BRPI0907864B1

BRPI0907864B1 - Método para o isolamento e identificação de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo, ou seu fragmento, específico para um antígeno ou ligante desejado

Info

Publication number: BRPI0907864B1
Application number: BRPI0907864-9A
Authority: BR
Inventors: Jörn Stitz; Ulf Grawunder
Original assignee: Agenus Inc.
Priority date: 2008-03-05
Filing date: 2009-03-04
Publication date: 2019-02-26
Also published as: JP2015097528A; BRPI0907864A2; MX355993B; CN101970482A; JP6019540B2; US20150072412A1; US10502745B2; WO2009109368A1; JP5707650B2; HK1149280A1; AU2009221239B2; NZ587512A; EP2098537A2; AU2009221239A1; HK1213012A1; EP2489674B1; WO2009109368A8; SG188841A1; ZA201005882B; US20170242031A1

Abstract

método para o isolamento e identificação de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo, ou seu fragmento, específico para um antígeno ou ligante desejado a presente invenção divulga novos métodos para a geração, expressão e rastreio de coleções diversas de proteínas de ligação, tais como anticorpos ou seus fragmentos, em células hospedeiras de vertebrado in vitro, para a identificação e isolamento de proteínas de ligação específicas para ligantes ou antígenos. os métodos divulgados aqui permitem a expressão de coleções diversas de proteínas de ligação a partir de pelo menos uma construção vetorial, que opcionalmente pode dar origem a coleções de proteínas de ligação diversas por transferência e expressão em células hospedeiras de vertebrado in situ.

Description

“MÉTODO PARA O ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE PELO MENOS UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICA UM ANTICORPO, OU SEU FRAGMENTO, ESPECÍFICO PARA UM ANTÍGENO OU LIGANTE DESEJADO”

Domínio da Invenção

A presente invenção divulga novos métodos para a geração, expressão e rastreio de diversas coleções de proteínas de ligação em células de vertebrado in vitro, permitindo a identificação e isolamento de proteínas de ligação reativas com ligantes ou antígenos. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos para a expressão retroviral, isolamento e identificação de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de ligação, como um anticorpo ou seu fragmento, específica para um antígeno ou ligante desejado.

Contexto

As tecnologias de apresentação têm desempenhado um papel importante no isolamento de proteínas de ligação específicas de alta afinidade para aplicações de diagnóstico e terapêuticas em um número vasto de distúrbios e doenças. Estas tecnologias estendem-se até ao domínio vasto da engenharia de anticorpos, enzimas sintéticas, proteômica e síntese de proteínas sem células. As tecnologias de apresentação biomolecular, que permitem a construção de uma grande reunião de biomoléculas codificadas de forma modular, sua apresentação para seleção apropriada e rápida caracterização (descodificação) de suas estruturas, são particularmente úteis para acessar e analisar a diversidade de proteínas em larga escala. Nos tempos recentes, as tecnologias de apresentação in vitro têm ganho importância devido ao isolamento de anticorpos por apresentação em fagos, apresentação em ribossomos e apresentação microbiana, que agora se tornaram em plataformas modernas de engenharia de anticorpos e proteínas. No entanto, os sistemas de expressão e apresentação microbianas sofrem de limitações, em particular para a expressão de proteínas grandes e diméricas de vertebrado, como anticorpos. Isto deve-se à incapacidade geral para expressar anticorpos completos em esses sistemas de expressão, que requer a apresentação de fragmentos de anticorpos manipulados, mas também se deve à ausência de glicosilação, ausência de proteínas chaperones, ausência de compartimentos subcelulares e tráfego de proteínas específicas de células eucarióticas, que individual e coletivamente originam artefatos de enovelamento de proteínas em proteínas de mamífero expressadas de forma microbiana. Recentemente também foram desenvolvidos métodos de apresentação in vitro empregando células hospedeiras eucarióticas, incluindo células de levedura, plantas e mamíferos. Os sistemas de expressão em células de leveduras e plantas também sofrem de ausência de glicosilação e chaperones específicos para células específicas de vertebrado e mamífero, de modo que as mesmas limitações respeitantes ao enovelamento de proteínas são aplicáveis à expressão de proteínas de vertebrado em esses sistemas. A ocorrência de

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 16/103 expressão, enovelamento apropriado de proteínas e modificação pós-tradução de grandes proteínas recombinantes, como anticorpos, só pode ser esperada com eficiência e qualidade razoáveis em sistemas de expressão de vertebrado, que idealmente expressam proteínas no sistema celular relacionado mais de perto do ponto de vista filogenético.

Em consequência, proteínas interessantes do ponto de vista terapêutico, como anticorpos de roedores ou humanos, são expressadas de forma ideal em células de roedores ou humanas, e não é surpreendente que apenas sistemas de expressão dessas espécies tenham sido aprovados por autoridades regulamentadoras para a produção de anticorpos terapêuticos completos de qualidade clínica. Todavia, os sistemas de expressão baseados 10 em células de vertebrado e mamífero são laboriosos, requerem estruturas prolongadas para o estabelecimento de linhas de células e clones com produção estável, e muitas vezes não é trivial uma modificação genética eficiente e controlada dessas células, o que, em consequência, torna esses sistemas menos atrativos para métodos de rastreio e apresentação. Por exemplo, métodos de transfecção de DNA não podem ser controlados quanto ao núme15 ro de construções de DNA que são incorporadas, de forma transitória ou estável, em células transfectadas, o que exclui a expressão clonal de bibliotecas de proteínas e, assim, um rastreio limpo de genes para fenótipos. Os sistemas virais alternativos não provêm um controle apropriado da expressão clonal, uma manutenção estável das construções genéticas e/ou sofrem do fato de esses sistemas causarem muitas vezes efeitos citopáticos nas células 20 alvo (por exemplo, expressão de vírus vacínia), de modo que clones protéicos não podem ser apresentados e/ou enriquecidos de modo seqüencial em um fenótipo particular, tal como, por exemplo, ligação específica a um antígeno.

Assim, um objetivo da presente invenção consiste em prover um método que ultrapassa de forma clara todas as limitações e desvantagens acima mencionadas de sistemas 25 procarióticos e eucarióticos de expressão e seleção gênicas da técnica anterior. O método de acordo com a invenção usa expressão retroviral estável de proteínas de ligação, tais como, em particular, anticorpos, em células de mamífero, em particular linhas de células linfocíticas B, de modo que é alcançada expressão estável e preferivelmente clonal de proteínas de anticorpos na presença de glicosilação, proteínas chaperones e tráfego de proteínas 30 apropriados, assegurando um enovelamento apropriado das proteínas e permitindo um rastreio eficiente e, se desejado, repetido quanto a clones de anticorpos de ligação a antígenos. Uma vez que a forma de realização preferida do método de acordo com a invenção é baseada na expressão retroviral de anticorpos, ou seus fragmentos, em linfócitos precursores, a tecnologia divulgada aqui é chamada de “Apresentação Retrocítica” (de apresentação retro35 viral de células linfocíticas pré-B).

Resumo da Invenção

A presente invenção refere-se de modo geral à provisão de anticorpos terapêuticos

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 17/103 ou de diagnóstico, ou seus fragmentos. Em particular, refere-se à identificação e seleção de anticorpos reativos com antígenos com sequências de aminoácidos totalmente humanas que têm interesse para aplicações terapêuticas. As formas de realização da invenção envolvem vetores de expressão retrovirais que permitem a expressão de coleções diversas de 5 proteínas de ligação, incluindo anticorpos ou seus fragmentos, em células de vertebrado, de preferência de mamífero, e métodos para o isolamento eficiente de moléculas reativas com ligantes ou antígenos. A presente invenção provê novos métodos para a geração de coleções diversas de proteínas de ligação, como anticorpos ou seus fragmentos, por três métodos alternativos. Em primeiro lugar, por mistura de cadeias de pelo menos uma molécula de 10 cadeia pesada ou leve contra uma coleção (biblioteca) diversa de cadeias leves ou pesadas (abordagem de mistura de cadeias), ou então, em segundo lugar, por diversificação de pelo menos uma combinação de cadeias pesadas e leves de um anticorpo após transdução retroviral em células de vertebrado in situ por mutação somática de construções de expressão transduzidas de forma retroviral (abordagem de mutação somática), ou então, em terceiro 15 lugar, por recombinação V(D)J de construções de expressão transduzidas de forma retroviral contendo as regiões codificadoras para domínios de ligação variáveis de anticorpos em configuração “quase-linha germinativa”, isto é, ainda separadas em segmentos gênicos V, opcionalmente D e J (abordagem de recombinação V(D)J). Deve ser entendido que coleções diversas de proteínas de ligação, incluindo anticorpos ou seus fragmentos, também 20 podem ser geradas por qualquer combinação dos métodos mencionados acima. De preferência, essas proteínas de ligação ou anticorpos ou seus fragmentos são apresentados na superfície de linfócitos precursores.

Em particular, a presente invenção provê métodos que permitem a expressão estável, e opcionalmente clonal, de coleções diversas de proteínas de ligação, de preferência 25 anticorpos, em células de vertebrado usando transdução retroviral, que facilita muito a amplificação, isolamento e clonagem de genes codificadores de proteínas de ligação, em comparação com sistemas de expressão alternativos de vertebrado baseados em plasmídeos ou baseados em vírus não de integração conhecidos na área. Como exemplo representativo mas não limitador, é divulgada a transdução retroviral de linfócitos precursores murinos que 30 são incapazes de expressar anticorpos endógenos, de modo que apenas anticorpos heterólogos e recombinantes são expressados nas células hospedeiras na forma de anticorpos ligados a membranas. Além disso, a invenção ilustra o modo como células que expressam proteínas de ligação reativas com ligantes ou antígenos, como anticorpos ou seus fragmentos, podem ser isoladas e opcionalmente expandidas in vitro, para enriquecer de modo itera35 tivo em uma população de células de ligação reativas com antígenos, de onde genes que codificam proteínas de ligação reativas com antígenos ou ligantes podem ser subseqüentemente clonados e seqüenciados por procedimentos comuns de biologia molecular conheciPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 18/103 dos na área (Fig. 1).

Apesar de uma forma de realização preferida do método de acordo com a invenção ser dirigida à expressão retroviral de proteínas de ligação, de preferência anticorpos completos humanos, pode ser usada de igual modo para a expressão de qualquer seu fragmento 5 (por exemplo, fragmentos de anticorpos F_v de cadeia simples ou F_ab). São divulgados protocolos de transdução retroviral que opcionalmente permitem (i) a distribuição de construções codificadoras de uma única proteína de ligação em células alvo isoladas, para assegurar a expressão clonal de proteínas de ligação nas células hospedeiras; (ii) a mistura de pelo menos uma construção de expressão que codifica uma primeira cadeia polipeptídica com pelo 10 menos uma construção de expressão que codifica uma segunda cadeia polipeptídica, desse modo gerando uma proteína de ligação multimérica funcional (por exemplo, uma molécula de anticorpo); (iii) a mutação somática de pelo menos uma construção de expressão que codifica pelo menos uma proteína de ligação por transdução de células de vertebrado in situ, e (iv) a geração da expressão da proteína de ligação por meio de pelo menos uma constru15 ção de expressão pelo mecanismo de recombinação V(D)J por transdução retroviral em células de vertebrado in situ.

Para alcançar mutação somática de construções que codificam proteínas de ligação in situ são divulgados vetores de expressão retrovirais e sua utilização, em que esses vetores contêm elementos genéticos de regulação cis que dirigem a hipermutação somática para 20 sequências codificadoras de proteínas, de preferência por uma via de citidina desaminase induzida por ativação (AID) (Papavasiliou & Schatz, 2002), ou usando outras enzimas que dirigem mutações somáticas para sequências codificadoras de proteínas de ligação. Para a geração de coleções diversas de proteínas de ligação, de preferência anticorpos ou seus fragmentos, por recombinação V(D)J in situ são divulgadas construções de vetores retrovi25 rais e sua utilização, em que essas construções contêm segmentos gênicos variáveis (V), opcionalmente de diversidade (D), e de junção (J) dispostos em configuração “quase-linha germinativa”, que permite a reunião de regiões codificadoras para proteínas de ligação imunoglobulinas ou do tipo imunoglobulinas via rearranjo mediado pelo gene ativador da recombinação (RAG) dos segmentos gênicos pelo processo chamado de recombinação V(D)J 30 (Grawunder etal., 1998).

De acordo com outro aspecto, a presente invenção também ilustra o modo como células transduzidas de forma retroviral que expressam de modo estável coleções diversas de proteínas de ligação recombinantes são subseqüentemente etiquetadas por ligação a pelo menos um ligante ou antígeno de interesse, e como células que se ligam ao ligante ou 35 antígeno de interesse acima mencionado são detectadas por reagentes secundários apropriados. São descritos métodos para a etiquetagem específica de células reativas com ligantes ou antígenos e seu enriquecimento ou isolamento, de preferência por separação de céluPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 19/103

Ias ativadas por fluorescência (FACS) de alta velocidade. Devido ao fenótipo de expressão estável de células transduzidas de forma retroviral, é descrito o modo como células reativas com antígenos podem ser opcionalmente isoladas e expandidas de novo em cultura de tecidos, de modo que podem ser efetuados ciclos opcionalmente iterativos de etiquetagem de 5 antígenos, enriquecimento dirigido a antígenos e expansão de células reativas com ligantes ou antígenos, até ser efetuada a subclonagem das células, permitindo a identificação da região codificadora de nucleotídeos para anticorpos reativos com antígenos por métodos comuns de clonagem por PCR (Fig. 1).

Os métodos divulgados aqui permitem a expressão de coleções diversas de cadei10 as de anticorpos, ou seus fragmentos, por meio de pelo menos uma construção vetorial, que opcionalmente pode originar coleções de proteínas de ligação diversas por transferência e expressão em células de vertebrado in situ. A expressão de cadeias de anticorpos em células de vertebrado é preferivelmente mediada por transdução retroviral.

Como tal, um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para o 15 isolamento e identificação de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo, ou seu fragmento, específico para um antígeno ou ligante desejado, que compreende os passos seguintes:

(a) transdução de pelo menos uma construção de expressão retroviral que codifica um anticorpo, ou seu fragmento, em células hospedeiras de vertebrado;

(b) expressão desse anticorpo, ou seu fragmento, nas referidas células hospedeiras de vertebrado;

(c) enriquecimento das células hospedeiras de vertebrado que expressam esse anticorpo, ou seu fragmento, com base na sua capacidade para se ligarem ao referido antígeno ou ligante desejado, e (d) isolamento e identificação da referida pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica o referido anticorpo, ou seu fragmento, a partir das células hospedeiras de vertebrado transduzidas de forma retroviral e enriquecidas.

Para além dos passos acima mencionados, o passo (d) pode ser precedido de um passo de expansão das células hospedeiras de vertebrado enriquecidas em cultura de teci30 dos. Além disso, o passo (c) pode ser seguido de um passo de expansão das células hospedeiras de vertebrado enriquecidas em cultura de tecidos, após o que o passo (c) é repetido pelo menos uma vez antes de ser efetuado o passo (d).

Para alcançar expressão clonal de pelo menos um anticorpo é preferível controlar a transdução retroviral de modo que a maior parte das células transduzidas de forma retroviral 35 seja geneticamente modificada apenas por uma construção retroviral recombinante por cadeia de anticorpo com integração no genoma da célula hospedeira. Em consequência, em uma forma de realização da presente invenção, a transdução retroviral é efetuada a uma

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 20/103 multiplicidade de infecção (MOI) igual ou menor do que 0,1.

Um anticorpo de acordo com o método da presente invenção é, de preferência, um anticorpo completo. Um fragmento de um anticorpo pode ser selecionado do grupo que consiste em uma cadeia pesada, uma cadeia leve, um domínio V_H isolado, um domínio V_L isola5 do, um fragmento scFv, um fragmento Fab e um fragmento F(ab’)2. O anticorpo, ou seu(s) fragmento(s), pode ter uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural, uma sequência de aminoácidos manipulada de forma artificial ou uma combinação dessas.

Apesar de o método da presente invenção ser usado de preferência para o isolamento e identificação de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ca10 deia de anticorpo, será claro para o profissional que o método da presente invenção também pode ser usado para o isolamento e identificação de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer receptor da superfície celular monomérico ou multimérico pertencente à superfamília Ig, e qualquer seu fragmento funcional, ou um receptor da superfície celular monomérico ou multimérico pertencente à superfamília de receptores do TNFa, ou 15 qualquer seu fragmento.

Além disso, quando a proteína de ligação for um anticorpo completo, o anticorpo completo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo totalmente humano, um anticorpo humanizado, no qual regiões CDR de um anticorpo ou anticorpos não humanos foram enxertadas em uma região de arcabouço de um anticorpo humano, e um anticorpo 20 quimérico, no qual domínios de regiões variáveis de uma espécie de vertebrado são combinados com domínios de regiões constantes de outra espécie de vertebrado, em que o domínio constante do anticorpo quimérico é preferivelmente derivado de um anticorpo ou anticorpos humanos.

Em uma forma de realização dos métodos divulgados aqui, as células hospedeiras 25 de vertebrado podem ser derivadas de um grupo de espécies que compreende peixes cartilaginosos, peixes ósseos, anfíbios, répteis, pássaros e mamíferos. O grupo de espécies de mamíferos pode incluir porcos, ovelhas, gado, cavalos e roedores. O grupo de roedores pode compreender adicionalmente camundongos, ratos, coelhos e porquinhos-da-índia. Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a espécie das células hospedeiras 30 de vertebrado é camundongo (Mus musculus).

As células hospedeiras de vertebrado para utilização em um método da presente invenção podem ser derivadas de qualquer órgão de vertebrado, mas de preferência são derivadas de células da linhagem linfocítica. Os linfócitos preferidos para utilização na presente invenção são da linhagem de células B, pois estas células expressam proteínas cha35 perones específicas para anticorpos e porque moléculas acessórias, como Iga e Ig3, requeridas para mediar a ancoragem à superfície celular dos anticorpos são expressadas em estas células. De modo mais preferível, as células B são linfócitos B precursores, pois podem

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 21/103 ser encontradas células pré-B que não expressam quaisquer cadeias de anticorpos endógenos. De fato, os linfócitos preferidos usados na presente invenção são incapazes de expressar polipeptídios de anticorpos endógenos, incluindo componentes da chamada cadeia leve substituta, codificados pelos genes lambda-5, VpreBI e VpreB2. Em consequência, os linfócitos preferidos expressam proteínas membranares acessórias que facilitam a deposição membranar de moléculas de anticorpos, como as moléculas Iga e IgP específicas de células B, mas estão desprovidos de expressão de qualquer polipeptídio de anticorpo endógeno ou componente da cadeia leve substituta. Contudo, deve ser notado que pode ser possível expressar moléculas Iga e IgP de forma ectópica por métodos conhecidos na área, por exemplo, transfecção estável com vetores de expressão para estas proteínas. Em uma forma de realização preferida da presente invenção, moléculas de anticorpos são ancoradas à membrana celular de linfócitos via proteínas Iga e IgP expressadas de forma endógena, que são expressadas de forma natural em linfócitos pré-B murinos.

Os métodos divulgados aqui incluem procedimentos que permitem o isolamento de células que exibem características de ligação desejadas para um ligante ou antígeno de interesse e o isolamento de genes que codificam uma proteína de ligação desejada de interesse. O método preferido e divulgado aqui de expressão retroviral de um anticorpo em células de vertebrado permite a expressão estável e preferivelmente clonal de anticorpos, o que facilita muito a amplificação, isolamento e clonagem de genes codificadores de anticorpos, em comparação com sistemas de expressão de vertebrados alternativos baseados em plasmídeos ou baseados em vírus não de integração conhecidos na área. Os métodos divulgados permitem a geração eficiente de coleções diversas de proteínas de ligação in vitro por um dos seguintes:

(i) mistura de pelo menos uma construção de expressão que codifica pelo menos uma cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação multimérica (tal como, por exemplo, uma cadeia pesada de um anticorpo) com pelo menos uma construção de expressão que codifica pelo menos uma cadeia polipeptídica correspondente (tal como, por exemplo, uma cadeia leve de um anticorpo), desse modo gerando uma proteína de ligação multimérica funcional (tal como, por exemplo, um anticorpo);

(ii) mutação somática de pelo menos um vetor de expressão que codifica pelo menos uma proteína de ligação por transferência para células de vertebrado in sitw, (iii) recombinação somática de segmentos gênicos V (variáveis), opcionalmente D (de diversidade), e J (de junção) que codificam domínios de ligação variáveis de imunoglobulinas e moléculas do tipo imunoglobulinas contidos em pelo menos um vetor de expressão por transferência para células de vertebrado in situ, pelo processo chamado de recombinação V(D)J, ou (iv) qualquer combinação dos procedimentos (i), (ii) e (iii).

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De acordo com uma forma de realização preferida, a pelo menos uma sequência de nucleotídeos consiste em uma pluralidade de sequências de nucleotídeos que compreendem uma sequência de cadeia pesada de anticorpo e múltiplas sequências de cadeias leves de anticorpos, ou então - em alternativa - compreendem uma sequência de cadeia leve de anticorpo e múltiplas sequências de cadeias pesadas de anticorpos.

De acordo com outra forma de realização preferida, o anticorpo ou seu fragmento compreende um domínio de ligação variável codificado pela pelo menos uma construção de expressão retroviral que permite a recombinação V(D)J para gerar uma sequência codificadora para um domínio de ligação variável por transdução retroviral ou

Em outra forma de realização preferida, o passo (b) do método acima é realizado em condições de mutagenização, de preferência via expressão de citidina desaminase induzida por ativação (AlD), que é expressada de forma endógena ou ectópica, em que a expressão ectópica da Al D é efetuada sob condições indutíveis.

Em um aspecto do método acima, a pelo menos uma construção de expressão retroviral que codifica o referido anticorpo, ou seu fragmento, contém uma combinação de elementos promotores e intensificadores de regulação c/s que permitem o direcionamento da mutação somática mediada pela Al D para um domínio de ligação variável codificado pela construção de expressão, em que os elementos promotores e intensificadores são selecionados do grupo que consiste nos seguintes:

(a) promotor da cadeia pesada de imunoglobulina, intensificador de íntron (ΕμΗ) e elementos intensificadores 3’a, (b) promotor da cadeia leve κ de imunoglobulina, intensificador de íntron κ (kíE) e elementos intensificadores 3’k (3’kE), (c) promotor da cadeia leve λ de imunoglobulina, elementos intensificadores Λ2-4 e Λ3-1 e (d) qualquer combinação funcional desses.

Descrição das Figuras

Fig. 1: Esta figura ilustra o princípio da “Apresentação Retrocítica” que permite a identificação e isolamento de uma proteína de ligação, como um anticorpo, específica para um antígeno ou ligante desejado. Em um primeiro passo, pelo menos uma construção de expressão retroviral que pode dar origem a expressão de uma coleção diversa de proteínas de ligação é transduzida de forma estável em células hospedeiras de vertebrado adequadas (“células seletoras”). Isto é feito por transfecção de pelo menos um vetor retroviral que codifica pelo menos uma proteína de ligação em células empacotadoras retrovirais (passo 1), que podem expressar de forma constitutiva ou transitória as proteínas retrovirais Gag, Pol e Env. Células empacotadoras transfectadas com a pelo menos uma construção de proteína de ligação retroviral irão então produzir partículas retrovirais recombinantes em um período

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de 24-72 horas pos-transfecção, contendo a pelo menos uma construção de expressão retroviral. As partículas retrovirais resultantes são acumuladas no sobrenadante da cultura de células das células empacotadoras retrovirais e podem ser usadas para transdução de células hospedeiras de vertebrado adequadas (“células seletoras”) (passo 2), que então expressam a proteína de ligação. No método preferido, as proteínas de ligação, como anticorpos ou seus fragmentos, são expressadas na superfície celular das “células seletoras”, e as células são então etiquetadas com um antígeno ou ligante desejado (passo 3). De seguida, as células de ligação a antígeno ou ligante são analisadas, de preferência, por separação de células ativadas por fluorescência (FACS), e as células que exibem ligação específica ao antígeno são separadas da população de células que não exibiu ligação, de preferência por FACS preparativa de alta velocidade (passo 4). As células reativas com antígeno ou ligante podem ser opcionalmente expandidas de novo em cultura de tecidos e, devido ao fenótipo de expressão estável de células transduzidas de forma retroviral, ciclos de triagem de células dirigidas a antígeno e expansão em cultura de tecidos podem ser repetidos até ser alcançada uma população detetável de células reativas com antígeno ou ligante. Esta população de células reativas com antígeno ou ligante pode ser sujeita a um passo final e preferível de triagem de células isoladas, ou pode ser usada diretamente para clonagem de genes codificadores de proteínas de ligação baseados na população. No passo seguinte (passo 5), as regiões codificadoras de domínios de ligação relevantes são clonadas das reuniões de células ou clones de células selecionados quanto ao antígeno ou ligante, por RT-PCR ou PCR genômico, usando pares de “primers” que se ligam a sequências específicas para a biblioteca de proteínas de ligação e/ou específicas para outras sequências vetoriais, por métodos comuns conhecidos na área. As regiões codificadoras clonadas e seqüenciadas para proteínas de ligação podem então ser opcionalmente expressadas na forma de proteínas recombinantes, em qualquer sistema de expressão escolhido, para caracterização funcional adicional e para confirmar a especificidade de ligação a antígenos ou ligantes (passo 6).

Fig. 2: (a) Esta figura ilustra a estrutura esquemática de anticorpos ou imunoglobulinas, e seus fragmentos, que são as proteínas de ligação preferidas de acordo com a invenção divulgada. A Fig. 2a) mostra a estrutura esquemática de um anticorpo IgG (esquerda), que é caracterizado por uma estrutura em forma de Y característica e é composto por duas cadeias pesadas e leves idênticas de imunoglobulina (Ig), compreendendo quatro (V_h-Ch1Ch2-Ch3) e dois domínios de imunoglobulina (V_l-Cl), respectivamente. Os domínios V são as regiões de ligação a antígenos altamente variáveis de cadeias IgH e IgL, ao passo que os domínios Ch e Cl representam os domínios de regiões constantes. Os domínios de regiões variáveis de cadeias IgH são codificados por segmentos gênicos V, D e J, ao passo que os domínios de regiões variáveis de cadeias IgL são codificados apenas por segmentos gêniPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 24/103 cos V e J, que é necessário reunir a partir de loci gênicos de imunoglobulinas da linha germinativa (Figs. 2b) e 2c) durante a linfopoiese B inicial pelo processo chamado de recombinação V(D)J.

Cadeias IgH e IgL de anticorpos permanecem juntas de modo covalente por pontes dissulfeto, que procedem ao acoplamento das cadeias IgH idênticas entre si em uma localização próxima da região de articulação flexível, isto é, entre os domínios Ch1 e Ch2, ao passo que pontes dissulfeto adicionais entre os domínios Ch1 e Cl, como representado, procedem ao acoplamento covalente de cadeias IgH e IgL (Fig. 2a à esquerda).

Fragmentos Fab são fragmentos univalentes de anticorpos completos que contêm apenas domínios V_h-Ch1/V_l-Cl acoplados por uma ponte dissulfeto natural, que podem ser derivados de anticorpos completos por divagem enzimática com papaína, ou que podem ser expressados na forma de proteínas recombinantes por expressão de cadeias IgH deletadas em Ch2-Ch3 em conjunto com cadeias IgL. Fragmentos adicionais de anticorpos totalmente humanos são fragmentos de domínios variáveis de cadeia simples (fragmentos scFv), que compreendem somente os domínios da região variável de cadeias IgH e IgL que são acopladas por um agente de ligação sintético ou uma ponte dissulfeto artificial. A expressão de anticorpos completos, ou fragmentos de anticorpos, como os fragmentos Fab e scFv representados, também podem ser expressados na forma de proteínas de ligação para implementar a invenção.

A Fig. 2b) representa de forma esquemática o processo de recombinação V(D)J que ocorre em um alelo da cadeia IgH da linha germinativa, originando a reunião das regiões codificadoras dos domínios V_H de anticorpos. Os domínios variáveis de cadeias IgH em espécies de vertebrados são codificados por uma pluralidade de segmentos gênicos V, D e J que estão separados em configuração de linha germinativa. Durante a recombinação V(D)J que ocorre durante a linfopoiese B inicial, um segmento gênico V, D e J selecionado é rearranjado de modo específico para sítios para gerar uma região codificadora única para um domínio V_H de um anticorpo. A recombinação V(D)J no locus da cadeia IgH é um processo ordenado e começa com o rearranjo de um segmento gênico D selecionado com um segmento gênico J selecionado, habitualmente em ambos os alelos da cadeia IgH. Só depois do rearranjo gênico D com J é que uma região V selecionada é reunida de forma específica para sítios à região DJ já reunida, desse modo gerando uma ORF V-D-J que codifica o domínio V_H. O processo de recombinação V(D)J depende da expressão de genes ativadores da recombinação (RAG) 1 e 2 específicos de linfócitos precursores.

A Fig. 2c) representa de modo esquemático o processo de recombinação V(D)J que ocorre em um alelo da cadeia IgL da linha germinativa, originando a reunião das regiões codificadoras de domínios V_L de anticorpos. Os domínios variáveis de cadeias IgL em espécies de vertebrados são codificados somente por segmentos gênicos V e J, que estão sepaPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 25/103 rados na configuração da linha germinativa, similares aos segmentos gênicos no locus da cadeia IgH. A geração de domínios V_L de anticorpos requer apenas um evento de recombinação V(D)J específico para sítios, como representado.

Fig. 3: Esta figura ilustra de modo esquemático o princípio da modificação genética estável de células alvo para a expressão de uma proteína de ligação de interesse (BPOI), como um anticorpo (alternativamente marcado com “X”), por transdução retroviral.

A Fig. 3a) ilustra a organização esquemática de um genoma retroviral do tipo selvagem (em cima à esquerda), em que os genes para as proteínas estruturais e funcionais Gag, Pol e Env estão localizados entre sequências chamadas de repetições terminais longas (LTR) 5’ e 3’ que flanqueiam o genoma retroviral. As 5’LTRs são importantes para a expressão dos genes retrovirais e também para a replicação do genoma retroviral na célula hospedeira infectada. Outra região importante do genoma retroviral é o sinal empacotador ψ (Psi), que é requerido para o empacotamento do RNA retroviral durante a replicação e/ou produção de partículas retrovirais.

Para a geração de partículas retrovirais recombinantes, os genes gag, pol e env podem ser removidos de um genoma retroviral de tipo selvagem, de modo que apenas restam LTRs 5’ e 3’ e o sinal empacotador ψ (Psi). Então, para a construção de vetores retrovirais recombinantes é conveniente introduzir um sítio múltiplo de clonagem (MCS) contendo vários sítios únicos e convenientes de enzimas de restrição. Esta concepção, representada em cima/direita, representa o vetor de transferência retroviral mais simples.

Para a expressão de retrovírus recombinantes que permitem a expressão de uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína de ligação de interesse (BPOI) “X”), como um anticorpo, é necessário inserir minimamente uma fase de leitura aberta (ORF) de uma BPOI em um vetor de transferência retroviral “vazio”, pois a região 5’LTR tem atividade promotora capaz de conduzir a expressão de qualquer gene posicionado a jusante. No entanto, para melhorar os níveis de expressão, a expressão de um gene de interesse (por exemplo, um BPOI-“X”) pode ser opcionalmente conduzida por um promotor heterólogo adicional (Prom.), e a adição opcional de um gene marcador, por exemplo, a jusante do promotor 5’LTR e sinal empacotador ψ, como ilustrado aqui, também pode permitir a seleção e/ou tráfego de construções transduzidas de modo retroviral.

A Fig. 3b) ilustra de forma esquemática o procedimento de transdução retroviral de células alvo que origina a expressão estável de uma BPOI-“X”, como um anticorpo. Para esta finalidade, em primeiro lugar, uma construção retroviral recombinante contendo um cassete de expressão para uma BPOI-“X” é transfectada de forma transitória em uma linha de células empacotadoras (PCL) retrovirais que expressa as proteínas retrovirais estruturais e funcionais Gag, Pol e Env de um retrovírus de tipo selvagem (esquerda). Uma PCL retroviral pode ser gerada por transfecção estável ou transitória de construções de expressão para

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 26/103 as proteínas Gag, Pol e Env em uma linha de células adequada e fácil de transfectar (por exemplo, células comuns HEK 293 humanas, ou fibroblastos NIH 3T3 de camundongo). Dois até três dias pós-transfecção, os genomas retrovirais recombinantes, contendo o gene BPOI-“X”, são empacotados em partículas retrovirais incompetentes para replicação, que 5 são acumuladas no sobrenadante da cultura de células da PCL. As partículas retrovirais são incompetentes para replicação porque estão desprovidas dos genes para as proteínas Gag, Pol e Env retrovirais funcionais e, em consequência, só conseguem distribuir uma vez a sua carga gênica em uma célula alvo, um processo chamado de transdução retroviral ou infecção em uma única ronda. Durante a transdução retroviral, o RNA empacotado de um retroví10 rus recombinante é introduzido nas células alvo, onde é transcrito de forma reversa em cDNA que então é integrado de modo estável no genoma da célula alvo. Dois até três dias após a transdução retroviral, um gene de interesse, como BPOI-“X”, é então expressado de modo permanente pelas células alvo devido à integração da construção retroviral de cDNA no genoma da célula hospedeira.

Fig. 4: Esta figura mostra a concepção esquemática de tipos preferidos de construções de expressão retrovirais que podem ser usadas para implementar a invenção. A figura ilustra a concepção esquemática de vetores retrovirais contidos em um esqueleto plasmídico de clonagem de DNA comum (linha preta fechada); os genes e regiões relevantes para o genoma retroviral estão salientados. Uma geração vetorial preferida, ilustrada no painel (a), 20 cuja clonagem detalhada é descrita nas Figs. 5 e 6 e provida no Exemplo 1, contém as regiões codificadoras de cDNA para cadeias IgyiH e IgxL humanas conduzidas por um promotor (Prom.) do CMV constitutivo forte e flanqueadas a montante e a jusante pelo intensificador de íntron de Ig κ (κίΕ) e elementos 3’k intensificadores (3’κΕ), que promovem a hipermutação somática nas regiões codificadoras V das cadeias IgH e IgL. As construções de expres25 são de cadeias IgH e IgL retrovirais contêm adicionalmente fases de leitura aberta para os marcadores de resistência a antibióticos higromicina B (higro^R) e puromicina (puro^R), respectivamente, permitindo a seleção de integração estável das construções de cadeias IgH e IgL por aplicação de seleção com fármaco antibiótico respectivo a culturas de células de vertebrado transduzidas de forma retroviral. Além disso, sítios convenientes e únicos de enzimas 30 de restrição estão salientados, permitindo a substituição direta de regiões codificadoras V por HindIII e Eco47lll, ou a substituição da totalidade das regiões codificadoras de cadeias IgH e IgL usando as enzimas de restrição HindIII e Notl. Deste modo, de uma construção de expressão de cadeia IgH ou IgL existente, diferentes regiões V e mesmo coleções completas de regiões V podem ser facilmente clonadas nos vetores de expressão divulgados.

(b) Em este painel é descrita outra classe de vetores preferidos que contêm uma substituição da região codificadora variável por um fragmento de DNA, em que a região codificadora variável ainda está separada em segmentos gênicos V, D e J (para a construção

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IgH) e segmentos gênicos V e J (para a construção da cadeia IgL) em configuração “quaselinha germinativa”. Em tudo o resto idênticos aos vetores de expressão retrovirais providos em (a), estes vetores retrovirais competentes para recombinação V(D)J requerem, em primeiro lugar, ser submetidos a rearranjo específico para sítios dos segmentos gênicos V, 5 opcionalmente D e J com a finalidade de gerar uma região codificadora para um domínio de ligação variável de uma cadeia IgH ou IgL. A clonagem detalhada desse vetor que permite a expressão de cadeias IgH após recombinação V(D)J está descrita na Fig. 11.

Uma característica única destas construções é a sua capacidade para gerar diversas regiões codificadoras de domínios V em células ativas para recombinação V(D)J in situ, 10 por exemplo, em linfócitos precursores que expressam proteínas RAG1 e RAG2 endógenas.

Uma vez que o processo de recombinação V(D)J não é preciso, uma coleção diversa de sequências de regiões codificadoras variáveis pode resultar de um vetor retroviral individual em um dado conjunto de segmentos gênicos V, D e J para IgH, ou um dado conjunto de segmentos gênicos V e J para IgL. A diversidade da reunião de segmentos gênicos V, opci15 onalmente D e J deve-se a uma combinação de atividade de exonucleases, adição de região N mediada por TdT e geração de nucleotídeos P, e todos podem contribuir individualmente ou em conjunto para a diversificação da reunião codificadora. Uma vez que os segmentos gênicos V, D e J foram clonados de um modo tal que diferentes membros da família de segmentos gênicos V, D e J podem ser facilmente substituídos por sítios únicos de enzi20 mas de restrição, um número limitado de construções geradas e introduzidas em células hospedeiras competentes para recombinação V(D)J pode dar origem a uma diversidade enorme de diversidade de proteínas de ligação geradas in situ. Uma vez que estes vetores contêm elementos kíE e 3’kE adicionais, que conferem hipermutação somática a uma região codificadora de domínio V rearranjada por V(D)J, uma coleção primária gerada in situ de 25 diversas proteínas de ligação pode ser opcional e adicionalmente submetida a mutagênese por um processo de hipermutação somática dependente da Al D. Deste modo, todo o processo de geração de diversidade de anticorpos in vivo pode ser recapitulado in situ e in vitro usando as construções retrovirais divulgadas e células hospedeiras exibindo atividade de recombinação V(D)J (por exemplo, linfócitos precursores), e no qual a hipermutação somáti30 ca mediada pela Al D está ativa ou pode ser ativada.

(c) Este painel ilustra de modo esquemático ainda outra concepção de construções retrovirais que pode ser usada para implementar a invenção. Aqui, a expressão das regiões codificadoras de IgH e IgL é conduzida pelo promotor 5’LTR do esqueleto retroviral, e a expressão de cadeias IgH e IgL está acoplada à expressão dos marcadores autofluorescentes 35 GFP e YFP, respectivamente, permitindo seguir e isolar células que expressam IgH e IgL simplesmente por análise das células transduzidas quanto a fluorescência verde e amarela. Estas construções são muito úteis para controlar a multiplicidade da infecção de “células

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É provida uma legenda dos símbolos usados nas Figs. 4a) até c) para sequências de DNA importantes incluídas na construção. A subdivisão das regiões codificadoras de IgH e IgL em domínios variáveis (V_H e V_L), todos contendo sequências líder (L) endógenas, regi5 ões de articulação (H), constantes (Ch1, Ch2, Ch3, Cl), e regiões codificadoras abrangendo membranas (M1/2, pois esta região é codificada por dois éxons) é provida para um melhor entendimento das ilustrações.

As Figs. 5a-e ilustram a estratégia de clonagem para a construção de um vetor de expressão de IgH (isotipo Igyi humana) retroviral, divulgada em detalhe no Exemplo 1 e na 10 concepção básica provida na Fig. 4(a). Está representada a clonagem de construções de expressão para IgG ligada a membranas bem como IgG segregada, como detalhado no Exemplo 1 - são providos sítios únicos de enzimas de restrição nos mapas plasmídicos para fins de referência geral. Com base na construção de expressão da cadeia IgyiH retroviral final, como divulgado aqui na Fig. 5e, qualquer outra região codificadora de domínio V_H, ou 15 uma coleção (biblioteca) de diversas regiões codificadoras de domínios V_H, pode ser introduzida nos vetores usando os sítios únicos de enzimas de restrição Hindlll e Eco47l11, substituindo a região V_H existente pelas referidas quaisquer outras regiões codificadoras de domínios V_H. A Fig. 5a ilustra um primeiro passo de clonagem preparatória no qual um sítio de restrição de Eco47l 11 (dentro de círculo) é removido do esqueleto do vetor pLHCX disponível 20 no mercado por mutagênese dirigida a sítios, como descrito no Exemplo 1. Este procedimento gera o esqueleto do vetor retroviral pLHCXml, no qual o sítio da enzima de restrição Eco47lll pode ser posteriormente reintroduzido para a clonagem e substituição de regiões codificadoras de domínios V_H. A vantagem de usar Eco47lll para esta finalidade baseia-se no fato de Eco47lll ser o único sítio de enzima de restrição que pode ser introduzido direta25 mente na borda entre regiões codificadoras de V_H e Cyi humanas sem alterar a composição de aminoácidos de cadeias IgyiH humanas expressadas. A Fig. 5a também ilustra o modo como fragmentos clonados dos genes de regiões constantes γι humanas, com ou sem éxons que abrangem membranas M1/M2, são clonados no esqueleto de pLHCXml usando sítios únicos de enzimas de restrição Hindlll e Clal presentes no MCS do pLHCXml. Os 30 fragmentos foram concebidos de modo a conterem sítios adicionais de enzimas de restrição Eco47lII e Notl flanqueadores para fins de clonagem posterior, como detalhado no Exemplo 1. A Fig. 5b) mostra os mapas plasmídicos dos intermediários de clonagem sem regiões codificadoras de domínios V_H, e está mostrado como uma região codificadora de V_H particular flanqueada por sítios Hindlll e Eco47lll é clonada nas construções. Estas construções, 35 que são geradas deste modo, estão representadas na Fig. 5c e, em princípio, seriam suficientes para conferir a expressão de cadeias IgyiH humanas em qualquer linha celular receptora. Todavia, a possibilidade de submeter a mutagênese adicional regiões codificadoras de

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V_H em um modo dependente da Al D é um aspecto desta invenção, e são divulgados dois passos de clonagem adicionais nos quais o elemento kíE do núcleo com sequências flanqueadoras adicionais é clonado em um sítio BglII único, a montante do promotor do CMV do cassete de expressão (Fig. 5c em baixo e Fig. 5d), e onde o elemento 3’kE com alguma se5 quência de DNA flanqueadora é clonado no sítio Clal único a jusante do cassete de expressão para cadeias IgYiH humanas. Isto dá origem ao vetor de expressão final para cadeias IgYiH humanas ligadas a membranas ou segregadas, para as quais são providos os mapas plasmídicos na Fig. 5e. Estas construções correspondem aos mapas plasmídicos esquemáticos que já foram divulgados na Fig. 4a, mas aqui com mapas precisos de enzimas de res10 trição e desenhados à escala.

As Figs. 6a-d ilustram a estratégia de clonagem detalhada provida no Exemplo 1 para a construção da construção de expressão de IgL (isotipo IgxL humana) retroviral, cuja concepção básica já foi provida na Fig. 4(b). Com base na construção de expressão final da cadeia IgxL retroviral, como divulgado aqui na Fig. 6d, qualquer outra região codificadora de 15 domínio V_L, ou uma coleção (biblioteca) de diversas regiões codificadoras de domínios V_L, pode ser introduzida nos vetores usando os sítios únicos de enzimas de restrição Hindlll e Eco47lll, por substituição da região V_L existente pela(s) referida(s) qualquer(quaisquer) outra(s) região(regiões) codificadora(s) de domínio(s) V_L. A estratégia de clonagem para os vetores de expressão de cadeias IgL retrovirais requereu passos de clonagem preparatória 20 para gerar um esqueleto de vetor retroviral modificado, onde os elementos desejados podiam ser clonados usando sítios convenientes de enzimas de restrição, como representado. Em um primeiro passo, a partir do plasmídeo comercial pLPCX, um sítio Eco47l11 indesejado foi removido do sinal empacotador ψ (Psi) por mutagênese dirigida a sítios, como descrito no Exemplo 2, originando um plasmídeo modificado pLPCXml (Fig. 6a). Em um segundo 25 passo, um novo esqueleto pLPCXm2 foi gerado por ligação de um fragmento grande, digerido com Ascl-BIpl, do plasmídeo comercial pLHCX a um fragmento Ascl-Ncol de pLPCXml (Fig. 6b). Para ambos os fragmentos foi necessário preencher as extremidades de DNA de Blpl e Ncol não compatíveis com nucleotídeos usando o fragmento Klenow, como descrito no Exemplo 1. No esqueleto pLPCXm2 resultante foi inserida a região constante para uma 30 cadeia kL (Ck) humana via Hindlll e Clal, como mostrado (Fig. 6b). De modo similar à estratégia de clonagem para cadeias IgH humanas, o fragmento Ck humano foi adicionalmente flanqueado por sítios Eco47lll e Notl, para facilitar procedimentos adicionais de clonagem. Após inserção do fragmento Ck humano, um elemento Vk humano selecionado foi clonado na construção via sítios únicos Hindlll e Eco47lll (Fig. 6c). Em princípio, esta construção 35 seria suficiente para conferir expressão de cadeias IgxL humanas em qualquer linha celular receptora. No entanto, tal como no caso das construções de expressão de cadeias IgH (Fig. 5a-e), elementos adicionais kíE e 3’kE foram clonados na construção nos sítios únicos BglII

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 30/103 e Clal a montante e a jusante do cassete de expressão da cadeia IgKL, de modo idêntico à estratégia de clonagem das construções de cadeias IgH (Fig. 6c e 6d). Nas construções finais, também a região codificadora do domínio Vk pode então ser abordada de modo seletivo para hipermutação somática mediada pela AID. A construção final corresponde ao mapa plasmídico esquemático que está detalhado na Fig. 4(b), mas aqui os mapas precisos de enzimas de restrição estão incluídos e desenhados à escala.

Fig. 7: Esta figura ilustra a estratégia de clonagem para uma construção de expressão retroviral para a citidina desaminase induzida por ativação (AID). Como representado, foi usado o esqueleto de vetor retroviral pLPCX comercial, e um fragmento de RT-PCR βει 0 pecífico de cDNA esplênico de camundongo contendo a região codificadora da AID foi clonado no sítio de restrição Xhol único do vetor pLPCX usando sítios compatíveis de enzima de restrição Xhol inseridos nos “primers” de amplificação por PCR, como descrito no Exemplo 2.

Fig. 8: Esta figura (8a e continuada na 8b) ilustra a estratégia de clonagem detalha15 da, também provida no Exemplo 2, para construções repórter retrovirais com e sem elementos intensificadores da cadeia IgKL, permitindo a identificação e quantificação de mutações somáticas por reversão de uma mutação de terminação EGFP definida.

Fig. 9: Esta figura provê uma prova de conceito experimental de que os vetores retrovirais divulgados permitem a mutação somática mediada pela AID de sequências, tais 20 como, de preferência, regiões codificadoras V de anticorpos, clonadas a jusante dos elementos promotores V. O painel (a) mostra uma análise da expressão com AID por coloração “Western” de cinco clones selecionados de células transformadas com A-MuLV FA-12 que foram transfectados de modo estável com uma construção de expressão de AID retroviral, cuja clonagem foi representada na Fig. 7. A análise de coloração “Western” mostra um sinal 25 distinto específico da AID de cerca de 25 kD nos clones transfectantes FA-12 1 até 4, mas não no transfectante 5 e nem no controle negativo (NC) não transfectado. O transfectante 3 foi usado para a realização de testes suplementares de vetores repórter retrovirais quanto a hipermutação somática (SHM) mediada pela AID, que está representada no painel (b): Aqui, as construções repórter retrovirais da Fig. 8 (uma vez com e uma vez sem elementos inten30 sificadores de IgK) foram transduzidas de forma retroviral em transfectantes FA-12 que expressam a AID e que não expressam a AID 3 e 5, respectivamente. Como esperado, apenas quando as construções repórter contendo os elementos intensificadores foram transduzidas no clone transfectante FA-12 que expressa a AID 3 foi possível detectar transduzidos revertentes verdes a uma freqüência de 0,2% aos 10 dias pós-transdução. Destas células verdes 35 a 0,2%, 100 clones de células individuais foram isolados por triagem de células isoladas, e estes clones foram analisados de novo quanto a fluorescência verde por FACS, após expansão. A grande maioria dos clones de triagem de células isoladas (95%) exibiu expressão

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 31/103 homogênea de fluorescência verde com a mesma intensidade de fluorescência do sinal fluorescente verde média das células verdes a 0,2% originalmente submetidas a triagem, e similar ao padrão de expressão com GFP representativo provido no painel de baixo à esquerda da Fig. 9b, confirmando que a população verde original se deveu a reversões da mutação de terminação EGFP. Quatro clones exibiram um padrão de fluorescência verde bimodal, como ilustrado de modo representativo no histograma de FACS do meio, e apenas 1 dos 100 clones submetidos a triagem de células isoladas dificilmente exibiu qualquer fluorescência verde (histograma de FACS do lado direito).

Fig. 10: Esta figura ilustra a sequência da região codificadora da EGFP com uma mutação de terminação manipulada que foi usada para clonagem de uma construção repórter de EGFP para quantificar hipermutação somática. No painel (a) é mostrado quais dos quatro nucleotídeos foram mutados no códon 107 e 108 da fase de leitura aberta da EGFP, desse modo gerando um códon de terminação no códon 107 e gerando uma alteração de aminoácidos de lisina em treonina no códon 108. Estas quatro alterações de nucleotídeos resultaram adicionalmente na introdução de um sítio único de enzima de restrição Spel, como indicado, que podería ser usado como marcador de diagnóstico para reversões de códons de terminação por hipermutação somática. O nucleotídeo G do códon de terminação TAG está embutido em um chamado de motivo de sequência RGYW, que é sabido ser um sítio crucial para hipermutação somática. Em 24 clones revertentes analisados por digestão com a enzima de restrição Spel foi possível confirmar que o sítio foi tornado resistente a digestão com Spel (e, assim, foi mutado). Em dez destes clones, a análise de sequências revelou que o nucleotídeo G no códon de terminação TAG original tinha sido mutado em um nucleotídeo C, originando um códon TAC, desse modo confirmando a análise de enzimas de restrição e demonstrando que a mutação somática mediada pela Al D havia sido dirigida para o G do motivo RGYW.

(b) Este painel mostra a ORF completa da EGFP mutada que foi clonada na construção da cadeia Igy1 H retroviral já divulgada na Fig. 5(e), em vez de uma região codificadora de domínio V_H.

Figs. 11 (a) e (b): Ilustração da estratégia de clonagem detalhada de um vetor de expressão de cadeias IgH retroviral competente para recombinação V(D)J, como divulgado em detalhe no Exemplo 4.

Fig. 12: Prova de conceito de que construções retrovirais requerendo recombinação V(D)J de segmentos gênicos V, D e J em configuração “quase-linha germinativa” podem dar origem a construções de expressão de cadeias pesadas rearranjadas de modo produtivo e células lg+ por transdução em linfócitos precursores positivos para RAG1/RAG2. O painel (a) contém dados que mostram a geração de células positivas para imunoglobulinas de superfície (0,04%, quadrante de cima à direita do gráfico de FACS à esquerda) após transduPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 32/103 ção de um vetor de expressão retroviral competente para recombinação V(D)J (descrição detalhada da clonagem, ver Fig. 11) em uma linha de células pré-B transformadas com AMuLV 230-238. A expressão de imunoglobulinas é acoplada à expressão da EGFP usando construções como ilustrado de modo esquemático na Fig. 4c. Em consequência, células que 5 expressam imunoglobulinas só podem ser geradas na população de células verdes (isto é, transduzidas de forma estável). O painel de coloração à direita mostra a nova análise da expressão de imunoglobulinas de superfície após uma única ronda de enriquecimento por FACS e expansão das células com imunoglobulinas de superfície raras (0,04%) por 8 dias em cultura de tecidos. Após esta ronda única de enriquecimento, a freqüência combinada de 10 células positivas para imunoglobulinas tinha aumentado para 17.8% (como esperado, detetáveis na população verde, isto é, transduzida de forma estável), de onde foram obtidos e seqüenciados produtos de amplificação por PCR. (b). Como exemplo representativo, este painel mostra uma sequência de DNA (clone 225, com a tradução em aminoácidos em cima) obtida de um produto de amplificação por PCR derivado de células com imunoglobulinas de 15 superfície após uma ronda de enriquecimento que havia sido transduzida com vetores retrovirais competentes para recombinação V(D)J “quase-linha germinativa”. Como referência, as sequências das regiões codificadoras dos segmentos gênicos V, D e J são providas em (b) em cima, também com a tradução em aminoácidos sobre os segmentos gênicos V e J, pois a sequência do segmento D pode ser lida em três fases de leitura diferentes, dependendo 20 da diversidade na junção após a recombinação V(D)J. Sequências intermediárias entre os segmentos gênicos V, D e J na configuração “quase-linha germinativa” estão representadas com pontos. A sequência do clone 225 recuperado representa claramente um evento de rearranjo V(D)J bona fide, com características típicas de perda de nucleotídeos e adições de sequências N catalisadas por TdT claramente detetáveis nas junções codificadoras entre os 25 segmentos gênicos V, D e J reunidos (o clone 225 perdeu todas as sequências intermediárias). A sequência do clone 225 exibiu uma fase de leitura aberta e, para além das variações acima mencionadas nas junções codificadoras, não continha mutações somáticas adicionais nas sequências V, D e J.

Fig. 13: Os dados mostram a realização de testes em um painel de diferentes linhas 30 de células pré-B murinas transformadas com A-MuLV quanto à suscetibilidade a transferência genética com vetor derivado do MLV ecotrópico. 1 χ 10⁵ células foram transduzidas com uma MOI de 0,5 usando uma preparação vetorial que tinha empacotado o gene repórter EGFP abrangendo o vetor de transferência LEGFP-N1. A transdução foi efetuada como detalhado no Exemplo 5. Aos dois dias pós-transdução foi detectada transferência gênica por 35 expressão de EGFP, usando FACS. Excetuando a linha de células pré-B 18/81, todas as outras linhas de células pré-B transformadas com A-MuLV testadas foram suscetíveis à transdução a freqüências que variaram entre 40-60% nas condições aplicadas, e podem, em

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 33/103 princípio, ser usadas para a presente invenção. Células alvo não manipuladas e não tratadas serviram de controles negativos e não exibiram fluorescência verde (não mostrado).

Fig. 14: Caracterização de um painel de linhas de células pré-B murinas quanto à expressão intracelular de cadeias pesadas de IgM endógenas (cy-μΗ), para identificar célu5 Ias desprovidas de expressão de anticorpos murinos endógenos que possam ser usadas como células seletoras para apresentação retrocítica. As células foram permeabilizadas e coradas usando anticorpos anti-cadeias pesadas de IgM murinas acoplados a FITC (FL1). Células não tratadas serviram de controles negativos. O experimento mostra que as linhas de células FA-12, 1624-5, 1624-6, 18/81-CÍ8-11 e 40E1 tinham expressão de anticorpos en10 dógenos praticamente não detectável e, assim, podem ser usadas em um método da presente invenção.

Fig. 15: Ilustração da complexidade de vetores de expressão retrovirais seguindo a concepção divulgada na Fig. 4(c) e o princípio experimental para a geração de uma biblioteca de anticorpos misturados de cadeias IgH e IgL. (a) As bibliotecas de vetores retrovirais 15 lgH(650)-LIB-IRES-GFP e lgL(245)-LIB-IRES-YFP abrangem coleções definidas de regiões codificadoras para cadeias pesadas (HC) e leves (LC) para anticorpos totalmente humanos com uma complexidade de 650 e 245 clones diferentes e totalmente seqüenciados, respectivamente. Ambos os vetores albergam a sequência empacotadora Psi (ψ), que flanqueia repetições terminais longas (LTR) e um sinal interno de entrada do ribossomo (IRES). De 20 modo paralelo à expressão de uma cadeia polipeptídica de anticorpo mediada pelo promotor viral na 5’LTR, o IRES permite a expressão acoplada do gene repórter gfp e yfp, respectivamente. Por transferência gênica viral em células seletoras, isto permite a detecção e enriquecimento convenientes de células transduzidas com êxito e que expressam cadeias de imunoglobulinas usando FACS.

(b) Geração de uma coleção de anticorpos totalmente humanos em células pré-B transformadas. Para gerar células empacotadoras transitórias, bibliotecas de bibliotecas de vetores de transferência retrovirais que codificam cadeias pesadas de anticorpos humanos (lgH(650)-LIB-IRES-GFP) são co-transfectadas com uma construção empacotadora (pVPack-GP) e uma construção de envelope (pVPack-Eco) nas células receptoras adequa30 das. Aos dois dias pós-transfecção, a biblioteca gerada de partículas vetoriais tendo empacotada a respectiva biblioteca de vetores de transferência é coletada e empregada para transduzir células pré-B seletoras. As células transduzidas que expressam as cadeias pesadas transferidas e o gene repórter gfp são expandidas e enriquecidas usando FACS. Após a expansão, as células são sujeitas a uma segunda transdução. Desta vez, a biblioteca 35 lgL(245)-LIB-IRES-YFP é transferida, seguida de expansão e enriquecimento de células que expressam a YFP e cadeias leves humanas empregando FACS. A população resultante constitui um anticorpo totalmente humano que apresenta uma biblioteca de anticorpos huPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 34/103 manos definidos expressada por células 1624-5, contendo no máximo uma complexidade de 159’250 clones.

Fig. 16: Esta figura mostra como uma transdução em dois passos com bibliotecas IgH-IRES-GFP e IgL-IRES-YFP foi efetuada em condições que asseguram uma transdução, originando expressão clonal de cadeias polipeptídicas na vasta maioria das células transduzidas. 1,5 x 10⁶ células pré-B transformadas com A-MuLV murinas 1624-5 foram suspensas em 1 mL de meio de cultura de tecidos suplementado com diferentes quantidades de sobrenadante de partículas vetoriais (diluído 1:1; 1:5; 1:20; 1:50; 1:100; 1:200) contendo vetores retrovirais recombinantes que codificam bibliotecas de cadeias IgH e IgL IgH-LIB-IRES-GFP ou IgL-LIB-IRES-YFP, respectivamente, já descritas na Fig. 15. Para assegurar que a maioria das células transduzidas recebeu cópias isoladas de vetores de transferência integrados no genoma das células hospedeiras, células apresentando eficiências de transferência gênica menores do que 10% (MOI <0,1, detectado por expressão dos repórteres GFP ou YFP acoplados) foram enriquecidas usando triagem por FACS aos quatro dias pós-infecção. As células foram expandidas por seis dias e sujeitas a uma segunda transdução empregando partículas vetoriais tendo empacotadas as regiões codificadoras de cadeias leves de anticorpos a uma diluição de 1:5, como descrito acima. Aqui, células positivas para GFP selecionadas quanto a expressão de cadeias pesadas foram infectadas com partículas vetoriais transdutoras da biblioteca IgL-LIB-IRES-YFP e vice-versa. Aos quatro dias pós-infecção, as células transduzidas que expressaram GFP e YFP foram enriquecidas usando FACS. Aproximadamente 20% das células exibiu expressão de GFP e YFP após a segunda transdução. Para assegurar que ocorreram apenas integrações de um único vetor por célula, foi enriquecido cerca de um terço das populações que revelaram somente expressão baixa ou moderada do gene repórter transduzido na segunda ronda (aproximadamente 8%).

Fig. 17: Titulação da coloração de IL-15 com uma população de células pré-B que expressam um anticorpo de referência anti-IL-15 por FACS, para definir condições ótimas que permitam condições ótimas de coloração do antígeno IL-15 para experimentos de Apresentação Retrocítica. O procedimento de titulação, divulgado em detalhe no Exemplo 7, incluiu uma titulação do antígeno IL-15 no intervalo de 2,5pg/mL-0,1pg/mL, a duas concentrações diferentes de um anticorpo policlonal secundário anti-IL-15 biotinilado, como indicado, que foi detectado com conjugado estreptavidina-PE por FACS. Células lg+ de superfície foram contra-coradas com um anticorpo anti-cadeia IgKL-APC. Como pode ser observado, a coloração ótima de IL-15 é alcançada a uma concentração de 0,1 ou 0,5 pg/mL de antígeno IL-15 e usando 3 pg/mL para o anticorpo policlonal secundário anti-IL-15.

Fig. 18: Análise da identificação por FACS de uma linha de células pré-B que expressa um anticorpo de referência anti-IL-15 (PC = controle positivo), que foi enriquecida em uma biblioteca diversa de células pré-B que expressam anticorpos a diferentes diluições,

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 35/103 usando as condições de coloração otimizadas de IL-15 ilustradas e determinadas na Fig. 17. O painel de cima à esquerda mostra a coloração dupla de cadeia lgKL-APC/IL-15 de células pré-B de controle transduzidas com uma combinação de bibliotecas de cadeias IgH e IgL, cuja geração já foi mostrada na Fig. 16 (NC = controle negativo). O painel de cima à direita 5 mostra a coloração dupla de cadeia lgKL-APC/IL-15 de células pré-B transduzidas com vetores de expressão retrovirais que codificam cadeias IgH e IgL de um anticorpo de referência para IL-15 (PC = controle positivo), como divulgado em detalhe no Exemplo 7. O perfil de FACS das células NC mostra que aproximadamente 50% das células transduzidas com a biblioteca de Ab são lg+ de superfície, detectado pela coloração anti-cadeia lgid_-APC. No 10 entanto, nenhuma das células lg+ de superfície exibe ligação à IL-15. Em contraste, as células PC, nas quais mais de 90% das células expressaram Ig de superfície, uma ligação específica ao antígeno IL-15 é aparente por um sinal específico no eixo x. Como esperado, quanto maior a expressão de Ig de superfície nas células PC mais pronunciado é o desvio para o sinal específico da IL-15, originando um padrão de coloração diagonal de células lg+ de su15 perfície/de ligação a IL-15, que é salientado por um portal em forma de elipse, como indicado. O painel de baixo, que mostra colorações duplas por FACS para Ig de superfície e ligação de IL-15 em cinco diluições diferentes de células PC enriquecidas na população de células que expressa bibliotecas de anticorpos aleatórios NC, mostra que células PC que expressam um anticorpo de referência específico anti-IL-15 podem ser detectadas a freqüên20 cias próximas da percentagem de células PC enriquecidas na biblioteca de células NC.

Fig. 19: Prova de conceito do enriquecimento de uma população de células reativas com IL-15 por Apresentação Retrocítica por meio de uma biblioteca de anticorpos diversos, como divulgado em detalhe no Exemplo 7. O painel de cima mostra colorações por FACS quanto a expressão de GFP/YFP (eixo y), indicadoras da freqüência de células transduzidas 25 com vetor retroviral de Ig, e IL-15/anti-IL-15-bio (eixo x), indicador da coloração específica de IL-15. O painel de cima à esquerda mostra a análise de FACS com duas cores de células pré-B de controle não transduzidas (NC = controle negativo), o painel de cima do meio mostra a análise de FACS com duas cores de células pré-B transduzidas com um anticorpo de referência anti-IL-15 como controle positivo (PC). O painel de cima à direita mostra a mesma 30 coloração por FACS com duas cores de uma população de células que foram transduzidas com um único vetor retroviral que codifica cadeias IgH que codifica a cadeia IgH do anticorpo de referência anti-IL-15 em combinação com uma biblioteca diversa >7 χ 10⁴ cadeias IgxL diferentes. Em consequência, esta biblioteca misturada de cadeias IgL contém potencialmente >7 χ 10⁴ anticorpos diferentes, e como esperado, mesmo com uma janela muito 35 estreita para células que expressam anticorpos e reativas com IL-15, como indicado no perfil de FACS em cima à direita, foi possível detectar muito poucas células reativas com IL-15 (aqui 2,42%, devido à janela próxima da população negativa, como indicado). A população

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 36/103 enriquecida foi expandida em cultura de tecidos e o procedimento de coloração idêntico e triagem por FACS foram repetidos três vezes, como mostrado para as três colorações por FACS em condições idênticas nos três painéis de FACS de baixo. Como pode ser observado, ciclos consecutivos de enriquecimento/expansão de células originaram uma população 5 de células que foi quase 100% positiva para expressão de anticorpos e ainda mais positiva para reatividade com IL-15 do que a linha de células PC original. Estes dados mostram claramente que, por triagem por FACS e expansão repetidas, uma população de células altamente reativas com antígeno pode ser enriquecida com êxito para uma população de células essencialmente 100% reativas com antígeno, desde uma população de células reativas 10 com antígeno de modo quase não detectável, usando três rondas consecutivas de Apresentação Retrocítica.

Fig. 20: Esta figura ilustra e confirma a reatividade específica com o antígeno IL-15 de 4 representativos de 24 clones de células individuais estabelecidos após triagem de células isoladas a partir de uma população de células enriquecidas em antígeno IL-15 3 vezes, 15 como descrito na Fig. 19. Os 4 clones de células selecionados são chamados de clone F, H, V e W, e todos exibem reatividade específica com a IL-15 em células positivas para GFP/YFP, indicador dos vetores retrovirais codificadores de Ig transduzidos de forma estável. Como esperado, células que expressam mais altamente GFP/YFP, que expressam níveis mais altos de anticorpos, exibiram maior especificidade para a IL-15, conduzindo aos 20 sinais de coloração diagonais característicos nas colorações duplas de lg/IL-15. Todos os clones de células exibiram reatividade específica com a IL-15, demonstrada pela omissão do antígeno IL-15 nas colorações, o que conduziu a perda da reatividade específica com a IL15 (não mostrado). Os dados provêm prova de conceito de que a Apresentação Retrocítica é um método eficiente para obter clones de células reativos com antígenos, a altas freqüên25 cias, partindo de populações de células que exibem no início células reativas com antígenos quase não detectáveis.

Fig. 21: Este figura provê uma segunda prova de conceito para enriquecimentos com êxito por Apresentação Retrocítica de células reativas com antígenos por ilustração do enriquecimento com êxito de células reativas com o antígeno IL-1 β até uma população de 30 células reativas com o antígeno de essencialmente 40% usando três rondas consecutivas de apresentação retrocítica de enriquecimento de células/expansão em cultura de tecidos, partindo de uma população de células reativas de forma mínima com a IL-1beta na população de células inicial. São providas colorações duplas para expressão de GFP/YFP (indicadora da expressão de anticorpos) e reatividade com IL-1 β. São providas colorações por 35 FACS em cima para células seletoras pré-B não transduzidas (como controle negativo = NC, em cima à esquerda) e células co-transduzidas com vetores retrovirais codificadores de um anticorpo de referência específico anti-IL-1 β humana SK48-E26 (como controle positivo =

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PC, em cima à direita), como indicado. Os painéis de baixo mostram as colorações por FACS para expressão de anticorpos e reatividade com IL-1 β de uma biblioteca de anticorpos gerada por mistura de uma biblioteca diversa de cadeias IgL de > 1,2x10⁵ clones individuais de cadeias IgL contra a cadeia IgH do anticorpo de referência SK48-E26, antes (0 x enriquecidas) e após 1,2 e 3 rondas de enriquecimento por Apresentação Retrocítica, como indicado e como divulgado em detalhe no Exemplo 8. Estes dados provêm uma prova de conceito independente, usando um segundo antígeno, de que a expressão e enriquecimento por Apresentação Retrocítica é um meio poderoso para enriquecer uma população de células específicas para antígenos a partir de níveis inicialmente quase não detectáveis.

Fig. 22: Esta figura mostra a confirmação da reatividade com o antígeno IL-1 β de um novo anticorpo identificado por Apresentação Retrocítica, como divulgado em detalhe no Exemplo 8. A partir da população de células 3x enriquecidas, mostrada na Fig. 21,24 clones de células individuais foram estabelecidos por triagem de uma única célula. Destes 24 clones de células, 12 clones albergavam uma nova cadeia IgL, chamada de LCB24, como di15 vulgado no Exemplo 8. A especificidade para a IL-Ιβ da nova cadeia IgxL LCB24 coexpressada com a cadeia IgH do anticorpo de referência específico para a IL-1 β SK48-E26 (ver Exemplo 8) foi analisada por FACS por nova transdução dos vetores de expressão retrovirais de cadeias IgL e IgH, clonados e caracterizados quanto à sequência, na linha original de células seletoras. As colorações por FACS mostram a análise da expressão de anti20 corpos (via GFP/YFP) e reatividade com IL-1 β por FACS de duas cores, como indicado.

Como esperado, não é detectada reatividade com a IL-1 β em células seletoras não transduzidas (NC = controle negativo, à esquerda), ao passo que é detectada uma coloração clara específica de IL-1 β em células de controle positivo que expressam cadeias IgH e IgL do anticorpo de referência SK48-E26 (meio). Um sinal similar específico da IL-1 β é detectável em 25 células seletoras que expressam anticorpo transduzidas com o vetor de cadeia IgH do anticorpo de referência SK48-E26 e a nova cadeia IgxL LCB24 totalmente humana, clonadas de clones de células de Apresentação Retrocítica específicos para IL-1 β (direita).

Fig. 23: Confirmação da ausência de reatividade cruzada com a IL-15 do novo anticorpo codificado pela cadeia IgxL LCB24/cadeia IgH SK48-E25. As duas colorações por 30 FACS à esquerda mostram controles negativos e positivos para o ensaio de coloração por FACS da IL-15, como indicado (NC = controle negativo, células seletoras não transduzidas, PC = controle positivo, células seletoras transduzidas com vetores de cadeias IgH e IgL que codificam um anticorpo de referência anti-IL-15). As duas colorações por FACS à direita mostram ausência de reatividade com a IL-15 em células que expressam anticorpo que co35 dificam o novo anticorpo composto pelas cadeias IgH de SK48-E26 e IgL LCB24, ou em células que expressam a combinação original IgH/lgL de SK48-E26. Isto demonstra que o novo anticorpo composto pelas cadeias IgH de SK48-E26 e IgL LCB24 não só é específico

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 38/103 para a IL-1 β mas também não exibe geralmente reatividade cruzada (ou adere) com outras proteínas, como a IL-15.

Fig. 24: Esta figura ilustra o enriquecimento com êxito de células reativas com o antígeno estreptavidina-APC-Cy7 por três rondas consecutivas de enriquecimento de célu5 las/expansão em cultura de tecidos da Apresentação Retrocítica, a partir de uma biblioteca de anticorpos gerada por mistura de uma biblioteca de cadeias IgL diversas com uma biblioteca de cadeias IgH diversas, como divulgado no Exemplo 9. Células reativas com estreptavidina-APC-Cy7 foram enriquecidas por três rondas consecutivas de triagem de células de alta velocidade, seguida de expansão em cultura de células, como indicado. A especificida10 de de ligação de células que expressam anticorpos para o antígeno estreptavidina-APC-Cy7 é demonstrada analisando perfis de FACS das populações de células enriquecidas de forma seqüencial na presença (painel de baixo) e ausência (painel de cima) do antígeno. Isto demonstra uma prova de conceito para o enriquecimento eficiente de específico para antígenos por Apresentação Retrocítica na ausência de qualquer anticorpo de referência que pu15 desse ser usado para abordagens de mistura de cadeias.

Fig. 25: Os dados apresentados em esta figura provêm evidência da especificidade da população de células enriquecidas por Apresentação Retrocítica 3 vezes divulgada na Fig. 24 quanto a reatividade específica para o fluorocromo Cy7 do corante em série estreptavidina-APC-Cy7. Para esta finalidade, células seletoras não transduzidas, células não en20 riquecidas que expressam uma combinação de bibliotecas de cadeias IgH/lgL e uma população de células enriquecidas em estreptavidina-APC-Cy7 3 vezes foram analisadas por FACS quanto à expressão de anticorpos (indicada por fluorescência de GFP/YFP) e reatividade com diferentes conjugados de estreptavidina-fluorocromo, como indicado. A população de células 3 vezes enriquecidas em estreptavidina-APC-Cy7 ligou-se apenas a estreptavidi25 na-APC-Cy7, mas não a estreptavidina-APC nem a estreptavidina-APC-Cy5.5, e coloração inespecífica de estreptavidina-APC-Cy7 também não foi detectável para as células seletoras ou para as células seletoras que expressam uma biblioteca diversa de anticorpos. Isto provê prova de conceito para o enriquecimento eficiente e altamente específico por Apresentação Retrocítica de anticorpos específicos a partir de células que expressam uma biblioteca di30 versa de anticorpos, sem a necessidade de cadeias IgH ou IgL de anticorpos de anticorpos de referência específicos para antígenos.

Fig. 26: Dois novos anticorpos humanos identificados por Apresentação Retrocítica, que partilham a mesma cadeia IgH, exibem ligação específica ao antígeno estreptavidinaAPC-Cy7. Como divulgado no Exemplo 9, foi possível identificar duas sequências de cadei35 as IgH diferentes (HC49 e HC58) e duas sequências de cadeias IgL diferentes (LC4 e LC10) a partir de clones de células submetidas a triagem isolada após três rondas de enriquecimento por Apresentação Retrocítica. Em esta figura, todos os emparelhamentos possíveis

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 39/103 de cadeias IgL LC4 e LC10 com HC49 e HC58 foram examinados quanto à reatividade com o antígeno alvo estreptavidina-APC-Cy7. Para esta finalidade, combinações de vetores de expressão retrovirais que codificam as diferentes cadeias IgH e IgL foram transduzidas em células seletoras, como indicado e como divulgado no Exemplo 9. Como ilustrado, os novos 5 anticorpos HC58/LC4 e HC58/LC10, ambos partilhando a mesma cadeia IgH, exibiram ligação específica para o antígeno estreptavidina-APC-Cy7, ao passo que anticorpos codificados por HC49/LC4 e HC49/LC10 não exibiram atividade de ligação significativa. A ligação específica dos dois novos clones de anticorpos ao antígeno estreptavidina-APC-Cy7, por nova transdução em células seletoras, provê evidência conclusiva de que é possível usar 10 Apresentação Retrocítica como divulgado aqui para identificar anticorpos raros de ligação em bibliotecas de anticorpos complexas.

Terminologia

É conveniente notar aqui que “e/ou”, quando usado aqui, deve ser entendido como divulgação específica de cada uma das duas características ou componentes especificados 15 com ou sem o outro. Por exemplo, “A e/ou B” deve ser entendido como divulgação específica de cada um dos (i) A, (ii) B e (iii) A e B, tal como se cada um fosse aqui apresentado individualmente.

Maturação da afinidade: Um processo imunológico altamente regulado de aperfeiçoamento conduzido por antígenos das especificidades de ligação de anticorpos produzidos 20 por linfócitos B estimulados por antígenos, a maior parte ocorrendo em centros germinativos. O processo é causado por hipermutação somática, maioritariamente dirigida às regiões codificadoras para os domínios variáveis de anticorpos, acoplada à expansão e sobrevivência seletivas de linfócitos B geradores de anticorpos com afinidades mais altas.

Anticorpo: Este termo descreve uma imunoglobulina, quer seja natural ou produzi25 da, parcial ou totalmente, por via sintética. O termo também abrange qualquer polipeptídio ou proteína compreendendo um sítio de anticorpo de ligação a antígenos, como anticorpos apenas de cadeias pesadas, por exemplo, de camelos ou lamas. Um anticorpo completo compreende duas cadeias pesadas (H) idênticas e duas cadeias leves (L) idênticas. Na sua forma monomérica, duas cadeias IgH e duas IgL se reúnem em uma molécula de anticorpo 30 ligada por dissulfeto configurada em Y simétrico que tem dois domínios de ligação formados pela combinação das regiões variáveis das cadeias IgH e IgL.

Os anticorpos podem ser isolados ou obtidos por purificação de fontes naturais, ou então podem ser obtidos por engenharia genética, expressão recombinante ou por síntese química, e então podem conter aminoácidos não codificados por genes de imunoglobulinas 35 da linha germinativa. Um anticorpo totalmente humano compreende cadeias pesadas e leves humanas, isto é, domínios variáveis e constantes da espécie humana. Um anticorpo quimérico compreende domínios de regiões variáveis de uma espécie de vertebrado combiPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 40/103 nados com domínios de regiões constantes de outra espécie de vertebrado. Os domínios constantes de um anticorpo quimérico são habitualmente derivados de um anticorpo ou anticorpos humanos. Anticorpos humanizados podem ser produzidos por enxertia de CDRs de anticorpos não humanos em regiões de arcabouço de domínios variáveis de IgH e IgL de 5 origem humana.

Fragmento de anticorpo: Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo completo podem desempenhar a função de ligação de antígenos. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab que consiste em domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e 10 VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb, que consiste em um domínio VH ou VL; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados; (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio V_He um domínio V_L estão ligados por um agente de ligação peptídico, que permite a associação dos dois domínios para formar um sítio de ligação de antígenos; (viii) dímeros Fv de 15 cadeia simples biespecíficos, e (ix) “diacorpos”, fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão gênica. As moléculas Fv, scFv ou de diacorpos podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes dissulfeto que ligam os domínios V_H e V_L. Também podem ser preparados minicorpos compreendendo um scFv ligado a um domínio CH3. Outros exemplos de fragmentos de ligação são Fab’, que diferem de fragmentos Fab pela adição de 20 alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo, e Fab’ - SH, que é um fragmento Fab’ no qual o(s) resíduo(s) cisteína dos domínios constantes contém(contêm) um grupo tiol livre. Em alguns casos, uma cadeia pesada ou leve também pode ser considerada um fragmento de anticorpo. Como será claro para o profissional, todos os fragmentos de anticorpos acima 25 exibem pelo menos uma função do anticorpo nativo completo de onde são derivados esses fragmentos e, assim, são chamados de fragmentos “funcionais”.

Antígeno: Qualquer biomolécula ou entidade química que pode ligar-se aos domínios variáveis de imunoglobulinas (ou anticorpos).

Proteína de ligação: Este termo define uma proteína de um par de moléculas que 30 se ligam entre si. O parceiro de ligação de uma proteína de ligação é habitualmente chamado de ligante. As proteínas de um par de ligação podem ser derivadas de modo natural ou podem ser produzidas, total ou parcialmente, por via sintética. Uma proteína do par de moléculas tem uma área na sua superfície, ou uma cavidade, que se liga e, assim, é complementar a uma organização particular espacial e polar da outra proteína do par de moléculas. 35 Exemplos de tipos de pares de ligação são antígeno-anticorpo, biotina-avidina, hormônioreceptor de hormônio, receptor-ligante, enzima-substrato. A presente invenção visa, de preferência, reações do tipo antígeno-anticorpo.

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Região determinante de complementaridade (CDR): Este termo refere-se às regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves de uma imunoglobulina. CDRs são as regiões, na estrutura tridimensional de uma imunoglobulina, que estabelecem contato direto com antígenos. Tipicamente, um anticorpo contém 3 CDRs de cadeias pesadas e 3 CDRs 5 de cadeias leves. As CDRs são habitualmente as partes mais diversas de receptores de antígenos.

Domínio: Uma fração estrutural de uma biomolécula que é caracterizada por uma estrutura tridimensional particular (por exemplo, domínios de regiões variáveis ou constantes de imunoglobulinas que estão relacionados do ponto de vista estrutural, como domínios do 10 tipo Ig que podem ser encontrados em muitas moléculas do sistema imunológico, que pertencem à chamada superfamília Ig).

Centro germinativo: Uma estrutura histológica distinta em órgãos linfóides periféricos (por exemplo, nodos linfáticos ou baço) onde ocorrem interações cognatas entre células apresentadoras de antígenos e entre diferentes populações de linfócitos, resultando na ex15 pansão proliferativa de linfócitos reativos com antígenos, bem como maturação da afinidade e recombinação com mudança de classe de anticorpos produzidos por linfócitos B reativos com antígenos.

Configuração da linha germinativa: A configuração não rearranjada de genes e loci gênicos tal como são herdados dos pais e como serão passados para gerações futuras 20 através da linha germinativa. Eventos de recombinação de DNA que ocorrem em células somáticas, tais como, por exemplo, recombinação V(D)J em linfócitos, conduzem a nova mistura ou perda de informação genética em certos loci gênicos e, em consequência, a uma alteração dos genes da configuração da linha germinativa.

Linfócito pré-B: Um linfócito B precursor é caracterizado pela expressão de genes 25 específicos de células B precursoras particulares, tais como, por exemplo, os genes Λ5 e V_PreBi e V_PreB2, e expressão de fatores linfóides precursores específicos envolvidos na recombinação V(D)J (por exemplo, RAG-1, RAG-2). Adicionalmente, linfócitos B precursores são caracterizados pela presença de DJ_H em ambos os alelos de cadeias pesadas, ou pelo menos um rearranjo V_HDJ_H em pelo menos um alelo de cadeias pesadas de imunoglobuli30 nas, ao passo que os loci gênicos de cadeias leves ainda estão em uma configuração da linha germinativa não rearranjada, de modo que as células pré-B não conseguem expressar anticorpos completos.

Órgãos linfóides primários: Órgãos nos quais ocorre desenvolvimento de linfócitos a partir de células estaminais hematopoiéticas, em camundongos e humanos, por exemplo, a 35 medula óssea, o timo e, durante a vida fetal, o fígado.

Configuração “quase-linha germinativa”: O arranjo artificial de segmentos gênicos V, opcionalmente D, e J com sequências de sinal flanqueadoras de recombinação clonadas

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 42/103 de loci gênicos de imunoglobulinas da linha germinativa em construções genéticas artificiais, de modo que o arranjo dos segmentos gênicos V, opcionalmente D, e J em essas construções genéticas artificiais ainda permite a recombinação específica para sítios dos segmentos gênicos em uma região codificadora variável pelo processo de recombinação V(D)J.

Mutação somática: Um processo em células somáticas que origina a introdução de mutações pontuais em regiões específicas do genoma. Quando ocorre em alta freqüência (>10‘⁴ mutações por par de bases por divisão celular) é chamada de hipermutação somática.

Recombinação V(D)J: Este é o processo que gera diversidade de anticorpos e receptores de células T, e é o método pelo qual são criados genes de anticorpos funcionais. Envolve o rearranjo de muitos segmentos gênicos que codificam para as proteínas de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas, e só ocorre em linfócitos.

Transfectar/Transfecção: No contexto de células eucarióticas, este é o processo de introdução de sequências de ácidos nucléicos em células eucarióticas, habitualmente associado à utilização de métodos químicos e/ou físicos.

Transformar/Transformação: No contexto de células eucarióticas, este é o processo de imortalização de uma célula para estabelecer uma linha de células de proliferação contínua.

Transdução: O processo de distribuição de DNA em células de vertebrados via a produção de vírus recombinantes. Para esta finalidade, uma linha de células empacotadoras, expressando proteínas estruturais para partículas virais, é transfectada com uma construção de DNA viral recombinante compreendendo os elementos reguladores para empacotamento da construção de DNA viral nas proteínas estruturais virais. Deste modo são produzidos vírus recombinantes que podem ser usados para infetar células alvo (de mamífero), conduzindo à introdução da informação gênica clonada no genoma viral recombinante.

Vetor/Construção: Uma sequência de ácido nucléico gerada de modo artificial que pode ser usada para transportar elementos de ácidos nucléicos entre diferentes organismos e espécies e que também pode ser usada para propagar, amplificar e manter informação genômica.

Descrição Detalhada

Anticorpos, ou imunoglobulinas, são a classe mais disseminada de proteínas de ligação que demonstraram ser particularmente úteis para aplicações terapêuticas e de diagnóstico. Os anticorpos terapêuticos passaram a ser a classe de fármacos biológicos com maior êxito comercial, e há um interesse continuado em métodos novos e poderosos para desenvolver terapêuticas baseadas em anticorpos (Baker, 2005).

Os anticorpos consistem em duas glicoproteínas de cadeias pesadas (H) e cadeias leves (L) idênticas que estão ligadas de modo covalente via ligações dissulfeto (Fig. 2a). Cada polipeptídio de cadeia pesada (IgH) e leve (IgL) da imunoglobulina compreende um

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domínio variavel N-terminal, que varia entre diferentes anticorpos, e uma região constante C-terminal, que é idêntica entre diferentes anticorpos pertencentes ao mesmo subtipo (isotipo) de imunoglobulinas (Fig. 2a). A combinação de domínios variáveis de cadeias IgH e IgL cria a bolsa de ligação de antígenos de um anticorpo e determina a sua especificidade, ao passo que as regiões constantes determinam a função efetora imunológica de um anticorpo. A variabilidade dos domínios variáveis de imunoglobulinas resulta do fato de domínios V_H e V_L serem codificados por uma pluralidade de segmentos gênicos, que são chamados de segmentos gênicos V (variáveis), D (de diversidade) e J (de junção). Durante a diferenciação de linfócitos B, um segmento gênico V, um D (somente presente no locus da cadeia IgH) e um J são selecionados de modo aleatório em cada célula e são rearranjados de modo específico para sítios para gerar a região codificadora para domínios V_H ou V_L. Este processo de recombinação gênica específica para sítios só ocorre em linfócitos precursores e é chamado de recombinação V(D)J (Grawunder et al., 1998) (referem-se também as Figs. 2b e 2c). O rearranjo de segmentos gênicos é mediado por produtos dos genes ativadores da recombinação (RAG) 1 e 2. Devido à pluralidade de segmentos gênicos V, D e J e à imprecisão na junção de segmentos gênicos, pode ser gerado um repertório enorme de diferentes especificidades de regiões V pelos milhões de linfócitos B produzidos pelo sistema imunológico a cada dia (Grawunder et al., 1998). Uma vez que o locus gênico de cadeias pesadas de imunoglobulinas contém segmentos gênicos V, D e J, a região codificadora para um domínio V_H de um anticorpo requer dois eventos de rearranjo V(D)J seqüenciais, ao passo que o locus gênico de imunoglobulinas não tem segmentos gênicos D e a região codificadora V_Lé gerada por um evento de rearranjo V com J (Fig. 2c). Em consequência, a diversidade de junção que é gerada por recombinação V(D)J na região CDR3 de cadeias IgH é maior do que a diversidade de junção em CDR3 que é gerada por apenas um evento de rearranjo para as cadeias IgL. Adicionalmente, nos estágios iniciais de diferenciação de células B, durante os quais ocorrem rearranjos de genes de cadeias IgH, é expressada a enzima terminal desoxinucleotidil-transferase (TdT) que é capaz de adicionar nucleotídeos não modelados nas junções D com J e V com D (chamada de diversidade de sequências N), diversificando adicionalmente o repertório de CDR3 de cadeias IgH. Em contraste, o repertório de CDR3 da cadeia IgL, que é formado mais tarde por junção dos segmentos gênicos V com J durante a diferenciação de células B, quando a expressão da TdT está maioritariamente regulada de modo negativo (Li et al., 1993), é um pouco menos complexo. Para além da geração de diversidade de CDR3 em regiões codificadoras V_H e V_L, ambos os repertórios de cadeias IgH e IgL podem ser adicionalmente diversificados pelo processo de hipermutação somática, que é desencadeado em células B maduras durante uma reação imunológica dependente de células T (Papavasiliou & Schatz, 2002). As mutações somáticas são dirigidas de modo específico para as regiões codificadoras V_H e V_L e são mediadas pela enzima esPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 44/103 pecífica da linhagem B citidina-desaminase induzida por ativação (abreviada para Al D, ver: Papavasiliou & Schatz, 2002). Em consequência da hipermutação somática que ocorre durante a imunização, células que expressam mutantes de anticorpos com maior afinidade contra o imunogene são selecionadas de modo positivo durante uma imunização que ocorre 5 maioritariamente em centros germinativos, o que origina um enriquecimento de células produtoras de anticorpos com maior afinidade. Estes anticorpos agora também acumulam mutações nas CDRs 1 e 2, um processo chamado de maturação da afinidade do repertório de anticorpos. A diversificação mediada pela AID e direcionamento específico para regiões codificadoras V_H e V_L são aumentados de modo significativo pela presença de elementos ou 10 motivos genéticos de regulação c/s, em particular elementos intensificadores do locus gênico das cadeias IgH e IgL, localizados na proximidade das regiões codificadoras V_H e V_L rearranjadas (Bachl & Olsson, 1999).

Para além dos anticorpos terapêuticos completos clássicos, formatos adicionais de proteínas de ligação, compreendendo fragmentos de anticorpos totalmente humanos, por 15 exemplo, os chamados fragmentos F_ab (Fig. 2a), fragmentos F_v de cadeia simples (Fig. 2a), nanocorpos, consistindo apenas em domínios V_H isolados, etc., também estão cada vez mais a ser explorados como agentes terapêuticos e de diagnóstico. Todavia, é claro para o profissional que esses fragmentos de anticorpos funcionais podem ser facilmente derivados de anticorpos completos por métodos comuns de bioquímica em uma base protéica, ou en20 tão por métodos convencionais de biologia molecular se estiver disponível a informação codificadora de um anticorpo completo desejado.

Tradicionalmente, anticorpos monoclonais dirigidos contra uma molécula ou epítopo de interesse (antígeno) são gerados por imunização de pequenos animais de laboratório ou animais de herdades, por exemplo, camundongos, ratos, coelhos, ou cabras e burros, res25 pectivamente. Após imunizações repetidas, os animais são sangrados para o isolamento de anticorpos policlonais a partir do seu soro sangüíneo, ou então, para a geração de anticorpos monoclonais, os animais são sacrificados para isolar linfócitos de órgãos linfóides secundários, como nodos linfáticos ou o baço. Linfócitos isolados são fundidos a células imortalizadas de mieloma para a geração de hibridomas, que são subseqüentemente subclona30 dos e rastreados quanto à secreção de anticorpos monoclonais exibindo propriedades funcionais desejadas, tais como, por exemplo, ligação a um antígeno ou alvo particular.

Desde o primeiro grande desenvolvimento em engenharia de anticorpos, nomeadamente o desenvolvimento da tecnologia de hibridomas para a geração dos denominados anticorpos monoclonais por Kõhler e Milstein (Kõhler & Milstein, 1975), demorou muito tem35 po até ser possível usar anticorpos monoclonais para o tratamento de doenças humanas.

Os principais motivos da entrada lenta de anticorpos na clínica foram desvantagens iniciais associadas à utilização de anticorpos de roedores para o tratamento de pacientes

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 45/103 humanos. Se esses anticorpos forem infundidos no sistema imunológico de um paciente, o sistema imunológico reconhece os anticorpos de roedores como sendo proteínas estranhas e monta uma resposta imunológica contra estes anticorpos, incluindo a geração de anticorpos neutralizadores (chamada de resposta HAMA=anticorpos humanos-anti-camundongo).

Uma resposta HAMA pode conduzir a um decréscimo significativo do tempo de semivida e, assim, da eficácia do anticorpo aplicado, e pode mesmo conduzir a efeitos secundários graves se o sistema imunológico reagir em demasia contra a proteína não humana injetada.

Em consequência, teve grande interesse médico e comercial desenvolver anticorpos terapêuticos que eram “mais” similares a anticorpos humanos. Inicialmente, isto foi al10 cançado por engenharia genética de anticorpos existentes de roedores, originando o desenvolvimento de anticorpos quiméricos ou humanizados (Clark, 2000). Os anticorpos quiméricos são gerados por fusão dos domínios de ligação variáveis de um anticorpo de roedor às regiões constantes de um anticorpo humano, usando técnicas comuns de engenharia genética e clonagem. Os anticorpos humanizados, em contraste, são gerados apenas por trans15 ferência das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um domínio variável de um anticorpo de roedor para a região de arcabouço da região variável de um anticorpo humano, o que também é efetuado por técnicas comuns de biologia molecular. Apesar de o procedimento para gerar anticorpos quiméricos ser direto, estes anticorpos ainda contêm 33% de sequências xenogenéicas e albergam um potencial significativo de imunogenicidade 20 (Clark, 2000). De fato, respostas imunológicas às partes de camundongo de um anticorpo quimérico estão bem documentadas e são chamadas de respostas de HACA (HACA=anticorpos humanos anti-quimérico).

Em contraste com o mencionado acima, o potencial imunogénico de anticorpos humanizados está adicionalmente decrescido. No entanto, o procedimento de engenharia 25 genética de anticorpos humanizados e, ao mesmo tempo, manutenção das afinidades de ligação e especificidades originais dos anticorpos de roedores após enxertia de CDRs não é trivial, e muitas vezes requer otimização adicional extensa por ciclos repetidos de mutagênese e rastreio. Pelos motivos mencionados acima, as abordagens de quimerização e humanização foram se tornando menos apreciadas em anos recentes como método de eleição 30 para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos.

O afastamento das abordagens de anticorpos quiméricos e humanizados para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos também foi causado pelo desenvolvimento de plataformas tecnológicas inovadoras permitindo o desenvolvimento de anticorpos “totalmente humanos”, cujas sequências de aminoácidos são idênticas às de anticorpos do soro hu35 mano. Em teoria, pensa-se que anticorpos totalmente humanos causam a menor imunogenicidade e efeitos secundários em pacientes humanos.

As duas plataformas mais estabelecidas de desenvolvimento de “anticorpos totalPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 46/103 mente humanos” são as seguintes:

A) Tecnologia de camundongos transgênicos com imunoglobulinas humanas, na qual grandes transgenes de loci gênicos de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas humanas da linha germinativa foram introduzidos no genoma do camundongo (Green & Jakobovits, 1998; Jakobovits et al., WO 98/24893 A2). Para usar estes camundongos transgênicos para o desenvolvimento de anticorpos humanos, estas estirpes de camundongos transgênicos foram cruzadas com estirpes de camundongos submetidas a deleção gênica que albergam deleções funcionais em seus loci gênicos de cadeias pesadas e leves κ de imunoglobulinas endógenas de camundongos. Assim, estes camundongos transgênicos com imunoglobulinas humanas montam uma resposta imunológica humoral maioritariamente humana por imunização, com a exceção de aproximadamente metade das células produtoras de anticorpos ainda albergar cadeias leves λ endógenas de camundongo, que conseqüentemente são inúteis para o desenvolvimento adicional de anticorpos terapêuticos e é necessário descartar.

B) Tecnologia de apresentação em fagos, baseada na expressão (apresentação) de bibliotecas altamente diversas de fragmentos de anticorpos (por exemplo, como fragmentos F_v de cadeia simples ou F_ab) na superfície de bacteriófagos de E. coli (Clackson et al., 1991; McCafferty et al., WO 92/01047 A1). Para a identificação de agentes de ligação específicos, bibliotecas de fagos de complexidade, qualidade e origem apropriadas são ligadas a antígenos imobilizados (“método de imobilização”) para enriquecimento em clones de fagos que se ligam ao antígeno imobilizado. Após várias rondas de aderência sobre plástico são determinadas sequências de clones de ligação selecionados. Uma variação do método consiste na tecnologia de apresentação em ribossomos totalmente sem células, na qual fragmentos de anticorpos não são apresentados em fagos mas sim expressados por transcrição e tradução in vitro, em condições em que os agentes de ligação traduzidos ainda “aderem” a ribossomos (Hanes & Plükthun, 1997). Para a apresentação em fagos ou ribossomos, um passo crucial é a nova manipulação de fragmentos de ligação em anticorpos completos, que então são expressados em células de vertebrados. Após a nova manipulação de clones selecionados em fagos em um formato de anticorpo completo e expressão em células de vertebrado, é necessário analisar se os anticorpos podem ser expressados de modo adequado e se as características originais de ligação a fagos ainda estão mantidas, o que pode não ser necessariamente o caso.

Apesar de as tecnologias do camundongo transgênico com imunoglobulinas humanas e de apresentação em fagos terem tido um grande impacto no desenvolvimento de anticorpos terapêuticos, ambas as plataformas tecnológicas têm vantagens e desvantagens a elas associadas.

Uma vantagem da tecnologia do camundongo transgênico é o fato de poder produPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 47/103 zir anticorpos com alta afinidade, devido à maturação da afinidade natural que ocorre em estes camundongos por imunização in vivo, e foi demonstrado que o perfil de afinidade de anticorpos humanos para um dado antígeno derivado de camundongos transgênicos humanos pode ser comparável à de camundongos de tipo selvagem. No entanto, várias desvan5 tagens associadas aos animais transgênicos com imunoglobulinas humanas são as seguintes:

1) Se os animais transgênicos forem tolerantes para o antígeno, a maior parte das vezes devido a alta similaridade estrutural com proteínas hospedeiras expressadas de forma endógena, a geração de anticorpos de alta afinidade contra esses antígenos “conservados” 10 pode tornar-se muito difícil, ou mesmo impossível. 2) Tal como em animais normais do tipo selvagem, anticorpos de animais transgênicos com imunoglobulinas humanas são preferencialmente gerados contra epítopos antigênicos fortes, tornando em um desafio o desenvolvimento de um anticorpo contra epítopos funcionais mas fracos de valor terapêutico. 3) Por fim, animais transgênicos com imunoglobulinas humanas não podem ser usados para otimi15 zação da afinidade de anticorpos existentes. O motivo é que as janelas temporais requeridas para a geração de animais transgênicos, só para a otimização de um dado clone de anticorpo, são demasiado longas. Essa abordagem envolvería a geração de duas estirpes de camundongos transgênicos com cadeias IgH e cadeias IgL para um anticorpo particular e iria requerer, adicionalmente, o retrocruzamento genético destas duas estirpes transgênicas 20 em pelo menos duas estirpes de animais nocautes deficientes para expressão de cadeias pesadas de imunoglobulinas endógenas e de cadeias κ leves, um processo que necessitaria de várias gerações de ninhadas e janelas temporais prolongadas.

Limitações similares às descritas acima se aplicam a uma plataforma tecnológica recentemente descrita baseada no desenvolvimento de camundongos, na qual os segmen25 tos gênicos variáveis (V), de diversidade (D) e junção (J) da linha germinativa dos loci gênicos de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas de camundongo foram substituídos pelas (partes das) regiões gênicas V, D e J da linha germinativa humana por abordagem seletiva de genes específica para sítios (Murphy & Yancopolous, WO 02/066630 A1). Em esses camundongos knock-in para genes de imunoglobulinas”, os segmentos gênicos V, D e J 30 murinos foram substituídos, de modo específico para sítios, pelos de loci gênicos de cadeias pesadas e leves de genes de imunoglobulinas humanas via recombinação homóloga na linha germinativa do camundongo. Em contraste com camundongos transgênicos com imunoglobulinas humanas, que produzem anticorpos totalmente humanos, esta estirpe de camundongo produz então anticorpos “quiméricos reversos”, contendo regiões de ligação de 35 antígenos humanas em um esqueleto de regiões constantes de camundongo.

As abordagens de apresentação em fagos e/ou ribossomos têm a vantagem notada de serem plataformas tecnológicas muito rápidas, pois a identificação de primeiros agentes

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 48/103 de ligação a partir de bibliotecas complexas de proteínas de ligação pode ser feita em um período de algumas semanas. Todavia, a apresentação em fagos também está associada a desvantagens significativas. 1) Devido à ausência de qualquer maturação da afinidade no sistema, não é trivial identificar agentes de ligação com alta afinidade de um rastreio de 5 apresentação em fagos ou ribossomos. Para abordar este problema foram desenvolvidas bibliotecas de fagos extremamente complexas representando mais de 10¹² clones. Mas mesmo usando essas bibliotecas complexas, muitas vezes os clones de ligação iniciais têm uma afinidade sub-ótima para o antígeno, e habitualmente ainda é necessário otimizar esses agentes de ligação usando procedimentos adicionais de otimização entediantes e demo10 rados. 2) Na apresentação em fagos apenas são expressados fragmentos de anticorpos, como fragmentos scF_v ou F_ab, pois o genoma fágico só consegue acomodar regiões codificadoras para moléculas relativamente pequenas. 3) É necessário fundir as proteínas de ligação a proteínas transportadoras, como a proteína fágica glll. As proteínas de fusão resultantes revelam muitas vezes menor reatividade com antígenos comparadas com seus anti15 corpos paternos ou proteínas ativas para ligação (Hoogenboom & Chames, 2000). 4) A apresentação em fagos não permite facilmente uma reunião controlada de proteínas que alcançam um fenótipo de ligação pela formação de homo- e heteromultímeros, pois, por exemplo, proteínas diméricas são forçadas a se reunir por meio de moléculas de ligação covalente. Todavia, no caso da engenharia de anticorpos, é essencial uma reunião apropri20 adamente regulada de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas, pois nem todas as cadeias pesadas de anticorpos são capazes de emparelhar com qualquer cadeia leve. 5) Sistemas baseados em bactérias ou fagos bacterianos não provêm modificações pós-tradução apropriadas (glicosilação, miristoilação e afins) da proteína de interesse apresentada, o que muitas vezes influencia de modo negativo as características de ligação das proteínas ex25 pressadas. 6) A expressão procariótica origina diferentes enovelamentos protéicos de proteínas em comparação com células de vertebrado, pois o ambiente citoplasmático difere dramaticamente de células hospedeiras eucarióticas ou de vertebrado, por exemplo, quanto ao potencial redox e a ausência de chaperones. 7) Os sistemas de apresentação em fagos são subseqüentemente sujeitos a ensaios de ligação ou captura de antígenos para enrique30 cer células reativas em condições de “aderência sobre plástico” bastante não fisiológicas, o que pode conduzir à identificação de uma grande percentagem de agentes de ligação falsos positivos que acabará por ser necessário descartar.

Devido às desvantagens acima mencionadas, muitos fragmentos de anticorpos selecionados por apresentação em fagos têm afinidade medíocre e/ou podem conter artefatos 35 estruturais. Adicionalmente, depois de agentes de ligação selecionados por apresentação em fagos serem novamente manipulados e expressados na forma de anticorpos completos em células de vertebrado, pode suceder que anticorpos selecionados por fagos sejam fraPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 49/103 camente expressáveis ou não sejam expressáveis de todo, ou então que exibam características de ligação alteradas.

Para abordar algumas das limitações da tecnologia de camundongos transgênicos/“knock-in” com imunoglobulinas humanas e apresentação em fagos foi recentemente desenvolvida uma tecnologia alternativa que envolve a modificação genética de células préB murinas primárias in vitro, originando células que expressam anticorpos humanos, seguida da sua enxertia em camundongos receptores deficientes do ponto de vista imunológico desprovidos de um compartimento de células B funcionais (Grawunder & Melchers, WO 03/068819 A1). Este procedimento conduz a uma reconstituição parcial de subconjuntos de células B que expressam anticorpos humanos nos camundongos enxertados, que podem ser subseqüentemente imunizados com qualquer antígeno ou ligante desejado. Esta tecnologia pode ser usada para desenvolver novos anticorpos ou proteínas de ligação, ou então para otimizar anticorpos existentes no que se refere à sua afinidade contra um alvo definido (Grawunder & Melchers, WO 03/068819 A1).

A utilização em este método de sistemas de expressão retrovirais é preferida porque a transferência gênica de cópias isoladas de construções de expressão pode ser transferida para células pré-B individuais (Kitamura et al., 1995; Stitz J. et al., 2005), e também porque há completa liberdade de escolha quanto às construções de expressão de anticorpos a serem usadas para a enxertia para os camundongos (por exemplo, bibliotecas de anticorpos para antígenos pré-selecionados, bibliotecas de anticorpos de pacientes doentes ou clones de anticorpos individuais). Em consequência, uma vantagem particular desta tecnologia é a sua flexibilidade, podendo ser aplicada ao desenvolvimento de novo de anticorpos bem como à otimização de candidatos para anticorpos terapêuticos existentes.

Foram descritos outros sistemas baseados em roedores para o desenvolvimento de anticorpos totalmente humanos, que envolvem a transplantação de células progenitoras hematopoiéticas humanas isoladas de doadores humanos para camundongos com deficiência imunológica (Mosier & Wilson, WO 89/12823 A1). Em esses camundongos enxertados com células humanas, células B humanas podem se desenvolver em alguma extensão; no entanto, apesar de aperfeiçoamentos recentes deste método (Traggiai et al., 2004), uma resposta imunológica humoral satisfatória envolvendo maturação da afinidade de anticorpos humanos não é alcançada em esses “camundongos humanizados”. Além disso, tal como no caso de camundongos transgênicos com imunoglobulinas humanas ou “knock-in”, anticorpos existentes não podem ser otimizados.

Qualquer tipo de plataforma tecnológica de anticorpos baseada em camundongos requer habitualmente imunização in vivo, que continua a ser um processo demorado quando comparado com abordagens in vitro.

Em consequência, para além das abordagens mencionadas acima relacionadas a

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 50/103 camundongos, foi recentemente desenvolvida uma variedade de tecnologias in vitro alternativas. Todavia, ainda é necessário demonstrar quão eficientes serão estes sistemas no desenvolvimento de produtos de anticorpos de alta qualidade e alta afinidade. Um sistema in vitro é baseado no isolamento de células B de memória enriquecidas quanto a antígenos de pacientes humanos com uma doença particular que possam ser isoladas e depois imortalizadas por transformação pelo Vírus Epstein-Barr (EBV) in vitro, seguida do rastreio quanto a linhas de EBV reativas com antígenos (Lanzavecchia, WO 04/76677 A2). Similares no conceito mas diferentes na metodologia são abordagens nas quais células do plasma produtoras de anticorpos de pacientes com um estado de doença agudo são primeiramente isola10 das de sangue periférico e depois imortalizadas por fusão a heteromielomas não produtores, seguido do seu rastreio quanto a produtores de anticorpos desejados (Lang et al., WO 90/13660 A2). Em alternativa, foram descritos métodos que visam o isolamento de células B de indivíduos vacinados ou imunizados, seguido do isolamento e clonagem de genes de anticorpos específicos de populações de células (Lawson & Lightwood, WO 04/106377 A1;

Schrader, WO 92/02551 A1) ou por PCR em células isoladas (Muraguchi et al., WO 04/051266 A1). Todavia, todas estas tecnologias baseiam-se na disponibilidade de populações de células B relevantes em pacientes humanos e são bastante limitadas na sua aplicação geral; em consequência, são maioritariamente usadas para a identificação de candidatos a anticorpos terapêuticos anti-infecciosos. Além disso, nem a maturação da afinidade, 20 nem o desenvolvimento de anticorpos dirigido a antígenos nem a otimização de anticorpos existentes são possíveis com qualquer uma das abordagens de rastreio baseadas em células B humanas.

Em consequência, foram recentemente descritos métodos in vitro alternativos adicionais envolvendo a expressão e rastreio de anticorpos recombinantes em células eucarióti25 cas usando sistemas de expressão transitória (Zauderer & Smith, WO 02/102855 A2, e Beerli etal., WO 08/055795 A1). Apesar de estes sistemas ultrapassarem algumas das limitações associadas a camundongos transgênicos, apresentação em fagos e tecnologias derivadas de células B humanas, estes sistemas ainda são caracterizados por algumas limitações. Em primeiro lugar, as tecnologias conhecidas de expressão/rastreio de anticorpos ba30 seadas em células eucarióticas não conferem um padrão de expressão estável para anticorpos recombinantes, impossibilitando ciclos repetitivos de enriquecimento de células que expressam anticorpos com especificidade de ligação desejada. Em segundo lugar, nenhuma das abordagens conhecidas envolvendo expressão de anticorpos baseada em células eucarióticas permite controlar a expressão cional de clones de ligação, o que, no caso do desen35 volvimento de anticorpos terapêuticos, torna em um desafio identificar um par de cadeias IgH e IgL correspondentes com a atividade de ligação desejada para antígenos ou ligantes. Em terceiro lugar, a tecnologia descrita em Zauderer e Smith (WO 02/102855 A2) não perPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 51/103 mite qualquer mutagênese in vitro, nem recombinação genética dos anticorpos expressados: o método é um mero procedimento de rastreio. Em consequência, aspectos de maturação da afinidade de proteínas de ligação não são abordados por esta técnica. Por fim, nenhum dos sistemas de expressão eucariótica/ rastreio é compatível com a geração in situ de reper5 tórios de anticorpos diversos a partir de construções de expressão de anticorpos individuais explorando o mecanismo da recombinação V(D)J de segmentos gênicos V, D e J de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas.

Um método alternativo para a identificação de peptídeos e ácidos nucléicos biologicamente ativos foi proposto por Jensen etal. (EP 1 041 143 A). O método preferido descrito 10 em EP 1 041 143 A compreende um procedimento de rastreio inicial no qual um grande número de vetores retrovirais pode ser introduzido em células, de modo que a célula individual é capaz de expressar alguns RNAs ou peptídeos diferentes. As células que exibem uma alteração fenotípica são subseqüentemente isoladas, e o DNA retroviral em esse clone pode ser isolado por PCR. Este produto de PCR pode então ser usado para transfectar de novo 15 células empacotadoras virais, para criar vetores retrovirais adicionais. Estes vetores retrovirais podem depois ser usados para a transdução de diferentes células e, por fim, após um segundo procedimento de clonagem, a substância ativa pode ser identificada. Essencialmente, este método origina uma alteração indireta do fenótipo de uma célula pela importação de peptídeos ou ácidos nucléicos biologicamente ativos. Isto contrasta com o método da 20 presente invenção, no qual as construções transduzidas de modo retroviral codificam diretamente as proteínas de ligação, de preferência anticorpos, às quais é dirigido o rastreio. Também deve notar-se que a dimensão dos peptídeos e ácidos nucléicos descritos em EP 1 041 143 A difere grandemente da dimensão dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos identificados por métodos da presente invenção.

Outro método de rastreio genômico baseado em retrovírus é apresentado em WO

03/083075 A2 (Bremel et al.). Este método refere-se à expressão e rastreio de sequências de DNA genômico que codificam genes e proteínas não caracterizados. É descrito um processo no qual uma linha de células é transduzida com uma construção de expressão retroviral de modo que um vírus de DNA genômico é inserido no genoma da linha de células na 30 forma de um pró-vírus, e então a expressão de polipeptídios do pró-vírus é analisada de modo direto. Esse método não provê a oportunidade de enriquecimento da linha de células, nem o isolamento e identificação dos polipeptídios expressados antes de a análise ser efetuada, o que representa um afastamento da tecnologia de rastreio de alto rendimento desenvolvida por Bremel e colaboradores.

Um requerimento de patente recentemente publicado (WO 08/055795 A1) de Beerli e colaboradores descreve uma plataforma de rastreio para o isolamento de anticorpos humanos que utiliza um sistema de expressão do vírus Sindbis. Uma característica essencial

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 52/103 desta plataforma é a geração de uma biblioteca de partida onde células B específicas para um antígeno de interesse são diretamente isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores humanos. Bibliotecas de scFv reativos com antígenos e recombinantes são geradas a partir desta reunião de células B e são rastreadas por apresentação na superfície de células de mamífero usando um sistema de expressão do vírus Sindbis. De modo similar à apresentação em fagos, uma das desvantagens deste sistema é o fato de ser necessário manipular de novo e expressar os scFvs de interesse na forma de IgGs completas em células de vertebrado. Esse processo pode estar associado a perda de afinidade do anticorpo de interesse por conversão, pois estes anticorpos podem não ser bem expressados em células de vertebrado e/ou podem exibir características de ligação alteradas.

Em contraste, a invenção divulgada aqui compreende uma combinação única e extremamente poderosa de métodos para o desenvolvimento e otimização de proteínas de ligação, de preferência anticorpos, ou seus fragmentos. Em comparação com tecnologias baseadas em camundongos, as principais vantagens da invenção divulgada aqui consistem em completa flexibilidade em termos da otimização e desenvolvimento de novo de anticorpos e a rapidez de identificação de agentes de ligação específicos em curtos períodos de tempo. Uma vez que todos os aspectos da invenção são implementados in vitro, não há limitações relacionadas ao desenvolvimento de anticorpos contra antígenos, altamente conservados ao longo de espécies ou que possam ser tóxicos em animais experimentais.

Em comparação com tecnologias baseadas em apresentação em fagos, as vantagens chave da invenção divulgada aqui consistem no fato de as proteínas de ligação, em particular anticorpos, poderem ser expressadas na forma de anticorpos completos, em uma célula de vertebrado, e de preferência em um ambiente de linfócitos B, isto é, a célula hospedeira natural de anticorpos, assegurando o enovelamento protéico mais natural e apropriado, modificação pós-tradução correta e um controle de qualidade do emparelhamento de cadeias pesadas e leves.

Em comparação com abordagens baseadas em células B humanas, as vantagens chave da invenção divulgada consistem na completa flexibilidade relacionada ao desenvolvimento de anticorpos contra qualquer alvo desejado, a possibilidade de otimizar anticorpos existentes quanto à afinidade, uma total liberdade de escolha quanto ao tipo de anticorpo a ser expressado no sistema (enriquecido quanto a antígenos, sintético, de pacientes, em condições de mistura de cadeias IgH e IgL, etc.).

Em comparação com outros sistemas de expressão baseados em células eucarióticas envolvendo construções de expressão baseadas em plasmídeos ou vetores virais não de integração, vantagens chave da invenção divulgada da “Apresentação Retrocítica” consistem no fato de ser possível alcançar expressão estável, sustentada e clonal usando tecPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 53/103 nologia de transferência gênica retroviral. A expressão estável, sustentada e clonal de anticorpos recombinantes nas células alvo permite ciclos repetitivos de enriquecimento de células específicas para antígenos ou ligantes, incluindo a possibilidade de isolar e de expandir células monoclonais para identificação dos genes de anticorpos. Além disso, a invenção divulgada aqui permite adicionalmente a geração suplementar de diversidade gênica por transdução retroviral em células hospedeiras de vertebrado in situ usando construções retrovirais isoladas por exploração do mecanismo específico de linfócitos de recombinação V(D)J ou exploração do processo de hipermutação somática para mutagênese adicional de proteínas de ligação.

Em consequência, em comparação com qualquer uma das tecnologias conhecidas para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos conhecidos na área, o método de apresentação retrocítica divulgado aqui provê soluções únicas, novas e poderosas para muitas limitações evidentes que afetam tecnologias preexistentes.

A invenção divulgada aqui é amplamente aplicável à expressão, rastreio e identificação de proteínas de ligação que se ligam de modo específico a um ligante ou antígeno de interesse. Não obstante a invenção poder ser implementada com qualquer proteína de ligação, incluindo mas não se limitando a receptores ligados a membranas monoméricos, homoou hetero-multiméricos, como receptores de células T, citoquinas ou receptores de quimioquinas, mas também com outras proteínas de esqueleto, as proteínas de ligação preferidas de acordo com a invenção são anticorpos completos, sendo particularmente preferidos anticorpos totalmente humanos. Todavia, deve ser entendido que qualquer fragmento (funcional) de um anticorpo, incluindo mas não se limitando a fragmentos Fv de cadeia simples (scF_v), fragmentos Fab, F(ab’)2, domínios V_H ou V_L isolados, cadeias pesadas ou leves isoladas ou qualquer sua combinação, com qualquer modificação de ocorrência natural ou manipulada artificialmente, pode ser usado para implementar a invenção. No que se refere a anticorpos completos, a invenção é particularmente aplicável a qualquer tipo de modificações manipuladas ou concebidas de modo artificial de regiões de ligação de anticorpos, por exemplo, as geradas por mutagênese dirigida a sítios ou regiões, fusão de sequências de ocorrência natural de diferentes anticorpos, randomização de sequências CDR, mistura de DNA, PCR sujeita a erros, apenas para nomear alguns métodos a título ilustrativo.

Um método preferido para a expressão de proteínas de ligação de acordo com a invenção consiste em usar transdução mediada por vetores retrovirais de células hospedeiras de vertebrado.

A utilização de vetores de retrovírus tem sido investigada desde há muitos anos no domínio da terapia gênica. Por exemplo, para fabricar vetores de vírus adeno-associados (AAV) que possam ser dirigidos para tipos específicos de células, Perabo et al. (WO 03/054197 A2) inseriram sequências aleatórias que codificam peptídeos alvo no gene do

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 54/103 capsídeo viral, em um sítio crítico para ligação ao receptor celular primário, e produziram bibliotecas de AAV que apresentaram os peptídeos no contexto do capsídeo viral. A pressão seletiva provida pelo ambiente da cultura conduziu a seleção por meio da capacidade dos clones virais para concretizar cada passo do processo de infecção, nomeadamente a ligação, captação, retirada do revestimento, translocação nuclear, replicação e expressão gênica. Usando esta técnica foram gerados vetores que procederam à transdução, de modo eficiente, de células de leucemia. Não obstante essa técnica poder ser útil para gerar mutantes virais que infetam células alvo previamente resistentes a infecção por AAV de tipo selvagem, não provê a geração de coleções diversas de proteínas de ligação in vitro.

Como tal, os métodos descritos no presente requerimento para a expressão de proteínas de ligação têm várias vantagens chave relativamente a quaisquer outros métodos conhecidos na área para a expressão de proteínas recombinantes em células hospedeiras eucarióticas e/ou de vertebrado.

1) Construções retrovirais recombinantes são integradas de forma estável no genoma da célula hospedeira e, desse modo, conferem um fenótipo de expressão estável e sustentado da proteína de ligação. 2) Por utilização de rácios apropriados entre partículas retrovirais e células alvo, chamado de “multiplicidade de infecção” (MOI), de preferência realizada a uma MOI igual ou menor do que 0,1, a transdução retroviral pode ser controlada, de modo que a maior parte das células transduzidas de forma retroviral é geneticamente modificada somente por uma construção retroviral recombinante que integra o genoma da célula hospedeira, originando expressão clonal de pelo menos uma proteína de ligação desejada. Uma vez que a expressão clonal de proteínas de ligação facilita muito a identificação e clonagem de proteínas de ligação individuais, este aspecto representa então uma forma de realização preferida da invenção. No entanto, em uma forma de realização alternativa, a invenção também pode ser implementada usando transdução retroviral a MOIs maiores do que 0,1.

Apesar das vantagens acima mencionadas de transdução retroviral como base para apresentação retrocítica, a expressão de proteínas de ligação recombinantes em células hospedeiras de vertebrado também pode ser alcançada por métodos alternativos, tais como, por exemplo mas não se limitando a transfecção de DNA transitória ou estável, transfecção de RNA, ou por transferência de vetores virais baseados em DNA, como vetores de adenovírus ou vetores baseados em poxvírus - apesar de nenhum dos métodos alternativos acima mencionados permitir uma expressão estável e clonal facilmente controlável de proteínas de ligação em células hospedeiras de vertebrado.

Células hospedeiras de vertebrado preferidas para a implementação da invenção são células da linhagem de linfócitos B, em particular linfócitos B precursores, que muitas vezes estão desprovidos de expressão de anticorpos endógenos mas que expressam prote

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 55/103 inas acessórias favoráveis, tais como, por exemplo, chaperones para enovelamento apropriado de proteínas e reunião de anticorpos, ou proteínas membranares acessórias que facilitam a deposição membranar de moléculas de anticorpos, tais como, por exemplo, as proteínas Iga ou Ig3 específicas de células B.

O princípio da expressão de proteínas recombinantes por transdução retroviral em células hospedeiras de vertebrado é um procedimento estabelecido e envolve a construção de vetores retrovirais recombinantes, que são relativamente pequenos (dimensão máxima do DNA recombinante a ser incorporado: 8-10 kB) e que podem ser clonados e manipulados por métodos comuns de biologia molecular na forma de vetores plasmídicos, de onde pode 10 ser transcrito o genoma de RNA retroviral. Um genoma retroviral de tipo selvagem contém somente três genes, gag, pol e env, que codificam as proteínas nucleares do núcleo, uma integrase retroviral, protease, RNAse e uma transcriptase reversa, e proteínas de envelope, respectivamente (Fig. 3a). Adicionalmente, o genoma retroviral contém sequências reguladoras c/s, como a sequência Psi (ψ) requerida para empacotamento do genoma de RNA 15 retroviral em partículas de vírus, um sinal poliA para terminação do transcrito retroviral e, por fim, as chamadas repetições terminais longas (LTRs) 5’ e 3’, que contêm elementos promotores e sinais para integração retroviral no genoma da célula hospedeira (Fig. 3a). Para a construção de retrovírus recombinantes, as regiões codificadoras gag, pol e env de um retrovírus de tipo selvagem são substituídas por qualquer cassete de expressão para um gene 20 de interesse (Fig. 3a), incluindo elementos reguladores c/s relevantes, como promotores ou intensificadores. Para integrar de forma estável esses genomas retrovirais recombinantes em um genoma hospedeiro, é necessário que um vetor plasmídico contendo um genoma retroviral seja transfectado de forma transitória ou estável em uma denominada linha de células empacotadoras (PCL) retrovirais, que expressam as proteínas estruturais virais codifi25 cadas por gag, pol e env em trans de um modo transitório ou estável e, em consequência, permitem o empacotamento do genoma viral recombinante (o vetor de transferência) em partículas retrovirais incompetentes para replicação (Fig. 3b). Estas partículas retrovirais permitem a infecção (transdução) em uma única ronda de células alvo (Fig. 3b). A entrada da partícula retroviral em células alvo é mediada por uma interação específica da proteína 30 Env com um receptor específico na célula alvo. Assim, a natureza da proteína Env determina o tropismo das partículas retrovirais para células hospedeiras específicas que expressam o receptor cognato. Retrovírus ecotrópicos estão restringidos a células de roedores, retrovírus anfotrópicos podem infetar várias espécies, incluindo células de roedores e humanas, e retrovírus pantrópicos podem infetar qualquer células em replicação com uma membrana 35 celular, pois a entrada na célula ocorre via estruturas presentes em todas as membranas de células eucarióticas. Partículas de vetores retrovirais com uma variedade de tropismos diferentes também podem ser geradas usando proteínas de envelope heterólogas de outros

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 56/103 vírus, como o vírus da leucemia do macaco Gibão (GaLV), vírus da estomatite vesicular (VSV) ou HIV e SIV, ou mesmo proteínas de membranas celulares, apenas para nomear algumas a título ilustrativo - uma técnica chamada de “pseudotipagem”. Após a entrada na célula, um retrovírus pode distribuir o genoma viral na célula hospedeira, onde as proteínas 5 virais medeiam a transcrição reversa do genoma em cDNA e, por fim, a sua integração estável no genoma da célula hospedeira, permitindo a expressão estável dos genes distribuídos (Fig. 3b). Em uma forma de realização preferida da invenção, partículas de MLV ecotrópicas são usadas para mediar a transferência gênica para células B murinas. No entanto, será apreciado por qualquer profissional que qualquer vetor retroviral infeccioso submetido a 10 pseudotipagem com qualquer outra proteína de envelope ou transmembranar pode ser empregado para implementar a invenção, desde que medeie a transdução em qualquer célula seletora alvo apropriada independentemente da sua espécie doadora paterna, tipo de célula ou sua expressão de um receptor cognato que medeia a entrada do vetor na célula.

Para alcançar transferência gênica mediada por vetores retrovirais, partículas retro15 virais contendo vetores (contendo transcritos de genomas retrovirais recombinantes, ou vetores de transferência) podem ser coletadas do sobrenadante da cultura de células de células empacotadoras que expressam vetores de transferência de forma estável ou transitória (Fig. 3b). Isto pode ser efetuado em um intervalo largo de protocolos e suas variações, conhecidos do profissional. Formas de realização preferidas desta invenção incluem: 1) prepa20 ração de sobrenadantes contendo partículas retrovirais sem células usando passagem por um filtro apropriado ou um passo de centrifugação que separa células empacotadoras de partículas vetoriais. Estas preparações de partículas retrovirais são subseqüentemente usadas para a transdução de células hospedeiras de vertebrado por co-incubação por uma janela temporal variável ou efetuando uma chamada de “infecção com rotação”. Aqui, uma 25 suspensão de células alvo é misturada com meio contendo partículas retrovirais e é sujeita a centrifugação de baixa velocidade (Fig. 3b). 2) Em alternativa, a co-cultura de células alvo com células empacotadoras, permitindo o contato célula-célula ou separação de ambas as populações celulares por uma membrana que permite a passagem de partículas retrovirais mas não das células empacotadoras, pode ser efetuada para permitir a transdução de célu30 Ias alvo.

Como células hospedeiras alvo para transdução retroviral, uma forma de realização preferida do método consiste em usar células da linhagem de linfócitos B de roedores que não expressam proteínas imunoglobulinas murinas endógenas e que podem ser transduzidas com retrovírus de um intervalo de hospedeiros ecotrópicos. Células da linhagem de lin35 fócitos B têm a vantagem de já expressarem proteínas Iga e Ig3 específicas de células B que são favoráveis para expressão na superfície celular e ancoragem de imunoglobulinas completas ligadas a membranas. A esse respeito, células derivadas de células do plasma

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 57/103 negativas para imunoglobulinas, tais como, por exemplo, células de mieloma, por exemplo mas não se limitando a Sp2/0, NSO, X63 e Ag8653, em geral estão desprovidas das proteínas Iga e IgP acessórias para deposição de imunoglobulinas membranares. Em esses casos e em qualquer outra célula hospedeira de vertebrado, onde as proteínas Iga e IgP não são 5 expressadas, o método ainda pode ser aplicado se for conferida expressão das proteínas

Iga e Ig3 por transfecção ou transdução de vetores de expressão para Iga e Ig3, um procedimento comum para qualquer profissional. Assim, por expressão ectópica de ambas as proteínas Iga e Ig3, o método pode ser implementado com qualquer linha de células hospedeiras de vertebrado, desde que sejam produzidas partículas retrovirais com tropismo apro10 priado que sejam capazes de proceder à transdução dessa linha de células hospedeiras de vertebrado. Para clarificar, a inovação divulgada aqui pode ser implementada com qualquer célula hospedeira de vertebrado se forem usadas partículas retrovirais pantrópicas (por exemplo mas não se limitando a partículas submetidas a pseudotipagem com a proteína G do VSV) em conexão com uma célula hospedeira que foi modificada para expressar de mo15 do ectópico as moléculas de ancoragem de imunoglobulinas Iga e Igp.

Células preferidas da linhagem de linfócitos B são, por exemplo, mas não estão limitadas a células B precursoras, B de leucemia ou B de linfoma, de qualquer espécie de vertebrado, mas também células B precursoras primárias que podem crescer em cultura de tecidos por longos períodos de tempo. Linfócitos B precursores representam células hospe20 deiras ideais para expressão retroviral de imunoglobulinas, pois a maior parte dessas linhas de células não expressa proteínas imunoglobulinas endógenas. Em particular, linhas de células pré-B murinas podem ser obtidas com facilidade de qualquer estirpe de camundongo por transformação com o vírus da leucemia murina de Abelson (A-MuLV). No entanto, células pré-B primárias com proliferação de longa duração e células pré-B transformadas com A25 MuLV expressam as proteínas específicas de células pré-B VpreB e Λ5, que em conjunto formam a chamada cadeia leve substituta, a qual, na ausência de cadeias leves convencionais, pode formar complexos de receptores de células pré-B da cadeia pesada de imunoglobulina e cadeia leve substituta. Uma vez que é desejado expressar imunoglobulinas constituídas de cadeias pesadas e leves recombinantes, são preferidas células pré-B desprovidas 30 de expressão de componentes da cadeia leve substituta, compreendendo os produtos gênicos dos genes Λ5 ou VpreBI ou VpreB2 na forma de deleções de genes únicos, duplos ou triplos. Sendo conhecido que a cadeia leve substituta pode ligar-se a cadeias pesadas heterólogas, é esperado que a expressão da cadeia leve substituta possa interferir, em um grau variável, no rastreio de pares IgH/lgL, mas devido a níveis geralmente baixos de expressão 35 de proteínas da cadeia leve substituta em células pré-B, o método ainda pode ser implementado usando células pré-B do tipo selvagem que expressam componentes da cadeia leve substituta. Em resumo, qualquer linha de células de vertebrado que expressa Iga e IgP e

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 58/103 que não expressa proteínas imunoglobulinas endógenas pode ser usada como células hospedeiras alvo para o método, em que células pré-B deficientes na cadeia leve substituta são as células hospedeiras preferidas para implementar a invenção.

As proteínas de ligação preferidas a serem expressadas, rastreadas e identificadas são anticorpos completos, e quanto à sequência de aminoácidos, imunoglobulinas totalmente humanas. Todavia, deve ser entendido que qualquer proteína de ligação capaz de expressão celular em células de vertebrado pode ser sujeita a rastreio e seleção quanto a ligação a ligantes ou antígenos específicos de acordo com o método divulgado. Por exemplo, essas proteínas de ligação podem incluir fragmentos de anticorpos de qualquer espécie de 10 vertebrado, tais como, por exemplo, Fv de cadeia simples, fragmentos Fab (Fig. 2a) ou domínios V_H ou V_l isolados, ou uma cadeia pesada ou leve, de preferência expressados de um modo que permite a deposição na membrana da superfície celular. Isto pode ser efetuado, por exemplo, por fusão a âncoras membranares de outras proteínas transmembranares do tipo I, utilização de domínios de ancoragem de GPI ou outros métodos conhecidos na área.

Além disso, o método também pode ser aplicável a outras proteínas ligadas a membranas, por exemplo mas não se limitando a receptores de citoquinas monoméricos ou multiméricos, ou receptores diméricos de células T e afins. A expressão retroviral de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas é efetuada, de preferência, por transdução seqüencial de construções de expressão retrovirais separadas para cadeias pesadas e leves. No entanto, a in20 venção também pode ser implementada efetuando uma co-transdução das células alvo, em que são usadas construções retrovirais separadas para cadeias IgH e IgL. A expressão separada de cadeias IgH e IgL a partir de vetores retrovirais diferentes oferece a vantagem de coleções de vetores retrovirais que codificam uma coleção diversa de cadeias pesadas de imunoglobulinas poderem ser combinadas de modo aleatório com coleções de vetores de 25 expressão retrovirais que codificam uma coleção diversa de cadeias leves de imunoglobulinas. Esta denominada mistura de cadeias pesadas e leves pode criar um grau largo de diversidade de especificidades de ligação de imunoglobulinas diferentes, mesmo quando o número total de coleções de cadeias pesadas e leves é limitado (por exemplo, 10⁴ cadeias pesadas diferentes combinadas de modo aleatório com 10⁴ cadeias leves diferentes origina, 30 em teoria, 10⁸ especificidades de anticorpos diferentes). A mistura de coleções de vetores de cadeias IgH e IgL é preferivelmente efetuada com uma mistura em um lado, significando que uma cadeia polipeptídica de um anticorpo é uma única construção que codifica uma única cadeia de anticorpo.

Contudo, deve ser entendido que também pode ser efetuada expressão retroviral 35 de cadeias IgH e IgL se ambas as proteínas forem codificadas no mesmo esqueleto retroviral (ver abaixo). Na sua configuração mais fácil, a expressão de cadeias pesadas e leves é conferida por clonagem de cDNAs de cadeias pesadas e leves em um vetor retroviral vazio,

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 59/103 no qual a expressão é conduzida pela atividade promotora da 5’LTR e o processamento apropriado de RNA é mediado pelas sequências 3’LTR (Fig. 3a). As construções de cadeias pesadas devem conter, de preferência, a sua região codificadora endógena abrangendo membranas, para permitir a deposição membranar ótima das imunoglobulinas recombinan5 tes. Todavia, para os profissionais, é claro que também domínios que abrangem membranas de outras proteínas transmembranares podem ser fundidos às regiões constantes de anticorpos, para assegurar deposição superficial das imunoglobulinas modificadas expressadas. Em particular no contexto da expressão de fragmentos de anticorpos, ou da expressão de proteínas de ligação diferentes de imunoglobulinas, diferentes regiões transmembranares de 10 proteínas ligadas a membranas podem ser vantajosas para expressão dos agentes de ligação na superfície celular.

Não obstante a expressão na superfície celular de anticorpos ou seus fragmentos ser uma forma de realização preferida da presente invenção, estas biomoléculas também podem ser expressadas, em alternativa, na forma de proteínas segregadas solúveis, de mo15 do que a detecção do anticorpo é efetuada em fase fluida. Essa forma de expressão pode ser vantajosa se o rastreio de clones produtores e agentes de ligação isolados envolver um ensaio que requer anticorpos solúveis, ou se o ensaio for efetuado em meio semi-sólido com um ensaio que permite a quantificação de níveis de expressão e especificidades de ligação em clones de células isoladas. Podem ser empregados vetores de expressão para imuno20 globulinas recombinantes que codificam para todos os isotipos conhecidos de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas, os quais, no caso de anticorpos totalmente humanos, permitem a expressão de anticorpos IgM, IgD, IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgAi, lgA₂ e IgE, contendo cadeias leves Igx ou IgÀ. Em todos os vetores de expressão retrovirais para cadeias pesadas e leves humanas, é preferido que apenas a região codificadora variável de uma 25 cadeia pesada e leve humana seja substituída usando enzimas de restrição únicas, tais como, por exemplo mas não se limitando a Hindlll e Eco47llI, como ilustrado na representação esquemática de vetores retrovirais de expressão de anticorpos (4a e 4b). Isto irá permitir uma fácil clonagem e substituição de regiões codificadoras variáveis em vetores de expressão retrovirais, com bibliotecas de regiões V ou regiões codificadoras de regiões V individu30 ais, na estrutura com as regiões codificadoras constantes de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas. Esse esquema de permutar apenas domínios de regiões variáveis, visando gerar vetores de expressão que codificam uma única especificidade ou visando gerar uma coleção de proteínas de ligação, será favorável. A este respeito, podem ser expressados anticorpos completos que contêm domínios de regiões variáveis e domínios de regiões 35 constantes derivados de espécies diferentes (anticorpos quiméricos).

O vetor de expressão retroviral mais simples para proteínas de ligação pode ser construído por inserção de uma região codificadora de cDNA para a proteína de ligação ou

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 60/103 gene de interesse em um esqueleto de vetor de expressão retroviral “vazio” (Fig. 3a). Mesmo na ausência de qualquer marcador de seleção e/ou marcador de rastreio (por exemplo, proteína verde fluorescente intensificada, EGFP) que permita a detecção direta de células transduzidas, a invenção pode ser implementada porque células que expressam de forma 5 estável proteínas de ligação a partir dos vetores retrovirais podem ser identificadas e isoladas com base na expressão estável das proteínas de ligação, em forma segregada ou em forma ligada a membranas. No entanto, são preferidas várias características incluídas nos vetores de expressão retrovirais. A primeira consiste em um elemento promotor constitutivo ou indutível forte que conduz a expressão das proteínas de ligação recombinantes, que é 10 colocado diretamente a montante das regiões codificadoras de cDNA (Fig. 4a, b). Esses promotores podem ser, por exemplo, mas não se limitando a promotores constitutivos, como o promotor do CMV inicial imediato, promotor da β-actina, promotor de EF-1a, ou promotores indutíveis, como o promotor indutível por tetraciclina ou qualquer outro antibiótico, que podem regular a expressão de modo positivo ou negativo por adição ou remoção de tetraci15 clina ou outros antibióticos e seus derivados, como doxiciclina. A inclusão de elementos promotores indutíveis nas construções de expressão retrovirais é outra forma de realização preferida, pois é conhecido que, em alguns esqueletos de vetores retrovirais, os promotores 5’LTR ou mesmo promotores constitutivos fortes podem ser silenciados.

Para além de elementos promotores, em uma forma de realização preferida são in20 cluídos genes marcadores nas construções de expressão retrovirais, que subseqüentemente permitem a seleção e/ou monitoração de transdução retroviral estável de células hospedeiras sem detecção das proteínas de ligação recombinantes (Fig. 4a, b). Marcadores de seleção e/ou rastreio são particularmente úteis para o protocolo preferido de transdução retroviral em dois passos, envolvendo a transdução seqüencial de vetores de expressão 25 retrovirais de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas. Em um protocolo de transdução em dois passos, uma célula hospedeira de vertebrado é primeiramente transduzida com pelo menos uma construção de expressão retroviral que codifica uma primeira cadeia ou cadeias polipeptídicas de imunoglobulinas, e depois de a primeira pelo menos uma cadeia polipeptídica ser expressada de forma estável, uma segunda transdução com pelo menos 30 uma construção de expressão retroviral que codifica a outra cadeia ou cadeias polipeptídicas de imunoglobulinas correspondentes, desse modo permitindo a geração de um anticorpo completo ou coleção de anticorpos. Se um marcador de seleção ou rastreio for usado para a seleção ou rastreio de um primeiro evento de transdução com êxito, será muito útil otimizar as freqüências de co-transdução de pelo menos duas construções de expressão 35 retrovirais que codificam cadeias separadas de uma proteína de ligação multimérica, como anticorpos. Em consequência, a utilização de marcadores de seleção e/ou rastreio é fortemente preferida.

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Marcadores de seleção que conferem resistência a antibióticos úteis para a seleção de células de mamífero incluem mas não estão limitados, por exemplo, a genes para resistência a puromicina, neomicina, higromicina B, ácido micofenólico, histidinol, bleomicina e fleomicina. Para a expressão de proteínas multiméricas, como anticorpos, codificadas por 5 construções retrovirais separadas, é preferível que a expressão de diferentes cadeias polipeptídicas esteja ligada a diferentes marcadores de seleção, desse modo permitindo a seleção separada para a transdução estável de construções de expressão correspondentes.

Genes marcadores, que permitem a monitoração da transdução retroviral em células hospedeiras, incluem mas não estão limitados a genes que conferem auto-fluorescência 10 a células transduzidas, tais como, por exemplo, mas não se limitando à proteína verde fluorescente (GFP), proteína verde fluorescente intensificada (EGFP), proteína amarela fluorescente (YFP), proteína azul fluorescente (BFP) e proteína vermelha fluorescente (RFP). Em alternativa, podem ser usados marcadores da superfície celular, como CD7 ou suas variantes truncadas, CD34 ou suas variantes truncadas, ou receptor do fator de crescimento dos 15 nervos de baixa afinidade. Em uma forma de realização preferida, a expressão destes marcadores de seleção em antibióticos, marcadores de fluorescência ou marcadores da superfície celular está acoplada à expressão da proteína de ligação recombinante via as chamadas de sequências internas de entrada do ribossomo (IRES), que permitem, em células de vertebrado, a co-expressão acoplada de dois genes de um único elemento promotor (Fig. 4b). 20 Todavia, o profissional também pode implementar a invenção por expressão de um gene de seleção e/ou marcador de um cassete de expressão separado contido na construção retroviral, conduzido por um elemento promotor adicional. Para a expressão de proteínas multiméricas, como imunoglobulinas, a partir de vetores retrovirais separados, é preferido que diferentes cadeias de proteínas de ligação estejam ligadas a diferentes marcadores de seleção 25 e/ou rastreio, desse modo permitindo a monitoração separada para a transdução estável das diferentes construções de expressão.

No caso de a expressão da proteína de ligação recombinante ser conduzida por um promotor separado, como esboçado acima, qualquer gene marcador de seleção ou rastreio também pode ser clonado a jusante da 5’LTR e a jusante da 5’LTR e sinal empacotador ψ, 30 de modo que a sua expressão é conduzida pelo promotor 5’LTR (ver Figs. 3 e 4).

Como mencionado acima, uma forma de realização preferida da invenção consiste em expressar anticorpos recombinantes, ou seus fragmentos, em células da linhagem de linfócitos B, de preferência em linfócitos pré-B. Em consequência, também é preferido conduzir a expressão de anticorpos recombinantes por combinações promotoras e intensifica35 doras que se sabe conferirem expressão em alto nível seletivamente em células da linhagem B. Essas combinações de promotores/intensificadores podem ser, por exemplo, mas não estão limitadas a combinações de promotor da cadeia leve κ de imunoglobulinas, íntron

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 62/103 κ e intensificador 3’k, ou combinações de cadeia pesada de imunoglobulina, íntron da cadeia pesada e intensificador 3’α. A combinação de combinações de promotor da cadeia leve κ de imunoglobulinas, íntron κ e intensificador 3’k é preferida (Fig. 4a, b), pois é conhecido que esta combinação permite expressão em alto nível de cadeias de imunoglobulinas em células da linhagem B e porque esta combinação de elementos gênicos de regulação c/s é capaz de promover hipermutação somática para regiões codificadoras de anticorpos em uma forma regulada, mediada pela enzima específica de células B ativadas Al D (citidina desaminase induzida por ativação), o que é uma forma de realização da invenção como adicionalmente detalhado abaixo.

No entanto, qualquer profissional pode apreciar que a expressão de um anticorpo recombinante particular em vetores retrovirais para implementar a invenção pode ser efetuada por qualquer combinação de elementos promotores/ intensificadores de regulação c/s e regiões codificadoras que permitem a expressão do anticorpo na célula hospedeira de vertebrado desejada, quer na membrana da superfície celular quer em forma segregada.

Apesar de ser uma forma de realização preferida desta invenção expressar proteínas de ligação multiméricas, como anticorpos, a partir de construções de expressão retrovirais separadas (Fig. 4a e b), a invenção também pode ser implementada se a expressão de diferentes cadeias protéicas de proteínas de ligação multiméricas estiver ligada na mesma construção de expressão retroviral. No caso de imunoglobulinas, isto pode ser feito, sem limitação, por expressão das cadeias pesada e leve de um promotor e separação das regiões codificadoras para cadeias pesadas e leves por sequências IRES. Em esta alternativa, é preferido clonar a cadeia pesada diretamente a jusante do promotor e a cadeia leve a jusante do IRES, pois é sabido que um gene após o IRES é muitas vezes expressado em níveis um pouco mais baixos do que o gene a montante do IRES. Uma vez que cadeias leves são as moléculas mais pequenas, é antecipado que é alcançada uma melhor expressão estequiométrica de cadeias pesadas e leves via ligação por IRES, se a expressão de cadeias leves for controlada via IRES.

Em alternativa, pode ser alcançada co-expressão de duas cadeias de uma proteína de ligação dimérica, como um anticorpo, por clonagem de dois cassetes de expressão separados em um único esqueleto retroviral, de modo que a expressão de cada cadeia de proteína de ligação individual é controlada de modo separado. Como substituto desta abordagem, também é possível ligar a expressão de duas cadeias de proteínas de ligação diferentes no mesmo vetor usando promotores bidirecionais que conferem atividades de transcrição em sentidos opostos. A última opção tem a vantagem potencial de não ocorrer interferência promotora, que pode afetar de modo negativo os níveis de expressão de promotores próximos.

Deve ser salientado que, independentemente da organização genética detalhada

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 63/103 de vetores retrovirais que albergam duas regiões codificadoras de proteínas de ligação, por exemplo, cadeias pesada e leve de imunoglobulinas, este método permite uma única transferência gênica retroviral de pares de proteínas de ligação para células alvo, o que permite um controle facilitado de expressão clonal de proteínas de ligação diméricas e reduz a jane5 Ia temporal para a geração de uma população de células que expressa um agente de ligação, em comparação com um protocolo de transdução retroviral em dois passos.

Para além de elementos gênicos de regulação c/s, como promotores e intensificadores, e genes marcadores selecionáveis ou rastreáveis, como marcadores de resistência a antibióticos e genes codificadores de proteínas auto-fluorescentes, as regiões codificadoras 10 para cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas podem ser clonadas nos vetores de expressão retrovirais em diferentes contextos.

Em uma forma de realização preferida da invenção, as regiões codificadoras de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas são clonadas em construções de expressão retrovirais na forma de sequências de cDNA contíguas, incluindo sequências líder requeridas 15 para expressão e/ou secreção superficiais apropriadas. Exemplos da concepção básica desses vetores de expressão com elementos intensificadores estão representados na Fig. 4a. De preferência, as cadeias pesadas codificam isotipos de cadeias pesadas γ1 humanas e as cadeias leves isotipos de cadeias leves k; todavia, deve ser entendido que podem ser empregados quaisquer outros isotipos de cadeias pesadas e leves da espécie humana ou 20 de outros vertebrados para implementar a invenção. Em esses vetores de expressão de cDNA retrovirais é preferido incluir uma enzima de restrição única na junção entre as regiões codificadoras variável e constante, que permite a substituição de apenas regiões codificadoras V_H e V_L para alterar a especificidade dos anticorpos expressados, ou que permite a inserção de uma pluralidade de regiões codificadoras V_H e V_L para a expressão de bibliotecas 25 de anticorpos retrovirais diversos nas células alvo. Em uma forma de realização preferida, o sítio de enzima de restrição introduzido nas bordas de ν_Η-Ογ1 e V_l-Ck é um sítio Eco47lll (Fig. 4a, b), que não altera a composição de aminoácidos das cadeias pesadas expressadas e apenas conduz a uma substituição conservada de aminoácidos de treonina em serina na primeira posição da região codificadora κ constante, o que não afeta as propriedades de 30 ligação de moléculas IgGi humanas expressadas de forma retroviral.

Como alternativa a construções retrovirais contendo a informação codificadora para anticorpos heterólogos, de preferência totalmente humanos, em configuração de cDNA, podem ser empregados vetores de expressão retrovirais contendo as regiões codificadoras em configuração genômica, com a estrutura típica éxon-íntron de cadeias pesadas e leves de 35 imunoglobulinas na linha germinativa. Uma vez que vetores retrovirais serão transcritos em mRNA por empacotamento de partículas retrovirais, essa organização de construções de expressão requer que a organização de transcrição das regiões codificadoras tenha o senti

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 64/103 do oposto à orientação de transcrição da 5’LTR do genoma retroviral, pois de outro modo o vetor de transferência retroviral já estaria processado, pelo que a estrutura éxon-íntron seria perdida antes da transdução e integração estável da construção recombinante nas células alvo. No entanto, estas construções oferecem a funcionalidade de anticorpos poderem ser 5 expressados como anticorpos ligados a membranas ou segregados, dependendo da natureza da célula alvo para a transdução e da capacidade da célula alvo para terminar a transcrição no códon de terminação interno para anticorpos segregados, ou por processamento alternativo de um doador de processamento a montante do códon de terminação para anticorpos segregados, até receptores de processamento dos éxons que abrangem membranas 10 de imunoglobulinas ligadas a membranas.

Um aspecto preferido da invenção é a geração e utilização de construções de expressão retrovirais para anticorpos humanos, ou qualquer anticorpo heterólogo ou seu fragmento, em que a região codifícadora variável da cadeia pesada e/ou leve ainda necessita de ser reunida, nas células alvo, a partir de segmentos gênicos V, opcionalmente D, e J em 15 configuração “quase-linha germinativa” pelo processo de recombinação V(D)J. Ilustrações da concepção básica desses vetores de expressão estão representadas na Fig. 4 b, que ainda partilham a característica das construções não rearranjáveis de que cassetes V-D-J ou V-J da “linha germinativa” para cadeias pesadas e leves podem ser substituídos por sítios únicos de enzimas de restrição, incluindo de preferência Eco47lll na borda 3’ da região 20 codifícadora do elemento J. Os elementos V, D e J contidos em esses vetores são flanqueados por sequências de sinal de recombinação (RSSs) conservadas que é sabido serem motivos de reconhecimento para os genes ativadores da recombinação (RAG) 1 e 2. Por coexpressão de RAG1 e RAG2 em qualquer célula de vertebrado, esses vetores irão recombinar, de modo específico para sítios, segmentos gênicos V, opcionalmente D e J de modo a 25 gerar as regiões V_H e V_L que codificam os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves de anticorpos, respectivamente. A expressão de genes RAG-1 e RAG-2 e, assim, a atividade de recombinação V(D)J estão normalmente restringidas a linfócitos precursores iniciais. Em consequência, a utilização preferida de linfócitos precursores para implementar a invenção provê automaticamente a atividade para recombinação V(D)J. Todavia, é sabido, por super30 expressão de RAG-1 e RAG-2, que qualquer linha celular somática de vertebrado pode ser tornada competente para recombinação V(D)J e, assim, qualquer profissional também pode implementar este aspecto da invenção com qualquer linha celular de linfócitos não precursores ao conferir expressão ectópica de RAG-1 e RAG-2. Em alternativa, podem mesmo ser empregadas linhas de células deficientes em RAG-1 ou RAG-2, em que a deficiência em 35 RAG-1 ou RAG-2 é complementada por super-expressão do gene RAG correspondente, ou seu fragmento.

Essas construções rearranjáveis por V(D)J têm a vantagem, a partir de uma única

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 65/103 construção de expressão retroviral que é transduzida de modo estável em uma célula hospedeira de vertebrado, de poder ser gerado um repertório diverso de especificidades de anticorpos via recombinação V(D)J mediada por RAG-1 e RAG-2.

Apesar de ser conhecido que a reunião de elementos gênicos V, D e J envolve um grau alto de imprecisão que contribui de modo significativo para as sequências de aminoácidos diversas encontradas na região determinante de complementaridade (CDR) 3 de V_H e V_L, é preferido empregar uma coleção de construções retrovirais V-D-J-Ογΐ e V-J-Ck, representando várias famílias de regiões V, elementos D e J, para aumentar a variabilidade logo ao nível das sequências providas de segmentos gênicos da linha germinativa. Ainda assim, a utilização preferida de construções retrovirais, permitindo a reunião somática de segmentos gênicos V, opcionalmente D, e J mediada pelo processo de recombinação V(D)J, permite a geração de uma grande diversidade de regiões de ligação de domínios variáveis por transdução em linfócitos precursores in situ, de modo que pode ser gerada uma coleção diversa de cadeias IgH e IgL a partir de uma única ou de números limitados de construções.

A diversidade gerada pela reunião imprecisa de segmentos gênicos V, D e J é grandemente aumentada pela presença do gene expressado de modo específico em linfócitos precursores desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT), que é a única DNA polimerase que é capaz de adicionar nucleotídeos a extremidades 3’ de DNA sem um filamento de DNA modelo complementar. Para aumentar a diversidade na junção é preferido empregar células com níveis altos de expressão de TdT endógena ou então, em alternativa, expressar de modo ectópico a TdT nas células hospedeiras alvo usadas para apresentação retrocítica, por métodos conhecidos na área.

Outra forma de realização da invenção consiste na utilização de construções retrovirais rearranjáveis por V(D)J contendo mais do que um segmento gênico V, ou D ou J, de modo que, pelo processo de recombinação V(D)J, diferentes segmentos gênicos V, D e J podem ser usados em diferentes clones rearranjados da mesma construção. A incorporação de uma pluralidade de diferentes segmentos gênicos V, D e J em essas construções só é restringida pela capacidade total de vetores retrovirais aceitadores de DNA, o que é relatado no máximo no intervalo 8-10 quilobases.

Apesar de a utilização de construções retrovirais competentes para recombinação V(D)J (Fig. 4a, b, painéis de baixo) para a expressão de anticorpos heterólogos, ou seus fragmentos, ser um aspecto da presente invenção, é claro que a geração de um repertório diverso via esta abordagem está maioritariamente restringido à geração de diversidade nas regiões CDR3 de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas, muito similar à característica de um repertório de anticorpos primários gerado durante a linfopoiese B inicial.

Uma característica distintiva do sistema imunológico adaptativo é a sua capacidade de maturação da afinidade de domínios variáveis de anticorpos, baseada na hipermutação

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 66/103 somática de regiões codificadoras de domínios variáveis. É sabido que a hipermutação somática é fortemente intensificada pela enzima citidina desaminase induzida por ativação (AlD). A hipermutação somática em alto nível depende adicionalmente da presença de elementos intensificadores de regulação c/s do locus gênico da imunoglobulina, e foi muito claramente descrito um efeito benéfico para combinações dos elementos intensificadores íntron IgK e 3’k. Em consequência, um aspecto da presente invenção consiste na utilização de construções de expressão retrovirais contendo estes elementos de regulação c/s para expressar de forma retroviral essas construções de expressão de imunoglobulinas em células alvo que expressam de forma endógena ou ectópica a enzima Al D, de forma constitutiva ou indutível, por métodos conhecidos na área.

A aplicação de “Apresentação Retrocítica” no contexto de construções retrovirais competentes para hipermutação somática e no contexto de células hospedeiras que expressam a Al D permite uma diversificação adicional de um anticorpo in situ, após transdução em células hospedeiras que expressam a Al D.

A combinação destes aspectos da invenção recapitula todos os eventos moleculares e genéticos que ocorrem no sistema imunológico adaptativo, nomeadamente a geração de um repertório de anticorpos primários a partir de uma ou de um número limitado de construções compreendendo um número limitado de segmentos gênicos V, D e J e a hipermutação somática adicional mediada pela Al D das regiões codificadoras para domínios variáveis de anticorpos de ligação a antígenos.

A seleção específica de agentes de ligação de anticorpos de afinidade mais alta para antígenos desejados pode ser alcançada por Apresentação Retrocítica via ligação acrescida a antígenos desejados de escolha detectada por tecnologia comum baseada em FACS, seguida de triagem celular preparativa de alta velocidade de agentes de ligação de antígenos fortes. Desse modo, agentes de ligação fortes podem ser isolados de modo seletivo, e os genes de anticorpos codificados pelos vetores retrovirais podem ser isolados de novo, clonados e seqüenciados a partir de células ou clones de células selecionados por métodos comuns de biologia molecular, conhecidos na área, incluindo mas não se limitando a métodos genômicos e RT-PCR.

Em uma forma de realização preferida, o passo final de triagem celular é efetuado na forma da triagem de uma única célula, permitindo o isolamento clonal e expansão final de clones de células reativos com antígenos, o que facilita a clonagem e determinação da sequência da região codificadora de pares de cadeias IgH e IgL cognatas a partir de agentes de ligação selecionados.

Se desejado, células enriquecidas por FACS podem ser expandidas em cultura e, opcionalmente, podem ser sujeitas de novo a ligação a antígenos e triagem celular de alta velocidade repetida de células altamente reativas, um processo que, opcionalmente, pode

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 67/103 ser aplicado de modo repetido até ser alcançada a intensidade de coloração desejada e, assim, a especificidade de ligação esperada para um antígeno desejado (Fig. 1). Este enriquecimento seletivo e expansão in vitro de células reativas com antígenos imitam o desenvolvimento seletivo de agentes de ligação de maior afinidade que ocorre em reações imuno5 lógicas dependentes de células T.

Deve ser notado que o enriquecimento auxiliado por triagem celular de alta velocidade de células reativas com antígenos é somente um método preferido de implementação da invenção, mas também podem ser aplicados outros modos de seleção e isolamento de células quanto à reatividade com antígenos, tais como, por exemplo, mas não se limitando a 10 métodos de imobilização, nos quais células são ligadas a antígenos imobilizados em um suporte sólido. Além disso, é possível enriquecer células reativas com antígenos por abordagens micromanipuladoras, por exemplo, mas não se limitando a crescimento de células em condições de diluição limitante em placas de microtítulo ou na forma de clones de células em meio semi-sólido, o que permite a coloração e/ou etiquetagem quanto a antígenos 15 específicos de clones de células e sua identificação por vias auxiliadas por microscópio, seguido da recolha manual e/ou robótica de clones reativos com antígenos.

Outra forma de realização da invenção consiste em efetuar ciclos repetitivos de seleção de antígenos/ triagem por FACS/expansão de células reativas com antígenos na presença de condições de mutagenização, dirigindo especificamente mutações para as regiões 20 codificadoras de domínios de ligação variáveis de anticorpos. Por esta abordagem, mutantes com afinidade mais alta, que são gerados in situ, são gerados em cada ronda de amplificação de células. Por triagem de células e enriquecimento de células exibindo ligação acrescida a antígenos por apresentação retrocítica, mutantes com maior afinidade podem ser enriquecidos e expandidos de modo seletivo. Pode ser alcançada uma alta taxa de mu25 tações dirigida a domínios de regiões variáveis de anticorpos por super-expressão da enzima Al D nas células que expressam anticorpos, em particular quando as construções de expressão contiverem elementos promotores e intensificadores de regulação cis, incluindo mas não se limitando a elementos intensificadores íntron κ de imunoglobulinas e 3’k, que é sabido conferirem hipermutação somática mediada pela Al D a regiões variáveis de anticor30 pos (Fig. 4a e b). Não obstante essa abordagem poder ser implementada usando células que expressam a Al D de modo constitutivo, de forma endógena ou ectópica, um aspecto da invenção emprega vetores de expressão da Al D, em que a expressão da Al D pode ser induzida e desligada de novo usando promotores indutíveis, por exemplo mas não se limitando a sistemas promotores indutíveis de tetraciclina e/ou doxiciclina (Gossen & Bujard, 1992), em 35 que a expressão de um gene de interesse é controlada por um promotor do CMV mínimo flanqueado por repetições em série do operon tet procariótico, e que pode ser induzido ou suprimido para expressão usando uma proteína de fusão HSV-VP16- repressor Tet, cuja

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 68/103 ligação ao operon tet é controlada de forma alostérica por tetraciclina ou derivados da tetraciclina.

A presente invenção é explicada em mais detalhe nos seguintes exemplos não limitadores.

EXEMPL01

Clonagem de vetores de expressão retrovirais para cadeias pesadas de imunoglobulinas (IgH) e cadeias leves de imunoglobulinas (IgL) totalmente humanas contendo marcadores de seleção dos fármacos antibióticos higromicina B e puromicina, respectivamente

Como mencionado antes, a invenção pode ser implementada com vetores de ex10 pressão retrovirais para proteínas de ligação de diferentes concepções (comparar, por exemplo, Figs. 4a-c). Como exemplo de uma das concepções vetoriais que podem ser usadas para implementar a invenção, é descrita aqui a estratégia de clonagem detalhada para vetores de expressão retrovirais que permite a expressão de anticorpos IgGi/KL totalmente humanos e a seleção quanto à manutenção estável destes vetores em células alvo usando 15 marcadores de resistência a antibióticos.

a) Construção de vetores de expressão retrovirais para cadeias pesadas de imunoglobulinas (IgH) humanas

Como ponto de partida para a construção de vetores de expressão retrovirais para cadeias pesadas de imunoglobulinas humanas usou-se o vetor retroviral disponível no mer20 cado pLHCX (BD-Clontech, Mountain View, CA) (Fig. 5a). O pLHCX contém um gene marcador de resistência à higromicina B conduzido pelo promotor 5'LTR do esqueleto retroviral. Adicionalmente, o pLHCX contém o promotor inicial imediato do CMV seguido de um único sítio múltiplo de clonagem (MCS) para inserção de genes de interesse a serem expressados. Adicionalmente, o esqueleto do pLHCX contém um sítio único conveniente de enzima 25 de restrição Bglll a montante do promotor do CMV (Fig. 5a), onde podem ser clonados elementos gênicos adicionais.

Uma forma de realização preferida da invenção consiste em usar a enzima de restrição Eco47llI para clonagem na estrutura de regiões codificadoras V_H humanas até regiões codificadoras de cadeias pesadas γ1 constantes humanas, pois este sítio particular de en30 zima de restrição pode ser introduzido na junção entre regiões codificadoras V_H e Cy1 sem alterar a composição de aminoácidos de cadeias IgH expressadas. No entanto, o pLHCX contém um sítio de enzima de restrição Eco47lll no sinal empacotador ψ (Fig. 5a), que impediría a utilização direta de Eco47lll para a estratégia acima mencionada de clonagem de regiões V_H. Para remover este sítio inconveniente de enzima de restrição Eco47lII do esque35 leto do vetor pLHCX, o seguinte primeiro passo de clonagem preparatória foi realizado como detalhado na Fig. 5a. O sítio Eco47lll no sinal empacotador ψ foi removido por mutagênese dirigida a sítios usando um estojo comercial Quikchange™ (Stratagene, La Jolla, CA) que

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 69/103 substitui o terceiro nucleotídeo C da sequência de reconhecimento de Eco47lll AGCGT por um A, usando pares de “primers” específicos que conferem a mutação desejada de acordo com as instruções do fabricante. O vetor modificado foi chamado de pLHCX-m1, e foi checado que esta substituição de um único par de bases no sinal empacotador ψ (Psi) não afetou a eficiência da transdução retroviral do vetor modificado pLHCX-m1 (dados não mostrados).

No esqueleto do pLHCX-m1 foram clonados em paralelo cDNAs que codificam a região constante para a Ογ1 humana com ou sem regiões codificadoras que abrangem membranas M1 e M2. Os fragmentos de DNA Ογΐ-m e Ογΐ-s foram amplificados por RTPCR usando como modelo cDNA de linfócitos do sangue periférico humano e os “primers” direto e reverso Seq-ID1, Seq-ID2, Seq-ID3 (ver abaixo). Para a amplificação por RT-PCR da forma ligada a membranas da IgG humana foi usada a combinação de “primers” Seq-ID1 e Seq-ID2, e para a clonagem da versão segregada da IgG humana foi usada a combinação de “primers” Seq-ID1 e Seq-ID3. Os “primers” direto e reverso de amplificação por PCR continham sítios de enzimas de restrição HindIII e Ciai, respectivamente, permitindo a clonagem direcional dos fragmentos amplificados por PCR nos sítios únicos HindIII e Ciai a jusante do promotor do CMV no pLHCX-m1 (Fig. 5a). O “primer” direto de amplificação por PCR continha adicionalmente um sítio Eco47lll interno útil para fusão na estrutura de regiões V_H até às regiões constantes, sem alterar a composição de aminoácidos das cadeias pesadas IgGi completas expressadas. Os “primers” reversos de amplificação por PCR Seq-ID2 e Seq-ID3 continham sítios adicionais Notl internos que permitem a digestão por enzimas de restrição da construção diretamente a jusante da região codificadora, para fins de clonagem geral, por exemplo, a troca da expressão de diferentes isotipos de Ig pela região codificadora de regiões constantes.

Seq-IDl: 5'-GATCAAGÇTTMÇGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC-3'

HAndIÃI/Eee.4?ÍI I

O “primer” Seq-ID2 foi usado como “primer” reverso para amplificação por PCR da versão segregada da IgGi humana em conjunto com Seq-ID1 e continha um sítio único Notl (sublinhado) para fins de clonagem.

Seq-102:5' -GATCATCGATgCCGCCgCTCΑΤΊT ACCCGC-AGAÇAGGGAGAGG-3¹ClaL ! Notl

O “primer” Seq-ID3 foi usado como “primer” reverso para amplificação por PCR da versão ligada a membranas da IgGi humana em conjunto com Seq-ID1 e continha um sítio único Notl (sublinhado) para fins de clonagem.

Seq-ID3:5'-GATCATCGATGCGGCCGCTAGGÇC CCCT GCC TGAT CATGTTC-3 ^f

Cl^T / Not-I

Os produtos de PCR resultantes de cerca de 1,0 kb para a versão segregada da Cy1 humana e de cerca de 1,2 kb para a versão ligada a membranas da Cy1 humana foram

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 70/103 digeridos com as enzimas de restrição Hindlll e Ciai e foram clonados de modo direcional em paralelo nos sítios compatíveis de enzimas de restrição de pLHCX-m1, originando os plasmídeos pLHCX-m1-CYl-s e pLHCX-m1-CYl-m, respectivamente (ver também a Fig. 5b). Foi então possível clonar regiões de cadeias V_H na estrutura com as regiões codificadoras para a Cy1 humana segregada ou ligada a membranas usando enzimas de restrição únicas Hindlll e Eco47l11, flanqueando fragmentos de regiões V_H (Fig. 5b). Esta combinação de enzimas de restrição só muito raramente é encontrada em regiões codificadoras V_H humanas de todas as 7 famílias de segmentos gênicos V humanos.

Para construir um vetor de expressão da cadeia pesada de IgGi humana completa, uma região codificadora V_H humana de um anticorpo totalmente humano previamente identificado, específico para ΝΙΡ-Ovalbumina, foi inserida nas construções pLHCX-m1-CYls e pLHCX-m1-Ογ1 m na forma de um fragmento Hindlll-Eco47lll, originando os plasmídeos pLHCX-m1-VHCYls e pLHCX-m1-VHCy1 m, respectivamente (Fig. 5c). A região codificadora V_H para o anticorpo humano específico para ΝΙΡ-Ovalbumina, incluindo a sequência líder e sítios de clonagem 5’-Hindlll e 3’Eco47lll, é provida na Seq-ID4. Deve notar-se que dois nucleotídeos C adicionais haviam sido adicionados a montante do ATG de início para tradução melhorada (aproximação de uma sequência de consenso de Kozak):

Seq-ID4:

AAGCTTCCATGGAGTT TGGGCTcAGCT GGGTTTTCCTTGT TGC Γ C TTΐ 1'AAGAGGTGTCC AG TGTCAGGTGCAG CTGGTGGAGTCTGGG GGAGGCGTGGT CCAGC C TGGGAGGT CCCTGAGACT CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTfiGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTC CAGGCAAGG GGC T G GAGTGGGTGGCAG TTATATCATAT GATGGAAG CAATΑΆΑΤACTACGCA gactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgca AATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAATGGTCGACCACG CGGAAAGCTACTACTACTA.CTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTC TCTAGCGCT

Os sítios de enzimas de restrição Hindlll e Eco47lll para clonagem estão sublinhados na Seq-ID4. O ATG de início da sequência líder começa na posição 9.

Não obstante estes vetores de expressão da cadeia pesada da IgGi humana representados na Fig. 5c já serem suficientes para implementar a invenção e para efetuar apresentação retrocítica em combinação com vetores de expressão retrovirais da cadeia IgL, a funcionalidade do direcionamento da hipermutação somática para regiões codificadoras V_Hrequer a presença de certos elementos intensificadores de regulação c/s dos loci gênicos de cadeias leves ou pesadas de imunoglobulinas. Uma vez que é sabido que os elementos intensificadores íntron κ e 3’k do locus gênico da cadeia leve κ são capazes de dirigir a hipermutação somática para regiões V localizadas a jusante de um promotor ativo, os vetores de expressão retrovirais básicos da cadeia pesada de Ig humana pLHCXml-VHCglm e pLHCXml-VHCgls (Fig. 5c) foram adicionalmente modificados do modo seguinte para conterem elementos intensificadores íntron κ e 3’κ. A sequência do intensificador íntron κ muriPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 71/103 ηο (κίΕ) está localizada em uma região intergênica com cerca de 2,3 kb de comprimento entre o elemento Jk5 e a região codificadora κ constante, cuja sequência pode ser derivada da entrada V00777 do NCBI-Genbank. Ο κίΕ do núcleo compreende apenas cerca de 0,5 kb em esta região intergênica, e a sua sequência pode ser derivada da entrada X00268 do

NCBI Genbank. O fragmento completo de 2,3 kb desde Jk5 até Ck, incluindo a região κίΕ, contém um sítio interno Bglll, impedindo a utilização desta enzima de restrição para clonagem de um fragmento genômico amplificado por PCR nos vetores pl_HCX-m1-VHCYl-s e pl_HCX-m1-VHCYl-m. No entanto, não há nenhum fragmento de enzima de restrição BamHI interno em esta região, desse modo permitindo a clonagem de um fragmento de PCR ge10 nômico flanqueado por um sítio BamHI em vetores linearizados com Bglll pLHCX-modlVHCyls e pLHCX-m1-VHCYlm (Fig. 5c). Foram construídos vetores contendo ambas as regiões intergênicas completas de cerca de 2,3 kb entre Jk5 e Ck por amplificação por PCR deste fragmento genômico de DNA genômico de camundongo usando os “primers” direto e reverso Seq-ID5 e Seq-ID6, ambos contendo sítios adicionais de enzima de restrição BamHI 15 (sublinhados) para clonagem no sítio único de enzima de restrição Bglll de pLHCX-m1VHCyls e pLHCX-m1-VHCYlm, dando origem aos plasmídeos pLHCX-m1-VHCYls-κίΕ e pLHCX-m1-VHCYlm-KÍE, respectivamente (Fig. 5d).

S e q-1D 5: 5'-GATCGGATCCGTACACTTTTCTCATCTT TTTTTATGTG-3'

BamHI

Seg-ID6: 5'-GATCGGATCCCTGAGGAAGGAAGCAÇAGAGÇATGG-3'

BamHI

Para além da inserção do fragmento genômico completo contendo κίΕ de cerca de

2,3 kb do locus gênico da cadeia leve κ de camundongo, também um fragmento de PCR 20 genômico mais curto, de cerca de 0,8 kb (posição 3634-4394 de V00777, Seq-ID7), contendo ο κίΕ do núcleo, foi clonado no sítio único Bglll de pLHCX-m1-VHCYl-s e pLHCX-m1VHCYl-m (não mostrado). Os “primers” de PCR direto e reverso usados para amplificação por PCR deste fragmento de DNA genômico estão representados na Seq-ID8 e Seq-ID9.

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Seq-ID7:

s * gaaaaatgtttaactgagciactataatcccataattttgaaaactattTATTAGCTTTT GTGT T TGACCCTT C CCTAGCCAAAGGCAAGTATTTAAGGACCCTTTAAAAC T C TTGAAAC TA CTTT AGAGTCATTAAGT T AT T T AAC CAC T T ΤΤΆΑΤ’Τ AC T T TAAAAT GAT G T C AAT T CCC T TT TAACT ATTAATTT ATTT TAAGGGGGGAAAGGCTGCTCATAATTCT ATTGTTTTTCTT GGTAA AGAACΊCTCAGTT1TCGTTTTTACTACCTCTGTCACCCAAGAGTTGGCATCTCAACAGAGGG GACTTΊ C CGAGAGGCCAT C T G G CAG TTG C T TAAGATCAGAAGTGAAGT C T G C CAGTTCCT CC AAGGCAGGTGGCCCAGATTACAGTTGACCTGTTCTGGTGTGGCTAAAAATTGTCCCATGTGG TTAC AAAC CATT AGAC CAGG GT C T GATGAATTGCTCAGAATATTTCTGGACACCCAAATACA GACCCTGGCTT AAGGCCCTGTCCATACAGTAGGTTTAGCTTGGCTACACCAAAGGAAGCCAT ACAGAGGCTAATATCAGAGTAITCTTGGAAGAGaCAGGAGAAAATGAAAGCCAGTTTCTGCT CTTACCTTATGTGCTTGTGTTCAGACTCCCAAACATCAGGAGTGTCAGATAAACTGGTCTGA ATCTCTGTCTGAAGCATGGAACTGAAAAGAATGTAGTTTCAGGGAAGAAAGGCAATAGAAGG AAGCCTGAGAATATCTTCAAAGGG-3'

Seq-IDB: 5'-GATCGGATCCGAAAAATGTT TAAG TCAÇ ÇTAC- 3'

BüitiHI

Seq-TD&: 5' -ÜATCfiGMCCCCCTTTGAAGATATTCTCAGGCTTCC-3

E.ãíftHI

O fragmento de cerca de 0,8 kb do kíE do núcleo contendo o fragmento de PCR genômico também foi clonado na forma de um fragmento de PCR digerido com BamHI no sítio único de enzima de restrição Bglll dos vetores pLHCX-m1-VHCYl-s e pLHCX-m1VHCYl-m (não mostrado aqui).

A sequência do elemento intensificador 3’k murino depositada pode ser recuperada com o número de referência X15878 do NCBI-Genbank e está contida em uma sequência genética de 808 pb localizada a cerca de 8,7 kb a jusante da região codificadora κ constante no genoma de camundongo.

O intensificador 3’k murino não contém um sítio Ciai interno e, em consequência, foi amplificado por PCR partindo de DNA genômico de camundongo usando os “primers” direto e reverso de PCR Seq-ID10 e Seq-ID11, respectivamente, contendo sítios adicionais de enzima de restrição Ciai para clonagem no sítio único de Ciai dos vetores retrovirais pLHCX-m1-VHCYls-3’K E e pLHCX-m1 -VHCy1 m-3'κ E (Fig. 5d).

Seq-lD10t 5' -GAGAATÇGMAGCTCAAACCAGCTTAGGGTACAC-3'

Ciai

Seq-TDll: 5' -gagaatcgattagaacgtgtctüüüccccatg-3'

Ciai

Isto originou os vetores de expressão da cadeia IgYiH finais pLHCX-m1-VHCYls3’kE-kíE e pLHCX-m1-VHCy1 ηη-3’κΕ-κίΕ (Fig. 5e) que codificam cadeias pesadas de Ig que, por co-expressão de cadeias IgL, conduzem à produção de anticorpos IgGi humanos segregados ou ligados a membranas, respectivamente.

Ambos os vetores contêm adicionalmente elementos de regulação c/s kíE e 3’kE a montante e a jusante do cassete de expressão da cadeia IgYiH, conferindo hipermutação somática às regiões V_H das cadeias IgyiH expressadas.

b) Clonagem de vetores de expressão retrovirais para cadeias leves Igx humanas

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Como ponto de partida para a construção de vetores de expressão retrovirais para cadeias leves de imunoglobulinas humanas permitindo a seleção por antibióticos para integração retroviral, foi usado o vetor retroviral disponível no mercado pLPCX (BD-Clontech, Mountain View, CA) (Fig. 6a). Este vetor contém um marcador de seleção por antibióticos 5 que confere resistência à puromicina, conduzido pelo promotor 5’LTR do esqueleto retroviral. Apesar de ter uma concepção similar à do esqueleto do pLHCX (ver Exemplo 1a), o pLPCX contém dois sítios Eco47lll e um MCS com mais sítios de enzimas de restrição, mas está desprovido do sítio único Bglll conveniente a montante do promotor do CMV (Fig. 6a).

Para remover as enzimas de restrição Eco47lll do esqueleto do vetor pLPCX e, ao 10 mesmo tempo, para introduzir uma enzima de restrição Bglll única a montante do promotor do CMV efetuaram-se os seguintes passos de clonagem preparatória. Em um primeiro passo, os sítios Eco47lll nos sinais empacotadores de pLHCX foram removidos por mutagênese dirigida a sítios, usando um estojo comercial Quikchange™ (Stratagene, La Jolla, CA), substituindo o terceiro nucleotídeo C da sequência de reconhecimento de Eco47llI AGCGCT 15 por um A, usando pares de “primers” específicos que conferem a mutação desejada de acordo com as instruções do fabricante (Fig. 6a). Foi verificado que esta substituição de um único par de bases no sinal empacotador ψ (Psi) não afetou as eficiências de transdução retroviral dos vetores mutados (dados não mostrados). O vetor mutado foi chamado de pLPCX-m1 (Fig. 6a). Para obter um esqueleto do vetor pLPCX completamente desprovido 20 de sítios Eco47l11 e incluindo adicionalmente um sítio único Bglll a montante do promotor do CMV, um fragmento Ascl-Notl de pLPCX-m1, no qual a extremidade de DNA digerida com Ncol havia sido preenchida com enzima Klenow, foi clonado em um esqueleto de pLHCX digerido com Ascl-BIpl em que a extremidade de DNA digerida com Blpl havia sido preenchida com enzima Klenow (Fig. 6b), desse modo gerando um vetor chamado de pLPCX-m2 25 no qual essencialmente apenas o gene da higromicina B de pLHCX havia sido substituído pelo marcador de resistência à puromicina de pLPCX (Fig. 6b).

Para a construção do vetor de expressão da cadeia IgxL, a região codificadora da cadeia leve κ constante foi clonada por PCR a partir de cDNA de linfócitos do sangue periférico humano usando os “primers” direto e reverso Seq-ID12 e Seq-ID13, contendo sítios de 30 enzimas de restrição Hindlll e Ciai, respectivamente, para clonagem direcional em pLPCXm2 (Fig. 6b). Como descrito na seção a.), o “primer” direto Seq-ID12 continha adicionalmente um sítio Eco47l11 permitindo a fusão na estrutura de regiões codificadoras V_L à região codificadora da cadeia leve κ constante, originando somente uma substituição conservada de aminoácidos treonina em serina na primeira posição da cadeia leve κ constante humana. O 35 “primer” reverso continha um sítio Notl interno adicional para facilitar procedimentos de clonagem posteriores, como, por exemplo, a substituição da região codificadora κ constante.

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Seq-ID12: 5' -ÇATCAAGGTTAOÇGÇTCTGTGGÇTGCACCATCTGTCTTCATC-^¹

Hifidl 11 /Etú47III

Seq-1 Dl3:5’-GATCATCGATGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3'

Clal / Notl

A inserção da região codificadora da cadeia leve κ constante, flanqueada por sítios Hindlll/Eco47lll na extremidade 5’ e sítios Notl/CIal na extremidade 3’, em pLPCX-m2 deu origem ao plasmídeo pLPCX-m2-CK.

Para construir um vetor de expressão da cadeia pesada IgKL humana completa, uma região codificadora Vk humana de um anticorpo totalmente humano previamente identificado, específico para NlP-Ovalbumina, foi inserida na construção pLPCX-m2-CK na forma de um fragmento Hindlll-Eco47lll (Fig. 6c). A região codificadora Vk para o anticorpo humano específico para NlP-Ovalbumina, incluindo a sequência líder e sítios de clonagem 5’Hindlll e 3’Eco47lll, é provida na Seq-ID14. Deve notar-se que dois nucleotídeos C adicionais haviam sido adicionados a montante do ATG de início para tradução melhorada (aproximação de uma sequência de consenso de Kozak):

Seq-1014; 5'AAGCTTCCATGGATATGAGGGT C C C C GCTCAGCTCCTG G GG C TCC T GCTACTC TGGCTCCGA GGTGCCAGATGT GACATCGAGAT GAC CCAGTCTCCATC CTCC CTG TCTGCAT CTGT AGGAGA CAGAGTCACCAT CACTTGCCGGG CAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATT GGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGC C C C TAAG C TCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGT C C CAT CAAGG-T T C AG TG G C AGTGG ATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGT C TGC A ACCT GAAGAT T T T G CAAC T TACTACTGTcAACAGAGTTACAGTACCCCCACTT T C GGC CAAG GGACCAAGGTGGAAATCAAGCGÇT-3^J

Os sítios de enzimas de restrição Hindlll e Eco47lll para clonagem estão sublinhados na Seq-ID14. O ATG de início da sequência líder começa na posição 9. A inserção deste fragmento HindllI-Eco47lII em pLPCX-m2-CK linearizado com HindlII-Eco47lII deu origem à construção de expressão pLPCX-Ma-νκΟκ (Fig. 6c).

Não obstante este vetor de expressão retroviral da cadeia leve κ já ser suficiente para implementar a invenção e para efetuar apresentação retrocítica por co-expressão com vetores de expressão retrovirais da cadeia pesada de Ig, foram clonados vetores adicionais que também continham elementos κίΕ e 3’kE, seguindo a mesma estratégia de clonagem das construções de expressão de cadeias pesadas de Ig. Assim, ο κίΕ de camundongo foi inserido no sítio único Bglll em pLPCX-m2-VK-CK, a montante do promotor do CMV, na forma de um fragmento genômico de PCR digerido com BamHI com cerca de 2,3 kb amplificado com pares de “primers” Seq-ID5 e Seq-ID6 (ver acima), ou então na forma de um fragmento genômico de PCR digerido com BamHI de cerca de 0,8 kb amplificado com pares de “primers” Seq-ID8 e Seq-ID9 (ver acima). Apenas está representada aqui a clonagem do fragmento genômico contendo κίΕ de camundongo de cerca de 2,3 kb em pLPCX-hi2-VkCk, originando o plasmídeo pLPCX-m2-VKCK-KÍE (Fig. 6d).

Por fim, e analogamente à construção de vetores de expressão retrovirais da ca

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 75/103 deia IgH contendo kíE e 3’kE descrita no Exemplo 1a acima, o 3’kE murino foi inserido, na forma de um fragmento genômico de PCR digerido com Ciai amplificado com pares de “primers” Seq-ID10 e Seq-ID11, no sítio de restrição único Ciai a jusante da região codifícadora da cadeia leve κ para gerar o vetor de expressão retroviral ρΙ_ΡΟΧ-ηη2-νκ-Οκ-κίΕ-3’κΕ (Fig. 6d).

Tal como o vetor de expressão da cadeia IgH contendo elementos kíE e 3’kE, este vetor contém agora todos os elementos de regulação c/s requeridos para conferir hipermutação somática a qualquer região codifícadora Vk clonada na construção (ver abaixo).

EXEMPLO 2

Geração de uma linha de células que super-expressa a citidina desaminase induzida por ativação (Al D)

Foi demonstrado que a proteína específica de células B ativadas citidina desaminase induzida por ativação (AlD) é um fator de ativação trans único que é necessário e suficiente para conferir um fenótipo de hipermutação somática a qualquer linha de células de vertebrado. Em células que expressam a Al D, a hipermutação somática pode ser dirigida de modo específico para loci gênicos ativos no que se refere à transcrição se estes forem arranjados em um contexto correto para elementos intensificadores de regulação c/s, em particular elementos kíE e 3’kE do locus da cadeia leve κ de imunoglobulinas. Para obter linhas de células que expressam de modo estável a AID, primeiramente foi construída, do modo seguinte, uma construção de expressão retroviral que codifica a AID murina.

O cDNA da AID murina foi amplificado por PCR usando Pfx polimerase de altafidelidade (Invitrogen, Carlsbad, CA) de cDNA de baço de camundongo total de acordo com as instruções do fabricante, usando os “primers” de PCR direto e reverso Seq-ID15 e SeqID16, contendo sítios de clonagem Xhol adicionais para ligação do fragmento amplificado por PCR em vetores compatíveis. Adicionalmente, o “primer” direto continha dois nucleotídeos C adicionais (salientados em itálico) a jusante do sítio Xhol e a montante do códon ATG de início da ORF da AID murina, para aproximar uma sequência de iniciação da tradução de Kozak e, desse modo, assegurar a tradução apropriada do cDNA clonado.

Seq-ID15: 5' -AATACTCGAGÇCATGGAÇAGCCTTCTG?VTGAAGCAAAAG-3^f

Xhol

Saq-IDl6: 5'-AATACTCGACTCAAAATCCCAACATACGAAATGCATC-3'

Xhol

O produto de RT-PCR resultante de 620 pb foi digerido com Xhol e foi ligado em pLPCX digerido com Xhol e tratado com fosfatase alcalina, da BD-Clontech (Mountain View, CA). Os produtos de ligação contendo a inserção em uma orientação correta foram determinados por digestão com enzimas de restrição de diagnóstico. Um clone com o padrão correto de enzimas de restrição contendo a inserção de cDNA da AID murina em orientação

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 76/103 correta foi checado por sequenciação de DNA e foi chamado de pLPCX-mAID e (Fig. 7).

A sequência clonada do cDNA da Al D murina correspondeu exatamente à ORF do cDNA da Al D murina publicada provida na entrada AF132979 do NCBI-Genbank.

De seguida, 10 pg da construção pLPCX-mAID linearizada com Pvul foram trans5 fectados em 5 x 10⁶ células pré-B transformadas com Abelson FA-12 suspensas de novo em 800 pL de meio RPMI simples por eletroporação a 300 V, 960 pF à temperatura ambiente. As células transfectadas foram suspensas de novo em 20 mL de meio de crescimento contendo FCS e foram plaqueadas em dez placas de 96 cavidades a 200 pL/cavidade. Às 48 horas pós-transfecção, células transfectadas de forma estável foram selecionadas por adi10 ção ao meio de crescimento de 2 pg/mL de antibiótico puromicina.

Após 10-14 dias pós-transfecção foram detectadas dezenas de colônias resistentes à puromicina, e os clones selecionados foram transferidos para meio de cultura fresco contendo 2 pg/mL de puromicina. Os clones resistentes à puromicina foram adicionalmente expandidos, e um número selecionado de clones foi testado quanto à expressão da proteína 15 Al D murina por coloração “Western” ECL, usando um anticorpo anti-AID de camundongo comercial como recomendado pelo fabricante (ver Fig. 9a).

Uma banda específica da proteína Al D foi detectável em cerca de 80% dos clones analisados de células transfectadas FA-12-AID, que exibiram um peso molecular aparente de 25 kD, como esperado. Daqui foi concluído que foram obtidas várias linhas de células 20 que super-expressam de modo constitutivo a proteína Al D murina.

EXEMPLO 3

Demonstração de hipermutação somática dirigida a um gene repórter em construções de expressão retrovirais de imunoglobulinas humanas contendo elementos kíE e 3’kE de regulação c/s

De seguida foi demonstrado que regiões variáveis de anticorpos humanos em construções de expressão retrovirais, como divulgado em esta invenção, são alvos para hipermutação somática mediada pela Al D. Para esta finalidade foi gerada uma construção repórter na qual a ORF da região V de uma cadeia IgH humana foi substituída por uma ORF de EGFP mutada, em que um códon de terminação havia sido introduzido no contexto de um motivo de sequência RGYW que é sabido ser muito importante para hipermutação somática (Bachl SOIsson, 1999).

A mutação de terminação foi introduzida no códon 107 da ORF da EGFP, alterando um códon de tirosina em um códon de terminação TAG. Além disso, o códon 108 foi modificado, desse modo gerando um novo sítio de restrição Spel de diagnóstico na sequência da 35 EGFP mutada, de modo que por reversão da mutação de terminação do códon 107 o sítio Spel seria destruído, desse modo facilitando a identificação e caracterização de revertentes. A modificação de sequência introduzida na ORF da EGFP está ilustrada na Fig. 10a, e a

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ORF da EGFP mutada completa é provida na Fig. 10b.

A construção repórter para a demonstração de hipermutação somática foi construída do modo seguinte.

A ORF da EGFP foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo pIRES-EGFP (BDClontech, Mountain View, CA) como modelo com Pfx polimerase de alta-fidelidade (Invitrogen, Carlsbad, CA) e os “primers” diretos Seq-ID17 e Seq-ID18, cada um contendo sítios adicionais de enzimas de restrição Hindlll e Eco47lll permitindo a substituição da região V_Hem pLHCXm1-VHCY-s-KÍE-3’KE por uma ORF da EGFP. O “primer” direto continha dois nucleotídeos C adicionais a montante do códon de início ATG, salientado em itálico, que aproxima uma sequência de consenso de iniciação da tradução de Kozak e assegura a iniciação apropriada da tradução no códon de início ATG correto.

Seq-IDl 7; 5* -CGCA*GÇTTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC'TGTTC-3^j'

Hindlll

Eeq-IDie: 5'-TAGAGÇGÇTCTTGTACAGCTCGT€CATGCCGAGAGTG-3^JECO17III

O fragmento de PCR da EGFP amplificado por Pfx de 737 pb foi clonado diretamente no vetor pCR4-Topo, que faz parte de um estojo de clonagem por PCR Zero-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA), dando origem ao vetor pCR4-Topo-EGFP (Fig. 11). De seguida, um clone checado quanto à sequência de pCR4-Topo-EGFP foi mutado nos códons 107 e 108 da ORF da EGFP, como ilustrado na Fig. 10, usando um estojo Quikchange™ (Stratagene, La Jolla, CA), de acordo com as instruções do fabricante, usando pares de “primers” específicos que conferem as mutações desejadas, desse modo gerando o plasmídeo pCR4Topo-EGFPmut.

A ORF da EGFP mutada e checada quanto à sequência de pCR4-Topo-EGFPmut foi recuperada do plasmídeo por digestão dupla com enzimas de restrição usando as enzimas de restrição Hindlll e Eco47lll. O fragmento digerido foi ligado no plasmídeo digerido duplamente com Hindlll e Eco47lll pLHCXm1-VHCY-s-KÍE-3’KE (Fig. 5e) e no plasmídeo digerido duplamente com Hindlll e Eco47lll pLHCXm1-VHCY-s (Fig. 5c), não contendo elementos intensificadores. Desse modo, em ambos os vetores, as regiões codificadoras V_Hforam substituídas pela ORF da EGFP mutada, que foram fundidas na estrutura às regiões Ογι, originando o plasmídeo repórter pLHCXm1-E(mut)-CY-s-KÍE-3’KE e o plasmídeo repórter de controle pLHCXml -E(mut)-CY-s (Fig. 11).

Ambos os plasmídeos foram transduzidos em clones transfectantes da AID FA-12 resistentes à puromicina 3 (expressando a AID) e 5 (sem expressão de AID) como controle. As células transduzidas foram cultivadas sob seleção de 2 mg/mL de higromicina B começando às 24 horas após a transdução, e as células foram analisadas quanto à emergência de células auto-fluorescentes verdes após 6, 8 e 10 dias de cultura. Somente na experiência

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 78/103 em que uma construção repórter de EGFP mutada foi expressada no contexto com κίΕ e 3’kE (isto é, usando o plasmídeo pLHCXm1-E(mut)-CY-s-KÍE-3’KE) e em transfectante de Al D FA-12, no qual foi detetável expressão de Al D por coloração “Western” (isto é, clone transfectante de Al D FA-12 3), foi possível detectar células auto-fluorescentes verdes após 6, 8 e 10 dias de cultura, quando foi detectável por FACS uma freqüência de estado estacionário de cerca de 0,2% (Fig. 9b) de células verdes. Em nenhum dos experimentos de controle (sem expressão de Al D e/ou sem elementos intensificadores presentes nas construções, dados não mostrados) foi possível detectar células verdes durante os 10 dias do experimento.

Da população 0,2% positiva para a EGFP, 192 células isoladas foram submetidas a triagem em cavidades individuais de duas 96 cavidades, e 100 clones destes clones submetidos a triagem isolada foram analisados por FACS quanto a fluorescência verde após o desenvolvimento de células suficientes. De 100 clones analisados, 95 clones exibiram um padrão homogêneo de fluorescência, de intensidade similar à fluorescência detectada nas células submetidas a triagem isolada, isto é, a uma fluorescência de cerca de 10² log (a autofluorescência de células de controle de células FA-12 permaneceu abaixo dos níveis de fluorescência de 10¹ log, indicado pela linha limite). Quatro clones exibiram um padrão heterogêneo de fluorescência, com cerca de metade das células sendo negativa e metade das células sendo positiva para expressão da EGFP. Somente um de 100 clones analisados praticamente não exibiu fluorescência de EGFP, apesar de também este clone estar ligeiramente acima dos níveis de fundo de auto-fluorescência. É possível que os 5 clones com padrão de EGFP heterogêneo e negativo se devam a silenciamento posicionai (parcial) da expressão de EGFP de integrantes retrovirais, ou os resultados podem dever-se a artefatos da triagem de células isoladas. Ainda assim, na maioria dos clones (95%), a expressão da EGFP foi claramente detectável. Vinte e quatro destes clones foram analisados por PCR usando os “primers” de clonagem Seq-ID17 e Seq-ID18, para amplificar de novo o gene EGFP das células transduzidas de forma estável.

Em contraste com um produto de PCR do vetor repórter contendo a ORF da EGFP mutada, não foi possível digerir nenhum dos 24 produtos de PCR de clones que expressam a EGFP com a enzima de restrição Spel, sugerindo uma reversão da mutação de terminação TAG no códon 107 da ORF da EGFP mutada (dados não mostrados).

Dez dos produtos de PCR foram analisados por sequenciação de DNA, confirmando que todos os dez clones continham uma mutação G->C do nucleotídeo G no motivo RGYW introduzido na ORF da EGFP, como descrito anteriormente na literatura (Bachl & Olsson, 1999).

Isto demonstra que, dependente da presença de elementos genéticos de regulação c/s, como elementos κίΕ e 3’kE, e dependente da expressão da Al D, níveis acrescidos de

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 79/103 mutação somática, e assim de mutagênese, podem ser dirigidos para as regiões de DNA a jusante de um promotor ativo e, desse modo, para as regiões codificadoras V_H de cadeias de anticorpos humanos no contexto das construções de expressão retrovirais divulgadas.

Em termos da estimativa do nível de mutação somática dependente da Al D nas construções com kíE e 3’kE, a taxa de mutação estimada situou-se no intervalo de cerca de 3 x 10'⁵ mutações/pb/geração. Este valor ainda é menor do que taxas de hipermutação somática que foram relatadas in vivo, que podem alcançar taxas de até 10⁴ ou mesmo 10'³/pb/geração. Não obstante, a taxa de mutação detectada ainda foi significativamente mais alta do que a taxa de mutação de fundo relatada em células de vertebrado, estimada no intervalo de 10'⁸ mutações/pb/geração. Assim, é concluído que taxas altas de mutação somática são dirigidas de modo específico para regiões a jusante de um promotor ativo nas construções retrovirais divulgadas de um modo intensificador e dependente da Al D, desse modo permitindo a aplicação de Apresentação Retrocítica em condições de mutagenização in vivo com base em hipermutação somática mediada pela expressão da Al D.

EXEMPLO 4

Demonstração da geração in situ de regiões codificadoras de anticorpos humanos usando vetores de expressão retrovirais competentes para recombinação V(D)J

a) Clonagem de um vetor de expressão retroviral de cadeias pesadas (IgH) humanas requerendo recombinação V(D)J antes da expressão das cadeias IgH

Como abordagem alternativa à expressão retroviral de cadeias pesadas (H) e leves (L) a partir de vetores de expressão de cDNA descrita no Exemplo 1, foi construída uma classe diferente de vetores retrovirais de cadeias IgH em que a região codificadora variável é codificada por segmentos gênicos V, D e J separados em uma configuração “quase-linha germinativa”, que ainda é necessário reunir pelo processo de recombinação V(D)J antes da expressão. A recombinação V(D)J medeia a reunião específica para sítios mas ligeiramente imprecisa de segmentos gênicos V, D e J, de modo que podem ser geradas regiões codificadoras V diversas a partir de uma única construção de expressão por transdução em células ativas para recombinação V(D)J in situ, tais como, por exemplo, células B precursoras.

Para esta finalidade, segmentos gênicos V_H3,30, D_H1,26 e Jh3 da linha germinativa foram individualmente clonados por PCR a partir de DNA genômico derivado de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) humano depletadas de células B. os “primers” de PCR usados para a amplificação dos segmentos gênicos V, D e J da linha germinativa foram escolhidos de modo a serem incluídas sequências de DNA flanqueadoras compreendendo sequências de sinal de recombinação (RSSs) conservadas e sequências adicionais de DNA intermediárias, permitindo a reunião apropriada de segmentos gênicos V, D e J. Todos os produtos de amplificação por PCR foram gerados usando DNA polimerase Pfx termicamente estável de verificação (Invitrogen, Carlsbad, CA) e foram inicialmente subcloPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 80/103 nados em um vetor de clonagem por PCR pSC-B (Stratagene, La Jolla, CA), em ambos os casos de acordo com as instruções dos fornecedores. Os fragmentos de PCR, subclonados em pSC-B, foram checados por sequenciação de DNA, e só foram usados fragmentos para clonagem adicional depois de ter sido checada a sequência de DNA.

Para a amplificação por PCR de um fragmento V_H3,30 humano da linha germinativa foram usados os “primers” de DNA Seq-ID19 e Seq-ID20 contendo sítios de enzimas de restrição BamHI e Nhel (como indicado), permitindo a subclonagem adicional dos fragmentos de DNA clonados por PCR.

Eeq-ID19: 5'-AT TTGGATCCCAC CATGGAGT TTGGGCT GftGC TGGGTTTTCCTCG-S^f

Bamlil

3eq-ID20 : 5' -CCGtKTA5CTCCTGACAGGAAACAGCCTCCATCTCCACCr-3'

Nhel

Deste modo obteve-se um produto de amplificação por PCR com 623 pb de com10 primento contendo o segmento gênico VH3.30 da linha germinativa com DNA flanqueador (Seq-ID21), ver Fig. 11a.

Seq-ID21:

‘ a 11tGGATCCCAC CATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTT CGT CGTTGCTC TTTTAAGAG GTGATTCATGGAGAAATAGAGAGACTGAGTGTGAGTGAACATGAGTGAGAAAAACTGGATTT GTGTGGCATTTT C TGATAACGGTGTCCTTCTGTTTGCAGGTGTC C AGTGTCAGGTGCAGCTG GTGGfiGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTC TGÇATTCACCTT CAG TAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTAG AGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATAC TACG CAGACTCCGTGAAGGGC CGATTCACCATC T C CAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAG AGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACAGTGAGGGGAAGTCATTGTGCGC CCAGACACAAACC TCC CTGCAGGAACGCTGGGGGGAAATCAGC GG CAGGGGGCGCTCAGGAG CCACTGATQAGAGTCAGCCCTGGAGGCAGGTGCAGATGGAGGCTGTTTCCTGTCAGGAGCTA GCqqq3’

De seguida efetuou-se amplificação por PCR de um fragmento de DNA genômico humano contendo o fragmento DH1,26 humano com DNA genômico flanqueador usando o par de “primers” Seq-ID22 e Seq-ID23, contendo sítios para as enzimas de restrição Nhel e 15 Xhol, respectivamente (Fig. 11a).

Seq-ID22: 5'-GGACCTAGCGGGC TGC ÇAGTÇÇ TÇACCC CACACCTAAGGT-3'

Nhel

Seq-ID23: 5'-GGGCTCGAGTCCTÇACCATCCAATGGGGACACTGTGGAGC-3' xhol

Deste modo obteve-se um produto de amplificação por PCR de 336 pb de comprimento contendo o segmento gênico DH1,26 da linha germinativa com DNA flanqueador (Seq-ID24).

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Seq-ID24;

5'qqa SCTASCG GGCTGCCAGTCCTCAC CC CACACCT AAGGT GAGCCACAGCCGCCAGAGCC TCCACAGGAGAC CCCACCCAGCAGCC C AGC C C CT ACCC AGGAGGC CC CAGAGCTCAGGGC GC C TGGGTGGAT TC TGAACAGCCCCGAGTCAC GGTGGGTATAGT GGGAGCTACTACCACTGT GA GAAAAGCTAT GT CCAAAACTGTCTCCCGGCCACTGCTGGAGG C CCAG CCAGAGAAGGGAC CA GCCGCCCGAACATACGACCTTCCCAGAC CTCATGACCCCCAG CAC TT GGAGCTCCACAGTGT CCCCATTGGATGGTGAGGflCTÇGAficGC 3'

Por fim obteve-se amplificação por PCR de um fragmento de DNA genômico humano contendo o fragmento JH3 humano com DNA genômico flanqueador usando o par de “primers” Seq-ID25 e Seq-ID26, contendo sítios para as enzimas de restrição Sall e Xbal/Hindlll, respectivamente, como indicado (Fig. 11a).

Seq-tD25; 5'-GGAGTÇaÇCCCTGCCTGGGTCTCAGCCCGGGGGTCTGTG-3'

Ss.1 I

Seq-ID2É: 5^J-TArATCTAflAATATAAGCTTftGCCATCTTACCTGAfiGAGACGGTGACC-3'

HLndIII

Deste modo obteve-se um produto de amplificação por PCR de 239 pb de comprimento contendo o segmento gênico JH3 da linha germinativa com DNA flanqueador (SeqID27).

Seq-ID27:

5'ggaGTCGACCCCTGCCT G G G T CTCAGCCCGGGGGTCTGTGTGGCTGGGGACAGGGACGC C GGCTGCCTCTGCTCTGTGC TT G GGCCATGTGACCCATTCGAGTGTCCTGCACGGGCACAGGT TTGTGTCTGGGCAGGAACAGGGAC TG ΪGTCCCTGTGTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAG GGACAATGGTCACCGTCTC T TCAG GTAAGATGGCTÂAGCTTa161 TCTAGAtata 3'

Os três fragmentos de DNA Seq-ID21, Seq-ID24 e Seq-ID27 foram clonados sequencialmente em um vetor ponte contendo sítios únicos de enzimas de restrição BamHI, 10 Nhel, Xhol e Xbal, de modo que foi possível montar um cassete contendo os segmentos gênicos VH3.30, DH1.26 e JH3 por ligação seqüencial dos fragmentos de DNA via os sítios de enzimas de restrição compatíveis. A Seq-ID21 foi ligada, na forma de um fragmento BamHI-Nhel, no vetor ponte linearizado com BamHI-Nhel, de seguida o fragmento digerido com Nhel-Xhol Seq-ID24 foi ligado no vetor ponte linearizado com Nhel-Xhol, que já conti15 nha a Seq-ID21, e, por fim, o fragmento digerido com Sall-Xbal Seq-ID27 foi ligado no vetor ponte linearizado com Xhol-Xbal que já continha a Seq-ID21 e Seq-ID24 clonadas, desse modo gerando um cassete artificial VH3.30- DH1.26-JH3 em um vetor ponte (Fig. 11a).

O cassete completo “quase-linha germinativa” contendo os segmentos gênicos VH3.30, DH1.26 e JH3 reunidos de modo artificial foi então clonado no vetor retroviral 20 MigR1 (Pear et al., 1998) que já continha a região codificadora para uma cadeia μΗ humana (Seq-ID28, ver abaixo) clonada nos sítios únicos Bglll e Hpal do vetor MigR1 (construção

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MigR1-muH, Fig. 11b). Foi possível usar um sítio único Xhol, que separa a região codificadora VH da região codificadora da cadeia μΗ constante em MigR1-muH (salientado a negrito no meio da Seq-ID28) para ligar o cassete VH3.30- DH1.26-JH3 na estrutura com a região codificadora da cadeia μΗ constante, sem afetar a sequência de aminoácidos na transição 5 de JH para a região codificadora constante.

Seq-ID28:

5'AGATCTACCAT GGAGT TT GG G CTG AG C TGGGTTTTCCTTGTTGCGATTTTAGAAGGTGTC CAGTGTGAGGTG CAGCTGG T G GAGTC T G G G GGAGGCTTGGTACAGCCCGGCAGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCGGCCTC T GGAT TC AC C T T TGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAG CTCCAGGGAAGGGCCTGGAATG G GTCTCAG CTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACT Al GCGGACTCTGT GGAGGGCC GAT T C ACC ATC TCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATC T GCAAATGAACAGTCTGAGAGC TGAGGATAC GGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCTCGTAC C TTAGCACCGCGTCCTCCCT TGAC TATTGGG GCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCT agtgcatccgccgcaacccttttccccctcgtctcctgtgagaattccccgtcggatacgag CAGCGTGGCCGTTGGCTGC C TCGCAC AGGAC TTCCTTCCCGACTCCATCACTTTCTCCT GGA aatacaagaacaactctgacat cagcagcac ccggggcttcccatcagtcctgagagggggc aagtacgcagccacctcac aggt gctgctgc cttccaaggacgtcatgcagggcacagacga ACACG TGGTGTGCAAAGTC CAGCACCCCAÀC GGCAACAAAGAAAAGAACGTGCCTCTTCCAG tgattgccgagctgcctcccaaagtgagcgtcttcgtcccaccgggcgacggcttcttcggc aacccccgcaagtccaaggtcatgtgccaggccacgggtttcagtccccggcagattcaggt g tcctggctgcgcgaggggaagc aggtggggtctggcgtcaccacggaccaggtgcaggc t g AGGCCAAAGAGTCTGGGCCCAC GACCTACAAGGTGACCAGCACACTGACCATCAAAGAGAGC GACTGGCTCAGCCAGAGCATGTTCACCTGCCGCGTGGATCACAGGGGCCTGACCTTCCAGCA GAATGCGTCCTCCATGTGTGTCC C CGATCAAQACACAGCCATCCGGGTCTTCGCCATCCC C C CATCCTTTGCCAGCATCTTCCT C ACCAAGTC c accaagttgacctgcctggtcacagacctg ACCACCTATGACAGCGTGACCATCTCCTGGACCCGCCAGAATGGCGAAGCTGTGAAAACCCA CACCAACATCTCCGAGAGCCACCCCAATGCCACT TTCAGCGCCGTGGGTGAGGCCAGCATCT G c gaggatgactggaattccggggagagütt cacgtgcaccgtgacccacacagacctgccc T CGCCACTGAAGCAGACCATCTCCCGGCCCAAGGGGGTGGCCCTGCACAGGCCCGATGTC TA C TT GCTGCCACCAGCCCGGGAGCAGCTGAAC C T GCGGGAGTCGGCCACCATCACGTGCCTGG TGACGGGCTTCTCTCCCGCGGACGTCTTCGTGCAGTGGATGCAGAGGGGGCAGCCCTTGTCC CCGGAGAAGTATGTGACCAGCGCCCCAATGCCTGAGCCCCAGGCCCCAGGCCGGTACTTCGC C CACAGCATCCTGACCGTGTCCGAAGAGGAAT GGAACACGGGGGAGACCTACACCTGCGTGG T GGCCCatgaggccctgcccaacagggtcacC GAGAGGACCGTGGACAAGTCCACCGAGGGG GAGGTGAGCGCCGACGAGGAGGGCTTTGAGAACCTGTGGGCCACCGCCTCCACCTTCATCGT C CTCTTCCTCCTGAGCCTCTTCTACAGTACCACcgtcaccttgttcaaggtgaaatgagcgg ccgctttacgcgttaac 3'

Os sítios das enzimas de restrição Bglll-Hpal nas extremidades 5’ e 3’ da inserção, respectivamente, também estão salientados a negrito e estão sublinhados, e indicam a transição para o esqueleto do vetor MigR1 (Pear etal., 1998).

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 83/103

Para substituir a região codificadora V na Seq-ID28, contida no esqueleto retroviral MigR1, pelo cassete VH3,30-DH1,26-JH3 “quase-linha germinativa”, foi necessário amplificar de novo por PCR o fragmento VH3,30-DH1,26-JH3 de cerca de 1,1 kb usando um “primer” direto contendo Bglll e um “prímer” reverso contendo Xhol Seq-ID29 e Seq-ID30, respectivamente (Fig. 11a).

Seq-ID29: 5'-GAAGATCrCACCATGGAGTTTG-3' &yirr

Seq-ID30 : 5' -ΑΤΟΓΤΑΙΧΤCTCGAGÃCGGTGA-3 '

O fragmento de PCR resultante de cerca de 1,1 kb foi digerido com Bglll e Xhol e foi ligado no vetor MigR1 contendo a cadeia μΗ linearizado com Bglll-Xhol, desse modo originando o vetor de expressão retroviral competente para recombinação V-D-J pVDJ-muHMigR1 (Fig. 11b).

b) Demonstração de recombinação V(D)J bona fide ocorrendo em vetores V-D-J retrovirais que gera sequências diversas por transdução em células B precursoras

Como prova de conceito, para demonstrar que pode ocorrer recombinação V(D)J apropriada em vetores retrovirais contendo segmentos gênicos V, D e J em configuração “quase-linha germinativa”, o vetor pVDJ-muH-MigR1 foi submetido a co-transdução na linha de células pré-B transformadas com A-MuLV 230-238 em conjunto com um vetor de expressão retroviral de cadeias IgL, como descrito no Exemplo 1b. Só se ocorrer um evento de recombinação V(D)J na construção pVDJ-muH-MigR1, que origina o rearranjo na estrutura dos segmentos gênicos V, D e J, é que um anticorpo IgM humano completo pode ser expressado na superfície celular das células duplamente transduzidas. A eficiência da transdução do vetor pVDJ-muH-MigR1 pode ser monitorada por co-expressão do gene marcador de EGFP acoplado a IRES. Como pode ser observado na Fig. 12(a), uma população muito pequena de 0,04% de células que foram transduzidas com pelo menos a construção pVDJmuH-MigR1 (a eficiência da transdução foi 44,7%) exibiu expressão detectável de IgM na superfície celular, mensurada por coloração por FACS com um anticorpo anti-cadeia leve capa. De forma notável, praticamente não foram detectáveis células expressando IgM na população de células não transduzida com a construção pVDJ-muH-MigR1 (quadrante de baixo à direita na Fig. 12(a)), demonstrando a especificidade da coloração.

As raras células que expressaram IgM detectáveis no quadrante de cima à direita da Fig. 12(a) foram submetidas a triagem por triagem celular preparativa usando um dispositivo de triagem de células de alta velocidade FACS-Aria (BD, Franklin Lakes, NJ) e foram expandidas em cultura de tecidos por 8 dias, com a finalidade de expandir as células para caracterização de integrantes retrovirais. O perfil de FACS para expressão da EGFP (indicador de construção pVDJ-muH-MigR1 integrada) e IgM de superfície após 8 dias de expansão mostrou possivelmente poucas células expandidas de forma clonal que exibiram IgM

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 84/103 na superfície celular e continham a construção pVDJ-muH-MigR1 (mensurada por fluorescência verde, Fig. 12(b)). Populações celulares distintas na área de cima à direita do gráfico de FACS da Fig. 12(b) foram submetidas a triagem, e DNA genômico foi preparado de populações de células reunidas.

O DNA genômico foi analisado por PCR de diagnóstico usando “primers” ligados na construção pVDJ-muH-MigR1 a montante da região VH e a jusante da região JH. Como esperado, os PCRs de diagnóstico originaram duas bandas discretas de intensidade quase igual, indicadoras de segmentos gênicos V, D e J não rearranjados (fragmento de cerca de 1,2 kb) e uma menor, fragmento de cerca de 0,5 kb, indicadora de segmentos gênicos recombinados V(D)J (dados não mostrados). A sequenciação da banda maior de PCR confirmou que este produto de amplificação por PCR representou o cassete V-D-J não rearranjado, ainda em configuração “quase-linha germinativa”. Estas construções não rearranjadas ainda eram detectáveis em células positivas para IgM se as células fossem transduzidas com mais do que uma construção, das quais nem todas poderíam estar acessíveis para recombinação V(D)J. O menor produto de amplificação por PCR não originou uma sequência única por sequenciação do produto de PCR, e foi necessário ser subclonado no vetor de clonagem por PCR pSC-B para análise de sequências de fragmentos de PCR individuais.

De 6 plasmídeo analisados, 2 continham sequências idênticas de recombinação V(D)J bona fide, e todas exibiram aspectos característicos de reunião dirigida a sítios de segmentos gênicos V, D e J por recombinação V(D)J, incluindo perda de nucleotídeos nas regiões codificadoras e adição de sequências não modeladas (regiões N) que são catalisadas pela enzima específica de linfócitos precursores desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) (Fig. 12(b)).

Já as duas sequências recuperadas, representadas pela sequência do clone 225 (Fig. 12b), constituem evidência firme da capacidade dos vetores de expressão retrovirais contendo segmentos gênicos V, D e J para sofrerem recombinação V(D)J em linfócitos B precursores, pois não há nenhuma outra explicação para o modo como estas sequências, exibindo todos os sinais de um evento de recombinação V(D)J bona fide, poderíam ter sido geradas de outro modo, mesmo se a eficiência em esta altura aparentasse ser baixa. É concluído, por aumento da eficiência da recombinação V(D)J no contexto da transdução retroviral de linfócitos precursores, que pode ser gerada uma coleção diversa de sequências de anticorpos a partir de um número limitado de vetores retrovirais contendo segmentos gênicos V, D e J em configuração “quase-linha germinativa”.

EXEMPLO 5

Identificação e caracterização de linhas de células B murinas seletoras adequadas para Apresentação Retrocítica

a) A expressão de anticorpos endógenos em linhas de células B pode potencialPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 85/103 mente dificultar a sua utilização como células seletoras em apresentação retrocítica, pois o emparelhamento de cadeias de imunoglobulinas endógenas de camundongo com cadeias de anticorpos completos recombinantes pode afetar de modo negativo a sua apresentação na superfície celular, ou pode conduzir à expressão de imunoglobulinas humano5 camundongo mistas com especificidades de ligação que não é possível definir. Em consequência, foi examinado um painel de linhas de células pré-B murinas transformadas com o vírus da leucemia murina de Abelson (A-MuLV), descritas na literatura, quanto à expressão intracelular de cadeias pesadas de IgM (μΗ) endógenas usando anticorpos anti-cadeias pesadas de IgM murinas acoplados a FITC (Southern Biotech). Estas células incluíram as li10 nhas 40E1, 230-238, 204-1 -8 (Alt et al., 1981), 18-81, subclone 8-11 de 18-81 (Rosenberg & Baltimore 1978), células 63-12 (aqui chamadas de FA-12) de camundongos deficientes em RAG-2 (Sinkai et al., 1992) e 1624-5, 1624-6 de camundongos depletados de cadeias leves substitutas triplas (Shimizu et al., 2002). As células foram permeabilizadas usando o estojo Fix/Perm (Caltech) seguindo as instruções do fabricante. Como ilustrado na Fig. 14, as li15 nhas de células FA-12, 40E1 e subclone 8-11 de 18-81, 1624-5 e 1624-6 exibiram o menor sinal ou sinal nulo de coloração de IgM intracelular, qualificando-as como células seletoras adequadas para Apresentação Retrocítica.

b) Uma vez que a Apresentação Retrocítica é baseada em transferência genética mediada por vetores de retrovírus, o painel de linhas de células pré-B murinas transforma20 das com A-MuLV foi adicionalmente examinado quanto à sua suscetibilidade a transdução retroviral usando partículas vetoriais derivadas de MLV ecotrópicas contendo um gene marcador da proteína verde fluorescente (GFP) 9 Fig. 13). 1 x 10⁵ células foram transduzidas, a uma MOI de 0,5, usando uma preparação vetorial que tinha empacotado o vetor de transferência LEGFP-N1 abrangendo o gene repórter GFP (Clontech) previamente titulada em cé25 lulas pré-B subclone 8-11 de 18-81 por diluição limitante. As partículas vetoriais foram geradas como descrito abaixo. A transdução foi efetuada por infecção com rotação, essencialmente usando centrifugação em tubos Eppendorf de 1,5 mL a 3,300 rpm e 30^sC por 3 horas. Aos dois dias pós-transdução, a transferência genética foi analisada determinando a freqüência de células expressando a GFP por análise de FACS. Células alvo não manipuladas 30 e não tratadas serviram de controles negativos. Como ilustrado na Fig. 13, apenas células 18-81 originais exibiram permissividade muito baixa a transdução com o vetor de MLV (<10%). Todas as outras linhas de células revelaram eficiências de transferência genética £40%. De forma notável, com as células FA-12, 40E1 e 1624-5, as eficiências da transferência genética foram máximas e alcançaram >50% no presente experimento.

Considerando o conjunto, verificou-se que as células FA12, 40E1 e 1624-5 são as mais adequadas para Apresentação Retrocítica considerando ambos os critérios a) expressão baixa ou ausente de imunoglobulinas murinas endógenas e b) suscetibilidade à transPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 86/103 dução retroviral. No entanto, uma vez que é desejado expressar imunoglobulinas compostas de cadeias pesadas e leves recombinantes, são preferidas células B também desprovidas de expressão de componentes de cadeias leves substitutas (expressáveis a partir de genes Λ5, ou VpreBI, ou VpreB2), pois essas também podem competir para associação de cadeias pesadas com cadeias leves recombinantes em células pré-B de tipo selvagem. Assim, é esperado que células 1624-5 derivadas de camundongos depletados de modo triplo em cadeias leves substitutas sejam as células mais adequadas para tecnologia suplementar de apresentação retrocítica. Todavia, deve ser entendido que qualquer outra linha de células, incluindo as linhas de células adicionais analisadas aqui, que satisfaça os critérios de expressão nula/baixa de imunoglobulinas endógenas e aptidão para transdução retroviral, pode ser usada para implementar o método divulgado aqui.

EXEMPLO 6

Geração de células seletoras que expressam, de forma clonal e estável, bibliotecas de anticorpos total mente humanos

Para gerar partículas vetoriais com vetores de transferência empacotados que codificam cadeias de anticorpos totalmente humanos, e suas bibliotecas, e sua utilização subseqüente para a transdução de linhas de células B murinas, realizaram-se experimentos de infecção pelo método seguinte. Células 293T-HEK de rim embrionário humano foram plaqueadas, a 2 x 10⁶, em 10 mL de Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% soro fetal de vitelo (FCS) e L-Glutamina por placa de cultura de tecidos de 10 cm, 16 até 24 horas antes da transfecção. Foram preparadas misturas de 5 pg dos vetores de transferência respectivos lgL(245)-LIB-IRES-YFP e lgH(650)-LIB-IRES-GFP (que codificam bibliotecas de cadeias pesadas ou leves ligadas por um IRES a expressão de GFP ou YFP, Fig. 15), 3 pg de pVPack-GP (uma construção de expressão que alberga genes gag e pol do MLV) e 2,5 pg de pVPack-Eco (uma construção de expressão que abrange o gene envdo MLV ecotrópico, ambas da STRATAGENE), tendo sido incubadas com 30 pL de Fugene (Roche) em 1 mL de DMEM sem soro e deixadas repousar por 15 até 30 minutos à temperatura ambiente. A mistura Fugene/DNA foi então suavemente adicionada às células 293T-HEK semeadas nas placas de 10 cm. Vetores de transferência codificadores de cadeias pesadas e leves foram transfectados em células empacotadoras transitórias separadas.

Às 48 horas pós-transfecção, sobrenadantes contendo partículas vetoriais foram coletados de células empacotadoras transitórias e foram centrifugados a 3 000 rpm, para remover células contaminadoras. Suspenderam-se 1,5 x 10⁶ células B murinas 1624-5 em 1 mL de meio suplementado com diferentes quantidades de partículas vetoriais (diluições 1:1; 1:5; 1:20; 1:50; 1:100; 1:200) que tinham empacotadas as regiões codificadoras de cadeias pesadas ou leves de anticorpos. A transdução foi efetuada por centrifugação em taças EpPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 87/103 pendorf de 1,5 mL a 3,300 rpm e 30^sC por 3 horas. Os sobrenadantes não usados foram armazenados a -80^sC para utilização em um instante posterior. Para assegurar a integração de cópias isoladas de vetores de transferência no genoma das células hospedeiras, as células que revelaram, aos quatro dias pós-infecção, uma eficiência da transferência genética menor do que 10% (detectada por expressão de GFP ou YFP) foram enriquecidas usando FACS (Fig. 16). As células foram expandidas por seis dias e foram submetidas a um segundo procedimento de transdução empregando partículas vetoriais previamente congeladas, que tinham empacotadas as regiões codificadoras de cadeias leves de anticorpos, a uma diluição de 1:5 como descrito acima. Aqui, células positivas para GFP selecionadas quanto a expressão de cadeias pesadas foram infectadas com partículas vetoriais com transdução da biblioteca cadeias leves-IRES-YFP e vice-versa (Fig. 15 & 16). Aos quatro dias pósinfecção, as células transduzidas com êxito que expressaram GFP e YFP foram enriquecidas usando FACS. Aproximadamente 20% das células exibiu expressão de GFP e YFP após a segunda transdução. Para assegurar que ocorreram apenas integrações de um único vetor por célula, foi enriquecido cerca de um terço das populações que revelaram expressão somente baixa ou moderada do gene repórter transduzido na segunda ronda (aproximadamente 8%, ver Fig. 16).

EXEMPLO 7

Detecção e enriquecimento de células que expressam anticorpos humanos reativos com antígenos por Apresentação Retrocítica

a) Como preparação de um experimento de prova de conceito de Apresentação Retrocítica, em primeiro lugar foram determinadas as condições ótimas de coloração e detecção de anticorpos de ligação à IL-15 expressados de forma retroviral em células seletoras. Células pré-B transformadas com A-MuLV 1624-5 que co-expressam uma biblioteca de cadeias IgH e IgL humanas foram misturadas, em uma razão de 2:1, com células pré-B transformadas com A-MuLV 1624-5 que expressam vetores de expressão retrovirais que codificam um anticorpo anti-IL-15 humano na superfície celular. Amostras de células misturadas foram incubadas com várias concentrações de IL-15 humana recombinante (0,1 até 2,5 pg/mL) e várias concentrações de um anticorpo policlonal biotinilado anti-hu-IL-15 (1,0 e 3,0 pg/mL), como indicado, com revelação final com estreptavidina-ficoeritrina (strep-PE). Para distinguir células apresentando anticorpos de células que não expressaram imunoglobulinas, as amostras foram adicionalmente contra-coradas com um anticorpo anti-hu-lgKL-APC. Como pode ser observado nos dois painéis de FACS em cima à direita da Fig. 17, as células reativas com IL-15 foram detectadas de modo mais eficiente (20,1 e 20,4%) usando uma combinação de 0,1 e 0,5 pg/mL de IL-15 recombinante como reagente primário e 3,0 pg/mL do anticorpo anti-hu-IL-15 biotinilado como reagente de coloração secundário.

b) De seguida efetuou-se um experimento de prova de conceito, no qual um anti

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 88/103 corpo de referência específico para a IL-15 humana foi enriquecido em uma reunião de células que expressam uma biblioteca diversa de anticorpos humanos, após o que as células reativas com antígeno enriquecidas foram analisadas por FACS. Na preparação deste experimento, uma biblioteca de anticorpos expressados de forma retroviral em células 1624-5 5 (ver Exemplo 6) foi corada quanto a expressão de Ig de superfície e quanto a ligação à IL-15 (NC), em conjunto com uma linha de células 1624-5 que expressa o anticorpo e referência específico para o antígeno IL-15 humana (PC). As análises por FACS destas linhas de células NC e PC estão apresentadas na Fig. 18 e demonstram a coloração específica para a IL15 do anticorpo de referência anti-IL-15 apresentado na superfície das células PC. Para 10 analisar se a linha de células que expressa o Ab anti-IL-15 de referência ainda é detectável de modo quantitativo por FACS, se as células PC estiverem enriquecidas na linha de células NC que expressa uma coleção aleatória de anticorpos humanos, diferentes diluições de células PC na biblioteca NC foram analisadas por FACS quanto a ligação específica de IL-15, usando as condições otimizadas de coloração de IL-15 determinadas acima. A análise por 15 FACS de células de controle negativo revelou apenas uma pequena população exibindo atividade de ligação com a IL-15. Em contraste, foi demonstrado que mais de 60% da população de controle positivo ligou-se à IL-15. Por mistura de ambas as populações acima, em rácios de 10, 12,5, 25, 37,5 e 50%, observou-se uma correlação entre as percentagens de células de controle positivo misturadas na reunião de células da biblioteca de anticorpos e a 20 fração de células que demonstrou ligação à IL-15. Assim, é concluído que células reativas com a IL-15 podem ser detectadas de modo quantitativo por coloração por FACS em misturas com outras células que expressam anticorpos inespecíficos.

c) De seguida efetuou-se um experimento de prova de conceito no qual células raras reativas com a IL-15 foram enriquecidas por Apresentação Retrocítica. Para esta finali25 dade foi gerada uma coleção altamente diversa de anticorpos humanos expressados em células pré-B 1624-5 por transdução retroviral de uma cadeia IgH de IL-15 (acoplada a GFP) e co-transdução de uma coleção complexa (complexidade aproximada de 7x10⁴) de cadeias IgxL humanas (acopladas a YFP). Deste modo foi criada uma biblioteca de anticorpos de Apresentação Retrocítica por mistura de uma coleção diversa de cadeias IgxL humanas 30 contra uma única cadeia IgH de um anticorpo específico anti-IL-15 humano. As células foram coradas quanto à reatividade com a IL-15 usando condições otimizadas determinadas anteriormente. As células reativas com a IL-15 foram enriquecidas por três rondas consecutivas de triagem de células por FACS de alta velocidade, seguida de expansão da cultura de células. Após três rondas de enriquecimento por Apresentação Retrocítica foi possível obter 35 uma população de células que expressa anticorpos humanos e que essencialmente corou de modo quantitativo para o antígeno IL-15 a partir de uma população inicial de células na qual as células reativas com a IL-15 dificilmente eram detectáveis (Fig. 19). Este experimen

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 89/103 to demonstrou que foi possível usar, de modo eficiente, rondas repetidas de enriquecimento por Apresentação Retrocítica para enriquecer células de ligação à IL-15.

d) Confirmação da especificidade de ligação à IL-15 de clones de células individuais estabelecidos de uma reunião de células 3x enriquecidas em IL-15 (ver exemplo anterior). De seguida, da reunião de células que havia sido submetida 3 vezes a enriquecimento por Apresentação retrocítica específico para a IL-15 foram estabelecidos 25 clones de células individuais por triagem de células isoladas. Estes 25 clones de células foram caracterizados quanto à sua especificidade para a IL-15 por coloração de IL-15, usando as condições de coloração previamente otimizadas (ver Exemplo 7a). Como controle da especificidade da coloração de IL-15, todos os clones foram também incubados com todos os reagentes de coloração, excetuando o antígeno IL-15. A maior parte dos 25 clones de células isoladas exibiu um padrão de coloração de IL-15 altamente específico, que se perdeu quando o antígeno IL-15 foi deixado fora da reação de coloração. Colorações específicas da IL-15 representativas estão mostradas na Fig. 19 com 4 clones selecionados de células individuais. As colorações destes clones são representativas de todos os 25 clones de células (chamados, por ordem alfabética, de A até Y) estabelecidos de uma população de células 3x enriquecidas no antígeno IL-15, e todos testaram positivos para a ligação ao antígeno IL-15. Controles negativos e positivos para a especificidade das colorações são providos na Fig. 19, como indicado.

EXEMPLO 8

Abordagem de mistura de cadeias ou evolução guiada: Detecção e enriquecimento iterativo de células que expressam anticorpos humanos específicos para antígenos por triagem de células de alta velocidade, clonagem das regiões codificadoras de regiões variáveis de células selecionadas quanto a antígenos e confirmação da especificidade para antígenos

Como descrito acima (Exemplo 6), foi gerada uma biblioteca de células que expressa uma biblioteca de cadeias IgxL humanas, com uma complexidade aproximada de 1,2 x 10⁵, em combinação com a cadeia pesada do anticorpo de referência SK48-E26 (Young et al., WO 95/07997 A1) dirigida contra o antígeno alvo IL-1 β humano. O esqueleto do vetor retroviral que alberga estas cadeias está representado em mais detalhe nas Figuras 4c e 11 (ver também Exemplo 4). Para esta finalidade, 3 x 10⁶ células pré-B 1624-5 transformadas com A-MuLV 1624-5 foram transduzidas com o vetor de transferência codificador da cadeia pesada do SK48-E26 que alberga partículas a uma MOI menor do que 0,1. Um dia após a transdução, células positivas para GFP foram enriquecidas por triagem comum de células de alta velocidade usando um FACSAria da BD. As células sujeitas a triagem foram expandidas em cultura de tecidos em uma incubadora umidificada por cinco dias. Após a expansão, a população de células foi transduzida com partículas que tinham empacotada a biblioteca de cadeias IgxL, a uma MOI de 1,5, por infecção comum com rotação como descrito

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 90/103 acima (Exemplo 5), e permitiu-se a recuperação das células da transdução por dois dias em cultura de tecidos. Após o período de dois dias de recuperação e expansão, 5 χ 10⁵ células que co-expressaram a GFP e YFP e, assim, que albergam uma construção de pelo menos uma cadeia pesada e uma leve foram enriquecidas empregando triagem preparativa de cé5 lulas usando um FACSAria da BD. A população de células agora enriquecida quanto a coexpressão de construções de cadeias IgH e IgL foi expandida por mais quatro dias em cultura de tecidos. Após esta expansão final, uma alíquota de 2 χ 10⁶ células que expressam a biblioteca de cadeias IgH/lgL foi corada com 2 pg/ml, em um volume de 100 pL, com IL-1 β humana recombinante (R&D Systems) por 30 minutos em gelo, seguida de dois passos de 10 lavagem usando solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com 1% soro fetal de vitelo (FCS). Após incubação com anticorpos policlonais dirigidos contra a IL-1 β e conjugados a biotina, as células foram lavadas de novo duas vezes e foram subseqüentemente coradas com estreptavidina-APC, para detecção de células de ligação ao antígeno e seu enriquecimento subseqüente usando citometria de fluxo. Após uma primeira ronda de 15 triagem de células por FACS, as células foram expandidas por cinco dias e foram sujeitas a outra ronda de coloração anti-IL-1 β e enriquecimento de células com coloração positiva, como descrito acima. Esta seleção foi repetida três vezes (Fig. 21). A população de células obtida após três rondas de enriquecimento por Apresentação Retrocítica foi corada de novo quanto à ligação de IL-1 β como descrito acima, mas desta vez as células reativas não foram 20 enriquecidas na forma de populações em volume como previamente, mas clones de células individuais foram submetidos a triagem em placas de 96 cavidades por triagem de células isoladas usando um FACSAria da BD. Após sete dias de cultura e expansão, clones de células individuais foram novamente analisados quanto à especificidade para o antígeno IL-1 β usando o protocolo descrito e, adicionalmente, como controle negativo, com todos os rea25 gentes secundários excetuando o antígeno IL-1 β. Como esperado e demonstrado usando citometria de fluxo, alguns clones exibiram ligação específica ao antígeno alvo, revelada por um sinal de FACS específico na presença do antígeno, mas não na sua ausência (excluindo a ligação de fundo dos clones a qualquer um dos reagentes de detecção secundários). No entanto, alguns clones exibiram um sinal de coloração independentemente da presença do 30 antígeno, indicando que estes clones ligaram-se de modo inespecífico a qualquer um dos reagentes secundários usados para a detecção da reatividade com a IL-1 β. No total, DNA genômico de 24 clones de células foi isolado e serviu de modelo para PCR genômica comum empregando os oligonucleotídeos Seq-ID31 e Seq-ID32, que se ligam de modo específico a montante e a jusante da região variável de cadeias leves humanas codificadas na 35 biblioteca retroviral de cadeias leves, respectivamente.

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 91/103

Se q-1 D31; 5' -Cd TGAACCT CCTCGT TCGACCC— 3'

Sé q-1D32: 5'-AGG CACAACAGAGGCAGTTCCAG-3'

Obtiveram-se produtos de amplificação por PCR com a dimensão esperada de cada clone celular analisado, e os produtos de amplificação por PCR foram diretamente sujeitos a análise de sequências de DNA. Dos 24 clones analisados verificou-se que doze albergam uma cadeia IgKL idêntica mas nova, chamada de LCB24, e, como esperado, também 5 albergaram a cadeia IgH do SK48-E26, determinado de modo separado.

Como esperado, todos os 12 clones que expressam a cadeia IgL LCB24 em combinação com a cadeia IgH SK48-E26 exibiram sinais específicos da IL-1 β usando citometria de fluxo, como mencionado acima.

Um produto de amplificação por PCR selecionado contendo a cadeia IgKL LCB24 10 nova amplificada foi digerido com as enzimas de restrição Hindlll e Eco47lll flanqueando a região codificadora variável (Fig. 4c), e o fragmento foi clonado em um vetor de expressão retroviral de cadeias IgxL com sítios de enzimas de restrição compatíveis, permitindo a fusão na estrutura da região codificadora V_L LCB24 à região codificadora da cadeia leve capa humana constante. Assim, o vetor resultante codificou uma nova cadeia IgxL totalmente 15 humana.

O vetor de expressão retroviral clonado de novo e checado quanto à sequência para a cadeia IgL LCB24 foi transduzido, em conjunto com a cadeia IgH SK48E26 do anticorpo de referência para a IL-1 β SK48-E26, em células 1624-5. Após expansão em cultura de tecidos por 2 dias, as células GFP+/YFP+ foram enriquecidas por triagem de células de alta 20 velocidade usando um FACSAria da BD. As células resultantes que expressaram Ig foram primeiramente testadas quanto à sua capacidade para se ligarem à IL-1 β como descrito. Como esperado, foi confirmada a sua reatividade mediada por apresentação de LCB24 em conjunto com a cadeia pesada do SK48-E26 (Fig. 22). Para excluir que o novo anticorpo tinha reatividade geralmente cruzada com outros antígenos ou proteínas, as células expres25 sando a combinação IgL LCB24/lgH SK48-E26 foram avaliadas quanto à reatividade com a IL-15, como descrito antes. Como ilustrado na Fig. 23, não foi possível detectar nenhuma reatividade para a IL-15 para o novo anticorpo IgL LCB24/HC SK48-E26, indicando a especificidade para o antígeno alvo do novo anticorpo. Controles adicionais incluíram uma linha de células que expressa um anticorpo de referência específico anti-IL-15 (como controle 30 positivo) e o anticorpo original SK48-E26 para a IL-1 β. Não obstante as células que expressam o anticorpo anti-IL-15, como esperado, terem exibido coloração específica para a IL-15, não foi detectada nenhuma reatividade para o anticorpo SK48-E26 para a IL-1 β ou para células (Fig. 23).

Em resumo, foi identificada uma nova cadeia leve que medeia a reatividade especíPetição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 92/103 fica para antígenos em um experimento de rastreio empregando uma biblioteca de cadeias leves misturada contra a cadeia pesada de um anticorpo de referência SK48-E26 específico para a IL-1 β.

EXEMPLO 9

Rastreio de Apresentação Retrocítica em bibliotecas de cadeias IgH e IgL misturadas. Detecção e enriquecimento iterativo de células que expressam anticorpos humanos específicos para antígenos por triagem de células de alta velocidade, clonagem das regiões codificadoras de regiões variáveis de células selecionadas quanto a antígenos e confirmação da especificidade para antígenos

Como descrito acima (Exemplo 6), foi gerada uma biblioteca de células que expressa uma biblioteca de cadeias pesadas com uma complexidade aproximada de 6.5 x 10⁵(acopladas a GFP) usando uma MOI de aproximadamente 0,1. O esqueleto do vetor retroviral que alberga estas cadeias está ilustrado em mais detalhe nas Figs. 4c e 11 (ver também Exemplo 4). Para esta finalidade, 3 x 10⁶ células pré-B 1624-5 transformadas com A-MuLV 1624-5 foram transduzidas com o vetor de transferência codificador da biblioteca de cadeias IgH acima mencionado albergando partículas a uma MOI menor do que 0,1. Dois dias após a transdução, células positivas para GFP foram enriquecidas por triagem comum de células de alta velocidade usando um FACSAria da BD. Após a triagem de células GFP+, as células foram expandidas em cultura de tecidos por dois dias adicionais. Após a expansão, a população de células GFP+ foi transduzida com partículas que tinham empacotada uma biblioteca de cadeias leves consistindo em 245 cadeias leves totalmente caracterizados quanto às sequências a uma MOI >1, como descrito antes. Aos dois dias pós-transdução, células GFP+/YFP+ duplamente transduzidas foram enriquecidas por triagem de células de alta velocidade, e a população de células, que alberga agora bibliotecas de cadeias IgH e IgL na maior parte das células, foi expandida de novo por três dias em cultura de tecidos. De seguida, uma alíquota de 2,5 x 10⁵ células foi corada com um coquetel de antígenos incluindo, interalia, SAV (estreptavidina)-APC-Cy7 como descrito acima (ver Exemplo 8) e foi enriquecida quanto à reatividade do antígeno alvo usando citometria de fluxo. Em paralelo, a população de células que expressam a biblioteca IgH/lgL de anticorpos foi corada usando anticorpos específicos anti-lgL capa. Verificou-se que aproximadamente 75% destas células apresenta anticorpos humanos da superfície celular (dados não mostrados). As células reativas com antígenos foram submetidas a triagem de células de alta velocidade usando um FACSAria da BD, e as células enriquecidas foram expandidas em cultura de tecidos por sete dias. Os mesmos procedimentos de coloração e enriquecimento de células, descritos acima, foram repetidos mais duas vezes. Após três rondas de seleção por Apresentação Retrocítica, a população de células resultante foi corada de novo, para checar a ligação do antígeno alvo SAV-APC-Cy7, e foi analisada usando citometria de fluxo. Como ilustrado na Fig. 24, a

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 93/103 população em volume obtida exibiu ligação ao SAV-APC-Cy7, indicando a seleção com êxito de anticorpos com especificidade de antígenos para o SAV-APC-Cy7. Para checar a especificidade da reatividade contra o antígeno alvo SAV-APC-Cy7, as células expressando a biblioteca enriquecidas três vezes também foram coradas com os antígenos SAV-APC e SAV-PerCP-Cy5,5 (Fig. 25). De modo similar a células não transduzidas e células não selecionadas expressando a biblioteca servindo de controles negativos, estes antígenos não foram ligados pelas células enriquecidas em SAV-APC-Cy7 três vezes. No entanto, as últimas células revelaram de novo reatividade forte com o SAV-APC-Cy7, indicando que a especificidade para antígenos da população de células selecionadas foi dirigida contra o fluorocromo Cy7 do corante em série SAV-APC-Cy7.

DNA genômico da população de células enriquecida 3 vezes foi isolado e serviu de modelo para PCR genômico comum empregando os oligonucleotídeos Seq-ID31 (ver acima) e Seq-ID33 que se ligam especificamente a montante e a jusante das regiões codificadoras de cadeias leves e pesadas humanas codificadas nas bibliotecas retrovirais.

Ξ eq -1D 3 3 : 5^J -CGGTTCGGGGAAGTAGTCC'.fT GAC- 3¹ )

Foram obtidos produtos de amplificação por PCR para as cadeias pesadas e cadeias leves de dimensão esperada, tendo sido subclonados separadamente em um vetor comum de clonagem de fragmentos de PCR pSC-B (Stratagene), como recomendado pelo fabricante. Clones plasmídicos de pSB-C albergando as regiões clonadas de cadeias pesadas e leves foram isolados de 10 clones bacterianos, cada um resultante da subclonagem de fragmentos de PCR de IgH e da subclonagem de fragmentos de PCR de IgL, em que todos foram sujeitos a análise de sequências de DNA. A sequenciação de DNA revelou duas sequências de cadeias IgH diferentes, chamadas de HC49, HC58, e duas sequências de cadeias IgL diferentes, chamadas de LC4 e LC10.

Fragmentos de DNA contendo as regiões codificadoras V_H e V_L foram isolados de clones checados quanto à sequência por digestão com Hindlll e Eco47lll, pois estes sítios de enzimas de restrição flanqueiam as regiões variáveis (ver Fig. 4c) das regiões V_H e V_Lrespectivas de HC49, HC58, LC4 e LC10. As regiões V_H e V_L isoladas de HC49, HC58, LC4 e LC10 foram clonadas em um vetor receptor retroviral albergando as regiões constantes de uma cadeia IgylH humana (expressão IRES acoplado a GFP) e uma cadeia IgxL humana (expressão IRES acoplado a YFP), respectivamente, como descrito acima. Deste modo foram geradas construções de vetores de expressão retrovirais que codificam cadeias IgH e IgL totalmente humanas para as novas cadeias IgH HC49 e HC58, cadeias IgL LC4 e LC10. Por co-transdução destes vetores em células pré-B 1624-5 e expansão por 8 dias, células GFP+/YFP+ foram enriquecidas usando citometria de fluxo como anteriormente. As células resultantes foram primeiramente testadas quanto à sua capacidade para se ligarem ao SAVAPC-Cy7 como descrito. Como ilustrado na Fig. 26, a reatividade de células expressando os

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 94/103 anticorpos HC49/LC4 e HC/LC10 não exibiu atividade de ligação significativa contra o SAVAPC-Cy7. Em contraste, a reatividade mediada pelos anticorpos HC58/LC4 e HC58/LC10 foi facilmente detectada. Isto provê uma prova de conceito para a identificação com êxito de novos anticorpos específicos para antígenos por Apresentação Retrocítica com base na mistura de coleções diversas de cadeias IgH e cadeias IgL, sem a necessidade de uma cadeia IgH ou IgL conhecida de um anticorpo de referência com especificidade para antígenos conhecida.

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Claims

1. Método para o isolamento e identificação de pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo, ou seu fragmento, específico para um antígeno ou ligante desejado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) transdução de pelo menos uma construção de expressão retroviral que codifica um anticorpo, ou seu fragmento, em células hospedeiras de vertebrado pelo uso de partículas retrovirais incompetentes para replicação, em que pelo menos uma construção se integra de forma estável no genoma da célula hospedeira de tal modo que as células hospedeiras transduzidas são capazes de expressar e exibir o referido anticorpo, ou seu fragmento, na sua superfície celular, e em que as células hospedeiras de vertebrado são linfócitos B precursores que expressam endogenamente moléculas Iga e IgP que facilitam a deposição da membrana do referido anticorpo ou de seu fragmento, e são incapazes de expressar polipeptídios de anticorpo endógeno e pelo menos um componente de cadeia leve substituto;

(b) expressão de forma estável do referido anticorpo, ou seu fragmento, nas referidas células hospedeiras de vertebrado e exibição do mesmo sobre sua superfície celular;

(c) enriquecimento das referidas células hospedeiras de vertebrado que expressam o referido anticorpo, ou seu fragmento, com base nas suas capacidades de se ligarem ao referido antígeno ou ligante desejado pela separação de células que exibem ligação ao antígeno específico a partir de uma população de células não-ligantes, isolando assim seletivamente ligantes de anticorpos fortes possuindo elevada afinidade ao referido antígeno ou ligante desejado, e (d) isolamento e identificação da referida pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica o referido anticorpo, ou seu fragmento, a partir das células hospedeiras de vertebrado enriquecidas e transduzidas de forma retroviral.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (d) é precedida pela expansão das referidas células hospedeiras de vertebrado enriquecidas em cultura de tecidos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (c) é seguida pela expansão das referidas células hospedeiras de vertebrado enriquecidas em cultura de tecidos, após isso a etapa (c), como definida na reivindicação 1, é repetida pelo menos uma vez.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a transdução retroviral é efetuada a uma multiplicidade de infecção igual ou menor do que 0,1.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,

CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento completo.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 99/103

CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de um anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em: uma cadeia pesada, uma cadeia leve, um domínio único V_H, um domínio único V_L, um fragmento scFv, um fragmento Fab e um fragmento F(ab’)2.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,

5 CARACTERIZADO pelo fato de que as células hospedeiras de vertebrado são derivadas de um grupo de espécies que consistem em peixes cartilaginosos, peixes ósseos, anfíbios, répteis, pássaros, mamíferos incluindo porco, ovelha, gado, cavalo e roedores incluindo camundongo, rato, coelho e porquinho da índia.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a 10 espécie de célula hospedeira de vertebrado preferida é de camundongo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo de comprimento completo é selecionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo totalmente humano, um anticorpo humanizado e um anticorpo quimérico.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9,

15 CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma construção de expressão é uma pluralidade de construções de expressão que codificam (i) uma sequência de cadeia pesada de anticorpo e múltiplas sequências de cadeias leves de anticorpo, ou (ii) uma sequência de cadeia leve de anticorpo e múltiplas sequências de cadeias pesadas de anticorpo.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10,

20 CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou seu fragmento, compreende um domínio de ligação variável codificado pela referida pelo menos uma construção de expressão retroviral que permite recombinação V(D)J com a finalidade de gerar uma sequência codificadora para um domínio de ligação variável por transdução retroviral.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 25 CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (b) é efetuada em condições de mutageniza- ção.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão do referido anticorpo, ou seu fragmento, nas células hospedeiras de vertebrado transduzidas de forma retroviral está operativamente

30 ligada a:

(a) pelo menos um marcador de seleção de antibiótico, (b) pelo menos um marcador de rastreio, e/ou (c) uma combinação destes, e em que a expressão do referido anticorpo, ou seu fragmento, é acoplada usando 35 pelo menos uma sequência interna de entrada do ribossomo (IRES).

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um marcador de rastreio é:

Petição 870180067999, de 06/08/2018, pág. 100/103 (i) uma proteína fluorescente selecionada do grupo que consiste em proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarela fluorescente (YFP), proteína vermelha fluorescente (RFP) e proteína azul fluorescente (BFP), ou (ii) um marcador da superfície celular selecionado do grupo que consiste em CD7, 5 CD34 e o receptor do fator de crescimento de nervo de baixa afinidade.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de enriquecimento (c) é efetuada por separação física de células de uma população de não-ligantes usando:

(i) separação de células ativadas por fluorescência (FACS);

10 (ii) micromanipulação, ou (iii) métodos de imobilização para o antígeno ou ligante imobilizado.