TWI707037B

TWI707037B - 表現載體生產與高通量細胞篩選

Info

Publication number: TWI707037B
Application number: TW108122173A
Authority: TW
Inventors: 安倫布萊德利; 宜彊李; 梁琦; 劉輝; 安德魯沃德; 瑋瑜黃
Original assignee: 英商凱美寶有限公司
Priority date: 2013-09-19
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2020-10-11
Also published as: US20230049767A1; US20190300876A1; GB201316644D0; EP3047022B1; TW201938791A; EP3047022A1; US11371042B2; US20160208239A1; TWI667345B; EP3047022B8; ES2811251T3; TW201546280A; WO2015040401A1; US10337000B2; EP3047022B2; EP3766970A1

Abstract

本發明尤其有關表現載體的生產以及應用至宿主細胞的生產，用於蛋白質庫表現與高通量篩選。本發明亦有關對PCR放大編碼人類抗體可變域之核苷酸序列有用的引子。

Description

表現載體生產與高通量細胞篩選

發明領域

本發明尤其有關表現載體的生產以及應用至宿主細胞的生產，用於蛋白質庫表現與高通量篩選。本發明亦有關於對PCR放大編碼人類抗體可變域之核苷酸序列或在細胞中與免疫球蛋白(Ig)基因座同源重組有用的核酸、PCR引子及混合物。

發明背景

本技藝認同篩選細胞或蛋白質庫的希求，以識別感興趣蛋白質(POI)或表現這些蛋白質的細胞。舉例而言，本技藝包含篩選B細胞及抗體庫的技術，以為了識別一或多個表現展示所欲特性(典型地特異性抗原結合)抗體的細胞。篩選不僅限於抗體篩選，但亦可能適用於針對一或多個所欲特性篩選其他類型的蛋白質集合。

為了表現蛋白質庫，相應的核苷酸序列可以被選殖到個別的表現載體內，並引入(例如轉染)到可表現該蛋白質的宿主細胞中。通常，分子選殖係使用以從一庫中選殖蛋白質編碼序列到宿主細胞內。分子選殖已經被應用到B 細胞(淋巴球)篩選技術，其中B細胞係藉由培養擴大，分選成單一細胞(例如，使用溶血斑檢測法或螢光焦點檢測(fluorescent foci assay))，源自該經分選細胞的抗體鏈(或可變區)mRNA係使用RT-PCR反轉錄並放大的，經放大的DNA進行分子選殖，以引入抗體鏈編碼序列至核酸載體內，且該載體然後係引入到宿主細胞內，用於瞬時表現(其中該載體係為游離基因體型)，或用於穩定表現(藉由隨機併入到宿主細胞基因組中)。參閱，舉例而言，J S Babcook等人之"Proc Natl Acad Sci U S A.1996 Jul 23；93(15)：7843-8,A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single,isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities”，(被稱為SLAM技術)，及S Tickle等人之"doi：10.1016/j.jala.2009.05.004 Journal of Laboratory Automation October 2009 vol.14 no.5 303-307,High-Throughput Screening for High Affinity Antibodies”，(被稱為UCB SLAM技術)。

分子選殖涉及以攜帶限制性內切酶選殖位點的引子PCR放大cDNA(藉由POI mRNA之RT-PCR而產生)。這將產生每一POI核苷酸序列係由限制性位點夾擊的PCR產物。該PCR產物然後係以適當的限制性內切酶消化，並藉由接合作用次選殖到提供一啟動子與多聚腺甘酸信號以及攜帶一選擇標記之一空的表現載體內。該經接合的產物然後係轉形到大腸桿菌內，且選殖係藉由標記的存在而選擇的。藉由費力的限制性圖譜及個自選殖株的定序確認並選擇具有正確序列插入的選殖株為必要的。每一單一正確的選殖株表現載體然後係個自地從大腸桿菌純化並轉染到一宿主細胞內(例如，CHO或HEK293哺乳類細胞)，用於瞬時或穩定的表現。

分子選殖因此為涉及到多重步驟的一費力技術，且不是很適合高通量。

瞬時表現，諸如從一線性表現卡匣，通常為受限的，而穩定表現對長期表現為較佳的。為了穩定表現，典型地該感興趣的POI編碼序列係藉由外源DNA自發併入的經典併入方法插入到哺乳類基因組中(意即，隨機併入基因組中)。這種方法常常導致顯著的轉錄變化(且因此為不可預測及不一致的POI表現)，由於在轉基因拷貝數及併入位點中之差異的結果(參閱Henikoff S於1992年之“Position effect and related phenomena,Curr Opin Genet Dev 2(6)：907-912”；Martin DI及Whitelaw E於1996年之“The variegating transgenes,Boessays 18(11)：919-923”；及Whitelaw E等人於2001年之“Epigenetic effects on transgene expression,Methods Mol Biol.158：351-368)”。此外，在此方式中併入的轉基因片段常常發現以連環體(concatemer)插入的，該者可能藉由重複誘導的基因靜默引致基因失活(參閱Garrick D等人於1998年之“Repeat-induced gene silencing in mammals,Nat Genet 18(1)：56-59”；及McBurney MW等人於2002年之“Evidence of repeat-induced gene silencing in cultured Mammalian cells：inactivation of tandem repeats of transfected genes,Exp Cell Res 274(1)：1-8”)。這些問題阻礙了POI庫及用於表現此種POI庫之細胞族群的生產。

對於從人類或攜帶一抗體庫的轉基因動物生成單株抗體(mAb)存在著許多技術。一般來說，mAb係從永生化B細胞獲得的，不是藉由融合作用(融合瘤技術)就是藉由轉形作用(病毒轉染或癌基因轉形)。然而，這些細胞永生化方法係不適合用於大型抗體庫的全面篩選，因為它們係高度偏倚、低效的，且典型地僅可抽樣可獲得庫的微小比例(典型地小於，舉例而言，從免疫小鼠獲得的B細胞庫(永生化細胞/輸入細胞)之0.1%)。使用不要求永生化的替代篩選方法因此係為有吸引力的，但目前技術面臨上述的問題。

發明概要

本發明著墨於對順適於高通量、適於庫及篩選之可靠生產的載體生產技術的需要，特別是具自動化潛力者。

因此，本發明之第一配置提供：-在第一層面，一種生產編碼感興趣蛋白質(POI)庫之細胞的方法，該方法包含：、a)提供表現一POI庫的細胞族群；b)分選該細胞族群，以產生一經分選的單一細胞族群，每一細胞包含編碼一個別POI的核酸； c)放大由該經分選之單一細胞族群所含括的核酸，以產生一經分選之編碼POI的放大核酸庫；d)修飾源自步驟(c)之經分選、放大的POI編碼核酸，以產生一經分選的表現卡匣庫，每一卡匣包含編碼一POI之核苷酸序列及用於表現該POI之一或多個調控元素；及e)從該卡匣庫轉殖POI表現卡匣至一經分選的宿主細胞族群，同時維持該POI表現卡匣分選，並產生表現一經分選POI庫的一經分選宿主細胞庫。

在一實施例中，步驟(e)中分選係藉由在數個相對位置及總體排列為固定的容器中提供該庫而維持的。這使得本發明方法能夠高通量處理並且自動化，例如，針對有效且快速的細胞篩選，以選擇一或多個感興趣的POI序列。此外或或者，步驟(e)中表現卡匣的轉殖係藉由批次轉殖實行的，且這也使得本發明的方法能夠高通量處理及自動化。

在第二層面中，一種用於執行前述方法的自動化裝置，該裝置包含a)用於持有在數個容器中之一經分選單一細胞族群的工具，其中每一單一細胞係在一個別容器中，每一細胞包含編碼個別POI的核酸；b)用於遞送PCR試劑至容器的工具，用於放大由該經分選單一細胞族群所含括的核酸，以產生經分選的編碼POI之放大核酸庫；c)用於遞送試劑至容器的工具，用於修飾經分選放大的 POI編碼核酸，以產生一經分選的表現卡匣庫，每一卡匣包含編碼一POI的核苷酸序列及一或多個用於表現該POI的調控元素；d)用於持有在數個容器中之經分選的宿主細胞族群的工具；e)用於從該卡匣庫轉殖POI表現卡匣至在該容器中之經分選宿主細胞族群的工具，且同時維持該POI表現卡匣分選；及f)用於實行表現卡匣轉染到在容器內之宿主細胞的工具，以產生表現經分選POI庫的經分選宿主細胞庫。

本發明之第二配置提供：-在第一層面，用於在一宿主細胞中表現一POI的表現卡匣，該卡匣係由包含一轉位子的線性核酸所提供，該轉位子包含5'-及3'-末端轉位子元素，伴隨在轉位子元素之間的一POI編碼核苷酸序列及用於POI表現的調控元素(等)。

在第二層面，一經分選的表現卡匣族群，該者編碼POI庫其對應於由一細胞族群表現的POI，每一卡匣包含編碼該POI庫中之一成員的一核苷酸序列，及一或多個用於POI表現的調控元素，其中該卡匣每一者包含該排列(在5'端至3'端方向)：轉位子元素-[POI核苷酸序列及調控元素(等)]-轉位子元素，且用於表現源自不同細胞之POI的表現卡匣在該經分選族群中係彼此分離的(例如，在一盤的不同孔洞中)。

在第三層面，製作包含一感興趣核苷酸序列(NOI)之轉位子的方法，該方法含a.提供一第一核苷酸序列其包含(在5'端至3'端方向)A、B及C，其中A係為一第一同源序列，B係為包含該NOI之一核苷酸序列，而C係為一第二同源序列；b.提供一第一模板核苷酸序列其包含(在5'端至3'端方向)W及X，其中W係為包含一第一轉位子元素的核苷酸序列，而X係為一第三同源序列；且c.提供一第二模板核苷酸序列其包含(在5'端至3'端方向)Y及Z，其中Y係為一第四同源序列，且Z係為包含一第二轉位子元素的核苷酸序列；且下列任一的d.(i)將該第一核苷酸序列與該第一模板混合，以雜交該第一及第三同源臂一起並實行核酸放大及延伸，並使用該第一模板延伸該第一核苷酸序列，以產生一第一經延伸核苷酸序列(第一ENS)，該者包含(在5'端至3'端方向)W、B及C；且(ii)將該第一ENS與該第二模板混合，以雜交該第二與第四同源臂一起並實行核酸放大及延伸，以延伸該第一ENS以產生一第二ENS，該者包含(在5'端至3'端方向)W、B及Z；或(ii)將該第一核苷酸序列與該第二模板混合，以雜交該第二及第四同源臂一起並實行核酸放大及延伸，以使用該第二模板延伸該第一核苷酸序列，以產生一第三經延伸核苷酸序列(第三ENS)，該者包含(在5'端至3'端方向)A、B及Z；且(ii)將該第三ENS與該第一模板混合，以雜交該第一及第三同源臂一起並實行核酸放大及延伸，以延伸該第三ENS，以產生一第四ENS，該者包含(在5'端至3'端方向)W、B及Z；或(iii)將該第一核苷酸序列與該第一及第二模板混合，以雜交該第一及第三同源臂一起，並雜交該第二及第四同源臂一起，並實行核酸放大及延伸，以使用該第二模板延伸該該第一核苷酸序列，以產生一第五ENS，該者包含(在5'端至3'端方向)W、B及Z；且e.分離包含(在5'端至3'端方向)W、B及Z之一ENS，從而產生一分離轉位子其包含由轉位子元素夾擊之一NOI；且f.可選地引入分離轉位子至一受體細胞，使得該轉位子併人至該細胞的基因組內。

本發明之第三配置提供：-一種生產用於表現一POI之宿主細胞的方法，該方法包含a.提供至少第一及第二表現卡匣，其中每一表現卡匣包含i.一第一併入元素及該第一併入元素核苷酸序列3'的一第二併入元素；且ii.在該等併入元素之間編碼POI之一核苷酸序列及一或多個用於表現該POI的調控元素；iii.其中該等併入元素係能夠藉由識別一核酸之一預決定核苷酸序列基序、使用一併入酶插入至該核酸內； b.提供一宿主細胞其基因組包含數個該基序者；且c.同時或依序地引入該第一及第二表現卡匣至該宿主細胞內，其中每一卡匣係於一該基序基因併入至該宿主細胞基因組內，用於由該宿主細胞表現POI；且d.可選地產生一細胞株其在包含培養該宿主細胞之一步驟中表現POI。

本發明之第四配置提供：-包含一第一分離核酸及一第二分離核酸的核酸混合物，其中該第一核酸係能夠雜交至由一標靶核酸所含括之一基因的人類抗體V區的5'端UTR序列，其中該基因編碼人類V區；且該第二核酸係能夠雜交至一第二序列，其中該第二序列係由該標靶核酸所含括，且在該UTR序列之3'端，其中該第一分離核酸包含一序列其係至少90%一致於選自由序列識別編號：1-47所組成之該群組中之一序列者。

一種包含一第一分離核酸及一第二分離核酸的核酸混合物，其中該等核酸係為不同的，且選自於核酸其包含至少90%一致於選自由序列識別編號：1-47所組成之該群組之一序列的序列者。

一種放大人類可變區序列之庫的方法，該方法使用該等序列之一或多者。

圖1A係為一示意圖，其例示本發明用於在一宿主細胞(例如CHO或HEK293細胞)中產生一抗體結合位點(POI)庫之方法之一非限制性例子。

圖1B係為一替代性示意圖，其例示本發明用於在一宿主細胞(例如CHO或HEK293細胞)中產生一抗體結合位點(POI)庫之方法之一非限制性例子。

圖2：對於不同B細胞族群之閘控(gating)策略之例子。(a)一流式細胞儀等高線圖展示在排除IgM與IgD B細胞之後CD38+CD95+記憶細胞族群之閘控的一個例子。(b)對CD19(太平洋藍)及抗原(卵清蛋白-AlexaFluor-488)陽性的每一個自記憶細胞然後係分選至在一96孔盤中的單獨孔洞內。

圖3：一流程圖其總結了從單一B細胞的高通量抗體生產。基於單一細胞的cDNA合成係使用恆定區特異性引子執行。對於5'端具人類巨細胞病毒(hCMV)啟動子片段之重鏈與輕鏈的V基因特異性引子混合物係使用於該第一輪PCR，以放大該V基因片段。黏著至該hCMV標籤的一通用正向引子係與一反向巢式引子使用於該第二輪PCR的恆定區。該等經放大的產物然後係與具5'端PB LTR-CMV啟動子及恆定區-多聚腺苷酸信號-3'端PB LTR的線性Ig-卡匣橋接。

圖4：藉由橋式PCR製造重鏈及輕鏈表現構建體。(a)從單一細胞放大之V_H與V_L基因片段對之溴化乙菲錠染色的瓊脂糖凝膠。每一泳道含有30μL V_H+V_L第二輪PCR產物中的10μL。(b)溴化乙菲錠染色的瓊脂糖凝膠顯示該橋式PCR結果。每一泳道含有用於Ig-表現之30μL橋式產物中的10μL。該陰性對照組顯示重鏈與輕鏈的Ig-卡匣。源自高通量96孔PCR平台的代表性PCR產物係於這裡顯示的。

圖5：分析源自項目1該經分選Ag-特異性單一B細胞的抗體序列。由個自B細胞表現之抗體序列係藉由重鏈V基因家族慣例排列，並分群以生成該顯示的演化樹。

圖6：顯示親和力成熟(affinity maturation)之分群家族之一例子，該親和力成熟係經由對表觀親和力(apparent affinity)與中和效力兩者之高突變。CNROR：無法解析等級。

圖7：藉由piggyBac轉位子系統表現量推進。該經轉染橋式PCR產物在HEK293細胞中的抗體表現係使用共轉染測試：伴隨不同數量的PBase：0；20；100；500ng/well。在每一孔洞中之上清液係收集的，於第0天；第2天；及第5天。數據顯示的是，該轉位子系統在第5天提高表現量2-4倍。

圖8：定量在轉染以橋式PCR產物之HEK293細胞之上清液中的IgG濃度的例子。該濃度係在轉染後第八天藉由一三明治ELISA測定的。該濃度係從約200ng/mL至3000ng/mL，這之間的濃度係可與先前技藝之雜交瘤技術之上清液中的濃度比較的。

圖9A及B：結合至卵清蛋白之抗體的代表性SPR光譜(sensorgrams)。大約三分之二的測試抗體顯示與抗原結合的證據，伴隨範圍歧異的區別結合親和力與動力學。

圖10：針對兩種不同標靶抗原的抗體表觀親和力。一範圍的綴合物(空心)以及功能性中和劑(實心)係偵測到，伴隨在微微莫耳範圍內偵測到的最高親和力。此實驗證實了我們的單一B細胞選殖技術在高親和力及功能性勝任抗體之識別與取得中為一有力的工具。

發明之詳細說明

圖1係為一示意圖，例示本發明用於在宿主細胞(例如CHO或HEK293細胞)中生產抗體結合位點(POI)庫之方法的一個例子，該方法在B細胞篩選過程中為有用的。在圖1該示意圖之末端生產的宿主細胞庫係為有用的，因為該細胞表現可以針對一預決定抗原篩選的抗體結合位點(例如V_H/V_L對)，以識別何者細胞表現感興趣的結合位點。這樣因此使得基因型到表型能夠連鎖，允許識別編碼一感興趣結合位點的核苷酸序列。此核苷酸序列然後可以用來構建用於穩定生產所欲抗體的細胞株，例如，生產標靶該預決定抗原的藥物性或診斷性或研究試劑抗體。在一例子中，在圖1示意圖之末端生產之該宿主細胞本身係為穩定地表現該結合位點的一細胞，且這賦予了用於長期製造該結合位點之便利及有效的穩定細胞株之生成的可能性。如下文進一步所討論的，在一例子中，位點介導的POI編碼表現卡匣插入可以在宿主細胞中執行，此提供了該穩定POI表現可避免隨機併入與連環體的附加優勢。

雖然例子係以抗體結合位點、抗體可變域及抗體鏈的觀點提供，本發明並不受限於此種蛋白質。在這個意義上，本發明係適用於任何感興趣蛋白質(POI)。在此上下文中，術語“蛋白質”亦包括感興趣的多胜肽與胜肽，以及蛋白質或多胜肽片段或域。

回到圖1之非限制性例子，在第一步驟中，一所欲的B細胞族群係提供的，該者可以為一生殖細胞、記憶細胞、漿母細胞、漿細胞或一般可能為一抗體分泌細胞(ASC)，或這些B細胞類型之二或多種的混合物。熟習該項技藝者係熟悉此種族群的選擇，舉例而言，使用細胞表面標記，任選地藉由FACS。此種標記可能選自於CD19、IgM、IgD、CD30及CD95，舉例而言，且可能包括這些中一或多者(例如，1、2、3、4)之一組合，或可能包括這些標記全部之一組合。擁有這些標記的細胞可能染色的，舉例而言，藉由可以由細胞分選系統偵測的任何小分子螢光團，諸如Alexa-488、Alexa-647、太平洋藍、R-藻紅蛋白、螢光素異硫氰酸酯或異藻藍蛋白，任選地共軛至一花青染料，例如Cy7。該B細胞族群可以在一初步步驟中，藉由從一或多個動物(例如小鼠、大鼠或人類或非人類動物)分離而產生，舉例而言已以一標靶抗原免疫的動物。因此，本發明之方法對篩選B細胞族群以識別衍自一B細胞之一或多個POI序列為有用的，其中該POI結合至具一所欲特性的標靶抗原。此種特性為，例如，結合至該標靶抗原及/或一結構上相關的、同源或異種同源抗原(例如，來自不同物種的一抗原)；及/或結合具所欲親和力之一抗原；及/或與一已知抗體競爭結合一預決定抗原(例如，該標靶抗原)；及/或結合一預決定的抗原決定位。

任選地，該所欲輸入的B細胞族群(例如，漿母細胞或漿細胞)可以使用該技藝中已知的技術，藉由執行抗原特異性細胞分選而選擇(例如參閱Jin,A等人於”Nature Medicine,2009,15(9)：1088-1093”)。該輸出係為一B細胞族群其表現特異性結合一預決定標靶抗原之抗體結合位點者。本發明人已發現執行此步驟以簡化整個B細胞篩選過程為有利的，從而允許有效且高通量的篩選。

一般地，抗原特異性GC(生殖中心)或記憶B細胞可以藉由標誌抗原捕獲的，因為它們顯性地表現在細胞表面上的跨膜抗體。該抗原可能被螢光標誌的(舉例而言，可以藉由細胞分選系統偵測的任何小分子螢光團，諸如Alexa-488、Alexa-647、太平洋藍、R-藻紅蛋白、螢光素異硫氰酸酯或異藻藍蛋白，任選地共軛至一花青染料，例如Cy7)。假若該B細胞族群已預先染色用於最初選擇，其係有利的是，使用一螢光團其具有不同於在該最初選擇中所使用之螢光團的發射波長者，以為了促進該分選過程，例如使用FACS。在一替代例中，該細胞可能同時針對細胞選擇標記的存在染色，並針對結合至螢光抗原/擁有抗原的VLP篩選。不受限於理論，其係認為的是，另一方面，漿母細胞或漿細胞將不容易藉由標誌抗原捕獲的，因為其分泌抗體的顯性表現。

在一替代實施例中，該抗原可能以其表面上具重組抗原的類病毒顆粒(VLP)捕獲的。VLP可能從CHO細胞、KEK細胞、小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)或其他哺乳類細胞株生成的，伴隨重組抗原、逆轉錄病毒之gag蛋白及MA-GFP(gag基質片段的p15-GFP融合蛋白)的共同表現。gag蛋白表現使得VLP能夠從細胞出芽，而MA-GFP標誌該VLP用於螢光偵測。gag與MA-GFP蛋白兩者皆與原生質膜的內表面結合，而重組抗原係於該VLP表面。在VLP上的抗原係以從重組細胞直接表現而不經任何純化或修飾步驟的原生形式呈現。一抗原的原生形式應提供所有的天然抗原決定位，該者大大地幫助中和抗體的選擇。VLP上抗原的高密度提高了對偵測在細胞表面上表現抗原特異性抗體之細胞的信/噪比，且大大地促進該分選步驟。該重組VLP可以伴隨不同螢光蛋白的表現而生成，諸如MA-CFP或MA-YFP。使用具不同抗原及不同螢光蛋白的多工VLP，表現高親和力綴合物(binders)、交叉反應性綴合物或同源物特異性綴合物的細胞可以被選擇。表現高親和力綴合物的該細胞可以藉由具相對高親和力基質(affinity matrix)的細胞選擇(親和力基質=對低密度抗原VLP比對高密度抗原VLP的結合活性比值)。對異種同源或不同抗原(針對2合1或雙特異性抗體的分離)表現交叉反應性綴合物的細胞，可以藉由於同一時間結合至不同類型VLP的細胞而選擇。表現同源物特異性綴合物的細胞亦可以藉由僅結合到特定抗原但不是其同源物的細胞而選擇。

B細胞由此係經分選(例如，使用FACS)，以提供一經分選、單一的B細胞族群。典型地，該等B細胞係分選至一標準盤(例如，一標準的96孔或364孔盤)的孔洞內，使得每一單一細胞係於一個別孔洞中，且不與其它細胞混合。其係可能，有一最小數目(例如，小於5%、小於3%、小於2%或小於1%、或不可偵測的程度)的孔洞不具有或具一個以上(例如兩個)的細胞，而這並不妨礙該篩選方法的總體效用(且不視為該所欲庫的一部分)。較佳地，盤上每一孔洞含有一單一B細胞。任選地，其係可能在該細胞分選步驟之前及/或之後直接培養細胞，但本發明人發現這不同於該技藝中的技術為必要的。因此，藉由避免此步驟，本發明之方法協助自身進一步精簡及高通量。

接著，在圖1所顯示的例子中，POI編碼之核酸係放大的。在該例子中，此係藉由反轉錄在該經分選細胞族群之細胞中的mRNA而執行(意即POI編碼的mRNA係轉換為對應的POI編碼cDNA)，且此係用PCR放大的。標準RT-PCR可以如熟習該項技藝者所熟悉般的使用(例如參閱Dixon AK等人於"Trends Pharmacol.Sci.,2000,21(2)：65-70")。這樣產生了一編碼抗體可變區庫的DNA庫。在此例子中，V_H及V_L兩者之序列對每一經分選細胞係拷貝並放大的。熟習該項技藝者將知道的是，每一細胞表現一單一類型的抗體結合位點，因此，每一單一經分選細胞僅有一單一類型放大的V_H序列及單一類型的V_L序列將被放大(因此，被使用孔洞哪裡，每個孔洞僅獲得單一的V_H與V_L類型，該者從而保留了形成結合位點的V_H與V_L序列之分組)。

POI編碼序列在該方法的後期階段亦經修飾，以產生表現卡匣庫，用於表現來自宿主細胞的POI。該表現卡匣含有POI編碼核苷酸序列及一或多個用於表現的調控元素(例如，一啟動子及/或增強子及/或多聚腺苷酸)。在一實施例中，該放大及修飾步驟可以使用PCR及對熟習該項技藝者將為顯而易見的適當模板與引子而同時執行。在另一實施例中，放大及修飾係於分開的步驟實行，例如，放大，然後修飾。在圖1之例子中，RT-PCR係首先實行，且然後該放大的POI編碼序列係修飾以產生表現卡匣，每一者包含(在5'端至3'端方向)：啟動子-POI核苷酸序列-多聚腺苷酸。在此例子中，夾擊的轉位子元素亦加入。該轉位子元素可以為piggyBac(PB)轉位子倒轉末端重複元素，以形成一轉位子核酸其包含下列結構：[5'端PB元素]-[啟動子]-[POI核苷酸序列]-[聚腺苷酸]-[3'端PB元素]。在一例子中，每一表現卡匣係由包含或由該轉位子組成的線性DNA提供的。

PB 5'端元素：

PB 3'端元素：

如圖1例子中所顯示，橋式PCR(參閱，例如，Mehta R.K.及Sihgh J.之"Biotechniques,1999,26(6)：1082-1086")可以使用以藉由添加該夾擊的轉位子元素構建該轉位子。

在該方法之這個階段，已經獲得一表現卡匣庫其編碼衍自該輸入細胞族群之POI編碼核苷酸序列庫者。在此例子中，該放大及修飾程序係於經分選在一或多個盤上之孔洞中的該等單一細胞上實行。因此，其結果為一經分選的表現卡匣庫(在此情況下每一單一孔洞，該孔洞含有衍自一單一輸入細胞之一種類型抗體結合位點之數個一種類型的V_H表現卡匣及一種類型的V_L表現卡匣)。接著，該經分選的表現卡匣(在本例子中，含括在個別轉位子中，且任選地以線性DNA)係轉殖至宿主細胞，以產生表現一經分選POI庫的經分選宿主細胞庫。在本例子中，此可以被執行的，藉由從一盤(或一組盤)上的孔洞轉殖表現卡匣至具有數個含有宿主細胞之細胞(例如，相同細胞株之一致類型的細胞，例如CHO或HEK293或酵母細胞)的一或多個其它盤。在此實施例中，該經分選卡匣庫可以使用多通道移液管(例如，如該技藝所知之一4、8、12、16(2×8)、64(8×8)、96(12×8)、384或1536通道移液管)手動或以一機械手臂轉殖，以同時從第一盤上之個自孔洞取回卡匣(在此情況下經分選的VH/VL卡匣對)，並轉移到在第二盤上的對應孔洞，其中這些孔洞含有宿主細胞。藉由這樣做，該表現卡匣的相對位置與經分選本質當轉殖至宿主細胞時係維持的。這具有維持V_H/V_L卡匣序列對之連鎖而不混合的優勢(意即，在第二盤上的每一孔洞，該孔洞僅含有宿主細胞及衍自一單一輸入B細胞的V_H及V_L序列)。有利地，假若亦有一些卡匣樣品遺留在該第一盤上，人們可以很容易識別一或多個孔洞為一有用的POI編碼序列(及表現卡匣與轉位子)的來源，藉由繼之針對一所欲抗體結合位點特性篩選該第二盤後，參照至在該第二盤上發現的所欲陽性組。還有，有利地人們可以在期望支持宿主細胞功能及維持的一培養基中(典型地不同於在用於序列放大及修飾之該第一盤細胞中所使用的環境)提供該宿主細胞的。在一替代實施例中，宿主細胞係加入到含有該表現卡匣庫之盤的孔洞中，使得該經分選的排列被保留(但是這樣然後不提供另一實施例額外的優勢，其中後者的表現卡匣主盤係保留而沒有宿主細胞混合物-舉例而言，對實行一第二轉殖到具有不同類型宿主細胞的另一盤為有用的，諸如當人們想要評估一不同宿主細胞類型之POI表現及展示/分泌績效時)。

一自動化多通道移液管之一例子為Thermo Scientific Matrix Hydra II 96-通道自動液體分注儀。V&P Scientific VP 177AD-1與VP 179BJD個別為設計用於快速填充96及384孔盤的分配歧管，且兩者任一可以在本發明之方法中使用，以轉殖卡匣至宿主細胞或用於一般樣品處理。

本發明方法之輸出，所以，在其最廣泛層面中，係為生產表現POI庫的一宿主細胞庫。如上文所討論的，這然後可以在後續的篩選步驟中使用(例如，使用一細胞結合檢測、ELISA、表面電漿共振(surface plasmon resonance)或其他適用於該POI特定本質的檢測)，以識別一或多個表現具所欲特性之POI的宿主細胞。人們然後能夠從該細胞或周圍培養基分離POI，及/或分離(且任選地複製或放大)編碼該所欲POI的一核苷酸序列(例如，DNA序列)。該核苷酸序列可以被測定。此種經分離細胞可以培養以產生POI-編碼細胞株(當該卡匣已穩定地併入至該細胞基因組中時為特別有用的，因為其係可能藉由定點基因併入，例如，使用轉位子執行)。該POI編碼核苷酸序列可以插入至一不同的表現載體及/或突變(例如，親和力成熟)，或融合到另一蛋白質序列。

轉位子併入係藉由在該宿主細胞中提供一對應的轉位酶酵素而達到(例如，藉由共轉染表現卡匣與包含一可表現轉位酶基因的載體，或藉由提供懷有此種轉位酶基因，例如誘導性，的宿主細胞)。在一例子中，每一卡匣包含PiggyBac轉位子元素，且該方法使用一piggyBac轉位酶(例如，野生型或高活性piggyBac轉位酶；參閱，例如，Yusa,K等人於”PNAS USA,2011,10(4)：1531-1536；及Yusa K等人於"A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications",PNAS USA,2010,108(4)：1531-1536)。

WT PBase：

高活性PBase：

當一轉位子係於該宿主細胞中使用於卡匣併入時，其係有額外的好處。首先，轉位子可以在宿主細胞中在數個拷貝中併入，從而提供多拷貝表現卡匣，以支持高量POI表現。此可以使用一高活性轉位酶酵素進一步提升。此外，轉位子較佳地可以於轉錄活性位點併入，從而亦有利於高量及有效的POI表現，如併入位點之地圖分析(mapping analysis)所證明。這可以藉由piggyBac看到，舉例而言(參閱Wang W.等人於"Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells",2008,PNAS USA,105(27)：9290-9295；Galvan D.L.等人於"Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integration in primary human T cells",J.Immunother.,2009,32(8)：837-844；及Yang W.等人於"Development of a database system for mapping insertional mutations onto the mouse genome with large-scale experimental data”,2009,BMC genomics,10(Suppl 3)：S7)。

因此，本發明提供下列觀念：-

1.一種生產編碼感興趣蛋白質(POI)庫之細胞的方法，該方法包含：-a)提供表現一POI庫的細胞族群；b)分選該細胞族群，以產生一經分選的單一細胞族群，每一細胞包含編碼一個別POI的核酸；c)放大由該經分選之單一細胞族群所含括的核酸，以生產編碼POI之一經分選的放大核酸庫；d)修飾源自步驟(c)之經分選放大的POI編碼核酸，以產生一經分選的表現卡匣庫，每一卡匣包含編碼一POI之核苷酸序列及用於表現該POI之一或多個調控元素；及e)從該卡匣庫轉殖POI表現卡匣至一經分選的宿主細胞族群，同時維持該POI表現卡匣分選，並產生表現一經分選POI庫的一經分選的宿主細胞庫。

步驟(c)與(d)可以分開地實行(以任何順序，例如，(c)然後(d))，或同時地實行。

任選地，步驟(c)包含PCR放大POI編碼序列，例如，使用POI編碼的mRNA作為模板的RT-PCR(例如，一、二、三或多個引子其包含或選自由序列識別編號：1-53所組成之該群組的一序列者，如下文進一步討論)。任選地，在步驟(c)中該放大核酸庫為DNA。在一例子中，每一POI 係為一抗體可變域，且步驟(c)包含使用一或多種V區特異性5'端引子及/或一或多種C區3'端引子(例如，Cγ，例如小鼠Cγ引子)PCR放大POI編碼序列。任選地，該PCR包含POI編碼核苷酸序列的5'端及/或3'端-RACE。在一例子中，該5'端-RACE係使用一或多種5'端引子實行的，該等5'端引子每一者同源於一抗體可變區的5'端UTR或啟動子序列。在一例子中，3'端-RACE係使用一或多種3'端引子實行的，該等3'端引子每一者同源於一抗體恆定區，例如，一CH1或Fc序列。在此實例中，每一放大的POI編碼序列編碼包含一抗體可變域與恆定區的抗體鏈。在一例子中，3'端-RACE使用一或多種人類恆定區序列作為引子；這然後產生編碼人化可變區序列，其中每一可變區係融合至一人類恆定區(例如，一人類γCH1或Fc(例如γ Fc))，從而在隨後的表現提供一人類抗體鏈(POI)。步驟(c)期間此人化係為有用的，因為從後期篩選識別的POI代表可以使用以生產針對人類使用抗體治療的人類鏈。在一例子中，5'端-RACE使用包含一可變區啟動子的5'端模板，用於產生放大的核酸，該核酸包含(在5'端至3'端方向)：啟動子及編碼POI的核苷酸序列。此外或或者，3'端-RACE係使用的，其中該RACE使用包含多聚腺苷酸序列的3'端模板，用於產生放大的核酸，該核酸包含(在5'端到3'端方向)：編碼POI之一核苷酸序列及多聚腺苷酸。在此情況中，放大與修飾以產生表現卡匣可以同時地進行(意即，步驟(c)及(d)係同時進行的)。

在一例子中，步驟(d)修飾係使用PCR實行，例如，橋式 PCR。舉例而言，步驟(d)係於步驟(c)之後實行，例如RT-PCR或RACE放大之後。在此情況中，橋式PCR係於一步驟中實行：該步驟包含雜交一第一引子至步驟(c)該核酸產物的5'端；及雜交一第二引子至步驟(c)該核酸產物的3'端(或至使用該第一引子的該雜交步驟之核酸產物的3'端)。或者，該第二引子可以最初使用地(以雜交至步驟(c)之產物)，且該者之產物可以與該第一引子雜交。或者，該第一及第二引子與步驟(c)之產物可以一起混合且實行PCR。

在任何情況中，其結果係為一經延伸產物，該產物包含(在5'端至3'端順序中)：[該第一引子之5'端序列]-[啟動子]-[編碼一POI的核苷酸序列]-[多聚腺苷酸]-[該第二引子之3'端序列]

在一實施例中，該啟動子與多聚腺苷酸係藉由步驟(c)與該POI-編碼核苷酸序列結合，如上文所描述(例如，伴隨適當引子，使用5'端-及3'端-RACE)。在另一實施例中，在步驟(d)中所使用之該第一引子包含一啟動子序列(例如，此一序列在該引子之3'端)。步驟(d)之結果然後組合該啟動子與該POI編碼核苷酸序列。此外或或者，在步驟(d)中所使用之該第二引子包含一多聚腺苷酸序列(例如，此一序列在該引子的5'端)。步驟(d)之結果然後組合了該多聚腺苷酸與該POI編碼核苷酸序列。其他組合為可能的，例如，啟動子係於步驟(c)中使用適當的引子加入的，且該多聚腺苷酸係於步驟(d)中使用適當的第二引子加入。在一例子中，步驟(c)(例如，RACE)在該產物核酸加入5'端及/或3'端序列，該者可以使用於在步驟(d)與引子雜交，其中後者使用橋式PCR。

步驟(c)及(d)之結果始終為用於表現一POI庫的一表現卡匣庫。在一例子中，對於表現(或最佳表現)所需或所欲的一或多個調控元素係從每一卡匣省略，但取代地，由該宿主細胞基因組所提供，一旦該卡匣已引入至該宿主細胞內。

在一實施例中，步驟(d)加入個別夾擊該啟動子與多聚腺苷酸的5'與3"端併入序列。舉例而言，該5'端序列係為一5'端轉位子元素(例如，一5'端PB末端元素)，且該3'端序列係為一3'端轉位子元素(例如，一3'端PB末端元素，該者相對於該5'端元素係於倒轉走向的)。舉例而言，該5'端併入序列係於該第一橋式PCR引子之5'端提供的，且/或該3'端併入序列係於該第二橋式PCR引子的3'端提供。其結果係為一表現卡匣庫，每一終端(5'與3'端)在轉位子元素中，意即每一卡匣係修飾以形成一轉位子。任選地，每一表現卡匣係以由一併入序列在5'與3'端終止(例如，一轉位子元素，例如，終止在倒轉端PB轉位子元素中)的一線性DNA產生的。替代併入序列可以使用以取代轉位子元素(進一步參閱下文)；舉例而言，該併入序列可以為同源臂(例如，至少15、20、50或100個連續的核苷酸)，用於再一或多個特定的標靶位點(與同源臂雜交者)實行同源併入至受體宿主細胞的基因組。或者，該併入序列可以為位點特異性重組序列(例如，lox、rox或frt)，用於位點特異性併入到宿主細胞基因組其在該基因組中之一或多個所欲的併入位點中帶有對應的位點特異性重組位點(根據該個別併入酶之提供或表現(意即cre、dre或flp個別地)。在一實施例中，RMCE係採用兩種不兼容的重組位點使用以插入(例如，野生型loxP及突變lox，例如lox2272或lox511)。

在一實施例中，一或多個用於POI表現的調控元素(例如，啟動子及/或增強子及/或多聚腺苷酸及/或一信號序列)係藉由步驟(c)加入，例如使用RACE。此外或或者，一或多個用於POI表現的調控元素(例如，啟動子及/或增強子及/或多聚腺苷酸及/或一信號序列)係藉由步驟(d)加入，例如使用橋式PCR。

此外或或者，在一實施例中，一5'及/或3'端併入序列係藉由步驟(c)加入，例如使用RACE。此外或或者，一5'及/或3'端併入序列係藉由步驟(d)加入，例如使用橋式PCR。

在一實施例中，一或多個用於POI表現的調控元素(例如，啟動子及/或增強子及/或聚腺苷酸及/或一信號序列)，及一5'及/或3'端併入序列係藉由步驟(c)加入，例如使用RACE。

在一實施例中，一或多個用於POI表現的調控元素(例如，啟動子及/或增強子及/或多聚腺苷酸及/或一信號序列)，及一5'及/或3'端併入序列係藉由步驟(d)加入，例如使用橋式PCR。

2.如觀念1之方法，其中步驟(e)中該經分選的表現卡匣係批次的轉殖到該經分選的宿主細胞中。

根據本發明之此實施例的批次轉移係優於先前技藝使用分子選殖以轉殖POI編碼核苷酸序列至宿主細胞內的方法。如上文所解釋的，後者要求費力且耗時的定序、分析，且次選殖已藉由含括末端限制性位點(以在隨後步驟中能夠引入到宿主細胞內)而修飾的個別POI編碼序列。典型地，一旦具限制性位點的一正確PCR的POI編碼序列已被確認，此然後係選作為一individual序列，以推動用於引入至宿主細胞內，後者然後生長以產生表現該所抉擇POI序列的一族群細胞。此多步驟、費力的分子選殖過程係執行的，針對在隨後篩選中所含括之庫中的每一POI變體。因此，先前技藝篩選方法可以花費數週(典型地在6-8週階層)，以執行一有用開始細胞庫，諸如抗體產生細胞。相反地，使用經分選批次轉移POI全部表現卡匣(意即，包括POI及用於表現的調控元素)的本發明方法，對於產生用於篩選的一經分選POI庫提供了一非常快的技術。這使得本方法順適於篩選的高通量自動化。舉例而言，本發明者-執行該方法的手動操作-使用4×96孔盤(近乎186個輸入B細胞)，已經能夠在僅2天中執行生產一用於POI表現的經分選宿主細胞庫。該表現的POI庫之篩選可以在大約僅2天中手動執行。顯然地，自動化加速這件事更多(且有利地在經分選等分試樣之間最小化交叉污染)。

對於批次轉移表現卡匣，數個經分選表現卡匣係於相同操作中(例如，一單一卡匣抽吸及遞送步驟，意即一單一移液步驟)與宿主細胞混合，用於轉移至細胞內(例如，藉由隨後或同時轉染到細胞內)。該操作為，舉例而言，藉由移液管之單一轉移(例如，使用一多通道移液器，例如在一單一操作中使用一4、8、12、16、64、96、384或1536通道移液管)。在一例子中，至少4個經分選的表現卡匣等分係於一單一操作中與經分選宿主細胞混合，使得每一表現卡匣等分試樣係與一個別細胞等分試樣混合(例如，在一個別容器內，例如，在一盤之一孔洞中或在一管架中之試管中)。在一例子中，至少4、8、12、16、24、32、40、48、56、64、96、384或1535經分選表現卡匣的等分試樣係於相同操作中與經分選宿主細胞混合，使得每一表現卡匣等分試樣係與一個別細胞等分試樣混合(例如，在一個別容器內，例如，在一盤之一孔洞中或在一管架中之試管中)。在一實施例中，該操作係為手動操作(例如，藉由使用一多通道移液管移液)。在另一實施例中，該操作為自動的，例如，藉由一自動液體分注裝置(例如，一液體處理機械手臂)

有利地，本發明人發現，其係可能批次轉殖源自步驟(d)之該表現卡匣至該經分選宿主細胞，而不需要純化該等卡匣，但仍然在步驟(e)中產生一有用的宿主細胞庫。這提供了更高的處理速度及通量，且使得該方法順適於較簡單的自動化。

3.如觀念1或2中之方法，其中(i)由步驟(d)所產生的該經分選表現卡匣庫係於數個相對於彼此位置為固定的容器中提供(例如，盤上的孔洞或管架中的試管)，其中，每一容器含有個別類型的表現卡匣，使得表現卡匣相對於彼此的相對位置為預決定的；且(ii)該等表現卡匣係於步驟(e)中轉殖到該經分選的宿主細胞中，使得該等表現卡匣的相對位置被維持的。

在一例子中，每一容器含有卡匣其編碼衍自在步驟(a)中所提供之一個別單一細胞的第一類型POI，且還有卡匣其編碼衍自該單一細胞的第二類型POI者。舉例而言，每一容器含有卡匣其編碼衍自一單一細胞的V_H及V_L序列。在此方式中，構成輸入細胞(其中，這些編碼抗體結合位點，例如，漿母細胞或漿細胞)之個別結合位點的該等可變域係一起保持在該經分選庫中，但不與衍自另一細胞的序列混合。此分選，由此，係有利地於該方法之後期步驟中維持，且在隨後的篩選結果中為可追踪的。

4.如前述任一觀念中之方法，其中(i)由步驟(d)所產生的該表現卡匣庫係藉由提供數個容器而經分選(例如，盤上的孔洞或管架中的試管)，其中，每一容器包含在步驟(b)中經分選的單一細胞之POI編碼序列；(ii)步驟(e)之該經分選宿主細胞係於數個容器中提供(例如，盤上的孔洞或管架中的試管)，且(iii)該等表現卡匣係於步驟(e)中轉殖到該經分選的宿主細胞中，使得在每一個別容器中的宿主細胞僅與衍自在步驟(b)中經分選的單一細胞的POI編碼序列混合。

5.如觀念3或4之方法，其中在步驟(d)中該經分選表現卡匣係於數個相對於彼此位置為固定的容器中提供 (例如，數個容器其具有X容器乘以Y容器之一排列者，例如一8×12孔盤(96孔盤)或具有8×12容器排列之倍數的一盤子(例如384孔盤))；且在步驟(e)中該經分選宿主細胞係於數個容器中提供，該等容器相對於彼此的位置為固定的，且包含相同於在步驟(d)中所使用該容器的排列(例如在步驟(d)與(e)中該等庫兩者皆於維度相同或本質上相同的96孔或384孔盤上提供)，使得在步驟(e)中分選係維持的。

6.如前述任一觀念中之方法，其中該經分選的宿主細胞庫係能夠穩定地表現該POI庫。

或者，經分選的宿主細胞庫能夠瞬時表現的。穩定表現(例如作為卡匣在宿主細胞基因組中基因併入的結果)對長期供應在篩選後經識別的細胞-及由此表現之POI-為有利的(且亦對等待實行篩選的細胞為有利的，假若在步驟(e)中所產生之該宿主細胞在使用於篩選之前係儲存一段時間的話)。

7.如前述任一觀念中之方法，其中由步驟(e)所產生之該經分選POI表現宿主細胞庫係於數個容器中提供(例如試管或孔洞)，其中每一容器含有在步驟(b)中經分選之單一細胞的POI。

此種試管可以固定在一管架或支架中；此種孔洞可能藉由在一或多個盤上提供而固定的。

8.如觀念7之方法，其中每一宿主細胞表現第一與第二POI，其中該等POI係為不同的，例如一蛋白質之次單位，例如抗體或T-細胞受器結合位點的可變域。

9.如前述任一觀念中之方法，其中步驟(b)包含分選單一細胞至個別容器內(例如在一或多個盤上之個別孔洞中)，並在該等容器中實行步驟(c)與(d)而同時維持分選。

10.如前述任一觀念中之方法，進一步包含篩選該經分選的POI庫，以識別具所欲特性的POI(例如結合至一抗原或抗體；或對一同族配體或抗原的結合親和力)及/或編碼該所識別之POI的核苷酸序列(例如DNA或RNA，例如mRNA或cDNA)。

11.如觀念10之方法，進一步包含識別、放大或合成編碼該所識別之POI的核苷酸序列(例如使用PCR或藉由培養一經選擇的宿主細胞或其之衍生細胞)；且任選地使用該所識別、放大或合成的核苷酸序列製造分離的POI。

12.如前述任一觀念中之方法，進一步包含篩選該經分選的POI庫以識別具有所欲特性的POI(例如結合至一抗原或抗體；或對一同族配體或抗原的結合親和力)，並分離表現該所識別POI的宿主細胞；及任選地繼代該細胞以產生表現該POI的一細胞株。

13.如前述任一觀念中之方法，其中步驟(e)包含基因併入(例如染色體併入)POI表現卡匣至個別宿主細胞基因組內，用於表現該個別的POI。或者，該等卡匣之一或多者係於其個別宿主細胞中游離基因體地提供，用於瞬時POI表現。

14.如觀念13之方法，其中該基因併入係使用一預決定的基因組核苷酸序列基序實行，用於插入該表現卡匣到個別細胞基因組內。

舉例而言，該基序係為由一轉位子使用以併入的一核苷酸序列(例如由PB使用的TTAA基序)；或一核苷酸序列其可以藉由同源重組與卡匣5'及3'端併入序列重組者；或使用以併入一位點特異性重組位點的基序。

15.如觀念14之方法，其中每一細胞基因組包含一個以上的該序列基序拷貝。

16.如觀念13、14或15之方法，其中該基因併入係藉由轉位子介導的併入而實行。

適合使用作為卡匣之5'與3'端併入序列的轉位子元素為第II類轉位子元素(例如piggyBac轉位子倒轉末端重複元素或Mariner轉位子元素)、或睡美人轉位子元素或Tc1類元素(TLE)。

17.如觀念13至16中任一項之方法，其中步驟(e)包含多重插入表現卡匣至個別的宿主細胞基因組內。

每一卡匣任選地係以線性核酸(例如線性DNA)的一部分提供。舉例而言，每一卡匣係為一線性轉位子，其包含或由5'-與3'-末端轉位子元素所組成(例如piggyBac倒轉末端重複元素)，伴隨在該等轉位子元素之間的POI核苷酸序列及用於表現的調節元素(等)。在一實施例中，其係進一步在該5'端轉位子元素之5'端及/或該3'端轉位子元素之3'端有序列；在另一實施例中，這些元素係個別地在該卡匣之5'與3'末端。

18.如前述任一觀念中之方法，其中該宿主細胞係為一哺乳類細胞株之細胞(例如CHO或HEK293細胞)或酵母細胞。

舉例而言，其中每一宿主細胞係為一哺乳類(例如人類或非人類動物、植物或昆蟲或囓齒類或小鼠或大鼠或兔或雞或駱駝科動物(Camelid)或魚細胞)、細菌或酵母細胞。

19.如前述任一觀念中之方法，其中在步驟(a)中該細胞係為從一或多個動物分離的細胞。

任選地，步驟(a)之每一細胞係為一哺乳類(例如人類或非人類動物、植物或昆蟲或囓齒類或小鼠或大鼠或兔或雞或駱駝科動物或魚細胞)、細菌或酵母細胞。

任選地，步驟(a)之所有細胞係為一生物體(等)相同類型之組織或腔隙(compartment)的細胞。舉例而言，它們全都為一或多個生物體之肝臟、腎臟、心臟、大腦、血液、淋巴球、前列腺、卵巢或生殖細胞，例如人類患者或非人類動物或囓齒類動物或小鼠或大鼠或兔子、雞或駱駝科動物或魚。

20.如前述任一觀念中之方法，其中在步驟(a)中該細胞包含或由B細胞、生殖中心細胞、記憶B細胞、抗體分泌細胞、漿細胞或漿母細胞所組成。

21.如前述任一觀念中之方法，其中每一POI係為一免疫球蛋白(例如抗體或T細胞受器)鏈或其部分(例如可變域)。

22.如前述任一觀念中之方法，其中每一POI包含或由一抗體可變域組成(例如，V_H、V_HH或V_L域或dAb或Nanobody^TM)。

23.如前述任一觀念中之方法，其中步驟(a)之每一細胞表現第一及第二POI，其中該等POI係彼此不同的；其中步驟(b)包含分選單一細胞到個別容器中(例如，在一或多個盤上的個別孔洞)，並於該等容器中實行步驟(c)與(d)，其中在步驟(c)後，每一容器包含與來自相同細胞之經放大的第一POI混合的經放大的第一POI；且其中步驟(e)包含將源自一個別容器之個別第一與第二POI編碼核酸與宿主細胞混合；其中源自步驟(a)相同細胞的第一及第二POI係轉殖至相同的宿主細胞，用於由該宿主細胞表現第一及第二POI，從而產生一經分選的宿主細胞庫，每一者共同表現個別的第一及第二POI。

24.如觀念23之方法，其中源自相同細胞之該第一及第二POI係為同族多胜肽，該二者一起形成一功能性蛋白(例如形成一抗原結合位點的V_H與V_L域)。

25.如觀念24之方法，其中該第一及第二POI個別地包含或由抗體V_H與V_L域組成，例如，該第一及第二POI個別地係為同族的抗體重鏈及輕鏈。

26.如前述任一觀念中之方法，其中步驟(b)包含結合由細胞表現的POI至一同族配體(例如，結合由細胞表現的抗體結合位點至一感興趣抗原)；任選地，其中該配體結合細胞表面表現的POI；且進一步分選並分離細胞其表現結合該配體的POI者，從而產生該經分選的細胞族群。

27.如觀念26之方法，其中FACS細胞分選係使用的；任選地螢光FACS。

28.如觀念26或27之方法，其中步驟(b)之每一經分選細胞係於一個別容器中提供(例如在一盤上之孔洞)，使得此種容器每一者(例如孔洞)包含不超過一種細胞類型。

29.如觀念28之方法，其中該經分選的細胞族群係於一或多個盤上的孔洞中提供的，該等盤總共包含小於5、4、3、2、1或0.5%的孔洞含有超過一種的細胞，及/或總共小於5、4、3、2、1或0.5%的孔洞不含有細胞。

30.如前述任一觀念中之方法，其中步驟(c)係使用PCR執行，例如，使用POI編碼RNA(例如mRNA)的RT-PCR。

31.如前述任一觀念中之方法，其中步驟(d)係使用PCR執行，例如橋式PCR。

32.如前述任一觀念之方法，其中步驟(d)包含藉由與一預決定序列組合，修飾經放大的核酸，使得該預決定序列夾擊該核酸之POI編碼核苷酸序列的5'及/或3'端；任選地其中該修飾放置一調控元素(例如，5'端啟動子及/或3'端多聚腺苷酸)及/或一轉位子元素(例如，piggyBac轉位子元素)夾擊POI編碼核苷酸序列的5'及/或3'端。

33.如觀念32之方法，其中每一POI包含一抗體可變域，且步驟(c)或(d)將POI編碼核苷酸序列與一抗體恆定區(任選地一人類恆定區，或不同於在步驟(a)之細胞中由 POI所含括之C區之物種的一種物種)組合，以產生編碼一抗體鏈(任選地一人化鏈)之一核苷酸序列。

舉例而言，步驟(a)之細胞編碼POI其包含非人類脊椎動物(例如囓齒類動物，例如小鼠或大鼠)之恆定區，且這些係藉由步驟(c)或(d)由人類恆定區取代的。舉例而言該等POI為抗體鏈(例如重鏈)其包含一人類可變域及藉由本發明之方法人化的一囓齒類動物(例如小鼠或大鼠)恆定區。此係為方便的，因為它提供了一高通量方式以規模地人化抗體鏈及抗體，且使隨後的選擇、生產及在上下文最終人類抗體/鏈格式的細胞與表現載體開發能夠適合用於人類醫療藥物用途。先前技術不這樣做。

34.如觀念33之方法，進一步包含篩選該經分選的POI庫，以識別表現具所欲特性之一抗體鏈的宿主細胞(例如，特異性抗原結合或抗原結合親和力)，識別該宿主細胞的抗體鏈編碼核苷酸序列，使用該抗體鏈編碼核苷酸序列以產生該所識別抗體鏈的拷貝，且配製該拷貝作為藥物組成物(任選地進一步與一或多種藥物、賦形劑、稀釋劑或載具組合)，用於人類醫藥治療；且任選地投藥該組成物至人類患者，用於該患者的醫藥治療。

35.如前述任一觀念中之方法，其中步驟(e)係自動化的；任選地，其中步驟(b)至(c)之一者或全部亦為自動化的。

自動化可能包括藉由一編程以實行本發明任何層面、配置、實施例或例子之方法的電腦控制該製程。

36.如前述任一觀念中之方法，其中(i)步驟(b)至(e)在內係於相當於至少180細胞中實行(倘若步驟(a)進行不超過1或2天)；且/或(ii)該表現的POI庫係針對一所欲特性篩選，且一或多個對應的宿主細胞或者POI編碼核苷酸序列係在相當於不超過4天中識別的。

本發明人使用近乎400個輸入B細胞並篩選抗原特異性抗體，伴隨(a)花費2天，及(b)花費3天實現-全部手動進行。顯然地，假若自動化係使用的，此將為更快的。因此，本發明較現有技藝提供顯著的時間節省，該者典型地花費6-8週以執行此種篩選。

37.一種自動化裝置，用於執行前述任一觀念中之方法，該裝置包含a.用於持有在數個容器(例如在一或多個盤上之孔洞、或在一管架或支架中之試管，如上文描述)中之一經分選的單一細胞族群的工具，其中每一單一細胞係在一個別容器中，每一細胞包含編碼個別POI的核酸；b.用於遞送PCR試劑至容器的工具，用於放大由該經分選單一細胞族群所含括的核酸，以產生經分選的編碼POI之放大核酸庫；c.用於遞送試劑至容器的工具，用於修飾經分選、放大的POI編碼核酸，以產生一經分選的表現卡匣庫，每一卡匣包含編碼一POI的核苷酸序列及一或多個用於表現該POI的調控元素； d.用於持有在數個容器中之經分選的宿主細胞族群的工具；e.用於從該卡匣庫轉殖(任選地批次轉殖)POI表現卡匣至在該容器中之經分選宿主細胞族群的工具，且同時維持該POI表現卡匣分選；及f.用於實行表現卡匣引入(例如轉染)至在容器內之宿主細胞的工具，以產生表現經分選POI庫的經分選宿主細胞庫；且g.任選地，一編程以實行本發明任何層面、配置、實施例或例子之方法的電腦。

38.如觀念37之裝置，進一步包含用於分選一細胞族群的工具(例如用於執行FACS的工具)，以產生該經分選的單一細胞族群

39.如觀念37或38之裝置，進一步包含用於控制該裝置操作的工具，用於自動化執行觀念1至36中任一項之方法。

40.一種用於實行觀念1至36中任一項之方法的套組，該套組包含如觀念37、38或39之一裝置，連同包含用於執行觀念32之方法之轉位子元素(等)的核酸。

該轉位子元素可以藉由，例如線性DNA實行。在一例子中，該等元素係為藉由剪切及黏貼轉位機制介導DNA併入的一轉位子元素(例如第II類轉位子)。在一例子中，該等元素為PB或Mariner類元素或Tc-1類元素(TLE)。

41.一種用於在一宿主細胞中表現一POI的表現卡匣，該卡匣係由包含一轉位子的線性核酸(例如線性DNA)所提供，該轉位子包含5'-及3'-末端轉位子元素，伴隨在該等轉位子元素之間的一POI編碼核苷酸序列及用於POI表現的調控元素(等)。

此種卡匣對基因併入可表現的POI序列至宿主細胞內為有用的，例如用於生產細胞株以提供POI來源，及/或在本發明之篩選方法中使用。該等轉位子元素可以為於此揭露的任何此種元素。

在一例子中，該卡匣包含或由一轉位子所組成，該轉位子包含5'-及3'-末端轉位子元素(例如piggyBac倒轉末端重複元素)，伴隨在該等轉位子元素之間之一POI編碼核苷酸序列及一或多個用於表現的調控元素(等)。在一實施例中，該卡匣進一步在該5'端轉位子元素之5'端及/或該3'端轉位子元素之3'端包含一序列。在一例子中，該卡匣包含一額外核苷酸序列其對應於該宿主細胞基因組之一核苷酸序列，該額外序列係於該POI編碼核苷酸序列的5'及/或3'端。舉例而言，該額外序列對應於在該宿主中活性轉錄的基因組宿主細胞序列。因此，該POI編碼序列係於適合該POI序列活性轉錄的環境中插入到該宿主。

在一例子中，如於此所使用，“族群”(例如一細胞或卡匣族群)或“庫”包含至少10、100、1000、104、105或106的成員。

42.一種如觀念41之表現卡匣族群，其中該族群編碼一POI庫。

43.一種如觀念42之經分選的表現卡匣族群。

44.一種經分選的表現卡匣族群，該者編碼POI庫其對應於由一細胞族群表現的POI，每一卡匣包含一核苷酸序列其編碼該POI庫中之一成員，及一或多個用於POI表現的調控元素(當在一宿主細胞中時)，其中該卡匣每一者包含該排列(在5'端至3'端方向)：轉位子元素-[POI核苷酸序列&調控元素(等)]-轉位子元素，且用於表現POI其對應於不同細胞之POI的表現卡匣在該經分選族群中係彼此分離的(例如，在一盤的不同孔洞中，例如在一或多個盤上每一孔洞一卡匣物種)。

在一例子中，每一卡匣係能夠表現(衍自)單一細胞的POI，例如衍自一單一B細胞的抗體重鏈或輕鏈或其片段。

在一例子中，piggyBac元素係使用的。

45.如觀念44之族群，其中每一表現卡匣係由一線性DNA所提供。

46.如觀念42至45中任一項之卡匣族群，其中每一卡匣係於一宿主細胞中。

47.一種經分選的宿主細胞族群，其包含如觀念43、44及45中任一項之經分選的表現卡匣族群，用於表現一經分選的POI庫。

48.一種製作包含一感興趣核苷酸序列(NOI)之轉位子的方法，該方法含a.提供一第一核苷酸序列(例如由DNA或RNA所提供) 其包含(在5'端至3'端方向)A、B及C(任選地由5’-A-B-C-3’該結構所組成)，其中A係為一第一同源序列，B係為包含該NOI(或由該NOI組成)之核苷酸序列，而C係為一第二同源序列；b.提供一第一模板核苷酸序列其包含(在5'端至3'端方向)W及X(或由該二者組成)，其中W係為包含一第一轉位子元素(例如piggyBac末端重複元素)(或由該者組成)的核苷酸序列，而X係為一第三同源序列；且c.提供一第二模板核苷酸序列其包含(在5'端至3'端方向)Y及Z(或由該二者組成)，其中Y係為一第四同源序列，且Z係為包含一第二轉位子元素(例如piggyBac末端重複元素)(或由該者組成)的核苷酸序列；且下列任一的d.(i)將該第一核苷酸序列與該第一模板混合，以雜交該第一及第三同源臂一起並實行核酸放大及延伸(例如使用PCR)，以使用該第一模板延伸該第一核苷酸序列，以產生一第一經延伸核苷酸序列(第一ENS)，該者包含(在5'端至3'端方向)W、B及C；且(ii)將該第一ENS與該第二模板混合，以雜交該第二與第四同源臂一起並實行核酸放大及延伸，以延伸該第一ENS以產生一第二ENS，該者包含(在5'端至3'端方向)W、B及Z(或由該三者組成)；或(ii)將該第一核苷酸序列與該第二模板混合，以雜交該第二及第四同源臂一起並實行核酸放大及延伸(例如使用PCR)，以使用該第二模板延伸該第一核苷酸序列，以產生一第三經延伸核苷酸序列(第三ENS)，該者包含(在5'端至3'端方向)A、B及Z；且(ii)將該第三ENS與該第一模板混合，以雜交該第一及第三同源臂一起並實行核酸放大及延伸，以延伸該第三ENS，以產生一第四ENS，該者包含(在5'端至3'端方向)W、B及Z(或由該三者組成)；或(iii)將該第一核苷酸序列與該第一及第二模板混合，以雜交該第一及第三同源臂一起，並雜交該第二及第四同源臂一起，並實行核酸放大及延伸(例如使用PCR)，以使用該第二模板延伸該第一核苷酸序列，以產生一第五ENS，該者包含(在5'端至3'端方向)W、B及Z(或由該三者組成)；且e.分離包含(在5'端至3'端方向)W、B及Z(或由該三者組成)之一ENS，從而產生一分離轉位子其包含由轉位子元素夾擊之一NOI；且f.任選地引入該分離轉位子至一受體細胞，使得該轉位子併入至該細胞的基因組內。

任選地，一、多個或全部的同源序列包含至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多個連續核苷酸之一核苷酸序列。

在一例子中，該NOI編碼一POI、蛋白質域或蛋白質片段或其自身係為一或多個調控元素(等)。舉例而言該 NOI編碼一POI其係為該受體細胞基因組中或在人類或非人類脊椎動物中之一蛋白質的異種同源物或同源物。

在一實施例中，W與X個別為該第一模板序列之5'及3'末端。此外或或者，Y與Z個別為該第二模板序列之5'及3'末端。當W與X個別為該第一模板序列之5'及3'末端，且Y與Z個別為該第二模板序列之5'及3'末端時，該方法之產物係為在其末端具轉位子元素的一種線性轉位子，該者係非常適合基因併入以修飾宿主細胞。

任選地該第一模板由5'-W-X-3'所組成。在一例子中，在W與X之間沒有介入核苷酸序列。在另一實施例中，在W與X之間進一步係有一核苷酸序列，例如一調控元素或外顯子或其它所欲的核苷酸序列(例如蛋白質編碼序列)，該等在該方法之產物中將變成緊接地合併於該NOI之上游。此係為有用的，舉例而言，對構建一表現卡匣其用於在一NOI上游合併一啟動子(其中該NOI編碼一POI)，用於該POI之後續表現，一旦該轉位子已經插入至一宿主細胞基因組內。

此外或或者，任選地該第二模板核苷酸序列由5'-X-Y-3'所組成，或在X與Y之間係有一介入核苷酸序列，例如一調控元素或外顯子或其它所欲的核苷酸序列(例如蛋白質編碼序列)，該等在該方法之產物中將變成緊接地合併於該NOI之下游。此係為有用的，舉例而言，對構建一表現卡匣其用於在一NOI下游合併一多聚腺苷酸(其中該NOI編碼一POI)，用於該POI之後續表現，一旦該轉位子已經插入至一宿主細胞基因組內。在另一例子中，該介入序列編碼將變成融合至該POI的一蛋白質，依據表現以產生一融合產物。舉例而言，該POI包含或由一抗體可變域組成，且該介入序列包含或由一抗體恆定區編碼序列組成。舉例而言，該介入序列編碼一抗體Fc或抗體CH1或CL域。在一例子中，由該介入序列編碼的Fc或恆定區或蛋白質係為人類Fc、恆定區或蛋白質。這對人化該POI為有用的(例如，當該POI係為一可變域時，例如一人類可變域時，產生一人化抗體鏈)。

49.如觀念48之方法，其中在W與X之間係有一介入核苷酸序列，及/或在Y與Z之間一介入核苷酸序列；任選地其中該介入序列或每一介入序列係為一調控元素或蛋白質編碼序列。

50.如觀念49之方法，其中該NOI編碼一蛋白質域(例如，一抗體可變域)，且在Y與Z之間係有一個編碼抗體恆定區(例如，抗體Fc，例如，人類Fc)的核苷酸序列，由此，該轉位子產物編碼一融合蛋白其包含融合至抗體恆定區的一蛋白質域(例如，編碼一抗體鏈)。

51.如觀念48至50中任一項之方法，其中該第一與第二同源臂中之一或多者係藉由PCR(例如，5'及/或3'端-RACE)與NOI組合，以在實行該延伸之前形成該第一核苷酸序列。

52.一種製成一轉位子庫的方法，其中該庫之成員編碼不同的POI(例如，不同的抗體可變域)，該方法包含i.提供包含NOI庫的一第一核苷酸序列族群；及 ii.對於每一第一核苷酸序列，實行觀念48至51中任一項之方法，從而產生編碼一POI庫的一轉位子庫。

53.如觀念52之方法，包含分選該第一核苷酸序列，以在實行步驟(ii)前提供一經分選的族群，其中一經分選的轉位子庫係產生的，該者編碼一經分選的POI庫。

54.如觀念52之方法，其中該轉位子庫之轉位子係混合在一起。

55.如觀念52至54中任一項之方法，其中該庫之轉位子係引入至受體細胞，使得轉位子併入至該細胞的基因組內，每一併入的轉位子包含由轉位子元素夾擊的POI表現卡匣，該卡匣包含一NOI及一或多個用於在一宿主細胞中表現該POI的調控元素。

56.如觀念55之方法當依賴觀念53時，其中當該轉位子引入細胞時，該分選係維持，從而產生表現一經分選POI庫的一經分選細胞庫。

57.一種生產用於表現一POI之宿主細胞的方法，該方法包含a.提供至少第一及第二表現卡匣，其中每一表現卡匣包含i.一第一併入元素及該第一併入元素核苷酸序列3'的一第二併入元素；且ii.在該等併入元素之間編碼POI之一核苷酸序列及一或多個用於表現該POI的調控元素；iii.其中該等併入元素係能夠藉由識別一核酸之一預決定核苷酸序列基序、使用一併入酶插入至該核酸內；b.提供一宿主細胞其基因組包含數個該基序者；且c.同時或依序地引入該第一及第二表現卡匣至該宿主細胞內，其中每一卡匣係於該基序基因併入至該宿主基因組內，用於由該宿主細胞表現POI；且d.任選地產生一細胞株其在包含培養該宿主細胞之一步驟中表現POI。

本發明之此層面對產生用於相對高表現一或多個感興趣POI的宿主細胞及細胞株為有用的。於多個基因位點基因併入POI卡匣提供穩定的表現，且其係還有標靶該宿主基因組中之轉錄活性區域的可能性。使用序列基序導引該插入到有用的位點，且如該技藝中所使用，其係較佳隨機併入序列。

58.如觀念57之方法，其中該第一卡匣的第一及第二併入元素係個別地一致於該第二卡匣的第一及第二併入元素。

在一例子中，每一卡匣包含第一及第二轉位子元素，例如相同類型的轉位子元素(例如PB或第II類轉位子)。在一例子中，所有元素皆為位點特異性重組位點，例如lox位點或frt位點或這些之混合物。在另一例子中，所有元素皆為同源臂(足以在該宿主細胞中用於同源重組的連續核苷酸序列)。在一例子中，該位點特異性重組位點係為相同的，或者它們為不同的(例如互不相容的位點(例如loxP及 lox511或2272)，用於實行RMCE(重組酶介導的卡匣交換)，用於定向插入卡匣至基因組中。

59.如觀念57或58之方法，其中該第一及第二卡匣每一者之第一及第二併入元素係於相互倒轉走向中(例如倒轉的PB轉位子元素或倒轉的位點特異性重組位點)。

60.如觀念57至59中任一項之方法，其中該等基序之一或多者在先於實行步驟(c)之前係工程化到宿主細胞的染色體內，例如lox位點對係工程化至一或多個宿主染色體內，其中對應於卡匣中lox對之對係使用的。

61.如觀念57至59中任一項之方法，其中該等基序之一或多者係內源於該宿主細胞基因組；任選地，其中卡匣併入處之該等基序每一者係為一內源性基序。

舉例而言，轉位子辨識內源性基序(例如PB辨識基因組中TTAA)。

62.如觀念57至61中任一項之方法，其中至少3種卡匣係基因併入至該宿主細胞基因組內，例如在一或多個宿主染色體內-這對穩定表現為有用的。

63.如觀念57至62中任一項之方法，其中該卡匣基因併入位點對該POI編碼序列之轉錄為活性的。

這可以使用在該卡匣中的轉位子(例如PB)實現的。

64.如觀念57至63中任一項之方法，其中每一卡匣係藉由在該併入位點與該宿主基因組之間的同源重組併入的；該併入位點與該宿主基因組之間的位點特異性重組併入的；或藉由轉位子介導的併入。

65.如觀念64之方法，其中該酵素係選自一重組酶或一轉位脢(例如對應於該併入元素PBase(例如高活性PBase)、flp或cre重組酶的一酵素)。

在一例子中，該宿主細胞已工程化以表現此(等)酵素，例如從基因併入的基因(例如一可誘導基因)。在另一實施例中，該酵素係從一游離基因體載體表現。在另一例子中，該酵素係引入至該宿主細胞內。

66.如觀念57至64中任一項之方法，其中每一卡匣係為一轉位子。

67.如觀念57至66中任一項之方法，包含提供一宿主細胞族群且在該族群的數個宿主細胞上實行如觀念57至66中任一項之方法；且任選地分離由步驟(c)或(d)所產生之該宿主細胞。

68.如觀念57至67中任一項之方法，包含分離由步驟(c)或(d)所產生之一宿主細胞，且識別、放大或合成編碼可由該細胞表現之POI的核苷酸序列；且任選地使用該經識別、放大或合成的核苷酸序列或其之突變產生分離的POI。

69.如觀念68之方法，包含配製該分離POI成一藥物，用於人類醫學；且任選地投藥該藥物至一人類患者。

70.一種宿主細胞族群，其藉由如觀念57至69中任一項之方法獲得的，每一細胞包含數個基因併入的表現卡匣，用於表現POI，每一宿主細胞貫穿其基因組相鄰於一併入的表現卡匣包含數個一致的核苷酸序列基序，用於表現源自每一此種卡匣的POI；每一併入卡匣包含a.一第一併入元素序列及該第一併入元素核苷酸序列3'的一第二併入元素序列；且b.在該等併入元素序列之間編碼POI之一核苷酸序列及一或多個用於表現該POI的調控元素。

71.如觀念70之宿主細胞，其中由該細胞表現的所有POI係為相同的POI。

72.如觀念70之宿主細胞，其中該細胞表現第一及第二POI(例如單一抗體類型的VH及VL域；或單一抗體類型的重鏈及輕鏈)，該二者聯合一起，以形成一種功能性蛋白或配體(例如抗原)結合位點。

73.一種一抗體的抗體或抗原結合位點，用於人類的醫學治療，其中該抗體或結合位點已經從藉由如觀念57至69中任一項之方法所產生之一宿主細胞分離出，或已從根據觀念70至72中任一項之宿主細胞族群分離出。

74.一種核酸混合物，其包含一第一分離核酸與一第二分離核酸，其中該第一核酸係能夠雜交到由一標靶核酸所含括之基因的人類抗體V區的5'端UTR序列(意即，一核苷酸序列)，其中該基因編碼人類V區；且該第二核酸係能夠雜交到一第二序列，其中該第二序列係由該標靶核酸所含括，且在該UTR序列的3'端，其中該第一分離核酸包含一序列(或由該序列組成)其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：1-47所組成該群組之一序列者。

序列識別編號：1-47包含如表1中所示之人類可變區特異性序列(更特別地，人類可變區的特異性5'端UTR核苷酸序列)。“特異性”意謂的是此種序列在人類可變區核酸的標準PCR(例如，RT-PCR)中可以使用作為一5'端引子序列。

序列識別編號：1-17包含人類重鏈可變區特異性序列。

序列識別編號：18-26人類κ鏈可變區特異性序列。

序列識別編號：27-47人類λ鏈可變區特異性序列。

在一實施例中，本發明提供一種核酸(例如一PCR引子或用於同源重組的一載體)，該核酸包含在表2中表示為X的序列中之至少15個連續核苷酸(或由其組成)，用於雜交至表2中表示為Y之基因區段的5'端UTR序列，例如用於執行PCR以拷貝該基因區段，或以雜交一同源重組載體至該5'端UTR序列，用於修飾該基因區段。在一例子中，該核酸包含至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25、或全部的序列X(或由其組成)。在一例子中，該連續核苷酸以序列X之3'端核苷酸結束(意即從X的3'端往5'端延伸的連續核苷酸係使用的)。在一實施例中，本發明提供二或多種該核酸的混合物，例如用於PCR拷貝二或多個可變區序列(例如使用源自對應B細胞之DNA、cDNA或RNA)。在一例子中，在該混合物中之二、多個或全部的核酸拷貝VH基因區段。在一例子中，在該混合物中之二、多個或全部的核酸拷貝Vλ基因區段。在一例子中，在該混合物中之二、多個或全部的核酸拷貝Vκ基因區段。任選地，該核酸或每一核酸緊接UTR序列(或該15或更多個連續核苷酸部分)之5'端包含一啟動子核苷酸序列。舉例而言，該啟動子序列係為如下之一CMV啟動子序列：5’-CTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCAGATC-3’(序列識別編號：54)

在一例子中，本發明提供：一種PCR引子或同源重組載體，其包含人類抗體可變基因區段UTR序列中至少15個連續的核苷酸，用於雜交至在表2中表示為Y的抗體可變基因區段的5'端UTR序列，其中該引子/載體序列係選自由表2中表示為X該序列所組成之該群組中。

在本發明該核酸、混合物或引子之一例子中，在PCR反應中，每一核酸或引子在從諸如45-70oC(例如於50℃、或60℃、或68℃)、或60-75℃之溫度下與其同族序列雜交。熟習該項技藝者將知道循環時間及溫度，以實行該PCR反應。

本發明之每一核酸與本發明之混合物對於執行PCR放大或複製標靶核苷酸序列係為有用的，其中該標靶核苷酸序列編碼一人類抗體可變域或包含此一域的蛋白質，舉例而言，由一或多種細胞(例如B細胞)分離出之人類可變區編碼核苷酸序列(等)之PCR。因此，在一實施例中，每一核酸係為一PCR引子。

本發明之每一核酸與本發明之混合物對於執行同源重組以修飾一標靶核苷酸序列(例如由一細胞之基因組所含括之序列，例如一哺乳類細胞，例如一ES細胞或CHO細胞)為有用的。對於同源重組，如熟習該項技藝者所知悉，人們使用一核酸載體其包含一5'端同源臂、一3'端同源臂、及任選地在其間之一預決定的感興趣核苷酸序列。該序列可以，舉例而言，編碼一POI、一蛋白質域或含括一調控元素。在一替代例，在該等同源臂之間係沒有介入序列的(且在此情況下，該載體係使用以刪除來自基因組中位於與該同源臂雜交區域之間的序列，如熟係該項技藝者所知悉的)。在本實施例中，本發明提供一同源重組載體，其中該載體包含一5'端臂、一3'端同源臂及任選地一在其間的核苷酸序列，其中該5'端臂包含一序列(或由其組成)，該序列係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：1-47所組成之該群組的一序列者，及/或其中該3'端臂包含一序列(或由其組成)其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：48-53所組成之該群組的一序列者。這使得使用同源重組在一脊椎動物中基因標靶Ig基因座的特定V及/或C基因區段成為可能。

本發明，因此，亦提供了修飾由一脊椎動物細胞所含括之Ig基因座的方法，該方法包含將本發明之該載體引入至細胞(例如藉由轉染)，並實行同源重組以修飾該Ig基因座；且任選地從該經修飾基因座表現一抗體V域或鏈。任選地，該V域之序列係經識別或拷貝或從細胞分離，並使用以產生一抗體或包含此一用於人類醫療用途之抗體的藥物組成物。

本發明進一步提供一PCR引子其包含一序列(或由其組成)，該序列係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：1-53所組成之該群組的一序列者。舉例而言，該引子係在體外。

該術語“分離”不包括存在於脊椎動物或脊椎動物細胞染色體內容中之序列。

該核酸、PCR引子或混合物可能在體外提供，例如與一PCR緩衝液或試劑混合。在一例子中，本發明之核酸、引子或混合物係於一容器、小瓶、試管、培養皿或PCR光析槽中提供。

任選地，該第一分離核酸包含一序列(或由其組成)其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於選自由序列識別編號：1-47所組成之該群組的一序列者。任選地，該第一分離核酸包含一序列(或由其組成)其選自由序列識別編號：1-47所組成之該群組。

75.如觀念74之混合物，其中該第一分離核酸包含一序列其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於選自由序列識別編號：1-17所組成之該群組中的一序列者。

任選地，該第一分離核酸包含一序列其選自由序列識別編號：1-17所組成之該群組。

76.如觀念74之混合物，其中該第一分離核酸包含一序列其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於選自由序列識別編號：18-26所組成之該群組中的一序列者。

任選地，該第一分離核酸包含一序列其選自由序列識別編號：18-26所組成之該群組。

77.如觀念74之混合物，其中該第一分離核酸包含一序列其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於選自由序列識別編號：27-47所組成之該群組中的一序列者。

任選地，該第一分離核酸包含一序列其選自由序列識別編號：27-47所組成之該群組。

78.如觀念74至77中任一項之混合物，其中該第二分離核酸包含一抗體恆定區序列；任選地一序列其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於選自由序列識別編號：48到53所組成之該群組中的一序列者。

任選地，該第二分離核酸包含一序列其選自由序列識別編號：48-53所組成之該群組。序列識別編號：48-51為來自小鼠恆定區的序列；序列識別編號：52及53為來自人類恆定區的序列(參閱表1)。

79.如觀念75之混合物，其中該第二分離核酸包含一抗體重鏈恆定區序列；且任選地包含一序列其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)序列識別編號：48或49。

80.如觀念76之混合物，其中該第二分離核酸包含一抗體κ鏈恆定區序列；且任選地包含一序列其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)序列識別編號：50或51。

81.如觀念77之混合物，其中該第二分離核酸包含一抗體λ鏈恆定區序列；且任選地包含一序列其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)序列識別編號：52或53。

82.一種核酸混合物，其包含一第一分離核酸與一第二分離核酸，其中該等核酸係為不同的，且選自包含一序列的核酸，其中該序列係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：1-47所組成之該群組中的一序列者。

在一例子中，該核酸係為PCR引子；在另一實施例中它們包含用於修飾一Ig基因座或基因座等的同源重組載體。

83.如觀念82之混合物，其包含一序列其選自由序列識別編號：18-26所組成之該群組，及一序列其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：18-26所組成之該群組及/或選自由序列識別編號：27-47所組成之該群組的一序列者。

84.如觀念82或83之混合物，其中該第一及第二分離核酸每一者係選擇的，其等至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：1-17所組成之該群組中的一序列者。

85.如觀念84之混合物，其包含至少3種不同的分離核酸，每一者至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：1-17所組成之該群組中的一序列者。

86.如觀念82或83之混合物，其中該第一及第二分離核酸每一者至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：18-26所組成之該群組中的一序列者。

87.如觀念84之混合物，其包含至少3種不同的分離核酸，每一者至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：18-26所組成之該群組中的一序列者。

88.如觀念82或83之混合物，其中該第一及第二分離核酸每一者至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：27-47所組成之該群組中的一序列者。

89.如觀念84之混合物，其包含至少3種不同的分離核酸，每一者至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號： 27-47所組成之該群組中的一序列者。

90.如觀念84或85之混合物，其中該混合物包含一抗體重鏈恆定區序列；且任選地包含序列識別編號：48或49。

91.如觀念86或87之混合物，其中該混合物包含一抗體κ鏈恆定區序列；且任選地包含序列識別編號：50或51。

92.如觀念88或89之混合物，其中該混合物包含一抗體λ鏈恆定區序列；且任選地包含序列識別編號：52或53。

93.如觀念1至36中任一項之方法，其中步驟(c)係使用如觀念74至92中任一項之一或多種混合物藉由PCR執行的。

94.如觀念48至56中任一項之方法，其中該方法係使用如觀念74至92中任一項之一或多種混合物藉由PCR執行的。

95.一種套組，其包含如觀念74至92中任一項之一或多種混合物，及如觀念36至39中任一項之裝置。

96.一種放大人類可變區序列庫的方法，該方法包含a.提供表現人類可變區庫的一細胞族群，其中該等細胞包含編碼該可變區的核苷酸序列；b.使用PCR及PCR模板複製數個該可變區編碼核苷酸序列；及 c.分離、定序或識別一或多個該經複製的核苷酸序列，或實行觀念1至36中任一項之方法的步驟(d)及(e)；其中步驟(b)之一或多個模板包含一序列其係至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%一致於(或100%一致於)選自由序列識別編號：1-53所組成之該群組的一序列者。

97.如觀念96之方法，其中步驟(b)使用如觀念74至92中任一項之一或多種混合物做為PCR模板。

98.如觀念96或97之方法，其中步驟(a)中之該細胞係為經分選的單一細胞(例如經分選到一或多個盤之孔洞)。

99.如觀念96或97之方法，進一步包含使用在步驟(c)所獲得之一複製序列生產一人類可變區(例如作為用於人類醫學之一分離抗體鏈或分離抗體的一部分)，且任選地生產表現該人類可變區之一細胞株。

下面任選的特徵係應用至於此描述本發明之任何配置、層面、實施例或例子。

任選地，該POI編碼核苷酸序列係操作地連接至能夠驅動該POI表現的啟動子，其中該啟動子包含可由一活化劑或抑制劑調控的一真核啟動子。在另一實施例中，該真核啟動子可操作地連接至一原核操作子，且該真核細胞任選地進一步包含一原核抑制子蛋白。

任選地，每一表現卡匣包含編碼一標記之序列，諸如一可選擇標記，例如潮黴素抗性基因或編碼一螢光蛋白(例如該螢光蛋白係選自DsRed、GFP、eGFP、CFP、eCFP及YFP)。

任選地，一或多個或全部的表現卡匣包含第一及第二POI編碼核苷酸序列，例如串聯的或作為一雙順反子卡匣。在一例子中，該編碼的POI為不同的(例如一抗體的VH及VL)；在另一例子中，它們為不同的。在一例子中，1、2、3、4、5、6或更多的POI編碼核苷酸序列。

在一例子中，該宿主細胞或每一宿主細胞係為CHO(中國倉鼠卵巢)細胞或HEK293細胞。

舉例而言，該感興趣蛋白可以為一抗體或其片段、一嵌合抗體或其片段、一ScFv或其片段、一Fc標籤的蛋白或其片段、一生長因子或其片段、一細胞因子或其片段、或一細胞表面受器的胞外域或其片段。

核酸構建體

重組表現卡匣(載體)可以包含編碼一感興趣蛋白的合成或cDNA起源的DNA片段，該者可操作地連接到一衍自哺乳類、病毒或昆蟲基因的適合轉錄及/或轉譯調控元素。此種調控元素包括轉錄啟動子、增強子、編碼適合mRNA核糖體結合位點的序列、及控制轉錄與轉譯終止的序列。哺乳類表現卡匣亦可以包含非轉錄元素，諸如一複製起點、其它5'或3"端夾擊的非轉錄序列、及5'或3'端非轉譯序列，諸如剪接供子與受子位點。一促進轉染子(transfectants)辨識的可選擇標記基因亦可能合併的。

在表現卡匣中對轉染脊椎動物細胞有用的轉錄及轉譯控制序列可能藉由病毒來源提供的。舉例而言，常用的啟動子及增強子係衍自於病毒，諸如多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)及人類巨細胞病毒(CMV)。病毒性基因啟動子、控制及/或信號序列可能被利用以驅動表現，倘若此種控制序列與該所抉擇的宿主細胞相容的話。非病毒的細胞啟動子亦可能使用(例如該β球蛋白與該EF-1α啟動子)，取決於該重組蛋白要在其中表現的該細胞類型。

衍自SV40病毒基因組的DNA序列，舉例而言，SV40起點、早期與晚期啟動子、增強子、剪接及多聚腺苷酸化位點可能使用以提供其它對異源DNA序列表現為有用的遺傳元素。早期及晚期啟動子係特別有用的，因為兩者皆容易以亦包含SV40病毒複製起點的一片段從SV40病毒獲得的(Fiers等人於”Nature,1978,273：113”)。較小或較大的SV40片段亦可能使用的。典型地，從HindⅢ位點朝向BglI位點延伸、位於SV40複製起點大約250的序列係包括在內。

使用於多重轉錄體表現的雙順反子表現載體先前已經描述過了(Kim S.K.與Wold B.J.於”Cell,1985,42：129”)，且可以與一或多個POI編碼序列組合使用。

宿主細胞與轉染

任選地，真核宿主細胞係於本發明之方法中使用，例如它們為哺乳類宿主細胞，包括，舉例而言，CHO細胞或小鼠細胞。

被表現的蛋白質(POI)較佳地將分泌到培養基中，取決於該所選擇的核酸序列，但亦可能保留在該細胞中或沈積在細胞膜中。各種哺乳類細胞培養系統可能採用以表現重組蛋白。適合的哺乳類宿主細胞株之例子包括猴腎細胞的COS-7株，由Gluzman於1981年在”Cell 23：175”中描述的，及其它能夠表現一適當載體的細胞株，包括，舉例而言，CV-1/EBNA(ATCC CRL10478)、L細胞、C127、3T3、CHO、HeLa細胞及BHK細胞株。其他開發用於特異性選擇或放大方案的細胞株伴隨於此提供的方法及組成物亦為有用的。一較佳的細胞株為命名K1的CHO細胞株。為了實現重組蛋白大量生產的目標，該宿主細胞株任選地係預適應於在適當情況下的生物反應器培養基。

在該技藝中，若干轉染實驗計畫為已知，且在Kaufman於1988年中之”Meth.Enzymology 185：537”綜述的。該所抉擇的轉染實驗計畫將取決於宿主細胞的類型及該POI的本性，且可以根據常規的實驗來抉擇。任何此類實驗計畫的基本要求首先為引入編碼該感興趣蛋白的DNA到一適合的宿主細胞內，且然後識別並分離已在一相對穩定、可表現方式中併入該異源DNA的宿主細胞。

將異源DNA引入細胞的一種常用方法為磷酸鈣沈澱，舉例而言，如由Wigler等人所描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567,1980)。藉由此種方法引入至一宿主細胞的DNA經常進行重新排列，使得此程序對獨立基因的共轉染為有用的。

聚乙烯誘導的細菌原生質體與哺乳類細胞融合(Schaffner等人於1980之”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77： 2163”)係為引入異源DNA的另一有用方法。原生質體融合實驗計畫經常產生多重拷貝的質體DNA併入到該哺乳類宿主細胞基因組中，且此技術要求該等選擇與放大標記在該POI之相同核酸上。

電穿孔亦可以使用以將DNA直接地引入至一宿主細胞的細胞質中，舉例而言，如由Potter等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7161,1988)或Shigekawa等人(BioTechniques,6：742,1988)所描述。不像原生質體融合，電穿孔不要求選擇標記與該POI在相同核酸上。

最近，若干對將異源DNA引入至一哺乳類細胞有用的試劑已被描述。這些包括LipofectinTM試劑與LipofectamineTM試劑(Gibco BRL公司，馬里蘭州蓋瑟斯堡)。這些試劑兩者都為使用以形成脂質-核酸複合物(或脂質體)的市售試劑，該二者當施用至培養細胞時，促進核酸攝入至細胞內。

一種用於放大該POI的方法亦為所欲的，用於該重組蛋白的表現，且典型地涉及一選擇標記的使用(在上文Kaufman中綜述)。細胞毒性藥物抗性係為最常使用作為一選擇標記的特性，且可以為一顯性性狀(例如，可以獨立於宿主細胞類型使用)或一隱性性狀(例如在被選擇活性為缺陷的特定宿主細胞中為有用的)兩者任一的結果。若干可放大標記適合在本發明之該等表現載體中使用的(例如在Maniatis之”Molecular Biology：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1989；pgs 16.9-16.14”中所描述的)。

在抗藥性哺乳類細胞中用於基因放大的有用選擇標記係於上文Kaufman,R.J.之表1中顯示的，且包括DHFR-MTX抗性、P-糖蛋白及多重藥物抗性(MDR)-各種親脂性的細胞毒性劑(例如阿黴素、秋水仙鹼、長春新鹼)及腺苷脫胺酶(ADA)-Xyl-A或腺苷與2'-脫氧柯福黴素。

其他顯性選擇標記包括衍自微生物的抗生素抗性基因，舉例而言新黴素、卡那黴素或潮黴素抗性。然而，這些選擇標記尚未顯示為可放大的(上文之Kaufman,R.J.)。對於哺乳類宿主，存在若干適合的選擇系統(上文Maniatis之”pgs 16.9-16.15”)。採用兩種顯性選擇標記的共轉染實驗計畫亦已經描述(Okayama及Berg,Mol.Cell Biol 5：1136,1985)。

在該技藝中，先前描述或已知的有用調控元素，亦可以包含在用於轉染哺乳類細胞之該核酸構建體中。該所抉擇的轉染實驗計畫與該所選擇於其中使用的元素將取決於所使用的宿主細胞類型。熟習該項技藝者知道眾多不同的實驗計畫及宿主細胞，且可以基於所使用的細胞培養系統的要求，選擇一適當的系統用於表現一所欲的蛋白質。

一層面提供了一藥物組成物其包含一分離POI(例如抗體、鏈或可變域)及一稀釋劑、賦形劑或載具，任選地其中該組成物係含括在一IV容器(例如且IV袋)或連結到IV注射器之一容器中，且其中該POI已經從本發明之一宿主細胞或宿主細胞族群分離出。

一層面提供了本發明之該POI在製造用於治療及/或預防患者例如，人類，之疾病或病症之一藥劑中的用途。

其應為理解的是，於此所描述的特定實施例係通過例示顯示，而不是作為本發明之限制。本發明之主要特徵可以在各種實施例中採用而不悖離本發明之發明範圍。使用不超過常規的研究，熟習該項技藝者將明白或能夠確定於此描述之特定程序的眾多等同物。此種等同物係視為在本發明之發明範圍內，並由該等請求項所涵蓋。在本說明書中提及的所有公開案與專利申請案係表現為熟習本發明所屬該項技藝者的技術人員之水平。所有公開案及專利申請案係於此併入以作為參考，其程度如同每一個自的公開案或專利申請案係具體且個自地顯示為併入以作為參考般。該字詞“一”或“一個”當連同術語“包含”在該等請求項及/或本說明書中使用時可能意謂“一種”，但其亦符合“一或多個“，”至少一個“及”一或兩個以上“的含義。在該等請求項中，術語“或”的使用係使用以意謂“及/或”，除非明確指示為僅意指替代物或該等替代物為相互排斥的，儘管本揭露內容支持僅意指替代物“及/或“之一定義。貫穿本申請案，該術語“約”係使用以指出一數值其包括對該被採用以決定該值之裝置、方法所固有的誤差變異，或存在於該等受試者之間的變異。

例子1

本發明之B細胞選殖技術包括三個主要步驟-藉助對應的細胞標記，分離源自脾臟、淋巴結及骨髓的抗原特異性單一B細胞或ASC；源自單一細胞的抗體序列保全及表現卡匣放大；在哺乳類細胞中表現重組抗體。該流程圖係於圖1B中顯示的。每一步驟之細節係於下文描述

例子1A：抗原特異性單一細胞的分離

抗原特異性細胞包括具膜結合抗體的記憶/GC細胞及抗體分泌漿細胞。一小組的細胞表面標記係使用以界定並標誌小鼠記憶/GC細胞(CD19；IgM；IgD；CD38；CD95)(圖2)。抗原特異性細胞係使用螢光標誌-可溶性抗原染色的(舉例而言，可以藉由細胞分選系統偵測的任何小分子螢光團，諸如Alexa-488、Alexa-647、太平洋藍、R-藻紅蛋白、螢光素異硫氰酸酯或異藻藍蛋白，任選地共軛至一花青染料，例如Cy7)，或在類病毒顆粒(VLP)中的細胞表面抗原染色的。圖2係為在OVA免疫小鼠脾臟中標誌抗原特異性記憶/GC細胞的例子。超過10,000OVA-特異性記憶/GC之IgG細胞可以從一脾臟經分選的。單一細胞分選係使用配備以自動細胞沈積單元的BD湧入流式細胞儀執行。FACS-分選細胞係沈積至具有用於下一步驟之溶解緩衝液的96孔PCR盤內。

一般地，抗原特異性GC(生殖中心)或記憶B細胞可以藉由標誌抗原捕獲的，因為它們顯性地表現在細胞表面上的跨膜抗體。另一方面，漿母細胞或漿細胞被認為不容易藉由標誌抗原捕獲的，因為其分泌抗體的顯性表現。我們接著試圖使用螢光標誌的抗原及抗CD138分離ASPC，以使用FACS從該細胞族群的剩餘餘部分分選該細胞(圖2)。如圖2中所顯示，在ELISPOT檢測中，大多數分離的抗原特異性漿細胞或漿母細胞顯示它們為抗原特異性ASC，但那些遺留的相同類型細胞中沒有顯示。這證明使用螢光-標誌抗原的細胞分選方法可以有效地捕獲所有的抗原特異性ASC，可能藉由殘留的跨膜抗體或細胞表面臨時的錨固分泌抗體。

該螢光標誌抗原可以以在其表面上具重組抗原的VLP取代。該等VLP係從CHO細胞、KEK細胞、MEF(小鼠胚胎成纖維細胞)或其他哺乳類細胞株中生成的，伴隨重組抗原、反轉錄病毒之gag蛋白及MA-GFP(gag基質片段的p15-GFP融合蛋白)的共同表現。gag表現使得VLP能夠從細胞出芽，而MA-GFP標誌該VLP用於螢光偵測。gag與MA-GFP蛋白兩者皆與原生質膜的內表面結合，且重組抗原係於該VLP表面。在VLP上的抗原係以從重組細胞直接表現而不經任何純化或修飾步驟的原生形式呈現。一抗原的原生形式應提供所有的天然抗原決定位，該者大大地幫助中和抗體的選擇。VLP上抗原的高密度提高了用於偵測在細胞表面上表現抗原-特異性抗體之細胞的信/噪比，且大大地促進該分選步驟。該重組VLPs可以伴隨不同螢光蛋白的表現而生成，諸如MA-CFP或MA-YFP。使用具不同抗原及不同螢光蛋白的多工VLP，表現高親和力綴合物(high affinity binders)、交叉反應性綴合物或同源物特異性綴合物的細胞可以被選擇。表現高親和力綴合物的該細胞可以藉由具相對高親和力基質(affinity matrix)的細胞選擇(親和力基質=對低密度抗原VLP比對高密度抗原VLP的結合活性比值)。對異種同源或不同抗原(針對2合1或雙特異性抗體的分離)表現交叉反應性綴合物的細胞，可以藉由於同一時間結合至不同類型VLP的細胞而選擇。表現同源物特異性綴合物的細胞亦可以藉由僅結合到特定抗原但不是其同源物的細胞而選擇。

例子1B：源自單一細胞之抗體序列的高通量回收

一種快速、有效且高通量的方法係開發的，用於從個自的B細胞生成抗體，而不需任何分子選殖步驟。該方法允許我們從一單一細胞的重鏈與輕鏈之經放大的可變基因區段產生Ig-表現構建體(圖3)。通過整個PCR程序，源自單一細胞之重鏈與輕鏈係於相同孔洞中放大的。

抗體V區之序列係藉由RT-PCR及兩輪下列程序的PCR回收。儲存在-80℃下的經分選單一細胞盤係於冰上解凍，並在使用前短暫離心。盤子係於熱循環儀中培育，在65℃下達5分鐘，且在4℃下無限期地。引子、Superscript III、dNTP、RNase抑制劑與緩衝液之6μL混合物係加入至每一孔洞，並藉由吸液混合。盤子係短暫地離心並於50℃下培育60分鐘。針對重鏈及輕鏈恆定區的特異性引子係使用以放大源自單一細胞的可變基因區段。使用以放大該κ、λ、γ鏈的基因特異性反向引子為γRT1、κRT1與λRT3。

該第一輪PCR係以在其5'端具人類巨細胞病毒 (hCMV)啟動子片段的正向V基因特異性引子、及反向恆定區特異性引子執行的。來自該RT-PCR之產物係使用作為用於該第一次PCR之模板。該PCR產物包含可變的免疫球蛋白區及部分的恆定區。針對第一次PCR，循環條件包括在98℃下達30分鐘的一起始變性步驟，繼之98℃下達10分鐘、72℃至60℃達30分鐘、且72℃達30分鐘，伴隨每一隨後的黏著步驟下降1℃的13個遞減循環；98℃達10分鐘、60℃達30分鐘及72℃達30分鐘之20個循環，繼之一最終延伸在72℃下達2分鐘，並保持在4℃無限期地。

在該第二輪PCR中，黏著至該hCMV標籤的一通用正向引子係與針對該恆定區的一反向巢式引子使用的。源自第一次PCR的1μL產物係使用作為該第二次巢式PCR之模板。針對第二次PCR，循環條件包括在98℃下達30分鐘的一起始變性步驟，繼之98℃達10分鐘、68℃達30分鐘及72℃達30分鐘之20個循環；一最終延伸在72℃下達2分鐘，並保持在4℃無限期地。第二輪PCR產物之1/3係於1%瓊脂糖凝膠上運行，以檢查源自單一細胞之抗體序列對RT及2輪PCR步驟的回收率。由於針對重鏈與輕鏈的引子係混合至相同孔洞中，該PCR產物含有兩個代表重鏈VDJ區與輕鏈VJ區的條帶。該PCR產物之預期大小對κ及λ輕鏈為~700bp，且對該γ重鏈為~500bp(圖4a)。

對於在哺乳類細胞中的抗體表現，該放大產物然後係以具5’端PB LTR-CMV啟動子及恆定區-多聚腺苷酸信號-3'端PB LTR的線性Ig-卡匣橋接(圖3)。該Ig-卡匣含有用於表現該抗體的所有必要元素，包括該CMV啟動子、該免疫球蛋白鏈恆定區與該聚(A)信號。此外，該卡匣在其末端具有CMV與恆定區同源物的一長重疊區。源自第二輪PCR的2μL產物係使用作為用於該橋式PCR的模板。針對該橋式PCR，循環條件包括在98℃下達30分鐘的一起始變性步驟，繼之98℃達10分鐘、68℃達30分鐘及72℃達2分鐘之5個循環；及98℃達10分鐘、60℃達30分鐘及72℃達2分鐘之25個循環；繼之一最終延伸在72℃下達2分鐘，並保持在4℃無限期地。該橋式PCR產物之1/3係於1%瓊脂糖凝膠上運行，以檢查該橋式PCR的回收率。該PCR產物之預期大小對κ及λ輕鏈為~2600bp，且對該γ重鏈為~3100bp(圖4b)。

該橋式步驟允許橋接所有表現元素及PB LTR一起，以與重鏈及輕鏈表現基因形成該PB轉位子。不論該小鼠抗體具有那種同型，小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、或人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、或恆定區之任何變體，可以在該橋接步驟中施用以重訂Fc格式。在此技術中施用之該方法不需要任何純化步驟，且可以廣泛地自動化。對不同的細胞族群，針對通過細胞分選及單一細胞PCR之該B細胞技術(BCT)的整體回收率係為約38-71%(參閱表3)。

例子1C：藉由群聚(clusters)之序列分析

該第二輪PCR產物係送去定序。該等核苷酸序列係使用Applied Biosystems 373 DNA定序儀而確定。該等序列係藉由Kymab seq-utils程式分析(Lee E.C.等人於”Nature Biotechnol.,2014,32：356-363”)。該程式預測胚原序列 (germline sequence)及該分析IG序列的高突變。該可變免疫球蛋白區包含一免疫球蛋白核苷酸序列之VDJ區，針對重鏈基因，及一免疫球蛋白核苷酸序列之VJ區，針對Igκ與Igλ。一選殖家族一般係藉由使用相關的免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈V(D)J序列由2或多個的樣本而界定。相關的免疫球蛋白重鏈V(D)J序列可以藉由其在該基因組中編碼的V(D)J基因區段的共享使用而識別(圖5)。

在一選殖家族之內，一般係有次家族，該等次家族基於在B細胞基因重組與體細胞高突變期間可以發生於其等之V(D)J區段內的共享突變而變化。具不同V(D)J區段使用的選殖株通常展現不同的結合特性。還有，具相同V(D)J區段使用但不同突變的選殖株展現不同的結合特性。B細胞進行體細胞高突變，其中在該抗體基因之核苷酸序列中的隨機改變係製造的，且B細胞其抗體具有具有較高親和力之B細胞者係選擇的(圖6)。假若源自相同譜系的低親和力選殖株具有中和功用，在具更多突變以獲得較高親和力的選殖株中，效價通常提高的。

例子1D：從單一細胞生成單株抗體

該最終PCR步驟放大編碼重鏈及輕鏈的該線性表現卡匣。該經放大、針對重鏈及輕鏈的卡匣，及該PB轉位酶(PBase)表現載體係共轉染到哺乳類細胞株而不經純化與選殖。具瞬時或穩定抗體表現的上清液然後係在對應的時間點收集。傳統表現載體之轉染可能造成連環體併入到基因組，且該被併入的基因係經受靜默的。PB轉位子介導的表現對轉染基因之高且穩定表現量提供了一主要的優勢，因為PB轉位子之多重拷貝(10-100)可以轉位並併入到在轉錄活性區域之內的基因組，允許抗體的高量表現(圖7)。

針對瞬時表現，橋式PCR產物與PBase表現載體的轉染係使用Lipofectamine 2000，按照製造商的實驗計畫進行。轉染係於96孔深孔盤中實行。簡言之，HEK293細胞係於DMEM+10%超低IgG的FBS(Invitrogen)中培養，以防止在下游蛋白質A純化步驟中，牛IgG與分泌的人類IgG競爭。對於96孔盤轉染，每一孔洞係於前一天接種在500μL培養基中的5×105細胞，並允許其第二天生長至1×106細胞。30μL橋式PCR產物中取出的25μL係與100ng的PBase載體在Optimem培養基以70uL的最終體積培育。二者培育皆為10分鐘。Lipofectamine 2000與該PCR產物然後藉由輕輕地吸液混合，並在加入到HEK293細胞之前培育達15分鐘，並輕輕混合。培養上清液係於轉染後第8天收集，用於下列的篩選。含有感興趣抗體之上清液的IgG濃度係藉由IgG ELISA測定(圖8)。該表現抗體的濃度係可比擬我們正常從雜交瘤技術得到的濃度，該者對最下游抗體結合能力或功能性檢測之篩選係足夠的。取決於不同的細胞族群，通過細胞分選，B細胞技術對IgG識別的總體命中率為36%-71%(表3)。

例子1E：使用LI-COR的奧德賽近紅外線掃描(Odyssey NIR scanning)的抗體結合篩選檢測

源自B細胞技術(BCT)轉染之HEK293細胞的表現抗體首先係使用LI-COR奧德賽近紅外線掃描針對其結合到感興趣抗原的能力篩選，且然後陽性選殖株係藉由表面電漿共振(ProteOn XPR36,BioRad)針對其表觀親和力篩選(參閱下文)。

B細胞產生的抗原特異性抗體係藉由螢光篩選識別的。使用一多頭(Multidrop)儀器，透明的384孔平底盤的每一孔洞係於80μL含有10%(v/v)FBS的F12培養基(1.25×10⁵細胞/mL)中接種1×10⁴個附著的CHO細胞，其中該CHO細胞係穩定地轉染一編碼人類跨膜抗原的基因。細胞係於37℃下在一CO₂培養箱中培育過夜。第二天，該培養基係藉由抽吸移除，且45μL的LI-COR IRDye 800CW抗小鼠抗體係於500ng/mL+5mM DRAQ5(LI-COR)下加入，該者係在FACS緩衝液(PBS+1% BSA+0.1% NaN₃)中稀釋1：25000。5μL的BCT上清液、在HEK293培養基中的5μL對照抗體(2μg/mL)、或在HEK293培養基中的5μL小鼠IgG1對照抗體(Sigma,2μg/mL)係使用一FluidX液體分注儀加入。盤子係於4℃下培育達1小時，且培養基係抽吸出。該反應係停止，且該細胞係藉由每孔加入25μL的三聚甲醛，並於RT下培育達15分鐘而固定。該盤子係以100μL的PBS洗滌兩次，且該洗滌溶液係藉由擦在紙巾上移除。該等盤子係使用一LI-COR奧德賽經典儀器掃描。取決於不同的細胞族群，對通過細胞分選的BCT，對抗原特異性識別的總體命中率為25%-61%(表3)。

例子1F：使用抗體捕獲方法藉由SPR之親和力測量

表現抗原特異性抗體的陽性選殖株然後係藉由表面電漿共振針對其表觀親和力篩選。抗小鼠IgG(GE Healthcare/Biacore)係藉由初級胺偶合，偶合至該GLM。該GLM晶片(BioRad)係使用NHS/EDAC活化，且該抗小鼠IgG偶合到該經活化表面，且然後使用1M的乙醇胺阻斷。固定化係於室溫或37℃下，在HBS-EP(Teknova)或HBS-N(GE Healthcare/Biacore)兩者任一中個別地實行。在該GLM晶片上的抗小鼠IgG表面係使用以直接捕獲感興趣抗體。對於動力學分析，5種濃度的分析物係使用(256nM、64nM、16nM、4nM及1nM)。針對數據分析，該結合光譜係使用唯一參照至該ProteOn XPR36的內部“interspot”而參照，其中該ProteOn XPR36係使用緩衝液注射光譜雙重參照的。最後該數據係使用ProteOn XPR36分析軟體固有的1：1模型分析。

圖9係為使用本發明該單一B細胞技術，源自該卵清蛋白免疫Kymouse®之抗體SPR數據之一例子。大約三分之二的測試抗體顯示與抗原結合的證據，伴隨範圍歧異的區別結合親和力與動力學。結合特性之變化揭示了該細胞分選程序在捕獲歧異品質抗體中為有效的。不管本實驗之規模(2隻動物)，在該低nM至低pM範圍中的許多高親和力抗體係分離，驗證親和力成熟的效率。

圖10顯示對於兩種不同的Kymab標靶抗原，抗體的表觀親和力。一範圍的綴合物(空心)以及功能性中合劑(實心)係偵測的，伴隨在微微莫耳範圍內偵測到的最高親和力。此證實了本發明之該單一B細胞選殖技術在高親和力及功能性勝任抗體之識別與取得中為一有力的工具。

如在本說明書及請求項(等)中所使用，字詞“正包含”(及任何形式的正包含，諸如“包含”及“包含著”)、“正具有”(及任何形式的正具有，諸如“具有”及“具有著”)、“正包括”(及任何形式的正包括，諸如“包括”及“包括著”)或“正含有”(及任何形式的正含有，諸如“含有”及“含有著”)係為包容或開放式的，且不排除額外、未列舉的元素或方法步驟。

該術語“或其等之組合”如於此所使用，意指對該術語之前所列出項目的全部排列與組合。舉例而言，“A、B、C或其等之組合係意欲包括下列至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且假若在一特定上下文中次序為重要的話，還包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。接續此例子，明確包括的為含有一或多個項目或條目之重複的組合，諸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB、及諸如此類。熟習此技藝者將理解的是，典型地，在任何組合中項目或條目之數目係沒有限制，除非從上下文另為明顯的。

本揭露內容之任何部分可能結合本揭露內容之任何其他部分閱讀，除非從上下文另為明顯的。

鑒於本揭露內容，於此揭露及主張的所有組成物及/或方法可以被製成與履行而無需過度實驗。雖然本發明之組成物及方法已就較佳實施例描述，對熟習該項技藝者，其將為明顯的是，變異可能施用至該組成物及/或方法，及在於此描述該方法之步驟中或該步驟之順序中，而不悖離本發明之觀念、精神與發明範圍。對熟習該項技藝者為明顯的所有此種類似取代物與修飾係認為在由該等所附請求項所界定的本發明之精神、發明範圍及觀念內。

<110> 凱美寶有限公司(KYMAB LIMITED)

<120> 表現載體生產與高通量細胞篩選

<130> PI-58951-D1-EN

<150> GB 1316644.2

<151> 2013-09-19

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<223> CMV啟動子序列

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<211> 313

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<220>

<223> piggyBac(PB)轉位子倒轉5'末端重複元素

<400> 55

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<212> DNA

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<220>

<223> piggyBac(PB)轉位子倒轉3'末端重複元素

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<212> PRT

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<220>

<223> 野生型piggyBac轉位酶

<400> 57

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<212> PRT

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<220>

<223> 高活性piggyBac轉位酶

<400> 58

Claims

一種生產編碼一包含V _H序列及V _L序列的抗體結合位點庫(repertoire)之細胞的方法，該方法包含：a)提供一表現一抗體結合位點庫的細胞族群，其之細胞係從一或多種動物所分離出的，且其包含B細胞、生殖中心細胞(germinal centre cell)、記憶B細胞、抗體分泌細胞、漿細胞或漿母細胞；b)藉由將該等抗體結合位點結合至一感興趣抗原來分選該細胞族群，以產生一經分選的單一細胞族群，每一細胞包含編碼一個別的抗體結合位點的核酸，且每一經分選的細胞係在一個別的容器中被提供；c)使用PCR放大由該經分選之單一細胞族群所含括的核酸，以產生一經分選的編碼抗體結合位點之經放大的核酸庫，其中每一抗體結合位點的V _H及V _L序列係在同一容器中被放大；d)修飾源自步驟(c)之經分選、放大的抗體結合位點編碼核酸，以產生一經分選的表現卡匣庫，每一容器包含一第一類型的卡匣及一第二類型的卡匣，該第一類型的卡匣包含衍自該單一細胞的一編碼一抗體結合位點之V _H序列的核苷酸序列與一或多種用於表現該抗體結合位點之V _H序列的調控元素，該第二類型的卡匣包含衍自該單一細胞的一編碼一抗體結合位點之V _L序列的核苷酸序列與一或多種用於表現該抗體結合位點之V _L序列的調控元素，其中每一抗體結合位點的V _H及V _L序列係在同一容器中被修飾；以及e)從該卡匣庫轉殖該抗體結合位點表現卡匣至一經分選的宿主細胞族群，同時保持該抗體結合位點表現卡匣分選及產生一表現一經分選的抗體結合位點庫之經分選的宿主細胞庫，其中該經分選的宿主細胞庫能表現該抗體結合位點庫。
如請求項1之方法，其中步驟(e)中之該經分選的表現卡匣係批次地轉殖到該等經分選的宿主細胞。
如請求項2之方法，其中步驟(e)中之該經分選的表現卡匣被轉殖時未經純化。
如請求項1-3中任一項之方法，其中(i)由步驟(d)所產生的該經分選表現卡匣庫係於數個相對於彼此位置為固定的容器中提供，其中，每一容器包含個別類型的表現卡匣，使得表現卡匣相對於彼此的相對位置為預決定的；且(ii)該等表現卡匣係於步驟(e)中轉殖到該等經分選的宿主細胞中，使得該等表現卡匣的相對位置被維持的。
如請求項1-3中任一項之方法，其中(i)由步驟(d)所產生的該表現卡匣庫係藉由提供數個容器而經分選，其中每一容器包含在步驟(b)中經分選的單一細胞之抗體結合位點編碼序列；(ii)步驟(e)之該等經分選宿主細胞係於數個容器中提供，且(iii)該等表現卡匣係於步驟(e)中轉殖到該等經分選的宿主細胞中，使得在每一個別容器中的宿主細胞僅與衍自在步驟(b)中經分選的單一細胞的抗體結合位點編碼序列混合。
如請求項1-3中任一項之方法，其中步驟(b)係使用FACS進行細胞分選。
如請求項6之方法，其中該進行細胞分選的FACS係螢光FACS。
如請求項1-3中任一項之方法，其中同族配體係一螢光標誌抗原；或是一類病毒顆粒(VLP)，其在表面上包含一表現抗原，且其進一步包含一螢光標誌蛋白。
如請求項1-3中任一項之方法，其中步驟(d)包含藉由與一預決定序列組合來修飾經放大的核酸，使得該預決定序列夾擊該等核酸之該等抗體結合位點編碼核苷酸序列的5'及/或3'端；其中該修飾放置一調控元素及/或一轉位子元素夾擊抗體結合位點編碼核苷酸序列的5'及/或3'端。
如請求項1-3中任一項之方法，其中步驟(e)包含將該等抗體結合位點表現卡匣基因併入(genomically-integrating)至個別用以表現該等個別的抗體結合位點的宿主細胞之基因組內，其中該基因併入係使用一用以插入該等表現卡匣到個別細胞基因組內的預決定的基因組核苷酸序列基序(motif)來實行。
如請求項10之方法，其中該基因併入係藉由轉位子介導的併入(integration)而實行。
如請求項1-3中任一項之方法，其中步驟(d)中之修飾係使用橋式PCR實行，以生產一包含5'-及3'-末端轉位子元素的表現卡匣庫，其中在該等轉位子元素之間具有一抗體結合位點編碼核苷酸序列及用於抗體結合位點表現的調控元素。