionowaniu | ||||||
| 22 | 1 | 10 | 6 | 14 | 11 | |||
| Białka oparte na ektodomenie hemaglutyniny z ssaczego sytemu ekspresji (rHA) | ||||||||
| rHA - A/H5N1/Qinghai A/Bar-headed Goose/Qinqhai/12/05, kład 2.2 | 100 | 100 | + | + | 4- | + | + | + |
| rHA -A/H5N1 /India A/chicken/lndia/NIV33487/2006, kład 2.2 | 99 | 99 | 4- | + | 4- | + | + | + |
| rHA - A/H5N Wietnam A/Vietnam/1203/2004, kład 1 | 97 | 95 | + | + | + | + | + | + |
| rHA - A/H5N1/Guiyang A/goose/Guiyang/337/2006, kład 4 | 94 | 93 | 4- | 4- | 4- | 4- | + | 4- |
| rHA-A/H5N1/Ck/Vietnam ! A/chicken/Vietnam/NCVD-016/08, kład 7 | 91 | 89 | - | - | - | - | - | - |
| rHA - A/H5N2/California A/American green-winged teal/ California/ HKWF609/2007 | 89 | 88 | + | + | + | + | + | + |
| Białko oparte na ektodomenie hemaglutyniny z bakulowirusowego sytemu ekspresji (rHA) | ||||||||
| rHA - A/H5N1/Poland A/swan/Poland/305-135V08/2006, kład 2.2 | 99 | 99 | 4- | + | + | + | + | 4- |
| Białka oparte na podjednostce HA1 hemaglutyniny z ssaczego sytemu ekspresji (rHA1) | ||||||||
| rHA1 -A/H5N Wietnam A/Vietnam/1203/2004. kład 1 | - | 95 | 4’ | + | + | + | + | + |
| rHA1 - A/H5N1/HK/156 A/Honq Konq/156/97, kład 0 | - | 95 | 4- | 4- | 4· | + | + | + |
| rHA1 - A/H5N1/HK/483 A/Hong Kong/483/1997, kład 0 | - | 94 | + | + | + | 4- | + | + |
| Wirusy grypy serotypu H5 | ||||||||
| IV-H5N3 A/duck/ltalv/775/2004 | 93 | 93 | 4- | 4- | 4- | + | + | 4- |
| IV- H5N1 A/mallard/ltalv/3401/2005. kład EA-nonGsGD | 93 | 93 | + | 4- | 4- | + | + | 4- |
| IV - H5N9 A/chicken/ltaly/22A/1998 | 91 | 90 | + | + | + | + | + | + |
| IV - H5N2 A/turkev/ltalv/1980 | 91 | 90 | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | |
| Izotyp Mab | igd | lgG1 | igGl | lgG1 | IgGl | lgG1 | ||
| Wybrane hybrydomy: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17, G-7-27-18 | 1 1 klon | 1 1 klon | 1 klon | 1 2 klony | 1 klon | 1 klon | ||
| ! Antygen nie wykazujący konformacji natywnej hemaglutyniny |
Otrzymane klony Mab, wszystkie izotypu lgG1, rozpoznawały konformacyjne antygeny HA: rHA (5/5) i rHA1 (3/3) z ssaczego systemu ekspresji, rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji oraz HA H5 w cząstkach wirusowych (4/4). Żaden z otrzymanych klonów Mab nie wiązał się z białkiem rHA - A/H5N1/Ck/Vietnam, które nie wykazywało cech natywnej HA. W sytuacji, kiedy wszystkie otrzymane klony Mab wykazywały pożądany szeroki zakres specyficzności względem HA H5 (Tabela 3), do dalszych badań wybrano kilka klonów Mab, które pochodziły z rozklonowania każdej z sześciu pierwotnych hybrydom. Takie podejście zwiększało prawdopodobieństwo znalezienia klonów rozpoznających różne epitopy specyficzne dla serotypu H5 hemaglutyniny. Spośród klonów Mab pochodzących z rozklonowania hybrydom: G-1-31, G-5-32, G-7-24 i G-7-27 wybrano po jednym klonie Mab a z rozklonowania hybrydomy, oznaczonej G-6-42, 2 klony Mab. Do dalszej charakterystyki przeznaczono także 1 klon G-2-14-10 otrzymany przez rozklonowanie hybrydomy, oznaczonej G-2-14.
PL 238 020 B1
Wybrane klony przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 oczyszczono z nadsączy hodowli hybrydom przy użyciu „HiTrap Protein G HP” (GE Healthcare). Preparatykę wykonano zgodnie z instrukcją producenta. Do elucji Mab stosowano 0,1 M bufor glicyna-HCI, pH 2,7. Frakcje białkowe neutralizowano w trakcie elucji przy użyciu 1 M buforu Tris-HCl, pH 9,0. Wymianę buforu i zagęszczanie przeciwciał wykonano przez wirowanie w ”Vivaspin® 6 Centrifugal Concentrator”, 10 000 MWCO (Sartorius Stedim Biotech). Oczyszczon e Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 badano przy użyciu spektrometrii mas oraz testów ELISA do analizy serotypowej specyficzności. W oparciu o profile immunoreaktywności i mapy peptydowe fragmentów Fab przeprowadzono różnicowanie wymienionych wyżej klonów przeciwciał. Dla oceny zdolności wytworzonych Mab do hamowania hemaglutynacji przeprowadzono testy HI. Wyniki wykonanych badań przedstawiono kolejno w przykładach: 6-10. Możliwe zastosowania otrzymanych przeciwciał opisano w przykładach: 11 i 12. Przeciwciała monoklonalne specyficzne wobec HA wirusów grypy serotypu H5: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 oraz ich zastosowania są przedmiotem niniejszego zgłoszenia patentowego.
P r z y k ł a d 6
Widma masowe wybranych klonów przeciwciał
Oczyszczone klony przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18, wybrane w wyniku selekcji w kierunku serotypowej specyficzności (Tabela 3) i opisane w przykładzie 5 analizowano przy użyciu spektrometru mas MALD1 TOF/TOF (4800 Plus, AB SCIEX). Przed wykonaniem widm masowych próby oczyszczono przy użyciu ZipTip®c4 (Millipore) zgodnie z procedurami zawartymi w instrukcji producenta: „User Guide for Reversed-Phase ZipTip”. Matrycę stanowił kwas synapinowy firmy Fluka o stężeniu 5 mg/ml rozpuszczony w 0,1% kwasie trifluorooctowym zawierającym 50% acetonitrylu. Pomiaru widm masowych dokonano w trybie liniowym (MS Linear Positive Ion) w zakresie od 20-170 kDa. Do kalibracji zewnętrznej wykorzystano wzorzec IgG (AB SCIEX). Wszystkie widma masowe zostały przetworzone przy użyciu filtru Gaussiana oraz procedur detekcji sygnałów za pomocą programu Data Explorer Software (V4.9).
Na Fig. 7a-g przedstawiono widma masowe oczyszczonych Mab przeciwko HA H5: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18. Sygnały o masach cząsteczkowych w zakresach: 147-153 kDa i 74-77 kDa pochodzą od badanych przeciwciał i odpowiadają kolejno jednokrotnie i dwukrotnie zjonizowanym próbom. Wyznaczone masy cząsteczkowe zgodne są z wartościami spodziewanymi dla mysich przeciwciał klasy IgG. Odmienności pomiędzy widmami poszczególnych klonów mogą być efektem zróżnicowanej glikozylacji białek. Masa cząsteczkowa Mab G-1-31-22 wynosi 147 kDa, natomiast Mab: G-2-14-10, G-5-32-5, G-7-24-17 i G-7-27-18 148 kDa. Widma masowe Mab: G-6-42-42 i G-6-42-71, otrzymanych przez rozklonowanie pierwotnej hybrydomy G-6-42 (Tabela 3), wskazują na obecność 2 form przeciwciał o masach cząsteczkowych: 147 kDa i 153 kDa (Fig. 7d,e). Przypuszczalnie, 2 formy przeciwciał różnią się poziomem glikozylacji a białka o wyższych masach cząsteczkowych powstały wskutek dodatkowej, nieenzymatycznej glikozylacji.
Związek wzrostu mas cząsteczkowych przeciwciał ze zwiększonym poziomem nieenzymatycznej glikozylacji został dobrze udokumentowany w badaniach frakcji immunoglobulinowych chorych na cukrzycę (Lapolla A i wsp. 1997, 2000a, 2000b). Przykładowo, masy cząsteczkowe przeciwciał klasy IgG osób zdrowych i standardu przeciwciał, oznaczone przy użyciu spektrometru mas wynosiły, odpowiednio: 149 kDa i 148 kDa, natomiast przeciwciał we frakcji białkowej osób ze słabo kontrolowaną cukrzycą 152 kDa (Lapolla A i wsp. 1997, 2000a). Efekt wzmożonej nieenzymatycznej glikozylacji osiągnięto również w warunkach in vitro przez inkubację frakcji białkowej osocza osoby zdrowej lub standardu przeciwciał klasy IgG w obecności wysokich stężeń glukozy, kiedy to obserwowano wzrost masy cząsteczkowej przeciwciał z, odpowiednio, 149 kDa i 148 kDa do 153 kDa (Lapolla A i wsp. 2000a).
P r z y k ł a d 7
Reaktywność wybranych klonów przeciwciał z antygenami hemaglutyniny
Przeciwciała monoklonalne: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18, wybrane w wyniku selekcji w kierunku serotypowej specyficzności (Tabela 3), oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa w sposób opisany w przykładzie 5. Dalsze badania polegały na oznaczeniu reaktywności wybranych klonów Mab z HA serotypów HI-HI 6 w celu określenia ich specyficzności i powinowactwa wobec HA H5 różnych szczepów IV oraz zdolności do reakcji krzyżowych z HA serotypów innych niż H5. Badania przeprowadzono przy użyciu antygenów HA H5 o zróżnicowanych właściwościach. Wśród tych antygenów były rekombinowane białka oparte na ektodomenie (rHA) lub podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny i AIV serotypu H5 (zestawienia: B i C). Rekom
PL 238 020 B1 binowane białka HA, pochodzące z ssaczego, wyjątkowo z bakulowirusowego systemu ekspresji, zawierały podjednostkę HA1, zwykle o prawidłowej konformacji, występowały w formie monomerów (rHA1) albo w większości lub częściowo tworzyły formy oligomeryczne (rHA). W badaniach otrzymanych Mab wykorzystano cztery certyfikowane szczepy AIV serotypu H5: H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9. Konformacyjne antygeny zawierały sekwencje HA dwunastu szczepów IV serotypu H5 o zróżnicowanej homologii względem immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai) - procentowy udział identycznych aminokwasów w sekwencjach podjednostki HA1 białek użytych w badaniach wynosił od 99% do 88% (zestawienie F). Antygeny: rHA - A/H5N1/Qinghai z ssaczego systemu ekspresji i rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji opisano szczegółowo w przykładach, odpowiednio: 2 i 3, natomiast pozostałe antygeny HA H5, wytworzone w komórkach ssaczych, w przykładzie 4.
W porównaniu do badań przeprowadzonych na nadsączach z hodowli hybrydom: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 (przykład 5), badania serotypowej specyficzności przeciwciał oczyszczonych z nadsączy tych hybrydom wykonano przy użyciu panelu antygenów, który poszerzono o rekombinowane białko oparte na ektodomenie HA z bakteryjnego systemu ekspresji i AIV serotypów: H1-H4 i H6-H16. Białko (17-522 aa, ARRRKKR) z sekwencją HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV, wyprodukowano metodą nadekspresji w bakteriach Escherichia coli w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków (IBA) w Warszawie (Polska). Po oczyszczeniu i renaturacji, białko HA H5 zostało poddane analizie przy użyciu spektrometrii mas, testów ELISA do badań antygenowości i oligomeryzacji białek HA, podobnie jak inne rekombinowane antygeny HA H5. W badaniach immunoreaktywności przeciwciał użyto preparat antygenu o czystości ~80%. Masa cząsteczkowa białka rHA - A/H5N1/Poland z bakteryjnego systemu, wyznaczona przy użyciu spektrometru mas MALDI TOF/TOF (4800 Plus, AB SCIEX), wynosiła 57 kDa. W przeciwieństwie do wyników uzyskanych dla białek rHA - A/H5N1/Qinghai i rHA - A/H5N1/Poland, odpowiednio, z ssaczego i balulowirusowego systemu ekspresji (przykłady: 2, 3), masa wyznaczona doświadczalnie dla bakteryjnej HA była zgodna z masą obliczoną na podstawie składu aminokwasowego w programie GPMAW 8.2 (Lighthouse). Wynika to z faktu, że białka produkowane w bakteriach nie ulegają glikozylacji. Przeprowadzone analizy wykazały, że otrzymane białko ma cechy natywnego antygenu: zachowuje epitopy konformacyjne rozpoznawane przez komercyjne przeciwciała przeciwko HA H5 (zestawienie A), w tym także przeciwciała HI oraz tworzy struktury oligomeryczne. W IBA wytworzono dwa warianty antygenowe białka. W testach opisanych w niniejszym przykładzie oraz w przykładach: 8 i 11 zastosowano drugi wariant antygenowy białka. W badaniach oczyszczonych Mab wykorzystano dwadzieścia jeden certyfikowanych szczepów AIV, które reprezentowały serotypy: H1-H4 i H6-H16 (zestawienie C).
Specyficzność wobec HA H5
Specyficzność oczyszczonych Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 wobec HA H5 sprawdzono przez ich miareczkowanie na białku rHA A/H5N1/Qinghai z ssaczego systemu ekspresji (ITC), które zostało użyte jako immunogen w procedurze otrzymywania przeciwciał (przykłady: 1, 2). Wykonano również miareczkowanie na rHA A/H5N1/Poiand z balulowirusowego (OET) i bakteryjnego systemu ekspresji (IBA) o wysokiej homologii z immunogenem (zestawienia: E, F).
W celu wykonania oznaczenia, białka rHA - A/H5N1/Qinghai (ITC) i rHA - A/H5N1/Poland (OET, seria 8), rozcieńczone w PBS do stężenia 1 pg/ml, nakładano na płytki MediSorp (NUNC) a preparat rHA - A/H5N1/Poland (IBA) o czystości -80%, zawierający zrenaturowaną hemaglutyninę w stężeniu ~1 μg/ml PBS, nakładano na płytki PolySorp, MediSorp, MaxiSorp i MultiSorp (NUNC). Część dołków płytki napełniano PBS zamiast roztworu antygenów. Po inkubacji w ciągu nocy w 2-8°C, płytki blokowano przy użyciu 10% FBS/PBS. Oczyszczone klony Mab analizowano jako serie 2-krotnych rozcieńczeń w 2% BSA/PBS. Na płytki opłaszczone antygenami z ssaczego i bakulowirusowego systemu ekspresji nakładano przeciwciała rozcieńczone w zakresie 8 μg/ml - 0,015 ng/ml, natomiast na płytki opłaszczone białkiem z bakteryjnego systemu ekspresji w zakresie 8 μg/ml - 7,8 (3,9) ng/ml. Kontrolę poziomu niespecyficznego wiązania przeciwciał stanowiły próby zawierające przeciwciała w stężeniu 4 μg/ml i/lub 8 μg/ml oraz 2% BSA/PBS (próba BLK) nakładane w dołki, odpowiednio, nieopłaszczone i opłaszczone antygenami. Płytki z wytworzonymi Mab oraz próbami kontrolnymi inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C. Do wykrywania Mab związanych z antygenami stosowano przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ, wyznakowane HRP (Sigma-Aldrich). Wtórne przeciwciała rozcieńczono 1:1000 w 2% BSA/PBS i inkubowano
PL 238 020 Β1 na płytkach w ciągu 1 h w 37°C. TMB (Sigma-Aldrich) stosowano jako substrat HRP. Reakcję hamowano przy użyciu 0,5 M roztworu H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Krzywe miareczkowania Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 na rHA - A/H5N1/Qinghai z ssaczego systemu ekspresji przedstawiono na Fig. 8 a na rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego i bakteryjnego systemu ekspresji, odpowiednio, na Fig. 9 i Fig. 10. Otrzymane wyniki wskazują, że wszystkie badane klony Mab mają wysokie powinowactwo wobec antygenów z eukariotycznego systemu ekspresji - wysokie poziomy sygnałów (A450) uzyskano dla nano-gramowych zakresów stężeń przeciwciał (Fig. 8, 9). Nie zaobserwowano istotnych różnic między krzywymi miareczkowania poszczególnych przeciwciał na antygenach pochodzących z ssaczego i bakulowirusowego systemu ekspresji. Wyniki badań immunoreaktywności poszczególnych klonów Mab z bakteryjnym białkiem rHA - A/H5N1/Poland związanym z płytkami: PolySorp, MediSorp, MaxiSorp i MultiSorp (NUNC) były podobne, dlatego przedstawiono je jako jako średnie wartości A450 ± SD, uzyskane na poszczególnych rodzajach płytek (Fig. 10). Reaktywność z antygenem wykazano dla przeciwciał: G-2-14-10, G-6-42-42, G-6-42-71 i G-7-27-18, przy czym wysokie wartości A450 uzyskano dla nano-gramowych (G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-27-18) lub mikro-gramowych (G-2-14-10) zakresów stężeń przeciwciał. W zastosowanych warunkach oznaczenia stwierdzono bardzo słabą reaktywność Mab G-5-32-5 oraz brak reaktywności Mab: G-1-31-22 i G-7-24-17 z bakteryjnym białkiem HA H5.
Przy użyciu programu Gene5 (Bio-Tek), z liniowych odcinków 4-parametrycznych krzywych miareczkowania wyznaczono przez interpolację stężenia, przy których poziomy sygnału (A450) wynosiły 1,5 i/lub 1,0. Wartości interpolowane uzyskane dla poszczególnych klonów Mab przedstawiono w Tabeli 4, zamieszczonej poniżej.
Bardziej szczegółowo, Tabela 4 przedstawia stężenia Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17, G-7-27-18, wyznaczone przez interpolację z liniowych zakresów 4-parametrycznych krzywych miareczkowania na rekombinowanych białkach HA o wysokiej homologii z immunogenem. Białko rHA* - A/H5N1/Qinghai (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) z sekwencją HA szczepu A/Bar-headed Goose/Qinghai/12/05(H5N1) AIV wyprodukowano w (*) ssaczym systemie ekspresji (ITC). Białka: rHA** - A/H5N1/Poland (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) i rHA*** A/H5N1/Poland (17-522 aa, ARRRKKR) wyprodukowano, odpowiednio, w (**) bakulowirusowym (OET, seria 8) i (***) bakteryjnym systemie ekspresji (IBA) w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV. Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA. Miareczkowanie na białkach HA z ssaczego i bakulowirusowego systemu ekspresji wykonano na płytkach MediSorp (NUNC) opłaszczonych antygenami w stężeniu 1 ug/ml a wyniki przedstawiono jako wartości stężeń interpolowane dla poziomu sygnału (A450) wynoszącego 1,5. Miareczkowanie na białku HA z bakteryjnego systemu ekspresji przeprowadzono na płytkach PolySorp, MediSorp, MaxiSorp i MultiSorp (NUNC) opłaszczonych preparatem rHA o czystości ~80%, który zawierał zrenaturowaną hemaglutyninę w stężeniu ~1 μg/ml. Wyniki przedstawiono jako średnie z wartości stężeń (± SD) interpolowanych dla poziomów A450 1,0 i/lub 1,5, uzyskanych w oznaczeniach przeprowadzonych na poszczególnych rodzajach płytek polistyrenowych. Krzywe miareczkowania i wartości interpolowane wyznaczono w programie Gene5 (Bio-Tek).
Tabela 4
| Klony Mab | Stężenie Mab dla A450 =1,5 [ng/ml] | Stężenie Mab dla A450 =1,0 [ng/ml] | ||
| rHA* A/H5N1/Qinghai | rHA** A/H5N1/Poland | rHA*** A/H5N1/Poland | rHA*** A/H5N1/Poland | |
| G-1-31-22 | 39 | 38 | - | |
| G-2-14-10 | 11 | 15 | - | -6368±157 |
| G-5-32-5 | 13 | 14 | ||
| G-6-42-42 | 9 | 10 | -10 ± 1 | -5 ± 1 |
| G-6-42-71 | 14 | 14 | -12 ±2 | -6 ± 1 |
| G-7-24-17 | 39 | 43 | - | - |
| G-7-27-18 | 7 | 9 | -322 ± 28 | -161 ±12 |
* ssaczy, ** bakulowirusowy, '“bakteryjny system ekspresji
PL 238 020 Β1
Wartości interpolowane z krzywych miareczkowania Mab: G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-27-18 na rHA - A/H5N1/Qinghai z ssaczego i rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji dla A450 = 1,5 osiągały wartości w zakresie, odpowiednio: 7-14 ng/ml i 915 ng/ml a w przypadku Mab: G-1-31-22 i G-7-24-17 wynosiły, odpowiednio: 39 ng/ml oraz 39 ng/ml i 38 ng/ml. Wartości interpolowane z krzywych miareczkowania Mab: G-6-42-42, G-6-42-71 na rHA A/H5N1/Poland z bakteryjnego systemu ekspresji dla A450 = 1,5 osiągały wartości, odpowiednio: ~10 ng/ml ±1 i ~12 ng/ml ± 2 i były porównywalne do wartości uzyskanych przez miareczkowanie tych przeciwciał na antygenach z eukariotycznego systemu ekspresji. W przypadku miareczkowania Mab G-7-27-18, stężenie interpolowane dla A450 = 1,5 z krzywej miareczkowania na bakteryjnym białku HA wynosiło -322 ng/ml ± 28 i było średnio 41-krotnie wyższe niż na antygenach pochodzących z ssaczego i bakulowirusowego systemu ekspresji. W zastosowanym zakresie rozcieńczeń Mab G-2-14-10, stężenie interpolowane dla A450 = 1,0 z krzywej miareczkowania na bakteiyjnym białku HA wynosiło -6368 ng/ml ± 157 i było ponad 1000-krotnie wyższe niż stężenia interpolowane dla tego samego poziomu sygnału uzyskane dla Mab: G-6-42-42, G-6-42-71 i ~40-krotnie wyższe niż uzyskane dla Mab G-7-27-18.
Dane przedstawione w Tabeli 4 wskazują na podobieństwo wyników uzyskanych dla poszczególnych klonów Mab w badaniach z użyciem białek rHA (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) z ssaczego i bakulowirusowego systemu ekspresji o wysokiej homologii, różniących się pod względem poziomu glikozylacji (przykłady: 2, 3) i oligomeryzacji (Fig. 3). W przypadku czterech z siedmiu otrzymanych klonów Mab, dla których w zastosowanych warunkach wykazano reaktywność z nieglikozylowanym bakteryjnym białkiem HA H5 (17-522 aa, ARRRKKR), interpolowane wartości stężeń wskazują na podobieństwo prezentacji epitopów dla Mab: G-6-42-42 i G-6-42-71 w rekombinowanych białkach HA różnego pochodzenia oraz duże lub bardzo duże różnice prezentacji epitopów dla Mab, odpowiednio: G-7-27-18 i G-2-14-10 w antygenach z prokariotycznego i eukariotycznego systemu ekspresji.
Reaktywność z rekombinowanymi białkami HA H5
Przed wykonaniem badań reaktywności wytworzonych Mab z rekombinowanych białkami HA H5, przeprowadzono analizę seryjnie rozcieńczonych przeciwciał na płytkach Ni-NTA, opłaszczonych rHA - A/H5N1/Vietnam z ssaczego systemu ekspresji (ITC) (zestawienie B). Oznaczenie przeprowadzono w warunkach opisanych w przykładzie 4. Stężenia Mab z liniowego zakresu krzywych miareczkowania, dające A450 ~2,5, przedstawiono poniżej w Tabeli 5.
Bardziej szczegółowo, Tabela 5 przedstawia stężenia Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17, G-7-27-18 z liniowego zakresu krzywych miareczkowania na rHA A/H5N1/Vietnam, przy których poziom sygnału (A450) wynosił ~2,5. Białko (18-530 aa, ARRRKKR, 6x His) z sekwencją HA szczepu A/Vietnam/1203/2004(H5N1) wyprodukowano w (*) ssaczym systemie ekspresji (ITC). Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA na płytkach Ni-NTA (Oiagen), opłaszczonych antygenem w stężeniu 1 μg/ml.
Tabela 5
| Klony Mab | Stężenie Mab dla A450 ~2,5 [ng/mll |
| rHA* A/H5N1/Vietnam | |
| G-1-31-22 | 50,0 |
| G-2-14-10 | 22,5 |
| G-5-32-5 | 20,0 |
| G-6-42-42 | 8,75 |
| G-6-42-71 | 12,5 |
| G-7-24-17 | 50,0 |
| G-7-27-18 | 12,5 |
| * ssaczy system ekspresji |
W celu przeprowadzenia badań immunoreaktywności, płytki Ni-NTA (Oiagen) opłaszczono białkami HA H5: rHA i rHA1 z ssaczego (ITC) oraz rHA z bakulowirusowego (OET, seria 8) systemu ekspresji. Antygeny rozcieńczono do stężenia 1 μg/ml w 1% BSA/PBS. Część dołków płytki napełniono 1% BSA/PBS i inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C równolegle z dołkami zawierającymi antygeny. Testowane klony Mab rozcieńczono w 2% BSA/PBS do stężeń, zgodnych z zamieszczonymi w Tabeli 5, po czym nakładano w opłaszczone i nieopłaszczone dołki płytki. Oznaczenie wykonywano
PL 238 020 B1 w obecności prób kontrolnych. Komercyjne przeciwciała przeciwko HA H5 (Mab 8, zestawienie A) stanowiły kontrolę pozytywną, natomiast 2% BSA/PBS kontrolę negatywną (próba BLK). Płytki z badanymi i kontrolnymi próbami inkubowano w ciągu nocy w 2-8°C. Do wykrywania Mab związanych z antygenem użyto przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ, wyznakowane HRP (Sigma-Aldrich). Wtórne przeciwciała rozcieńczono 1:1000 w 2% BSA/PBS i inkubowano na płytkach w ciągu 1 h w 37°C. TMB (Sigma-Aldrich) stosowano jako substrat HRP. Reakcję hamowano przy użyciu 1,25 M roztworu H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Wyniki badań reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z rekombinowanymi białkami opartymi na ektodomenie (rHA) i podjednostce HA1 (rHA1) hemaglutyniny przedstawiono na Fig. 11. Otrzymane klony Mab rozpoznawały wszystkie konformacyjne antygeny HA: rHA (5/5) i rHA1 (3/3) z ssaczego systemu ekspresji, rHA A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji. Żaden z otrzymanych klonów Mab nie wiązał się z białkiem rHA - A/H5N1/Ck/Vietnam nie wykazującym cech natywnej HA. Wyniki uzyskane dla oczyszczonych przeciwciał są zgodne z wynikami testów na obecność serotypowo-specyficznych przeciwciał w nadsączach z hodowli rozklonowanych hybrydom, które przedstawione w Tabeli 3 i opisano w przykładzie 5. Badania immunoreaktywności udowodniły, że Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 rozpoznają konformacyjne epitopy HA H5 i są skierowane przeciwko podjednostce HA1 antygenu. W przeciwieństwie do niektórych z komercyjnych przeciwciał przeciwko HA H5 (Fig. 6), opisanych w zestawieniu A, wszystkie otrzymane Mab wykazały reaktywność wobec HA H5 odległych antygenowo szczepów IV.
W celu zapewnienia lepszej porównywalności danych, wartości sygnałów (A450) uzyskane w badaniach reaktywności wytworzonych przeciwciał z rekombinowanymi białkami HA H5 o sekwencjach różnych szczepów wirusa wyrażono jako % wartości A450 odczytanych w testach z użyciem immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai). Uzyskane w ten sposób wyniki, opisywane dalej jako reaktywność względna wytworzonych przeciwciał wobec rekombinowanych białek HA, przedstawiono na Fig. 12. Otrzymane klony Mab zachowały wysoką reaktywność, wykazaną z rHA - A/H5N1/Qinghai, wobec białek rHA (17/18-530 aa, ARRRKKR, 6x His) z ssaczego systemu ekspresji o sekwencjach HA wirusów grypy: A/H5N1/India, A/H5N1/Vietnam i A/H5N1/Guiyang - względne reaktywności wobec poszczególnych antygenów wynosiły, odpowiednio: 96-113%, 100-111% i 96-121%. Identyczność aminokwasów tworzących podjednostkę HA1 wymienionych wyżej antygenów względem podjednostki HA1 immunogenu wynosiła od 99% do 93% (zestawienie F).
Dla większości otrzymanych klonów (5/7) stwierdzono obniżenie względnych reaktywności wobec białka rHA - A/H5N2/California (19-506 aa, 6x His) z ssaczego systemu ekspresji do wartości mieszczących się w zakresie 58-85%. Podjednostka HA1 tego antygenu zawierała 88% aminokwasów identycznych z sekwencją podjednostki HA1 immunogenu (zestawienie F). Obniżenie względnych reaktywności obserwowano także w badaniach z użyciem białka rHA - A/H5N1/Poland (17-530 aa, ARRRKKR, 6x His) z balulowirusowego systemu ekspresji o wysokiej homologii z immunogenem (99% identyczności sekwencji podjednostki HA1, zestawienie F). Dotyczyło to wszystkich otrzymanych Mab (7/7) a względne reaktywności wynosiły od 46% do 87%.
W testach z użyciem białek opartych na podjednostce HA1 z ssaczego systemu ekspsresji: rHA1 - A/H5N1/Vietnam (1-345 aa, 6x His), rHA1 - A/H5N1/HK/156 (18-346 aa, 6x His) i rHA1 A/H5N1/HK/483 (17-346 aa, 6x His) stwierdzono niższą reaktywność w porównaniu do reaktywności z białkami rHA z ssaczego systemu ekspresji o sekwencjach HA wirusów grypy: A/H5N1/Qinghai, A/H5N1/India, A/H5N1/Vietnam i A/H5N1/Guiyang. Względne reaktywności wobec poszczególnych antygenów rHA1 wynosiły, odpowiednio: 60-89%, 43-81% i 26-55%. Różnice względnych reaktywności otrzymanych klonów przeciwciał wobec białka rHA - A/H5N1/Vietnam i rHA1 - A/H5N1/Vietnam wynosiły od 21% do 42%. Jest to zgodne z wcześniejszymi obserwacjami, że czułość wykrywania przeciwciał przeciwko podjednostce HA1 jest niższa w wypadku użycia białek rHA1 niż białek rHA do opłaszcznia płytek Ni-NTA (przykłady: 4, 5). Identyczność aminokwasów w białkach rHA1 z sekwencjami HA wirusów grypy: A/H5N1/Vietnam, A/H5N1/HK/156, A/H5N1/HK/483 względem sekwencji podjednostki HA1 immunogenu wynosiła, odpowiednio: 95%, 95% i 94% (zestawienie F).
Obniżenie względnych reaktywności z antygenem rHA - A/H5N2/California o stosunkowo wysokim stopniu oligomeryzacji (Fig. 3), które obserwowano dla większości otrzymanych Mab (5/7), mogło wynikać z niższej homologii białka względem immunogenu (88% vs 99%-93% identyczności sekwencji podjednostki HA1, zestawienie F) ale też z różnicy prezentacji antygenu związanej z długością fragmentu białka (19-506 aa vs 17/18-530 aa). Znacznie niższa reaktywność wszystkich otrzyma
PL 238 020 B1 nych Mab wobec rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji niż wobec białka rHA - A/H5N1/Qinghai o zbliżonej sekwencji i innych białek rHA z ssaczego systemu ekspresji tej samej długości (17/18-530 aa), wykazana w badaniach z użyciem płytek Ni-NTA, była przypuszczalnie efektem stosunkowo niskiej oligomeryzacji białka, co mogło mieć wpływ na wydajność opłaszczenia i/lub sposób prezentacji antygenu związanego z płytką przez ogon 6x His. Uzasadnienie dla takiej interpretacji stanowią wyniki prac nad optymalizacją testów ELI SA do oznaczania specyficzności wytworzonych Mab (przykład 3) oraz badań specyficzności otrzymanych klonów Mab wobec rHA - A/H5N1/Poland i rHA - A/H5N1/Qinghai, które przeprowadzono z użyciem płytek MediSorp i opisano w pierwszej części niniejszego przykładu. Badania te nie wykazały istotnych różnic poziomu reaktywności poszczególnych klonów Mab wobec antygenów z ssaczego i bakulowirusowego systemu ekspresji, pomimo różnic poziomu glikozylacji (przykłady: 2, 3) i oligomeryzacji (Fig. 3). Podobnie jak w przypadku białka rHA - AH5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji, bardzo niski stopień oligomeryzacji lub jej brak skutkujący sposobem opłaszczenia i prezentacji antygenów był prawdopodobną przyczyną obniżonych względnych reaktywności wytworzonych Mab z białkami rHA1 związanymi na płytce Ni-NTA. Analiza uzyskanych wyników prowadzi do wniosku, że obserwowane zróżnicowanie względnych reaktywności otrzymanych Mab wobec rekombinowanych antygenów HA H5 są raczej efektem odmiennych właściwości białek użytych w badaniach niż zmienności sekwencji tworzących podjednostkę HA1 tych białek.
Reaktywność z wirusami grypy serotypów H1-H16
Badania zdolności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 do rozpoznawania HA w cząstkach wirusowych przeprowadzono metodą ELISA przy użyciu dwudziestu pięciu szczepów AIV, reprezentujących seroptypy HI-HI 6 (zestawienie C). Oznaczenie przeprowadzono w warunkach opisanych w przykładzie 4, Wyniki badań immunoreaktywności otrzymanych klonów Mab przedstawiono w Tabeli 6, zamieszczonej poniżej.
Bardziej szczegółowo, Tabela 6 przedstawia wyniki badań reaktywności Mab: G-1-31-22, G-214-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z LPAIV serotypów: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 i H16 (zestawienie C). Oznaczenie przeprowadzono metodą ELISA, opłaszczając płytki MaxiSorp (NUNC) wirusami rozcieńczonymi do 4000 HAU/ml na podstawie wartości specyfikowanej przez producenta. Wirusy grypy (x-OvO) pochodziły z IZSVe. Oczyszczone przeciwciała były badane w stężeniu 20 ng/ml.
PL 238 020 Β1
Tabela 6
| Serotyp HA | Wirusy ptasiej grypy (AIV) | Klony Mab | ||||||
| G-1 -31 -22 | G-2 -14 -10 | G-5 -32 -5 | G-6 -42 -42 | G-6 -42 -71 | G-7 -24 -17 | G-7 -27 -18 | ||
| H1 | A/duck/lt/1447/05(H1N1) | - | - | - | - | - | ||
| H2 | A/duck/Germ/1215/73(H2N3) | - | - | - | - | - | - | - |
| H3 | A/pass/lt/6000/V00(H3N8) | - | - | - | - | - | - | - |
| A/psitt/lt/2873/00(H3N8) | - | - | - | - | - | - | - | |
| H4 | A/cockatoo/En g/72(H4 N8) | X | - | - | - | - | - | - |
| H5 | A/mallard/IV3401/05(H5N1) | + | + | + | + | + | + | + |
| A/turk/lt/80(H5N2) | + | + | + | + | + | + | + | |
| A/duck/lt/775/04(H5N3) | + | + | 4- | + | + | + | + | |
| A/ck/lt/22A/98(H5N9) | + | + | + | + | + | + | + | |
| H6 | A/turkey/Canada/65 (H6N2) | - | - | - | - | - | - | - |
| H7 | A/ck/lt/1067/V99(H7N1) | - | - | - | - | - | - | |
| A/ty/lt/9289/V02(H7N3) | - | - | - | - | - | - | ||
| A/malfard/lt/4810-79/04(H7N4) | - | - | - | - | - | - | ||
| A/macaw/626/80(H7N7) | - | - | - | - | - | - | - | |
| H8 | A/turk/OnV6118/68(H8N4) | - | - | - | - | - | - | - |
| H9 | A/ty/Wis/66(H9N2) | - | - | - | - | - | - | - |
| A/turk/Scotland/1/70(H9N7) | - | - | - | - | - | - | - | |
| H10 | A/ostrich/SA/01(H10N1) | - | - | - | - | - | - | - |
| H11 | A/duck/Eng/56(H11N6) | - | - | - | - | - | - | - |
| A/duck/Memphis/546/174(H11N9) | - | - | - | - | - | - | - | |
| H12 | A/duck/Alberta/60/76(H12N5) | - | - | - | - | - | - | - |
| H13 | A/gull/Maryland/704/77(H13N6) | - | - | - | - | - | - | |
| H14 | A/mallard/Gurjev/263/82(H14N5) | - | - | - | - | - | - | - |
| H15 | A/shearwater/2576/79(H15N9) | - | - | - | - | - | - | * |
| H16 | A/gull/Denmark/68110/02(H16N3) | - | - | - | - | - | - |
Wszystkie otrzymane klony Mab tj. G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 rozpoznawały HA wirusów Al: H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9. Wyniki uzyskane dla oczyszczonych przeciwciał są zgodne z wynikami testów na obecność przeciwciał specyficznych wobec AIV serotypu H5 w nadsączach z hodowli rozklonowanych hybrydom, które przedstawione w Tabeli 3 i opisano w przykładzie 5. Testy z użyciem AIV serotypów: H1-H4 i H6-H16 wykazały, że wytworzone przeciwciała nie reagują krzyżowo z HA serotypów innych niż H5.
Wyniki badań reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z AIV: H5N3, H5N1, H5N9 i H5N2 przedstawiono na Fig. 13. Reaktywność wszystkich otrzymanych klonów przeciwciał była największa wobec AIV H5N3. W testach z użyciem tego wirusa odczytano sygnały (A450) o wartościach w zakresie: 1,4-3,0. Zgodnie z wynikami analizy sekwencji antygenów HA H5 względem sekwencji źródłowej immunogenu (rHA - A/H5N1/Qinghai), które zamieszczono w zestawieniach: E i F, zarówno białko pełnej długości jak i podjednostka HA1 HA wirusa H5N3 wykazywały najwyższe wskaźniki homologii (Max Score, Total Score, Identities) wśród hemaglutynin szczepów AIV użytych w badaniach immunoreaktywności otrzymanych Mab.
W celu zapewnienia lepszej porównywalności danych, wartości sygnałów (A450) uzyskane w badaniach reaktywności wytworzonych przeciwciał z wirusami: H5N1, H5N9 i H5N2 wyrażono jako % wartości A450 odczytanych w testach z użyciem AIV H5N3. Uzyskane w ten sposób wyniki, opisywane dalej jako reaktywność względna wytworzonych przeciwciał wobec AIV serotypu H5, przedstawiono na Fig. 14. Reaktywność Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 wobec AIV H5N1 stanowiła 45-80% reaktywności oznaczonej z wirusem H5N3. W porównaniu do hemaglutyniny AIV H5N3, podjednostkę HA1 HA wirusa H5N1 charakteryzuje taka sama
PL 238 020 B1 identyczność sekwencji wyznaczona względem immunogenu (93%) oraz niższe wskaźniki homologii: Max Score i Total Score (zestawienie F). Dalsze obniżenie reaktywności otrzymanych Mab obserwowano w badaniach z użyciem AIV H5N9 i AIV H5N2. Względne reaktywności przeciwciał wobec tych wirusów mieściły się w zakresach, odpowiednio: 10-39% i 24-35%. Zgodnie z danymi zamieszczonymi w zestawieniu F, podjednostka HA1 wirusów H5N9 i H5N2 zawiera 90% aminokwasów identycznych z sekwencją podjednostki HA1 immunogenu a wskaźniki homologii: Max Score i Total Score są wyższe w przypadku antygenu wirusa H5N9 niż wirusa H5N2.
Analiza uzyskanych wyników prowadzi do wniosku, że obserwowane zróżnicowanie reaktywności poszczególnych klonów Mab wobec AIV: H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9 może być związane ze zmiennością sekwencji tworzących podjednostkę HA1 HA wirusów użytych w badaniach i/lub efektywnością opłaszczania płytek do testów ELISA antygenami wirusowymi. Informację o różnicach składu preparatów wirusowych, które mogły mieć wpływ na warunki oznaczenia immunoreaktywności przeciwciał, zamieszczono w opisie wykonania testów ELISA z użyciem wirusów grypy (przykład 4).
Podsumowanie
Dalsze badania Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18, po ich oczyszczeniu z nadsączy hodowli hybrydom, przeprowadzono przy użyciu antygenów HA H5 o zróżnicowanych właściwościach. Wśród antygenów były rekombinowane białka oparte na ektodomenie HA (rHA) z ssaczego, bakulowirusowego i bakteryjnego systemu ekspresji, białka oparte na podjednostce HA1 (rHA1), otrzymane w komórkach ssaczych oraz dwadzieścia pięć szczepów AIV, które reprezentowały serotypy H1-H16 (zestawienia: B, C). Przeważająca większość antygenów HA H5 (13/14) wykazywała cechy natywnej hemaglutyniny (Fig. 2, 5, 6).
Otrzymane klony Mab rozpoznawały wszystkie konformacyjne, glikozylowane antygeny HA H5: białka rHA (6/6) i rHA1 (3/3) z eukariotycznego systemu ekspresji (Fig. 11) oraz AIV serotypu H5 (4/4) (Fig. 13) o zróżnicowanej homologii względem immunogenu - rHA - A/H5N1/Qinghai (99% do 88% identyczności sekwencji podjednostki HA1, zestawienie F). W zastosowanych warunkach oznaczenia, dla niektórych klonów (4/7) wykazano również znaczną reaktywność z nieglikozylowanym bakteryjnym białkiem HA H5. Żaden z otrzymanych klonów Mab nie wiązał się z niekonformacyjnym białkiem rHA A/H5N1/Ck/Vietnam (Fig. 11) ani z AIV serotypów: H1-H4 i H6-H16 (Tabela 6).
Uzyskane wyniki prowadzą do wniosku, że Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 są skierowane przeciwko konformacyjnym epitopom podjednostki HA1 hemaglutyniny, wykazują szeroki zakres specyficzności wobec HA serotypu H5 i jednocześnie nie reagują krzyżowo z HA serotypów: H1-H4 i H6-H16.
P r z y k ł a d 8
Różnicowanie klonów oparte na profilach immunoreaktywności
Na podstawie wyników z badań reaktywności Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 z antygenami HA H5 (przykład 7) stworzono profile immunoreaktywności przeznaczone do analizy porównawczej otrzymanych klonów. Na Fig. 15 przedstawiono profile reaktywności przeciwciał z białkami: rHA - A/H5N1/Qinghai z ssaczego, rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego i rHA - A/H5N1/Poland z bakteryjnego systemu ekspresji oraz z AIV H5N3 o najwyższej homologii z immunogenem wśród użytych w badaniach, odpowiednio, rekombinowanych białek HA i AIV serotypu H5. Na Fig. 16 przedstawiono profile względnych reaktywności otrzymanych klonów wobec rekombinowanych białek o sekwencjach HA H5 różnych szczepów IV, natomiast na Fig. 17 wobec AIV: H5N1, H5N9 i H5N2. Pojęcie względnej reaktywności wprowadzono i opisano w przykładzie 7. W przypadku rekombinowanych antygenów pojęcie to oznacza poziom reaktywności w stosunku do reaktywności z immunogem (rHA - A/H5N1/Qinghai) a w przypadku AIV w stosunku do reaktywności wykazanej z wirusem H5N3. Reaktywności względne wobec rekombinowanych białek HA H5 i wirusów Al serotypu H5 wyrażone są jako % wartości A450 uzyskanej w testach z użyciem, odpowiednio, białka rHA - A/H5N1/Qinghai i AIV H5N3. Informacje o antygenach użytych w badaniach immunoreaktywności zamieszczono w zestawieniach: B i C. Rekombinowane białka HA H5 opisano szczegółowo w przykładach: 2, 3, 4, 7. Sposób przeprowadzenia testów opisano w przykładzie 7.
Przeciwciała: G-6-42-42 i G-6-42-71 odróżniają się wyraźnie od innych otrzymanych klonów charakterystycznymi profilami reaktywności (Fig. 15, 16, 17). Dla przeciwciał tych wykazano wysokie powinowactwo wobec białek rHA - A/H5N1/Qinghai z ssaczego i rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji w testach z użyciem płytek MediSorp (Fig. 15), W porównaniu do pozostałych pięciu klonów, Mab G-6-42-42 i G-6-42-71 charakteryzują: najwyższe reaktywności z białkiem rHA - A/H5N1/Poland, wyprodukowanym w E. coli, a także z wirusem H5N3 (Fig. 15), wyrównane na
PL 238 020 B1 poziomie ~100% względne reaktywności wobec białek: rHA - A/H5N1/India, rHA - A/H5N1/Vietnam i rHA - A/H5N1/Guiyang oraz najniższe względne reaktywności wobec innych białek rHA i rHA1 (Fig. 16). Zgodnie z wynikami przedstawionymi na Fig. 17, przeciwciała: G-6-42-42 i G-6-42-71 wyróżniają także znacznie niższe względne reaktywności z AIV H5N9 niż z wirusem H5N2 (11%, 10% vs 30%, 29%). Podobieństwo wszystkich profili immunoreaktywności Mab G-6-42-42 i G-6-42-71 (Fig. 15, 16, 17) wskazuje, że przeciwciała te, pochodzące z rozklonowania tej samej pierwotnej hybrydomy, oznaczonej G-6-42 (Tabela 3), reprezentują jeden klon. Dodatkowo, widma masowe zarówno przeciwciał G-6-42-42 jak i przeciwciał G-6-42-71 wykazały obecność dwóch form białka (Fig. 7d,e), czego nie stwierdzono w przypadku pozostałych klonów (Fig. 7a,b,c,f,g).
Ważnym kryterium różnicującym pozostałe z otrzymanych Mab tj. G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-7-24-17 i G-7-27-18 są poziomy sygnałów (A450) osiągane przy określonych stężeniach przeciwciał, traktowane jako orientacyjna miara powinowactwa wobec antygenów i przedstawione na Fig. 15. Profile względnych reaktywności przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-7-24-17 i G-7-27-18 wobec rekombinowanych białek HA H5 i AIV serotypu H5, przedstawione na Fig. 16 i 17, wykazują znaczne podobieństwo, ale także różnice, które stały się podstawą różnicowania tych klonów. Kluczowymi antygenami różnicującymi okazały się: białko rHA - A/H5N2/California (Fig. 16) oraz AIV H5N1 (Fig. 17).
Przeciwciała G-1-31-22 i G-7-24-17 odróżniają się od przeciwciał G-2-14-10, G-5-32-5 i G-7-27-18 między innymi tym, że wykazują niższe powinowactwo wiązania z białkami rHA - A/H5N1/Qinghai z ssaczego i rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji zaadsorbowanymi na płytkach MediSorp (Fig. 15), a także z białkiem rHA - A/H5N1/Vietnam związanym na płytce Ni-NTA (Tabela 5). W przeciwieństwie do innych otrzymanych klonów, dla przeciwciał G-1-31-22 i G-7-24-17 nie wykazano reaktywności z bakteryjnym białkiem rHA - A/H5N1/Poland w zastosowanych warunkach a reaktywność z AIV H5N3 była najniższa i porównywalna jedynie do reaktywności Mab G-5-32-5 z tym wirusem (Fig, 15). Wyniki badań, które przedstawiono na Fig. 16, wykazały znacznie niższy poziom względnej reaktywności klonów: G-1-31-22 i G-7-24-17 z białkiem rHA - A/H5N2/California niż klonów: G-2-14-10, G-5-32-5 i G-7-27-18 (70% w 85-102%). Podczas gdy profile reaktywności klonów G-1-31-22 i G-7-24-17, przedstawione na Fig. 15 i 16 są podobne, profile względnych reaktywności tych przeciwciał wobec AIV serotypu H5, przedstawione na Fig. 17, wskazują, że Mab G-1-31-22 i G-7-24-17 są różnymi klonami. Mab G-1-31-22 wykazywały znacznie wyższą względną reaktywność wobec AIV H5N1 niż Mab G-7-24-17 (80% VJ 54%) oraz pozostałe klony otrzymanych przeciwciał (80% vs 45-67%).
Profile immunoreaktywności, przedstawione na Fig. 15, 16 i 17 pokazują, że przeciwciała G-5-32-5 mają cechy odróżniające je zarówno od przeciwciał G-1-31-22 i G-7-24-17 jak i G-2-14-10 i G-7-27-18. Mab G-5-32-5 charakteryzuje wysokie powinowactwo wiązania z białkami: rHA A/H5N1/Qinghai z ssaczego i rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji zaadsorbowanymi na płytkach MediSorp a jednocześnie bardzo słaba reaktywność z bakteryjnym białkiem HA i jedna z najniższych reaktywność z AIV H5N3 (Fig. 15). Klon ten wyróżnia spośród innych przeciwciał najwyższy poziom względnej reaktywności z białkami: rHA - A/H5N2/California, rHA1 A/H5N1/Vietnam i rHA1 - A/H5N1/HK/483 z ssaczego oraz z białkiem rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji związanymi na płytkach Ni-NTA (Fig. 16) oraz najniższy poziom względnej reaktywności wobec AIV H5N1 (Fig. 17). Uzyskane wyniki wskazują, że Mab G-5-32-5 rozpoznają glikozylowane białka HA, wytworzone w eukariotycznym systemie ekspresji z większym powinowactwem niż HA w cząstkach wirusowych.
Klony G-2-14-10 i G-7-27-18 znalazły się w grupie przeciwciał o wysokim powinowactwie wiązania z białkami: rHA - A/H5N1/Qinghai z ssaczego i rHA - A/H5N1/Poland z bakulowirusowego systemu ekspresji zaadsorbowanymi na płytkach MediSorp (Fig. 15). W porównaniu do klonów: G-1-31- 22, G-7-24-17 i G-5-32-5, przeciwciała G-2-14-10 i G-7-27-18 wykazały znaczną reaktywność z białkiem rHA - A/H5N1 /Poland, wyprodukowanym w bakteryjnym systemie ekspresji, oraz wyższą reaktywność z AIV H5N3 (Fig. 15). Reaktywność Mab G-7-27-18 zarówno wobec bakteryjnej HA H5 jak i wobec AIV H5N1 była wyższa niż Mab G-2-14-10, co wskazuje, że przeciwciała te są różnymi klonami (Fig. 15). Oprócz różnic widocznych na Fig. 15, przeciwciała G-2-14-10 i G-7-27-18 charakteryzuje znaczne podobieństwo profili względnych reaktywności z rekombinowanych białkami HA i wirusami: H5N1, H5N9 i H5N2 (Fig. 16, 17). W zakresie względnych reaktywności, klony: G-2-14-10 i G-7-27-18 odróżniają od przeciwciał: G-1-31-22, G-7-24-17, G-5-32-5 przede wszystkim wyniki uzyskane w badaniach z użyciem białka rHA - A/H5N2/California i AIV H5N1 (Fig. 16, 17). Poziomy względnych
PL 238 020 B1 reaktywności Mab: G-2-14-10 i G-7-27-18 z białkiem rHA - A/H5N2/California były niższe niż Mab G-5-32-5 i wyższe niż Mab: G-1-31-22 i G-7-24-17, natomiast z wirusem H5N1 były niższe niż Mab G-1-31-22 i wyższe niż Mab: G-7-24-17 i G-5-32-5.
Podsumowanie
W wyniku zastosowanej procedury otrzymywania Mab metodą hybrydom (przykład 1) otrzymano 7 klonów przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18. Analiza profili immunoreaktywności wykazała, że Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-7-24-17 i G-7-27-18 są różnymi klonami, natomiast Mab: G-6-42-42 i G-6-42-71 reprezentują jeden klon przeciwciał, odmienny od pozostałych pięciu klonów. Tak więc otrzymano sześć klonów Mab rozpoznających różne epitopy specyficzne dla serotypu H5 hemaglutyniny.
P r z y k ł a d 9
Różnicowanie klonów oparte na mapach peptydowych fragmentów Fab
Celem opisanych poniżej badań było uzyskanie fragmentów Fc i Fab przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 przez trawienie ficyną oraz porównanie ich map peptydowych powstałych w wyniku trypsynolizy. Na podstawie zarejestrowanych widm masowych wskazano peptydy charakterystyczne jedynie dla określonego lub tylko niektórych z otrzymanych klonów przeciwciał (peptydy „różnicujące”) oraz takie, które występowały we wszystkich analizowanych Mab (peptydy „wspólne”).
Oczyszczone Mab zagęszczono przy użyciu koncentratorów wirówkowych „VivaSpin 6” MWCO 10 000 (Sartorius Stedim Biotech) z jednoczesną wymianą buforu na PBS, pH 7,4. Trawienie przeciwciał przy użyciu ficyny przeprowadzano wykorzystując komercyjny zestaw „Pierce™ Mouse IgG1 Fab and F(ab’)2 Micro Preparation Kit” (Pierce/Thermo Scientific). Przygotowanie próby, trawienie i oczyszczanie wykonano ściśle wg instrukcji producenta. Na kolumnę z ficyną nanoszono białko w maksymalnym stężeniu tj. 250 pg w 125 pl roztworu. Czas trawienia wynosił 5 h. Rozdzielone przez chromatografię powinowactwa frakcje, które zawierały fragmenty Fab, Fe oraz niestrawione przeciwciała, zagęszczano przy użyciu koncentratorów wirówkowych VivaSpin 6” MWCO 5 000 (Sartorius Stedim Biotech) z jednoczesną wymianą buforu na PBS, pH 7,4.
Zagęszczone frakcje rozdzielano stosując elektroforezę (SDS-PAGE) w warunkach nieredukujących w układzie 2 żeli poliakrylamidowych (5% żel zagęszczający, pH 6,8 i 12,5% żel rozdzielający, pH 8,8). Prążki odpowiadające fragmentom: Fab i Fc oraz cząsteczkom IgG wycinano z żelu, redukowano przy użyciu 10 mM ditiotreitolu (Sigma-Aldrich), alkilowano przy użyciu 50 mM jodoacetamidu (Sigma-Aldrich) i trawiono roztworem trypsyny (Promega) o stężeniu 10 ng/ml. Równolegle prowadzono trawienie wyżej wymienionych frakcji trypsyną w roztworze. Każdorazowo roztwory zawierające peptydy zagęszczano w koncentratorze (Koncentrator 5301, Eppendorf) i analizowano metodą spektrometrii mas MALDI TOF/TOF.
Masy cząsteczkowe peptydów oraz ich jony fragmentacyjne oznaczano przy użyciu spektrometru mas MALDI TOF/TOF (4800 Plus, AB SCIEX). Matrycę stanowił kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy rozpuszczony w 0,1% kwasie trifluorooctowym zawierającym 50% acetonit rylu. Mapy peptydowe rejestrowano w trybie z reflektorem (MS Reflector Positive Ion) w zakresie od 900-8000 Da. Do kalibracji zewnętrznej wykorzystano wzorzec „4700 proteomics analyzer calibration mixture” (AB SCIEX). Masy cząsteczek, uwzględniane w obliczeniach i podawane w opisie są masami monoizotopowymi zjonizowanej pojedynczej cząsteczki z przyłączonym atomem wodoru. Peptydy identyfikowano na podstawie uzyskanych map peptydowych oraz widm fragmentacyjnych z wykorzystaniem baz danych dostępnych w systemie Mascot. Teoretyczne masy peptydów, których sekwencja potwierdzona została przy użyciu systemu Mascot, obliczono stosując ogólnodostępną usługę internetową na serwerze ExPASy. Peptydy znalezione w białkowych bazach danych opisywano dalej w tekście i tabelach jako „zidentyfikowane”. W tabelach oznaczono je symbolem „*”. Dla rozróżnienia, za peptydy „niezidentyfikowane” uznawano te, które nie zostały przypisane do żadnego znanego białka. W przypadku tych peptydów, podane masy monoizotopowe są średnimi ze wszystkich uzyskanych widm masowych. Dane zawarte w tabelach, zamieszczonych poniżej, są swoistą wypadkową obu zastosowanych metod trypsynolizy. Znaki: „+” i ,-” w tabelach oznaczają, odpowiednio, obecność i brak określonego peptydu w mapach peptydowych poszczególnych Mab.
Mapy peptydowe fragmentów Fc
Mapy peptydowe fragmentów Fc Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 oraz sekwencje aminokwasowe zidentyfikowanych peptydów w tych mapach przedstawiono w Tabeli 7(a,b), zamieszczonej poniżej.
PL 238 020 Β1
Bardziej szczegółowo, Tabela 7 przedstawia (a) mapy peptydowe fragmentów Fc Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 oraz (b) sekwencje aminokwasowe peptydów zidentyfikowanych w tych mapach. Mapy peptydowe, otrzymane w wyniku trypsynolizy, analizowano przy użyciu spektrometrii mas MALDI TOF/TOF. Peptydy zidentyfikowano na podstawie uzyskanych map peptydowych oraz widm fragmentacyjnych z wykorzystaniem baz danych dostępnych w systemie Mascot.
Tabela 7a
| Mapy peptydowe fragmentów Fc przeciwciał monoklonalnych (Mab) | |||||||||
| Klony Mab | masa [Da] | ||||||||
| 1169,6* | 1243,7* | 1301,7* | 1826,9* | 2112,0* | 2753,3* 2782,3* 1580,9 1771,9 | 1854,9* 2258,1* | 1965,8 | 2764,1 | |
| G-1-31-22 | 4» | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 4 + 4 | - | - | - |
| G-2-14-10 | 4- | 4- | 4 | + | 4 | 4 4 + 4 | - | - | + |
| G-5-32-5 | 4- | + | 4 | 4 | 4 4 + 4 | - | + | ||
| G-6-42-42 | 4 | 4- | 4 | + | 4 | 4 4 4 4 | | + i | 4 | - |
| G-6-42-71 | 4 | 4* | 4* | 4 | 4 | + 444 | 4 | 4 | - |
| G-7-24-17 | + | + | 4 | 4 | 4 4 + 4 | + | 4 | - | |
| G-7-27-18 | 4 | 4- | + | 4 | 4 | 4 4 + 4 | - 4 | - | + |
| peptydy „zidentyfikowane’ |
Tabela 7b
| Sekwencje aminokwasowe peptydów zidentyfikowanych w mapach peptydowych fragmentów Fc | |
| masa [Da] | sekwencja aminokwasowa |
| 1169,6 | IQHQDWTGGK |
| 1243,7 | VNSAAFPAPIEK |
| 1301,7 | VHNEGLPAPIVR |
| 1826,9 | EPQVYVLAPPQEELSK |
| 1854,9 | SVSELPIMHQDWLNGK |
| 2112,0 | FSWFVDDVEVNTATTKPR (1 MC)a |
| 2258,1 | SVSELPlMHQDWLNGKEFK (1 MC)a |
| 2753,3 | STVSLTCMVTSFYPDYIAVEWQR (CYS_CAM)b |
| 2782,3 | DTLTIS GTPEVTCWVD VG H D DPEVK (CYS_CAM)b |
| aMC oznacza 1 pominięte miejsce trawienia bCYS_CAM oznacza cysteinę modyfikowaną jodoacetamidem (modyfikację wprowadzono celowo przed trawieniem białka trypsyną, żeby uniknąć reorganizacji mostków dwusiarczkowych w czasie hydrolizy) |
Analiza map peptydowych fragmentów Fc otrzymanych Mab pozwoliła na wyróżnienie trzynastu peptydów (Tabela 7a). Dziewięciu z tych peptydów udało się przypisać sekwencje aminokwasowe (Tabela 7b), które zidentyfikowano jako fragmenty przeciwciał klasy IgG. Zdecydowana większość peptydów (9/13), przedstawionych w Tabeli 7a, to peptydy „wspólne”, wśród których siedem stanowią peptydy „zidentyfikowane” a dwa „niezidentyfikowane”. Cztery kolejne peptydy to fragmenty „różnicujące” (Tabela 7a). Sekwencje aminokwasowe dwóch z nich są znane (Tabela 7b). Identyczny profil peptydów „różnicujących” we fragmentach Fc stwierdzono w dwóch grupach klonów, z których jedna obejmowała Mab: G-6-42-42, G-6-42-71 i G-7-24-17 a druga Mab: G-2-14-10 i G-5-32-5. W porównaniu do Mab grupy drugiej, Mab G-7-27-18 zawierały dodatkowy peptyd „różnicujący”. W klonie G-1-31-22 nie stwierdzono obecności fragmentów „różnicujących”.
Mapy peptydowe fragmentów Fab
Podobnie jak w przypadku fragmentów Fc, analiza map peptydowych fragmentów Fab klonów: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 pozwoliła wskazać peptydy „wspólne” i „różnicujące”. Peptydy „wspólne” pochodzące z części Fab przeciw
PL 238 020 Β1 ciał oraz sekwencje aminokwasowe zidentyfikowanych peptydów „wspólnych” przedstawiono w Tabeli 8(a,b), zamieszczonej poniżej.
Bardziej szczegółowo, Tabela 8 przedstawia (a) peptydy „wspólne” w mapach peptydowych fragmentów Fab Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 oraz (b) sekwencje aminokwasowe zidentyfikowanych peptydów „wspólnych”. Mapy peptydowe, otrzymane w wyniku trypsynolizy, analizowano przy użyciu spektrometrii mas MALDI TOF/TOF. Peptydy zidentyfikowano na podstawie uzyskanych map peptydowych oraz widm fragmentacyjnych z wykorzystaniem baz danych dostępnych w systemie Mascot.
Tabela 8a
| Mapy peptydowe fragmentów Fab przeciwciał monoklonalnych (Mab) - peptydy „wspólne” | |||||||||
| Klony Mab | masa [Da] | ||||||||
| 1636,9' | 1666,8 | 1678,8 | 2015,0 | 2028,0 | 2037,0 | 2255,2 | 2421,0 | 2439,1 | |
| G-1-31-22 | * | + | + | 4 | + | + | 4· | + | + |
| G-2-14-10 | 4· | + | + | 4- | + | + | 4· | + | + |
| G-5-32-5 | 4- | + | + | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- |
| G-6-42-42 | 4- | 4- | 4· | 4- | 4- | 4- | 4- | 4· | 4- |
| G-6-42-71 | 4- | i- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4· | 4· | 4· |
| G-7-24-17 | 4· | + | 4- | 4- | 4- | + | + | 4* | 4* |
| G-7-27-18 | * | 4· | + | 4· | 4- | 4- | + | + | 4- |
| ‘peptydy „zidentyfikowane” |
Tabela 8b
| Sekwencje aminokwasowe zidentyfikowanych peptydów „wspólnych” w mapach peptydowych fragmentów Fab | |
| masa [Da] | sekwencja aminokwasowa |
| 1696,9 | PAVLNQPSSVSGSLGQR |
Analiza map peptydowych fragmentów Fab otrzymanych przeciwciał pozwoliła wskazać dziewięć peptydów „wspólnych” (Tabela 8a). Spośród nich tylko jeden, o masie 1696,9 Da, zidentyfikowano przy użyciu wyszukiwarki Mascot. Przypisano mu sekwencję aminokwasową, przedstawioną w Tabeli 9b. Mimo, że dla większości pozostałych peptydów otrzymano dobrej jakości widma fragmentacyjne, nie udało się ich zidentyfikować w oparciu o białkowe bazy danych.
Peptydy „różnicujące” w mapach peptydowych fragmentów Fab przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 oraz sekwencje aminokwasowe zidentyfikowanych peptydów „różnicujących” przedstawiono w Tabeli 9(a,b), zamieszczonej poniżej.
Bardziej szczegółowo, Tabela 9 przedstawia (a) peptydy „różnicujące” w mapach peptydowych fragmentów Fab przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 oraz (b) sekwencje aminokwasowe zidentyfikowanych peptydów „różnicujących”. Mapy peptydowe, otrzymane w wyniku trypsynolizy, analizowano przy użyciu spektrometrii mas MALDI TOF/TOF. Peptydy zidentyfikowano na podstawie uzyskanych map peptydowych oraz widm fragmentacyjnych z wykorzystaniem baz danych dostępnych w systemie Mascot.
Tabela 9a
| Mapy peptydowe fragmentów Fab przeciwciał monoklonalnych (Mab) - peptydy „różnicujące” | ||
| Klony Mab | masa [Da] | |
| 1944,1 1445,7 1515,8 1705,9’ 1111,5 1800,8 1580,9 1430,7 1884,0 1647,8 1819,8 1110,5 1872,1' 3300,5* | ||
| G-1-31-22 G-2-14-10 G-5-32-5 G-6-42-42 G-6-42-71 G-7-24-17 G-7-27-18 | - + -«•W!'...... + + + 4· + 4 + | + + 4 . - . f . + | ............ + + j 4 - . 4 4 - - - 4- + + + + । FZdZI ------ 4- 4- 4 - - - - 4 4 |
| ‘peptydy „zidentyfikowane” |
PL 238 020 Β1
Tabela 9b
| Sekwencje aminokwasowe zidentyfikowanych peptydów „różnicujących” w mapach peptydowych fragmentów Fab | |
| masa [Da] | sekwencja aminokwasowa |
| 1705,9 | LWIYGTSDLASGVPAR |
| 3300,5 | ATLTVDASSSTAYlQLSSLSSEDSAVYFCAR |
Analiza map peptydowych fragmentów Fab otrzymanych przeciwciał pozwoliła wskazać czternaście peptydów „różnicujących”, z których trzy, o masach: 1705,9 Da, 1872,1 Da i 3300,5 Da zidentyfikowano z wykorzystaniem białkowych baz danych (Tabela 9a). Peptydom: 1705,9 Da i 3300,5 Da przypisano sekwencje aminokwasowe, przedstawione w Tabeli 9b. W częściach Fab klonów: G-2-14-10, G-6-42-42 i G-6-42-71 rozpoznano trzy, klonów: G-1-31-22 i G-5-32-5 pięć a klonów G-7-24-17 i G-7-27-18 sześć „różnicujących” peptydów.
Profile peptydów „różnicujących” w mapach peptydowych fragmentów Fab
Mapy peptydowe fragmentów Fab przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 poddano szczegółowej analizie porównawczej. W Tabeli 10(a-e) przedstawiono profile peptydów „różnicujących” pochodzących z fragmentów Fab poszczególnych Mab i porównano je z profilami pozostałych klonów przeciwciał. Wśród peptydów „różnicujących” wskazano peptydy występujące w mapie peptydowej tylko jednego określonego klonu przeciwciał, opisywane dalej jako peptydy charakterystyczne dlatego klonu.
Bardziej szczegółowo, Tabela 10 przedstawia peptydy „różnicujące” w mapach peptydowych fragmentów Fab klonów: (a) G-6-42-42 i G-6-42-71, (b) G-2-14-10 i G-5-32-5, (c) G-1-31-22, (d) G-7-24-17, (e) G-7-27-18, otrzymane w wyniku trypsynolizy i analizowane przy użyciu spektrometrii mas MALDI TOF/TOF.
Tabela 10a
| Peptydy różnicujące” w mapach peptydowych fragmentów Fab klonów: G-6-42-42 i G-6-42-71 | |||
| Klony Mab | masa [Da] | ||
| 1580,9 | 1515,8 | 1944,1 | |
| G-6-42-42 | + | + | |
| G-6-42-71 | + | + | + |
| G-7-24-17 | + | + | |
| G-1-31-22 | + | - | |
| G-2-14-10 | - | - | + |
| G-5-32-5 | - | - | + |
| G-7-27-18 | - | - | - |
Dla przeciwciał: G-6-42-42 i G-6-42-71 zaobserwowano występowanie takich samych fragmentów „różnicujących” pochodzących zarówno z części Fab (Tabela 10a) jak i części Fc (Tabela 7a). Są to jedyne klony, wśród wytworzonych Mab, dla których otrzymano identyczne mapy peptydowe. Przyjęto, że reprezentują one jeden klon przeciwciał. W części Fab przeciwciał G-6-42-42 (G-6-42-71) rozpoznano charakterystyczny dla tego klonu peptyd o masie 1580,9 Da. Ponadto stwierdzono, że przeciwciała G-6-42-42 (G-6-42-71) różnią się od czterech z pięciu pozostałych klonów równoczesną obecnością fragmentów: 1515,8 Da i 1944,1 Da.
Tabela 10b
| Peptydy „różnicujące” w mapach peptydowych fragmentów Fab klonów: G-2-14-10 i G-5-32-5 | |||||
| Klony Mab | masa [Da] | ||||
| 1110,5 | 1647,8 | 1819,8 1705,9* | 1445,7 | 1944,1 | |
| G-2-14-10 | - + | + | |||
| G-5-32-5 | + | + | + | + | |
| G-1-31-22 | + | + | > | ||
| G-7-27-18 | - | - 4- | + | - | |
| G-7-24-17 | - | - | + | - | |
| G-6-42-42 (G-6-42-71) | - | - | - | - | + |
| ‘peptydy „zidentyfikowane” |
PL 238 020 Β1
W wyniku trawienia części Fab klonu G-2-14-10 uzyskano trzy peptydy „różnicujące” (TabeIa1 Ob), w tym jeden, o masie 1705,9 Da, który został zidentyfikowany (Tabela 9b). Wśród peptydów pochodzących z części Fab przeciwciał G-2-14-10 nie rozpoznano peptydu charakterystycznego dla tego klonu. W mapie peptydowej fragmentu Fab przeciwciał G-5-32-5 wskazano pięć „niezidentyfikowanych” peptydów „różnicujących”, w tym trzy charakterystyczne dla tego klonu: 1110,5 Da, 1647,8 Da i 1819,8 Da (Tabela 10b). Zarówno Mab G-2-14-10 jak i Mab G-5-32-5 różnią się od pozostałych czterech klonów jednoczesną obecnością peptydów: 1445,7 Da i 1944,1 Da. Profile peptydów „różnicujących”, przedstawione w Tabeli 10b, wskazują, że Mab G-2-14-10 i G-5-32-5 są różnymi klonami a jednocześnie każdy z nich jest odmienny od pozostałych klonów przeciwciał.
Tabela 10c
| Peptydy „różnicujące” w mapie peptydowej fragmentu Fab klonu G-1-31-22 | |||||
| Klony Mab | masa [Da] | ||||
| 1884,0 | 1705,9* | 1111,5 | 1445,7 | 1515,8 | |
| G-1-31-22 | 4- | 4* | 4* | + | |
| G-7-27-18 | 4- | + | + | ||
| G-7-24-17 | . i | + | - | 4- | |
| G-2-14-10 | - ; | 4- | 4- | ||
| G-5-32-5 | - | - | * | - | |
| G-6-42-42 | - | - | - | ||
| (G-6-42-71) | |||||
| ‘peptydy „zidentyfikowane” |
Analiza map peptydowych fragmentu Fab klonu G-1-31-22 pozwoliła na wskazanie pięciu peptydów „różnicujących” (Tabela 10c), z których jeden, o masie 1705,9 Da, został zidentyfikowany (Tabela 9b). W mapie peptydowej Mab G-1-31-22 rozpoznano charakterystyczny dla niego peptyd o masie 1884,0 Da. Przeciwciała G-1-31-22 różnią się od pozostałych klonów także równoczesną obecnością „niezidentyfikowanych” peptydów: 1111,5 Da, 1445,7 Da i 1515,8 Da.
Tabela 10d
| Peptydy „różnicujące” w mapie peptydowej fragmentu Fab klonu G-7-24-17 | |||||
| Klony Mab | masa [Dal | ||||
| 1430,7 | 1705,9* | 1111,5 1515,8 | 1800,8 | 1944,1 | |
| G-7-24-17 | + | + | + + | + | + |
| G-1-31-22 | + | + 4* | - | - | |
| G-7-27-18 | IW | + | J .........f i | w | |
| G-6-42-42 (G-6-42-71) | - | - | ।...........................;..................... | 1 . I j | + |
| G-2-14-10 | - | [—7 j | |||
| G-5-32-5 | - | - | - | ||
| ‘peptydy „zidentyfikowane” |
W mapie peptydowej fragmentu Fab klonu G-7-24-17 wskazano sześć peptydów „różnicujących” (Tabela 10d), z których jeden, o masie 1705,9 Da, został zidentyfikowany (Tabela 9b). W części Fab przeciwciał G-7-24-17 zlokalizowano charakterystyczny dla tego klonu peptyd o masie 1430,7 Da. Klon G-7-24-17 wyróżnia się także jednoczesną obecnością peptydów: 1111,5 Da, 1515,8 Da, 1800,8 Da i 1944,1 Da.
Tabela 10e
| Peptydy „różnicujące” w mapie peptydowej fragmentów Fab klonu G-7-27-18 | |||||
| Klony Mab | masa [Da] | ||||
| 1872,1* | 3300,5* | 1705,9* 1111,5 | 1445,7 | 1800,8 | |
| G-7-27-18 | 4- | 4· | ψ 4 | 4* | + |
| G-1-31-22 | - | - | 4- 4- | + | |
| G-7-24-17 | - | - | 4- + | - | + |
| G-2-14-10 | - | - | 4 | + | |
| G-5-32-5 | >· | - | |||
| G-6-42-42 (G-6-42-71) | - | - | - | - | |
| ‘peptydy „zidentyfikowane” |
PL 238 020 B1
Analiza mapy peptydowej fragmentu Fab klonu G-7-27-18 umożliwiła rozpoznanie sześciu peptydów „różnicujących” (Tabela 10e). Wśród nich są trzy, o masach: 1705,9 Da, 1872,1 Da i 3300,5 Da, które zidentyfikowano (Tabela 9b), Peptydy: 1872,1 Da i 3300,5 Da wykryto wyłącznie w mapie peptydowej Mab G-7-27-18. Ponadto klon G-7-27-18 różni się od pozostałych przeciwciał jednoczesnym występowaniem peptydów: 1111,5 Da, 1445,7 Da i 1800,8 Da.
Podsumowanie
W wyniku trawienia ficyną otrzymano fragmenty Fc i Fab przeciwciał: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18, a następnie w wyniku trypsynolizy otrzymano ich mapy paptydowe. Na podstawie uzyskanych map peptydowych oraz widm fragmentacyjnych podjęto próbę identyfikacji peptydów przy użyciu baz danych dostępnych w systemie Mascot.
Większość peptydów w mapach fragmentów Fc badanych Mab (Tabela 7a) stanowiły peptydy „wspólne” (9/13; 69%). Sekwencje aminokwasowe większości peptydów pochodzących z fragmentów Fc (9/13; 69%) odnaleziono w białkowych bazach danych (Tabela 7b). Uzyskane wyniki są zgodne z aktualnym stanem wiedzy, że fragmenty Fc stanowią konserwowaną w obrębie gatunku i izotypu część immunoglobulin, bez znaczenia dla specyficzności przeciwciał. Inaczej niż w przypadku fragmentów Fc, w mapach peptydowych fragmentów Fab przebadanych przeciwciał (Tabele: 8a, 9a) większość stanowiły peptydy „różnicujące” (14/23; 61%). Ponadto we fragmentach Fab zidentyfikowano (Tabele: 8b, 9b) tylko niewielką ilość peptydów (4/23; 17%), znacznie mniej niż we fragmentach Fc (17% vs 69%). Fragmenty Fab przeciwciał charakteryzuje znaczna zmienność sekwencji determinująca ich specyficzność, stąd bazy danych mogą być w tych obszarach niekompletne.
Główne znaczenie dla identyfikacji otrzymanych przeciwciał miała analiza porównawcza map peptydowych ich zmiennych części odpowiedzialnych za wiązanie antygenu, czyli fragmentów Fab. Różnicowanie klonów oparto przede wszystkim na obecności peptydów charakterystycznych dla poszczególnych klonów lub określonych grup klonów („peptydy różnicujące”). Najbardziej informujące było występowanie peptydów o unikalnych sekwencjach aminokwasowych, których nie zdeponowano dotychczas w białkowych bazach danych („niezidentyfikowane peptydy różnicujące”).
Szczegółowa analiza map peptydowych fragmentów Fab wykazała, że wytworzone przeciwciała różnią się ilością i profilem peptydów „różnicujących” (Tabela 10a-e). Wśród otrzymanych siedmiu Mab rozpoznano sześć odmiennych klonów przeciwciał i wykazano, że przeciwciała: G-6-42-42 i G-6-42-71 stanowią ten sam klon. Jest to zgodne z wynikami różnicowania wytworzonych Mab opartymi na profilach immunorektywności, które przedstawiono przykładzie 8.
P r z y k ł a d 10 Oznaczenia aktywności wytworzonych Mab w teście zahamowania hemaglutynacji
Przeciwciała monoklonalne wytworzone w wyniku szczepienia myszy rHA - A/H5N1/Qinghai i wyselekcjonowane w kierunku specyficzności wobec HA serotypu H5, zostały poddane badaniom przy użyciu testu HI. Test wykorzystuje zdolność przeciwciał specyficznie wiążących się z określonymi miejscami antygenowymi w cząsteczce HA do blokowania wiązania białka z receptorami na powierzchni erytrocytów, co manifestuje się utratą zdolności antygenu do aglutynacji erytrocytów.
Badaniom poddano oczyszczone przeciwciała: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18. Komercyjne Mab przeciwko HA H5 (Pierce/Thermo Scientific, Acris Antibodies), oznaczone: Mab 7, Mab 8, Mab 9, użyto jako przeciwciała referencyjne. Zgodnie ze specyfikacjami, przeciwciała rozpoznają HA H5 w teście HI (zestawienie A). Test HI wykonano przy użyciu LPAIV H5N3 jako antygenu. Hemaglutyninę tego szczepu AIV charakteryzuje najwyższa homologia z sekwencją źródłową immunogenu wśród hemaglutynin IV serotypu H5, stosowanych w procedurze otrzymywania Mab (zestawienia: E, F). Dotyczy to zarówno białka pełnej długości jak i podjednostki HA1, gdzie zlokalizowane są epitopy dla przeciwciał HI. Test HI przeprowadzono również z wykorzystaniem LPAIV H5N2 jako antygenu. Analizy porównawcze hemaglutynin AIV: H5N3, H5N1, H5N9 i H5N2, wykazały, że podjednostka HA1 HA wirusa H5N2 ma najniższą homologię z podjednostką HA1 immunogenu, jeżeli brać pod uwagę wszystkie wskaźniki homologii: Max Score, Total Score, Identities (zestawienie F). Zgodnie z wynikami badań z użyciem czterech szczepów LPAIV serotypu H5 metodą ELISA (przykład 7), reaktywność wszystkich otrzymanych klonów Mab wobec AIV H5N3 była najwyższa a wobec AIV H5N2 była jedną z niższych (Fig. 13) i stanowiła 24-35% reaktywności oznaczonej z wirusem H5N3 (Fig. 14). W teście HI zastosowano wirusy i antysurowice, certyfikowane przez IZSVe, które opisano poniżej w zestawieniu G.
PL 238 020 Β1
Zestawienie G Wirusy grypy i antysurowice użyte w badaniach aktywności hamowania hemaglutynacji wytworzonych Mab.
| Test HI z niskopatogennym wirusem ptasiej grypy H5N3 | Pochodzenie | ||
| Antygen | LPAIV | A/duck/IV775/04(H5N3) | x-OvO |
| Kontrola pozytywna | Antysurowica | A/duck/lt/775/04(H5N3) | x-OvO |
| Kontrola negatywna | Antysurowica | A/macaw/626/80(H7N7) | x-OvO |
| Test HI z niskopatogennym wirusem ptasiej grypy H5N2 | Pochodzenie | ||
| Antygen | LPAIV | A/turk/lt/80(H5N2) | x-OvO |
| Kontrola pozytywna | Antysurowica | A/turk/It/80(H5N2) | x-OvO |
| Kontrola negatywna | Antysurowica | A/macaw/626/80(H7N7) | x-OvO |
| LPAIV - niskopatogenny (LP) wirus ptasiej grypy (AIV) | |||
| x-OvO Limited (Wielka Brytania), Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Yenezie (IZSVe, Włochy) |
W teście zastosowano świeży preparat erytrocytów pobranych z krwi kurcząt SPF, uzyskany ze sterylnej hodowli w ZChD PIWet-PIB. Każdy wykonany test HI uwzględniał kontrolę pozytywną, która zawierała antysurowice przeciwko AIV H5N3 lub AIV H5N2, inkubowane z antygenami wirusowymi, odpowiednio: H5N3 lub H5N2. Niezależnie od użytego antygenu, kontrolami negatywnymi były próby zawierające antysurowicę przeciwko AIV H7N7. Dla wszystkich badanych przeciwciał i anty surowic wykonywano kontrole krwinek (wewnętrzna kontrola oznaczenia), które nie zawierały antygenu wirusowego. Do każdego testu HI wyznaczano jednostkę hemaglutynacji (HAU).
Dla oceny aktywności HI wytworzonych Mab, wykonano serie 2-krotnych rozcieńczeń wybranych klonów przeciwciał i ich mieszaniny w PBS-Dulbecco (Sigma-Aldrich) na 96-pozycyjnych płytkach o V-kształtnych dnach studzienek (CellStar/Greiner bio-one). W ten sposób uzyskano rozcieńczenia przeciwciał w zakresie od 2x do 4096(8192)x. W analogiczny sposób rozcieńczono referencyjne Mab przeciwko HA H5. Na każdej testowej płytce wykonywano seryjne rozcieńczenia antysurowic kontrolnych - przeciwko AIV H5N3 lub AIV H5N2 (kontrola pozytywna) i AIV H7N7 (kontrola negatywna), uzyskując rozcieńczenia od od 2x do 4096(8192)x. Następnie do studzienek zawierających Mab i antysurowice, rozcieńczone 4 i więcej razy w objętości końcowej 25 μΙ, dodawano po 25 μΙ zawiesiny AIV H5N3 lub AIV H5N2 zawierającej 4 HAU. Do studzienek przeznaczonych do kontroli krwinek zawierających 2-krotnie rozcieńczone Mab i antysurowice, dodawano po 25 μΙ PBS-Dulbecco. Po 25 min. wstępnej inkubacji w temperaturze pokojowej, do wszystkich studzienek dodawano po 25 μ11% zawiesiny erytrocytów. Wynik obserwowano po minimum 30 min. inkubacji z krwinkami.
Zgodnie z zasadą tesu, zahamowanie hemaglutynacji oceniane było wzrokiem przez porównanie z kontrolami krwinek. W przypadku prób Hl-pozytywnych, erytrocyty nie są aglutynowane przez antygeny wirusowe i dlatego swobodnie opadają na dno studzienek tak samo jak w próbach do kontroli krwinek. Miano HI przeciwciał monoklonalnych zdefiniowano jako najniższe stężenie przeciwciał powodujące zahamowanie hemaglutynacji. Miano HI antysurowic określono standardowo jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia, które hamuje aglutynację erytrocytów przez antygeny wirusowe. Wyniki testów HI dla Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17, G-7-2718 z użyciem AIV: H5N3 i H5N2 jako antygenów przedstawiono poniżej w Tabeli 11, łącznie z wynikami uzyskanymi dla przeciwciał referencyjnych i antysurowic kontrolnych.
Bardziej szczegółowo, Tabela 11 przedstawia wyniki testów HI dla Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17, G-7-27-18 z użyciem LPAIV: H5N3 i H5N2 (x-OvO) jako antygenów. Każdy wykonany test uwzględniał kontrolę pozytywną (antysurowice przeciwko AIV H5N3 lub AIV H5N2) i negatywną (antysurowica przeciwko AIV H7N7) oraz kontrole krwinek. W teście HI z użyciem AIV H5N3 zastosowano komercyjne Mab przeciwko HA H5 (Pierce/Thermo Scientific, Acris Antibodies) jako przeciwciała referencyjne.
PL 238 020 Β1
Tabela 11
| Mab i antysurowice kontrolne | Stężenia Mab [pg/mi] Rozcieńczenia antysurowicy | Wynik | |
| Aktywność HI | Miano HI | ||
| Test HI z niskopatogennym wirusem ptasiej grypy H5N3 | |||
| G-1-31-22 | 0,3 - 526 | ||
| G-2-14-10 | 0,8-1011 | - | - |
| G-5-32-5 | 0,9 -1008 | - | - |
| G-6-42-42 | 0,7-1034 | - | - |
| G-6-42-71 | 0,9-973 | - | - |
| G-7-24-17 | 0,5-877 | - | - |
| G-7-27-18 | 0,9-1023 | - | - |
| G-1-31-22 + G-2-14-10 + G-5-32-5 + G-6-42-42 + G-6-42-71 + G-7-24-17 + G-7-27-18 | 0,7 - 726 | - | - |
| Mab 9 (Pierce/Thermo Sci., Nr. kat. MA1-81928) | 0,1 - 125 | 4- | 7,8 pg/ml |
| Mab 7 (Acris Antibodies, Nr kat. AM00945PU-N) | 0,1 - 125 | + | 2,0 pg/ml |
| Mab 8 (Acris Antibodies, Nr kat. AM00941PU-N) | 0,1 - 125 | + | 1,0 pg/ml |
| Antysurowica przeciwko LPAIV H5N3 | 4x - 2048x (4096x) | 1:512, 1:1024 | |
| Antysurowica przeciwko LPAIV H5N7 | 4x - 2048x (4096x) | - | - |
| Test HI z niskopatogennym wirusem ptasiej grypy H5N2 | |||
| G-1-31-22 | 0,5 - 526 | - | - |
| G-2-14-10 | 1,0 - 1011 | - | - |
| G-5-32-5 | 1,0 - 1008 | - | - |
| G-6-42-42 | 1,0-1034 | - | - |
| G-6-42-71 | 0,9 - 973 | - | - |
| G-7-24-17 | 0,9 - 877 | π | - |
| G-7-27-18 | 1,0-1023 | - | |
| Antysurowica przeciwko LPAIV H5N2 | 4x -4096x | 4- | 1:512 |
| Antysurowica przeciwko LPAIV H5N7 | 4x - 4096x | - |
Testy HI wykazały, że żaden z klonów Mab, wytworzonych w wyniku szczepienia myszy rHA A/H5N1/Qinghai i wyselekcjonowanych w kierunku serotypowej specyficzności, nie ma zdolności hamowania hemaglutynacji przez AIV: H5N3 i H5N2. Dla Mab: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6- 42-42, G-6-42-71, G-7-24-17, G-7-27-18 nie wykazano aktywności HI, mimo zastosowania szerokiego zakresu stężeń przeciwciał: od sub-mikrogramowych do kilkuset-mikrogramowych, przy czym niektóre klony badano w stężeniach osiągających wartości ~1 mg, W tych samych warunkach, miana HI komercyjnych Mab, opisanych jako Mab 9, Mab 7 i Mab 8, oznaczone z użyciem AIV H5N3 wynosiły, odpowiednio: 7,8 pg/ml, 2,0 pg/ml i 1,0 pg/ml. Poprawność wykonania oznaczenia potwierdziły wysokie miana HI pozytywnych antysurowic kontrolnych (antysurowice przeciwko AIV H5N3 lub AIV H5N2) i brak aktywności HI negatywnej antysurowicy kontrolnej (antysurowica przeciwko AIV H7N7). Dodatkowo, obserwacja prób do kontroli krwinek nie wskazywała, żeby badane próby przeciwciał i antysurowic miały wpływ na jakość erytrocytów.
Przeciwciała: G-1-31-22, G-2-14-10, G-5-32-5, G-6-42-42, G-6-42-71, G-7-24-17 i G-7-27-18 odróżniają się od Mab 7 i Mab 8 o, odpowiednio, wąskim i szerokim zakresie specyficzności wobec HA H5 (Fig. 6), że przy zachowaniu szerokiej serotypowej specyficzności (Fig. 11, 13) nie hamują hemaglutynacji (Tabela 11). Negatywne wyniki testów HI dla wytworzonych Mab (Tabela 11) w połączeniu z pozytywnymi wynikami badań ich reaktywności z AIV: H5N3 i H5N2 w teście ELISA (Fig. 13) wskazują, że epitopy rozpoznawane przez otrzymane przeciwciała mogą znajdować się poza RBD.
Przykład 11 Użycie wytworzonych Mab do oceny jakości antygenów hemaglutyniny H5
Głównym wyzwaniem prac nad otrzymaniem podjednostkowych szczepionek przeciwko grypie, opartych na użyciu białek hemaglutyniny wyprodukowanych metodami inżynierii genetycznej,
PL 238 020 B1 jest otrzymanie antygenów przypominających HA wirusową. Szczególne znaczenie dla jakości HA szczepionkowej ma prawidłowość struktury podjednostki HA1, gdzie zlokalizowane są konformacyjne epitopy dla przeciwciał neutralizujących. Jednym ze wskaźników przydatności białek HA do produkcji szczepionek jest reaktywność przeciwciał o znanych właściwościach z wytworzonymi antygenami. Badania antygenowości znalazły szerokie za stosowanie w analizach białek HA produkowanych w postaci ciałek inkluzyjnych w komórkach bakterii, gdzie warunkiem otrzymania wartościowego antygenu szczepionkowego jest zastosowania odpowiednich metod renaturacji i oczyszczania białka (Sączyńska V 2014). Ze względu na to, że nowo otrzymane klony przeciwciał rozpoznają wyłącznie konformacyjne epitopy podjednostki HA1 i wykazują szeroki zakres specyficzności wobec HA H5, mogą być użyte z powodzeniem w badaniach właściwości antygenów do produkcji szczepionek przeciwko HPIV serotypu H5, niezależnie od źródłowej sekwencji antygenu szczepionkowego. Przewidywane jest również wykorzystanie wytworzonych przeciwciał do k ontroli stabilności antygenów i szczepionek przeciwko grypie. Innym możliwym zastosowaniem otrzyma nych Mab jest ich użycie do monitorowania jakości białek HA H5 przeznaczonych do stosowania lub już stosowanych jako reagenty w testach diagnostycznych na zasadzie sprawdzenia, czy konformacja epitopów serotypowo-specyficznych w antygenach jest prawidłowa.
W celu wykazania przydatności otrzymanych przeciwciał do oceny jakości antygenów HA H5, przeprowadzono badania antygenowości białka rHA - A/H5N1/Poland z bakteryjnego systemu ekspresji przy użyciu Mab: G-6-42-42, G-6-42-71 i G-7-27-18. Po oczyszczeniu i renaturacji, białko HA H5 (17-522 aa, ARRRKKR), wyprodukowane w oparciu o sekwencję HA szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006(H5N1) AIV (IBA), poddano analizom, które wykazały prawidłowość jego konformacji. Metody badania i właściwości białka opisano szczegółowo w przykładzie 7. Białko rHA - A/H5N1/Poland analizowano przed i po denaturacji w warunkach redukujących. Denaturację przeprowadzono przez rozcieńczenie preparatu białkowego w 2x stężonym buforze do denaturacji (4% SDS, 625 mM β-merkaptoetanol, 120 mM Tris-HCl, pH 8,0) w stosunku 1:1 (obj./obj.) i ogrzanie otrzymanego roztworu w 99°C w ciągu 10 minut. Badanie antygenowości przeprowadzono metodą ELISA na płytkach PolySorp, MediSorp, MaxiSorp i MultiSorp (NUNC) opłaszczonych konformacyjnym i zdenaturowanym preparatem rHA o czystości ~80%, który zawierał hemaglutyninę w stężeniu ~1 μg/ml. Na płytki, zablokowane przy użyciu 10% FBS/PBS, nałożono Mab: G-6-42-42, G-6-42-71 i G-7-27-18 po ich seryjnym, 2-krotnym rozcieńczeniu. Oznaczenie przeprowadzono w warunkach opisanych w przykładzie 7. Stężenia interpolowane z 4-parametrycznych krzywych miareczkowania przeciwciał na bakteryjnym białku HA wyznaczono w programie Gene5 (Bio-Tek).
Na Fig. 18 i 19 przedstawiono wyniki badań antygenowości konformacyjnego i poddanego denaturacji białka rHA - A/H5N1 /Poland z bakteryjnego systemu ekspresji przy użyciu przeciwciał G-6-42-42, G-6-42-71 i G-7-27-18. Różnice krzywych miareczkowania Mab: G-6-42-42, G-6-42-71 i G-7-27-18 na konformacyjnym i zdenaturownym białku rHA, wyrażające się wysokimi poziomami odczytu (A450) z oznaczeń na białku przed i bardzo niskimi po denaturacji, wskazują na utratę prawidłowej konformacji przez białko HA w warunkach denaturacji. W przeciwieństwie do wyników uzyskanych z konformacyjnym białkiem rHA, wartości A450 odczytane w testach ze zdenaturowanym antygenem zależały od rodzaju płytki użytej do jego wiązania i zmniejszały się wraz ze wzrostem hydrofilowości opłaszczanej powierzchni. Najwyższe sygnały z miareczkowania przeciwciał odczytano na antygenie, który po denaturacji zaadsorbowano na płytkach PolySorp o wysokim powinowactwie wiązania cząsteczek hydrofobowych. Stężenia interpolowane dla A450 = 1,0 z krzywych miareczkowania Mab: G- 6-42-42, G-6-42-71 i G-7-27-18 na zdenaturowanym bakteryjnym białku HA związanym z tym rodzajem płytki były, odpowiednio: 338-, 389- i 35-krotnie wyższe niż na białku konformacyjnym. Zdenaturowany antygen związany na płytkach MultiSorp o najwyższej hydrofilowości nie był rozpoznawany przez użyte w badaniach przeciwciała.
Wyniki opisane w niniejszym przykładzie potwierdzają wcześniejsze ustalenia, że otrzymane przeciwciała: G-6-42-42, G-6-42-71 i G-7-27-18 rozpoznają konformacyjne epitopy hemaglutyniny (przykłady: 5, 7). Pewien poziom reaktywności tych przeciwciał z białkiem rHA poddanym denaturacji, obserwowany w testach z użyciem niektórych rodzajów płytek, był przypuszczalnie efektem częściowej renaturacji białka po rozcieńczeniu w PBS w warunkach opłaszczania płytek.
Uzyskane wyniki potwierdzają przydatność otrzymanych przeciwciał do badań właściwości zarówno nowo wytworzonych białek HA H5 jak i do detekcji zmian tych białek w trakcie przechowywania. Dotyczy to zarówno antygenów przeznaczonych do produkcji szczepionek przeciwko IV serotypu H5 np. HPAIV H5N1 jak i antygenów stosowanych w testach diagnostycznych.
PL 238 020 B1
P r z y k ł a d 12 Zastosowanie wytworzonych Mab w testach diagnostycznych
W celu wykazania możliwości zastosowania otrzymanych Mab w testach diagnostycznych, opracowano prototypowy blokujący test ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 (bELISA H5). W teście bELISA H5 wykorzystano klon G-7-27-18. Jako antygen użyto białko 17-530 aa (ARRRKKR, 6x His) o sekwencji HA wirusa H5N1 szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006, które wyprodukowano w bakulowirusowym systemie ekspresji (OET). Właściwości białka opisano szczegółowo w przykładzie 2. Test bELISA H5 został zoptymalizowany. Oznaczenia na płytkach polistyrenowych o zróżnicowanej polarności umożliwiły wybór płytki najlepszej dla wiązania antygenu i prezentacji epitopu dla Mab G-7-27-18. W dodatkowych eksperymentach określono korzystne warunki inkubacji płytek na poszczególnych etapach procedury oznaczania. Optymalne stężenia/rozcieńczenia reagentów zostały wyznaczone przez miareczkowanie.
W optymalnym wariancie testu bELISA H5, płytki MediSorp (NUNC) opłaszczano antygenem w stężeniu 0,5 pg/ml (50 pl/dołek) w ciągu nocy w 2-8°C. Niespecyficzne miejsca wiązania na płytkach blokowano w ciągu 1 h w temperaturze pokojowej przy użyciu „Protein-Free T20 (PBS) Blocking Buffer” (200 pl/dołek) firmy Pierce. Do dołków płytki, przeznaczonych dla kontroli Mab, dodawano po 100 pl, natomiast do pozostałych dołków płytki po 50 pl buforu inkubacyjnego (1% BSA/PBS). Kontrolne i badane próby surowicy rozcieńczano w dołkach płytki przez dodanie 50 pl surowicy do 50 pl 1% BSA/PBS. Próby inkubowano na płytkach w ciągu 1 h w 37°C z mieszaniem (150 rpm). Następnie na płytki nakładano Mab 7-27-18 (50 pl/dołek), rozcieńczone do 1 pg/ml w „Antibody Stabilizer PBS” (Candor Bioscience) i ponownie inubowano płytkę w ciągu 1 h w 37°C przy 150 rpm. Do wykrywania Mab związanych z antygenem stosowano przeciwciała przeciwko mysim przeciwciałom klasy IgG, specyficzne wobec łańcucha γ, wyznakowane HRP (Sigma-Aldrich). Wtórne przeciwciała rozcieńczano 1:3500 w „HRP-Protector” (Candor Bioscience) i inkubowano na płytkach (50 pl/dołek) w ciągu 1 h w 37°C przy 150 rpm. TMB (Sigma-Aldrich) stosowano jako substrat HRP (50 pl/dołek). Po 15 min. inkubacji w temperaturze pokojowej, reakcję hamowano 0,5 M roztworem H2SO4 (50 pl/dołek). Absorpcję prób odczytywano przy λ = 450 nm.
Oznaczenia przeprowadzano w obecności prób kontrolnych. Kontrolę maksymalnego wiązania Mab 7-27-18 z antygenem HA H5 (kontrola Mab) uzyskano w dołkach płytki, do których nie dodawano surowicy. Jako kontrolę negatywną stosowano normalną surowicę kurcząt (Abcam), natomiast jako kontrole pozytywne antysurowice uzyskane przez szczepienie kurcząt SPF inaktywowanymi AIV: H5N3 i H5N2 (x-OvO). Antysurowica przeciwko AIV H5N3 stanowiła silną a przeciwko AIV H5N2 słabą kontrolę pozytywną. Zgodnie z powyższym protokołem wykonano 13 testów bELISA H5. Kontrolę Mab oznaczano w 8 powtórzeniach na każdej płytce. Pozostałe próby kontrolne i badane próby surowicy analizowano w 2 powtórzeniach. Poziom hamowania wiązania Mab 7-27-18 z antygenem przez surowice, wyrażony w procentach, obliczano wg wzoru: % hamowania = 100 - [(A450 próby/A450 kontroli Mab) x 100]. W obliczeniach uwzględniano średnie wartości A450 kontroli Mab i analizowanych prób.
Wstępną ocenę wartości diagnostycznej testu bELISA H5 przeprowadzono z wykorzystaniem dostępnych komercyjnie surowic kurcząt (Abcam, x-OvO), surowic otrzymanych z ZChD PIWet-PIB, a także prób surowicy przygotowanych w trakcie badań immunizacyjnych kurcząt, przeprowadzonych przez IBA. Surowice przeznaczone do analizy były uprzednio przebadane na obecność przeciwciał przeciwko HA wirusów grypy przy użyciu testu HI. Test HI umożliwia klasyfikację zwierząt jako anty HA-pozytywne lub anty-HA negatywne, jak również określenie serotypowej specyficzności antysurowic. W procedurach walidacji testów do diagnostyki zakażeń IV test HI traktowan y jest jako tzw. złoty standard. Miano HI normalnej surowicy kurcząt (Abcam) oraz surowic pochodzących z badań immunizacyjnych (IBA) zostało oznaczone w IBA przy zastosowaniu AIV H5N2 (x-OvO) jako antygenu. Antysurowice (x-OvO), certyfikowane przez IZSVe, charakteryzowano przyjmując specyfikowane wartości miana HI.
Surowice anty H5-negatywne pochodziły od grupy nieszczepionych kurcząt zróżnicowanej pod względem typu, rasy, wieku i warunków chowu. Surowice anty H5-negatywne, pozytywne wobec HA serotypów H1-H4 i H6-H16 (x-OvO) zostały otrzymane przez szczepienie kurcząt SPF inaktywowanymi AIV, które wymieniono w zestawieniu C. Surowice anty H5-pozytywne uzyskano przez szczepienie zwierząt przy użyciu antygenów HA H5: kurcząt SPF inaktywowanymi AIV: H5N1, H5N2, H5N3, H5N9 (x-OvO), wymienionymi w zestawieniu C oraz kurcząt z chowu ściółkowego rekombinowanym białkiem HA H5 (rH5-E. coli). Białko rH5-E. coli (pierwszy wariant antygenowy) wytworzono w IBA w oparciu o sekwencję HA wirusa H5N1 szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006. Właściwości białka opisano w przykładzie 7. Do otrzymania antysurowic wykorzystano antygeny HA H5 o zróżnicowa
PL 238 020 Β1 nej sekwencji. Wskaźniki względnej homologii tych antygenów, przedstawiono w zestawieniach: E i F. Próby użyte do wstępnej oceny wartości diagnostycznej testu bELISA H5 zostały opisane szczegółowo w poniższym zestawieniu.
Zestawienie H Próby surowic kurcząt analizowane testem bELISA H5 (IBA) z użyciem Mab G-7-27-18.
| Surowice | Ilość kurcząt/serii | Ilość prób | Miano HI | Pochodzenie |
| Kontrole do testu bELISA | ||||
| Kontrola negatywna Normalna surowica kurcząt | 1 seria | 1 | < 1:86 | Abcam (Nr kat. ab7477) |
| Kontrola pozytywna, silna anty AIV H5N3 (l)1 | 1 seria | 1 | 1:5127 | x-OvO* |
| Kontrola pozytywna, słaba anty AIV H5N2 (3)' | 1 seria | 1 | 1:5127 | x-OvO* |
| Anty H5-negatywne (1) kurcząt SPF typu nieśnego2 | 10 | 18 | n.d.s | ZChD PlWet-PIB ** |
| kurcząt typu nieśnego3 | 30 | 130 | < 1:86 | IBA*** |
| kurcząt typu mięsnego4 | 42 | 61 | < 1:86 | kontrole w badaniach immunizacyjnych |
| Anty H5-negatywne (2) | ||||
| anty AIV: H1-H4, H6-H12, | ||||
| H14-H161 | po 1 serii | 20 | pozytywne | x-OvO* |
| anty AIVH13‘ | 2 serie | 2 | pozytywne7 | x-OvO* |
| Anty H5-pozytywne (1) | ||||
| anty AIV H5N11 | 1 seria | 1 | 1:5127 | x-OvO* |
| anty AIV H5N21 | 3 serie | 3 | 1:256; 1:5127 | x-OvO* |
| anty AIV H5N31 | 3 serie | 3 | 1:5127 | x-OvO* |
| anty AIV H5N91 | 3 serie | 3 | 1:256; 1:5127 | x-OvO* |
Anty H5-pozytywne (2) , 5 69 115 1:8-1:5126 IBA”* kurczęta typu nieśnego badania immumzacyjne 'Kurczęta SPF szczepiono inaktywowanymi AIV serotypów: H1-H16 (Zestawienie C) 2Krew pobrano w 63 i/lub 77 dniu życia kurcząt SPF typu nieśnego (White Leghorn) (1 lub 2 pobrania od 1 kury).
3Krew pobrano od kurcząt typu nieśnego (Rossa 1) z chowu ściółkowego w 49, 56, 63, 70 i 77 dniu życia zwierząt (3-5 pobrań od 1 kury).
4 Krew pobrano od kurcząt typu mięsnego (Ross 308) z chowu ściółkowego w 21, 35, 38, 42 i 49 dniu życia zwierząt (1-4 pobrania od 1 kury).
5 Kurczęta typu nieśnego z chowu ściółkowego (Rossa 1) szczepiono białkiem rH5- E. coli z sekwencją HA wirusa Al H5N1 szczepu A/swan/Poland/305-135V08/2006 (EpiFIuDatabase Accession No. EPI156789). Krew pobrano 1 i/lub 2 tygodnie po podaniu 2-giej dawki antygenu, w 56 i/lub 63 dniu życia zwierząt albo w 70 i/lub 77 dniu życia zwierząt (1 lub 2 pobrania od 1 kury).
6oznaczono stosując AIV H5N2 (x-OvO) jako antygen i HIU=1:8 (IBA) 7zgodnie ze specyfikacją (x-OvO) 8nie oznaczono *x-OvO Limited (Wielka Brytania), Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe, Włochy) **Zakład Chowu Drobiu, Państwowy Instytut Weterynaryjny-Państwowy Instytut Badawczy (Puławy, Polska) ***lnstytut Biotechnologii i Antybiotyków (Warszawa, Polska)
PL 238 020 Β1
Analizy surowic H5-negatywnych testem bELISA H5 umożliwiły wyznaczenie wartości „cut-off” opracowanego testu (średnia wartość % hamowania + 2xSD) a przez to interpretację wyników oznaczeń badanych prób. Wartości % hamowania wyższe od wartości „cut-off oznaczają, że próby są seropozytywne a niższe, że są seronegatywne. Wyniki analiz prób przy użyciu testu bELISA H5 w odniesieniu do wartości „cut-off’ zostały zaprezentowane na Fig. 20. Dane z oznaczeń kontroli negatywnej, surowic anty-Hi (H2-H16)-pozytywnych przedstawiono jako średnia wartość % hamowania z określonej liczby niezależnych oznaczeń (n) poszczególnych prób. Wyniki pozostałych analiz przedstawiono jako średnia wartość % hamowania z określonej liczby prób (n) w poszczególnych grupach surowic.
Średnie wartości % hamowania kontroli negatywnej, anty H5-negatywnych surowic kurcząt nieszczepionych oraz szczepionych AIV serotypów innych niż H5 (H1-H4, H6-H16) znalazły się na Fig. 20 poniżej wartości „cut-off’. Z kolei średnie wartości % hamowania anty H5-pozytywnych surowic kurcząt szczepionych AIV serotypu H5 oraz białkiem rH5-E. coli znalazły się powyżej wartości „cut-off’. Uzyskane wyniki wskazują, że prototypowy test bELISA H5 pozwala na odróżnienie kurcząt szczepionych antygenami HA H5 od kurcząt anty H5-negatywnych. Co ważne, antysurowice przeciwko AIV serotypów: H1-H4 i H6-H16 nie dają reakcji krzyżowych w opracowanym teście. Przypuszczalnie test bELISA H5 umożliwiłby także jednoznaczną diagnostykę zwierząt zakażonych IV serotypu H5, takimi jak HPAIV H5N1. W przypadku szczepień przeciwko HPAIV przy użyciu białek HA H5, test bELISA H5, razem z testem do wykrywania przeciwciał przeciwko innym antygenom IV np. neuraminidazie, mógłby znaleźć zastosowanie jako tzw. test DIVA przeznaczony do odróżniania zakażonych zwierząt od zwierząt szczepionych.
Charakterystykę prototytopowego testu bELISA H5 poszerzono o wstępne wyznaczenie kluczowych parametrów walidacyjnych testu diagnostycznego. Powtarzalność oznaczeń określono przez wykonanie niezależnych oznaczeń kontroli Mab, kontroli negatywnej (normalna surowica kurcząt) i kontroli pozytywnych (antysurowice przeciwko AIV: H5N3 i H5N2). Specyficzność analityczną (Asp) i diagnostyczną (Dsp) testu oceniono przez obliczenie udziału prób oznaczonych jako prawdziwie negatywne (TN) wśród surowic kurcząt szczepionych AIV serotypów: H1-H4, H6-H16 (Asp) oraz anty H5-negatywnych surowic nieszczepionej grupy kurcząt (Dsp). Czułość diagnostyczną (Dse) testu bELISA H5 wyznaczono przez obliczenie udziału prób oznaczonych jako prawdziwie pozytywne (TP) wśród surowic kurcząt szczepionych AIV serotypu H5 (H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9) albo białkiem rH5-E. coli. Wyniki oznaczeń parametrów walidacyjnych testu bELISA H5 przedstawiono w Tabeli 12, zamieszczonej poniżej.
Bardziej szczegółowo, Tabela 12 przedstawia wyniki wstępnych oznaczeń parametrów walidacyjnych blokującego testu ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko HA H5 (bELISA H5) w surowicach kurcząt, który opracowano i zoptymalizowano w IBA. W teście bELISA H5 (IBA) wykorzystano Mab G-7-27-18. Analizowane próby były uprzednio klasyfikowane jako anty H5 pozytywne lub negatywne na podstawie wyników testu HI. Powtarzalność oznaczeń określono przez wykonanie niezależnych oznaczeń prób kontrolnych. Specyficzność analityczną (Asp) i diagnostyczną (Dsp) testu oceniono przez obliczenie udziału prób oznaczonych jako prawdziwie negatywne (TN) wśród anty H5-negatywnych surowic. Czułość diagnostyczną (Dse) wyznaczono przez obliczenie udziału prób oznaczonych jako prawdziwie pozytywne (TP) wśród anty H5-pozytywnych surowic.
Claims (12)
1. Kompozycja przeciwciał monoklonalnch przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5 wiążących się z epitopami antygenów H5, lub ich fragmentów Fab, zawierająca:
i. G-1-31-22 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-1-31-22 zdepo- nowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3292, ii. G-2-14-10 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-2-14-10 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3293, iii. G-5-32-5 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-5-32-5 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3294, iv. G-6-42-42 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-6-42-42 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3295,
v. G-7-24-17 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-7-24-17 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3296, oraz vi. G-7-27-18 wyprodukowane przez linię komórkową mysiej hybrydomy G-7-27-18 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3297.
2. Kompozycja przeciwciał monoklonalnych według zastrz. 1, znamienna tym, że hemaglutynina pochodzi z wirusa grypy serotypu H5 w tym H5N1, H5N2, H5N3 i H5N9.
3. Kompozycja farmaceutyczna lub diagnostyczna zawierająca kompozycję przeciwciał zdefiniowanych w zastrz. 1-2 oraz odpowiedni nośnik lub znacznik.
4. Kompozycja przeciwciał określonych w zastrz. 1-2 do zastosowania w diagnozowaniu lub leczeniu zakażeń wywołanych przez wirusa grypy serotypu H5.
5. Linie komórkowe mysich hybrydom wybrane z grupy obejmującej:
(i) G-1-31-22 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3292, (ii) G-2-14-10 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3293, (iii) G-5-32-5 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3294, (iv) G-6-42-42 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3295, (v) G-7-24-17 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3296 i (vi) G-7-27-18 zdeponowaną w DSMZ pod numerem DSM ACC3297.
6. Sposób diagnozowania infekcji wirusami grypy serotypu H5 in vitro obejmujący kontaktowanie próbki biologicznej z kompozycją przeciwciał monoklonalnych zdefiniowaną w jednym z zastrz. 1-3 i detekcję wiązania się rzeczonych przeciwciał z wirusem grypy serotypu H5 lub białkiem hemaglutyniny H5.
7. Zestaw diagnostyczny do wykrywania infekcji wirusami grypy serotypu H5 zawierający kompozycję przeciwciał monoklonalnych jak zdefiniowano w jednym z zastrz. 1-3, oraz reagenty do wykrywania przeciwciał lub ich fragmentów związanych z wirusem grypy serotypu H5 lub białkiem hemaglutyniny H5.
8. Zestaw diagnostyczny do wykrywania, oznaczania ilościowego lub półilościowego wirusów grypy serotypu H5 w próbkach biologicznych, zawierający kompozycję przeciwciał monoklonalnych jak zdefiniowano w jednym z zastrz. 1-3 oraz oraz narzędzia i reagenty powszechnie stosowane w testach immunologicznych
9. Zestaw diagnostyczny do wykrywania, oznaczania ilościowego lub półilościowego przeciwciał przeciwko wirusom grypy serotypu H5 w próbkach biologicznych zawierający kompozycję przeciwciał monoklonalnch jak zdefiniowano w jednym z zastrz. 1-3 oraz narzędzia i reagenty powszechnie stosowane w testach immunologicznych
10. Zestaw diagnostyczny według jednego z zastrz. 7-9, w którym przeciwciała są w formie nieizolowanej lub są wyizolowane i oczyszczone.
11. Zestaw diagnostyczny według jednego z zastrz. 7-10, znamienny tym, że wykorzystywany jest w testach wybranych z grupy obejmującej: test immunoenzymatyczny, korzystnie bELISA H5, immunofluorescencyjny, immunochemiluminescencyjny, radioimmunologiczny, immunochromatograficzny, immunodyfuzyjny, immunoprecypitacyjny, test z użyciem immunoczujników, które mogą być stosowane jako tzw. testy DIVA do odróżniania zakażonych zwierząt od zwierząt szczepionych.
12. Zestaw diagnostyczny według jednego z zastrz. 7-11, znamienny tym, że jest wykorzystywany do odróżniania zakażonych zwierząt od zwierząt szczepionych jako tzw. test DIVA.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL418671A PL238020B1 (pl) | 2016-09-12 | 2016-09-12 | Kompozycja przeciwciał monoklonalnych przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5 i jej zastosowanie, hybrydomy produkujące rzeczone przeciwciała, sposób diagnozowania infekcji wirusami grypy serotypu H5 oraz zestawy diagnostyczne |
| US16/332,782 US10696737B2 (en) | 2016-09-12 | 2017-09-11 | Monoclonal antibodies against hemagglutinin of h5-serotype influenza viruses and their uses, hybridomas producing said antibodies, compositions and diagnostic kits |
| EP17784704.3A EP3510045B1 (en) | 2016-09-12 | 2017-09-11 | Monoclonal antibodies against hemagglutinin of h5-serotype influenza viruses and their uses, hybridomas producing said antibodies, compositions and diagnostic kits |
| PCT/PL2017/000084 WO2018048317A1 (en) | 2016-09-12 | 2017-09-11 | Monoclonal antibodies against hemagglutinin of h5-serotype influenza viruses and their uses, hybridomas producing said antibodies, compositions and diagnostic kits |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL418671A PL238020B1 (pl) | 2016-09-12 | 2016-09-12 | Kompozycja przeciwciał monoklonalnych przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5 i jej zastosowanie, hybrydomy produkujące rzeczone przeciwciała, sposób diagnozowania infekcji wirusami grypy serotypu H5 oraz zestawy diagnostyczne |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL418671A1 PL418671A1 (pl) | 2018-03-26 |
| PL238020B1 true PL238020B1 (pl) | 2021-06-28 |
Family
ID=60117726
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL418671A PL238020B1 (pl) | 2016-09-12 | 2016-09-12 | Kompozycja przeciwciał monoklonalnych przeciwko hemaglutyninie wirusów grypy serotypu H5 i jej zastosowanie, hybrydomy produkujące rzeczone przeciwciała, sposób diagnozowania infekcji wirusami grypy serotypu H5 oraz zestawy diagnostyczne |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10696737B2 (pl) |
| EP (1) | EP3510045B1 (pl) |
| PL (1) | PL238020B1 (pl) |
| WO (1) | WO2018048317A1 (pl) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2018212924A1 (en) * | 2017-01-30 | 2019-07-04 | Cedars-Sinai Medical Center | Diagnosis of scleroderma |
| CN111117970B (zh) * | 2020-01-20 | 2020-11-17 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一种识别n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体及其应用 |
| KR102517114B1 (ko) * | 2020-08-28 | 2023-04-03 | 원광대학교산학협력단 | 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트 |
| CN112175072B (zh) * | 2020-09-23 | 2022-06-28 | 浙江大学医学院附属第一医院 | 抗h5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体zju5-01及其应用 |
| KR102605065B1 (ko) * | 2021-10-14 | 2023-11-22 | 원광대학교산학협력단 | 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5n1에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8124092B2 (en) * | 2007-03-13 | 2012-02-28 | Institute For Research In Biomedicine | Antibodies against H5N1 strains of influenza A virus |
| EP2947094B1 (en) * | 2007-09-13 | 2018-11-14 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Monoclonal antibodies specific to hemagglutinin and neuraminidase from influenza virus h5-subtype or n1-subtype and uses thereof |
| US8900585B2 (en) * | 2010-10-20 | 2014-12-02 | New York Blood Center, Inc. | Influenza hemagglutinin-specific monoclonal antibodies for preventing and treating influenza virus infection |
| WO2013105896A1 (en) * | 2012-01-12 | 2013-07-18 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Monoclonal antibodies targeting neutralizing epitopes on h5 influenza virus of clade 2.3 |
-
2016
- 2016-09-12 PL PL418671A patent/PL238020B1/pl unknown
-
2017
- 2017-09-11 WO PCT/PL2017/000084 patent/WO2018048317A1/en active Search and Examination
- 2017-09-11 US US16/332,782 patent/US10696737B2/en active Active
- 2017-09-11 EP EP17784704.3A patent/EP3510045B1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3510045A1 (en) | 2019-07-17 |
| PL418671A1 (pl) | 2018-03-26 |
| EP3510045B1 (en) | 2021-11-03 |
| WO2018048317A8 (en) | 2018-05-03 |
| US10696737B2 (en) | 2020-06-30 |
| WO2018048317A1 (en) | 2018-03-15 |
| US20190352375A1 (en) | 2019-11-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3510045B1 (en) | Monoclonal antibodies against hemagglutinin of h5-serotype influenza viruses and their uses, hybridomas producing said antibodies, compositions and diagnostic kits | |
| AU2008297594B2 (en) | Monoclonal antibodies specific to hemagglutinin and neuraminidase from influenza virus H5-subtype or N1-subtype and uses thereof | |
| US20190142931A1 (en) | Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto | |
| WO2010073647A1 (ja) | 抗ヒトインフルエンザウイルス・ヒト型抗体 | |
| JP5886194B2 (ja) | インフルエンザ感染の診断および／または処置のための組成物および方法 | |
| KR102122618B1 (ko) | 인플루엔자 중화를 위한 작용제 | |
| CA2700430A1 (en) | Influenza virus haemagglutinin-specific monoclonal antibodies | |
| JP2014506580A (ja) | インフルエンザの治療および診断のための組成物および方法 | |
| US20210046176A1 (en) | Methods of generating broadly protective vaccine compositions comprising neuraminidase | |
| KR20160054161A (ko) | 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단용 단클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이 단클론항체를 사용하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 감염 진단방법 | |
| PL235555B1 (pl) | Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA ) wirusa grypy H5N1, kompozycja zawierająca polipeptyd i jej zastosowanie, przeciwciało wiążące się specyficznie z polipeptydem oraz sposób otrzymywania tego polipeptydu | |
| US11566064B2 (en) | Hemagglutinin-specific antibodies and uses thereof | |
| KR20150112584A (ko) | 인플루엔자 a 바이러스 특이적 단클론 항체 및 이를 이용한 인플루엔자 감염 치료 및 진단 방법 | |
| JP6525214B2 (ja) | 抗体またはその可変領域を含む抗体断片、抗原ポリペプチド、およびその利用 | |
| WO2014077777A1 (en) | Monoclonal antibodies targeting neutralizing epitopes on h7 influenza viruses | |
| Cabral et al. | Development and characterization of neutralizing monoclonal antibodies against the pandemic H1N1 virus (2009) | |
| US20230077716A1 (en) | Antibodies protective against influenza b | |
| Pascha et al. | Fc-dependent protective efficacy of non-inhibitory antibodies targeting influenza A virus neuraminidase is limited by epitope availability | |
| Cabral et al. | Development of neutralizing monoclonal antibodies against the pandemic H1N1 virus (2009) using plasmid DNA immunogen | |
| WO2010110737A1 (en) | Monoclonal antibody against a conserved domain of m2e polypeptide in influenza viruses | |
| JPWO2015068781A1 (ja) | インフルエンザウイルスａ型のグループ１に対して広域な中和活性を有する抗体 |