KR20100128296A - 항원- 또는 리간드-특이적 결합 단백질의 확인 - Google Patents

항원- 또는 리간드-특이적 결합 단백질의 확인 Download PDF

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Abstract

본 발명은 척추동물 숙주 세포에서 항체 또는 그 단편과 같은 결합 단백질의 다종 컬렉션을 시험관내 생성, 발현 및 스크리닝하고, 리간드- 또는 항원-결합 단백질을 확인 및 분리하기 위한 신규 방법들을 개시한다. 본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 벡터 구성물로부터 결합 단백질의 다종 컬렉션의 발현을 허용하며, 이것은 선택적으로 척추동물 숙주 세포로의 전달 및 발현시에 다종 결합 단백질 컬렉션을 인시튜 생성할 수 있다.

Description

항원- 또는 리간드-특이적 결합 단백질의 확인{IDENTIFICATION OF ANTIGEN- OR LIGAND-SPECIFIC BINDING PROTEINS}
본 발명은 척추동물 세포에서 다종 컬렉션의 결합 단백질을 시험관내 생성, 발현 및 스크리닝하기 위한 신규 방법을 개시하며, 이로써 리간드- 또는 항원-반응성 결합 단백질의 확인 및 분리가 가능해진다. 특히, 본 발명은 원하는 항원 또는 리간드에 특이적인 항체 또는 그 단편과 같은 결합 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 레트로바이러스 발현, 분리 및 확인을 위한 방법에 관한 것이다.
매우 많은 수의 장애 및 질환에 있어서 진단 및 치료 용도를 위한 특이적 고친화성 결합 단백질의 분리에서 디스플레이 기술이 중요한 역할을 하고 있다. 이런 기술들은 항체 조작, 합성 효소, 프로테오믹스, 및 세포-프리 단백질 합성에 이르는 넓은 분야로 확대되고 있다. 생물분자 디스플레이 기술에 의해 모듈 방식 코딩된 생물분자의 큰 풀을 구축하고, 이들을 디스플레이하여 특성을 선별하고, 구조를 신속히 특성화(디코딩)하는 것이 가능하며, 대규모로 단백질 다양성에 접근하여 분석하는데 특히 유용하다. 최근, 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 미생물 디스플레이에 의한 항체의 분리로 인하여 시험관내 디스플레이 기술이 주목을 받고 있으며, 이것은 현재 항체 및 단백질 조작 플랫폼에서 주류가 되고 있다. 그러나, 미생물 발현 및 디스플레이 시스템은 항체 같은 커다란 다이머 형태의 척추동물 단백질에는 특히 제한적이라는 문제가 있다. 이것은 조작된 항체 단편의 디스플레이가 필요한 이러한 발현 시스템에서는 일반적으로 전장 항체를 발현할 수 없고, 더구나 글리코실화의 결여, 샤프롱 단백질의 부재, 아세포 구획의 결여 및 진핵 세포 특이적 단백질 이동이 있기 때문이며, 이들은 개별적으로 그리고 집단적으로 미생물 발현된 포유동물 단백질에서 단백질 접힘에 인공적인 부분을 만든다. 최근, 효모, 식물 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵 숙주 세포를 사용한 시험관내 디스플레이 방법이 또한 개발되었다. 효모 및 식물 세포 발현 시스템에서도 역시 글리코실화 및 특정한 척추동물 및 포유동물 세포 특이적 샤프롱의 결여가 문제가 되며, 따라서 단백질 접힘에 관하여 동일한 제한이 이러한 시스템에서 척추동물 단백질을 발현하는데 적용된다. 항체 같은 커다란 재조합 단백질의 발현, 적절한 단백질 접힘 및 번역후 변형은 척추동물 발현 시스템에서만 합당한 효능 및 품질로 발생한다고 예상될 수 있으며, 계통발생적으로 가장 가까이 관련된 세포 시스템에서 단백질이 발현되는 것이 이상적이다.
따라서, 설치류나 인간으로부터 유래하는 항체 같은 치료적으로 흥미로운 단백질은 설치류나 인간 세포에서 발현되는 것이 이상적이며, 임상 등급의 전장 치료용 항체의 생산에 있어서 이러한 종들로부터의 발현 시스템만이 규제당국에 의해서 승인되는 것은 당연하다. 그러나, 척추동물 및 포유동물 세포 기반 발현 시스템은 힘이 들고, 안정하게 생산되는 셀라인과 클론을 확립하는데 긴 시간 프레임이 필요하며, 이러한 세포의 효과적이며 제어 가능한 유전자 변형이 대체로 쉽게 이루어지는 일이 아니기 때문에, 스크리닝 및 디스플레이 방법에 있어서 이들 시스템은 매력이 적다. 예를 들어, DNA 트랜스펙션 방법에서는 트랜스펙션된 세포에 일시적으로 또는 안정하게 편입되는 DNA 구성물의 수를 제어할 수 없고, 이것은 단백질 라이브러리의 클론 발현과 그에 따른 청정 유전자의 표현형 스크리닝을 방해한다. 대안적인 바이러스 시스템은 클론 발현의 적절한 제어, 유전자 구성물의 안정한 유지가 불가능하며, 및/또는 이러한 시스템이 흔히 표적 세포에서 세포병리학적 효과를 야기함으로써(예를 들어, 우두 바이러스 발현), 단백질 클론이 디스플레이될 수 없고 및/또는 그에 이어서 예를 들어 항원과의 특이적 결합과 같은 특정 표현형으로 부화될 수 없다는 문제가 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 선행기술의 원핵 및 진핵 유전자 발현 및 선별 시스템의 상기 언급된 한계 및 단점들을 전부 분명히 극복하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법은 포유동물 세포, 특히 B 림프구 셀라인에서, 특히 항체와 같은 결합 단백질의 안정한 레트로바이러스 발현을 이용하며, 이로써 항체 단백질의 안정한, 바람직하게는 클론 발현이 적절한 글리코실화, 샤프롱 단백질 및 단백질 이동의 존재 하에 달성되고, 적절한 단백질 접힘이 확보되고, 항원 결합 항체 클론에 대한 효과적인, 원한다면 반복적인 스크리닝이 허용된다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예가 전구체 림프구에서 항체 또는 그 단편의 레트로바이러스 발현에 기초하므로, 본원에 개시된 기술을 '레트로사이트 디스플레이(Retrocyte Display)' 레트로바이러스 preB 림프구 디스플레이(retroviral preB lymphocyte display))라고 명명한다.
발명의 개요
본 발명은 일반적으로 치료용 또는 진단용 항체 또는 그 단편의 준비에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 치료 용도로서 흥미로운 완전한 인간 아미노산 서열을 가진 항원-반응성 항체의 확인 및 선별에 관한 것이다. 본 발명의 구체예들은 척추동물, 바람직하게는 포유동물 세포에서, 항체 또는 그 단편을 포함하여, 다종 컬렉션의 결합 단백질의 발현을 가능하게 하는 레트로바이러스 발현 벡터, 및 리간드- 또는 항원-반응성 분자의 효과적인 분리를 위한 방법을 포함한다. 본 발명은 세 가지 대안적 방법에 의한 항체 또는 그 단편과 같은 다종 콜렉션의 결합 단백질의 생성을 위한 신규 방법을 제공한다. 먼저, 다종 컬렉션(라이브러리)의 경쇄 또는 중쇄에 대한 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 분자의 사슬 셔플링에 의한 것(사슬-셔플링 접근법), 또는 두 번째는 레트로바이러스 형질도입된 발현 구성물의 체세포 돌연변이에 의해 척추동물 세포에 레트로바이러스 인시튜 형질도입 후 항체 중쇄와 경쇄의 적어도 하나의 조합의 다양화에 의한 것(체세포 돌연변이 접근법), 또는 세 번째는 "유사-점라인(quasi-germline)" 형태로, 즉 V, 선택적으로 D 및 J 유전자 세그먼트로 더 분리된, 항체의 가변 결합 도메인의 코딩 영역을 함유하는 레트로바이러스 형질도입된 발현 구성물의 V(D)J 재조합에 의한 것(V(D)J 재조합 접근법)이다. 또한, 항체 또는 그 단편을 포함하여 다종 컬렉션의 결합 단백질이 상기 언급된 방법들의 임의의 조합에 의해서 생성될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 바람직하게, 상기 결합 단백질 또는 항체 또는 그 단편은 전구체 림프구의 표면에 디스플레이된다.
특히, 본 발명은 레트로바이러스 형질도입을 이용하여 척추동물 세포에서 다종 컬렉션의 결합 단백질, 바람직하게는 항체의 안정한, 선택적으로는 클론 발현을 허용하는 방법을 제공하며, 이것은 본 분야에 공지된 대안인 플라스미드 기반 또는 비통합형 바이러스 기반 척추동물 발현 시스템과 비교하여 결합 단백질 암호화 유전자의 증폭, 분리 및 클로닝을 상당히 용이하게 한다. 제한적이지는 않지만 대표적인 예로서, 내인성 항체를 발현할 수 없는 뮤린 전구체 림프구의 레트로바이러스 형질도입이 개시되며, 이에 의해서는 단지 숙주 세포에서 막 결합 항체로서 이종성, 재조합 항체만이 발현된다. 또한, 본 발명은 항체 또는 그 단편과 같은, 리간드- 또는 항원-반응성 결합 단백질을 발현하는 세포를 분리할 수 있는 방법과 선택적으로 시험관내 방식으로 확장(expand)할 수 있는 방법을 예시하며, 이로써 반복적으로 항원-반응성 결합자 세포의 집단이 부화(富化)될 수 있고, 이로부터 항원- 또는 리간드-반응성 결합 단백질을 암호화하는 유전자가 본 분야에 공지된 표준 분자생물학 과정에 의해서 계속해서 클로닝되고 서열화될 수 있다(도 1).
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 결합 단백질, 바람직하게는 인간 전장 항체의 레트로바이러스 발현에 관한 것이지만, 그것의 어떤 단편(예를 들어, 항체의 단쇄 Fv 또는 Fab 단편들)의 발현에도 마찬가지로 사용될 수 있다. (i) 숙주 세포에서 결합 단백질의 클론 발현을 확보하기 위한, 단일 결합 단백질 암호화 구성물의 단일 표적 세포로의 송달; (ii) 기능적 멀티머 결합 단백질(예를 들어, 항체 분자)을 생성하기 위한, 제 1 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 적어도 하나의 발현 구성물과 제 2 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 적어도 하나의 발현 구성물의 셔플링; (iii) 척추동물 세포의 인시튜 형질도입시 적어도 하나의 결합 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 발현 구성물의 체세포 돌연변이; 및 (iv) 척추동물 세포에 레트로바이러스 인시튜 형질도입시 V(D)J 재조합의 메커니즘에 의한 적어도 하나의 발현 구성물로부터 결합 단백질 발현의 생성을 선택적으로 허용하는 레트로바이러스 형질도입 프로토콜이 개시된다.
결합 단백질 암호화 구성물의 인시튜 체세포 돌연변이를 달성하기 위한 레트로바이러스 발현 벡터 및 이들의 활용이 개시되며, 이때 상기 벡터는, 바람직하게는 활성화 유도 시티딘 데아미나제(AID) 경로(Papavasiliou & Schatz, 2002)를 통해서, 또는 체세포 돌연변이를 결합 단백질 암호화 서열에 표적화하는 다른 효소를 사용함에 의해서, 체세포 초돌연변이를 단백질 암호화 서열에 표적화하는 시스-조절성 유전자 요소를 함유한다. 인시튜 V(D)J 재조합에 의해 다종 컬렉션의 결합 단백질, 바람직하게는 항체 또는 그 단편을 생성하기 위한 레트로바이러스 벡터 구성물 및 이들의 활용이 개시되며, 이때 상기 구성물은 "유사-점라인" 형태로 배열된 가변(V), 선택적으로 다양성(D), 및 연결(J) 유전자 세그먼트를 함유하고, 이것은 V(D)J 재조합으로 공지된 과정에 의해서 유전자 세그먼트들의 재조합 활성화 유전자(RAG) 매개 재배열을 통해 면역글로불린 또는 면역글로불린 유사 결합 단백질의 코딩 영역들의 조립을 허용한다(Grawunder et al., 1998).
다른 양태에 따라서, 본 발명은 또 다종 컬렉션의 재조합 결합 단백질을 안정하게 발현하는 레트로바이러스 형질도입된 세포를 적어도 하나의 관심의 리간드 또는 항원과 결합함으로써 계속해서 표지화하는 방법, 및 상기 언급된 관심의 리간드 또는 항원에 결합된 세포를 적합한 2차 시약에 의해 검출하는 방법을 더 예시한다. 리간드- 또는 항원-반응성 세포의 특이적 표지화 방법 및 이들의 부화 또는 분리가 설명되며, 이것은 고속 형광 활성화 세포 정렬(FACS)에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 레트로바이러스 형질도입된 세포의 안정한 발현 표현형으로 인해, 선택적으로 항원-반응성 세포를 분리하고 조직 배양물에서 다시 확장할 수 있는 방법이 설명되며, 이로써 선택적으로 항원 표지화, 항원 지정 부화, 및 리간드- 또는 항원-반응성 세포의 확장의 반복 사이클이 수행될 수 있으며, 이것은 세포의 서브클로닝이 수행되어 표준 PCR 클로닝 방법에 의해 항원-반응성 항체의 뉴클레오티드 코딩 영역의 확인이 가능해질 때까지 행해진다(도 1).
본원에 개시된 방법은 적어도 하나의 벡터 구성물로부터 다종 컬렉션의 항체 사슬 또는 그 단편의 발현을 허용하며, 이것은 선택적으로 척추동물 세포로의 인시튜 전달 및 발현시 다양한 결합 단백질의 컬렉션을 발생시킬 수 있다. 척추동물 세포에서 항체 사슬의 발현은 레트로바이러스 형질도입에 의해 매개되는 것이 바람직하다.
이와 같이, 본 발명의 제 1 양태는 원하는 항원 또는 리간드에 특이적인 항체 또는 그 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 분리 및 확인을 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
(a) 항체 또는 그 단편을 암호화하는 적어도 하나의 레트로바이러스 발현 구성물을 척추동물 숙주 세포에 형질도입하는 단계;
(b) 상기 항체 또는 그 단편을 상기 척추동물 숙주 세포에서 발현시키는 단계;
(c) 상기 원하는 항원 또는 리간드와 결합하는 능력을 기초로 상기 항체 또는 그 단편을 발현하는 척추동물 숙주 세포를 부화시키는 단계; 및
(d) 레트로바이러스 형질도입되고 부화된 척추동물 숙주 세포로부터 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 분리하고 확인하는 단계
를 포함한다.
상기 언급된 단계들에 더하여, 단계 (d)의 앞에 부화된 척추동물 숙주 세포를 조직 배양물에서 확장하는 단계가 있을 수 있다. 또한, 단계 (c)에 이어서 부화된 척추동물 숙주 세포를 조직 배양물에서 확장하는 단계가 있을 수 있으며, 이후 단계 (c)는 단계 (d)가 수행되기 전에 적어도 1번 반복된다.
적어도 하나의 항체의 클론 발현을 달성하기 위해서는 레트로바이러스 형질도입된 세포의 대부분이 숙주 세포 게놈에 통합되는 항체 사슬당 단지 하나의 재조합 레트로바이러스 구성물에 의해서만 유전적으로 변형되도록 레트로바이러스 형질도입을 제어하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 레트로바이러스 형질도입은 0.1 이하의 감염 다중도(MOI)로 수행된다.
본 발명의 방법에 따른 항체는 전장 항체인 것이 바람직하다. 항체의 단편은 중쇄, 경쇄, 단일 VH 도메인, 단일 VL 도메인, scFv 단편, Fab 단편, 및 F(ab')2 단편으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 그 단편(들)은 자연 발생 아미노산 서열, 인공 조작된 아미노산 서열 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
본 발명의 방법은 항체 사슬을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 분리 및 확인에 바람직하게 사용되지만, 본 발명의 방법이 Ig-초과(Ig-superfamily)에 속하는 어떤 모노머 또는 멀티머 세포 표면 수용체, 및 그것의 어떤 기능적 단편, 또는 TNF α-수용체 초과에 속하는 모노머 또는 멀티머 세포 표면 수용체, 또는 그것의 어떤 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 분리 및 확인에도 역시 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
또한, 결합 단백질이 전장 항체인 경우, 이 전장 항체는 완전 인간 항체, 비인간 항체 또는 항체들의 CDR 영역이 인간 항체 프레임워크에 접목된 인간화된 항체, 및 한 척추동물 종으로부터의 가변 영역 도메인이 다른 척추동물 종의 불변 영역 도메인과 조합된 키메라 항체로 구성되는 군으로부터 선택되며, 이때 키메라 항체의 불변 도메인은 인간 항체 또는 항체들로부터 유래되는 것이 바람직하다.
본원에 개시된 방법의 구체예에서, 척추동물 숙주 세포는 연골어류, 경골어류, 양서류, 파충류, 조류 및 포유류를 포함하는 종의 군으로부터 유래될 수 있다. 포유류 종의 군은 돼지, 양, 소, 말 및 설치류를 포함할 수 있다. 설치류 군은 또한 마우스, 래트, 토끼 및 기니아피그를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 척추동물 숙주 세포 종은 마우스(Mus musculus)이다.
본 발명의 방법에 사용되는 척추동물 숙주 세포는 어떠한 척추동물 기관으로부터도 유래될 수 있지만, 림프구 계통 세포로부터 유래되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 림프구는 B 세포 계통을 가지는데, 이는 이들 세포가 항체 특이적 샤프롱 단백질을 발현하고, 항체의 세포 표면 고정을 매개하는데 필요한 Igα 및 Igβ 같은 부속 분자가 이들 세포에서 발현되기 때문이다. 더 바람직하게, B 세포는 전구체 B 림프구이며, 이는 preB 세포가 어떤 내인성 항체 사슬도 발현하지 않는다고 판명될 수 있기 때문이다. 사실, 본 발명에서 이용되는 것과 같은 바람직한 림프구는 람다-5, VpreB1 및 VpreB2 유전자에 의해 암호화된, 소위 대리 경쇄(surrogate light chain)라고 하는 성분을 포함하는 내인성 항체 폴리펩티드를 발현할 수 없다. 따라서, 상기 바람직한 림프구는 B 세포 특이적 Igα 및 Igβ분자와 같은 항체 분자의 막 부착을 용이하게 하는 부속 막 단백질을 발현하지만, 이들은 어떤 내인성 항체 폴리펩티드 또는 대리 경쇄 성분의 발현은 결여한다. 그러나, 본 분야에 공지된 방법에 의해서, 예를 들어 이들 단백질에 맞는 발현 벡터로의 안정한 트랜스펙션에 의해 Igα 및 Igβ 분자를 외적으로 발현하는 것은 가능할 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 항체 분자는 내인성 발현된 Igα 및 Igβ단백질을 통해 림프구의 세포막에 고정되며, 이러한 단백질은 뮤린 preB 림프구에서 자연적으로 발현된다.
본원에 개시된 방법은 관심의 리간드 또는 항원에 대한 원하는 결합 특성을 나타내는 세포의 분리 및 관심의 원하는 결합 단백질을 암호화하는 유전자의 분리를 허용하는 과정을 포함한다. 본원에 개시된 척추동물 세포에서 항체를 레트로바이러스 발현하는 바람직한 방법은 항체의 안정한, 바람직하게는 클론 발현을 허용하며, 이것은 본 분야에 공지된 대안인 플라스미드 기반 또는 비통합형 바이러스 기반 척추동물 발현 시스템과 비교하여 항체 암호화 유전자의 증폭, 분리, 및 클로닝을 상당히 용이하게 한다. 개시된 방법은 다종 컬렉션의 결합 단백질의 효과적인 시험관내 생성을 허용하며, 이것은 다음에 의해서 이루어진다:
(i) 멀티머 결합 단백질(예를 들어, 항체의 중쇄 같은)의 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 적어도 하나의 발현 구성물과 적어도 하나의 매칭되는 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 항체의 경쇄 같은)을 암호화하는 적어도 하나의 발현 구성물을 셔플링하여 기능적 멀티머 결합 단백질(예를 들어, 항체 같은)의 생성;
(ii) 척추동물 세포로의 인시튜 전달시 적어도 하나의 결합 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 발현 벡터의 체세포 돌연변이;
(iii) V(D)J 재조합으로 공지된 과정에 의한, 척추동물 세포로의 인시튜 전달시 적어도 하나의 발현 벡터에 함유된 면역글로불린 및 면역글로불린 유사 분자의 가변 결합 도메인을 암호화하는 V(가변), 선택적으로 D(다양성), 및 J(연결) 유전자 세그먼트의 체세포 재조합; 또는
(iv) 과정 (i), (ii), 및 (iii)의 임의의 조합.
바람직한 구체예에 따라서, 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 항체 중쇄 서열과 복수의 항체 경쇄 서열들을 포함하거나, 또 다르게는 항체 경쇄 서열과 복수의 항체 중쇄 서열들을 포함하는 복수의 뉴클레오티드 서열이다.
또 다른 바람직한 구체예에 따라서, 항체 또는 그 단편은 V(D)J 재조합을 가능하게 하는 적어도 하나의 레트로바이러스 발현 구성물에 의해 암호화된 가변 결합 도메인을 포함하며, 이로써 레트로바이러스 형질도입시 가변 결합 도메인의 코딩 서열이 생성된다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 방법의 단계 (b)는 돌연변이화 조건 하에서 수행되며, 이것은 내인성 또는 외적 발현되는 활성화 유도 시티딘 데아미나제(AID)의 발현을 통해 이루어지는 것이 바람직하고, 이때 AID의 외적 발현은 유도성 조건 하에서 수행된다.
상기 방법의 한 양태에서, 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 적어도 하나의 레트로바이러스 발현 구성물은 AID 매개 체세포 돌연변이를 발현 구성물에 의해 암호화되는 가변 결합 도메인에 표적화하는 것을 허용하는 시스-조절성 프로모터와 인핸서 요소의 조합을 함유하며, 이때 프로모터 및 인핸서 요소는 다음 (a)~(d)로 구성되는 군으로부터 선택된다:
(a) 면역글로불린 중쇄 프로모터, 인트론 인핸서(EμH) 및 3'α 인핸서 요소,
(b) 면역글로불린 κ 경쇄 프로모터, κ 인트론 인핸서(κiE) 및 3'κ 인핸서(3'κE) 요소,
(c) 면역글로불린 λ 경쇄 프로모터, λ2-4 및 λ3-1 인핸서 요소, 및
(d) 이들의 임의의 기능적 조합.
도 1은 원하는 항원 또는 리간드에 특이적인 항체와 같은 결합 단백질의 확인 및 분리를 허용하는 '레트로사이트 디스플레이"의 원리를 도시한다. 제 1 단계에서, 다종 컬렉션의 결합 단백질의 발현을 일으킬 수 있는 적어도 하나의 레트로바이러스 발현 구성물이 적합한 척추동물 숙주 세포("선별자 세포")에 안정하게 형질도입된다. 이것은 적어도 하나의 결합 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스 패키징 세포에 트랜스펙션함으로써 달성되며(단계 1), 이 세포는 레트로바이러스 단백질 Gag, Pol 및 Env를 구성적으로 또는 일시적으로 발현할 수 있다. 다음에, 적어도 하나의 레트로바이러스 결합 단백질 구성물로 트랜스펙션된 패키징 세포가 트랜스펙션 후 24~72시간 이내에 적어도 하나의 레트로바이러스 발현 구성물을 함유하는 재조합 레트로바이러스 입자를 생산할 것이다. 결과의 레트로바이러스 입자는 레트로바이러스 패키징 세포의 세포 배양 상청액에 축적되고, 적합한 척추동물 숙주 세포("선별자 세포")에 형질도입하는데 사용될 수 있으며(단계 2), 이어서 결합 단백질이 발현된다. 바람직한 방법에서, 항체 또는 그 단편과 같은 결합 단백질은 "선별자 세포"의 세포 표면에서 발현되고, 이어서 세포가 원하는 항원 또는 리간드로 표지된다(단계 3). 다음에, 항원- 또는 리간드-결합 세포가 바람직하게는 형광 활성화 세포 정렬(FACS)에 의해 분석되고, 특이적 항원 결합을 나타내는 세포가 바람직하게는 예비 고속 FACS에 의해서 비결합 세포 집단으로부터 분리된다(단계 4). 항원- 또는 리간드-반응성 세포는 선택적으로 조직 배양물에서 다시 확장될 수 있으며, 레트로바이러스 형질도입된 세포의 안정한 발현 표현형으로 인하여, 검출가능한 항원- 또는 리간드-반응성 세포 집단이 얻어지는 지점에 이를 때까지 항원-지정 세포 정렬과 조직 배양물 확장의 사이클이 반복될 수 있다. 이 항원- 또는 리간드-반응성 세포 집단은 최종적인 바람직한 단일-세포 정렬 단계가 수행되거나, 집단 기반 결합 단백질 암호화 유전자의 클로닝에 직접 사용될 수 있다. 다음 단계(단계 5)에서, 관련된 결합 도메인의 코딩 영역이 본 분야에 공지된 표준 방법에 의한, 결합 단백질 라이브러리에 특이적인 및/또는 다른 벡터 서열에 특이적인 서열과 결합하는 프라이머 쌍을 이용하는 RT-PCR 또는 게놈 PCR에 의해서, 항원- 또는 리간드-선별된 세포 풀 또는 세포 클론으로부터 클로닝된다. 다음에, 선택적으로 결합 단백질의 클로닝되어 서열화된 코딩 영역이 어떤 선택된 발현 시스템에서 재조합 단백질로서 발현될 수 있으며, 이것을 기능적으로 더 특성화하여 항원- 또는 리간드-결합 특이성을 확인할 수 있다(단계 6).
도 2(a)는 개시된 발명에 따른 바람직한 결합 단백질인, 항체 또는 면역글로불린 및 그 단편의 도식적 구조를 도시한다. 도 2(a)는 특징적인 Y-모양 구조를 특징으로 하고, 각각 4개(VH-CH1-CH2-CH3) 및 2개의 면역글로불린 도메인(VL-CL)을 포함하는, 2개의 동일한 면역글로불린(Ig) 중쇄와 경쇄로 이루어진, IgG 항체(좌)의 도식적 구조를 나타낸다. V-도메인은 IgH 및 IgL 사슬의 고도 가변 항원 결합 영역이고, CH 및 CL 도메인은 불변 영역 도메인을 표시한다. IgH 사슬의 가변 영역 도메인은 V, D 및 J 유전자 세그먼트에 의해 암호화되는 반면, IgL 사슬의 가변 영역 도메인은 단지 V 및 J 유전자 세그먼트에 의해서만 암호화되며, 이들은 V(D)J 재조합으로 공지된 과정에 의해서, 조기 B 림프구형성 동안 점라인 면역글로불린 유전자 좌위(도 2(b) 및 2(c))로부터 조립되어야 한다.
항체 IgH와 IgL 사슬은 이황화 다리에 의해 함께 공유 고정되고, 이들은 가요성 힌지 영역에 가까운 장소에서, 즉 CH1과 CH2 도메인 사이에서 함께 동일한 IgH 사슬을 연결하는 반면, 나타낸 대로, CH1과 CL 도메인 사이의 추가의 이황화 다리는 IgH와 IgL 사슬을 공유 연결한다(도 2(a) 좌).
Fab 단편은 천연 이황화 다리에 의해 연결된 VH-CH1/VL-CL 도메인만을 함유하는 전장 항체의 1가 단편이며, 이것은 전장 항체로부터 효소 파파인 절단에 의해서 유래될 수 있거나, 또는 IgL 사슬과 함께 CH2-CH3 고갈 IgH 사슬을 발현시킴으로써 재조합 단백질로서 발현될 수 있다. 완전 인간 항체의 추가 단편은 단쇄 가변 도메인 단편들(scFv-단편들)이며, 이들은 합성 링커 또는 인공 이황화 다리에 의해 연결된 IgH 및 IgL 사슬의 가변 영역 도메인만을 포함한다. 본 발명을 실현하기 위해서, 나타낸 Fab 및 scFv 단편으로서, 전장 항체, 또는 항체 단편의 발현은 또한 결합 단백질로서 발현될 수 있다.
도 2(b)는 점라인 IgH 사슬 대립형질 상에서 일어나는 V(D)J 재조합의 과정을 도식적으로 묘사한 것으로서, 결과적으로 항체 VH 도메인의 코딩 영역이 조립된다. 척추동물 종에서 IgH 사슬의 가변 도메인은 점라인 형태로 분리되어 있는 다수의 V, D 및 J 유전자 세그먼트에 의해 암호화된다. 조기 B 림프구형성 동안 일어나는 V(D)J 재조합 동안, 하나의 선택된 V, D 및 J 유전자 세그먼트가 부위-특이적으로 재배열되어 항체 VH 도메인의 독특한 코딩 영역이 생성된다. IgH 사슬 좌위에서의 V(D)J 재조합은 순서에 따른 과정이며, 일반적으로 양측 IgH 사슬 대립형질 상에서 선택된 D가 선택된 J 유전자 세그먼트로로 재배열되는 것부터 시작된다. D의 J로의 유전자 재배열 직후, 하나의 선택된 V 영역이 이미 조립된 DJ 영역과 부위-특이적으로 연결되고, 이로써 VH 도메인을 암호화하는 V-D-J ORF가 생성된다. V(D)J 재조합 과정은 전구체 림프구 특이적 재조합 활성화 유전자(RAG) 1 및 2의 발현에 의존한다.
도 2(c)는 점라인 IgL 사슬 대립형질 상에서 일어나는 V(D)J 재조합의 과정을 도식적으로 묘사한 것으로서, 결과적으로 항체 VL 도메인의 코딩 영역이 조립된다. 척추동물 종에서 IgL 사슬의 가변 도메인은 IgH 사슬 좌위의 유전자 세그먼트와 유사한, 점라인 형태로 분리되어 있는 V 및 J 유전자 세그먼트에 의해서만 암호화된다. 항체 VL 도메인의 생성에는 나타낸 대로 오직 하나의 부위-특이적 V(D)J 재조합 사건만 필요하다.
도 3은 레트로바이러스 형질도입에 의한 항체(또 다르게는 표지된 "X")와 같은 관심의 결합 단백질(BPOI)의 발현을 위한 표적 세포의 안정한 유전자 변형의 원리를 도식적으로 도시한다.
도 3(a)는 야생형 레트로바이러스 게놈(위 좌측)의 편제를 도식적으로 묘사하며, 여기서 구조적 및 기능적 단백질 Gag, Pol 및 Env의 유전자는 레트로바이러스 게놈 측면의 소위 5' 및 3' 긴-말단 반복(LTR) 서열 사이에 위치된다. 5' LTR은 감염된 숙주 세포에서 레트로바이러스 유전자의 발현과 또한 레트로바이러스 게놈의 복제에 중요하다. 레트로바이러스 게놈에서 또 다른 중요한 영역은 ψ(Psi) 패키징 신호인데, 이것은 레트로바이러스 입자의 복제 및/또는 생산 동안 레트로바이러스 RNA의 패키징에 필요하다.
재조합 레트로바이러스 입자의 생성을 위해서 gag , pol 및 env 유전자가 야생형 레트로바이러스 게놈으로부터 제거될 수 있고, 이로써 단지 5' 및 3' LTR 및 ψ(Psi) 패키징 신호만이 남게 된다. 재조합 레트로바이러스 벡터의 구축을 위해서는 몇 개의 독특하고 편리한 제한 효소 부위를 함유하는 다중 클로닝 부위(MCS)를 도입하는 것이 편리하다. 위 우측에 나타낸 대로 이 디자인은 가장 단순한 레트로바이러스 전달 벡터를 표시한다.
항체와 같은 재조합 단백질(예를 들어, 관심의 결합 단백질(BPOI) "X")의 발현을 허용하는 재조합 레트로바이러스의 발현을 위해서는 BPOI의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 최소로 "빈" 레트로바이러스 전달 벡터에 삽입되어야 하고, 이때 5' LTR 영역은 어떤 하류 위치된 유전자의 발현을 추진할 수 있는 프로모터 활성을 가진다. 그러나, 발현 수준을 개선하기 위하여, 선택적으로 관심의 유전자의 발현(예를 들어, BPOI-"X")이 추가의 이종성 프로모터(Prom.)에 의해서 추진될 수 있고, 본원에 나타낸 대로, 예를 들어 5' LTR 프로모터 및 ψ 패키징 신호의 하류에 마커 유전자의 선택적 부가는 레트로바이러스 형질도입된 구성물의 선별 및/또는 추적을 허용할 수 있다.
도 3(b)는 항체와 같은 BPOI-"X"의 안정한 발현을 가져오는 표적 세포의 레트로바이러스 형질도입의 과정을 도식적으로 도시한다. 이를 위해서 먼저 BPOI-"X"의 발현 카세트를 함유하는 재조합 레트로바이러스 구성물이 레트로바이러스 패키징 셀라인(PCL)에 일시적으로 트랜스펙션되어, 야생형 레트로바이러스(좌)의 구조적이고 기능적인 레트로바이러스 단백질 Gag, Pol 및 Env가 발현된다. 레트로바이러스 PCL은 적합하고 용이한 트랜스펙션 셀라인(예를 들어, 표준 인간 293 HEK 세포 또는 마우스 NIH 3T3 섬유아세포)에 Gag, Pol 및 Env 단백질 발현 구성물을 안정하게 또는 일시적으로 트랜스펙션함으로써 생성될 수 있다. 트랜스펙션 2~3일 후에 BPOI-"X" 유전자를 함유하는 재조합 레트로바이러스 게놈이 복제 비적격 레트로바이러스 입자 안에 패키징되고, 이것이 PCL의 세포 배양 상청액에 축적된다. 이 레트로바이러스 입자는 복제 비적격인데, 이는 이들이 기능적 레트로바이러스 Gag, Pol 및 Env 단백질 유전자를 결여하기 때문이며, 따라서 이들은 유전자 유효하중을 표적 세포에 오직 한번만 송달할 수 있고, 이것이 바로 레트로바이러스 형질도입, 또는 단일 라운드 감염이라고 불리는 과정이다. 레트로바이러스 형질도입 동안 재조합 레트로바이러스의 패키징된 RNA가 표적 세포에 도입되고, 표적 세포에서 cDNA로 역전사된 다음, 표적 세포 게놈에 안정하게 통합된다. 레트로바이러스 형질도입 2~3일 후, 이 cDNA 레트로바이러스 구성물이 숙주 세포 게놈에 통합됨으로써 BPOI-"X" 같은 관심의 유전자가 표적 세포에 의해서 영구적으로 발현된다.
도 4는 본 발명을 실현하는데 사용될 수 있는 바람직한 타입의 레트로바이러스 발현 구성물의 도식적 디자인을 나타낸다. 이 도면은 표준 DNA 클로닝 플라스미드 백본(닫힌 검은선)에 함유된 레트로바이러스 벡터의 도식적 디자인을 묘사하며, 관련된 유전자와 레트로바이러스 게놈 영역이 강조된다. 패널 (a)에 묘사된 한 바람직한 벡터 생성은 강한 구성성 CMV 프로모터(Prom)에 의해 추진된, Igκ 인트론 인핸서(κiE)와 3'κ 인핸서(3'κE) 요소가 상류 및 하류에서 측면에 위치된 인간 IgγH 사슬 및 IgκL 사슬의 cDNA 코딩 영역을 함유하며, 이로써 IgH 및 IgL 사슬의 V 코딩 영역에서 체세포 초돌연변이가 촉진되는데, 이것의 상세한 클로닝은 도 5 및 6에 설명되고 실시예 1에 제공된다. 레트로바이러스 IgH 및 IgL 사슬 발현 구성물은 추가로 항생제 내성 마커인 히그로마이신 B(hygroR) 및 퓨로마이신(puroR)에 대한 오픈 리딩 프레임을 각각 함유하며, 이것은 레트로바이러스 형질도입된 척추동물 세포의 배양물에 각 항생제 약물 선별을 적용하여 IgH 및 IgL 사슬 구성물의 안정한 통합의 선별을 허용한다. 이에 더하여, 편리하고 독특한 제한 효소 부위가 강조되며, 이것은 HindIII 및 Eco47III로 V 코딩 영역의 직접 치환, 또는 제한 효소 HindIII 및 NotI의 사용에 의한 전체 IgH 및 IgL 사슬 코딩 영역의 치환을 허용한다. 이 방식에 의해 하나의 기존 IgH 또는 IgL 사슬 발현 구성물로부터 상이한 V 영역과 심지어 V 영역의 전체 컬렉션이 개시된 발현 벡터에서 쉽게 클로닝될 수 있다.
(b) 이 패널에서는 또 다른 부류의 바람직한 벡터가 설명되는데, 이것은 DNA 단편에 의한 가변 코딩 영역의 치환을 지니고 있으며, 여기서 가변 코딩 영역은 "유사-점라인" 형태로 V, D 및 J 유전자 세그먼트(IgH 구성물) 및 V 및 J 유전자 세그먼트(IgL 사슬 구성물)로 더 분리된다. 그렇지 않고 (a)에 제공된 레트로바이러스 발현 벡터와 동일하다면, IgH 또는 IgL 사슬의 가변 결합 도메인의 코딩 영역을 생성하기 위해서, 이들 V(D)J-재조합 적격 레트로바이러스 벡터는 먼저 V, 선택적으로 D 및 J 유전자 세그먼트의 부위-특이적 재배열이 이루어져야 한다. V(D)J 재조합 후 IgH 사슬의 발현을 허용하는 이러한 벡터의 상세한 클로닝은 도 11에 설명된다.
이들 구성물의 독특한 특징은 V(D)J 재조합 활성 세포에서, 예를 들어 내인성 RAG1 및 RAG2 단백질을 발현하는 전구체 림프구에서 다종 V 도메인 코딩 영역을 인시튜 생성하는 이들의 능력이다. V(D)J 재조합 과정은 정확하지 않기 때문에, 가변 코딩 영역 서열의 다종 컬렉션은 IgH에 대한 주어진 세트의 V, D 및 J 유전자 세그먼트, 또는 IgL에 대한 주어진 세트의 V 및 J 유전자 세그먼트 내의 1개의 개별 레트로바이러스 벡터로부터 생길 수 있다. V, 선택적으로 D 및 J 유전자 세그먼트의 연결에 있어서의 다양성은 엑소뉴클레아제 활성, TdT 매개 N-영역 부가, 및 P 뉴클레오티드 생성의 조합으로 인한 것이며, 이들은 모두 개별적으로 또는 연대하여 코딩 연결부 다양화에 기여할 수 있다. V, D 및 J 유전자 세그먼트가 상이한 V, D 및 J 유전자 세그먼트 과의 일원이 독특한 제한 효소 부위에 의해 쉽게 치환될 수 있는 방식으로 클로닝되기 때문에, 제한된 수의 구성물이 생성되어 V(D)J 재조합 적격 숙주 세포에 도입됨으로써 인시튜 생성된 결합 단백질 다양성의 매우 큰 다양성이 생길 수 있다. 이들 벡터가 V(D)J-재배열 V 도메인 코딩 영역에 체세포 초돌연변이를 부여하는 추가의 κiE 및 3'κE 요소를 함유하므로, 다종 결합 단백질의 1차 인시튜 생성된 컬렉션이 AID-의존성 체세포 초돌연변이 과정에 의해 선택적으로 더 돌연변이될 수 있다. 이 방식에 의해 생체내 항체 다양성을 생성하는 전 과정이 개시된 레트로바이러스 구성물 및 V(D)J 재조합 활성을 나타내는 숙주 세포(예를 들어, 전구체 림프구)를 사용하여 시험관내에서 인시튜로 반복 재현될 수 있으며, 여기서 AID 매개 체세포 초돌연변이는 활성이거나, 또는 활성화될 수 있다.
(c) 이 패널은 본 발명을 실현하는데 사용될 수 있는 레트로바이러스 구성물의 또 다른 디자인을 도시적으로 묘사한다. 여기서, IgH 및 IgL 코딩 영역의 발현이 레트로바이러스 백본의 5' LTR 프로모터에 의해 추진되고, IgH와 IgL 사슬의 발현이 GFP 및 YFP 자가형광 마커의 발현과 각각 커플링되며, 이로써 형질도입된 세포를 녹색 및 황색 형광에 대해 분석함으로써 간단히 IgH 및 IgL 발현 세포의 추적 및 분리가 가능해진다. 이들 구성물은 더 이상의 표지화 과정 없이 "선별자 세포"의 감염 다중도를 제어하는데 매우 유용하다.
이 구성물에 포함된 중요한 DNA 서열에 대해 도 4(a)-(c)에서 사용된 기호의 유래가 제공된다. 내인성 리더(L) 서열, 힌지(H), 불변(CH1, CH2, CH3, CL), 및 막-스패닝 코딩 영역(M1/2, 이 영역이 2개의 엑손에 의해 암호화되기 때문)을 모두 함유하는 가변 도메인(VH 및 VL)으로 IgH 및 IgL 코딩 영역을 세분하면 이 도면이 더 잘 이해된다.
도 5a~e는 실시예 1에 상세히 설명된, 도 4(a)에 제공된 기본 디자인의 레트로바이러스 IgH(인간 Igγ1 이소타입) 발현 벡터의 구축을 위한 클로닝 전략을 도시한다. 실시예 1에 상세히 나타낸 대로, 막에 결합된 IgG뿐만 아니라 분비된 IgG 둘 다에 대한 발현 구성물의 클로닝이 묘사되며, 플라스미드 맵에 있는 독특한 제한 효소 부위가 전반적인 참조를 위해 제공된다. 본원의 도 5e에 개시된, 최종 레트로바이러스 Igγ1H 사슬 발현 구성물에 기초하여, 임의의 다른 VH 도메인 코딩 영역, 또는 다종 VH 도메인 코딩 영역의 컬렉션(라이브러리)이 기존의 VH 영역을 상기 임의의 다른 VH 도메인 코딩 영역으로 치환함으로써 독특한 HindIII 및 Eco47III 제한 효소 부위를 사용하여 벡터에 도입될 수 있다. 도 5a는 첫 번째 예비 클로닝 단계를 묘사하며, 여기서 실시예 1에 설명된 대로 부위 지정 돌연변이유발에 의해 상업적으로 이용가능한 pLHCX 벡터 백본으로부터 Eco47III 제한 부위(원형)가 제거된다. 이로써 레트로바이러스 벡터 백본 pLHCXm1이 생성되며, 여기서 Eco47III 제한 효소 부위는 VH 도메인 코딩 영역의 클로닝 및 치환을 위해 나중에 다시 도입될 수 있다. 이런 목적을 가지고 Eco47III을 사용하는 것의 이점은 Eco47III가 발현된 인간 Igγ1H 사슬의 아미노산 조성의 변화 없이 인간 VH와 Cγ1 코딩 영역 사이의 경계에 직접 도입될 수 있는 유일한 제한 효소 부위라는 사실에 기초한다. 도 5a는 또한 막 스패닝 엑손 M1/M2가 있거나 또는 없는 인간 γ1 불변 영역 유전자의 클로닝된 단편들이 pLHCXm1의 MCS에 존재하는 독특한 HindIII 및 ClaI 제한 효소 부위를 사용하여 pLHCXm1 백본에서 클로닝되는 방법을 도시한다. 실시예 1에 상세히 설명된 대로, 단편들은 추후의 클로닝을 위해 추가의 측면 Eco47III 및 NotI 제한 효소 부위를 함유하도록 디자인되었다. 도 5b)는 VH 도메인 코딩 영역이 없는 클로닝 중간체들의 플라스미드 맵을 나타내며, 또한 HindIII 및 Eco47III 부위가 측면에 위치된 특정 VH 코딩 영역이 구성물에서 클로닝되는 방법을 나타낸다. 이와 같이 생성된 이들 구성물이 도 5c에 묘사되며, 이들은 원칙적으로 어떤 수여자 셀라인에서도 인간 Igγ1H 사슬의 발현을 부여하는데 충분할 것이다. 그러나, 본 발명의 한 양태에서 AID 의존적 방식으로 VH 코딩 영역이 추가로 돌연변이될 가능성이 존재하며, 2개의 추가 클로닝 단계가 개시되는데, 여기서는 추가 측면 서열이 있는 코어 κiE 요소가 발현 카세트(도 5c 아래쪽 및 도 5d)의 CMV 프로모터 상류의 독특한 BglII 부위에서 클로닝되고, 어떤 측면 DNA 서열이 있는 3'κ 요소가 인간 Igγ1H 사슬의 발현 카세트 하류의 독특한 ClaI 부위에서 클로닝된다. 결과적으로 막에 결합된 인간 Igγ1H 사슬이나 분비된 인간 Igγ1H 사슬의 최종 발현 벡터가 얻어지며, 이것의 플라스미드 맵이 도 5e에 제공된다. 이들 구성물은 도 4a에 이미 개시된 도식적 플라스미드 맵에 상응하며, 여기서는 정확한 제한 효소 맵을 일정한 비율의 축척으로 나타낸다.
도 6a~d는 레트로바이러스 IgL(인간 IgκL 이소타입) 발현 구성물의 구축을 위한 실시예 1에 제공된 상세한 클로닝 전략을 도시하며, 이것의 기본 디자인은 도 4(b)에 이미 제공되었다. 본원의 도 6d에 개시된, 최종 레트로바이러스 IgκL 사슬 발현 구성물에 기초하여, 임의의 다른 VL 도메인 코딩 영역, 또는 다종 VL 도메인 코딩 영역의 컬렉션(라이브러리)이 기존 VL 영역을 상기 임의의 다른 VL 도메인 코딩 영역(들)으로 치환함으로써 독특한 HindIII 및 Eco47III 제한 효소 부위를 사용하여 벡터에 도입될 수 있다. 레트로바이러스 IgL 사슬 발현 벡터의 클로닝 전략에는 예비 클로닝 단계가 필요했으며, 이로써 변형된 레트로바이러스 벡터 백본이 생성되고, 여기에서 원하는 요소가, 나타낸 편리한 제한 효소 부위를 사용하여 클로닝될 수 있었다. 첫 번째 단계에서, 상업용 플라스미드 pLPCX로부터, 실시예 2에 설명된 대로 부위 지정 돌연변이유발에 의해 ψ(Psi) 패키징 신호로부터 바람직하지 않은 Eco47III 부위가 제거되었고, 그 결과 변형된 플라스미드 pLPCXm1이 얻어졌다(도 6a). 두 번째 단계에서, 상업용 플라스미드 pLHCX로부터의 커다란 AscI-BlpI 분해 단편과 pLPCXm1로부터의 AscI-NcoI 단편을 라이게이션하여 신규 pLPCXm2 백본이 생성되었다(도 6b). 두 단편 모두에서 비양립성 BlpI과 NcoI DNA 단부는 실시예 1에 설명된 대로 Klenow 단편을 사용하여 뉴클레오티드로 채워져야 한다. 결과의 pLPCXm2 백본에 인간 κL 사슬(Cκ)의 불변 영역이 나타낸 HindIII 및 ClaI를 통해 삽입되었다(도 6b). 인간 IgH 사슬의 클로닝 전략과 유사하게, 추가의 클로닝 과정을 용이하게 하기 위해서 인간 Cκ 단편의 측면에 Eco47III과 NotI 부위가 더 위치되었다. 인간 Cκ 단편의 삽입 후에 선별된 하나의 인간 Vκ 요소가 독특한 HindIII 및 Eco47III 부위를 통해 구성물에서 클로닝되었다(도 6c). 이 구성물은 원칙적으로 어떤 수여자 셀라인에서도 인간 IgκL 사슬의 발현을 부여하는데 충분할 것이다. 그러나, IgH 사슬 발현 구성물의 경우와 마찬가지로(도 5a~e), IgH 사슬 구성물의 클로닝 전략과 동일하게, 추가의 κiE 및 3'κE 요소가 IgκL 사슬 발현 카세트의 상류 및 하류의 독특한 BglII 및 ClaI 부위에서 구성물에서 클로닝되었다(도 6c 및 6d). 다음에, 최종 구성물에서 역시 Vκ 도메인 코딩 영역이 AID 매개 체세포 초돌연변이에 대해 표적화될 수 있다. 최종 구성물은 도 4(b)에 상세히 설명된 도식적 플라스미드 맵에 상응하며, 여기서는 정확한 제한 효소 맵을 일정한 비율의 축척으로 나타낸다.
도 7은 활성화 유도 시티딘 데아미나제(AID)의 레트로바이러스 발현 구성물에 대한 클로닝 전략을 도시한다. 나타낸 대로, 상업용 pLPCX 레트로바이러스 벡터 백본이 사용되었고, AID 코딩 영역을 함유하는 마우스 비장 cDNA로부터의 특정 RT-PCR-단편이 실시예 2에 설명된 대로 PCR 증폭 프라이머에 삽입된 양립성 XhoI 제한 효소 부위를 사용하여 pLPCX 벡터의 독특한 XhoI 제한 부위에서 클로닝되었다.
도 8(도 8a 및 8b)은 실시예 2에 제공된, IgκL 사슬 인핸서 요소가 있는 레트로바이러스 리포터 구성물과 IgκL 사슬 인핸서 요소가 없는 레트로바이러스 리포터 구성물에 대한 상세한 클로닝 전략을 도시하며, 이것은 규정된 EGFP 중단 돌연변이의 역돌연변이에 의한 체세포 돌연변이의 확인 및 정량을 허용한다.
도 9는 개시된 레트로바이러스 벡터가, V-프로모터 요소의 하류에 클로닝된 서열, 바람직하게는 항체 V 코딩 영역과 같은 서열의 AID 매개 체세포 돌연변이를 허용한다는 개념에 대한 실험적 증거를 제공한다. 패널 (a)는 레트로바이러스 AID 발현 구성물로 안정하게 트랜스펙션된 5개의 선별된 FA-12 A-MuLV 형질전환된 세포 클론의 웨스턴-블롯팅에 의한 AID 발현의 분석을 나타내며, 이것의 클로닝은 도 7에 묘사되었다. 웨스턴-블롯 분석은 FA-12 트랜스펙턴트 클론 1-4에서는 약 25kD에서 뚜렷한 AID-특이적 신호를 나타내지만, 트랜스펙턴트 5와 비트랜스펙션된 음성 대조군(NC)에서는 신호가 나타나지 않는다. 트랜스펙턴트 3을 사용하여 레트로바이러스 리포터 벡터를 AID 매개 체세포 초돌연변이(SHM)에 대해 더 시험하였고, 이것이 패널 (b)에 묘사된다. 여기서는 도 8의 레트로바이러스 리포터 구성물(Igκ 인핸서 요소를 가진 것 하나와 가지지 않은 것 하나)이 AID 발현 및 AID 비발현 FA-12 트랜스펙턴트 3 및 5에 각각 레트로바이러스 형질도입되었다. 예상된 대로, 인핸서 요소를 함유한 리포터 구성물이 AID 발현 FA-12 트랜스펙턴트 클론 3에 형질도입되었을 때만 형질도입 10일 후에 0.2% 빈도로 녹색 복귀 돌연변이(revertant) 트랜스덕턴트를 검출하는 것이 가능했다. 단일 세포 정렬에 의해서 이들 0.2% 녹색 세포로부터 100개의 개별 세포 클론이 분리되었고, 이들 클론이 확장 후 FACS에 의해 녹색 형광에 대해 다시 분석되었다. 단일 세포 정렬된 클론의 거의 대부분(95%)이 원 정렬된 0.2% 녹색 세포의 중간 녹색 형광 신호와 동일한 형광 강도로 균일한 녹색 형광 발현을 나타냈으며, 이것은 도 9b의 아래 좌측 패널에 제공된 대표적인 GFP 발현 패턴과 유사하며, 이로써 원 녹색 집단이 EGFP 중단 돌연변이의 역돌연변이로 인한 것이었음이 확인된다. 4개의 클론은 중앙의 FACS 히스토그램에 대표적으로 묘사된 대로 바이모달형 녹색 형광 패턴을 나타냈고, 클로닝되어 단일 세포 정렬된 100개 중 단지 1개만이 거의 어떤 녹색 형광도 나타내지 않았다(우측 FACS 히스토그램).
도 10은 체세포 초돌연변이를 정량하기 위해 EGFP 리포터 구성물을 클로닝하는데 사용된 조작된 중단 돌연변이를 가진 EGFP 코딩 영역의 서열을 도시한다. 패널 (a)에 나타낸 4개의 뉴클레오티드는 EGFP 오픈 리딩 프레임의 코돈 107 및 108에서 돌연변이되었으며, 이로써 코돈 107에 중단-코돈이 생성되고, 코돈 108에서는 리신이 트레오닌 아미노산으로 변화되었다. 이들 4개의 뉴클레오티드 변화에 의해 독특한 SpeI 제한 효소 부위가 추가로 도입되었고, 이것은 나타낸 대로 체세포 초돌연변이시 중단 코돈 역돌연변이의 진단 마커로서 사용될 수 있었다. TAG 중단 코돈의 G-뉴클레오티드는 소위 말하는 RGYW 서열 모티프에 매립되는데, 이것은 체세포 초돌연변이의 핫스폿이라고 알려져 있다. SpeI 제한 효소 분해에 의해 분석된 24개의 복귀 돌연변이 클론에서는 이 부위가 SpeI 분해에 내성이 되었던 것이 확인될 수 있었다(따라서 돌연변이되었다). 이들 클론 중 10개에서 서열 분석에 의해서 원 TAG 중단 코돈에서 G 뉴클레오티드가 C 뉴클레오티드로 돌연변이되어 결과적으로 TAC 코돈이 된 것이 밝혀졌으며, 따라서 제한 효소 분석에 의해 AID 매개 체세포 돌연변이가 RGYW 모티프의 G에 표적화되었다는 것이 확인되었다.
(b) 이 패널은 VH 도메인 코딩 영역 대신에, 도 5(e)에 이미 개시된 레트로바이러스 Igγ1H 사슬 구성물에서 클로닝된 돌연변이된 EGFP의 전체 ORF를 나타낸다.
도 11(a) 및 (b)는 실시예 4에 상세히 개시된, V(D)J 재조합 적격 레트로바이러스 IgH 사슬 발현 벡터의 상세한 클로닝 전략을 도시한다.
도 12는 "유사-점라인" 형태의 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 V(D)J 재조합을 필요로 하는 레트로바이러스 구성물이 RAG1/RAG2 양성 전구체 림프구로의 형질도입시 생산적으로 재배열된 중쇄 발현 구성물과 Ig+ 세포를 발생시킬 수 있다는 개념에 대한 증거를 나타낸다. 패널 (a)는 A-MuLV 형질전환된 preB 셀라인 230-238에서 V(D)J 재조합 적격 레트로바이러스 발현 벡터(클로닝의 상세한 설명은 도 11 참조)의 형질도입 후 표면 면역글로불린 양성 세포(0.04%, 좌 FACS 플롯의 위 우측 사등분)의 생성을 나타내는 데이터를 담고 있다. 이 면역글로불린 발현은 도 4c에 도식적으로 도시된 구성물을 이용하여 EGFP 발현과 커플링된다. 따라서, 면역글로불린 발현 세포는 녹색(즉, 안정하게 형질도입된) 세포 집단에서만 생성될 수 있다. 우측 염색 패널은 단일 회전의 FACS 부화 및 조직 배양물에서 8일간 드문(0.04%) 표면 면역글로불린 세포의 확장 후 표면 면역글로불린 발현의 재분석을 나타낸다. 이 1회전의 부화 후, 면역글로불린 양성 세포의 합계 빈도는 17.8%까지 증가했으며(예상된 대로, 녹색, 즉 안정하게 형질도입된 집단에서 검출가능), 이로부터 PCR 앰플리콘이 얻어져 서열화되었다. (b). 대표예로서, 이 패널은 "유사-점라인" V(D)J 재조합 적격 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 1회전 부화 후의 표면 면역글로불린 세포로부터 유래된 PCR 앰플리콘으로부터 얻어진 DNA 서열(클론 225, 위쪽에 아미노산 번역이 있음)을 나타낸다. 참조로서 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 코딩 영역의 서열이 (b)의 위쪽에 제공되며, 역시 V 및 J 유전자 세그먼트의 위쪽에 아미노산 번역이 있고, D 세그먼트 서열이 V(D)J 재조합 후의 접합부 다양성에 따라서 3개의 상이한 리딩 프레임에서 판독될 수 있다. "유사-점라인" 형태의 V, D 및 J 유전자 세그먼트 사이에 개재된 서열은 점으로 묘사된다. 회수된 클론 225의 서열은 V(D)J 재배열 사건을 분명히 충실히 나타내며, 뉴클레오티드 손실 및 TdT 촉매된 N-서열 부가의 전형적인 특징이 조립된 V, D 및 J 유전자 세그먼트 사이의 코딩 조인트에서 분명히 검출될 수 있다(모든 개재 서열은 클론 225에서 손실이 있었다). 클론 225의 서열은 오픈 리딩 프레임을 나타냈고, 코딩 접합부에서의 상기 언급된 변형과는 별도로, V, D 및 J 서열에 추가의 체세포 돌연변이는 함유하지 않았다.
도 13은 에코트로픽 MLV-유래 벡터 유전자 전달 감수성에 대한 일단의 상이한 A-MuLV 형질전환된 뮤린 preB 셀라인의 시험 결과를 나타내는 데이터이다. 1x105 개 세포에 전달 벡터 LEGFP-N1을 포함한 리포터 유전자 EGFP가 패키징된 벡터 제제가 0.5의 MOI로 형질도입되었다. 형질도입은 실시예 5에 상세히 설명된 대로 수행되었다. 형질도입 2일 후, FACS를 이용하여 EGFP의 발현에 의해 유전자 전달이 검출되었다. preB 셀라인 18/81을 제외한, 다른 모든 시험된 A-MuLV 형질전환된 preB 셀라인은 적용된 조건 하에서 40~60% 범위의 빈도로 형질도입에 감수성을 나타냈으며, 이들은 원칙적으로 본 발명에 사용될 수 있다. 음성 대조군으로 사용된 미처리 자생 표적 세포는 녹색 형광을 나타내지 않았다(도시하지 않음).
도 14는 레트로사이트 디스플레이에서 선별자 세포로서 사용될 수 있는 내인성 뮤린 항체 발현이 없는 세포를 확인하기 위한, 내인성 IgM 중쇄(cy-μH)의 세포내 발현에 대한 일단의 뮤린 preB 셀라인의 특성화를 나타낸다. 세포가 투과화되었고, FITC(FL1)에 연결된 항-뮤린 IgM 중쇄 항체를 사용하여 염색되었다. 미처리된 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. 이 실험에서 셀라인 FA-12, 1624-5, 1624-6, 18/81-cl8-11, 및 40E1에서 내인성 항체 발현이 실질적으로 검출되지 않았던 것으로 나타나며, 따라서 이들은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
도 15는 도 4(c)에 개시된 디자인에 따른 레트로바이러스 발현 벡터의 복잡도 및 IgH 및 IgL 사슬 셔플링된 항체 라이브러리를 생성하는 실험 원리를 도시한다. (a) 레트로바이러스 벡터 라이브러리 IgH(650)-LIB-IRES-GFP 및 IgL(245)-LIB-IRES-YFP는 완전 인간 항체의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)에 대한 규정된 컬렉션의 코딩 영역을 포함하며, 이때 각각 복잡도는 650개 및 245개의 상이한 완전 서열화된 클론을 가진다. 두 벡터는 모두 패키징 서열 Psi(ψ), 측면 긴 말단 반복(LTR) 및 내부 리보솜 진입 신호(IRES)를 숨기고 있다. 5' LTR에서 바이러스 프로모터에 의해 매개된 항체 폴리펩티드 사슬의 발현에 병행하여, IRES는 리포터 유전자 gfp 및 yfp의 커플링된 발현을 각각 가능하게 한다. 선별자 세포로의 바이러스 유전자 전달시, 이것은 FACS를 이용한 성공적으로 형질도입된 면역글로불린 사슬 발현 세포의 편리한 검출 및 부화를 허용한다.
(b) 형질전환된 preB 세포에서 완전 인간 항체 컬렉션의 생성. 일시적 패키징 세포를 생성하기 위해서, 인간 항체(IgH(650)-LIB-IRES-GFP)의 중쇄를 암호화하는 레트로바이러스 전달 벡터 라이브러리의 라이브러리가 적합한 수여자 세포에 패키징 구성물(pVPack-GP)과 외피 구성물(pVPack-Eco)로 공-트랜스펙션된다. 트랜스펙션 2일 후, 각각의 전달 벡터 라이브러리가 패키징된 생성된 벡터 입자 라이브러리가 수거되고, 선별자 preB 세포에 형질도입하는데 사용된다. 전달된 중쇄 및 리포터 유전자 gfp를 발현하는 형질도입된 세포가 FACS를 이용하여 확장되고 부화된다. 확장 후, 세포에 2차 형질도입이 수행된다. 이때 IgL(245)-LIB-IRES-YFP 라이브러리가 전달된 다음, FACS를 이용하여 YFP 및 인간 경쇄를 발현하는 세포가 확장되고 부화된다. 결과의 집단은 1624-5 세포에 의해 발현된 규정된 인간 항체 라이브러리를 나타내는 완전 인간 항체를 구성하며, 최대 159'250 클론의 복잡도를 함유한다.
도 16은 형질도입이 확보되는 조건에서 IgH-IRES-GFP 및 IgL-IRES-YFP 라이브러리로 2-단계 형질도입을 수행하는 방법을 나타내며, 결과적으로 거의 대부분의 형질도입된 세포에서 폴리펩티드 사슬이 클론 발현된다. 1.5x106 개의 1624-5 뮤린 A-Mu1V 형질전환된 preB 세포가, 도 15에 이미 설명된 IgH 및 IgL 사슬 라이브러리 IgH-LIB-IRES-GFP 또는 IgL-LIB-IRES-YFP를 각각 암호화하는 재조합 레트로바이러스 벡터를 함유하는 벡터 입자 상청액(1:1; 1:5; 1:20; 1:50; 1:100; 1:200으로 희석)을 상이한 양으로 보충한 조직 배양 배지 1 ml에 현탁되었다. 형질도입된 세포의 대부분이 숙주 세포 게놈에 통합된 전달 벡터의 단일 카피를 수용했다는 것을 확인하기 위해서, 10% 미만의 유전자 전달 효율을 나타내는 세포(MOI < 0.1, 커플링된 GFP 또는 YFP 리포터의 발현에 의해 검출된 대로)가 감염 4일 후에 FACS 정렬을 이용하여 부화되었다. 세포는 6일 동안 확장되었고, 상기 설명된 1:5의 희석 비율로 항체의 경쇄 코딩 영역이 패키징된 벡터 입자를 사용하여 2차 형질도입되었다. 여기서, 중쇄 발현에 대해서 선별된 GFP-양성 세포는 IgL-LIB-IRES-YFP 라이브러리를 형질도입한 벡터 입자로 감염되었고, 그 반대로도 이루어졌다. 감염 4일 후에 GFP 및 YFP를 발현하는 형질도입된 세포가 FACS를 이용하여 부화되었다. 2차 형질도입 후 세포의 약 20%가 GFP 및 YFP 발현을 나타냈다. 세포당 오직 하나의 벡터 통합만이 발생했다는 것을 확인하기 위해서, 두 번째 회전에서 형질도입된 리포터 유전자의 아주 적거나 중간 정도로 발현했던 집단의 약 1/3이 부화되었다(약 8%).
도 17은 레트로사이트 디스플레이 실험의 최적 IL-15 항원 염색 조건을 허용하는 최적 조건을 규정하기 위한, FACS에 의한 항-IL-15 기준 항체를 발현하는 preB 세포의 집단에 의한 IL-15 염색의 적정을 나타낸다. 실시예 7에 상세히 개시된 대로, 염색 과정은 나타낸 대로, 바이오틴화된 폴리클로날 항-IL-15 2차 항체의 두 상이한 농도에서, 2.5㎍/ml~0.1㎍/ml 범위의 IL-15 항원의 적정을 포함했으며, 2차 항체가 FACS에 의해 스트렙토아비딘-PE 콘쥬게이트와 함께 검출되었다. 표면 Ig+ 세포는 항-IgκL 사슬-APC 항체로 대조 염색되었다. 보이는 대로, 최적 IL-15 염색은 0.1 또는 0.5㎍/ml IL-15 항원 농도에서, 3㎍/ml의 2차 폴리클로날 항-IL-15 항체를 사용했을 때 달성된다.
도 18은 도 17에서 결정되어 도시된 최적화된 IL-15 염색 조건을 사용함으로써, 상이한 희석 비율로 항체 발현 preB 세포의 다종 라이브러리에 스파이크된, 항-IL-15 기준 항체 발현 preB 셀라인(PC = 양성 대조군)의 FACS-확인의 분석을 나타낸다. 위 좌측 패널은 IgH와 IgL 사슬 라이브러리의 조합으로 형질도입된 대조군 preB 세포의 IgκL 사슬-APC/IL-15 이중 염색을 나타내며, 이것의 생성은 도 16에 이미 도시되었다(NC = 음성 대조군). 위 우측 패널은 실시예 7에 상세히 개시된 대로, 기준 IL-15 항체(PC = 양성 대조군)의 IgH 및 IgL 사슬을 암호화하는 레트로바이러스 발현 벡터로 형질도입된 preB 세포의 IgκL 사슬-APC/IL-15 이중 염색을 나타낸다. NC 세포의 FACS 프로파일은, 항-IgκL 사슬-APC 염색에 의해 검출된 대로, Ab-라이브러리 형질도입된 세포의 약 50%가 표면-Ig+라는 것을 나타낸다. 그러나, 표면-Ig+ 세포 중 어느 것도 모두 IL-15에 대한 결합을 나타내지 않는다. 이와 대조적으로, 90%를 넘는 세포가 표면 Ig를 발현했던 PC 세포는 x-축 상의 특이적 신호에 의해서 특이적 IL-15-항원 결합이 보인다. 예상된 대로, PC 세포에서 표면-Ig의 더 높은 발현은 특이적 IL-15 신호의 이동을 더 많이 표출했고, 결과적으로 표면-Ig+/IL-15 결합 세포의 사선 염색 패턴이 나타나며, 이것이 나타낸 대로 타원-모양 게이트로 강조된다. NC 무작위 항체 라이브러리 발현 세포 집단에 스파이크된 PC 세포의 5개의 상이한 희석 비율에서 표면-Ig와 IL-15-결합에 대한 이중-FACS 염색을 보이는 아래쪽 패널은 특이적 항-IL-15 기준 항체 발현 PC 세포가 NC 세포 라이브러리에 스파이크된 PC 세포 퍼센트에 가까운 빈도로 검출될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 19는 실시예 7에 상세히 개시된 대로, 다종 항체 라이브러리로부터 레트로사이트 디스플레이에 의한 IL-15-반응성 세포 집단의 부화 개념에 대한 증거이다. 위 패널은 Ig-레트로벡터 형질도입된 세포의 빈도를 나타내는 GFP/YFP 발현(y-축)과 특이적 IL-15 염색을 나타내는 IL-15/항-IL-15-bio(x-축)에 대한 FACS 염색을 나타낸다. 위 좌측 패널은 비형질도입된 대조군 preB 세포(NC = 음성 대조군)의 2색 FACS 분석을 나타내고, 위 가운데 패널은 양성 대조군(PC)인 항-IL-15 기준 항체로 형질도입된 preB 세포의 2색 FACS 분석을 나타낸다. 위 우측 패널은 > 7x104 개의 상이한 다종 IgκL 사슬 라이브러리와 조합된 기준 항-IL-15 항체의 IgH 사슬을 암호화하는 단일 IgH 사슬 암호화 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 세포 집단의 동일한 2색 FACS 염색을 나타낸다. 따라서, 이 IgL 사슬 셔플링된 라이브러리는 잠재적으로 >7x104 개의 상이한 항체를 함유하며, 예상되는바, 항체-발현 및 IL-15 반응성 세포의 매우 좁은 게이팅에 의해서도, 위 우측 FACS 프로파일에 나타난 대로, 매우 적은 IL-15 반응성 세포도 검출될 수 있다(여기서는 2.42%, 나타낸 대로 음성 집단에 근접한 게이팅으로 인해). 부화된 집단은 조직 배양물에서 확장되었고, 동일한 염색 과정 및 FACS-정렬이 3회 반복되었으며, 이것은 아래쪽 3개의 FACS 패널에 동일한 조건 하의 3회의 FACS 염색으로 나타난다. 보이는 대로, 연속 부화/세포 확장 사이클에 의해 세포 집단은 항체 발현에 대해 거의 100% 양성으로 되었고, IL-15-반응성에 대해서는 원 PC 셀라인보다 훨씬 더 양성이었다. 이 데이터는 반복된 FACS 정렬 및 확장에 의해서, 연속 3회전의 레트로사이트 디스플레이를 이용하여 거의 검출 불가능한 항원-반응성 세포 집단으로부터 고도의 항원-반응성 세포 집단이 본질적으로 100% 항원-반응성 세포 집단까지 성공적으로 부화될 수 있다는 것을 분명히 나타낸다.
도 20은 도 19에 설명된, 3회 IL-15 항원 부화된 세포 집단으로부터 단일 세포 정렬 후 확립된 24개 개별 세포 클론 중 대표적인 4개의 특이적 IL-15 항원 반응성을 예시하고 확인한다. 4개의 선택된 세포 클론을 클론 F, H, V 및 W로 지칭하며, 이들은 모두 GFP/YFP 양성 세포에서 특이적 IL-15 반응성을 나타내고, 이것은 안정하게 형질도입된 Ig 암호화 레트로바이러스 벡터의 징표이다. 예상된 대로, 더 높은 항체 수준을 발현하는, 더 높은 GFP/YFP 발현 세포는 더 높은 IL-15 특이성을 나타냈으며, Ig/IL-15 이중 염색에서 특징적인 사선 염색 신호가 생긴다. 모든 세포 클론은 특이적 IL-15 반응성을 나타냈으며, 염색에서 IL-15 항원의 생략에 의해 증명된 대로, 이것은 IL-15-특이적 반응성(도시하지 않음)의 손실을 야기했다. 이 데이터는 레트로사이트 디스플레이가 초기에는 거의 검출 불가능한 항원-반응성 세포를 나타내는 세포 집단으로부터 높은 빈도의 항원-반응성 세포 클론을 얻기 위한 효과적인 방법이라는 개념에 대한 증거를 제공한다.
도 21은 초기 세포 집단 내의 최소한의 IL-1베타-반응성 세포 집단에서 시작하여, 연속 3회전 레트로사이트 디스플레이 세포 부화/조직 배양 확장을 이용하여 본질적으로 40% 항원-반응성 세포 집단까지에 이른 IL-1β 항원-반응성 세포의 성공적인 부화를 도시함으로써 항원-반응성 세포의 성공적인 레트로사이트 디스플레이 부화 개념에 대한 두 번째 증거를 제공한다. GFP/YFP 발현(항체 발현의 징표)과 IL-1β 반응성에 대해 이중 염색이 제공된다. 나타낸 대로, 위쪽의 FACS 염색은 비형질도입된 preB 선별자 세포(음성 대조군 = NC, 위 좌측) 및 항-인간 IL-1β 특이적 기준 항체 SK48-E26(양성 대조군 = PC, 위 우측)을 암호화하는 레트로바이러스 벡터로 공-형질도입된 세포에 대해 제공된다. 아래쪽 패널은 실시예 8에 상세히 지시되고 개시된 대로, 레트로사이트 디스플레이 부화 전(Ox 부화)과 1, 2 및 3회전의 레트로사이트 디스플레이 부화 후에, SK48-E26 기준 항체의 IgH 사슬에 대한 >1.2x105 개 개별 IgL 사슬 클론의 다종 IgL 사슬 라이브러리의 셔플링에 의해 생성된 항체 라이브러리의 항체 발현 및 IL-1β 반응성에 대한 FACS 염색을 나타낸다. 이들 데이터는 2차 항원을 이용하는 개념에 대한 독자적인 증거를 제공하며, 레트로사이트 디스플레이 발현 및 부화는 초기의 거의 검출 불가능한 수준으로부터 항원-특이적 세포의 집단을 부화시키는 강력한 수단이다.
도 22는 실시예 8에 상세히 개시된 대로, 레트로사이트 디스플레이에 의해서 확인된 신규 항체의 IL-1β 항원 반응성의 확인을 나타낸다. 도 21에 도시된 3x 부화된 세포 집단으로부터 24개의 개별 세포 클론이 단일 세포 정렬에 의해 확립되었다. 실시예 8에 개시된 대로, 이들 24개 세포 클론 중 12개의 클론이 신규 IgL 사슬을 숨기고 있었고, 이것을 LCB24로 명명했다. IL-1β 특이적 기준 항체 SK48-E26의 IgH 사슬과 함께 공-발현된 신규 LCB24 IgκL 사슬의 IL-1β 특이성(실시예 8 참조)이 클로닝되고 서열 특성화된 IgL 및 IgH 사슬 레트로바이러스 발현 벡터의 원 선별자 셀라인으로의 재형질도입시 FACS에 의해 분석되었다. FACS 염색은, 나타낸 대로, 두 가지 색의 FACS에 의한 항체 발현(GFP/YFP를 통한) 및 IL-1β 반응성의 분석을 나타낸다. 예상된 대로, 비형질도입된 선별자 세포(NC = 음성 대조군, 좌)에서는 IL-1β 반응성이 검출되지 않지만, 기준 항체 SK48-E26(가운데)의 IgH 및 IgL 사슬을 발현하는 양성 대조군 세포에서는 분명한 IL-1β 특이적 염색이 검출된다. 유사한 IL-1β 특이적 신호가 SK48-E26 기준 항체 IgH 사슬 벡터 및 IL-1β 특이적 레트로사이트 디스플레이 세포 클론(우)으로부터 클로닝된 신규 완전 인간 LCB24 IgκL 사슬로 형질도입된 항체 발현 선별자 세포에서 검출될 수 있다.
도 23은 LCB24 IgkL 사슬/SK48-E25 IgH 사슬에 의해 암호화된 신규 항체에서 IL-15에 대한 교차-반응성의 결여를 확인한다. 나타낸 대로, 좌측 두 개의 FACS 염색은 IL-15 FACS 염색 분석에 대한 음성 및 양성 대조군을 나타낸다(NC = 음성 대조군, 비형질도입된 선별자 세포, PC = 양성 대조군, 항-IL-15 기준 항체를 암호화하는 IgH 및 IgL 사슬 벡터로 형질도입된 선별자 세포). 우측 두 개의 FACS 염색은 SK48-E26 IgH 및 LCB24 IgL 사슬로 이루어진 신규 항체를 암호화하는 항체 발현 세포에서, 또는 원 SK48-E26 IgH/IgL 조합을 발현하는 세포에서 IL-15 반응성을 나타내지 않는다. 이것은 SK48-E26 IgH 및 LCB24 IgL 사슬로 이루어진 신규 항체가 IL-1β에 대해 특이적일 뿐만 아니라, 일반적으로 IL-15 같은 다른 단백질에 대해 교차-반응성(또는 점착성)이 아니라는 것을 증명한다.
도 24는 실시예 9에 개시된 대로 다종 IgL과 다종 IgH 사슬 라이브러리의 셔플링에 의해 생성된 항체 라이브러리로부터, 연속 3회전 수행된 레트로사이트 디스플레이 세포 부화/조직 배양 확장에 의한 스트렙토아비딘-APC-Cy7 항원-반응성 세포의 성공적인 부화를 도시한다. 나타낸 대로, 스트렙토아비딘-APC-Cy7 반응성 세포가 연속 3회전 고속 세포 정렬에 의해서 부화된 다음, 세포 배양 확장되었다. 스트렙토아비딘-APC-Cy7 항원에 대한 항체 발현 세포의 결합-특이성은 항원의 존재(하부 패널) 및 부재(상부 패널) 하에서 연속 부화된 세포 집단의 FACS 프로파일을 분석함으로써 증명된다. 이것은 사슬 셔플링 접근법에 사용될 수 있는 어떠한 기준 항체의 부재 하에서도 레트로사이트 디스플레이에 의해 항원-특이적인 효과적인 부화가 이루어진다는 개념에 대한 증거를 나타낸다.
도 25는 스트렙토아비딘-APC-Cy7 탠덤 염료의 Cy7 형광색소에 특이적인 반응성에 대한 도 24에 개시된 3회 레트로사이트 디스플레이 부화된 세포 집단의 특이성에 대한 증거를 제공하는 데이터를 제시한다. 이를 위해서, 비형질도입된 선별자 세포, IgH/IgL 사슬 라이브러리 조합을 발현하는 미부화 세포 및 3회 스트렙토아비딘-APC-Cy7 부화된 세포 집단이, 나타낸 대로, 항체 발현(GFP/YFP 형광으로 표시) 및 상이한 스트렙토아비딘-형광색소 콘쥬게이트에 대한 반응성에 대해 FACS에 의해서 분석되었다. 3회 스트렙토아비딘-APC-Cy7 부화된 세포 집단은 스트렙토아비딘-APC-Cy7에만 결합되었고, 스트렙토아비딘-APC나 스트렙토아비딘-APC-Cy5.5에는 결합되지 않았으며, 스트렙토아비딘-APC-Cy7의 비-특이적 염색 역시 선별자 세포나 다종 항체 라이브러리를 발현하는 선별자 세포에서 검출될 수 없었다. 이것은 항원-특이적 기준 항체로부터 유래하는 항체 IgH 또는 IgL 사슬의 필요 없이, 다종 항체 라이브러리를 발현하는 세포로부터 특정 항체의 효과적이고 고도로 특이적인 레트로사이트 디스플레이 부화 개념에 대한 증거를 제공한다.
도 26은 동일한 IgH 사슬을 공유하고 있는, 레트로사이트 디스플레이에 의해서 확인된 2개의 신규 인간 항체로서, 항원-스트렙토아비딘-APC-Cy7에 대해 특이적 결합을 나타낸다. 실시예 9에 개시된 대로, 레트로사이트 디스플레이 부화를 3회전 수행한 후 단일 정렬된 세포 클론으로부터 두 상이한 IgH 사슬 서열(HC49 및 HC58)과 두 상이한 IgL 사슬 서열(LC4 및 LC10)이 확인될 수 있었다. 이 도면에서, IgL 사슬 LC4 및 LC10과 HC49 및 HC58의 모든 가능한 쌍들이 표적 항원 스트렙토아비딘-APC-Cy7에 대한 반응성에 대해 시험되었다. 이를 위해서, 상이한 IgH 및 IgL 사슬을 암호화하는 레트로바이러스 발현 벡터의 조합이 실시예 9에 지시되고 개시된 대로 선별자 세포에 형질도입되었다. 도시된 대로, 동일한 IgH 사슬을 공유하는 신규 항체들인 HC58/LC4 및 HC58/LC10은 스트렙토아비딘-APC-Cy7 항원에 대한 특이적 결합을 나타냈지만, HC49/LC4 및 HC49/LC10에 의해 암호화된 항체들은 유의한 결합 활성을 나타내지 않았다. 선별자 세포에의 재-형질도입시 항원 스트렙토아비딘-APC-Cy7에 대한 두 신규 항체 클론의 특이적 결합은 복잡한 항체 라이브러리에서 드문 항체 결합자를 확인하는데 본원에 개시된 레트로사이트 디스플레이를 사용하는 것이 가능하다는 것의 결정적인 증거를 제공한다.
용어
본원에서 사용된 "및/또는"은 편의상 두 가지의 특정된 특징 또는 구성요소의 각각의 특정 명세가 나머지 하나와 함께 또는 그것만 단독으로 취해져야 한다는 것을 말한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B의 각각의 특정 명세가 취해져야 하며, 여기서 각각은 개별적으로 설정된 것과 동일하다.
친화성 성숙: 항원-자극된 B 림프구에 의해 생산된 항체의 결합 특이성의 항원-추진된 개선의 고도로 조절된 면역학적 과정으로서, 대부분 배 중심에서 발생한다. 이 과정은 항체의 가변 도메인의 코딩 영역에 대부분 표적화되는 체세포 초돌연변이에 의해 야기되며, 이것은 고 친화성 항체를 생성하는 B 림프구의 선별적 확장 및 생존과 커플링된다.
항체: 이 용어는 천연 생산된 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성 생산된 면역글로불린을 설명한다. 또한, 이 용어는, 예를 들어 낙타 또는 라마로부터의 중쇄 유일 항체와 같은, 항체-항원 결합 부위를 포함하는 어떤 폴리펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 전장 항체는 2개의 동일한 중쇄(H)와 2개의 동일한 경쇄(L)를 포함한다. 모노머 형태의 2개의 IgH와 2개의 IgL 사슬은 대칭형 Y 모양의 이황화물 연결된 항체 분자로 조립되고, 이것은 IgH와 IgL 사슬의 가변 영역의 조합에 의해 형성된 2개의 결합 도메인을 가진다.
항체는 천연 출처로부터 정제에 의해 분리되거나 얻어질 수도 있고, 또는 유전자 조작, 재조합 발현 또는 화학 합성에 의해 얻어질 수도 있으며, 이 경우에는 점라인 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되지 않은 아미노산을 함유할 수 있다. 완전 인간 항체는 인간 중쇄와 경쇄, 즉 인간 종으로부터의 가변 도메인과 불변 도메인을 포함한다. 키메라 항체는 또 다른 척추동물 종의 불변 영역 도메인과 조합된 한 척추동물 종으로부터의 가변 영역 도메인을 포함한다. 키메라 항체의 불변 도메인은 일반적으로 인간 항체 또는 항체들로부터 유래된다. 인간화된 항체는 인간 기원의 IgH 및 IgL 가변 도메인의 프레임워크 영역 상에 비인간 항체의 CDR을 접목함으로써 생산될 수 있다.
항체 단편: 전체 항체의 단편들은 항원 결합 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인과 VL 도메인이 펩티드 링커에 의해서 연결되어 이 2개의 도메인이 회합됨으로써 항원 결합 부위를 형성한 단쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이중특이적 단쇄 Fv 다이머; 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축된 다가 또는 다중특이적 단편인 "디아체(diabody)"가 있다. Fv, scFv 또는 디아체 분자는 VH와 VL 도메인을 연결하는 이황화물 다리의 편입에 의해 안정화될 수 있다. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디(minibody)도 또한 제조될 수 있다. 결합 단편의 다른 예는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 몇 개의 잔기의 첨가로 인해 Fab 단편과 차이를 나타내는 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올기를 지니는 Fab' 단편인 Fab'-SH이다. 어떤 경우, 중쇄 또는 경쇄가 항체 단편으로 간주될 수도 있다. 당업자가 당연히 인정하는 대로, 상기 모든 항체 단편은 상기 단편이 유래된 전체 자생 항체의 적어도 하나의 기능을 나타내므로 '기능적' 단편이라고 칭해진다.
항원: 면역글로불린(또는 항체)의 가변 도메인에 의해 결합될 수 있는 어떤 생물분자 또는 화학적 존재.
결합 단백질: 이 용어는 서로 결합하는 한 쌍의 분자에서의 한 단백질을 정의한다. 결합 단백질의 결합 파트너는 일반적으로 리간드라고 한다. 결합 쌍의 단백질은 천연 유래될 수도 있고, 또는 완전히 또는 부분적으로 합성 생산될 수도 있다. 분자 쌍 중 한 단백질은 그것의 표면에 분자 쌍 중 나머지 단백질의 특정한 공간적 및 극성 구조에 상보하는 영역, 또는 공동을 가지며, 여기에 분자 쌍의 나머지 단백질이 결합된다. 결합 쌍 타입의 예는 항원-항체, 바이오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이다. 본 발명은 바람직하게 항원-항체 타입 반응에 관련된다.
상보성 결정 영역(CDR): 이 용어는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역을 말한다. CDR은 항원과의 접촉이 직접 성립되는 면역글로불린의 3-차원 구조의 영역이다. 항체는 전형적으로 3개의 중쇄 CDR과 3개의 경쇄 CDR을 함유한다. CDR은 일반적으로 항원 수용체들 중 가장 다양한 부분이다.
도메인: 특정한 3-차원 구조를 특징으로 하는 생물분자의 구조적 부분(예를 들어, 소위 말하는 Ig-초과에 속하는, 면역 시스템의 많은 분자에서 발견될 수 있는 Ig-유사 도메인과 같은, 구조적으로 관련된 면역글로불린의 가변 또는 불변 영역 도메인).
배 중심: 말초 림프양 기관(예를 들어, 림프절 또는 비장)에 존재하는 뚜렷한 조직학적 구조로서, 여기서 항원 제시 세포들과 상이한 림프구 집단들 사이에서 동족 상호작용이 일어나고, 그 결과 항원-반응성 림프구의 증식성 확장, 및 항원-반응성 B 림프구에 의해 생산된 항체의 친화성 성숙과 부류 전환 재조합이 일어난다.
점라인 형태: 모 유전자로부터 물려받은 점라인을 통해 다음 세대로 전해지는 유전자 및 유전자 좌위의 재배열되지 않은 형태. 예를 들어 림프구에서의 V(D)J 재조합 같은, 체세포에서 발생하는 DNA 재조합 사건에 의해 어떤 유전자 좌위의 유전자 정보가 재셔플링되거나 상실되어 유전자가 점라인 형태로부터 변하게 된다.
PreB 림프구: 전구체 B 림프구는, 예를 들어 λ5 및 VpreB1와 VpreB2 유전자 같은 특정한 전구체 B 세포 특이적 유전자의 발현, 및 V(D)J 재조합에 수반되는 전구체 림프양 특이적 인자들(예를 들어, RAG-1, RAG-2)의 발현을 특징으로 한다. 이에 더하여, 전구체 B 림프구는 양측 중쇄 대립형질 상에 DJH의 존재 또는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 대립형질 상에서 적어도 하나의 VHDJH 재배열을 특징으로 하지만, 경쇄 유전자 좌위는 재배열되지 않은 점라인 형태로 유지되므로 preB 세포는 완전한 항체를 발현할 수 없다.
일차 림프양 기관: 조혈줄기세포로부터 림프구가 발생하는 기관이며, 마우스 및 인간에서는, 예를 들어 골수, 흉선, 및 태아일 동안의 간이 이러한 기관이다.
"유사-점라인" 형태: V, 선택적으로 D 및 J 유전자 세그먼트의 인공적 재배열로서, 이때 측면 재조합 신호 서열이 인공 유전자 구성물에서 점라인 면역글로불린 유전자 좌위로부터 클로닝되며, 이러한 인공 유전자 구성물에서 V, 선택적으로 D 및 J 유전자 세그먼트의 재배열은 V(D)J 재조합 과정에 의해 가변 코딩 영역으로 유전자 세그먼트의 부위-특이적 재조합을 더 허용한다.
체세포 돌연변이: 게놈의 특정 영역에 점돌연변이의 도입을 가져오는 체세포 내에서의 과정. 이것이 높은 빈도(>10-4 돌연변이/염기쌍/세포분열)로 발생하는 경우를 체세포 초돌연변이라고 한다.
V(D)J 재조합: 이것은 항체 및 T 세포 수용체 다양성을 생성하는 과정이며, 기능적 항체 유전자들을 만드는 방법이다. 이것은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 단백질을 코딩하는 많은 유전자 세그먼트들의 재배열을 수반하며, 림프구에서만 일어난다.
트랜스펙션하는/트랜스펙션: 진핵 세포와 관련하여, 이것은 진핵 세포에 핵산 서열을 도입하는 과정이며, 일반적으로 화학 및/또는 물리적 방법의 사용과 연합된다.
형질전환하는/형질전환: 진핵 세포와 관련하여, 이것은 계속 증식하는 셀라인을 확립하기 위한 세포의 불멸화 과정이다.
형질도입하는: 재조합 바이러스의 생산을 통해 척추동물 세포에 DNA를 송달하는 과정. 이를 위해서, 바이러스 입자의 구조 단백질을 발현하는 패키징 셀라인이 바이러스 구조 단백질 안에 바이러스 DNA 구성물을 패키징하기 위한 조절 요소를 포함하는 재조합 바이러스 DNA 구성물로 트랜스펙션된다. 이에 의해서, (포유동물) 표적 세포를 감염시키는데 사용될 수 있는 재조합 바이러스가 생산되며, 결과적으로 재조합 바이러스 게놈에 클로닝된 유전자 정보가 도입된다.
벡터/구성물: 상이한 생물들과 종들 사이에서 핵산 요소를 이동시키는데 사용될 수 있으며, 또한 게놈 정보를 증식, 증폭 및 유지하는데도 사용될 수 있는 인공적으로 생성된 핵산 서열.
상세한 설명
항체 또는 면역글로불린은 가장 광범한 부류의 결합 단백질로서, 치료 및 진단 용도에 특히 유용한 것으로 입증되었다. 치료용 항체는 상업적으로 가장 성공한 부류의 생물 의약으로 발전하였으며, 항체 기반 치료제를 개발하기 위한 새롭고 강력한 방법에 계속 관심이 모이고 있다(Baker, 2005).
항체는 이황화 결합을 통해서 공유 연결된 2개의 동일한 중쇄(H) 및 경쇄(L) 당단백질로 구성된다(도 2a). 각각의 면역글로불린 중쇄(IgH) 및 경쇄(IgL) 폴리펩티드는 상이한 항체마다 다른 N-말단 가변 도메인과 동일한 면역글로불린 서브타입(이소타입)에 속하는 상이한 항체에서는 동일한 C-말단 불변 영역을 포함한다(도 2a). IgH와 IgL 사슬 가변 도메인의 조합에 의해서 항체의 항원 결합 주머니가 만들어지고 그것의 특이성이 결정되는 반면, 불변 영역은 항체의 면역 이펙터 기능을 결정한다. 이들의 가변 도메인에 존재하는 면역글로불린의 가변성은 VH 및 VL 도메인이 다수의 유전자 세그먼트에 의해 암호화된다는 사실에 기인하며, 이들 세그먼트는 V(가변), D(다양성) 및 J(연결) 유전자 세그먼트로 지칭된다. B 림프구의 분화 동안 하나의 V, 하나의 D(IgH 사슬 좌위에만 존재한다) 및 하나의 J 유전자 세그먼트가 각 세포에서 무작위로 선택되고, 부위-특이적으로 재배열되어 VH 또는 VL 도메인의 코딩 영역이 생성된다. 이 부위 특이적 유전자 재조합 과정은 오직 전구체 림프구에서만 발생하며, 이것은 V(D)J 재조합이라고 알려져 있다(Grawunder et al., 1998)(도 2b 및 2c에도 언급됨). 유전자 세그먼트의 재배열은 재조합 활성화 유전자(RAG) 1 및 2 산물에 의해서 매개된다. 다수의 V, D 및 J 유전자 세그먼트와 유전자 세그먼트 연결의 부정확성으로 인하여, 상이한 V 영역 특이성의 막대한 레퍼토리가 면역 시스템에 의해서 매일 생산되는 수백만 개의 B 림프구에 의해 발생될 수 있다(Grawunder et al ., 1998). 면역글로불린 중쇄 유전자 좌위가 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 함유하기 때문에, 항체의 VH 도메인의 코딩 영역은 두 번의 연속 V(D)J 재배열 사건을 필요로 하지만, 면역글로불린 유전자 좌위는 D 유전자 세그먼트를 결여하고, 하나의 V의 J로의 재배열 사건에 의해 VL 코딩 영역이 생성된다(도 2c). 따라서, IgH 사슬의 CDR3 영역에서 V(D)J 재조합에 의해 발생되는 접합부 다양성은 IgL 사슬에 대한 오직 한 번의 재배열 사건에 의해 발생되는 CDR3 접합부 다양성보다 크다. 이에 더하여, IgH 사슬 유전자 재배열이 발생하는 조기 B 세포 분화 단계에서 효소 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스페라제(TdT)가 발현되고, 이것은 D-J 및 V-D 접합부에서 주형이 아닌 뉴클레오티드를 부가할 수 있으며(소위 말하는 N-서열 다양성), 이로써 IgH 사슬 CDR3 레퍼토리가 추가로 다양화된다. 이와 반대로, B 세포 분화 동안 후기 V-J 유전자 세그먼트 연결시 형성되는 IgL 사슬의 CDR3 레퍼토리는, TdT 발현이 매우 하향 조절된 경우(Li et al., 1993) 다소 덜 복잡해진다. VH 및 VL 코딩 영역에서 CDR3 다양성의 발생과는 별도로, IgH 및 IgL 사슬 레퍼토리는 모두 T 세포 의존성 면역 반응 과정에서 성숙 B 세포에서 촉발되는 체세포 초돌연변이의 과정에 의해 더 다양화될 수 있다(Papavasiliou & Schatz, 2002). 체세포 돌연변이는 VH 및 VL 코딩 영역에 특이적으로 표적화되고, B 계통 특이적 효소 활성화 유도 시티딘 데아미나제(AID로 약칭됨, Papavasiliou & Schatz, 2002 참조)에 의해 매개된다. 면역화 동안 발생하는 체세포 초돌연변이의 결과로서, 면역원에 대한 고 친화성 항체 돌연변이를 발현하는 세포가 대부분 배 중심에서 발생하는 면역화 과정에서 양성 선별되고, 결과적으로 고 친화성 항체를 생산하는 세포가 부화된다. 또한, 이들 항체는 CDR 1 및 2에 돌연변이를 축적하는데, 이 과정을 항체 레퍼토리의 친화성 성숙이라고 한다. AID 매개된 다양화와 VH 및 VL 코딩 영역에 대한 특이적 표적화는 재배열된 VH 및 VL 코딩 영역에 가까이 위치된 IgH 및 IgL 사슬 유전자 좌위의 시스-조절성 유전자 요소 또는 모티프, 특히 인핸서 요소의 존재에 의해 현저히 증가된다(Bachl & Olsson, 1999).
종래의 전장 치료용 항체에 더하여, 완전 인간 항체의 단편, 예를 들어 소위 말하는 Fab 단편(도 2a), 단쇄 Fv 단편(도 2a), 단일 VH 도메인만으로 구성된 나노바디 등을 포함하는 추가 포맷의 결합 단백질이 또한 치료제 및 진단제로서 점점 증가하여 조사되고 있다. 그러나, 원하는 전장 항체의 코딩 정보를 이용할 수만 있다면 이러한 기능적 항체 단편이 단백질 기반의 표준 생화학 방법, 또는 종래의 분자생물학 방법에 의해 전장 항체로부터 쉽게 유래될 수 있다는 것이 당업자에게 자명하다.
종래에는 관심의 분자 또는 에피토프(항원)에 대해 지정된 모노클로날 항체가 작은 실험실, 또는 농장 동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 또는 염소 및 당나귀의 면역화에 의해서 각각 생성된다. 반복된 면역화 후, 동물의 혈청으로부터 폴리클로날 항체를 분리하기 위해 동물에서 채혈하고, 모노클로날 항체의 생성을 위해 동물을 죽여서 림프절이나 비장과 같은 2차 림프양 기관으로부터 림프구가 분리된다. 분리된 림프구가 불멸 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마가 생성되고, 이것이 계속해서 서브클로닝된 다음, 예를 들어 특정 항원 또는 표적과의 결합 같은 원하는 기능적 특성을 나타내는 모노클로날 항체의 분비에 대해 스크리닝된다.
항체 조작에 있어서의 첫 번째 획기적 진전, 즉 Koeler 및 Milstein(Koeler & Milstein, 1975)에 의한 소위 말하는 모노클로날 항체의 생성을 위한 하이브리도마 기술의 개발로부터 인간 질환의 치료에 모노클로날 항체가 사용될 수 있게 되기까지는 오랜 시간이 걸렸다.
항체가 임상에 사용되는 것이 지연된 주된 이유는 설치류 항체를 사용하여 인간 환자를 치료한 것과 관련하여 초기에 차질이 있었기 때문이다. 이러한 항체가 환자의 면역 시스템에 주입된 경우, 면역 시스템은 설치류 항체를 외래 단백질로서 인식하여 중화 항체의 생성을 포함하여 이들 항체에 대한 면역 반응을 시동시킨다(HAMA = 인간-항-마우스 항체 반응이라고 한다). HAMA 반응은 적용된 항체의 반감기와 그에 따른 항체 효능을 상당히 감소시킬 수 있고, 면역 시스템이 주사된 비인간 단백질에 대해 과잉반응하는 경우에는 심지어 심각한 부작용이 생길 수도 있다.
따라서, 인간 항체와 "더" 유사한 치료용 항체를 개발하는데 대단한 의학적 상업적 관심이 있었다. 초기에 이것은 기존 설치류 항체의 유전자 조작에 의해 달성되었으며, 그 결과 키메라 또는 인간화된 항체가 개발되었다(Clark, 2000). 키메라 항체는 표준 유전자 조작 및 클로닝 기술을 사용하여 설치류 항체의 가변 결합 도메인과 인간 항체의 불변 영역을 융합함으로써 생성된다. 이와 반대로, 인간화된 항체는 설치류 항체로부터의 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDR)을 인간 항체의 가변 영역 프레임워크로 전달함으로써 생성되며, 이것 역시 표준 분자생물학 기술에 의해 행해진다. 키메라 항체를 생성하는 과정은 간단하지만, 이들 항체는 33%의 이종성 서열을 또한 함유하며, 면역원성의 상당한 가능성을 숨기고 있다(Clark, 2000). 사실, 키메라 항체의 마우스 부분에 대한 면역 반응이 문헌에 공개되어 있으며, 이것을 HACA-반응(HACA = 인간 항-키메라 항체)이라고 한다.
상기 언급된 것과는 반대로, 인간화된 항체에서는 면역원성의 가능성이 더욱 감소된다. 그러나, 인간화된 항체를 유전자 조작하면서 동시에 CDR 접목 후 설치류 항체의 원래의 결합 친화성과 특이성을 유지하는 과정은 쉽지 않으며, 대체로 반복된 돌연변이유발 및 스크리닝 사이클에 의한 광범한 추가의 최적화를 필요로 한다. 상기 언급된 이유 때문에 키메라화 및 인간화 접근법은 치료용 항체의 개발을 위해 선택하는 방법으로서 최근 몇 해 동안 덜 인정되고 있었다.
또한, 치료용 항체의 개발을 위한 키메라 및 인간화된 항체가 부재하는 개발이 혁신 기술 플랫폼의 개발에 의해 추진되었으며, 이것은 아미노산 서열이 인간 혈청 항체와 동일한 "완전 인간" 항체의 개발을 가능하게 했다. 완전 인간 항체는 이론적으로는 인간 환자에서 최소한의 면역원성과 부작용을 유발한다고 생각된다.
두 가지의 가장 확립된 "완전 인간 항체" 개발 플랫폼은 다음과 같다:
A) 인간 면역글로불린 트랜스젠 마우스 기술, 여기서는 점라인 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌위의 커다란 트랜스젠이 마우스 게놈에 도입되었다(Green & Jakobovits, 1998; Jakobovits et al., WO98/24893 A2). 인간 항체의 개발에 이들 트랜스젠 마우스를 사용하기 위해서, 이들 트랜스젠 마우스 혈통이 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자 좌위에 기능적 결실을 숨기고 있는 유전자 녹아웃 마우스 계통과 교배되었다. 따라서, 항체 생산 세포의 대략 반이 내인성 마우스 λ 경쇄를 더 숨기고 있는 것을 예외로 하면, 이들 인간 면역글로불린 트랜스젠 마우스는 면역화시 상당한 인간 체액성 면역 반응을 시동시켰고, 따라서 이들은 더 이상 치료용 항체 개발에서 무용하므로 폐기되어야 한다.
B) 파지 디스플레이 기술, 이것은 E. coli의 박테리오파지의 표면에서 항체 단편들(예를 들어, 단쇄 Fv 또는 Fab 단편으로서)의 고도 다종 라이브러리의 발현(디스플레이)에 기초한다(Clackson et al., 1991; McCafferty et al., WO 92/01047 A1). 특이적 결합자의 확인을 위해서, 적합한 복잡성, 특질 및 기원을 가진 파지 라이브러리가 고정된 항원("패닝")에 결합되고, 이로써 고정된 항원에 결합된 파지 클론이 부화된다. 몇 회전의 패닝 후, 선별된 결합 클론의 서열이 결정된다. 이 방법의 변형이 완전 세포-프리 리보솜 디스플레이 기술인데, 여기서는 항체 단편이 파지 상에 나타나지 않고, 오히려 번역된 결합자가 리보솜에 또한 "점착"하는 조건 하에서 시험관내 전사 및 번역에 의해서 발현된다(Hanes & Pluckthun, 1997). 파지 또는 리보솜 디스플레이에 있어서, 한 중요한 단계가 전장 항체로의 결합 단편의 재조작이며, 이것은 그 후에 척추동물 세포에서 발현된다. 파지 선별된 클론의 전장 항체 포맷으로의 재조작과 척추동물 세포 발현 후, 반드시 그럴 필요는 없지만, 항체가 충분히 발현될 수 있는지와 원래의 파지 결합 특성이 여전히 유지되는지 분석되어야 한다.
인간 면역글로불린 트랜스젠 마우스 및 파지 디스플레이 기술이 치료용 항체 개발에 큰 영향을 미쳤지만, 두 기술 플랫폼은 이들과 관련하여 장점과 단점을 모두 가진다.
트랜스젠 마우스 기술의 한 장점은 생체내 면역화시 이들 마우스에서 발생하는 자연적인 친화성 성숙으로 인해 그것이 고 친화성 항체를 송달할 수 있다는 점이며, 이로써 인간 트랜스젠 마우스로부터 유래된 주어진 항원을 향한 인간 항체의 친화성 프로파일이 야생형 마우스의 프로파일과 비슷하다는 것이 증명되었다. 그러나, 인간 면역글로불린 트랜스젠 동물과 관련된 몇 가지 단점도 있는데, 이들 단점은 다음과 같다: 1) 트랜스젠 동물이 항원에 내성인 경우, 대부분은 내인성 발현된 숙주 단백질과의 높은 구조적 유사성으로 인하여, 이러한 "보존된" 항원에 대한 고 친화성 항체의 생성이 매우 어려워질 수 있거나 심지어 불가능해질 수도 있다. 2) 정상 야생형 동물에서와 마찬가지로, 인간 면역글로불린 트랜스젠 동물로부터의 항체는 강한 항원 에피토프에 대해 우선적으로 생성되고, 이것은 치료적 가치를 지닌 기능적이지만 약한 에피토프에 대한 항체를 개발하는 것을 도전적인 과제로 만들 수 있다. 3) 마지막으로, 인간 면역글로불린 트랜스젠 동물은 기존 항체의 친화성 최적화에는 사용될 수 없다. 이것의 이유는 하나의 주어진 항체 클론의 최적화에 대하여, 트랜스젠 동물의 생성에 필요한 시간 프레임이 너무 길기 때문이다. 이와 같은 접근법은 하나의 특정 항체를 위해 2개의 IgH 사슬 및 IgL 사슬 트랜스젠 마우스 계통의 생성을 수반할 것이며, 그 다음에는 이들 두 트랜스젠 계통과 내인성 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 발현에 대해 모두 결핍된 적어도 2개의 녹아웃 동물 계통의 유전자 역교배가 추가로 필요하며, 이 과정에는 몇 번의 번식 세대와 확장된 시간 프레임이 필요할 것이다.
상기 설명된 것과 유사한 한계가 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌위의 점라인 가변(V), 다양성(D) 및 연결(J) 유전자 세그먼트가 부위-특이적 유전자 표적화에 의해 인간 점라인 V, D 및 J 유전자 영역(의 일부)으로 치환된 마우스의 개발에 기초한 최근 설명된 기술-플랫폼에도 적용된다(Murphy & Yancopoulos, WO 02/066630 A1). 이들 "면역글로불린 유전자-녹인" 마우스에서는 뮤린 V, D 및 J 유전자 세그먼트가 마우스 점라인에서 상동성 재조합을 통해 인간 면역글로불린 유전자 중쇄 및 경쇄 유전자 좌위의 세그먼트로 부위 특이적으로 치환되었다. 완전 인간 항체를 생산하는 인간 면역글로불린 트랜스젠 마우스와는 반대로, 이 마우스 계통은 마우스 불변 영역 백본 상에 인간 항원 결합 영역을 지닌 "역-키메라" 항체를 생산한다.
파지 및/또는 리보솜 디스플레이 접근법은 매우 빠른 기술 플랫폼이라는 장점이 인정되는데, 이는 결합 단백질의 복잡한 라이브러리로부터 최초 결합자의 확인이 수 주 이내에 달성될 수 있기 때문이다. 그러나, 파지 디스플레이는 또한 상당한 단점과도 관련된다. 1) 시스템에 어떤 친화성 성숙도 없기 때문에 파지 또는 리보솜 디스플레이 스크린으로부터 고 친화성 결합자를 확인하는 것이 쉽지 않다. 이 문제를 다루기 위해서 1012 개를 넘는 클론을 나타내는 극히 복잡한 파지 라이브러리가 개발되었다. 그러나, 이러한 복잡한 라이브러리를 사용해서도 초기 결합 클론은 대체로 항원에 대해 최적 수준 이하의 친화성을 가지며, 이러한 결합자는 일반적으로 번거롭고 시간 소모적인 추가 최적화 과정을 사용하여 더 최적화될 필요가 있다. 2) 파지 디스플레이에서는 scFv 또는 Fab 단편과 같은 항체 단편만이 발현되는데, 이는 파지 게놈이 비교적 작은 크기의 분자에 대한 코딩 영역만을 수용할 수 있기 때문이다. 3) 결합 단백질이 파지 gIII 단백질과 같은 캐리어 단백질과 융합되어야 한다. 결과의 융합 단백질은 대체로 이들의 모 항체 또는 결합-활성 단백질과 비교하여 낮은 항원-반응성을 나타낸다(Hoogenboom & Chames, 2000). 4) 파지 디스플레이는 호모- 및 헤테로-멀티머 형성을 통해서 결합 표현형을 획득하는 단백질의 제어된 조립을 쉽게 허용하지 않는데, 이는 예를 들어 공유 링커 분자에 의해 강제로 다이머 단백질이 조립되기 때문이다. 그러나, 항체 조작의 경우, 매 항체 중쇄마다 어떤 경쇄와 쌍을 이룰 수 있는 것이 아니기 때문에, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 적절히 조절된 조립이 필수적이다. 5) 박테리아 기반 또는 박테리아 파지 기반 시스템은 디스플레이된 관심의 단백질의 적합한 번역후 변형(글리코실화, 미리스토일화 등)을 제공하지 않으며, 이것은 대체로 발현된 단백질의 결합 특성에 부정적인 영향을 미친다. 6) 원핵 발현은 척추동물 세포와 비교하여 단백질에서 상이한 단백질 접힘을 가져오는데, 이는 세포질 환경, 예를 들어 산화환원 전위 및 샤프롱의 결여 등의 환경이 진핵 숙주 세포 또는 척추동물 숙주 세포와 극히 상이하기 때문이다. 7) 파지 디스플레이 시스템은 계속해서 아주 비-생리적인 "패닝" 조건 하에서 항원 결합 또는 포착에 대해 분석되어 반응성 세포가 부화되고, 그 결과 궁극적으로 폐기되어야 하는 거짓-양성 결합자의 큰 퍼센트가 확인될 수 있다.
상기 언급된 단점의 결과로서, 많은 파지 디스플레이 선별된 항체 단편이 평범한 친화성을 가지게 되고 및/또는 구조적 인공부분을 지니게 될 수 있다. 이에 더하여, 일단 파지 디스플레이 선별된 결합자가 재조작되어 척추동물 세포에서 전장 항체로 발현되면, 파지 선별된 항체가 불량하게 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 일이 있거나, 또는 이들이 변경된 결합 특성을 나타내는 일이 있을 수 있다.
인간 면역글로불린 트랜스젠/녹인 마우스 기술과 파지 디스플레이의 일부 한계를 다루기 위해서, 최근 개발된 대안 기술은 일차 뮤린 preB 세포의 시험관내 유전자 변형을 수반하고, 그 결과 인간 항체를 발현하는 세포가 얻어지며, 이어서 이것이 기능적 B 세포 구획을 결여한 면역결핍 수여자 마우스에 이식된다(Grawunder & Melchers, WO 03/068819 A1). 이로써 이식된 마우스에서 인간 항체를 발현하는 B 세포 하위단위가 부분적으로 재구축되고, 계속해서 어떤 원하는 항원 또는 리간드로 면역화될 수 있다. 이 기술은 신규 항체 또는 결합 단백질을 개발하는데, 또는 규정된 표적에 대한 친화성과 관련하여 기존 항체를 최적화하는데 사용될 수 있다(Grawunder & Melchers, WO 03/068819 A1).
이 방법에서는 레트로바이러스 발현 시스템의 사용이 바람직한데, 이는 발현 구성물의 단일 카피의 유전자 전달이 개별 preB 세포로 전달될 수 있고(Kitamura et al., 1995; Stitz J et al., 2005), 또한 항체 발현 구성물을 마우스의 이식에 사용하는 것에 관해서 선택이 완전히 자유롭기 때문이다(예를 들어, 항원 예비 선별된 항체 라이브러리, 병에 걸린 환자로부터의 항체 라이브러리, 또는 개별 항체 클론). 따라서, 이 기술의 특정한 장점은 그것이 항체의 신규 개발뿐만 아니라 기존 치료용 항체 후보의 최적화에도 적용될 수 있다는 유연성에 있다.
완전 인간 항체의 개발을 위한 다른 설치류 기반 시스템도 설명되었는데, 이것은 인간 공여자로부터 분리된 인간 조혈 선조 세포를 면역결핍 마우스에 이식하는 것을 수반한다(Mosier & Wilson, WO 89/12823 A1). 이러한 인간 세포 이식된 마우스에서는 인간 B 세포가 어떤 범위로 발생될 수 있지만, 최근 이 방법의 개선에도 불구하고(Traggiai et al., 2004), 인간 항체의 친화성 성숙을 수반하는 만족할 만한 체액성 면역 반응은 이러한 "인간화된 마우스"에서 달성되지 않는다. 이에 더하여, 인간 면역글로불린 트랜스젠 또는 "녹인" 마우스의 경우와 마찬가지로, 기존 항체가 최적화될 수 없다.
어떠한 종류의 마우스 기반 항체 기술 플랫폼이든 일반적으로 생체내 면역화가 필요한데, 이것은 시험관내 접근법과 비교하면 여전히 시간 소모적인 과정이다.
따라서, 상기 언급된 마우스-관련 접근법에 더하여, 여러 대안적인 시험관내 기술이 최근 개발되었다. 그러나, 이런 시스템들이 고 품질, 고 친화성 항체 산물을 개발하는데 어느 정도 효과적인지는 더 입증되어야 한다. 한 시험관내 시스템은 분리될 수 있는 특정 질환에 걸린 인간 환자로부터 항원-부화된 기억 B 세포의 분리에 기초하며, 분리 후 시험관내에서 엡스타인-바 바이러스(EBV) 형질전환에 의해 불멸화되고, 이어서 항원-반응성 EBV 계통에 대해 스크리닝된다(Lanzavecchia, WO 04/76677 A2). 개념은 유사하지만 방법은 상이한 접근법으로서, 급성 질환 상태의 환자의 말초혈로부터 항체를 생산하는 혈장 세포가 먼저 분리되고, 비-생산형 이종골수종에 융합되어 불멸화된 다음, 원하는 항체 생산자에 대해 스크리닝하는 방법이 있다(Lang et al, WO 90/13660 A2). 또 다르게는, 백신접종된 또는 면역화된 개체로부터 B 세포를 분리한 후에 세포 집단(Lawson & Lightwood, WO 04/106377 A1; Schrader, WO 92/02551 A1)으로부터, 또는 단일 세포 PCR(Muraguchi et al., WO 04/051266 A1)에 의해 특이적 항체 유전자를 분리하여 클로닝하는 것을 목표로 하는 방법이 설명되었다. 그러나, 이들 기술은 모두 인간 환자에서 관련된 B 세포 집단의 이용성에 의존하고, 일반적인 용도가 많이 제한적이므로, 항-감염 치료용 항체 후보의 확인에 주로 사용된다. 더욱이, 어떠한 인간 B 세포-기반 스크리닝 접근법에서도 항체의 친화성 성숙이나 항원 지정 개발, 또는 기존 항체의 최적화는 가능하지 않다.
따라서, 일시적 발현 시스템을 사용하여 진핵 세포에서 재조합 항체의 발현 및 스크리닝을 포함하는 추가의 대안적 시험관내 방법이 최근 설명되었다(Zauderer & Smith, WO 02/102855 A2 및 Beerli et al, WO 08/055795 A1). 이들 시스템에서는 트랜스젠 마우스와 파지 디스플레이와 인간 B 세포 유래 기술에서의 애로사항이 일부 회피되지만, 이들 시스템 역시 많은 제한을 특징으로 한다. 먼저, 공지된 진핵 세포 기반 항체 발현/스크리닝 기술은 재조합 항체에 대해 안정한 발현 패턴을 부여하지 못하며, 원하는 결합 특이성을 가진 항체-발현 세포의 반복적 부화 사이클이 불가능하다. 둘째, 진핵 세포 기반 항체 발현을 포함하는 공지된 접근법 중 어느 것도 결합자 클론의 클론 발현의 제어가 불가능하며, 치료용 항체 개발의 경우, 원하는 항원 또는 리간드 결합 활성을 가진 매칭되는 IgH 사슬과 IgL 사슬 쌍을 확인해야 하는 도전 과제가 남는다. 셋째, Zauderer 및 Smith(WO 02/102855 A2)에 설명된 기술은 어떠한 시험관내 돌연변이유발, 또는 발현된 항체의 유전자 재조합도 허용하지 않는 단순한 스크리닝 과정에 불과하다. 따라서, 이 기술에서는 결합 단백질의 친화성 성숙 측면이 다뤄지지 않는다. 마지막으로, 진핵 발현/스크리닝 시스템 중 어느 것도 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 V(D)J 재조합 메커니즘을 이용한 개별 항체 발현 구성물로부터 다종 항체 레퍼토리의 인시튜 생성과 양립되지 못한다.
생물학적 활성 펩티드 및 핵산을 확인하기 위한 대안적 방법이 Jensen 등(EP 1 041 143 A)에 의해 제안되었다. EP 1 041 143 A에 설명된 바람직한 방법은 초기 스크리닝 과정을 포함하며, 여기서는 다수의 레트로바이러스 벡터가 세포에 도입됨으로써 개별 세포가 다수의 상이한 RNA 또는 펩티드를 발현할 수 있게 된다. 계속해서 표현형에 변화를 나타내는 세포가 분리되고, 그 클론의 레트로바이러스 DNA가 PCR에 의해 분리될 수 있다. 다음에, 이 PCR 산물을 사용하여 바이러스 패키징 세포를 다시 트랜스펙션하여 추가의 레트로바이러스 벡터가 만들어진다. 다음에, 이들 바이러스 벡터를 사용하여 상이한 세포에 형질도입하고, 마지막으로 2차 클로닝 과정 후에 활성 물질이 확인될 수 있다. 본질적으로 이 방법은 생물학적 활성 펩티드 또는 핵산의 도입에 의해 세포 표현형에 간접적인 변화를 일으킨다. 이것은 레트로바이러스 형질도입된 구성물이 스크리닝되는 결합 단백질, 바람직하게는 항체를 직접 암호화하는 본 발명의 방법과는 대조적이다. 또한, EP 1 041 143 A에 설명된 펩티드 및 핵산은 본 발명의 방법에 의해서 확인된 항체 또는 항체 단편의 크기와 큰 차이를 나타낸다는 것이 주지되어야 한다.
레트로바이러스 기반 게놈 스크리닝을 위한 추가적인 방법이 WO 03/083075 A2(Bremel et al .)에 제시된다. 이 방법은 특성화되지 않은 유전자 및 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 서열의 발현 및 스크리닝에 관한 것이다. 설명된 과정에서는 셀라인이 레트로바이러스 발현 구성물로 형질도입되어 게놈 DNA 바이러스가 프로바이러스로서 셀라인의 게놈에 도입된 다음, 이 프로바이러스로부터 폴리펩티드의 발현이 직접 분석된다. 이와 같은 방법은 셀라인 부화 기회를 제공하지 않을 뿐만 아니라, 분석이 수행되기 전에 발현된 폴리펩티드를 분리 및 확인할 수 있는 기회도 제공하지 않기 때문에, Bremel과 동료들에 의해 개발된 고처리량 스크리닝 기술보다는 우수성이 떨어진다.
Beerli와 동료들에 의해 최근 공개된 특허출원(WO 08/055795 A1)은 인간 항체의 분리를 위한 스크리닝 플랫폼을 설명하며, 이것은 Sindbis 바이러스 발현 시스템을 이용한다. 이 플랫폼의 본질적인 특징은 관심의 항원에 특이적인 B 세포가 인간 공여자의 말초혈 단핵세포(PBMC)로부터 직접 분리되어 출발 라이브러리가 생성된다는 점이다. 재조합 항원-반응성 scFv 라이브러리가 이 B 세포 풀로부터 생성되고, Sindbis 바이러스 발현 시스템을 사용하여 포유동물 세포 표면 디스플레이에 의해 스크리닝된다. 파지 디스플레이와 유사하게, 이 시스템의 단점 중 하나도 관심의 scFv가 재조작되어 척추동물 세포에서 전장 IgG로서 발현되어야 한다는 점이다. 이와 같은 과정은 전환시 관심의 항체의 친화성 손실과 관련될 수 있으며, 이들 항체는 척추동물 세포에서 잘 발현되지 않을 수 있고 및/또는 변경된 결합 특성을 나타낼 수 있다.
반면에, 본원에 개시된 발명은 결합 단백질, 바람직하게는 항체 또는 그 단편을 개발하고 최적화하는 방법들의 독특하고 극히 강력한 조합을 포함한다. 마우스 기반 기술과 비교하여, 본원에 개시된 발명의 주요 장점은 항체의 최적화 및 신규 개발에 관한 완전한 유연성, 및 짧은 시간 기간 내에 특이적 결합자를 확인할 수 있는 속도이다. 본 발명의 모든 양태는 시험관내에서 실현될 수 있으므로, 종간 보존성이 높거나, 또는 실험 동물에서 독성일 수 있는, 항원에 대한 항체의 개발과 관련된 제한이 없다.
파지 디스플레이 기반 기술과 비교하여, 본원에 개시된 발명의 핵심적인 장점은 결합 단백질, 특히 항체가 척추동물 세포에서, 바람직하게는 B 림프구 환경에서, 즉 항체의 천연 숙주 세포에서 전장 항체로서 발현될 수 있다는 점이며, 이로써 가장 자연스러우며 적절한 단백질 접힘, 정확한 번역후 변형, 및 중쇄와 경쇄 쌍의 품질 제어가 확보된다.
인간 B 세포 접근법과 비교하여, 개시된 발명의 핵심적인 장점은 어떤 원하는 표적에 대한 항체 개발과 관련된 완전한 유연성, 기존 항체의 친화성이 최적화될 수 있는 가능성, 시스템에서 발현되는 항체 타입에 관한 완전한 선택의 자유(항원-부화, 합성, 환자 유래, IgH 및 IgL 사슬 셔플링 조건 하에서 등)이다.
플라스미드 기반 발현 구성물 또는 비통합형 바이러스 벡터를 포함하는 다른 진핵 세포 기반 발현 시스템과 비교하여, '레트로사이트 디스플레이'라고 하는 개시된 발명의 핵심적인 장점은 레트로바이러스 유전자 전달 기술을 사용하여 안정하고 지속적인 클론 발현이 달성될 수 있다는 점이다. 표적 세포에서 재조합 항체의 안정하고 지속적인 클론 발현은 항원- 또는 리간드-특이적 세포의 반복적 부화 사이클을 허용하고, 여기에는 항체 유전자의 확인을 위한 모노클로날 세포의 분리 및 확장 가능성이 포함된다. 또한, 본원에 개시된 발명에 의해서, V(D)J 재조합의 림프구 특이적 메커니즘을 이용하거나, 또는 결합 단백질의 추가의 돌연변이유발을 위해 체세포 초돌연변이 과정을 이용함으로써, 단일 레트로바이러스 구성물을 사용하여 척추동물 숙주 세포에 인시튜 레트로바이러스 형질도입시 유전자 다양성이 추가로 생성될 수 있다.
따라서, 본 분야에 공지된 치료용 항체의 개발을 위한 공지된 기술 중 어떤 것과 비교하여, 본원에 개시된 레트로사이트 디스플레이 방법은 기존의 기술이 가지고 있던 많은 명백한 한계들에 대한 독특하고 새로운 강력한 해결책을 제공한다.
본원에 개시된 발명은 관심의 리간드 또는 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질의 발현, 스크리닝 및 확인에 광범하게 이용될 수 있다. 본 발명은, 제한되지는 않지만, 모노머, 호모- 또는 헤테로-멀티머 막 결합 수용체, 예를 들어 T 세포 수용체, 사이토카인, 또는 케모카인 수용체를 포함하는 임의의 결합 단백질뿐만 아니라 다른 스캐폴드 단백질을 사용해서도 수행될 수 있지만, 본 발명에 따른 바람직한 결합 단백질은 전장 항체이고, 특히 완전 인간 항체가 바람직하다. 그러나, 제한되지는 않지만, 어떤 자연 발생한 또는 인공 조작된 변형을 가진 단쇄 Fv 단편(scFv), Fab 단편, F(ab')2, 단일 VH 또는 VL 도메인, 단일 중쇄 또는 경쇄 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 항체의 어떤 (기능적) 단편도 본 발명을 실현하는데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 전장 항체와 관련하여, 본 발명은 특히 항체 결합 영역의 어떤 종류의 인공 조작되거나 디자인된 변형, 예를 들어 몇 개를 거명하면 부위 지정 또는 영역 지정 돌연변이유발, 상이한 항체로부터의 자연 발생 서열들의 융합, CDR 서열의 무작위화, DNA 셔플링, 오차-경향 PCR에 의해 생성된 변형들에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 단백질의 발현을 위한 바람직한 방법은 척추동물 숙주 세포의 레트로바이러스 벡터 매개 형질도입을 사용하는 것이다.
레트로바이러스 벡터의 사용이 유전자 치료법 분야에서 수년간 조사되었다. 예를 들어, 특정 세포 타입에 표적화될 수 있는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 조작하기 위하여, Perabo 등(WO 03/054197 A2)은 바이러스 캡시드 유전자에서 1차 세포 수용체와의 결합을 위한 중요한 부위에 표적화 펩티드들을 암호화하는 서열을 무작위로 삽입하고, 바이러스 캡시드 배경에서 펩티드를 나타내는 AAV 라이브러리를 생산했다. 배양 환경에 따라서 제공되는 선별적 압력이 감염 과정의 모든 단계, 즉 결합, 흡수, 코팅제거, 핵 전위, 복제 및 유전자 발현을 달성하는 바이러스 클론의 능력에 의해서 선별을 추진했다. 이 기술을 사용하여 백터가 생성되었고, 백혈병 세포에 효과적으로 형질도입되었다. 이와 같은 기술은 야생형 AAV에 의한 감염에는 이미 내성인 표적 세포를 감염시키는 바이러스 돌연변이를 생성하는데는 유용할 수 있지만, 결합 단백질의 다종 컬렉션의 시험관내 생성을 제공하지 못한다.
이와 같이, 결합 단백질의 발현을 위한 본 출원에서 설명된 방법은 진핵 및/또는 척추동물 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 위해 본 분야에 공지된 어떤 다른 방법을 능가하는 몇 가지 중요한 장점들을 가진다.
1) 재조합 레트로바이러스 구성물이 숙주 세포 게놈에 안정하게 통합되고, 이로써 결합 단백질의 안정하고 지속적인 발현 표현형이 부여된다. 2) "감염 다중도"(MOI)라고 하는 레트로바이러스 입자 대 표적 세포의 비를 적합한 값으로 이용함으로써, 바람직하게는 0.1 이하의 MOI에서 수행됨으로써, 레트로바이러스 형질도입이 제어될 수 있고, 이로써 레트로바이러스 형질도입된 세포의 대부분이 숙주 세포 게놈에 통합된 오직 하나의 재조합 레트로바이러스 구성물에 의해서만 유전적으로 변형되고, 그 결과 적어도 하나의 원하는 결합 단백질의 클론 발현이 얻어진다. 결합 단백질의 클론 발현이 개별 결합 단백질의 확인 및 클로닝을 상당히 용이하게 하기 때문에, 따라서 이 양태는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타낸다. 그러나, 다른 구체예에서, 본 발명은 0.1을 넘는 MOI에서 레트로바이러스 형질도입을 이용하여 실현될 수도 있다.
레트로사이트 디스플레이를 위한 기반으로서 레트로바이러스 형질도입의 상기 언급된 장점들에도 불구하고, 척추동물 숙주 세포에서 재조합 결합 단백질의 발현은, 제한되지는 않지만, 예를 들어 일시적 또는 안정한 DNA 트랜스펙션, RNA 트랜스펙션과 같은 대안적인 방법이나, 또는 아데노바이러스 또는 폭스바이러스 기반 벡터와 같은 DNA 기반 바이러스 벡터의 전달에 의해서도 달성될 수 있지만, 상기 언급된 대안적인 방법 중 어느 것도 척추동물 숙주 세포에서 결합 단백질의 쉽게 제어할 수 있는 안정한 클론 발현을 허용하지 않는다.
본 발명의 실현을 위한 바람직한 척추동물 숙주 세포는 B 림프구 계통의 세포, 특히 전구체 B 림프구인데, 이것은 대체로 내인성 항체 발현은 결여하지만, 예를 들어 적절한 단백질 접힘과 항체 조립을 위한 샤프롱 같은 유리한 부속 단백질, 또는 예를 들어 B 세포 특이적 Igα 또는 Igβ 단백질 같은 항체 분자의 막 부착을 용이하게 하는 부속 막 단백질은 발현한다.
척추동물 숙주 세포에서 레트로바이러스 형질도입에 의한 재조합 단백질 발현 원리는 확립된 과정으로서, 재조합 레트로바이러스 벡터의 구축을 포함하는데, 이것은 비교적 작고(편입되는 재조합 DNA의 최대 크기: 8~10kB), 플라스미드 벡터로서 표준 분자생물학 방법에 의해 클로닝되고 조작될 수 있으며, 이로부터 레트로바이러스 RNA 게놈이 전사될 수 있다. 야생형 레트로바이러스 게놈은 gag , pol 및 env의 단지 3개의 유전자를 함유하고, 이들이 핵 중심 단백질, 레트로바이러스 인테그라제, 프로테아제, RNAse, 및 역전사효소, 및 외피 단백질을 각각 암호화한다(도 3a). 이에 더하여, 레트로바이러스 게놈은 바이러스 입자 안에 레트로바이러스 RNA 게놈을 패키징하는데 필요한 Psi(ψ) 서열 같은 시스-조절성 서열, 레트로바이러스 전사체 종결을 위한 polyA 신호, 및 마지막으로 숙주 세포 게놈에 레트로바이러스의 통합을 위한 프로모터 요소와 신호를 함유하는 소위 말하는 5'- 및 3'-긴 말단 반복(LTR)을 함유한다(도 3a). 재조합 레트로바이러스의 구축을 위해서, 야생형 레트로바이러스의 gag , pol 및 env 코딩 영역이 프로모터나 인핸서 같은 관련된 시스-조절성 요소를 포함하는 관심의 유전자에 알맞은 임의의 발현 카세트(도 3a)로 치환된다. 숙주 게놈에 이러한 재조합 레트로바이러스 게놈을 안정하게 통합하기 위해서는 레트로바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드 벡터가 소위 말하는 레트로바이러스 패키징 셀라인(PCL)에 일시적으로 또는 안정하게 트랜스펙션되어야 하며, 이로써 일시적 또는 안정한 방식으로 gag , pol 및 env에 의해 암호화된 바이러스 구조 단백질이 인트랜스 발현되고, 복제 부적격 레트로바이러스 입자 안에 재조합 바이러스 게놈(전달 벡터)이 패키징된다(도 3b). 이러한 레트로바이러스 입자는 표적 세포의 1회의 감염(형질도입)을 허용한다(도 3b). 표적 세포로의 레트로바이러스 입자의 진입은 표적 세포 상의 특정 수용체와 Env 단백질의 특이적 상호작용에 의해 매개된다. 따라서, Env 단백질의 성질이 동족 수용체를 발현하는 특정 숙주 세포에 대한 레트로바이러스 입자의 향성을 결정한다. 에코트로픽 레트로바이러스는 설치류 세포에는 제약이 있고, 암포트로픽 레트로바이러스는 설치류 및 인간 세포를 포함하는 다양한 종들을 감염시킬 수 있고, 판트로픽 레트로바이러스는 세포막을 가진 임의의 복제 세포를 감염시킬 수 있는데, 이런 세포의 진입이 모든 진핵 세포막 상에 존재하는 구조를 통해 일어나기 때문이다. 또한, 다양한 상이한 향성을 가진 레트로바이러스 벡터 입자들이, 예를 들어 몇 가지만 거명하자면, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 소포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 HIV 및 SIV와 같은 다른 바이러스의 이종성 외피 단백질 또는 심지어 세포막 단백질을 사용하여 생성될 수 있으며, 이 기술은 "수도타이핑"(pseudotyping)이라고 알려져 있다. 세포 진입 후, 레트로바이러스가 숙주 세포에 바이러스 게놈을 송달할 수 있고, 여기서 바이러스 단백질이 게놈의 cDNA로의 역전사를 매개하여, 마침내 숙주 세포 게놈에 안정하게 통합됨으로써, 송달된 유전자의 안정한 발현이 가능해진다(도 3b). 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 에코트로픽 MLV 입자를 사용하여 뮤린 B 세포로의 유전자 전달을 매개한다. 그러나, 어떤 다른 외피 또는 막통과 단백질로 수도타이핑된 어떤 감염성 레트로바이러스 벡터든 본 발명을 실현하는데 사용될 수 있다는 것을 당업자는 인정할 것이며, 단 그것은 모 공여자 종, 세포 타입, 또는 벡터 세포 진입을 매개하는 동족 수용체의 발현에 독립적으로 어떤 적합한 표적 선별자 세포에서 형질도입을 매개하여야 한다.
레트로바이러스 벡터 매개 유전자 전달을 달성하기 위해서, 벡터 함유 레트로바이러스 입자(재조합 레트로바이러스 게놈, 또는 전달 벡터의 전사체를 함유하는)가 전달 벡터를 안정하게 또는 일시적으로 발현하는 패키징 세포의 세포 배양 상청액으로부터 수거될 수 있다(도 3b). 이것은 당업자에게 공지된 광범한 프로토콜 및 그 변형들에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예는 다음을 포함한다: 1) 벡터 입자로부터 패키징 세포를 분리하는 적합한 필터 또는 원심분리 단계를 통한 계대를 이용하여 세포-프리 레트로바이러스 입자 함유 상청액의 제조. 다음에, 이들 레트로바이러스 입자 제제를 사용하여 가변 시간 프레임 동안 공-인큐베이션에 의해서 또는 소위 "스핀 감염"을 수행함으로써 척추동물 숙주 세포에 형질도입한다. 여기서는, 표적 세포 현탁액이 레트로바이러스 입자 함유 배지와 혼합되어 저속 원심분리된다(도 3b). 2) 또는 달리, 표적 세포와 패키징 세포의 공-배양에 의해 막에 의한 두 세포 집단의 세포-세포 접촉 또는 분리가 가능해지고, 이것은 레트로바이러스 입자의 계대는 허용하면서 패키징 세포의 계대는 허용하지 않으며, 이 과정을 수행함으로써 표적 세포의 형질도입이 가능해진다.
레트로바이러스 형질도입에 알맞은 숙주 표적 세포로서, 본 방법의 바람직한 구체예는 내인성 뮤린 면역글로불린 단백질을 발현하지 않고 에코트로픽 숙주 범위의 레트로바이러스로 형질도입될 수 있는 설치류 유래의 B 림프구 계통 세포를 사용하는 것이다. B 림프구 계통의 세포는 이들이 이미 세포 표면 발현 및 막 결합된 전장 면역글로불린의 고정에 유리한 B 세포 특이적 Igα 및 Igβ 단백질을 발현하고 있다는 장점을 가진다. 이와 관련하여, 예를 들어 골수종 세포 같은 면역글로불린 음성 혈장 세포-유래 세포, 제한되지는 않지만, 예를 들어 Sp2/0, NSO, X63 및 Ag8653은 일반적으로 막 면역글로불린 부착을 위한 부속 Igα 및 Igβ 단백질을 결여한다. 이러한 경우, Igα 및 Igβ 단백질이 발현되지 않는 어떤 다른 척추동물 숙주 세포에서도 만일 당업계의 표준 과정인 Igα 및 Igβ에 대한 발현 벡터의 트랜스펙션 또는 형질도입시 Igα 및 Igβ 단백질의 발현이 부여된다면 이 방법이 역시 적용될 수 있다. 따라서, 두 Igα 및 Igβ 단백질의 외적 발현시 이 방법은 어떤 척추동물 숙주 셀라인을 사용해서도 실현될 수 있으며, 단 상기 척추동물 숙주 셀라인에 형질도입될 수 있는 적합한 향성을 가진 레트로바이러스 입자가 생산되어야 한다. 분명히 하기 위해서, 본원에 개시된 혁신은, 만일 판트로픽 레트로바이러스 입자(제한되지는 않지만, 예를 들어 VSV의 G 단백질로 수도타이핑된 입자)가 면역글로불린 앵커 분자 Igα 및 Igβ를 외적으로 발현하도록 변형된 숙주 세포와 함께 사용된다면 어떤 척추동물 숙주 세포를 사용해서도 실현될 수 있다.
B 림프구 계통의 바람직한 세포는, 제한되지는 않지만, 예를 들어 어떤 척추동물 종으로부터의 전구체 B-, B-백혈병 또는 B-림프종 세포, 그리고 장기간 동안 조직 배양물에서 성장될 수 있는 1차 전구체 B 세포이다. 전구체 B 림프구는 이러한 셀라인이 대부분 내인성 면역글로불린 단백질을 발현하지 않기 때문에 면역글로불린의 레트로바이러스 발현을 위한 이상적인 숙주 세포가 될 것이다. 특히, 뮤린 preB 셀라인은 Abelson-뮤린 백혈병 바이러스(A-MuLV)로의 형질전환에 의해 어떤 마우스 균주로부터도 쉽게 얻어질 수 있다. 그러나, 장기 증식하는 1차 preB 세포뿐만 아니라 A-MuLV 형질전환된 preB 세포는 preB 세포 특이적 단백질인 VpreB 및 λ5를 발현하고, 이들은 함께 소위 말하는 대리 경쇄를 형성하며, 이것은 종래의 경쇄의 부재 하에서 면역글로불린 중쇄 및 대리 경쇄의 preB 세포 수용체 복합체를 형성할 수 있다. 재조합 중쇄와 경쇄로 이루어진 면역글로불린을 발현하는 것이 바람직하기 때문에, 단일, 이중 또는 삼중-유전자 녹아웃으로서 λ5, 또는 VpreB1, 또는 VpreB2 유전자의 유전자 산물을 포함하는, 대리 경쇄 성분의 발현을 결여하는 preB 세포가 바람직하다. 대리 경쇄는 이종성 중쇄와 결합할 수 있다고 알려져 있으므로, 대리 경쇄 발현이 IgH/IgL 쌍의 스크리닝을 다양한 정도로 방해할 수 있다고 예상되지만, 일반적으로 preB 세포에서 대리 경쇄 단백질의 발현 수준이 낮기 때문에, 본 방법은 대리 경쇄 성분을 발현하는 야생형 preB 세포를 사용해서도 실현될 수 있다. 요약하면, Igα 및 Igβ를 발현하고 내인성 면역글로불린 단백질은 발현하지 않는 어떤 척추동물 셀라인이 본 방법에서 표적 숙주 세포로서 사용될 수 있고, 대리 경쇄 결핍 preB 세포가 본 발명을 실현하기 위한 바람직한 숙주 세포이다.
발현, 스크리닝 및 확인되는 바람직한 결합 단백질은 전장 항체이고, 아미노산 서열로는 완전 인간 면역글로불린이다. 그러나, 척추동물 세포에서 세포 발현이 가능한 어떤 결합 단백질도 개시된 방법에 따라서 특이적 리간드 또는 항원 결합에 대해 스크리닝 및 선별될 수 있다. 예를 들어, 이러한 결합 단백질은 어떤 척추동물 종으로부터의 항체의 단편, 예를 들어 단쇄 Fv, Fab 단편(도 2a) 또는 단일 VH 또는 VL 도메인, 또는 중쇄 또는 경쇄를 포함할 수 있으며, 이들은 세포 표면 막에 부착 가능한 방식으로 발현되는 것이 바람직하다. 이것은, 예를 들어 다른 타입 I 막통과 단백질의 막 앵커와의 융합, GPI-앵커 도메인의 이용 또는 본 분야에 공지된 다른 방법에 의해서 달성될 수 있다. 또한, 본 방법은 다른 막 결합 단백질, 제한되지는 않지만, 예를 들어 모노머 또는 멀티머 사이토카인 수용체, 또는 다이머 T 세포 수용체 등에도 이용될 수 있다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 레트로바이러스 발현은 중쇄 및 경쇄에 대한 별도의 레트로바이러스 발현 구성물의 연속 형질도입에 의해서 달성되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 또한 표적 세포의 공-형질도입을 수행함으로써 실현될 수도 있으며, 이때도 IgH 및 IgL 사슬에 대한 별도의 레트로바이러스 구성물이 사용된다. 상이한 레트로바이러스 벡터로부터 IgH와 IgL 사슬의 별도의 발현은 다종 컬렉션의 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 레트로바이러스 벡터의 컬렉션이 다종 컬렉션의 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 레트로바이러스 발현 벡터의 컬렉션과 무작위로 조합될 수 있다는 장점을 제공한다. 이런 소위 말하는 중쇄와 경쇄 셔플링에 의해서 중쇄 및 경쇄 컬렉션의 총 수가 제한되는 경우에도 상이한 면역글로불린 결합 특이성의 다양성 정도가 커질 수 있다(예를 들어, 104 개의 상이한 중쇄가 104 개의 상이한 경쇄와 무작위로 조합되면, 이론적으로 108 개의 상이한 항체 특이성이 생긴다). IgH와 IgL 사슬 벡터의 컬렉션의 셔플링은 원 사이드 셔플링으로 수행되는 것이 바람직하며, 이것은 항체의 한 폴리펩티드 사슬이 단일 항체 사슬을 암호화하는 단일 구성물이라는 것을 의미한다.
그러나, 레트로바이러스 IgH 및 IgL 사슬 발현은 또한 두 단백질이 동일한 레트로바이러스 백본 상에서 암호화되는 경우에도 달성될 수 있다는 것이 이해되어야 한다(아래 참조). 그것의 가장 용이한 형태에서, 중쇄 및 경쇄 발현은 빈 레트로바이러스 벡터에서 중쇄 및 경쇄 cDNA의 클로닝에 의해 부여되며, 이때 발현은 5' LTR의 프로모터 활성에 의해 추진되고, 적절한 RNA 가공은 3' LTR 서열에 의해 매개된다(도 3a). 중쇄 구성물은 바람직하게는 이들의 내인성 막 스패닝 코딩 영역을 함유해야 하며, 이로써 재조합 면역글로불린의 최적 막 부착이 가능해진다. 그러나, 다른 막통과 단백질의 막 스패닝 도메인도 항체의 불변 영역과 융합될 수 있으며, 이로써 발현된 변형된 면역글로불린의 표면 부착이 확보될 수 있다는 것도 당업자에게 자명하다. 특히, 항체 단편의 발현, 또는 비면역글로불린 결합 단백질의 발현과 관련하여, 막에 결합된 단백질의 상이한 막통과 영역은 결합자의 세포 표면 발현에 유리할 수 있다.
항체 또는 그 단편의 세포 표면 발현이 본 발명의 바람직한 구체예이지만, 이들 생물분자는 가용성의 분비된 단백질로서 발현될 수도 있으며, 그러면 항체의 검출은 유체상에서 수행된다. 이와 같은 발현 형태는, 단일 생산자 클론 및 결합자의 스크리닝이 가용성 항체가 필요한 분석을 포함하는 경우, 또는 분석이 반고체 배지에서 수행되는 경우에 유리할 수 있으며, 이때 분석은 단일 세포 클론에서 발현 수준 및 결합 특이성의 정량을 허용한다. 재조합 면역글로불린의 발현 벡터는 모든 공지된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 이소타입의 코딩에 사용될 수 있으며, 이것은 완전 인간 항체의 경우, Igκ 또는 Igλ 경쇄를 함유하는, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 및 IgE 항체의 발현을 허용한다. 인간 중쇄 및 경쇄에 대한 모든 레트로바이러스 발현 벡터에서는, 레트로바이러스 항체 발현 벡터의 도식적 도면에 묘사된 대로(4a 및 4b), 인간 중쇄 및 경쇄의 가변 코딩 영역만이 독특한 제한 효소, 제한되지는 않지만, 예를 들어 HindIII 및 Eco47III을 사용하여 치환되는 것이 바람직하다. 이것은 레트로바이러스 발현 벡터에서 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 코딩 영역 쪽의 프레임 내에서 V-영역 라이브러리 또는 개별 V-영역 코딩 영역에 의한 가변 코딩 영역의 용이한 클로닝 및 치환을 허용할 것이다. 가변 영역 도메인만을 교환하는 이와 같은 방식은 단일 특이성을 암호화하는 발현 벡터의 생성을 목표로 하거나, 또는 결합 단백질 컬렉션의 생성을 목표로 할 때 유리할 것이다. 이와 관련하여, 상이한 종으로부터 유래된 가변 영역 도메인과 불변 영역 도메인을 함유하는 전장 항체가 발현될 수 있다(키메라 항체).
결합 단백질에 알맞은 가장 간단한 레트로바이러스 발현 벡터가 관심의 결합 단백질 또는 유전자의 cDNA 코딩 영역을 "빈" 레트로바이러스 발현 벡터 백본에 삽입함으로써 구축될 수 있었다(도 3a). 형질도입된 세포의 직접 검출을 허용하는 어떤 선별 마커 및/또는 스크리닝 마커(예를 들어, 강화 녹색 형광 단백질, EGFP)가 부재할 때도, 레트로바이러스 벡터로부터 결합 단백질을 안정하게 발현하는 세포가 분비된 또는 막에 결합된 형태의 결합 단백질의 안정한 발현에 기초하여 확인되어 분리될 수 있기 때문에 본 발명이 실현될 수 있었다. 그러나, 레트로바이러스 발현 벡터에 포함된 여러 특징들이 바람직하다. 첫 번째는 재조합 결합 단백질의 발현을 추진하는 강한 구성성 또는 유도성 프로모터 요소로서, 이것은 코딩 cDNA 영역의 상류에 바로 위치된다(도 4a, b). 이러한 프로모터는, 제한되지는 않지만, 예를 들어 즉시 조기 CMV 프로모터, β-액틴 프로모터, EF-1α 프로모터와 같은 구성성 프로모터, 또는 테트라시클린 유도성 또는 어떤 다른 항생제 유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터일 수 있으며, 이들은 테트라시클린이나 다른 항생제 및 그 유도체, 예를 들어 독시시클린의 부가 또는 제거에 의해 발현을 상향 조절 또는 하향 조절할 수 있다. 레트로바이러스 발현 구성물에 유도성 프로모터 요소의 포함이 또 다른 바람직한 구체예인데, 그 이유는 일부 레트로바이러스 벡터 백본에서는 5' LTR 프로모터나 심지어 강한 구성성 프로모터도 침묵할 수 있다고 알려져 있기 때문이다.
프로모터 요소에 더하여, 바람직한 구체예는 레트로바이러스 발현 구성물에 마커 유전자를 포함하며, 이것은 나중에 재조합 결합 단백질의 검출 없이 숙주 세포의 안정한 레트로바이러스 형질도입의 선별 및/또는 모니터를 가능하게 한다(도 4a, b). 선별 및/또는 스크리닝 마커는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 레트로바이러스 발현 벡터의 연속 형질도입을 수반하는, 바람직한 2단계 레트로바이러스 형질도입 프로토콜에서 특히 유용하다. 2단계 형질도입 프로토콜에서, 먼저 척추동물 숙주 세포가 제 1 면역글로불린 폴리펩티드 사슬 또는 사슬들을 암호화하는 적어도 하나의 레트로바이러스 발현 구성물로 형질도입되고, 적어도 하나의 제 1 폴리펩티드 사슬이 안정하게 발현된 후, 상응하는 다른 면역글로불린 폴리펩티드 사슬 또는 사슬들을 암호화하는 적어도 하나의 레트로바이러스 발현 구성물을 사용한 두 번째 형질도입이 수행되어, 완전 항체 또는 항체들의 컬렉션이 생성된다. 만일 선별 또는 스크리닝 마커가 성공적인 첫 번째 형질도입 사건을 선별하거나 스크리닝하는데 사용된다면, 그것은 항체 같은 멀티머 결합 단백질의 개별 사슬들을 암호화하는 적어도 2개의 레트로바이러스 발현 구성물의 공-형질도입 빈도를 최적화하는데 매우 유용하다. 따라서, 선별 및/또는 스크리닝 마커의 사용은 매우 바람직하다.
포유동물 세포 선별에 유용한 항생제에 대한 내성을 부여하는 선별 마커는, 제한되지는 않지만, 예를 들어 퓨로마이신, 네오마이신, 히그로마이신 B, 미코페놀산, 히스티디놀, 블레오마이신, 및 플레오마이신 내성 유전자를 포함한다. 별도의 레트로바이러스 구성물에 의해 암호화되는 항체와 같은 멀티머 단백질의 발현에서는 상이한 폴리펩티드 사슬의 발현이 상이한 선별 마커에 연결되는 것이 바람직하며, 이로써 상응하는 발현 구성물의 안정한 형질도입에 대한 별도의 선별이 가능해진다.
숙주 세포로의 레트로바이러스 형질도입의 모니터를 가능하게 하는 마커 유전자는, 제한되지는 않지만, 형질도입된 세포에 자가형광을 부여하는 유전자, 제한되지는 않지만, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP), 강화 녹색 형광 단백질(EGFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청색 형광 단백질(BFP) 및 적색 형광 단백질(RFP) 등을 포함한다. 또 다르게는, CD7 또는 그것의 말단 절단형 변이체, CD34 또는 그것의 말단 절단형 변이체, 또는 낮은 친화성 신경성장인자 수용체와 같은 세포 표면 마커가 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 항생제 선별 마커, 형광 마커 또는 세포 표면 마커의 발현이 소위 내부 리보솜 진입 서열(IRES)을 통해서 재조합 결합 단백질의 발현과 커플링되며, 이로써 척추동물 세포에서 단일 프로모터 요소로부터 두 유전자의 커플링된 공-발현이 허용된다(도 4b). 그러나, 당업자는 또한 추가의 프로모터 요소에 의해 추진되는, 레트로바이러스 구성물에 함유된 별도의 발현 카세트로부터 선별 및/또는 마커 유전자를 발현함에 의해서도 본 발명을 실현할 수 있다. 별도의 레트로바이러스 벡터로부터 면역글로불린 같은 멀티머 단백질의 발현에서는, 상이한 결합 단백질 사슬이 상이한 선별 및/또는 스크리닝 마커에 연결되는 것이 바람직하고, 이로써 상이한 발현 구성물의 안정한 형질도입을 별도로 모니터할 수 있게 된다.
재조합 결합 단백질의 발현이 상기 개략된 대로 별도의 프로모터에 의해 추진되는 경우, 임의의 선별 또는 스크리닝 마커 유전자가 5' LTR의 하류 및 5' LTR과 ψ 패키징 신호의 하류에서 또한 클로닝될 수 있으며, 이로써 그것의 발현이 5' LTR 프로모터에 의해 추진된다(도 3 및 4 참조).
상기 언급된 대로, 본 발명의 바람직한 구체예는 B 림프구 계통 세포, 바람직하게는 preB 림프구에서 재조합 항체 또는 그 단편을 발현하는 것이다. 따라서, B 계통 세포에서 선택적으로 높은 수준의 발현을 부여한다고 공지된 프로모터와 인핸서 조합에 의해 재조합 항체의 발현을 추진하는 것이 또한 바람직하다. 이러한 프로모터/인핸서 조합은, 제한되지는 않지만, 예를 들어 면역글로불린 κ 경쇄 프로모터, κ-인트론 및 3'κ 인핸서 조합, 또는 면역글로불린 중쇄, 중쇄 인트론 및 3'α 인핸서 조합일 수 있다. 면역글로불린 κ 경쇄 프로모터, κ-인트론 및 3'κ인핸서의 조합이 바람직한데(도 4a, b), 이 조합이 B 계통 세포에서 면역글로불린 사슬의 높은 수준의 발현을 허용하고, 시스-조절성 유전자 요소들의 이런 조합이 활성화된 B 세포 특이적 효소 AID(활성화 유도 시티딘 데아미나제)에 의해 매개되는, 항체의 코딩 영역에서의 체세포 초돌연변이를 조절되는 방식으로 촉진할 수 있다고 알려져 있기 때문이며, 본 발명의 이 구체예가 아래 더 상세히 설명된다.
그러나, 본 발명을 실현하는 레트로바이러스 벡터에서 특정한 재조합 항체의 발현이 원하는 척추동물 숙주 세포에서 세포 표면 막 상에, 또는 분비된 형태로 항체의 발현을 허용하는 시스-조절성 프로모터/인핸서 요소와 코딩 영역의 어떠한 조합에 의해서도 행해질 수 있다는 것을 당업자는 인정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예는 별도의 레트로바이러스 발현 구성물로부터 항체와 같은 멀티머 결합 단백질을 발현하는 것이지만(도 4a 및 b), 본 발명은 또한 멀티머 결합 단백질의 상이한 단백질 사슬의 발현이 동일한 레트로바이러스 발현 구성물 상에서 연결된 경우에도 실현될 수 있다. 면역글로불린의 경우, 이것은, 제한되지는 않지만, 한 프로모터로부터 중쇄와 경쇄의 발현, 그리고 IRES 서열에 의한 중쇄 및 경쇄의 코딩 영역의 분리에 의해서 달성될 수 있다. 이런 대안에서, 프로모터의 하류에서 바로 중쇄가 클로닝되고, IRES의 하류에서 경쇄가 클로닝되는 것이 바람직한데, 이는 IRES 뒤의 유전자가 대체로 IRES 상류의 유전자보다 다소 낮은 수준으로 발현된다고 알려져 있기 때문이다. 경쇄는 더 작은 분자이므로, 경쇄 발현이 IRES를 통해서 제어되는 경우, IRES 결합을 통해 발현된 중쇄 및 경쇄의 보다 양호한 화학량론적 발현이 달성될 것으로 예상된다.
또 다르게는, 항체와 같은 다이머 결합 단백질의 두 사슬의 공-발현이 단일 레트로바이러스 백본에서 두 개의 별도의 발현 카세트를 클로닝함으로써 달성될 수 있으며, 이 경우 각 개별 결합 단백질 사슬의 발현은 개별적으로 조절된다. 이 접근법의 대안으로서, 반대 방향으로 전사 활성을 부여하는 2 방향성 프로모터를 사용하여 동일한 벡터에서 두 개의 상이한 결합 단백질 사슬의 발현을 연결하는 것도 가능하다. 후자의 옵션은 가까이 근접해 있는 프로모터의 발현 수준에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 프로모터 간섭이 일어나지 않는다는 잠재적인 장점을 가진다.
2개의 결합 단백질 코딩 영역, 예를 들어 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 숨기고 있는 레트로바이러스 벡터의 상세한 유전자 구조와 무관하게, 이 방법이 표적 세포로 결합 단백질 쌍의 단일 레트로바이러스 유전자 전달을 허용하고, 이로써 2단계 레트로바이러스 형질도입 프로토콜과 비교하여, 다이머 결합 단백질의 클론 발현의 용이한 제어가 가능해지고, 결합자 발현 세포 집단의 생성에 걸리는 시간 프레임이 감소된다는 점이 강조되어야 한다.
프로모터 및 인핸서 같은 시스-조절성 유전자 요소, 및 항생제 내성 마커 및 자가형광 단백질을 암호화하는 유전자 같은 선별가능한 또는 스크리닝 가능한 마커 유전자에 더하여, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 코딩 영역은 상이한 배경의 레트로바이러스 발현 벡터에서 클로닝될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 코딩 영역은 적절한 표면 발현 및/또는 분비에 필요한 리더 서열을 포함하여, 연속 cDNA 서열로서 레트로바이러스 발현 구성물에서 클로닝된다. 인핸서 요소를 가진 이러한 발현 벡터의 기본 디자인의 예가 도 4a에 묘사된다. 바람직하게는, 중쇄는 인간 γ1 중쇄 이소타입을 암호화하고, 경쇄는 κ 경쇄 이소타입을 암호화하지만, 인간 또는 다른 척추동물 종들의 어떤 다른 중쇄 및 경쇄 이소타입을 사용해서도 본 발명을 실현할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이러한 레트로바이러스 cDNA 발현 벡터에서는 가변 코딩 영역과 불변 코딩 영역 사이의 접합부에 독특한 제한 효소를 포함하는 것이 바람직하며, 이것은 단지 VH 및 VL 코딩 영역의 치환만을 허용함으로써 발현된 항체의 특이성을 변경시키거나, 또는 표적 세포에서 다종 레트로바이러스 항체 라이브러리의 발현을 위한 다수의 VH 및 VL 코딩 영역의 삽입을 허용한다. 바람직한 구체예에서, VH-Cγ1과 VL-Cκ의 경계에 도입되는 제한 효소 부위는 Eco47III 부위(도 4a, b)이고, 이것은 발현된 중쇄의 아미노산 조성을 변경하지는 않으며, 단지 불변 κ 코딩 영역의 첫째 위치에서 보존된 트레오닌을 세린 아미노산으로 변화시킬 뿐으로서, 이것은 레트로바이러스 발현된 인간 IgG1 분자의 결합 특성에 영향을 미치지 않는다.
cDNA 형태의 이종성, 바람직하게는 완전 인간 항체의 코딩 정보를 함유하는 레트로바이러스 구성물에 대한 대안으로서, 게놈 형태의 코딩 영역을 함유하는 레트로바이러스 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 이 경우 전형적인 엑손-인트론 구조가 점라인의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄에서 발견된다. 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 입자 패키징시 mRNA에서 전사될 것이므로, 발현 구성물의 이와 같은 구조는 코딩 영역의 전사 구조가 레트로바이러스 게놈의 5' LTR의 전사 방향과 반대 방향으로 전개될 필요가 있는데, 그 이유는 만일 그렇지 않다면 레트로바이러스 전달 벡터가 이미 스플라이싱되어서 표적 세포에 재조합 구성물이 형질도입되어 안정하게 통합되기 전에 엑손-인트론 구조가 손실될 것이기 때문이다. 그러나, 이들 구성물은 형질도입을 위한 표적 세포의 성질에 따라서 항체가 막 결합된 항체 또는 분비된 항체로서 발현될 수 있는 기능성, 및 분비된 항체의 내부 중단 코돈에서, 또는 분비된 항체의 중단 코돈의 상류의 스플라이스 도너의 선택적 스플라이싱에 의해 막 결합된 면역글로불린의 막 스패닝 엑손의 어셉터를 스플라이싱함으로써 전사를 종결할 수 있는 표적 세포의 능력을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태는 인간 항체 또는 어떤 이종성 항체 또는 그 단편에 알맞은 레트로바이러스 발현 구성물의 생성 및 이용이며, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 코딩 영역은 V(D)J 재조합 과정에 의해 "유사-점라인" 형태의 V, 선택적으로 D 및 J 유전자 세그먼트로부터 표적 세포에서 더 조립될 필요가 있다. 이러한 발현 벡터의 기본 디자인의 그림이 도 4b에 묘사되는데, 이것은 중쇄 및 경쇄의 "점라인" V-D-J 또는 V-J 카세트가 J-요소 코딩 영역의 3' 경계에서 바람직하게는 Eco47III을 포함하여 독특한 제한 효소 부위로 치환될 수 있는 재배열 가능하지 않은 구성물의 특징을 또한 공유한다. 이러한 벡터에 함유된 V, D 및 J-요소는 재조합 활성화 유전자(RAG) 1 및 2에 대한 인식 모티프라고 알려진 보존된 재조합 신호 서열(RSS)이 측면에 위치된다. 어떤 척추동물 세포에서 RAG1과 RAG2의 공-발현시, 이러한 벡터는 V, 선택적으로 D 및 J 유전자 세그먼트를 부위 특이적으로 재조합할 것이고, 이로써 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 암호화하는 VH 및 VL 영역이 각각 생성될 수 있다. RAG-1 및 RAG-2 유전자의 발현과 그에 따른 V(D)J 재조합 활성은 일반적으로 조기 전구체 림프구에만 제한된다. 따라서, 본 발명을 실현할 수 있는 전구체 림프구의 바람직한 사용이 자동적으로 V(D)J 재조합에 대한 활성을 제공한다. 그러나, RAG-1 및 RAG-2 과발현시, 어떠한 체세포 척추동물 셀라인도 V(D)J 재조합에 능숙해질 수 있다고 알려져 있으므로, 당업자는 또한 RAG-1 및 RAG-2의 외적 발현을 부여함으로써, 어떠한 비전구체 림프구 셀라인에서도 본 발명의 이 양태를 실현할 수 있다. 대안으로서 심지어 RAG-1 또는 RAG-2 결핍 셀라인이 사용될 수도 있으며, 이때 RAG-1 또는 RAG-2 결핍성은 상응하는 RAG 유전자 또는 그 단편의 과발현에 의해 보완된다.
이러한 V(D)J 재배열 가능한 구성물은 척추동물 숙주 세포에 안정하게 형질도입된 단일 레트로바이러스 발현 구성물로부터 항체 특이성의 다종 레퍼토리가 RAG-1 및 RAG-2 매개된 V(D)J 재조합을 통해 생성될 수 있다는 장점을 가진다.
V, D 및 J 유전자 요소의 연결이 매우 큰 부정확도를 수반하고, 이것이 VH 및 VL 상보성 결정 영역(CDR) 3에서 발견되는 다종 아미노산 서열에 상당히 기여한다고 알려져 있지만, 몇 가지 V-영역 과들, D 및 J 요소를 대표해서 V-D-J-Cγ1 및 V-J-Cκ 레트로바이러스 구성물의 컬렉션을 사용하는 것이 바람직하며, 이로써 제공된 점라인 유전자 세그먼트 서열의 수준에서 이미 가변성이 증가될 수 있다. 그렇지만, V(D)J 재조합 과정에 의해서 매개되는 V, 선택적으로 D 및 J 유전자 세그먼트의 체세포 조립을 허용하는 레트로바이러스 구성물의 바람직한 사용은 전구체 림프구로의 인시튜 형질도입시 가변 도메인 결합 영역의 매우 큰 다양성의 생성을 허용하고, 이로써 단일 또는 제한된 수의 구성물로부터 IgH 및 IgL 사슬의 다종 컬렉션이 생성될 수 있다.
V, D 및 J 유전자 세그먼트의 부정확한 연결에 의해 생성된 다양성은 전구체 림프구 특이적으로 발현된 유전자 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스페라제(TdT)의 존재에 의해 크게 증가되는데, 이것은 상보성 주형 DNA 가닥 없이 3' DNA 단부에 뉴클레오티드를 부가할 수 있는 유일한 DNA 중합효소이다. 접합부 다양성을 증가시키기 위해서, 높은 내인성 TdT 발현 수준을 가진 세포를 사용하거나, 또 다르게는 본 분야에 공지된 방법에 의해 레트로사이트 디스플레이에 사용된 표적 숙주 세포에서 TdT를 외적으로 발현시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예는 하나를 초과하는 V, 또는 D 또는 J 유전자 세그먼트를 함유하는 V(D)J 재배열 가능한 레트로바이러스 구성물의 사용이며, 이로써 V(D)J 재조합 과정에 의해서 상이한 V, D 및 J 유전자 세그먼트가 동일한 구성물로부터의 상이한 재배열된 클론들에서 사용될 수 있다. 이러한 구성물에 다수의 상이한 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 편입은 최대 8~10kb의 범위라고 보고된 DNA를 수용하는 레트로바이러스 벡터의 총 용량에 의해서만 제한된다.
이종성 항체 또는 그 단편의 발현을 위한 V(D)J 재조합 적격 레트로바이러스 구성물(도 4a, b, 아래쪽 패널)의 사용이 본 발명의 한 양태이지만, 이런 접근법을 통한 다종 레퍼토리의 생성이 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 CDR3 영역에서의 다양성의 생성에 주로 제한되며, 이것은 조기 B 림프구형성 동안 생성되는 1차 항체 레퍼토리의 특징과 매우 유사하다.
적응 면역 시스템의 특징은 항체 가변 도메인의 친화성 성숙 능력이며, 이것은 가변 도메인 코딩 영역의 체세포 초돌연변이에 기초한다. 체세포 초돌연변이는 효소 활성화 유도 시티딘 데아미나제(AID)에 의해서 크게 증진된다고 알려져 있다. 높은 수준의 체세포 초돌연변이는 또한 면역글로불린 유전자 좌위로부터의 시스-조절성 인핸서 요소의 존재에 의존하며, Igκ 인트론과 3'κ 인핸서 요소의 조합에서 유리한 효과가 가장 분명히 설명되었다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 이들 시스-조절성 요소들을 함유하는 레트로바이러스 발현 구성물을 사용하여, 본 분야에 공지된 방법에 의해서 구성적으로 또는 유도적으로, AID 효소를 내인성으로 또는 외적으로 발현하는 표적 세포에서 이러한 면역글로불린 발현 구성물을 레트로바이러스 발현하는 것이다.
체세포 초돌연변이 적격 레트로바이러스 구성물 및 AID 발현 숙주 세포와 관련하여 '레트로사이트 디스플레이'의 적용은 AID 발현 숙주 세포에의 형질도입 후, 항체의 추가의 인시튜 다양화를 허용한다.
본 발명의 이러한 양태들의 조합은 적응 면역 시스템에서 발생하는 모든 분자 및 유전자 사건들, 즉 제한된 수의 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 포함하는 하나 또는 제한된 수의 구성물로부터 1차 항체 레퍼토리의 생성 및 항체들의 항원-결합 가변 도메인의 코딩 영역의 추가의 AID 매개된 체세포 초돌연변이를 재현한다.
원하는 항원에 대한 고 친화성 항체 결합자의 특이적 선별은 표준 FACS 기반 기술에 의해 검출되는 선택된 원하는 항원에 대한 증가된 결합을 통한 레트로사이트 디스플레이 후, 강한 항원 결합자의 고속 예비 세포 정렬에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 강한 결합자가 선택적으로 분리될 수 있고, 레트로바이러스 벡터에 의해 암호화된 항체 유전자는, 제한되지는 않지만, 게놈 및 RT-PCR을 포함하는 본 분야에 공지된 표준 분자생물학 방법에 의해서 선별된 세포 또는 세포 클론으로부터 재분리, 클로닝 및 서열화될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 최종 세포 정렬 단계는 단일 세포 정렬로서 수행되며, 이것은 항원 반응성 세포 클론의 클론 분리 및 최종 확장을 허용하여, 선별된 결합자로부터 동종 IgH 및 IgL 사슬 쌍의 코딩 영역의 클로닝 및 서열 결정을 용이하게 한다.
원한다면, FACS 부화된 세포가 배양물에서 확장될 수 있고, 선택적으로 고도 반응성 세포의 항원 결합 및 반복된 고속 세포 정렬이 다시 수행될 수 있으며, 이 과정은 선택적으로 원하는 염색 강도와 그에 따른 원하는 항원의 예상된 결합 특이성이 달성될 때까지 반복하여 적용될 수 있다(도 1). 항원 반응성 세포의 이런 선택적 부화 및 시험관내 확장은 T 세포 의존성 면역 반응에서 발생하는 고 친화성 결합자의 선택적 성장을 의태한다.
항원-반응성 세포의 고속 세포 정렬기 보조 부화만이 본 발명을 실현하는 바람직한 방법이지만, 항원 반응성에 대해 세포를 선별하여 분리하는 다른 방식, 제한되지는 않지만, 예를 들어 고체 지지체 상에 고정된 항원에 세포가 결합되는 패닝 방법 등도 적용될 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 또한, 미세조작 접근법에 의해서, 제한되지는 않지만, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에서 제한 희석 조건 하에 세포를 성장시키거나 또는 반고체 배지 중의 세포 클론으로서 항원-반응성 세포를 부화시키는 것도 가능하며, 이로써 현미경 보조 방식에 의해 세포 클론의 특정 항원-염색 및/또는 표지화와 이들의 확인, 그리고 이어서 항원 반응성 클론의 수동 및/또는 로봇 보조 선별이 가능해진다.
본 발명의 추가의 구체예는 가변 항체 결합 도메인의 코딩 영역에 돌연변이를 특이적으로 표적화하는, 돌연변이화 조건의 존재 하에 항원-반응성 세포의 항원-선별/FACS-정렬/확장의 반복 사이클을 수행하는 것이다. 이 접근법에 의해서, 인시튜 생성되는 고 친화성 돌연변이가 각 세포 증폭 회전에서 생성된다. 레트로사이트 디스플레이에서 증가된 항원 결합을 나타낸 세포의 세포 정렬 및 부화시, 고 친화성 돌연변이가 선별적으로 부화되고 확장된다. 항체 가변 영역 도메인에 표적화된 높은 돌연변이 비율은 항체 발현 세포에서 AID 효소를 과발현함으로써 달성될 수 있으며, 특히 발현 구성물이, 제한되지는 않지만, 항체 가변 영역에 AID 매개된 체세포 초돌연변이를 부여한다고 알려진, 면역글로불린 κ 인트론 및 3'κ 인핸서 요소를 포함하는 시스-조절성 프로모터 및 인핸서 요소를 함유하는 경우 그러하다(도 4a 및 b). 이와 같은 접근법은 내인성으로 또는 외적으로 AID를 구성적으로 발현하는 세포를 사용하여 실현될 수 있었지만, 본 발명의 한 양태는 AID 발현 벡터를 이용하는데, 여기서는 AID 발현이 유도성 프로모터, 제한되지는 않지만, 예를 들어 테트라시클린 및/또는 독시시클린 유도성 프로모터 시스템(Gossen & Bujard, 1992)을 사용하여 유도된 다음 다시 소실되며, 이 경우 관심의 유전자의 발현은 원핵 tet-오페론의 텐덤 반복이 측면에 위치된 최소 CMV 프로모터에 의해 제어되며, tet-오페론과의 결합이 테트라시클린 또는 테트라시클린 유도체에 의해 알로스테릭하게 제어되는 HSV-VP16-Tet-억제인자 융합 단백질을 사용하여 발현이 유도되거나 억제될 수 있다.
다음의 비제한적 실시예에서 본 발명이 더 상세히 설명된다.
실시예 1
히그로마이신 B 및 퓨로마이신 항생제 약물 선별 마커를 각각 함유하는 완전 인간 면역글로불린 중쇄( IgH ) 및 면역글로불린 경쇄 ( IgL ) 레트로바이러스 발현 벡터의 클로닝
상기 언급한 대로, 본 발명은 상이한 디자인의 결합 단백질에 대한 레트로바이러스 발현 벡터를 사용하여 실현될 수 있다(예를 들어, 도 4a~c 비교). 본 발명을 실현하는데 사용될 수 있는 벡터 디자인의 한 예로서, 레트로바이러스 발현 벡터에 대한 상세한 클로닝 전략이 본원에 설명되며, 이것은 완전 인간 IgG1/κL 항체의 발현, 및 항생제 내성 마커를 이용한 표적 세포에서 안정하게 유지되는 이들 벡터의 선별을 허용한다.
a) 인간 면역글로불린 중쇄(IgH)에 대한 레트로바이러스 발현 벡터의 구축
레트로바이러스 인간 면역글로불린 중쇄 발현 벡터의 구축을 위한 출발점으로서 상업적으로 이용가능한 레트로바이러스 벡터 pLHCX를 사용했다(BD-Clontech, Mountain View, CA)(도 5a). pLHCX는 레트로바이러스 백본의 5' LTR 프로모터에 의해 추진되는 히그로마이신 B 내성 마커 유전자를 함유한다. 이에 더하여, pLHCX는 CMV-즉시 조기 프로모터와 그에 뒤따라서 발현될 관심의 유전자의 삽입을 위한 간단한 다중 클로닝 부위(MCS)를 함유한다. 또한, pLHCX 백본은 CMV 프로모터의 상류에 편리하고 독특한 BglII 제한 효소 부위를 함유하며(도 5a), 여기에서 추가의 유전자 요소가 클로닝될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예는 인간 불변 γ1 중쇄 코딩 영역을 향한 인간 VH 코딩 영역의 인프레임 클로닝에 Eco47III 제한 효소를 사용하는 것으로서, 이 특정 제한 효소 부위는 발현된 IgH 사슬의 아미노산 조성의 변화 없이 VH와 Cγ1 코딩 영역 사이의 접합부에 도입될 수 있다. 그러나, pLHCX는 ψ 패키징 신호에 하나의 Eco47III 제한 효소 부위를 함유하고(도 5a), 때문에 상기 언급된 VH 영역 클로닝 전략에서 Eco47III을 직접적으로 사용할 수 없게 된다. pLHCX 벡터 백본으로부터 이런 불편한 Eco47III 제한 효소 부위를 제거하기 위해서, 다음의 첫 번째 예비 클로닝 단계를 도 5a에 상세히 나타낸 대로 수행했다. ψ 패키징 신호의 Eco47III 부위를, 제조자의 지시에 따라 원하는 돌연변이를 부여하는 특정 프라이머 쌍을 사용하여, Eco47III 인식 서열 AGCGCT의 세 번째 C 뉴클레오티드를 A로 치환하는 상업용 Quikchange™ 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 부위 지정 돌연변이유발에 의해 제거했다. 변형된 벡터를 pLHCX-m1이라고 지칭했고, ψ(Psi) 패키징 신호의 이 단일 염기쌍 치환이 변형된 벡터 pLHCX-m1의 레트로바이러스 형질도입 효능에 영향을 미치지 않았음을 검증했다(데이터 도시하지 않음).
pLHCX-m1 백본에서 막-스패닝 코딩 영역 M1 및 M2가 있는 또는 없는 인간 Cγ1의 불변 영역을 암호화하는 cDNA가 병행하여 클로닝될 수 있다. Cγ1-m 및 Cγ1-s DNA 단편을 주형으로서 인간 말초혈 림프구의 cDNA를 사용하고, 포워드 및 리버스 프라이머 Seq-ID1, Seq-ID2, Seq-ID3을 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭했다(아래 참조). 인간 IgG의 막 결합 형태의 RT-PCR 증폭에서는 Seq-ID1과 Seq-ID2의 프라이머 조합을 사용했고, 인간 IgG의 분비된 버전의 클로닝에는 Seq-ID1과 Seq-ID3의 프라이머 조합을 사용했다. 포워드 및 리버스 PCR 증폭 프라이머는 HindIII 및 ClaI 제한 효소 부위를 각각 함유했으며, 이로써 pLHCX-m1에 있는 CMV 프로모터 하류의 독특한 HindIII 및 ClaI 부위를 향한 PCR-증폭된 단편의 방향성 클로닝이 허용된다(도 5a). 포워드 PCR 증폭 프라이머는 발현된 전장 IgG1 중쇄의 아미노산 조성의 변화 없이 VH 영역과 불변 영역을 인프레임 융합하는데 유용한 내부 Eco47III 부위를 더 함유했다. 리버스 PCR 증폭 프라이머 Seq-ID2 및 Seq-ID3은 추가의 내부 NotI 부위를 함유했고, 이것은 일반적인 클로닝 목적을 위해, 예를 들어 상이한 Ig 이소타입의 발현을 위해 불변 영역 코딩 영역을 교환하려는 목적으로 코딩 영역의 하류에서 바로 구성물의 제한 효소 분해를 허용한다.
Figure pct00001
프라이머 Seq-ID2는 Seq-ID1과 함께 인간 IgG1의 분비된 버전의 PCR 증폭에서 리버스 프라이머로서 사용되었고, 클로닝 목적을 위한 독특한 NotI 부위(밑줄)를 함유했다.
Figure pct00002
프라이머 Seq-ID3은 Seq-ID1과 함께 인간 IgG1의 막 결합 버전의 PCR 증폭에서 리버스 프라이머로서 사용되었고, 클로닝 목적을 위한 독특한 NotI 부위(밑줄)를 함유했다.
Figure pct00003
인간 Cγ1의 분비된 버전에서 약 1.0kb, 인간 Cγ1의 막 결합된 버전에서 약 1.2kb의 결과의 PCR 산물을 HindIII 및 ClaI 제한 효소에 의해 분해했고, 병행하여 양립성 제한 효소 부위 pLHCX-m1에서 방향성 있게 클로닝하여, 플라스미드 pLHCX-m1-Cγ1-s 및 pLHCX-m1-Cγ1-m을 각각 만들었다(도 5b 참조). 다음에, VH 사슬 영역을 VH 영역 단편이 측면에 위치된 독특한 제한 효소 HindIII 및 Eco47III을 사용하여 분비된 또는 막 결합된 인간 Cγ1의 코딩 영역 쪽으로 인프레임 클로닝할 수 있었다(도 5b). 이런 제한 효소 조합은 7개의 인간 V-유전자 세그먼트 과 전부의 인간 VH 코딩 영역에서 단지 매우 드물게 발견된다.
완전한 인간 IgG1 중쇄 발현 벡터를 구축하기 위해서, NIP-오브알부민에 특이적인, 미리 확인된 완전 인간 항체로부터의 인간 VH 코딩 영역을 HindIII-Eco47III 단편으로서 pLHCX-m1-Cγ1s 및 pLHCX-m1-Cγ1m 구성물에 삽입하여, 플라스미드 pLHCX-m1-VHCγ1s 및 pLHCX-m1-VHCγ1m을 각각 만들었다(도 5c). 리더 서열과 5'-HindIII 및 3'-Eco47III 클로닝 부위를 포함하는 NIP-오브알부민 특이적 인간 항체의 VH 코딩 영역이 Seq-ID4에 제공된다. 개선된 번역을 위해 2개의 추가의 C 뉴클레오티드가 개시-ATG의 상류에 부가되었다는 것이 주지되어야 한다(Kozak-컨센서스 서열과 유사):
Seq-ID4:
AAGCTT CCATGGAGTTTGGGCTcAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAATGGTCGACCACGCGGAAAGCTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCT AGCGCT
Seq-ID4에서 클로닝을 위한 HindIII 및 Eco47III 제한 효소 부위를 밑줄로 나타낸다. 리더 서열의 개시 ATG는 위치 9에서 시작된다.
도 5c에 묘사된 이 인간 IgG1 중쇄 발현 벡터로도 본 발명을 실현하고 레트로바이러스 IgL 사슬 발현 벡터와 조합하여 레트로사이트 디스플레이를 수행하는데 이미 충분하지만, VH 코딩 영역에 체세포 초돌연변이를 표적화하는 기능성은 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 유전자 좌위의 어떤 시스-조절성 인핸서 요소의 존재를 필요로 한다. κ 경쇄 유전자 좌위의 κ 인트론 및 3'κ 인핸서 요소가 활성 프로모터의 하류에 위치된 V 영역에 체세포 초돌연변이를 표적화할 수 있다고 알려져 있으므로, 기본 레트로바이러스 인간 Ig 중쇄 발현 벡터 pLHCXm1-VHCg1m 및 pLHCXm1-VHCg1s(도 5c)가 다음 방식으로 κ 인트론과 3'κ 인핸서 요소를 함유하도록 추가로 변형되었다. 뮤린 κ 인트론 인핸서(κiE)의 서열이 Jκ5 요소와 불변 κ 코딩 영역 사이에 위치된 약 2.3kb 길이의 인터제닉 영역 내에 위치되며, 이것의 서열은 NCBI-Genbank 엔트리 V00777로부터 유래될 수 있다. 코어 κiE는 이 인터제닉 영역 내에 단지 약 0.5kb를 포함하며, 이것의 서열은 NCBI Genbank 엔트리 X00268로부터 유래될 수 있다. κiE 영역을 포함하여 Jκ5에서 Cκ까지 전체 2.3kb 단편은 내부 BglII 부위를 함유하므로 pLHCX-m1-VHCγ1-s 및 pLHCX-m1-VHCγ1-m 벡터에서 PCR 증폭된 게놈 단편을 클로닝하는데 이 제한 효소를 사용하지 않아도 되게 된다. 그러나, 이 영역에는 내부 BamHI 제한 효소 단편이 없기 때문에, BglII 선형화된 벡터 pLHCX-mod1-VHCγ1s 및 pLHCX-m1-VHCγ1m에서 BamHI 부위가 측면에 위치된 게놈 PCR 단편의 클로닝은 가능하다(도 5c). 포워드 및 리버스 프라이머 Seq-ID5 및 Seq-ID6을 사용하여 마우스 게놈 DNA로부터 이 게놈 단편의 PCR 증폭에 의해 Jκ5에서 Cκ 사이에 전체 약 2.3kb 인터제닉 영역을 함유하는 벡터를 구축하였고, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머는 모두 pLHCX-m1-VHCγ1s 및 pLHCX-m1-VHCγ1m의 독특한 BglII 제한 효소 부위에서 클로닝을 위한 추가의 BamHI 제한 효소 부위(밑줄)를 함유하고, 그 결과 플라스미드 pLHCX-m1-VHCγ1s-κiE 및 pLHCX-m1-VHCγ1m-κiE가 각각 만들어졌다(도 5d).
Figure pct00004
마우스 κ 경쇄 유전자 좌위로부터의 게놈 단편을 함유하는 전체 약 2.3kb의 κiE를 삽입하는 것에 더하여, 코어 κiE를 함유하는 더 짧은 약 0.8kb의 게놈 PCR 단편(V00777의 위치 3634~4394, Seq-ID7)을 pLHCX-m1-VHCγ1-s 및 pLHCX-m1-VHCγ1-m의 독특한 BglII 부위에서 또한 클로닝했다(도시하지 않음). 이 게놈 DNA 단편의 PCR 증폭에 사용된 포워드 및 리버스 PCR 프라이머는 Seq-ID8 및 Seq-ID9에 묘사된다.
Seq-ID7: 5'GAAAAATGTTTAACTCAGCTACTATAATCCCATAATTTTGAAAACTATTTATTAGCTTTTGTGTTTGACCCTTCCCTAGCCAAAGGCAACTATTTAAGGACCCTTTAAAACTCTTGAAACTACTTTAGAGTCATTAAGTTATTTAACCACTTTTAATTACTTTAAAATGATGTCAATTCCCTTTTAACTATTAATTTATTTTAAGGGGGGAAAGGCTGCTCATAATTCTATTGTTTTTCTTGGTAAAGAACTCTCAGTTTTCGTTTTTACTACCTCTGTCACCCAAGAGTTGGCATCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGAGGCCATCTGGCAGTTGCTTAAGATCAGAAGTGAAGTCTGCCAGTTCCTCCAAGGCAGGTGGCCCAGATTACAGTTGACCTGTTCTGGTGTGGCTAAAAATTGTCCCATGTGGTTACAAACCATTAGACCAGGGTCTGATGAATTGCTCAGAATATTTCTGGACACCCAAATACAGACCCTGGCTTAAGGCCCTGTCCATACAGTAGGTTTAGCTTGGCTACACCAAAGGAAGCCATACAGAGGCTAATATCAGAGTATTCTTGGAAGAGACAGGAGAAAATGAAAGCCAGTTTCTGCTCTTACCTTATGTGCTTGTGTTCAGACTCCCAAACATCAGGAGTGTCAGATAAACTGGTCTGAATCTCTGTCTGAAGCATGGAACTGAAAAGAATGTAGTTTCAGGGAAGAAAGGCAATAGAAGGAAGCCTGAGAATATCTTCAAAGGG-3'
Figure pct00005
또한, 게놈 PCR 단편을 함유하는 약 0.8kb 단편 코어 κiE를 벡터 pLHCX-m1-VHCγ1-s 및 pLHCX-m1-VHCγ1-m의 독특한 BglII 제한 효소 부위 모두에서 BamHI 분해된 PCR 단편으로서 클로닝했다(도시하지 않음).
부착된 뮤린 3'κ 인핸서 요소의 서열은 NCBI-Genbank 참조번호 X15878 하에 검색될 수 있으며, 마우스 게놈의 불변 κ 코딩 영역의 약 8.7kb 하류에 위치된 808bp 유전자 서열에 함유된다.
뮤린 3'κ 인핸서는 내부 ClaI 부위를 함유하지 않으므로, 레트로바이러스 벡터 pLHCX-m1-VHCγ1s-3'κE 및 pLHCX-m1-VHCγ1m-3'κE의 독특한 ClaI 부위에서 클로닝하기 위한 추가의 ClaI 제한 효소 부위를 각각 함유하는 포워드 및 리버스 PCR 프라이머 Seq-ID10 및 Seq-ID11을 사용하여 마우스 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다(도 5d).
Figure pct00006
결과적으로 최종적인 Igγ1H 사슬 발현 벡터 pLHCX-m1-VHCγ1s-3'κE-κiE 및 pLHCX-m1-VHCγ1m-3'κE-κiE(도 5e)가 만들어졌고, 이들 벡터는 IgL 사슬 공-발현시 각각 분비된 또는 막 결합된 인간 IgG1 항체를 생산하는 Ig 중쇄를 암호화한다.
두 벡터는 Igγ1H 사슬 발현 카세트의 상류 및 하류에 κiE 및 3'κE 시스-조절성 요소를 더 함유하고, 이들은 발현된 Igγ1H 사슬의 VH 영역에 체세포 초돌연변이를 부여한다.
b) 인간 Igκ 경쇄에 대한 레트로바이러스 발현 벡터의 클로닝
레트로바이러스 통합을 위한 항생제 선별을 허용하는 레트로바이러스 인간 면역글로불린 경쇄 발현 벡터의 구축을 위한 출발점으로서, 상업적으로 이용가능한 레트로바이러스 벡터 pLPCX(BD-Clontech, Mountain View, CA)를 사용했다(도 6a). 이 벡터는 레트로바이러스 백본의 5' LTR 프로모터에 의해서 추진되는, 퓨로마이신 내성을 부여하는 항생제 선별 마커를 함유한다. pLHCX 백본의 디자인과 유사하게(실시예 1a 참조), pLPCX도 2개의 Eco47III 부위와 추가의 제한 효소 부위를 가진 MCS를 함유하고, CMV 프로모터의 상류에서 편리하고 독특한 BglII 부위는 결여한다(도 6a).
pLPCX 벡터 백본으로부터 Eco47III 제한 효소를 제거하는 동시에 CMV 프로모터의 상류에 독특한 BglII 제한 효소를 도입하기 위해서 다음의 예비 클로닝 단계를 수행했다: 첫 번째 단계에서 pLHCX의 패키징 신호에 있는 Eco47III 부위를, 제조자의 지시에 따라 원하는 돌연변이를 부여하는 특정 프라이머 쌍을 사용하는 Eco47III 인식 서열 AGCGCT의 세 번째 C 뉴클레오티드를 A로 치환하는 상업용 Quikchange™ 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 부위 지정 돌연변이유발에 의해 제거했다(도 6a). ψ(Psi) 패키징 신호에서의 이런 단일 염기쌍 치환이 돌연변이된 벡터의 레트로바이러스 형질도입 효능에 영향을 미치지 않았음이 입증되었다(데이터 도시하지 않음). 돌연변이된 벡터는 pLPCX-m1로 지칭했다(도 6a). Eco47III 부위가 완전히 결여되고 CMV 프로모터의 상류에 독특한 BglII 부위를 추가로 포함하는 pLPCX 벡터 백본을 얻기 위해서, NcoI 분해된 DNA 단부가 Klenow 효소로 채워진, pLPCX-m1로부터의 AscI-NcoI 단편을 BlpI 분해된 DNA 단부가 Klenow 효소로 채워진, AscI-BlpI 분해된 pLHCX 백본에서 클로닝했고(도 6b), 이로써 본질적으로 단지 pLHCX의 히그로마이신 B 유전자만이 pLPCX의 퓨로마이신 내성 마커로 치환된 벡터 pLPCX-m2가 생성되었다(도 6b).
IgκL 사슬 발현 벡터의 구축을 위해서, 불변 κ 경쇄 코딩 영역을, pLPCX-m2에서 방향성 클로닝하기 위해, HindIII 및 ClaI 제한 효소 부위를 각각 함유하는 포워드 및 리버스 프라이머 Seq-ID12 및 Seq-ID13을 사용하여 인간 말초혈 림프구 cDNA로부터 PCR 클로닝했다(도 6b). 단락 a)에 설명된 대로, 포워드 프라이머 Seq-ID12는 VL 코딩 영역과 불변 κ 경쇄 코딩 영역의 인프레임 융합을 허용하는 Eco47 III 부위를 더 함유했고, 이것은 인간 불변 κ 경쇄의 처음 위치에서 1개의 보존된 트레오닌을 세린 아미노산으로 치환한다. 리버스 프라이머는 추가의 내부 NotI 부위를 함유했고, 이것은, 예를 들어 불변 κ 코딩 영역의 교환 같은 후기 클로닝 과정을 촉진한다.
Figure pct00007
5' 단부에는 HindIII/Eco47III 부위, 3' 단부에는 NotI/ClaI 부위가 측면에 위치된 불변 κ 경쇄 코딩 영역을 pLPCX-m2에 삽입하여 플라스미드 pLPCX-m2-Cκ를 만들었다.
완전한 인간 IgκL 중쇄 발현 벡터를 구축하기 위해서, NIP-오브알부민에 특이적인, 미리 확인된 완전 인간 항체로부터의 인간 Vκ 코딩 영역을 구성물 pLPCX-m2-Cκ에 HindIII-Eco47III 단편으로서 삽입했다(도 6c). 리더 서열 및 5'-HindIII과 3'-Eco47III 클로닝 부위를 포함하는 NIP-오브알부민 특이적 인간 항체의 Vκ 코딩 영역이 Seq-ID14에 제공된다. 개선된 번역을 위해 2개의 추가의 C 뉴클레오티드가 개시-ATG의 상류에 부가되었다는 것이 주지되어야 한다(Kozak-컨센서스 서열과 유사):
Seq-ID14: 5'- AAGCTT CCATGGATATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTcAACAGAGTTACAGTACCCCCACTTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCA AGCGCT -3'
Seq-ID14에서 클로닝을 위한 HindIII 및 Eco47III 제한 효소 부위를 밑줄로 나타낸다. 리더 서열의 개시 ATG는 위치 9에서 시작된다. HindIII-Eco47III 선형화된 pLPCX-m2-Cκ에 이 HindIII-Eco47III 단편을 삽입하여 발현 구성물 pLPCX-m2-VκCκ를 만들었다(도 6c).
이 레트로바이러스 κ 경쇄 발현 벡터로도 본 발명을 실현하고 레트로바이러스 Ig 중쇄 발현 벡터와의 공-발현시 레트로사이트 디스플레이를 수행하는데 충분하지만, Ig 중쇄 발현 구성물에 대한 동일한 클로닝 전략에 따라서 κiE 및 3'κE 요소를 더 함유하는 추가의 벡터를 클로닝했다. 따라서, 프라이머 쌍 Seq-ID5 및 Seq-ID6(상기 참조)과 함께 증폭된 약 2.3kb 게놈 BamHI 분해된 PCR 단편으로서, 또는 프라이머 쌍 Seq-ID8 및 Seq-ID9(상기 참조)와 함께 증폭된 약 0.8kb 게놈 BamHI 분해된 PCR 단편으로서, 마우스 κiE를 CMV 프로모터의 상류에서 pLPCX-m2-Vκ-Cκ의 독특한 BalII 부위에 삽입했다. pLPCX-m2-VκCκ에서 약 2.3kb 게놈 마우스 κiE 함유 단편의 클로닝만을 여기 나타내며, 그 결과 플라스미드 pLPCX-m2-VκCκ-κiE를 만들었다(도 6d).
마지막으로, 상기 실시예 1a에 설명된 κiE 및 3'κE 함유 IgH 사슬 레트로바이러스 발현 벡터의 구축과 유사하게, 프라이머 쌍 Seq-ID10 및 Seq-ID11과 함께 증폭된 ClaI 분해된 게놈 PCR 단편으로서 뮤린 3'κE를 κ 경쇄 코딩 영역의 하류에서 독특한 ClaI 제한 부위에 삽입하여, 레트로바이러스 발현 벡터 pLPCX-m2-Vκ-Cκ-κiE-3'κE를 생성했다(도 6d).
κiE 및 3'κE 요소를 함유하는 IgH 사슬 발현 벡터와 마찬가지로, 이 벡터도 이 구성물에서 클로닝되는 임의의 Vκ 코딩 영역에 체세포 초돌연변이를 부여하는데 필요한 모든 시스-조절성 요소를 함유한다(아래 참조).
실시예 2
활성화 유도 시티딘 데아미나제(AID)를 과발현하는 셀라인의 생성
활성화된 B 세포 특이적 단백질 활성화 유도 시티딘 데아미나제(AID)가 어떤 척추동물 셀라인이든 체세포 초돌연변이 표현형을 부여하는데 필요 충분한 독특한 트랜스-활성화 인자라는 것이 증명되었다. AID를 발현하는 세포에서, 체세포 초돌연변이는 전사 활성 유전자 좌위가 면역글로불린 κ 경쇄 좌위의 시스-조절성 인핸서 요소, 특히 κiE 및 3'κE 요소에 대해 정확한 관계로 배열된 경우, 이들 좌위에 특이적으로 표적화될 수 있다. AID를 안정하게 발현하는 셀라인을 얻기 위해서, 먼저 뮤린 AID를 암호화하는 레트로바이러스 발현 구성물을 다음 방식으로 구축했다:
제조자의 지시에 따라서 고충실 Pfx-중합효소(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 마우스 전체 비장 cDNA로부터 뮤린 AID cDNA를 PCR 증폭했으며, 이때 포워드 및 리버스 PCR 프라이머는 Seq-ID15 및 Seq-ID16이고, 이들은 양립성 벡터에 PCR 증폭된 단편을 라이게이션하기 위한 추가의 XhoI 클로닝 부위를 함유한다. 이에 더하여, 포워드 프라이머는 뮤린 AID ORF의 XhoI 부위 하류와 개시 ATG 코돈 상류에 추가로 2개의 C 뉴클레오티드(이탤릭체로 강조)를 함유했고, 이로써 Kozak 번역 개시 서열과 유사하게 되어, 클로닝된 cDNA의 적절한 번역이 보장되었다.
Figure pct00008
결과의 620bp RT-PCR 산물을 XhoI로 분해하고, BD-Clontech(Mountain View, CA)에서 입수한 XhoI 분해되고 알칼리성 포스파타제 처리된 pLPCX에 라이게이션했다. 정확한 배향의 삽입부를 함유하는 라이게이션 산물을 진단용 제한 효소 분해에 의해 판정했다. 정확한 배향의 뮤린 AID cDNA 삽입부를 함유하는 정확한 제한 효소 패턴을 가진 클론을 DNA 서열화에 의해 검증하여 pLPCX-mAID라고 지칭했다(도 7).
클로닝된 뮤린 AID cDNA의 서열은 NCBI-Genbank 엔트리 AF132979에 제공된 공개된 뮤린 AID cDNA ORF에 정확하게 상응했다.
다음에, PvuI 선형화된 pLPCX-mAID 구성물 10㎍를, 주위 온도에서 300V, 960 μF에서 전기천공하여, 800㎕ 플레인 RPMI 배지에 재현탁된 5x106 FA-12 Abelson 형질전환 preB 세포에 트랜스펙션했다. 트랜스펙션된 세포를 FCS를 함유하는 성장 배지 20ml에 다시 현탁하고, 200㎕/웰로 10개의 96웰 플레이트에 평판했다. 트랜스펙션 48시간 후, 성장 배지에 2㎍/ml 퓨로마이신 항생제를 첨가하여 안정하게 트랜스펙션된 세포를 선별했다.
트랜스펙션 10~14일 후, 수십 개의 퓨로마이신 내성 콜로니가 검출되었으며, 선별된 클론을 2㎍/ml 퓨로마이신을 함유하는 신선한 배양 배지로 옮겼다. 이 퓨로마이신 내성 클론을 더 확장시키고, 선별된 수의 클론을 제조자의 추천에 따라서 상업용 항-마우스 AID 항체를 사용하여 ECL 웨스턴-블롯팅에 의해 뮤린 AID 단백질의 발현에 대해 시험했다(도 9a 참조).
분석된 FA-12-AID 트랜스펙션된 세포 클론 중 약 80%에서 특이적 AID 단백질 결합이 검출되었고, 예상된 대로 25kD의 겉보기 분자량을 나타냈다. 이로부터, 뮤린 AID 단백질을 구성적으로 과발현하는 몇 개의 셀라인이 얻어졌다고 결론내릴 수 있었다.
실시예 3
시스 - 조절성 κ iE 및 3'κE 요소를 함유하는 레트로바이러스 인간 면역글로불린 발현 구성물에서 리포터 유전자에 표적화된 체세포 초돌연변이의 증명
다음에, 본 발명에 개시된 것과 같은, 레트로바이러스 발현 구성물에서 인간 항체 가변 영역이 AID 매개된 체세포 초돌연변이에 대한 표적임을 증명했다. 이를 위하여, 인간 IgH 사슬의 V-영역 ORF가, 체세포 초돌연변이의 핫스판이라고 알려진 RGYW 서열 모티프 맥락에 중단 코돈이 도입된 돌연변이된 EGFP ORF로 치환된 리포터 구성물을 생성했다(Bachl & Olsson, 1999).
중단 돌연변이를 EGFP ORF의 코돈 107에 도입하여 티로신 코돈을 TAG 중단 코돈으로 변화시켰다. 이에 더하여, 코돈 108을 변형시켜서 돌연변이된 EGFP 서열 내에 신규의 진단용 SepI 제한 부위를 생성했고, 이로써 코돈 107에서 중단 돌연변이의 역돌연변이시 SpeI 부위가 파괴되어 역돌연변이체의 확인 및 특성화가 용이하게 될 것이다. EGFP ORF에 도입된 서열 변형을 도 10a에 나타내고, 전체 돌연변이된 EGFP ORF는 도 10b에 제공된다.
체세포 초돌연변이를 증명하기 위한 리포터 구성물을 다음과 같이 구축했다:
고충실 Pfx-중합효소(Invitrogen, Carlsbad, CA)와 pLHCXm1-VHCγ-s-κiE-3'κE의 VH-영역의 EGFP ORF로의 치환을 허용하는 HindIII 및 Eco47III 제한 효소 부위를 각각 더 함유하는 포워드 프라이머 Seq-ID17과 Seq-ID18을 사용하고, 주형으로서 플라스미드 pIRES-EGFP(BD-Clontech, Mountain View, CA)로부터 EGFP ORF를 PCR 증폭했다. 포워드 프라이머는 ATG 개시 코돈의 상류에 추가로 2개의 C 뉴클레오티드를 함유했고(이탤릭체로 강조), 이로써 Kozak 번역 개시 컨센서스 서열과 유사해져 정확한 ATG 개시 코돈에서 적절한 번역 개시가 보장된다.
Figure pct00009
Pfx 증폭된 EGFP PCR 737bp 단편을 Zero-Blunt PCR 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 일부인 pCR4-Topo 벡터에서 직접 클로닝하여 pCR4-Topo-EGFP 벡터를 만들었다(도 11). 다음에, pCR4-Topo-EGFP의 서열-검증된 클론을 원하는 돌연변이를 부여하는 특정 프라이머 쌍을 이용하여, 제조자의 지시에 따라 Quikchange™키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 도 10에 나타낸 대로 EGFP ORF의 코돈 107과 108에 돌연변이를 일으켜 플라스미드 pCR4-Topo-EGFPmut를 생성했다.
pCR4-Topo-EGFPmut의 서열 검증된 돌연변이된 EGFP ORF를 제한 효소 HindIII 및 Eco47III을 사용한 이중 제한 효소 분해에 의해 플라스미드로부터 회수했다. 분해된 단편을 HindIII 및 Eco47III 이중 분해된 플라스미드 pLHCXm1-VHCγs-κiE-3'κE(도 5e)와 인핸서 요소를 함유하지 않는 HindIII 및 Eco47III 이중 분해된 플라스미드 pLHCXm1-VHCγ-s(도 5c)에 라이게이션했다. 이로써 두 벡터에서 모두 VH 코딩 영역이 돌연변이된 EGFP ORF로 치환되었고, 이것을 Cγ1 영역에 인프레임 융합하여, 리포터 플라스미드 pLHCXm1-E(mut)-Cγs-κiE-3'κE 및 대조군 리포터 플라스미드 pLHCXm1-E(mut)-Cγ-s를 만들었다(도 11).
두 플라스미드를 퓨로마이신 내성 FA-12 AID 트랜스펙턴트 클론 3(AID 발현)과 대조군으로서 5(AID 미발현)에 형질도입했다. 형질도입된 세포를 형질도입 24시간 후에 시작하여 2mg/ml 히그로마이신 B 선별 하에 배양하고, 배양 6, 8 및 10일 후에 녹색 자가형광 세포의 출현에 대해 세포를 분석했다. 돌연변이된 EGFP 리포터 구성물이 κiE 및 3'κE와 관련하여 발현되었던 실험에서(즉, 플라스미드 pLHCXm1-E(mut)-Cγ-s-κiE-3'κE 사용), 그리고 AID 발현이 웨스턴-블로팅에 의해 검출되었던 FA-12 AID 트랜스펙턴트(즉, FA-12 AID 트랜스펙턴트 클론 3)에서만 배양 6, 8 및 10일 후에 녹색 자가형광 세포가 검출될 수 있었고, 이 경우 약 0.2%(도 9b)의 정류 상태 빈도로 FACS에 의해 녹색 세포가 검출되었다. 대조군 실험(AID 미발현, 및/또는 구성물에 인핸서 요소의 부재, 데이터 도시하지 않음) 중에서는 어떤 것도 10일간의 실험 기간 동안 녹색 세포가 검출되지 않았다.
0.2% EGFP 양성 집단으로부터 192개의 단일 세포를 2개의 96웰의 각 웰에서 정렬하고, 충분한 세포가 성장된 후 이들 단일 정렬된 클론으로부터 100개의 클론을 FACS에 의해서 녹색 형광에 대해 분석했다. 분석된 100개의 클론에서 95개 클론이 단일 정렬된 세포에서 검출된 형광과 유사한 강도로, 즉 약 102 log 형광으로 균일한 형광 패턴을 나타냈다(FA-12 세포 대조군 세포의 자가형광은 101 log 형광 수준 아래로 유지되었고, 이것은 역치 라인을 표시한다). 4개의 클론은 세포의 약 반은 EFGP 발현에 대해 음성이고, 나머지 반은 양성인 불균일한 형광 패턴을 나타냈다. 분석된 100개의 클론 중 단지 1개만 EGFP 형광을 실제로 나타내지 않았으며, 이 클론은 바탕 자가형광 수준을 약간 넘었다. 불균일한 음성 EGFP 패턴을 가진 5개의 클론은 레트로바이러스 통합체에서 EGFP 발현의 위치에 따른 (부분적) 침묵화로 인한 것일 수 있거나, 또는 이 결과는 단일 세포 정렬 인공부분으로 인한 것일 수 있다. 그렇지만, 대부분의 클론(95%)에서 EGFP 발현이 분명히 검출되었다. 이들 클론 중 24개를 클로닝 프라이머 Seq-ID17 및 Seq-ID18을 사용하여 PCR에 의해 분석하여, 안정하게 형질도입된 세포로부터 EGFP 유전자를 다시 증폭했다.
돌연변이된 EGFP ORF를 함유하는 리포터 벡터로부터의 PCR 산물과는 반대로, EGFP 발현 클론으로부터의 24개 PCR 산물은 어느 것도 SpeI 제한 효소로 분해될 수 없었으며, 이는 돌연변이된 EGFP ORF의 코돈 107에서 TAG 중단 돌연변이의 역돌연변이를 시사한다(데이터 도시하지 않음).
PCR 산물 중 10개를 DNA 서열화에 의해 분석했고, 이로써 10개 클론이 모두 선행 문헌에 보고된 대로(Bachl & Olsson, 1999), EGFP ORF에 도입된 RGYW 모티프에 G 뉴클레오티드의 G->C 돌연변이를 함유했다는 것이 확인되었다.
이것은 κiE 및 3'κE 요소와 같은 시스-조절성 유전자 요소의 존재에 따라서, 그리고 AID 발현에 따라서 상승된 수준의 체세포 돌연변와 이에 따른 돌연변이유발이 개시된 레트로바이러스 발현 구성물과 관련하여 활성 프로모터 하류의 DNA 영역에 표적화될 수 있고, 따라서 인간 항체 사슬의 VH 코딩 영역에 표적화될 수 있다는 것을 증명한다.
κiE 및 3'κE 구성물에서 AID 의존성 체세포 돌연변이 수준을 추정하는 것에 관하여, 추정된 돌연변이 비율은 약 3x10-5 돌연변이/bp/생성 범위였다. 이 수치는 10-4 또는 심지어 10-3 /bp/생성 비율까지 도달할 수 있다고 보고된 생체내 체세포 초돌연변이 비율보다는 낮다. 그렇지만, 검출된 돌연변이 비율은 10-8 돌연변이/bp/생성 범위인 것으로 추정되는 척추동물 세포에서 보고된 바탕 돌연변이 비율보다는 상당히 높았다. 따라서, 높은 체세포 돌연변이 비율이 인핸서 및 AID 의존성 방식으로 개시된 레트로바이러스 구성물에서 활성 프로모터의 하류 영역에 특이적으로 표적화되고, 이로써 AID 발현에 의해 매개되는 체세포 초돌연변이에 기초하여 생체내 돌연변이화 조건에서 레트로사이트 디스플레이의 적용이 가능하다는 결론이 내려진다.
실시예 4
V(D)J 재조합 적격 레트로바이러스 발현 벡터를 사용한 인간 항체 암호화 영역의 인시튜 생성의 증명
a) IgH 사슬 발현 전에 V(D)J 재조합을 필요로 하는 레트로바이러스 인간 중쇄( IgH ) 사슬 발현 벡터의 클로닝
실시예 1에 설명된 cDNA 발현 벡터로부터 중쇄(H) 및 경쇄(L)를 레트로바이러스 발현하는 것에 대한 대안적인 접근법으로서, 가변 코딩 영역이 "유사-점라인" 형태의 분리된 V, D 및 J 유전자 세그먼트에 의해 암호화되는 상이한 레트로바이러스 IgH 사슬 벡터 부류를 구축했고, 이는 발현 전에 역시 V(D)J 재조합 과정에 의해서 조립되어야 한다. V(D)J 재조합은 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 부위 특이적이지만 약간 부정확한 조립을 매개하고, 이로써 예를 들어 전구체 B 세포와 같은 V(D)J 재조합 활성 세포로의 형질도입시 단일 발현 구성물로부터 다종 V 코딩 영역이 인시튜 생성될 수 있다.
이를 위하여, B 세포 고갈된 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)로부터 유래된 게놈 DNA로부터 점라인 VH3.30, DH1.26 및 JH3 유전자 세그먼트를 개별적으로 PCR 클로닝했다. 점라인 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 증폭에 사용된 PCR 프라이머는 보존된 재조합 신호 서열(RSS)과 추가의 개재 DNA 서열을 포함하는 측면 DNA 서열이 포함되도록 선택했으며, 이로써 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 적절한 조립이 가능했다. 교정 열안정성 DNA 중합효소 Pfx(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 모든 PCR 앰플리콘을 생성했고, pSC-B PCR 클로닝 벡터(Stratagene, La Jolla, CA)에서 처음에 서브클로닝했으며, 두 경우 모두 공급자의 지시에 따랐다. pSC-B에서 서브클로닝된 PCR 단편을 DNA 서열화에 의해 검증했고, 만일 DNA 서열이 검증된 서열을 가진다면 단편들은 추가의 클로닝에만 사용했다.
점라인 인간 VH3.30 단편의 PCR 증폭에서는, DNA 프라이머 Seq-ID19 및 Seq-ID20을 사용했으며, 이들은 PCR 클로닝된 DNA 단편의 추가 서브클로닝을 허용하는 BamHI 및 NheI 제한 효소 부위를 함유한다(나타낸 대로).
Figure pct00010
이 방식으로 DNA가 측면에 위치한 점라인 VH3.30 유전자 세그먼트를 함유하는 623bp 길이의 PCR 앰플리콘이 얻어졌으며(Seq-ID21), 도 11a를 참조한다.
Seq-ID21:
5'attt GGATCC CACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGATTCATGGAGAAATAGAGAGACTGAGTGTGAGTGAACATGAGTGAGAAAAACTGGATTTGTGTGGCATTTTCTGATAACGGTGTCCTTCTGTTTGCAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTAGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACAGTGAGGGGAAGTCATTGTGCGCCCAGACACAAACCTCCCTGCAGGAACGCTGGGGGGAAATCAGCGGCAGGGGGCGCTCAGGAGCCACTGATCAGAGTCAGCCCTGGAGGCAGGTGCAGATGGAGGCTGTTTCCTGTCAGGA GCTAGC ggg3'
다음에, 게놈 DNA가 측면에 위치한 인간 DH1.26 단편을 함유하는 인간 게놈 DNA 단편의 PCR 증폭을 NheI 및 XhoI 제한 효소 부위를 각각 함유하는 프라이머 쌍 Seq-ID22 및 Seq-ID23을 사용하여 달성했다(도 11a).
Figure pct00011
이 방식으로 DNA가 측면에 위치한 점라인 DH1.26 유전자 세그먼트를 함유하는 336bp 길이의 PCR 앰플리콘이 얻어졌다(Seq-ID24).
Seq-ID24:
5'gga GCTAGC GGGCTGCCAGTCCTCACCCCACACCTAAGGTGAGCCACAGCCGCCAGAGCCTCCACAGGAGACCCCACCCAGCAGCCCAGCCCCTACCCAGGAGGCCCCAGAGCTCAGGGCGCCTGGGTGGATTCTGAACAGCCCCGAGTCACGGTGGGTATAGTGGGAGCTACTACCACTGTGAGAAAAGCTATGTCCAAAACTGTCTCCCGGCCACTGCTGGAGGCCCAGCCAGAGAAGGGACCAGCCGCCCGAACATACGACCTTCCCAGACCTCATGACCCCCAGCACTTGGAGCTCCACAGTGTCCCCATTGGATGGTGAGGA CTCGAG ccc3'
마지막으로, 게놈 DNA가 측면에 위치한 인간 JH3 단편을 함유하는 인간 게놈 DNA 단편의 PCR 증폭을, 나타낸 대로, SalI 및 XbaI/HindIII 제한 효소 부위를 각각 함유하는 프라이머 쌍 Seq-ID25 및 Seq-ID26을 사용하여 달성했다(도 11a).
Figure pct00012
이 방식으로 DNA가 측면에 위치한 점라인 JH3 유전자 세그먼트를 함유하는 239bp 길이의 PCR 앰플리콘이 얻어졌다(Seq-ID27).
Seq-ID27:
5'gga GTCGAC CCCTGCCTGGGTCTCAGCCCGGGGGTCTGTGTGGCTGGGGACAGGGACGCCGGCTGCCTCTGCTCTGTGCTTGGGCCATGTGACCCATTCGAGTGTCCTGCACGGGCACAGGTTTGTGTCTGGGCAGGAACAGGGACTGTGTCCCTGTGTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTAAGATGGCT AAGC TT atat TCTAGA tata3'
3개 DNA 단편 Seq-ID21, Seq-ID24 및 Seq-ID27을 독특한 BamHI, NheI, XhoI 및 XbaI 제한 효소 부위를 함유하는 셔틀 벡터에서 연속 클로닝했고, 이로써 양립성 제한 효소 부위를 통한 DNA 단편들의 연속 라이게이션에 의해 유전자 세그먼트 VH3.30, DH1.26 및 JH3을 함유하는 카세트를 조립할 수 있었다. Seq-ID21을 BamHI-NheI 선형화된 셔틀 벡터에 BamHI-NheI 단편으로서 라이게이션한 다음, NheI-XhoI 분해된 단편 Seq-ID24를 Seq-ID21을 이미 함유하고 있는 NheI-XhoI 선형화된 셔틀 벡터에 라이게이션하고, 마지막으로 SalI-XbaI 분해된 단편 Seq-ID27을 클로닝된 Seq-ID21과 Seq-ID24를 이미 함유하고 있는 XhoI-XbaI 선형화된 셔틀 벡터에 라이게이션하여, 셔틀 벡터에 인공 VH3.30-DH1.26-JH3 카세트를 생성했다(도 11a).
다음에, 인공적으로 조립된 VH3.30, DH1.26 및 JH3 유전자 세그먼트를 함유하는 전체 "유사-점라인" 카세트를 MigR1 벡터(구성물 MigR1-muH, 도 11b)의 독특한 BglII 및 HpaI 부위에서 클로닝된 인간 μH 사슬(Seq-ID28, 아래 참조)의 코딩 영역을 이미 함유하고 있는 레트로바이러스 벡터 MigR1(Pear et al. 1998)에서 클로닝했다. MigR1-muH의 불변 μH 사슬 코딩 영역으로부터 VH 코딩 영역을 분리하는 독특한 XhoI 부위(Seq-ID28 중앙에서 볼드체 인쇄로 강조)를 사용하여, 불변 코딩 영역을 향한 전이 형태 JH의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않고, VH3.30-DH1.26-JH3 카세트를 불변 μH 사슬 코딩 영역에 인프레임 라이게이션할 수 있었다.
Seq-ID28:
5' AGATCT ACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCGATTTTAGAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCCGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAATGGGTCTCAGCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGATACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCTCGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGT CTCGAG CGCTAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTTGGCTGCCTCGCACAGGACTTCCTTCCCGACTCCATCACTTTCTCCTGGAAATACAAGAACAACTCTGACATCAGCAGCACCCGGGGCTTCCCATCAGTCCTGAGAGGGGGCAAGTACGCAGCCACCTCACAGGTGCTGCTGCCTTCCAAGGACGTCATGCAGGGCACAGACGAACACGTGGTGTGCAAAGTCCAGCACCCCAACGGCAACAAAGAAAAGAACGTGCCTCTTCCAGTGATTGCCGAGCTGCCTCCCAAAGTGAGCGTCTTCGTCCCACCCCGCGACGGCTTCTTCGGCAACCCCCGCAAGTCCAAGCTCATCTGCCAGGCCACGGGTTTCAGTCCCCGGCAGATTCAGGTGTCCTGGCTGCGCGAGGGGAAGCAGGTGGGGTCTGGCGTCACCACGGACCAGGTGCAGGCTGAGGCCAAAGAGTCTGGGCCCACGACCTACAAGGTGACCAGCACACTGACCATCAAAGAGAGCGACTGGCTCAGCCAGAGCATGTTCACCTGCCGCGTGGATCACAGGGGCCTGACCTTCCAGCAGAATGCGTCCTCCATGTGTGTCCCCGATCAAGACACAGCCATCCGGGTCTTCGCCATCCCCCCATCCTTTGCCAGCATCTTCCTCACCAAGTCCACCAAGTTGACCTGCCTGGTCACAGACCTGACCACCTATGACAGCGTGACCATCTCCTGGACCCGCCAGAATGGCGAAGCTGTGAAAACCCACACCAACATCTCCGAGAGCCACCCCAATGCCACTTTCAGCGCCGTGGGTGAGGCCAGCATCTGCGAGGATGACTGGAATTCCGGGGAGAGGTTCACGTGCACCGTGACCCACACAGACCTGCCCTCGCCACTGAAGCAGACCATCTCCCGGCCCAAGGGGGTGGCCCTGCACAGGCCCGATGTCTACTTGCTGCCACCAGCCCGGGAGCAGCTGAACCTGCGGGAGTCGGCCACCATCACGTGCCTGGTGACGGGCTTCTCTCCCGCGGACGTCTTCGTGCAGTGGATGCAGAGGGGGCAGCCCTTGTCCCCGGAGAAGTATGTGACCAGCGCCCCAATGCCTGAGCCCCAGGCCCCAGGCCGGTACTTCGCCCACAGCATCCTGACCGTGTCCGAAGAGGAATGGAACACGGGGGAGACCTACACCTGCGTGGTGGCCCATGAGGCCCTGCCCAACAGGGTCACCGAGAGGACCGTGGACAAGTCCACCGAGGGGGAGGTGAGCGCCGACGAGGAGGGCTTTGAGAACCTGTGGGCCACCGCCTCCACCTTCATCGTCCTCTTCCTCCTGAGCCTCTTCTACAGTACCACCGTCACCTTGTTCAAGGTGAAATGAGCGGCCGCTTTACGC GTTAAC 3'
또한, 삽입부의 5' 및 3' 단부에 각각 존재하는 BglII-HpaI 제한 효소 부위를 볼드체 인쇄와 밑줄로 강조하며, 이것은 MigR1 벡터 백본을 향한 전이를 표시한다 (Pear et al. 1998).
MigR1 레트로바이러스 백본에 함유된 Seq-ID28에서 V-코딩 영역을 VH3.30-DH1.26-JH3 "유사-점라인" 카세트로 치환하기 위해서, 약 1.1kb의 VH3.30-DH1.26-JH3 단편을 각각 BglII함유 포워드 및 XhoI 함유 리버스 프라이머 Seq-ID29 및 Seq-ID30을 사용하여 PCR에 의해 다시 증폭해야 했다(도 11a).
Figure pct00013
결과의 약 1.1kb PCR-단편을 BglII 및 XhoI로 분해하고, MigR1 벡터를 함유하는 BglII-XhoI 선형화된 μH-사슬에 라이게이션하여, V-D-J 재조합 적격 레트로바이러스 발현 벡터 pVDJ-muH-MigR1을 만들었다(도 11b).
b) 전구체 B 세포에서 형질도입시 다종 서열을 생성하는 레트로바이러스 V-D-J 벡터에서 발생하는 충실한 V(D)J 재조합의 증명
개념 증거로서, "유사-점라인" 형태로 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 함유하는 레트로바이러스 벡터에서 적절한 V(D)J 재조합이 발생할 수 있음을 증명하기 위해서, 벡터 pVDJ-muH-MigR1을, 실시예 1b에 설명된 대로, 레트로바이러스 IgL 사슬 발현 벡터와 함께 A-MuLV-형질전환된 preB 셀라인 230-238에 공-형질도입했다. 다만 V(D)J 재조합 사건이 pVDJ-muH-MigR1 구성물에서 발생하는 경우에만, V, D 및 J 유전자 세그먼트의 인프레임 재배열이 일어나서, 이중 형질도입된 세포의 세포 표면에서 전장 인간 IgM 항체가 발현될 수 있다. pVDJ-muH-MigR1 벡터의 형질도입 효능은 IRES-결합된 EGFP 마커 유전자의 공-발현에 의해 모니터될 수 있다. 도 12(a)에서 볼 수 있는 대로, 항-카파 경쇄 항체에 의한 FACS-염색에 의해 측정했을 때, 적어도 pVDJ-muH-MigR1 구성물로 형질도입된 세포에서는 0.04%의 매우 작은 집단이 세포 표면에서 검출가능한 IgM 발현을 나타냈다(형질도입 효능은 44.7%였다). 주목할 만한 것은, pVDJ-muH-MigR1 구성물로 형질도입되지 않은 세포 집단(도 12(a)의 아래 우측 사등분)에서는 IgM 발현 세포가 실질적으로 검출되지 않았다는 점이며, 이는 염색의 특이성을 증명한다.
레트로바이러스 통합체의 특성화를 위해 세포를 확장시키기 위해, 도 12(a)의 위 우측 사등분에서 드물게 검출되는 IgM 발현 세포를 FACS-Aria 고속 세포 정렬기(BD, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 예비 세포 정렬에 의해 정렬하고, 8일간 조직 배양물에서 확장시켰다. 확장 8일 후 EGFP 발현(통합된 pVDJ-muH-MigR1 구성물의 징표)과 표면 IgM에 대한 FACS 프로파일은 세포 표면에 IgM을 나타내고 pVDJ-muH-MigR1 구성물을 함유하는 클론 확장된 세포를 적게라도 나타냈다(녹색 형광에 의해 측정, 도 12(b)). 도 12(b)의 FACS 플롯의 위 우측 영역에 있는 뚜렷한 세포 집단을 정렬하고, 모인 세포 집단으로부터 게놈 DNA를 제조했다.
VH의 상류와 JH 영역의 하류에서 pVDJ-muH-MigR1 구성물에 결합된 프라이머를 사용하여 진단용 PCR에 의해 게놈 DNA를 분석했다. 예상된 대로, 진단용 PCR에 의해 거의 동일한 강도의 2개의 분리된 밴드가 얻어졌으며, 이들은 재배열되지 않은 V, D 및 J 유전자 세그먼트(약 1.2kb 단편)와 더 작은 약 0.5kb 단편을 나타내며, 이것은 V(D)J 재조합 유전자 세그먼트의 징표이다(데이터 도시하지 않음). 더 큰 PCR 밴드를 서열화하여, 이 PCR 앰플리콘이 역시 "유사-점라인" 형태인 재배열되지 않은 V-D-J 카세트를 표시함을 확인했다. 이들 재배열되지 않은 구성물도 IgM 양성 세포에서 검출되었으며, 세포가 하나를 초과하는 구성물로 형질도입된 경우에는, 전부는 아니지만 이들 중에서 V(D)J 재조합이 일어날 수도 있었다. 더 작은 PCR 앰플리콘은 PCR 산물의 서열화시에는 독특한 서열이 얻어지지 않았고, 각 PCR 단편의 서열 분석을 위해 pSC-B PCR 클로닝 벡터에서 서브클로닝해야 했다.
분석된 6개의 플라스미드에서 2개는 동일한 충실한 V(D)J 재조합 서열을 함유했으며, 이들은 전구체 림프구 특이적 효소인 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스페라제(TdT)에 의해 촉매되는 코딩 영역에서 뉴클레오티드 손실 및 주형이 아닌 서열(N-영역)의 부가를 포함하여, V(D)J 재조합에 의한 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 부위 지정 연결의 모든 특징적인 특질을 나타냈다(도 12(b)).
클론 225(도 12b)의 서열을 표시하는 이미 회수된 2개의 서열이 전구체 B 림프구에서 V(D)J 재조합을 일으킬 수 있는 V, D 및 J 유전자 세그먼트 함유 레트로바이러스 발현 벡터의 능력에 대한 명확한 증거이며, 이런 관점에서 볼 때 효능이 겉보기에 낮다 하더라도, 충실한 V(D)J 재조합 사건의 모든 징후를 나타내는 이들 서열이 어떻게 발생될 수 있었는가에 대한 다른 설명은 없는 상황이다. 전구체 림프구에서 레트로바이러스 형질도입과 관련하여 V(D)J 재조합의 효능이 증가하면, "유사-점라인" 형태로 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 함유하는 제한된 수의 레트로바이러스 벡터로부터 항체 서열의 다종 컬렉션이 생성될 수 있다.
실시예 5
레트로사이트 디스플레이를 위한 적합한 선별자 뮤린 B 셀라인의 확인 및 특성화
a) B 셀라인에서 내인성 항체의 발현은 레트로사이트 디스플레이에서 선별자 세포로서 이들의 이용성에 잠재적으로 해로울 수 있는데, 내인성 마우스 면역글로불린 사슬과 재조합 완전 항체 사슬의 쌍이 이들의 세포-표면 디스플레이에 부정적인 영향을 미치거나, 또는 규정할 수 없는 결합 특이성을 가진 혼성된 인간-마우스 면역글로불린의 발현을 가져올 수 있기 때문이다. 따라서, FITC(Southern Biotech)에 연결된 항-뮤린 IgM 중쇄 항체를 사용하여 내인성 IgM 중쇄(μH)의 세포내 발현에 대해서 문헌에 설명된 일단의 Abelson 뮤린 백혈병 바이러스(A-MuLV) 형질전환된 뮤린 preB 셀라인을 시험했다. 이들 세포는 RAG-2 결핍 마우스(Sinkai et al., 1992)로부터의 40E1, 230-238, 204-1-8(Alt et al., 1981), 18-81, 18-81 서브클론 8-11(Rosenberg & Baltimore 1978), 63-12(여기서는 FA-12라고 칭한다) 계통 세포, 및 삼중 대리 경쇄 녹아웃 마우스(Shimizu et al., 2002)로부터의 1624-5, 1624-6 계통 세포를 포함했다. 제조자의 지시에 따라 Fix/Perm-키트(Caltech)를 사용하여 세포를 투과화했다. 도 14에 나타낸 대로, 셀라인 FA-12, 40E1, 및 18-81 서브클론 8-11, 1624-5 및 1624-6은 세포내 IgM 염색에 대해 최소한의 신호를 나타내거나 신호를 전혀 나타내지 않았으며, 따라서 이들은 레트로사이트 디스플레이를 위한 적합한 선별자 세포의 자격을 가진다.
b) 레트로사이트 디스플레이가 레트로바이러스 벡터 매개 유전자 전달에 기초하므로, 녹색 형광 단백질(GFP) 마커 유전자를 함유하는 에코트로픽 MLV-유래 벡터 입자를 사용하여 일단의 뮤린 A-MuLV 형질전환된 preB 셀라인을 레트로바이러스 형질도입 감수성에 대해 더 시험했다(도 13). 제한 희석에 의해 18-81 서브클론 8-11 preB 세포 상에서 미리 적정된 전달 벡터 LEGFP-N1(Clontech)을 포함하는 리포터 유전자 GFP가 패키징된 벡터 제제를 사용하여 1x105 개의 세포를 MOI 0.5로 형질도입했다. 벡터 입자는 아래 설명된 대로 생성했다. 형질도입은 3시간 동안 30℃ 및 3,300rpm에서 1.5ml-에펜드로프 튜브 원심분리를 필수적으로 사용하여, 스핀 감염에 의해 수행했다. 형질도입 2일 후에, FACS 분석에 의해 GFP 발현 세포의 빈도를 결정하여 유전자 전달을 분석했다. 미처리 나이브 표적 세포를 음성 대조군으로 사용했다. 도 13에 도시된 대로, 원래의 18-81 세포만이 MLV 벡터 형질도입에 대해 매우 낮은 허용성을 나타냈다(< 10%). 다른 셀라인은 모두 =40%의 유전자 전달 효율을 나타냈다. FA-12, 40E1 및 1624-5 세포를 사용한 경우 유전자 전달 효율이 최대였고, 본 실험에서는 > 50%에 도달했다는 점이 주목할 만하다.
종합하면, FA12, 40E1 및 1624-5 세포가 두 기준, 즉 a) 낮은 또는 부재하는 내인성 뮤린 면역글로불린 발현, 및 b) 레트로바이러스 형질도입 감수성을 고려할 때 레트로바이러스 디스플레이에 가장 적합하다고 판명되었다. 그러나, 재조합 중쇄와 경쇄로 이루어진 면역글로불린을 발현하는 것이 바람직하기 때문에, B 세포는 야생형 preB 세포에서 재조합 경쇄와 중쇄의 회합과 경합할 수도 있는 대리 경쇄 성분의 발현(λ5, 또는 VpreB1, 또는 VpreB2 유전자로부터 발현될 수 있음)도 역시 결여하는 것이 바람직하다. 따라서, 대리 경쇄 삼중 녹아웃 마우스로부터 유래된 1624-5 세포가 추가의 레트로사이트 디스플레이 기술에 가장 적합한 세포인 것으로 예상된다. 그러나, 본원에서 분석된 추가의 셀라인을 포함하여, 무/저 내인성 면역글로불린 발현 및 레트로바이러스 형질도입능의 기준을 만족하는 어떠한 다른 셀라인도 본원에 개시된 방법을 실현하는데 사용될 수 있다.
실시예 6
완전 인간 항체 라이브러리를 안정하게 클론 발현하는 선별자 세포의 생성
완전 인간 항체 사슬 및 이들의 라이브러리를 암호화하는 전달 벡터가 패키징된 벡터 입자를 생성하고, 계속해서 이들을 뮤린 B 셀라인의 형질도입에 사용하기 위해서, 다음 방법에 따라 감염 실험을 수행했다. 인간 배아 신장 293T-HEK 세포를 트랜스펙션 16~24시간 전에 10cm 조직 배양 접시 당, 10% 태아 소 혈청(FCS) 및 L-글루타민이 보충된 듈베코스 변형 이글 배지(DMEM) 10ml에 2 x 106으로 평판했다. 전달 벡터 IgL(245)-LIB-IRES-YFP 및 IgH(650)-LIB-IRES-GFP(GFP 또는 YFP 발현에 IRES에 의해 연결된 중쇄 또는 경쇄의 라이브러리를 암호화한다, 도 15) 각 5㎍, pVPack-GP(MLV의 gag 및 pol 유전자를 숨긴 발현 구성물) 3㎍ 및 pVPack-Eco(에코트로픽 MLV의 env 유전자를 포함하는 발현 구성물, 모두 STRATAGENE) 2.5㎍의 혼합물을 제조하고, 1ml 혈청-프리 DMEM에서 Fugene(Roche) 30㎕와 함께 인큐베이션한 다음, 실온에서 15~30분간 그대로 두었다. 다음에, Fugene/DNA 혼합물을 10cm 접시에 파종된 293T-HEK 세포에 조심스럽게 첨가했다. 중쇄 및 경쇄 암호화 전달 벡터를 각각의 일시적 패키징 세포에 트랜스펙션했다.
트랜스펙션 48시간 후, 벡터 입자 함유 상청액을 일시적 패키징 세포로부터 수거해서 3,000rpm에서 원심분리하여 오염원 세포를 제거했다. 1.5x106 개의 1624-5 뮤린 B 세포를 항체의 중쇄 또는 경쇄 암호화 영역이 패키징된 벡터 입자(희석 비율 1:1; 1:5; 1:20; 1:50; 1:100; 1:200)가 상이한 양으로 보충된 배지 1ml에 현탁했다. 3시간 동안 30℃ 및 3,300rpm에서 1.5ml 에펜드로프 컵에서 원심분리하여 형질도입을 수행했다. 사용하지 않은 상청액은 나중에 이용하기 위해 -80℃에 보관했다. 전달 벡터의 단일 카피가 숙주 세포 게놈에 통합되었음을 확인하기 위해서, 감염 4일 후에 10% 미만의 유전자 전달 효율을 나타낸 세포(GFP 또는 YFP의 발현에 의해 검출됨)를 FACS를 사용하여 부화시켰다(도 16). 이 세포를 6일간 확장시키고, 상기 설명된 대로 1:5의 희석 비율로, 항체의 경쇄 코딩 영역이 패키징된 냉동시켜 두었던 벡터 입자를 사용하여 2차 형질도입 과정을 수행했다. 여기서, 중쇄 발현에 대해 선별된 GFP-양성 세포를 경쇄-IRES-YFP 라이브러리를 형질도입한 벡터 입자로 감염시켰고, 반대로도 수행하였다(도 15 및 16). 감염 4일 후에, GFP 및 YFP를 발현하는 성공적으로 형질도입된 세포를 FACS를 사용하여 부화시켰다. 세포의 약 20%가 2차 형질도입 후에 GFP 및 YFP 발현을 나타냈다. 세포당 단지 단일 벡터 통합만이 일어났음을 확인하기 위해서, 2차 회전에서 형질도입된 리포터 유전자의 발현이 낮거나 중간 정도였던 집단의 약 1/3을 부화시켰다(약 8%, 도 16 참조).
실시예 7
레트로사이트 디스플레이에 의한 항원-반응성 인간 항체 발현 세포의 검출 및 부화
a) 레트로사이트 디스플레이의 개념 증거 실험을 위한 준비로서, 먼저 선별자 세포에서 레트로바이러스 발현된 IL-15 결합 항체에 대한 최적 염색 및 검출 조건을 결정했다. 인간 IgH 및 IgL 사슬 라이브러리를 공-발현하는 1624-5 A-MuLV 형질전환된 preB 세포를 세포 표면에서 인간 항-IL-15 항체를 암호화하는 레트로바이러스 발현 벡터를 발현하는 1624-5 A-MuLV 형질전환된 preB 세포와 2:1의 비율로 혼합했다. 혼합된 세포 샘플을, 나타낸 대로 다양한 농도의 재조합 인간 IL-15(0.1 내지 2.5㎍/ml), 및 다양한 농도의 바이오틴화된 폴리클로날 항-hu-IL-15 항체(1.0 및 3.0㎍/ml)와 함께 인큐베이션했으며, 이것은 궁극적으로 스트렙토아비딘-피코에리트린(스트렙토아비딘-PE)과 함께 나타내었다. 비면역글로불린 발현 세포로부터 항체를 나타내는 세포를 구별하기 위해서, 샘플을 항-hu-IgκL-APC 항체로 추가로 대조염색했다. 도 17의 2개의 위 우측 FACS 패널에서 볼 수 있는 대로, IL-15 반응성 세포는 1차 시약으로서 0.1 및 0.5㎍/ml의 재조합 IL-15와 2차 염색 시약으로서 3.0㎍/ml의 바이오틴화된 항-hu-IL-15 항체의 조합을 사용하여 가장 효과적으로 검출되었다(20.1 및 20.4%).
b) 계속해서 개념 증거 실험을 수행했으며, 여기서는 인간 IL-15에 특이적인 기준 항체를 인간 항체의 다종 라이브러리를 발현하는 세포 풀에 스파이크했고, 스파이크된 항원-반응성 세포를 FACS에 의해 분석했다. 이 실험의 준비시, 1624-5 세포에서 레트로바이러스 발현된 항체의 라이브러리(실시예 6 참조)를, 인간 IL-15 항원에 특이적인 기준 항체를 발현하는 1624-5 셀라인(PC)과 나란히, 표면 Ig 발현 및 IL-15 결합에 대해 염색했다(NC). 이들 NC 및 PC 셀라인에 대한 FACS 분석을 도 18에 나타내는데, 이것은 항-IL-15 기준 항체의 특이적 IL-15 염색이 PC 세포의 표면에서 나타났음을 입증한다. 기준 항-IL-15 Ab 발현 셀라인이 FACS에 의해 정량적으로 검출될 수 있는지 분석하기 위해서, PC 세포가 인간 항체의 무작위 컬렉션을 발현하는 NC 셀라인에 스파이크된 경우, NC 라이브러리 중에 상이한 희석 비율로 존재하는 PC 세포를 상기 결정된 최적화된 IL-15 염색 조건을 사용하여 특이적 IL-15 결합에 대해서 FACS에 의해 분석했다. 음성 대조군 세포의 FACS 분석에서는 아주 작은 집단만이 IL-15 결합 활성을 나타내는 것으로 드러났다. 반면에, 양성 대조군 집단에서는 60% 초과가 IL-15에 결합하는 것으로 나타났다. 10, 12.5, 25, 37.5, 및 50%의 비율로 상기 두 집단을 혼합하자, 항체 라이브러리 세포 풀에 혼합된 양성 대조군 세포의 퍼센트와 IL-15에 결합하는 것으로 나타난 세포 분획 사이에 상호작용이 관찰되었다. 따라서, IL-15 반응성 세포가 다른 비-특이적 항체 발현 세포와의 혼합물 중에서도 FACS 염색에 의해 정량적으로 검출될 수 있다는 결론이 내려진다.
c) 계속해서 개념 증거 실험을 수행했으며, 여기서는 드문 IL-15 반응성 세포를 레트로사이트 디스플레이에 의해 부화시켰다. 이를 위하여, 1624-5 preB 세포에서 발현되는 인간 항체의 고도 다종 컬렉션을 IL-15 IgH 사슬(GFP에 연결)의 레트로바이러스 형질도입과 인간 IgκL 사슬(YFP에 연결)의 복잡한 컬렉션(복잡도 약 7x104)의 공-형질도입에 의해 생성했다. 따라서, 인간 항-IL-15 특이적 항체로부터의 단일 IgH 사슬에 대한 인간 IgκL 사슬의 다종 컬렉션의 셔플링에 의해 레트로사이트 디스플레이 항체 라이브러리가 얻어졌다. 세포를 앞서 결정된 최적 조건을 사용하여 IL-15 반응성에 대해 염색했다. IL-15 반응성 세포를 고속 FACS 세포 정렬의 연속 3회전 수행하여 부화시킨 다음, 세포 배양 확장을 수행했다. 3회전의 레트로사이트 디스플레이 부화 후, 인간 항체를 발현하는 세포 집단이 얻어질 수 있었으며, 이것은 IL-15 반응성 세포가 거의 검출되지 않았던 초기 세포 집단으로부터의 항원-IL-15에 대해 필히 정량적으로 염색되었다(도 19). 이 실험은 반복된 레트로사이트 디스플레이 부화가 IL-15 결합 세포를 부화시키는데 효과적으로 사용될 수 있었음을 증명했다.
d) 3x IL-15 부화된 셀 풀로부터 확립된 각 세포 클론의 IL-15 결합 특이성의 확인(이전 실시예 참조). 계속해서 IL-15-특이적 레트로사이트 디스플레이 부화가 3회 수행된 세포 풀로부터, 25개의 개별 세포 클론이 단일 세포 정렬에 의해 확립되었다. 이들 25개의 세포 클론을, 앞서 최적화된 염색 조건(실시예 7a 참조)을 사용하여 IL-15 염색에 의해서 IL-15 특이성에 대해 특성화했다. IL-15 염색의 특이성에 대한 대조군으로서, 모든 클론을 또 IL-15 항원을 제외한 모든 염색 시약과 함께 인큐베이션했다. 25개의 단일 세포 클론은 대부분 매우 특이적인 IL-15 염색 패턴을 나타냈으며, 이것은 IL-15 항원이 염색 반응에서 제외되었을 때는 소실되었다. 대표적인 IL-15 특이적 염색을 도 19에 나타내며, 여기서 4개의 개별 세포 클론이 선별된다. 이들 클론의 염색이 3x IL-15 항원 부화된 세포 집단으로부터 확립된 전체 25개의 세포 클론(알파벳 순서로 A-Y라고 칭함)을 대표하며, 이들이 모두 시험되었고, IL-15 항원 결합에 대해 양성이었다. 나타낸 대로, 염색 특이성에 대한 음성 및 양성 대조군은 도 19에 제공된다.
실시예 8
사슬 셔플링 또는 인도된 진화 접근법: 고속 세포 정렬에 의한 항원 특이적 인간 항체 발현 세포의 검출 및 반복적 부화, 항원 선별된 세포로부터 가변 영역 코딩 영역의 클로닝 및 항원-특이성의 확인
상기 설명된 대로(실시예 6), 표적 항원 인간 IL-1β에 대해 발생된 기준 항체 SK48-E26(Young et al., WO 95/07997 A1)의 중쇄와 조합하여 약 1.2 x 105의 복잡도로 인간 IgκL 사슬의 라이브러리를 발현하는 세포 라이브러리를 생성했다. 이들 사슬을 숨기고 있는 레트로바이러스 벡터 백본이 도 4c 및 11에 더 상세히 묘사된다(실시예 4 참조). 이를 위해 3 x 106 개의 1624-5 A-MuLV 형질전환된 1624-5 preB 세포를 0.1 미만의 MOI로 SK48-E26 IgH 사슬 암호화 전달 벡터를 숨기고 있는 입자로 형질도입했다. 형질도입 1일 후, GFP-양성 세포를 BD의 FACSAria를 사용하여 표준 고속 세포 정렬에 의해 부화시켰다. 정렬된 세포를 5일간 가습 인큐베이터에서 조직 배양물 중에서 확장시켰다. 확장 후, 세포 집단을 상기 설명된 대로(실시예 5) 표준 스핀 감염에 의해 1.5의 MOI로 IgκL 사슬 라이브러리가 패키징된 입자로 형질도입하고, 조직 배양물 중에서 2일 동안 형질도입 후 세포를 회수했다. 2일간의 회수 및 확장 기간 후, GFP와 YFP를 공-발현하며, 따라서 적어도 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 구성물이 숨겨진 5 x 105 개 세포를 BD의 FACSAria를 사용하여 예비 세포 정렬에 의해 부화시켰다. IgH와 IgL 사슬 구성물의 공-발현에 대해 부화된 세포 집단을 조직 배양물에서 다시 4일간 확장시켰다. 이 최종 확장 후, IgH/IgL-사슬 라이브러리를 발현하는 2 x 106 세포의 알리쿼트를 얼음 위에서 30분간 재조합 인간 IL-1β(R&D Systems)를 사용하여 100㎕ 부피 중에서 2㎍/ml로 염색한 후, 1% 태아 소 혈청(FCS)으로 보충된 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 2번 세척했다. IL-1β에 대해 발생되고 바이오틴에 콘쥬게이트된 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 다시 2번 세척하고, 계속해서 스트렙토아비딘-APC로 염색한 다음, 유세포분석에 의해 항원-결합 세포와 이들의 이어진 부화를 검출했다. FACS에 의한 최초의 세포 정렬 후 세포를 5일간 확장시키고, 상기 설명된 대로 항-IL-1β 염색과 양성 염색된 세포의 부화에 대해 다시 한번 FACS를 수행했다. 이 선별 과정을 3회 반복했다(도 21). 3회의 레트로사이트 디스플레이 부화 후 얻어진 세포 집단을 상기 설명된 대로 IL-1β 결합에 대해 다시 염색했지만, 이번에는 반응성 세포들이 앞서와 같이 벌크 집단으로 부화되지 않았으며, 개별 세포 클론을 BD의 FACSAria를 사용하여 단일 세포 정렬에 의해 96웰 플레이트에서 정렬시켰다. 배양 및 확장 7일 후에, 각 세포 클론을 설명된 프로토콜을 사용하여 IL-1β 항원-특이성에 대해 다시 분석했고, 이에 더하여 항원 IL-1β를 제외하고 모든 2차 시약을 사용한 것을 음성 대조군으로 하였다. 예상되고 또 유세포분석에 의해 입증된 대로, 일부 클론은 항원의 존재 하에 특이적 FACS 신호에 의해 드러난 것처럼 표적 항원과의 특이적 결합을 나타냈지만, 항원이 부재할 때는 그렇지 않았다(2차 검출 시약 중 어느 것과 클론의 바탕 결합은 배제). 그러나, 일부 클론은 항원의 존재와 무관하게 염색 신호를 나타냈으며, 이는 이들 클론이 IL-1β 반응성의 검출에 사용된 2차 시약 중 어느 것과 비특이적으로 결합했다는 것을 시사한다. 종합하면, 24개 세포 클론의 게놈 DNA를 분리하여, 레트로바이러스 경쇄 라이브러리에서 각각 암호화된 인간 경쇄의 가변 영역의 상류 및 하류에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 Seq-ID31 및 Seq-ID32를 사용하는 표준 게놈 PCR의 주형으로 사용하였다.
Figure pct00014
각 분석된 세포 클론으로부터 예상된 크기의 PCR 앰플리콘이 얻어졌으며, 이 PCR 앰플리콘에 직접 DNA 서열 분석을 수행했다. 분석된 24개의 클론 중 12개가 새로운 IgκL 사슬을 동일하게 숨기고 있는 것으로 나타났으며, 이 사슬을 LCB24라고 칭했고, 별도로 측정했을 때 예상된 대로 SK48-E26의 IgH 사슬도 숨기고 있었다.
예상된 대로, SK48-E26 IgH 사슬과 조합하여 LCB24 IgL 사슬을 발현하는 12개 클론은 전부 상기 언급된 대로 유세포분석을 사용했을 때 특이적 IL-1β 신호를 나타냈다.
증폭된 새로운 LCB24 IgκL 사슬을 함유하는 선별된 PCR 앰플리콘을 가변 코딩 영역의 측면에 위치된 제한 효소 HindIII 및 Eco47III으로 분해했고(도 4c), 단편들을 양립성 제한 효소 부위를 가진 레트로바이러스 IgκL 사슬 발현 벡터에서 클로닝하여, LCB24 VL 코딩 영역과 불변 인간 카파 경쇄 코딩 영역의 인프레임 융합을 허용했다. 따라서, 결과의 벡터는 신규의 완전 인간 IgκL 사슬을 암호화했다.
LCB24 Ig/L 사슬에 대한 재클로닝되고 서열 검증된 레트로바이러스 발현 벡터를 IL-1β 기준 항체 SK48-E26의 SK48E26 IgH 사슬과 함께 1624-5 세포에 형질도입했다. 조직 배양물에서 2일간 확장 후, GFP+/YFP+ 세포를 BD의 FACSAria를 사용하여 고속 세포 정렬에 의해 부화시켰다. 먼저 결과의 Ig 발현 세포를 설명된 대로 IL-1β와 결합하는 능력에 대해서 시험했다. 예상된 대로, SK48-E26의 중쇄와 함께 LCB24의 디스플레이에 의해 매개된 이들의 반응성이 확인되었다(도 22). 새로운 항체가 다른 항원이나 단백질과 일반적으로 교차-반응했다는 것을 배재하기 위해서, LCB24 IgL/SK48-E26 IgH 조합을 발현하는 세포를 앞서 설명된 대로 IL-15 반응성에 대해 분석했다. 도 23에 나타낸 대로, 신규 IgL LCB24/HC SK48-E26 항체에서 IL-15에 대한 반응성이 검출되지 않았으며, 이는 이 신규 항체의 표적 항원-특이성을 시사한다. 추가의 대조군은 항-IL-15 특이적 기준 항체(양성 대조군)를 발현하는 셀라인 및 원 SK48-E26 IL-1β 항체를 포함했다. 항-IL-15 항체 발현 세포는 예상된 대로 IL-15에 대한 특이적 염색을 나타냈지만, SK48-E26 IL-1β 항체 또는 세포에서는 반응성이 검출되지 않았다(도 23).
요약하면, 항원-특이적 반응성을 매개하는 신규 경쇄가 IL-1β 특이적 기준 항체 SK48-E26의 중쇄에 대해 셔플링된 경쇄 라이브러리를 이용한 스크리닝 실험에서 확인되었다.
실시예 9
셔플링된 IgH 및 IgL 사슬 라이브러리에 대한 레트로사이트 디스플레이 스크리닝: 고속 세포 정렬에 의한 항원 특이적 인간 항체 발현 세포의 검출 및 반복적 부화, 항원 선별된 세포로부터 가변 영역 코딩 영역의 클로닝 및 항원-특이성의 확인
상기 설명된 대로(실시예 6), 약 0.1의 MOI를 사용하여 약 6.5 x 105의 복잡도로 중쇄 라이브러리(GFP에 연결)를 발현하는 세포 라이브러리를 생성했다. 이들 사슬을 숨기고 있는 레트로바이러스 벡터 백본이 도 4c 및 11에 더 상세히 묘사된다(실시예 4 참조). 이를 위해 3 x 106 개의 1624-5 A-MuLV 형질전환된 1624-5 preB 세포를 0.1 미만의 MOI로 상기 언급된 IgH 사슬-라이브러리 암호화 전달 벡터를 숨기고 있는 입자로 형질도입했다. 형질도입 2일 후, GFP-양성 세포를 BD의 FACSAria를 사용하여 표준 고속 세포 정렬에 의해 부화시켰다. GFP+ 세포의 정렬 후, 세포를 조직 배양물에서 2일간 더 확장시켰다. 확장 후, GFP+ 세포 집단에 245개의 완전 서열 특성화된 경쇄로 구성된 경쇄 라이브러리가 패키징된 입자를 상기 설명된 대로 >1의 MOI로 형질도입했다. 형질도입 2일 후, GFP+/YFP+ 이중 형질도입된 세포를 고속 세포 정렬에 의해 부화시키고, 대부분의 세포에 IgH와 IgL 사슬 라이브러리가 둘 다 숨겨진 세포 집단을 조직 배양물에서 3일간 다시 확장시켰다. 이후, 2.5 x 105 세포의 알리쿼트를 상기 설명된 대로(실시예 8 참조) 특히 SAV(스트렙토아비딘)-APC-Cy7을 포함하는 항원 칵테일로 염색하고, 유세포분석을 이용하여 표적 항원의 반응성에 대해 부화시켰다. 병행하여, 항체 IgH/IgL 라이브러리를 발현하는 세포 집단을 항-IgL 카파 특이적 항체를 사용하여 염색했다. 이들 세포의 약 75%가 세포 표면에 인간 항체를 나타내는 것으로 판명되었다(데이터 도시하지 않음). 항원-반응성 세포를 BD의 FACSAria를 사용하여 고속 세포 정렬에 의해 정렬하고, 부화된 세포를 조직 배양물에서 7일간 확장시켰다. 상기 설명된 것과 동일한 염색 및 세포 부화 과정을 2회 더 반복했다. 3회의 레트로사이트 디스플레이 선별 후, 결과의 세포 집단을 다시 염색하여 표적 항원 SAV-APC-Cy7의 결합을 평가하고, 유세포분석을 사용하여 분석했다. 도 24에 나타낸 대로, 얻어진 벌크 집단은 SAV-APC-Cy7에 결합하는 것으로 나타났으며, 이는 SAV-APC-Cy7에 대한 항원-특이성을 가진 항체의 성공적인 선별을 시사한다. 표적 항원 SAV-APC-Cy7에 대한 반응성의 특이성을 평가하기 위해, 3회 부화된 라이브러리 발현 세포를 항원 SAV-APC 및 SAV-PerCP-Cy5.5로 다시 염색했다(도 25). 음성 대조군으로 사용된 형질도입되지 않은 세포 및 선별되지 않은 라이브러리 발현 세포와 유사하게, 3회 SAV-APC-Cy7 부화된 세포는 이들 항원과 결합하지 않았다. 그러나, 나중에 세포는 SAV-APC-Cy7에 대한 강한 반응성을 다시 드러냈는데, 이는 선별된 세포 집단의 항원-특이성이 SAV-APC-Cy7 탠덤 염료의 Cy7 형광에 대해 발생되었음을 시사한다.
3회 부화된 세포 집단의 게놈 DNA를 분리하여, 레트로바이러스 라이브러리에서 암호화된 인간 경쇄 및 중쇄의 코딩 영역의 상류 및 하류에서 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 Seq-ID31(상기 참조) 및 Seq-ID33을 사용하는 표준 게놈 PCR의 주형으로 사용했다.
Figure pct00015
예상된 크기의 중쇄 및 경쇄에 대한 PCR 앰플리콘이 얻어졌고, 이들을 표준 PCR 단편 클로닝 벡터 pSC-B(Stratagene)에서 제조자에 의해 권장된 대로 개별적으로 서브클로닝했다. IgH PCR 단편 서브클로닝 및 IgL PCR 단편 서브클로닝의 결과로서 클로닝된 중쇄 및 경쇄 영역을 숨기고 있는 pSC-B 플라스미드 클론이 10개의 박테리아 클론으로부터 분리되었고, 이것을 모두 DNA 서열 분석했다. DNA 서열화에 의해 2개의 상이한 IgH 사슬 서열(HC49, HC58이라고 칭함)과 2개의 상이한 IgL 사슬 서열(LC4 및 LC10이라고 칭함)이 드러났다.
VH 및 VL 코딩 영역을 함유하는 DNA 단편을 HindIII 및 Eco47III 분해에 의해서 서열 검증된 클론으로부터 분리했고, 이들 제한 효소 부위는 HC49, HC58, LC4 및 LC10의 각 VH 및 VL 영역의 가변 영역 측면에 위치한다(도 4c 참조). 상기 설명된 대로, HC49, HC58, LC4 및 LC10의 분리된 VH 및 VL 영역을 인간 Igγ1H 사슬(GFP에 연결된 IRES를 발현) 및 인간 IgκL 사슬(YFP에 연결된 IRES를 발현)의 불변 영역을 숨기고 있는 레트로바이러스 수여자 벡터에서 각각 클로닝했다. 따라서, 신규 HC49 및 HC58 IgH 사슬, LC4 및 LC10 IgL 사슬에 대한 완전 인간 IgH 및 IgL 사슬을 암호화하는 레트로바이러스 발현 벡터 구성물이 생성되었다. 이들 벡터를 1624-5 preB 세포에 공-형질도입하고 8일간 확장시킨 경우, 앞서와 마찬가지로 유세포분석에 의해 GFP+/YFP+ 세포가 부화되었다. 결과의 세포를 설명된 대로 SAV-APC-Cy7과 결합하는 능력에 대해 먼저 시험했다. 도 26에 나타낸 대로, 항체 HC49/LC4 및 HC/LC10을 발현하는 세포의 반응성은 SAV-APC-Cy7에 대한 유의한 결합 활성을 나타내지 않았다. 이와 반대로, 항체 HC58/LC4 및 HC58/LC10에 의해서 매개된 반응성은 쉽게 검출되었다. 이것은, 기지의 항원-특이성을 가진 기준 항체에서 유래하는 기지의 IgH 또는 IgL 사슬의 필요 없이, 다종 컬렉션의 IgH 사슬과 IgL 사슬의 셔플링에 기반한 레트로사이트 디스플레이에 의한 새로운 항원-특이적 항체의 성공적인 확인에 대한 개념 증거를 제공한다.
참고문헌
·Alt F, Rosenberg N, Lewis S, Thomas E, Baltimore D (1981) "Organization and reorganization of immunoglobulin genes in A-MULV-transformed cells: rearrangement of heavy but not light chain genes" Cell 27, 381-390.
·Bachl J and Olsson C (1999) "Hypermutation targets a green fluorescent protein-encoding transgene in the presence of immunoglobulin enhancers" Eur J. Immunol. 29, 1383-1389.
·Baker M (2005) "Upping the ante on antibodies" Nature Biotechnology 23, 1065-1072.
·Boder ET, Midelfort KS, Wittrup KD (2000) "Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar anigen-binding affinity" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 10701-5.
·Clackson T, Hoogenboom H, Griffiths AD, Winter G (1991) "Making antibody fragments using phage display libraries" Nature 352, 624-628.
·Clark M (2000) "Antibody humanization: A case of the 'Emperor' new clothes' ?" Immunol. Today 21, 397-402.
·Dunn IS (1995) "Assembly of functional bacteriophage lambda virions incorporating C-terminal peptide or protein fusions with the major tail protein" J. Mol. Biol. 248, 497-506.
·Efimov VP, Nepluev IV, Mesyanzhinov VV (1995) "Bacteriophage T4 as a surface display vector" Virus Genes 10, 173-7.
·Gossen M and Bujard H (1992) "Tight control of gene expression in vertebrate cells by tetracycline-responsive promoters" Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 5547-5551.
·Grawunder U, West RB, Lieber MR (1998) "Antigen receptor gene rearrangement" Curr. Opin. Immunol. 10: 172-180.
·Green LL and Jakobovits A (1998) "Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes" J. Exp. Med. 188, 483-495.
·Hanes J and Pluekthun A (1997) "In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4937-4942.
·Hanes J, Schaffitzel C, Knappik A & Pluckthun A (2000) "Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library selected and evolved by ribosome display" Nature Biotech. 18, 1287-1292.
·Hoogenboom HR and Chames P (2000) "Natural and designer binding sites made by phage display technology" Immunol. Today 21, 371-378.
·Kitamura T, Onishi T, Kinoshita S, Shibuya A, Miyajima A, Nolan GP (1995) "Efficient screening of retroviral cDNA expression libraries" Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 9146-9150.
·Koeler G and Milstein C (1975) "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity" Nature 256, 495-497.
·Li YS, Hayakawa K, Hardy RR (1993) "The regulated expression of B lineage associated genes during B cell differentiation in bone marrow and fetal liver" J. Exp. Med. 178, 951-960.
·Li M (2000) "Applications of display technology in protein analysis" Nature Biotechnology 18, 1251-6.
·Lipovsek D & Pluckthun A (2004) "In - vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display" J. Immunol. Methods 290, 51-67.
·Maruyama IN, Maruyama HI, Brenner S (1994) "Lambda foo: a lambda phage vector for the expression of foreign proteins" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8273-7.
·Papavasiliou FN and Schatz DG (2002) "Somatic hypermutation of immunoglobulin genes: merging mechanisms for genetic diversity" Cell 109, Suppl: S35-S44.
·Pear WS, Miller JP, Xu L, Pui JC, Soffer B, Quackenbush RC, Pendergast AM, Bronson R, Aster JC, Scott ML, Baltimore D (1998) "Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow" Blood 92, 3780-92.
·Ren ZJ, Lewis GK, Wingfield PT, Locke EG, Steven AC, Black LW (1996) "Phage display of intact domains at high copy number: a system based on SOC, the small outer capsid protein of bacteriophage T4" Protein Sci. 5, 1833-43.
·Rosenberg N and Baltimore D (1978) "The effect of helper virus on Abelson virus-induced transformation of lymphoid cells" J. Exp. Med. 147, 1126-1141.
·Rosenberg A (1996) "T select phage display system: a powerful new protein display system based on the bacteriophage T7" Innovations 6, 1-6.
·Santini C, Brennan D, Mennuni C, Hoess RH, Nicosia A, Cortese R, Luzzago A (1998) "Efficient display of an HCV cDNA expression library as C-terminal fusion to the capsid protein D of bacteriophage lambda" J. Mol. Biol. 282, 125-35.
·Shimizu T, Mundt C, Licence S, Melchers F, Matensson IL (2002) "VpreB1/VpreB2/lambda 5 triple-deficient mice show impaired B cell development but functional allelic exclusion of the IgH locus" J. Immunol. 168, 6286-6293.
·Shinkai Y, Rathbun G, Lam KP, Oltz EM, Stewart V, Mendelsohn M, Charron J, Datta M, Young F, Stall AM, et al. (1992)"RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement" Cell 68, 855-867.
·Smith GP (1985) "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the viron surface" Science 228, 1315-17.
·Sternberg N & Hoess RH (1995) "Display of peptides and proteins on the surface of bacteriophage lambda" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(5), 1609-13.
·Stitz J, Krutzik PO, Nolan GP (2005) "Screening of retroviral cDNA libraries for factors involved in protein phosphorylation in signaling cascades" Nucleic Acids Res. 33, e39.
·Traggiai E, Chicha L, Mazzucchelli L, Bronz L, Piffaretti JC, Lanzavecchia A, Manz MG (2004) "Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice" Science 304, 104-107.
·EP 1 041 143 A: Jensen MR, Pedersen FS, Mouritzen S, Hindersson P, Duch M, Soerensen MS, Dalum I, Lund AH "A method for identification of biologically active peptides and nucleic acids"
·WO 89/12823 A1: Mosier DE and Wilson DB "Human immune system in non-human animal"
·WO 90/13660 A2: Lang AB, Larrick JW, Cryz SJ "Human monoclonal antibodies to sero-specific determinants of gram-negative bacteria"
·WO 92/01047 A1: McCafferty J, Pope AR, Johnson KS, Hoogenboom HRJM, Griffiths AD, Jackson RH, Holliger, KP, Marks JD, Clackson TP, Chiswell DJ, Winter GP, Bonnert TP "Methods for producing members of specific binding pairs"
·WO 92/02551 A1: Schrader JW "Methods for the production of proteins with a desired function"
·WO 95/01997 A1: Young PR, Gross MS, Jonak ZL, Theisen TW, Hurle MR, Jackson JR "Recombinant and humanized IL-1beta antibodies for treatment of IL-1 mediated inflammatory disorders in man"
·WO 98/24893 A2: Jakobovits A, Kucherlapati R, Klapholz S, Mendez M, Green L "Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vk regions and antibodies produced therefrom"
·WO 02/066630 A1: Murphy AJ and Yancopoulos GD "ethods of modifying eukaryotic cells"
·WO 02/102855 A2: Zauderer M and Smith ES "In vitro methods for producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells"
·WO 03/017935 A2: van der Winkel JGJ, van Dijk MA, Schuurman J, Gerritsen AF, Baadsgaard O "Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)"
·WO 03/054197 A2: Perabo L, Buueing H, Enssle J, Reid M, Hallek M "A library of modified structural genes or capsid modified particles useful for the identification of viral clones with desired cell tropism"
·WO 03/068819 A1: Grawunder U and Melchers GF "Method for the generation of genetically modified vertebrate precursor lymphocytes and use thereof for the production of heterologous binding proteins"
·WO 03/083075 A2: Bremel RD, Bleck GT, Imboden M, Eakle K "Retrovirus-based genomic screening"
·WO 04/051266 A1: Muraguchi A, Kishi H, Tamiya E, Suzuki M "Microwell array chip for detecting antigen-specific lymphocyte, method of detecting antigen-specific lymphocyte and method of cloning antigen-specific lymphocyte antigen receptor gene"
·WO 04/076677 A2: Lanzavecchia A "Monoclonal antibody production by EBV transformation of B cells"
·WO 04/106377 A1: Lawson ADG and Lightwood DJ "Methods for producing antibodies"
·WO 08/055795 A1: Beerli R, Bachmann M, Bauer M "Selection of human monoclonal antibodies by mammalian cell display"
SEQUENCE LISTING <110> 4-Antibody AG <120> Isolation and Identification of Antigen- or Ligand-Specific Binding Proteins <130> 2134 WO <140> <141> <150> EP 08004096.7 <151> 2008-03-05 <150> US 61/125,886 <151> 2008-04-29 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gatcaagctt agcgcttcca ccaagggccc atcggtcttc cc 42 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gatcatcgat gcggccgctc atttacccgg agacagggag agg 43 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gatcatcgat gcggccgcta ggccccctgc ctgatcatgt tc 42 <210> 4 <211> 443 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> VH coding region for NIP-Ovalbumin specific human antibody <400> 4 aagcttccat ggagtttggg ctcagctggg ttttccttgt tgctctttta agaggtgtcc 60 agtgtcaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcgtggt ccagcctggg aggtccctga 120 gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagtagcta tgctatgcac tgggtccgcc 180 aggctccagg 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Claims (21)

  1. (a) 척추동물 숙주 세포에 항체 또는 그 단편을 암호화하는 1 이상의 레트로바이러스 발현 구성물을 형질도입하는 단계;
    (b) 상기 척추동물 숙주 세포에서 상기 항체 또는 그 단편을 발현하는 단계;
    (c) 원하는 항원 또는 리간드에 결합하는 능력에 기초하여, 상기 항체 또는 그 단편을 발현하는 척추동물 숙주 세포를 부화(富化)하는 단계; 및
    (d) 레트로바이러스 형질도입되고 부화된 척추동물 숙주 세포로부터 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 1 이상의 뉴클레오티드 서열을 분리 및 확인하는 단계
    를 포함하는, 원하는 항원 또는 리간드에 특이적인 항체 또는 그 단편을 암호화하는 1 이상의 뉴클레오티드 서열을 분리 및 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (d) 전에 상기 부화된 척추동물 숙주 세포를 조직 배양물에서 확장하는(expanding) 단계가 선행되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (c) 다음에 상기 부화된 척추동물 숙주 세포를 조직 배양물에서 확장하는 단계가 후속되고, 이후 제1항에 정의된 단계 (c)를 1회 이상 반복하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 형질도입은 0.1 이하의 감염 다중도로 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 전장 항체인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 단편이 중쇄, 경쇄, 단일 VH 도메인, 단일 VL 도메인, scFv 단편, Fab 단편, 및 F(ab')2 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 척추동물 숙주 세포가 연골어류, 경골어류, 양서류, 파충류, 조류, 돼지, 양, 소, 말을 포함하는 포유류 및 마우스, 래트, 토끼 및 기니아피그를 포함하는 설치류로 구성되는 종들의 군으로부터 유래하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 척추동물 숙주 세포가 마우스로부터 유래되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 척추동물 숙주 세포가 림프구인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 림프구가 전구체 B 림프구인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 림프구가 내인성 항체 폴리펩티드 및/또는 1 이상의 대리(surrogate) 경쇄 성분을 발현할 수 없는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 척추동물 숙주 세포가 내인성 Igα 및 Igβ 분자 또는 이소 발현되는(ectopically expressed) Igα 및 Igβ 분자를 발현하는 것인 방법.
  13. 제5항에 있어서, 전장 항체가 완전 인간 항체, 인간화된 항체 및 키메라 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 뉴클레오티드 서열이 (i) 하나의 항체 중쇄 서열과 다수의 항체 경쇄 서열, 또는 (ii) 하나의 항체 경쇄 서열과 다수의 항체 중쇄 서열을 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는, 레트로바이러스 형질도입시 가변 결합 도메인에 대한 코딩 서열이 생성되도록 V(D)J 재조합을 가능하게 하는 상기 1 이상의 레트로바이러스 발현 구성물에 의해 암호화되는 가변 결합 도메인을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 돌연변이화 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 1 이상의 레트로바이러스 발현 구성물은 이 발현 구성물에 의해 암호화되는 가변 결합 도메인이 AID 매개 체세포 돌연변이의 표적이 될 수 있도록 시스-조절성 프로모터와 인핸서 요소의 조합을 함유하고, 여기서 프로모터 및 인핸서 요소는
    (a) 면역글로불린 중쇄 프로모터, 인트론 인핸서(EμH) 및 3'α 인핸서 요소,
    (b) 면역글로불린 κ 경쇄 프로모터, κ 인트론 인핸서(κiE) 및 3'κ 인핸서(3'κE) 요소,
    (c) 면역글로불린 λ 경쇄 프로모터, λ2-4 및 λ3-1 인핸서 요소, 및
    (d) 이들의 임의의 조합
    으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 형질도입된 척추동물 숙주 세포에서 상기 항체 또는 그 단편의 발현은
    (a) 1 이상의 항생제 선별 마커,
    (b) 1 이상의 스크리닝 마커, 및/또는
    (c) 이들의 조합
    에 작동가능하게 연결되고, 여기서 상기 항체 또는 그 단편의 발현은 1 이상의 내부 리보솜 진입 서열(IRES) 사용으로 커플링되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 1 이상의 스크리닝 마커는
    (i) 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)로 구성되는 군으로부터 선택된 형광 단백질; 또는
    (ii) CD7, CD34 및 저 친화성 신경성장인자 수용체로 구성되는 군으로부터 선택된 세포 표면 마커
    인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다이머이고, 이의 레트로바이러스 구성물로부터의 발현은
    (i) 1종의 이중-방향성 프로모터,
    (ii) 2종의 개별 프로모터, 또는
    (iii) 1 이상의 내부 리보솜 진입 서열(IRES) 및 오직 1종의 프로모터 사용
    에 의해 제어되는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 부화 단계 (c)는
    (i) 형광 활성화된 세포 정렬(FACS);
    (ii) 마이크로조작; 또는
    (iii) 고정된 항원 또는 리간드에의 패닝법
    을 사용하여 비결합자 집단으로부터 세포들을 물리적으로 분리하여 수행되는 것인 방법.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2098536A1 (en) 2008-03-05 2009-09-09 4-Antibody AG Isolation and identification of antigen- or ligand-specific binding proteins
CA2757178C (en) * 2009-04-03 2020-05-19 Medical Research Council Mutants of activation-induced cytidine deaminase (aid) and methods of use
WO2012158948A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 The Rockefeller University Human immunodeficiency virus neutralizing antibodies adn methods of use thereof
KR20140107295A (ko) * 2011-12-22 2014-09-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 진핵 세포용 전장 항체 표시 시스템 및 그것의 용도
ES2529419T3 (es) * 2012-01-12 2015-02-19 Adnagen Gmbh Método para la cuantificación, caracterización genética cualitativa y caracterización de la expresión génica de células predeterminadas
DK2692865T3 (en) 2012-07-30 2015-02-16 Nbe Therapeutics Llc Transponeringsmedieret identification of specific binding proteins, or functional
TWI619727B (zh) * 2013-02-27 2018-04-01 中央研究院 抗體之原位親和力成熟作用
JP6962563B2 (ja) * 2015-05-12 2021-11-05 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ 単一粒子解析方法およびその解析のためのシステム
GB201603372D0 (en) * 2016-02-26 2016-04-13 Ucl Business Plc Cell
JP2023510963A (ja) * 2020-01-21 2023-03-15 シンテゴ コーポレイション 細胞のトランスフェクションおよび細胞のクローン集団の生成のためのデバイスおよび方法

Family Cites Families (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4713332A (en) 1984-01-13 1987-12-15 The Ontario Cancer Institute T cell specific CDNA clone
WO1985003947A1 (en) 1984-03-01 1985-09-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. U T-cell receptor-specific for antigen polypeptides and related polynucleotides
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
ATE144791T1 (de) 1987-06-23 1996-11-15 Univ Leland Stanford Junior Innerhalb des alpha-locus gelegenes t-zell- rezeptor-gen und dna-konstruktionen
US6544771B1 (en) 1987-12-11 2003-04-08 Cell Genesys, Inc. Retroviral gene therapy vectors and therapeutic methods based thereon
JP2981486B2 (ja) 1988-06-14 1999-11-22 メディカル・バイオロジー・インスティチュート 哺乳動物の免疫系研究方法
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
AU5675790A (en) 1989-05-09 1990-11-29 Cetus Corporation Human monoclonal antibodies to sero-specific determinants of gram-negative bacteria
US6969586B1 (en) 1989-05-16 2005-11-29 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US6291160B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US6680192B1 (en) 1989-05-16 2004-01-20 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US6291159B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US6291161B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertiore
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5871974A (en) 1990-09-28 1999-02-16 Ixsys Inc. Surface expression libraries of heteromeric receptors
US5753432A (en) 1990-10-19 1998-05-19 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Genes and genetic elements associated with control of neoplastic transformation in mammalian cells
ATE243747T1 (de) 1991-07-15 2003-07-15 Wellcome Found Herstellung von antikörpern
US6319707B1 (en) 1991-08-12 2001-11-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Board Regents Of The University Of Washington Cap-independent multicistronic retroviral vectors
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
US5866344A (en) 1991-11-15 1999-02-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody selection methods using cell surface expressed libraries
US5348867A (en) 1991-11-15 1994-09-20 George Georgiou Expression of proteins on bacterial surface
US6051427A (en) 1993-06-11 2000-04-18 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US6506604B2 (en) 1993-06-11 2003-01-14 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US5834256A (en) 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
WO1995001997A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Smithkline Beecham Corporation RECOMBINANT AND HUMANIZED IL-1β ANTIBODIES FOR TREATMENT OF IL-1 MEDIATED INFLAMMATORY DISORDERS IN MAN
KR970010603B1 (ko) 1993-09-17 1997-06-28 신원철 신규 항진균성 항생물질과 이를 생산하는 신규 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 및 이를 이용한 신규 항진균성 항생물질의 제조방법
DE4406512C1 (de) 1994-02-28 1995-02-16 Gsf Forschungszentrum Umwelt Integrationsvektoren zur Herstellung von Genen, die rekombinante Antikörper codieren
US20010053523A1 (en) 1995-06-02 2001-12-20 M&E Biotech A/S. Method for identification of biologically active peptides and nucleic acids
EP1041143A3 (en) * 1995-06-02 2000-11-29 M &amp; E Biotech A/S A method for identification of biologically active peptides and nucleic acids
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
EP0934953A2 (en) 1997-12-03 1999-08-11 Boehringer Mannheim Corporation Complex specific antibodies, method of preparation and uses thereof
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
DE19816129A1 (de) 1998-04-09 1999-10-14 Dolores Schendel T-Zellrezeptor-Expressionskassette
CA2675802A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Medical Research Council Use of an immunoglobulin-producing cell line to gererate diversity in a gene or gene product
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
EP1188825A1 (en) 2000-09-18 2002-03-20 Universiteit Leiden T cell receptor transfer into a candidate effector cell or a precursor thereof
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CN1306272C (zh) 2000-11-17 2007-03-21 罗切斯特大学 筛选编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的方法
EP1830190A3 (en) 2000-11-17 2008-07-09 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
US20050196755A1 (en) 2000-11-17 2005-09-08 Maurice Zauderer In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
JP4359503B2 (ja) 2001-08-23 2009-11-04 ゲンマブ エー／エス インターロイキン１５（ｉｌ−１５）に特異的なヒト抗体
CN1408874A (zh) * 2001-09-25 2003-04-09 韩泽广 原核细胞体内抗体文库构建、抗体的筛选和优化及用途
EP1438400B1 (en) 2001-10-01 2009-06-17 Dyax Corp. Multi-chain eukaryotic display vectors and uses thereof
EP1456383B1 (en) * 2001-12-21 2014-03-12 Medigene AG A library of modified structural genes or capsid modified particles useful for the identification of viral clones with desired cell tropism
CA2471392A1 (en) * 2001-12-22 2003-08-21 4-Antibody Ag Method for the generation of genetically modified vertebrate precursor lymphocytes and use thereof for the production of heterologous binding proteins
US7384738B2 (en) * 2002-03-28 2008-06-10 Bremel Robert D Retrovirus-based genomic screening
US20040038304A1 (en) 2002-03-28 2004-02-26 Gala Design, Inc. Antibody libraries
DK1506288T3 (da) 2002-05-10 2013-07-22 Medical Res Council Aktiveringsinduceret deaminase (aid)
ATE386810T1 (de) 2002-06-14 2008-03-15 Dyax Corp Rekombination von nukleinsäurebibliotheksmitgliedern
ES2368733T3 (es) 2002-07-18 2011-11-21 Merus B.V. Producción recombinante de mezclas de anticuerpos.
AU2003276403B2 (en) 2002-11-09 2010-04-15 Adaptimmune Limited T cell receptor display
ATE536548T1 (de) 2002-11-14 2011-12-15 Vivalis Mikrowell-array-chip zum nachweis eines antigenspezifischen lymphozyten, verfahren zum nachweis eines antigenspezifischen lymphozyten und verfahren zur klonierung eines antigenrezeptorgens eines antigenspezifischen lymphozyten
EP1597280B2 (en) 2003-02-26 2016-08-24 Institute for Research in Biomedicine Monoclonal antibody production by ebv transformation of b cells
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
EP1737971B1 (en) 2004-01-20 2017-08-16 Merus N.V. Mixtures of binding proteins
EP1784506B1 (en) 2004-07-21 2010-08-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Lentiviral vectors and uses thereof
GB0506912D0 (en) 2005-04-05 2005-05-11 Celltech R&D Ltd Biological products
PL2327763T3 (pl) 2005-08-05 2018-08-31 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt Gmbh Generowanie komórek T specyficznych względem antygenu
KR101030612B1 (ko) 2005-10-21 2011-04-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 폴리펩타이드의 재조합 발현 방법
EP1979378B1 (en) 2005-12-20 2012-07-25 MorphoSys AG Novel collection of hcdr3 regions and uses therefor
WO2007137616A1 (en) 2006-05-30 2007-12-06 Millegen Highly diversified antibody libraries
EP1975239A1 (en) 2006-09-27 2008-10-01 Bundesrepublik Deutschland, letztvertreten durch den Präsidenten des Paul-Ehrlich-Instituts Prof. Dr. Johannes Löwer Pseudotyping of retroviral vectors, methods for production and use thereof for targeted gene transfer and high-throughput screening
EP1921142A1 (en) 2006-11-07 2008-05-14 Cytos Biotechnology AG Selection of human monoclonal antibodies by eukaryotic cell display
EP2126105A4 (en) 2007-02-20 2010-11-03 Anaptysbio Inc SOMATIC HYPERPERMUTATION SYSTEMS
JP5941616B2 (ja) 2007-05-25 2016-06-29 シムフォゲン・アクティーゼルスカブＳｙｍｐｈｏｇｅｎ Ａ／Ｓ 組み換えポリクローナルタンパク質を製造する方法
EP2193146B1 (en) 2007-09-14 2016-05-25 Adimab, LLC Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8637435B2 (en) 2007-11-16 2014-01-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Eukaryotic cell display systems
FR2924440B1 (fr) 2007-12-04 2015-01-09 Pf Medicament Nouveau procede de generation et de criblage d'une banque d'anticorps
EP2098536A1 (en) 2008-03-05 2009-09-09 4-Antibody AG Isolation and identification of antigen- or ligand-specific binding proteins
EP2271758B1 (en) 2008-04-14 2018-09-12 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
CA2736277C (en) 2008-09-10 2016-06-21 Philochem Ag Display library for antibody selection
CN102282256B (zh) 2008-12-05 2014-09-17 凯奥目生物科学株式会社 针对在细胞表面表达的蛋白质的抗体制作方法
MX2015000979A (es) 2012-07-27 2015-11-23 Univ Illinois Ingenieria de receptores de celulas t.

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Publication number Publication date
JP2015097528A (ja) 2015-05-28
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