CN1408874A - 原核细胞体内抗体文库构建、抗体的筛选和优化及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在原核细胞即大肠杆菌体内构建多种属、高滴度、高丰度、高多样性的抗体文库、高特异性、高亲和力抗体的筛选和优化及用途。解决了噬菌体展示技术体外构建抗体文库不能反映实际抗原抗体反应的缺陷，利用在原核细胞即大肠杆菌增殖表达并能用于大肠杆菌双杂交的特殊重组质粒中构建高滴度、高丰度、高多样性抗体和抗体片段文库和次级抗体文库。在筛选抗体前，不需要纯化抗原，仅需要含有抗原表位的基因DNA顺序，并将抗原基因的全部或部分开放阅读框架(open reading frame，ORF)可操作地与特殊蛋白编码基因形成融合基因，从而进行高特异性、高亲和力抗体的筛选和优化。本发明的用途是所获得抗体和抗体片段可作为药物用于临床疾病诊断、治疗，也可以用于生命科学研究及抗体工程和基因工程生产和改造。

Description

原核细胞体内抗体文库构建、抗体的筛选和优化及用途

一、技术领域

本发明涉及基因组学、蛋白组学、分子生物学、免疫学、细胞生物学、抗体工程、基因工程以及临床医学如疾病治疗和诊断等领域，具体地，本发明涉及在原核细胞即大肠杆菌体内构建多种属、高滴度、高丰度、高多样性的抗体文库、高特异性、高亲和力抗体的筛选和优化及其用途。

二、背景技术

既往用于产生抗体的方法有许多。如将抗原注射入动物体内如兔产生多克隆抗体，或者免疫动物如小鼠结合杂交瘤技术制备单克隆抗体(例如，Kohler et al.，Nature 256：495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohleret al.，Eur.J.Immunol.6：292，1976)。但以上均不是多种属、高滴度、高丰度、高多样性的抗体文库，所产生的抗体不是人类的抗体。而目前能产生多种属、高滴度、高多样性的抗体文库的技术和筛选及优化高亲和力抗体方法是噬菌体展示技术(phage display)(例如，ClacksonT，et al.Nature 352：624，1991)。近年，也有用核糖体展示技术构建抗体文库和筛选抗体(例如，Hanes J，Pluckthun A.Proc Natl Acad Sci U S A 94：4937，1997)。但展示技术属于体外筛选技术，不一定能反映实际的抗原抗体反应。近来，有人用酵母双杂交技术在酵母内筛选抗体(例如，VisintinM，et al.Proc Natl Acad Sci U S A 96：11723，1999)，获得成功。但酵母生长慢，不易操作。目前，国内主要引进噬菌体展示技术建立人类高滴度文库，未用其他方法。中国专利ZL95105582介绍了“重组单链可变区抗体片段及其应用”，该专利采用重组DNA技术在大肠杆菌中生产抗体片段，仅涉及到单链抗体片段的生产。

三、发明内容

本发明需要解决的技术问题是：如何在原核细胞即大肠杆菌体内构建多种属、高滴度、高丰度、高多样性的抗体文库、次抗体文库，对高特异性、高亲和力抗体的筛选和优化。本发明的技术解决方案是：原核细胞体内抗体文库构建方法，包括原核细胞体内抗体，其特征在于原核细胞体内抗体文库构建包括以下步骤：(1)取生物的外周血、淋巴结、脾脏、骨髓、肝脏等免疫相关组织、细胞；(2)从所取的组织、细胞中分离RNA，并逆转录获得cDNA；(3)分别设计针对免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区和第三恒定区的DNA引物，在获得的cDNA中扩增免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区和第三恒定区；(4)用限制性内切酶、连接酶等和/或同源重组的分子生物学和遗传学的方法，将上一步骤获得的免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区和Fab插入特殊的重组质粒，并与重组质粒中特殊编码基因如RNA多聚酶α亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列形成融合蛋白，从而形成质粒抗体文库。抗体文库的构建也可以不采用前两个步骤，采用完全人工合成或半人工合成方式设计免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区。本发明所指“多种属”包括人类、小鼠、大鼠等脊椎动物，但不限于脊椎动物，可以包括所有能产生抗体的生物。本发明所述“高滴度”指抗体文库所含有的质粒在10⁵cfu/毫升以上。本发明所述“高丰度”指80％克隆含有插入子，并且插入子90％以上为抗体或抗体片段。本发明所述“高多样性”指抗体文库所含有插入子大多为不同的抗体或抗体片段。本发明所述“各种抗体”或“抗体或抗体片段”指完整抗体即带有完成重链、轻链的恒定区和可变区，也指抗体中的一部分包括重链、轻链的可变区，可变区中的互补决定区(CDRs)和恒定区的一部分，可指单链抗体(single chain Fv，scFv)、可变区(Fv)抗体和免疫球蛋白Fab抗体，但不限于单链抗体(scFv)、可变区(Fv)抗体和免疫球蛋白Fab抗体。本发明所述“抗体”在质粒文库构建和筛选过程中既指抗体DNA顺序，也指抗体蛋白。本发明所要求的特殊重组质粒包括所有能用于原核细胞即细菌双杂交的质粒，这种质粒除含有一般质粒共有蛋白编码基因外，还含有特殊蛋白编码基因如RNA多聚酶α亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列，但不限于上述RNA多聚酶α亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列。

在原核细胞内筛选特异性抗体的方法，其特征在于筛选特异性抗体包括以下步骤：(1)将抗原基因的全长或部分开放阅读框架(ORF)插入在细菌双杂交中能用作诱饵质粒的DNA序列中。诱饵质粒包括所有能用于原核细胞即细菌双杂交的质粒，这种质粒除含有一般质粒共有蛋白编码基因外，还含有特殊蛋白编码基因如DNA结合的蛋白或者腺苷酸环化酶的部分序列。插入的抗原基因能与DNA结合的蛋白序列或腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因。(2)将步骤(1)获得的含有抗原的质粒与从文库构建步骤(4)获得的含有抗体文库质粒混合，加入含有报道基因(如耐抗生素药基因和β-半乳糖苷酶等)的感受态大肠杆菌进行共转化。(3)将从步骤(2)所得的大肠杆菌铺在含有抗生素和能与β-半乳糖苷酶起化学反应呈现颜色的试剂X-gal的细菌培养平板，孵育过夜。(4)能在细菌培养平板生长并有颜色反应的是阳性克隆，含有相应的抗体或抗体片段如scFv、Fv和Fab等。颜色反应的强度与抗原-抗体间的亲和力成正相关。(5)从步骤(4)获得的含侯选抗体的质粒通过与含抗原的质粒再次共转化至上述感受态大肠杆菌，观察生长和颜色反应证实其特异性。筛选特异性抗体在原核细胞内，主要指大肠杆菌，但不限于大肠杆菌；本发明所使用的诱饵质粒是用于原核细胞即细菌双杂交的质粒，这种质粒除含有一般质粒共有蛋白编码基因外，还含有特殊蛋白编码基因如λcl蛋白或者腺苷酸环化酶的部分序列，但不限于上述λcl蛋白或者腺苷酸环化酶的部分序列；在筛选抗体前，不需要纯化抗原，仅需要含有抗原表位的基因DNA顺序，并将抗原基因的全部或部分开放阅读框架(open reading frame，ORF)可操作地与特殊蛋白编码基因形成融合基因。本发明所述“诱饵质粒”指装载抗原基因的质粒；“可操作地”指使用基因工程方法构建重组质粒；“融合基因”指特殊蛋白编码基因如λcl蛋白或者腺苷酸环化酶的部分序列与抗原基因形成一个完整阅读框架，连续转录和翻译，所形成的蛋白既含有特殊蛋白如λcl蛋白或者部分腺苷酸环化酶又含有抗原蛋白。本发明的筛选特异性抗体的方法能最佳地与本发明的多种属、高滴度、高丰度、高多样性的抗体文库联用，但不限于二者联用。该方法与其他已知的方法如噬菌体展示、小鼠免疫等技术比较具有快速、简便、高通量等特点。

在原核细胞内构建次级抗体文库的方法，其特征是：构建次级抗体文库包括以下步骤：(1)利用随机突变的多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增轻链和重链可变区，插入上述用于构建抗体文库的质粒，并与质粒中的特殊蛋白编码基因如RNA多聚酶α亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因，形成次级抗体文库；(2)将原有的抗体轻链和重链可变区插入上述用于构建抗体文库的质粒后，利用特殊宿主菌引起随机突变，抽提质粒，形成次级抗体文库；(3)利用链替换技术，分别替换抗体轻链和重链可变区后，插入上述质粒，形成次级抗体文库；(4)利用抗体轻链和重链可变区的互补决定区(complementarity determining regions，CDRs)的随机突变，形成次级抗体文库。构建次级抗体文库主要目的是为筛选和优化高亲和力抗体，但不限于该目的。本发明所提“次级抗体文库”指已经经过一次以上抗体筛选并得到一个以上抗体，但抗原抗体的亲和力不能满足实验要求，实验者根据已知抗体DNA顺序所构建的抗体文库。本发明适用于多种属包括人类、小鼠、大鼠、兔等脊椎动物和非脊椎动物的次级抗体文库构建；本发明的次级抗体文库构建适用于所有类型抗体。本发明的次级抗体文库所含有插入子为不同的抗体或抗体片段，即完整抗体即带有完成重链、轻链的恒定区和可变区或者抗体中的一部分包括重链、轻链的可变区，可变区中的互补决定区(CDRs)和恒定区的一部分或者单链抗体(singlechain Fv，scFv)、可变区(Fv)抗体和免疫球蛋白Fab抗体，但不限于上述抗体形式。本发明的次级抗体文库载体是特殊重组质粒包括所有能用于原核细胞即细菌双杂交的质粒，这种质粒除含有一般质粒共有蛋白编码基因外，还含有特殊蛋白编码基因如RNA多聚酶α亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列，但不限于上述RNA多聚酶α亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列。次级抗体文库可以是天然的、也可以是完全人工合成的或者半人工合成。

在原核细胞体内筛选和优化高亲和性抗体的方法，其特征是：筛选和优化包括以下步骤：(1)将抗原基因的全长或部分开放阅读框架(ORF)插入在细菌双杂交中的诱饵质粒的并与质粒中的DNA结合的蛋白序列或腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因。(2)含有次级抗体文库的质粒与从步骤(1)获得的含有抗原的质粒混合，加入含有报道基因(如耐抗生素药基因和β-半乳糖苷酶等)的感受态大肠杆菌进行共转化。(3)将从步骤(2)所得的大肠杆菌铺在含有抗生素和能与β-半乳糖苷酶起化学反应呈现颜色的试剂X-gal的细菌培养平板，孵育过夜。(4)能在细菌培养平板生长并有颜色反应的是阳性克隆。(5)颜色反应的强度与抗原-抗体间的亲和力成正相关。颜色反应可用分光光度计测量比较，选择颜色反应比原有抗体明显的抗体即为优化的高亲和力抗体。本发明适用于从本发明上述特异性抗体筛选步骤(5)所获得的或者所有其他来源的抗体的优化，如抗体与抗原的亲和力不高(低于10^-6M，但不限于此)，需要利用本方法优化高亲和性抗体。本发明所使用的诱饵质粒即装载抗原基因的质粒是用于原核细胞即细菌双杂交的质粒，这种质粒含有特殊蛋白编码基因如λcl蛋白或者腺苷酸环化酶的部分序列，但不限于上述λcl蛋白或者腺苷酸环化酶的部分序列；在筛选抗体前仅需要含有抗原表位的基因DNA顺序，并将抗原基因的全部或部分ORF可操作地与特殊蛋白编码基因形成融合基因。本发明的筛选特异性抗体的方法能最佳地与本发明的次级抗体文库联用，但不限于二者联用。

在本发明中，还提供适用于本发明的质粒系统，这种质粒可用于原核细胞即大肠杆菌双杂交，质粒分别含有相互有联系的蛋白编码基因。相互有联系的蛋白指蛋白相互作用能启动原核细胞特定基因转录表达如λcl蛋白与RNA多聚酶α亚单位相互作用启动转录或者蛋白结合形成活性蛋白酶如腺苷酸环化酶而催化底物化学反应，但不限于λcl蛋白与RNA多聚酶α亚单位及腺苷酸环化酶。用于构建抗体基因文库的质粒和含有抗原基因的诱饵质粒，插入子分别与相互有联系的蛋白基因形成融合基因。而且本发明还提供了上述载体转化的宿主细胞。该宿主细胞是原核生物即大肠杆菌，该宿主含有多个报道基因和调控元件。报道基因是耐抗生素药基因包括抗青霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素等以及β-半乳糖苷酶等。调控元件含有与上述质粒中含有的特定蛋白如λcl蛋白结合的DNA元件，或者含有能与活性蛋白酶如腺苷酸环化酶底物产物cAMP作用的元件。

在本发明所产生的人类抗体文库，含有天然或人工合成或半人工合成的高滴度、高丰度、高多样性的单链抗体片段(scFv)、Fv和Fab。这些天然的抗体和抗体片段来自未免疫的人类胎儿、健康成人以及不同疾病患者的外周血、淋巴结、脾脏、骨髓、肝脏等免疫相关组织、细胞等。不同疾病包括传染病、肿瘤、白血病、免疫相关疾病、心脑血管疾病等；这些抗体和抗体片段也来自完全人工合成和半人工合成抗体片段。本发明所产生的人类抗体文库可用于获得高特异性、高亲和力抗体，所获得的抗体用于多种疾病的诊断和治疗，也用于科学研究包括基因组学、蛋白组学、分子生物学、细胞生物学等研究。

在本发明所产生的小鼠、大鼠、兔等脊椎动物抗体文库，含有天然或人工合成或半人工合成的高滴度、高丰度、高多样性的单链抗体片段(scFv)、Fv和Fab。这些抗体和抗体片段是天然的，来自未免疫和抗原免疫后的胚胎、幼年、成年小鼠、大鼠、兔等脊椎动物的外周血、淋巴结、脾脏、骨髓等免疫相关组织、细胞等。这些抗体和抗体片段也来自完全人工合成和半人工合成抗体片段。本发明所产生的小鼠、大鼠、兔等脊椎动物抗体文库可用于获得高特异性、高亲和力抗体，所获得的抗体用于多种疾病动物模型的治疗实验，也用于科学研究包括基因组学、蛋白组学、分子生物学、细胞生物学等研究。

在本发明所产生各种次级文库，用于高亲和力抗体筛选，使亲和力提高数个数量级。一般从低于10^-6M提高到10^-7-10^-9M以上。提高亲和力的抗体更佳地用于用于多种疾病的诊断和治疗，也用于科学研究包括基因组学、蛋白组学、分子生物学、细胞生物学等研究。

本发明适用于所有生物种属包括所有真核生物、原核生物、病毒等的抗原。抗原包括所有生物的基因，可以是分泌蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白、细胞器蛋白、核内蛋白等。抗原基因不需表达纯化，所构建的抗原基因可以是全长或部分开放阅读框架(ORF)。插入抗原基因须与诱饵质粒中的特殊蛋白编码基因如DNA结合的蛋白或者腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因。

本发明提供了大规模高通量筛选高特异性、高亲和力的天然的、人工合成和半人工合成的抗体手段。大规模高通量指适用于流水线、自动化操作，每次筛选可达10-10000个抗原筛选。在本发明所产生抗体是高特异性、高亲和力的天然的、人工合成和半人工合成的抗体；抗体种类包括抗体片段如单链抗体(scFv)、Fv和Fab和完整抗体；抗体种属是人类、小鼠、大鼠、兔等脊椎动物和非脊椎动物；抗体针对所有生物基因产物蛋白。

原核细胞体内抗体文库构建、抗体的筛选和优化的用途：

(1)抗体工程和基因工程：

A.所获得的抗体包括抗体片段如单链抗体(scFv)、Fv和Fab和完整抗体可以直接在原核细胞(大肠杆菌)、真核细胞(酵母)、哺乳动物细胞(如CHO细胞)、昆虫细胞、植物细胞表达；可以利用现有技术纯化。可以直接生产。

B.所获得的抗体包括抗体片段如单链抗体(scFv)、Fv和Fab和完整抗体可以经抗体工程和基因工程加工衍生出多种类型抗体如双链抗体(dsFv)、多链抗体、多功能抗体等组合，提高特异性、亲和力，功能特化或多样化等。

C.在本发明中所获得的抗体基因可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。可以将抗体编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成抗体表达载体。

(2)生命科学研究：是现有单克隆抗体和多克隆抗体应用领域的替代抗体或补充抗体并有新的用途。

A.分子生物学研究：可用于基因功能研究如Western印记、免疫沉淀、免疫吸附、蛋白修饰状态等。

B.免疫学研究：用于研究细胞免疫、体液免疫等；

C.细胞生物学研究：用于研究细胞增殖、分化、凋亡、细胞信号传导过程等；可用于免疫组织细胞学等、可用于流式细胞仪等多种检测仪器。

D.基因组学包括功能基因组学蛋白组学等：可以用于相关技术如蛋白芯片等，也可用于蛋白相互作用图谱研究。

E.动物实验：可用于个别基因功能研究，也可用于大规模基因功能研究和疾病诊断和治疗研究等。

F.所获得的大量抗体可以制成蛋白芯片用于生命科学研究。

G.所获得的抗体可用来发现其抗原的抑制剂、拮抗剂或受体等。

(3)临床疾病诊断：

是现有用于临床疾病诊断的单克隆抗体和多克隆抗体的替代抗体或补充抗体，并有新的用途。

A.所获得的抗体可用于现有所有免疫诊断方法包括免疫组织病理学、免疫细胞学、免疫血清学等检查。可用于流式细胞仪等多种检测仪器。

B.所获得的高特异性、高亲和力人类抗体，适用于多种疾病如肿瘤、白血病、心脑血管疾病、免疫相关疾病等患者的体内诊断。人类抗体是安全的、副作用较少，可以连接同位素用于体内诊断。

C.所获得的抗体拓展了免疫诊断疾病的范围。

D.所获得的大量抗体可以制成蛋白芯片用于疾病诊断。

(4)临床疾病治疗：

是现有用于临床疾病治疗的小鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体的替代抗体或补充抗体，并有新的应用范围。

A.传染性和感染性疾病治疗：病原包括病毒、立克次体、细菌、寄生虫等，本发明所获得的针对性高特异性、高亲和力抗体、可以直接中和病原或次级蛋白产物，可以引导、刺激宿主的特异性的细胞免疫、体液免疫和非特异性的免疫系统消灭病原。本发明所获得可以单独使用或与其他药物合用。

B.肿瘤和白血病治疗：本发明所获得的针对肿瘤和白血病的特异或相对特异性抗原的高特异性、高亲和力抗体，或者所衍生的携带免疫毒素、同位素等的抗体，可以引导、刺激宿主的特异性的细胞免疫、体液免疫和非特异性的免疫系统消灭肿瘤和白血病细胞；或者干扰肿瘤和白血病细胞增殖过程；或者引起肿瘤和白血病细胞坏死、凋亡或分化。本发明所获得可以用于原发性肿瘤、转移性肿瘤；可以单独使用或与其他药物合用。

C.免疫相关疾病治疗：免疫相关疾病包括过敏如哮喘、结缔组织疾病如系统性红瘢狼疮、硬皮病以及有免疫机制介入的疾病。本发明所获得抗体可以通过调节机体的特异性的细胞免疫、体液免疫和非特异性的免疫系统治疗免疫相关疾病。本发明所获得抗体可以单独使用或与其他药物合用。

D.心脑血管疾病和血液病治疗：这里心脑血管疾病和血液病主要是指由于血栓形成所引起的疾病，本发明所获得抗体可以通过调节机体的血栓形成机制治疗心脑血管疾病和血液病。本发明所获得抗体可以单独使用或与其他药物合用。

E.其他疾病：除上述疾病外，还可以用本发明所获得抗体开发治疗其他疾病。本发明所获得抗体可以单独使用或与其他药物合用。

通常，所获得抗体可配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性介质载体中，这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。pH通常为约5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。药物制剂应与给药方式相匹配，也可以是片剂和胶囊等。治疗性制剂均在无菌条件下或特殊条件下制备。

四、具体实施方式

实施例1：实施举例1是为进一步阐述本发明。应理解，这些举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围(以下各实施例同)。原核细胞体内抗体文库构建方法，包括以下步骤：(1)取生物的外周血、淋巴结、脾脏、骨髓、肝脏等免疫相关组织、细胞；(2)从所取的组织、细胞中分离RNA，并逆转录获得cDNA；(3)分别设计针对免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区和第三恒定区的DNA引物，在获得的cDNA中扩增免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区和第三恒定区；(4)用限制性内切酶、连接酶等和/或同源重组的分子生物学和遗传学的方法，将上一步骤获得的免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区和Fab插入特殊的重组质粒，并与重组质粒中特殊编码基因如RNA多聚酶α亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列形成融合蛋白，从而形成质粒抗体文库。

实施例2：原核细胞内筛选特异性抗体的方法，包括以下步骤：

(1)将抗原基因的全长或部分开放阅读框架(ORF)插入在细菌双杂交中能用作诱饵质粒的DNA序列中。诱饵质粒包括所有能用于原核细胞即细菌双杂交的质粒，这种质粒除含有一般质粒共有蛋白编码基因外，还含有特殊蛋白编码基因如DNA结合的蛋白或者腺苷酸环化酶的部分序列。插入的抗原基因能与DNA结合的蛋白序列或腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因。(2)从步骤(1)获得的含有抗原的质粒与从文库构建步骤(4)获得的含有抗体文库质粒混合，加入含有报道基因(如耐抗生素药基因和β-半乳糖苷酶等)的感受态大肠杆菌进行共转化。(3)将从步骤(2)所得的大肠杆菌铺在含有抗生素和能与β-半乳糖苷酶起化学反应呈现颜色的试剂X-gal的细菌培养平板，孵育过夜。(4)能在细菌培养平板生长并有颜色反应的是阳性克隆，含有相应的抗体或抗体片段如scFv、Fv和Fab等。颜色反应的强度与抗原-抗体间的亲和力成正相关。(5)从步骤(4)获得的含侯选抗体的质粒通过与含抗原的质粒再次共转化至上述感受态大肠杆菌，观察生长和颜色反应证实其特异性。

实施例3：原核细胞内构建次级抗体文库的方法，包括以下步骤：(1)以原有的抗体轻链和重链可变区为模板，采用以下方法构建衍生的次级抗体文库，但不限于以下4种方法。利用随机突变的多聚酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增轻链和重链可变区，插入上述用于构建抗体文库的质粒，并与质粒中的特殊蛋白编码基因如RNA多聚酶α亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因，形成次级抗体文库；(2)将原有的抗体轻链和重链可变区插入上述用于构建抗体文库的质粒后，利用特殊宿主菌引起随机突变，抽提质粒，形成次级抗体文库；(3)利用链替换技术，分别替换抗体轻链和重链可变区后，插入上述质粒，形成次级抗体文库；(4)利用抗体轻链和重链可变区的互补决定区(complementarity determining regions，CDRs)的随机突变，形成次级抗体文库。

实施例4：原核细胞体内筛选和优化高亲和性抗体的方法，包括以下步骤：(1)将抗原基因的全长或部分开放阅读框架(ORF)插入在细菌双杂交中的诱饵质粒的并与质粒中的DNA结合的蛋白序列或腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因。(2)含有次级抗体文库的质粒与从步骤(1)获得的含有抗原的质粒混合，加入含有报道基因(如耐抗生素药基因和β-半乳糖苷酶等)的感受态大肠杆菌进行共转化。(3)将从步骤(2)所得的大肠杆菌铺在含有抗生素和能与β-半乳糖苷酶起化学反应呈现颜色的试剂X-gal的细菌培养平板，孵育过夜。(4)能在细菌培养平板生长并有颜色反应的是阳性克隆。(5)颜色反应的强度与抗原-抗体间的亲和力成正相关。颜色反应可用分光光度计测量比较，选择颜色反应比原有抗体明显的抗体即为优化的高亲和力抗体。

Claims (10)

1.原核细胞体内抗体文库构建及抗体的筛选方法，包括原核细胞体内抗体，其特征在于在原核细胞体内构建多种属、高滴度、高丰度、高多样性抗体和抗体片段文库，筛选高特异性抗体。

2.根据权利要求1所述的原核细胞体内抗体文库构建及抗体的筛选方法，其特征在于，在原核细胞体内，主要指大肠杆菌体内，但不限于大肠杆菌，文库中的抗体来自人类、大鼠、小鼠、兔等脊椎动物，但不限于脊椎动物，抗体文库可以是天然、人工合成和半人工合成的抗体文库，文库中的抗体可以是完整抗体和抗体片段包括单链抗体(scFv)、Fv和Fab等。

3.根据权利要求1所述的原核细胞体内抗体文库构建及抗体的筛选方法，其特征在于，用于构建文库的重组质粒可以用于原核细胞即大肠杆菌双杂交体系，抗原不要表达、纯化，但抗原基因包括全部或部分开放阅读框架必须插入诱饵质粒中的特殊蛋白基因形成融合基因。

4.根据权利要求1所述的原核细胞体内抗体文库构建及抗体的筛选方法，其特征在于，抗体文库构建包括以下步骤：(1)取生物的外周血、淋巴结、脾脏、骨髓、肝脏等免疫相关组织、细胞；(2)从所取的组织、细胞中分离RNA，并逆转录获得cDNA；(3)分别设计针对免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区和第三恒定区的DNA引物，在获得的cDNA中扩增免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区和第三恒定区；(4)用限制性内切酶、连接酶等和/或同源重组的分子生物学和遗传学的方法，将上一步骤获得的免疫球蛋白重链可变区、轻链可变区和Fab插入特殊的重组质粒，并与重组质粒中特殊编码基因如RNA多聚酶α亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列形成融合蛋白，从而形成质粒抗体文库。

5.根据权利要求1所述的原核细胞体内抗体文库构建及抗体的筛选方法，其特征在于，诱饵质粒能用于原核细胞即大肠杆菌双杂交体系，诱饵质粒DNA编码特殊蛋白，蛋白可以是λc1蛋白或者部分腺苷酸环化酶，但不限于λcl蛋白或者部分腺苷酸环化酶。

6.根据权利要求1所述的原核细胞体内抗体文库构建及抗体的筛选方法，其特征在于，筛选特异性抗体包括以下步骤：将抗原基因的全长或部分开放阅读框架(ORF)插入在细菌双杂交中能用作诱饵质粒的DNA序列中，诱饵质粒包括所有能用于原核细胞即细菌双杂交的质粒，这种质粒除含有一般质粒共有蛋白编码基因外，还含有特殊蛋白编码基因如DNA结合的蛋白或者腺苷酸环化酶的部分序列，插入的抗原基因能与DNA结合的蛋白序列或腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因；(2)从步骤(1)获得的含有抗原的质粒与从文库构建步骤(4)获得的含有抗体文库质粒混合，加入含有报道基因(如耐抗生素药基因和β-半乳糖苷酶等)的感受态大肠杆菌进行共转化；(3)将从步骤(2)所得的大肠杆菌铺在含有抗生素和能与β-半乳糖苷酶起化学反应呈现颜色的试剂X-gal的细菌培养平板，孵育过夜；(4)能在细菌培养平板生长并有颜色反应的是阳性克隆，含有相应的抗体或抗体片段如scFv、Fv和Fab等，颜色反应的强度与抗原-抗体间的亲和力成正相关；(5)从步骤(4)获得的含侯选抗体的质粒通过与含抗原的质粒再次共转化至上述感受态大肠杆菌，观察生长和颜色反应证实其特异性。

7.根据权利要求1所述的原核细胞体内抗体文库构建及抗体的筛选方法，其特征在于，抗体经过一次筛选后，在原核细胞内构建次级抗体文库，并筛选和优化高亲和性抗体，可以利用随机突变的多聚酶链反应或者特殊宿主菌或者抗体轻链和重链替换技术或者抗体轻链和重链可变区的互补决定区随机突变等方法形成次级抗体文库，但不限于上述方法。

8.根据权利要求7所述的原核细胞内构建次级抗体文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以原有的抗体轻链和重链可变区为模板，采用以下方法构建衍生的次级抗体文库，但不限于以下4种方法，利用随机突变的多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增轻链和重链可变区，插入上述用于构建抗体文库的质粒，并与质粒中的特殊蛋白编码基因如RNA多聚酶亚单位或者腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因，形成次级抗体文库；(2)将原有的抗体轻链和重链可变区插入上述用于构建抗体文库的质粒后，利用特殊宿主菌引起随机突变，抽提质粒，形成次级抗体文库；(3)利用链替换技术，分别替换抗体轻链和重链可变区后，插入上述质粒，形成次级抗体文库；(4)利用抗体轻链和重链可变区的互补决定区(complementary determining regions，CDRs)的随机突变，形成次级抗体文库。

9.根据权利要求7所述的原核细胞体内筛选和优化高亲和性抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将抗原基因的全长或部分开放阅读框架(ORF)插入在细菌双杂交中的诱饵质粒的并与质粒中的DNA结合的蛋白序列或腺苷酸环化酶的部分序列形成融合基因；(2)含有次级抗体文库的质粒与从步骤(1)获得的含有抗原的质粒混合，加入含有报道基因(如耐抗生素药基因和β-半乳糖苷酶等)的感受态大肠杆菌进行共转化；(3)将从步骤(2)所得的大肠杆菌铺在含有抗生素和能与β-半乳糖苷酶起化学反应呈现颜色的试剂X-gal的细菌培养平板，孵育过夜；(4)能在细菌培养平板生长并有颜色反应的是阳性克隆；(5)颜色反应的强度与抗原-抗体间的亲和力成正相关；颜色反应可用分光光度计测量比较，选择颜色反应比原有抗体明显的抗体即为优化的高亲和力抗体。

10.原核细胞体内抗体文库构建、抗体的筛选和优化的用途，所获得抗体和抗体片段可作为药物用于临床疾病诊断、治疗，也可以用于生命科学研究及抗体工程和基因工程生产和改造。